CN114470008B - 短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌在制备治疗卵巢早衰的产品中的应用 - Google Patents
短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌在制备治疗卵巢早衰的产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公布了用于改善卵巢早衰(POF)的益生菌菌株及其应用。本发明提供的益生菌菌株为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reute)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明在动物水平上证实,短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌能显著改善卵巢早衰(POF)模型小鼠卵巢功能:改善模型小鼠卵巢重量下降,增加模型小鼠卵巢始基卵泡及窦卵泡数目,改善少模型小鼠卵巢内颗粒细胞凋亡指数以及其血清激素水平。目前卵巢早衰缺乏针对病因的治疗药物,本发明短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌可对有卵巢早衰有明显改善作用,可广泛推广应用,市场应用价值高。
Description
技术领域
本发明属于益生菌领域,涉及用于治疗卵巢早衰的益生菌及其应用,具体为短短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌在制备治疗卵巢早衰的产品中的应用。
技术背景
卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性在40岁之前出现以雌激素水平降低,FSH>40IU/L、同时伴不同程度围绝经症状的内分泌疾病。据报道,POF的发病率约为1%~3.8%,其主要临床表现为月经失调、盗汗、潮热、烦躁、不孕,同时POF可导致骨质疏松、心血管疾病的发病率增高,严重影响患者身体健康和生活质量。然而,现临床用于治疗POF主要方法是激素替代疗法,该方法虽可以缓解雌激素缺乏所致症状,但不能从根本上改善卵巢功能,同时增加乳腺癌等病发病风险。目前,POF发病原因仍不明确,遗传、代谢、免疫、医源性损伤等多种因素可导致卵巢功能受损,但均未能完全阐明其发病机制。因此,进一步探讨POF的发病机制,开发广泛应用于临床的卵巢功能保护剂,有望提高POF女性的生育力和生活质量,具有深远的社会及学术效益。
肠道菌群是定植在肠道内的庞大微生物群落,密切参与营养、代谢、免疫等众多生理过程。今年研究表明,肠道菌群在药物代谢及吸收过程中扮演重要角色。关注化疗药物相关领域发现,肠道菌群影响化疗药物的功效及毒副作用:革兰氏阳性细菌抗生素可降低铂类化疗药物的治疗效果;健康小鼠粪菌液可改善顺铂(Cisplatin)引起的肠粘膜损伤。因此,肠道益生菌及其制剂成为防治POF非常重要的防治手段。
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)是一种革兰氏阳性细菌,常用于食物发酵。国外研究发现,短乳杆菌补充可缓解放疗治疗导致的口腔黏膜炎:研究纳入75名头颈部恶性肿瘤患者,试验组患者在接受放疗治疗通过,口服补充2×109cfu短乳杆菌,结果发现短乳杆菌补充治疗组患者放疗部位疼痛及吞咽困难症状明显改善;此外,短乳杆菌可改善结肠炎模型小鼠的体重下降及结肠炎症改变。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuter)属于乳杆菌属,是一种圆形末端弯曲杆菌,我国于2001年将罗伊氏乳杆菌正式批准为可用于保健功能的益生菌菌株;其可定植于肠道中,研究表明对10名健康志愿者和9名进行了回肠造瘘的志愿者连续补充该菌,结果显示罗伊氏乳杆菌在健康志愿者消化道(胃、十二指肠、回肠)中的定植。
外源性补充罗伊氏乳杆菌可预防腹泻及结肠炎。一项在以色列14所儿童保育中心开展的前瞻性研究结果提示,罗伊氏乳杆菌可缩短4-10月龄婴儿的腹泻天数;另外一项随机双盲试验发现,在配方奶中添加1×107CFU罗伊氏乳杆菌可减少婴儿返流和哭泣时间。
发明内容
短乳杆菌可改善放疗治疗副反应,减轻放疗治疗所导致放疗部位疼痛及器官功能,而目前关于短乳杆菌在防治卵巢早衰尚无明确报道,我们探索了短乳杆菌在POF中的治疗作用。
罗伊氏乳杆菌在缓解代谢综合征方面备受关注,2018年发表在Cell Metabolism的文章中已经表明罗伊氏乳杆菌可以通过产生色氨酸分解代谢产物来激活AhR配体,从而改善代谢综合征。考虑到罗伊氏乳杆菌可定植于肠道内,且可参与改善机体炎症及代谢等病理生理过程,而目前关于罗伊氏乳杆菌在防治卵巢早衰尚无明确报道,我们探索了罗伊氏乳杆菌在POF中的治疗作用。
本发明的第一目的是提供短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌在制备保护卵巢功能药物的应用。
本发明的所要解决的技术问题是短乳杆菌在医学治疗的新用途。
本发明的第一方面是提供短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在制备预防和/或治疗卵巢早衰的产品中应用。
本发明第二方面提供罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reute)在制备预防和/或治疗卵巢早衰及相关卵巢功能减退的产品中应用。
本发明第三方面提供短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在制备具有以下任一项或多项作用的产品中的应用:
1)提高作用对象的卵巢重量;
2)抑制卵巢可内颗粒细胞凋亡;
3)增加作用对象卵巢内始基卵泡及窦卵泡数目;
4)稳定对象血清内激素水平。
或者,罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reute)在制备具有以下任一项或多项作用的产品中的应用:
1)提高作用对象的卵巢重量;
2)抑制卵巢可内颗粒细胞凋亡;
3)增加作用对象卵巢内始基卵泡及窦卵泡数目;
4)稳定对象血清内激素水平。
本发明第四方面提供一种药物,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能;所述药物的有效成分包括短乳杆菌;或者,
一种药物,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能;其特征在于,所述药物的有效成分包括罗伊氏乳杆菌。
本发明第五方面提供一种菌剂,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能,所述菌剂采用包括如下步骤的方法制得:将短乳杆菌厌氧条件下培养,分离短乳杆菌后,以1×107-1×108cfu/mL浓度重悬于缓冲液中,获得所述菌剂;或者,
一种菌剂,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能,其特征在于,所述菌剂采用包括如下步骤的方法制得:将罗伊氏乳杆菌在厌氧条件下培养,分离罗伊氏乳杆菌后,以1×107-1×108cfu/mL浓度重悬于缓冲液中,获得所述菌剂。
本发明的有益效果为:
本发明的短乳杆菌对卵巢功能损伤产生明显保护作用,并且能够改善模型小鼠卵巢重量下降,增加模型小鼠卵巢始基卵泡及窦卵泡数目,减少模型小鼠卵巢内颗粒细胞凋亡指数以及其血清激素水平。目前卵巢早衰缺乏针对病因的治疗药物,而短乳杆菌在动物实验上证实可明显改善小鼠卵巢功能,可用于制备防治POF药物,可广泛推广应用,市场应用价值高。
本发明的罗伊氏乳杆菌对顺铂导致卵巢功能损伤产生明显保护作用,并且能够改善模型小鼠卵巢重量下降,增加模型小鼠卵巢始基卵泡及窦卵泡数目,减少模型小鼠卵巢内颗粒细胞凋亡指数以及其稳定血清激素水平。目前卵巢早衰缺乏针对病因的治疗药物,而罗伊氏乳杆菌在动物实验上证实可明显改善小鼠卵巢功能,可用于制备防治POF药物。本发明罗伊氏乳杆菌可对卵巢早衰有明显改善作用,可广泛推广应用,市场应用价值高。
附图说明
图1是短乳杆菌对POF模型小鼠改善小鼠卵巢重量的统计图,数据采用one-wayANOVA,校正Dunne t post-hoc test。
图2是短乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢组织损伤病理结果图。A图为正常小鼠卵巢组织形态学变化HE图,B图为POF模型小鼠卵巢组织形态学变化HE染色图,C图为POF+L.brevis卵巢组织形态学变化HE图,标尺为250μm。
图3是短乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢内卵泡数目统计图。A图为卵巢始基卵泡数量统计图,B图为卵巢闭锁数量统计图。(*代表p<0.05,**代表p<0.01,统计方法采用one-way ANOVA,校正Dunne t post-hoc test)
图4是短乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢内颗粒细胞凋亡结果图。A图为正常小鼠卵巢组织TUNNEL凋亡染色结果图,B图为POF模型小鼠卵巢组织TUNNEL凋亡染色结果图,C图为POF+Lactobacillus brevis卵巢组织TUNNEL凋亡染色结果图,D图为凋亡指数统计图。(*代表p<0.05,**代表p<0.01,统计方法采用one-way ANOVA,校正Dunne t post-hoc test)
图5是短乳杆菌改善POF模型小鼠血清激素水平结果图。A图为POF+L.brevis组小鼠血清FSH水平较POF降低,B图为POF+L.brevis组小鼠血清E2水平较POF升高。(*代表p<0.05,统计方法采用one-way ANOVA,校正Dunne t post-hoc test)
图6是罗伊氏乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢重量下降的统计图,数据采用one-wayANOVA,校正Dunne t post-hoc test。(*代表p<0.05,**代表p<0.01,统计方法采用one-wayANOVA,校正Dunne t post-hoc test)
图7是罗伊氏乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢组织损伤病理结果图。A图为正常小鼠卵巢组织形态学变化HE图,B图为POF模型小鼠卵巢组织形态学变化HE染色图,C图为POF+L.reuter卵巢组织形态学变化HE图,标尺为250μm。
图8是罗伊氏乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢内卵泡数目统计图。A图为卵巢始基卵泡数量统计图,B图为卵巢窦卵泡数量统计图,C图为卵巢闭锁卵泡数量统计图。(*代表p<0.05,**代表p<0.01,统计方法采用one-way ANOVA,校正Dunne t post-hoc test)
图9是罗伊氏乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢内颗粒细胞凋亡结果图。A图为正常小鼠卵巢组织TUNNEL凋亡染色结果图,B图为POF模型小鼠卵巢组织TUNNEL凋亡染色结果图,C图为POF+Lactobacillus reuter卵巢组织TUNNEL凋亡染色结果图,D图为凋亡指数统计图。(*代表p<0.05,**代表p<0.01,统计方法采用one-way ANOVA,校正Dunne t post-hoctest)
图10是罗伊氏乳杆菌改善POF模型小鼠血清内雌鼠水平统计图;A图为雌激素(E2)含量,B图为促卵泡生成素(FSH)含量。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
以下结合附图和实施对本发明的技术方案做进一步的说明。
本发明一实施例提供短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在制备预防和/或治疗卵巢早衰及相关卵巢功能减退的产品中应用。
所述短乳杆菌为现有菌株。例如可以为保藏号为:CGMCC NO.1.2028的短乳杆菌。具体的保藏信息为:
原始编号:PCM 488
保藏号为:CGMCC NO.1.2028;
保藏日期:1996年08月12日;
保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
保藏单位简称:CGMCC;
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述菌株可以通过CGMCC直接购买。
所述的卵巢早衰的原因选自遗传、代谢、免疫或医源性损伤。
可选的,所述医源性损伤为化疗药物造成的损伤。
所述相关卵巢功能减退的症状包括卵巢重量减退、卵泡数量减少、卵巢内颗粒细胞凋亡或血清激素水平下降中的任一项或多项。需说明的是,卵巢功能减退是导致女性不可逆性闭经,生殖器官萎缩及出现围绝经期相关症状的女性全身性内分泌系统疾病。
一些实施证明,所述卵巢功能改善包括:减缓作用对象卵巢重量下降,增加作用对象卵巢始基卵泡及窦卵泡数目。
一些实施证明,所述卵巢功能改善包括:降低作用对象卵巢内颗粒细胞凋亡指数,通过组织凋亡TUNNEL染色判断。
一些实施证明,所述卵巢功能改善包括:稳定作用对象血清激素水平。所述的血清激素可以包括E2(雌二醇)及FSH(卵泡生成素);稳定作用对象血清激素水平包括使血清内雌激素水平(E2)升高及促卵泡生成素下降(FSH)。
所述减缓作用对象卵巢重量下降是指,使作用对象的卵巢重量接近或达到健康卵巢水平。例如,以健康卵巢的重量为基准,所述产品可以使作用对象的卵巢重量恢复到健康卵巢的70%,80%,85%,90%,95%,100%。
所述增加作用对象卵巢始基卵泡及窦卵泡数目是指,所述产品可以使作用对象的卵巢始基卵泡及窦卵泡数目接近或达到健康卵巢水平。例如,以健康卵巢始基卵泡及窦卵泡数目为基准,所述产品可以使作用对象的卵巢始基卵泡及窦卵泡数目恢复到健康卵巢的70%,80%,85%,90%,95%,100%。
所述降低作用对象卵巢内颗粒细胞凋亡指数是指,所述产品可以使作用对象的卵巢内颗粒细胞凋亡指数接近或达到健康卵巢水平。例如,以健康卵巢内颗粒细胞凋亡指数为基准,所述产品可以使作用对象的卵巢内颗粒细胞凋亡指数不超过健康卵巢指数的2倍。
所述稳定作用对象血清激素水平是指,所述产品可以使作用对象的血清激素水平接近或达到健康水平。例如,以健康对象血清激素水平为基准,所述产品可以使作用对象的血清激素水平处于健康对象血清激素水平的80%-120%之间。
本发明一实施提供短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在制备具有以下任一项或多项作用的产品中的应用:
1)提高作用对象的卵巢重量;
2)抑制卵巢可内颗粒细胞凋亡;
3)增加作用对象卵巢内始基卵泡及窦卵泡数目;
4)稳定对象血清内激素水平。
前面所述任一项应用中,所述产品包括药物、保健食品或功能性食品。
所述作用对象对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本发明一实施例提供一种药物,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能;所述药物的有效成分包括短乳杆菌。
所述短乳杆菌为所述药物的有效成分物质或有效成分之一。
所述药物中,短乳杆菌的使用剂量为1×106-1×109cfu/个体。
可选的,所述提高卵巢功能包括以下任一项或多项:1)提高作用对象的卵巢重量;2)抑制卵巢可内颗粒细胞凋亡;3)增加作用对象卵巢内始基卵泡及窦卵泡数目;4)稳定对象血清内激素水平。
可选的,所述的治疗卵巢早衰的药物还包含药学上可接受的载体或辅料。
所述药物中,短乳杆菌具有活性。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,除非特别说明,药物剂型并无特别限定,例如,所述的治疗卵巢早衰的药物形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、喷剂或注射剂。
本发明中,单个剂型含有为达到所需药物量的预定活性物质,本发明为短乳杆菌。
本发明一实施例提供一种菌剂,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能,所述菌剂采用包括如下步骤的方法制得:将短乳杆菌厌氧条件下培养,分离短乳杆菌后,以1×107-1×108cfu/mL浓度重悬于缓冲液中,获得所述菌剂。
所述短乳杆菌的培养条件为MRS培养基中37℃条件下厌氧培养24小时,传代培养。
所述缓冲液为无菌磷酸盐缓冲盐水。其浓度及pH为适合菌体存活的浓度及pH。
所述菌剂中,短乳杆菌具有生物活性。
本发明通过一系列POF小鼠模型验证了本发明菌株在治疗卵巢早衰及相关发展疾病中的作用,验证了本发明菌株具有改善卵巢功能的作用。下面将结合附图和具体实验过程详细讲述。
实施例1短乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢功能
1.实验方法:
1.1短乳杆菌的培养:取500ul无菌PBS溶解从保藏中心购买的CGMCC NO.1.2028购买的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌粉,充分溶解后分别接种于高压灭菌的MRS液体培养基中。将锥形瓶放置于厌氧培养袋中,短乳杆菌37℃厌氧培养48h。
1.2菌液冻存:培养后菌液等量分装至15ml离心管中,向每管中加入无菌甘油,并使甘油占比20%,混匀,储存于﹣80℃备用。
1.3.细菌计数:取1ml甘油菌液至EP管中,取3个无菌1.5ml EP。用无菌PBS梯度稀释为10-5、10-6、10-7,分别取200ul稀释后菌液接种于3个血琼脂平皿中,使用涂布棒将菌液均匀涂布于皿中。短乳杆菌37℃厌氧培养24h,短乳杆菌37℃厌氧培养48h。之后取出血琼脂平皿,选取菌落数量在30-300CFU的血平皿进行计数。所含菌量(CFU/ul)=计数量×稀释倍数/200。
1.4.灌胃用菌液:取出1.2冻存甘油菌置于常温复溶,待菌液溶解后5000×g离心5min。弃去上清,加入适量PBS使每管含菌量为1×109CFU/200ul。
1.5POF动物模型构建:充分溶解顺铂的溶液,按1.5mg/kg腹腔注射给药,每天1次,连续7天。
1.6动物实验分组:将8周龄C57BL/6雌性小鼠之后随机分为3组,即对照组(Control组),POF动物模型组(POF组),短小乳酸菌L.brevis组(POF+L.brevis组)。POF+L.brevis组:按照1.4制备L.brevis菌液,200ul连续3天对POF+L.brevis组灌胃处理,灌胃后按POF造模方案对POF组和POF+L.brevis组造模,并于造模期间对第1,2,3,6,7天对POF+L.brevis组灌胃L.brevis菌液,Control组和POF组灌等量纯净水。造模结束后分离小鼠卵巢,进行卵巢组织称重,病理染色及TUNNEL特殊染色。
1.7小鼠卵巢组织分离及称量:沿着“Y”型子宫的两端找到两侧的卵巢组织,剪除卵巢并于称量纸上剔除多余的系膜组织。吸干卵巢上的血迹后进行称量并记录。
1.8小鼠卵巢组织形态学变化观察、卵泡计数及凋亡TUNNEL染色
1.8.1石蜡切片
将新鲜卵巢组织置于4%多聚甲醛固定24h后,在自动脱水仪器仪器上设置好程序进行脱水;包埋;石蜡切片厚度为3μm,连续切片2张形成一个蜡片;间隔30μm再次连续切片,每间隔5个切片选取1个蜡片贴附于载玻片上,每个卵巢组织取5张切片,用于HE染色。同样再选取5张切片用于Tunel凋亡检测。
1.8.2HE染色:切片放置60℃烤箱1h;置于二甲苯10min两次进行脱腊;置于梯度乙醇溶液脱二甲苯,无水乙醇I 5min,无水乙醇II 5min,95%乙醇3min,70%乙醇3min;苏木精染液染5min,水洗1min;1%盐酸乙醇溶液分化,水洗1min;0.2%氨水的反蓝1min;1%伊红染液染30s;乙醇脱水,95%乙醇30s,无水乙醇1min,无水乙醇1min;二甲苯透明两次,每次1min。中性树胶封片,光学显微镜观察拍照。
1.8.2卵巢各级卵泡计数:HE染色的小鼠卵巢组织中各级卵泡数目。即每间隔5个切片进行卵泡计数。对卵母细胞胞核清晰可见的卵泡进行计数。卵巢组织各级卵泡数=5张切片各级卵泡数的总和×5。仅各级卵泡分级标准如下:
a.始基卵泡:完整的卵母细胞被单层扁平颗粒细胞包围。
b.初级卵泡:完整的卵母细胞被单层立方颗粒细胞包围。
c.次级卵泡:颗粒细胞层数在2层(含2层)以上,且少于7层,无明显窦腔的卵泡。
d.窦卵泡:有明显的卵母细胞,颗粒细胞层数在7层(含7层)以上,可见窦腔。
e.闭锁卵泡:卵母细胞皱缩,颗粒细胞排列紊乱。
1.8.3卵巢TUNNEL染色:
取1.8.1中其切片进行烤片、脱蜡;稀释后的Proteinase K进行组织通透,通透后组织在避光环境下加入Streptavidin-TRITC试剂进行孵育染色:每个样本加入50ulStreptavidin-TRITC试剂,37℃避光孵育30min。孵育完后,加入100ulPBS轻轻漂洗3次,每次5min;DAPI染色液复染细胞核:每样本加入100ul DAPI染色液,室温避光反应10min。复染核后甘油封片,荧光纤维镜下观察拍照。
2.实验结果:
2.1结果如图1所示,POF+L.brevis组小鼠卵巢重量较POF升高(p<0.05),说明短小乳杆菌可改善POF小鼠的卵巢重量减轻。
2.2结果如图2,3所示:与POF小鼠卵巢相比,POF+L.brevis组小鼠卵巢内病理损伤程度明显改善,各级卵泡结构清晰,窦卵泡内颗粒细胞层数清晰;统计卵巢各级卵泡数量:POF+L.brevis组内始基卵泡数目增加,差异具有统计学差异(p<0.05);闭锁卵巢数目减少(p<0.05)。
2.3结果如图4所示:荧光显微镜下观察,POF+L.brevis组小鼠窦卵泡内颗粒细胞凋亡程度较POF组明显减轻,镜下可见红色变片状荧光面积明显减少,通过比较窦卵泡内凋亡细胞/正常细胞比值计算凋亡指数,结果提示POF+L.brevis组颗粒细胞凋亡指数明显降低(p<0.05)。
2.5结果如图5所示:POF+L.brevis组小鼠血清FSH水平较POF降低(p<0.05),E2水平较POF升高,说明短小乳杆菌可改善POF小鼠的血清激素水平改变。
本发明一实施例提供罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuter)在制备预防和/或治疗卵巢早衰及相关卵巢功能减退的产品中应用。
所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuter)为现有菌株。例如可以为保藏号为:CGMCC NO.1.12733的罗伊氏乳杆菌。具体的保藏信息为:
原始编号:LE08
保藏号为:CGMCC NO.1.12733;
保藏日期:2013年12月17日;
保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
保藏单位简称:CGMCC;
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述罗伊氏乳杆菌可以通过CGMCC直接购买。
所述的卵巢早衰的原因选自遗传、代谢、免疫或医源性损伤。
可选的,所述医源性损伤为化疗药物造成的损伤。
所述相关卵巢功能减退的症状包括卵巢重量减退、卵泡数量减少、卵巢内颗粒细胞凋亡或血清激素水平下降中的任一项或多项。需说明的是,卵巢功能减退是导致女性不可逆性闭经,生殖器官萎缩及出现围绝经期相关症状的女性全身性内分泌系统疾病。
一些实施证明,所述卵巢功能改善包括:减缓作用对象卵巢重量下降,增加作用对象卵巢始基卵泡及窦卵泡数目。
一些实施证明,所述卵巢功能改善包括:降低作用对象卵巢内颗粒细胞凋亡指数,通过组织凋亡TUNNEL染色判断。
一些实施证明,所述卵巢功能改善包括:稳定作用对象血清激素水平。所述的血清激素可以包括E2(雌二醇)及FSH(卵泡生成素);稳定作用对象血清激素水平包括使血清内雌激素水平(E2)升高及促卵泡生成素下降(FSH)。
所述减缓作用对象卵巢重量下降是指,使作用对象的卵巢重量接近或达到健康卵巢水平。例如,以健康卵巢的重量为基准,所述产品可以使作用对象的卵巢重量恢复到健康卵巢的70%,80%,85%,90%,95%,100%。
所述增加作用对象卵巢始基卵泡及窦卵泡数目是指,所述产品可以使作用对象的卵巢始基卵泡及窦卵泡数目接近或达到健康卵巢水平。例如,以健康卵巢始基卵泡及窦卵泡数目为基准,所述产品可以使作用对象的卵巢始基卵泡及窦卵泡数目恢复到健康卵巢的70%,80%,85%,90%,95%,100%。
所述降低作用对象卵巢内颗粒细胞凋亡指数是指,所述产品可以使作用对象的卵巢内颗粒细胞凋亡指数接近或达到健康卵巢水平。例如,以健康卵巢内颗粒细胞凋亡指数为基准,所述产品可以使作用对象的卵巢内颗粒细胞凋亡指数不超过健康卵巢指数的2倍。
所述稳定作用对象血清激素水平是指,所述产品可以使作用对象的血清激素水平接近或达到健康水平。例如,以健康对象血清激素水平为基准,所述产品可以使作用对象的血清激素水平处于健康对象血清激素水平的80%-120%之间。
本发明一实施提供罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)在制备具有以下任一项或多项作用的产品中的应用:
1)提高作用对象的卵巢重量;
2)抑制卵巢可内颗粒细胞凋亡;
3)增加作用对象卵巢内始基卵泡及窦卵泡数目;
4)稳定对象血清内激素水平。
前面所述任一项应用中,所述产品包括药物、保健食品或功能性食品。
所述作用对象对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本发明一实施例提供一种药物,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能;所述药物的有效成分包括罗伊氏乳杆菌。
所述罗伊氏乳杆菌为所述药物的有效成分或有效成分之一。
所述药物中,罗伊氏乳杆菌的治疗剂量为1×106-1×109cfu/个体。
可选的,所述提高卵巢功能包括以下任一项或多项:1)提高作用对象的卵巢重量;2)抑制卵巢可内颗粒细胞凋亡;3)增加作用对象卵巢内始基卵泡及窦卵泡数目;4)稳定对象血清内激素水平。
可选的,所述的治疗卵巢早衰的药物还包含药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,除非特别说明,药物剂型并无特别限定,例如,所述的治疗卵巢早衰的药物形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、喷剂或注射剂。
本发明中,单个剂型含有为达到所需药物量的预定活性物质,本发明为罗伊氏乳杆菌。
本发明一实施例一种菌剂,具有以下任一项功能:1)预防和/或治疗卵巢损伤;2)预防和/或治疗卵巢早衰,3)提高卵巢功能,所述菌剂采用包括如下步骤的方法制得:将罗伊氏乳杆菌厌氧条件下培养,分离罗伊氏乳杆菌后,以1×107-1×108cfu/mL浓度重悬于缓冲液中,获得所述菌剂。
所述菌剂中,罗伊氏乳杆菌具有生物活性。
所述罗伊氏乳杆菌的培养条件为MRS培养基中37℃条件下厌氧培养24小时,传代培养。
缓冲液为无菌磷酸盐缓冲盐水。其浓度及pH为适合菌体存活的浓度及pH。
本发明通过一系列POF小鼠模型验证了本发明菌株在治疗卵巢早衰及相关发展疾病中的作用,验证了本发明菌株具有改善卵巢功能的作用。下面将结合附图和具体实验过程详细讲述。
实施例1罗伊氏乳杆菌改善POF模型小鼠卵巢功能
1.实验方法:
1.1罗伊氏乳杆菌的培养:取500ul无菌PBS溶解从保藏中心购买的CGMCCNO.1.12733的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuter)菌粉,充分溶解后分别接种于高压灭菌的MRS液体培养基中。将锥形瓶放置于厌氧培养袋中,罗伊氏乳杆菌37℃厌氧培养24h。
1.2菌液冻存:培养后菌液等量分装至15ml离心管中,向每管中加入无菌甘油,并使甘油占比20%,混匀,储存于﹣80℃备用。
1.3细菌计数:取1ml甘油菌液至EP管中,取3个无菌1.5ml EP。用无菌PBS梯度稀释为10-5、10-6、10-7,分别取200ul稀释后菌液接种于3个血琼脂平皿中,使用涂布棒将菌液均匀涂布于皿中。罗伊氏乳杆菌37℃厌氧培养24h,罗伊氏乳杆菌37℃厌氧培养48h。之后取出血琼脂平皿,选取菌落数量在30-300CFU的血平皿进行计数。所含菌量(CFU/ul)=计数量×稀释倍数/200。
1.4灌胃用菌液:取出冻存甘油菌置于常温复溶,待菌液溶解后5000×g离心5min。弃去上清,加入适量PBS使每管含菌量为1×109CFU/200ul。
1.5POF动物模型构建:充分溶解顺铂的溶液,按1.5mg/kg腹腔注射给药,每天1次,连续7天。
1.6动物实验分组:将8周龄C57BL/6雌性小鼠之后随机分为3组,即对照组(Control组),POF动物模型组(POF组),罗伊氏乳酸杆菌L.reuteri组(POF+L.reuteri组)。Cis-platinum+L.reuteri组:按照1.4制备L.reuteri菌液,200ul连续3天对POF+L.reuteri组灌胃处理,灌胃后按POF造模方案对POF组和POF+L.reuteri组造模,并于造模期间第1,2,3,6,7天对POF+L.reuteri组灌胃L.reuteri菌液;POF组和Control组灌等量纯净水。造模结束后分离小鼠卵巢,进行卵巢组织称重,病理染色及TUNNEL特殊染色。
1.7小鼠卵巢组织分离及称量:沿着“Y”型子宫的两端找到两侧的卵巢组织,剪除卵巢并于称量纸上剔除多余的系膜组织。吸干卵巢上的血迹后进行称量并记录。
1.8小鼠卵巢组织形态学变化观察、卵泡计数及凋亡TUNNEL染色
1.8.1石蜡切片
将新鲜卵巢组织置于4%多聚甲醛固定24h后,在自动脱水仪器仪器上设置好程序进行脱水;包埋;石蜡切片厚度为3μm,连续切片2张形成一个蜡片;间隔30μm再次连续切片,每间隔5个切片选取1个蜡片贴附于载玻片上,每个卵巢组织取5张切片,用于HE染色。同样再选取5张切片用于Tunel凋亡检测。
1.8.2HE染色:切片放置60℃烤箱1h;置于二甲苯10min两次进行脱腊;置于梯度乙醇溶液脱二甲苯,无水乙醇I 5min,无水乙醇II 5min,95%乙醇3min,70%乙醇3min;苏木精染液染5min,水洗1min;1%盐酸乙醇溶液分化,水洗1min;0.2%氨水的反蓝1min;1%伊红染液染30s;乙醇脱水,95%乙醇30s,无水乙醇1min,无水乙醇1min;二甲苯透明两次,每次1min。中性树胶封片,光学显微镜观察拍照。
1.8.3卵巢各级卵泡计数:HE染色的小鼠卵巢组织中各级卵泡数目。即每间隔5个切片进行卵泡计数。对卵母细胞胞核清晰可见的卵泡进行计数。卵巢组织各级卵泡数=5张切片各级卵泡数的总和×5。仅各级卵泡分级标准如下:
a.始基卵泡:完整的卵母细胞被单层扁平颗粒细胞包围。
b.初级卵泡:完整的卵母细胞被单层立方颗粒细胞包围。
c.次级卵泡:颗粒细胞层数在2层(含2层)以上,且少于7层,无明显窦腔的卵泡。
d.窦卵泡:有明显的卵母细胞,颗粒细胞层数在7层(含7层)以上,可见窦腔。
e.闭锁卵泡:卵母细胞皱缩,颗粒细胞排列紊乱。
1.8.4卵巢TUNNEL染色:
取1.8.1中其切片进行烤片、脱蜡;稀释后的Proteinase K进行组织通透,通透后组织在避光环境下加入Streptavidin-TRITC试剂进行孵育染色:每个样本加入50ulStreptavidin-TRITC试剂,37℃避光孵育30min。孵育完后,加入100ulPBS轻轻漂洗3次,每次5min;DAPI染色液复染细胞核:每样本加入100ul DAPI染色液,室温避光反应10min。复染核后甘油封片,荧光纤维镜下观察拍照。
1.9血清激素(雌激素E2,促卵泡生成素FSH)检测
1.9.1小鼠血清样本采集:用1ml注射器采集小鼠下腔静脉血500ul,装入加有EDTA抗凝剂的1.5ml EP管中,13000×g,4℃离心10min,取上清至一新1.5ml EP管中,并于液氮中速冻后储存于﹣80℃冰箱待用。
1.9.2酶联免疫(ELISA)方法检测小鼠血清内E2及FSH水平:ELISA试剂盒均购买于中国Bioswamp公司,按说明书操作使用。
2.实验结果:
2.1结果如图1所示,POF+L.reuter组小鼠卵巢重量较POF升高(p<0.05),说明罗伊氏乳杆菌可改善POF小鼠的卵巢重量减轻。
2.2结果如图2,3所示:与POF小鼠卵巢相比,POF+L.reuter组小鼠卵巢内病理损伤程度明显改善,各级卵泡结构清晰,窦卵泡内颗粒细胞层数清晰;统计卵巢各级卵泡数量:POF+L.reuter组内始基卵泡及窦卵泡数目增加,差异具有统计学差异(p<0.05);闭锁卵巢数目减少(p<0.05)。
2.3结果如图4所示:荧光显微镜下观察,POF+L.reuter组小鼠窦卵泡内颗粒细胞凋亡程度较POF组明显减轻,镜下可见红色变片状荧光面积明显减少,通过比较窦卵泡内凋亡细胞/正常细胞比值计算凋亡指数,结果提示POF+L.reuter组颗粒细胞凋亡指数明显降低(p<0.05)。
2.4结果如图5所示:POF+L.reuter组小鼠血清E2含量对比POF明显增高(p<0.01),而FSH含量较POF组明显降低(p<0.05)。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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1.短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在制备治疗卵巢损伤产品中应用,其特征在于,所述短乳杆菌的保藏号为:CGMCC NO. 1.2028。
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