CN105920605A

CN105920605A - 抗肌醇代谢药在构建神经管畸形小鼠模型中的应用

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Publication number: CN105920605A
Application number: CN201610407640.3A
Authority: CN
Inventors: 王建华; 郭金; 石英飞; 王芳; 刘赛; 官臻; 王秀伟; 张霆; 牛勃; 安彦新
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-06-12
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2016-09-07

Abstract

本发明提供了一种获得神经管畸形(NTDs)小鼠模型的方法，在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠，从而构建神经管畸形小鼠模型。该小鼠模型可用于神经管畸形的医学和生物学研究，有助于了解人类NTDs的病因及发病机制，为进一步研究肌醇代谢障碍在NTDs发生中的作用机制提供模型。并且，本发明方法神经管畸形率高、吸收胎少、对胚胎致死率低，并且对孕鼠毒副作用小。

Description

抗肌醇代谢药在构建神经管畸形小鼠模型中的应用

技术领域

本发明涉及一种构建神经管畸形小鼠模型的方法，尤其涉及一种抗肌醇代谢药物的应用，以及使用该药物构建神经管畸形小鼠模型的方法。

背景技术

神经管畸形(Neural Tube Defects，NTDs)是指在胚胎发育早期，由于遗传倾向和环境因素的影响，神经管闭合不全而引起的一组出生缺陷，主要表型包括无脑儿、脊柱裂及脑或脑脊膜膨出等，是胎儿和新生儿中最常见、最严重的中枢神经系统先天畸形，全世界范围内发病率为0.05％-0.2％。NTDs危害极大，如无脑儿，脑膨出和颅脊柱裂的胎儿常常死产或出生后很快死亡；而脊柱裂患儿虽然可以存活，但会导致神经功能缺损，涉及感觉缺失、无能力行走、尿失禁及脑积水等症状，严重影响患儿的生理发育和生活质量，也给患者家庭带来称重的经济与精神负担。

因此，建立合适的动物模型有助于了解人类NTDs的病因及发病机制，并且对于孕前合理的预防干预减少NTDs的发生具有重要的意义。

除叶酸外，围孕期肌醇(inositol)缺乏与NTDs发生密切相关，目前通过限制食物摄入肌醇直接建立肌醇缺乏的NTDs动物模型尚未见成功报道，虽然Greene等在小鼠怀孕期间进行低肌醇饮食喂养已发现肌醇缺乏可导致死胎死产、发育迟缓及胚胎体重减轻等现象产生，但是并未出现NTDs及其它出生缺陷等表型，这是因为动物体内营养状况及肌醇饮食较难控制，短时间肌醇不足，动物可通过自身代偿机制，提高体内肌醇合成来满足机体的需要。而利用基因敲除构建动物模型，目前涉及到的有关基因已有200多种，但这些利用基因工程技术构建的NTDs模型有破坏基因组结构的倾向。

发明内容

本发明提供了一种获得神经管畸形小鼠模型的方法，该小鼠模型可用于神经管畸形的医学和生物学研究，有助于了解人类NTDs的病因及发病机制。

本发明第一个方面是提供一种获得神经管畸形小鼠模型的方法，包括：提供孕鼠，在胚胎发育至开始形成神经管时，对孕鼠施加抗肌醇代谢药物。

本发明第二个方面是提供一种抗肌醇代谢药物在构建神经管畸形小鼠模型中的应用，更优选为在制备构建神经管畸形小鼠模型试剂中的应用，包括：

在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。

其中，所述抗肌醇代谢药物优选为锂盐，优选为能够在小鼠体内解离出Li⁺的锂盐，更优选为包括但不限于碳酸锂、尿酸锂、枸缘酸锂、醋酸锂、溴化锂中的任意一种或几种，并优选为碳酸锂。

其中，所述孕鼠选自C57BL/6J小鼠。

其中，所述施加可以优选为注射，更优选为腹腔注射。

在本发明的一种优选实施例中，在胚胎发育7.5天时将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。

在本发明的一种优选实施例中，抗肌醇代谢药物的给药剂量选自300-370mg/kg孕鼠体重，更优选为320-350mg/kg孕鼠体重，更优选为330-350mg/kg孕鼠体重。

在本发明的一种优选实施例中，所述小鼠选自7-8周龄成年小鼠。

在本发明的一种优选实施例中，所述小鼠选自SPF级小鼠。

在本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，所述胚胎发育计算时间为：发现阴栓的第二天早晨8:00定义为孕0.5天，即胚胎发育0.5天。

在本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，剂量mg/kg或mg/kg体重均指的是mg/kg孕鼠体重。

本发明建立了肌醇代谢障碍NTDs出生缺陷小鼠模型，为进一步研究肌醇代谢障碍在NTDs发生中的作用机制提供模型。并且，本发明方法神经管畸形率高、吸收胎少、对胚胎致死率低，并且对孕鼠毒副作用小。

附图说明

图1为本发明实施例中血清肌醇代谢检测结果；

图2为Li₂CO₃引起的正常和发育异常胚胎；

图3为Li₂CO₃引起的正常和发育异常胚胎HE染色结果；图3A为正常和NTDs小鼠胚胎端脑的病理结果；图3B为正常和NTDs小鼠胚胎后脑的病理结果；a和b分别为胚胎形态；

图4为Li₂CO₃引起的神经管畸形照片，其中图4A和4B为正常胚胎侧面和背面神经管照片，4C和4D为NTDs胚胎正面和侧面神经管照片。

具体实施方式

实施例1

实验材料：

7-8周龄SPF级成年C57BL/6J小鼠适应性喂养后，将雌鼠与雄鼠按1:1或2:1的比例合笼过夜。

第二天清晨检查雌鼠阴道口有无阴栓，存在阴栓表示有过交配行为，将发现阴栓的第二天早晨8:00定为孕0.5天(E0.5天)，然后孕鼠分笼饲养，随机分为实验处理组和对照组。

在孕7.5天(E7.5天)时，给予实验组雌鼠不同剂量(100mg/kg-400mg/kg)的Li₂CO₃腹腔注射，正常对照组雌鼠给予等体积的生理盐水。

怀孕13.5(E13.5天)天时，对孕鼠进行摘眼球采血；采血后的小鼠以颈椎脱臼法处死，腹部向上置于手术台上，75％酒精消毒。沿腹中线剖腹取出妊娠子宫，将子宫成串取下置于盛有预冷PBS的培养皿中，体视显微镜下小心取出胚胎，并仔细观察每窝胚胎，记录活胎数、死胎数、吸收胎数、畸形胎数，观察体视显微镜下可见的畸形情况。

一、Li₂O₃剂量实验

在100mg/kg-400mg/kg区间进行剂量条件实验。表1，表2反映了交配后E7.5天腹腔注射不同剂量Li₂CO₃，在E13.5天取材时观察到的胚胎发育情况。

表1结果显示Li₂CO₃剂量在250mg/kg、300mg/kg和400mg/kg均出现畸形胚胎，畸形表型包括无眼畸形和NTDs，其中300mg/kg剂量的畸形比率最高为12.1％。Li₂CO₃剂量在250mg/kg和300mg/kg体重小鼠的存活率差异不大，分别为69.6％和63.6％，而在400mg/kg剂量的小鼠存活率有上升的趋势，因此最佳建模剂量应在250mg/kg和400mg/kg之间。

表1，Li₂CO₃剂量对构建NTDs模型的影响(括号内为百分比)

剂量(mg/kg体重)	胚胎数	正常数(％)	吸收胎数(％)	畸形数(％)
					400	29	21(72.4)	7(24.1)	1^*(3.4)
300	33	21(63.6)	8(24.2)	3^#、1^*(12.1)
					250	23	16(69.6)	6(26.1)	1^*(4.3)
200	12	9(75.0)	3(25.0)	0
					100	11	9(81.8)	2(18.2)	0
0	34	32(94.1)	2(5.9)	0

表1中，*表示无眼畸形，#表示神经管畸形(NTDs)

表2，建立小鼠模型最佳剂量(括号内为百分比)

表2中，*表示眼部畸形；#表示唇裂；§表示发育迟缓；&表示颜面畸形

表2结果显示Li₂CO₃剂量在250mg/kg、300mg/kg、330mg/kg和350mg/kg体重时，随着药物剂量增加，胚胎畸形率的比率出现增高的趋势，350mg/kg体重组畸形率的比率明显增高，达到了50％。然而，Li₂CO₃剂量在370mg/kg和400mg/kg体重时，畸形率的比率却出现下降趋势。350mg/kg体重组NTDs的发生率最高，达到了26.7％，其他畸形的发生率也高于其他实验组，且无死胎。

选择Li₂CO₃ 350mg/kg体重剂量作为造模剂量，并进行了重复试验，结果如表3所示，各批次之间差异不显著(P>0.05)。说明此剂量的重复性好。

表3，Li₂CO₃ 350mg/kg体重剂量诱导NTD重复实验结果(括号内为百分比)

表3中，*表示眼部畸形；#表示唇裂；§表示发育迟缓；&表示颜面畸形

另外，孕鼠未发现毒副作用导致死亡。

实施例2

参照实施例1，CD-1孕鼠在孕8天(E8天)时，注射Li₂CO₃，300mg/kg体重剂量以下，未发现对孕鼠的明显毒副作用，给药剂量350mg/kg体重时，孕鼠出现毒副作用导致死亡率13.3％，如表4所示。

表4，不同剂量Li₂CO₃对CD-1孕鼠毒副作用

剂量(mg/kg体重)	注射孕鼠数量	孕鼠死亡数
			200	15	0
300	20	0
			350	15	2
400	15	5

表5，300mg/kg体重剂量Li₂CO₃对神经管畸形的影响

剂量(mg/kg体重)	吸收胎比例	神经管畸形发生率
			E8天注射	30％	13％

表5也证明了锂盐能够用于构建神经管畸形模型，但是相比于实施例1中的C57BL/6J小鼠，CD-1小鼠神经管畸形发生率明显更低一些，而且吸收胎比例相对较高。另外，锂盐对CD-1孕鼠毒副作用更强。

二、小鼠模型鉴定

为了确定Li₂CO₃抑制IMPase活性后肌醇的代谢水平，本研究应用GC-MS技术检测了实施例1中E7.5天母鼠在腹腔注射Li₂CO₃ 350mg/kg体重剂量之后，不同时间点母鼠血清中肌醇含量的改变。即检测母鼠血清在注射Li₂CO₃后0(注射Li₂CO₃前)、4、8、16h时肌醇的水平，结果如图1显示：肌醇水平在4-8h后降到最低，仅为正常血清的1/2，之后开始恢复，但在注射Li₂CO₃ 16h后，肌醇水平仍低于正常水平。

体视显微镜下观察小鼠胚胎外部发育情况，结果如图2显示。E13.5天正常小鼠胚胎(图2A为正常胚胎脊柱、B为正常胚胎侧面)外观较为饱满圆滑，头部前、中、后脑室均已形成，脊柱表面完整无裂口，神经管闭合完全，可见明显的耳泡、眼泡，尾部弯曲细长。此外，正常活胚胎在镜下可以观察到心脏搏动。畸形胚胎均有不同程度的发育迟缓，表现为身长比正常胚胎短，体重比正常胚胎低，发育迟滞，仅相当于E12.5左右的发育状态。NTDs畸形胚胎中，露脑(前脑和全脑)畸形(图2C为神经管未闭合前脑畸形、D为神经管未闭合全脑畸形)的发生率最高，可见少数NTDs表现为脊柱裂(图2E为神经管未闭合脊柱畸形)；除了NTDs外，还观察到无眼畸形(图2F)、颜面部(颅面部)畸形(图2G)和发育迟缓(图2H)。

Li₂CO₃引起胚胎神经管发育异常的病理改变结果见图3。低倍镜(40×)下，正常对照组小鼠神经管发育良好，管腔形状规则，神经上皮的内、外界膜平整，神经管均闭合，已经分化为明显的端脑、中脑和后脑，且神经管周围的间充质细胞分布均匀密集(图3A中a-1、图3B中a-1)。露脑畸形小鼠胚胎端脑虽然已经分化发育，但是端脑神经管完全没有闭合，神经腔面不平整，管壁薄厚不一致，各脑室形状不规则，同时中脑神经管也未闭合(图3A中b-1)；正常胚胎后脑室为规则菱形，而露脑畸形胚胎的后脑顶板未融合，呈“一字”腔室形状，仅被一层羊膜和间质所包裹(图3B中b-1)。

在100×和200×放大倍数下，正常神经管的神经上皮细胞和间质层细胞排列整齐紧密，且神经上皮室管膜边缘整齐，未见有脱落的细胞(图3A和3B中的a-2、a-3)。而NTDs神经上皮细胞和间质层细胞排列紊乱，细胞核小，神经上皮室管膜边缘不整齐，可见有脱落的细胞，并且存在多处血管破裂，血细胞外渗进入中胚层结构，这种病理变化在端脑表现的尤为显著，且端脑神经管未闭合程度更严重(图3A和3B中的b-2、b-3)。病理结果显示，肌醇缺乏可能影响神经管Closer2或前后脑神经孔融合更严重，导致畸形表型多为露脑畸形。

为了进一步验证，采用体式显微镜观察胚胎发育第9.5天时神经管发育状态，结果如图4所示。相比于正常胚胎(图4A和B)，NTDs胚胎神经管发育明显出现畸形(图4C和D)。

综上所述，本发明构建神经管畸形小鼠模型的方法，能够获得理想的小鼠模型，畸形率高、重复性好，对孕鼠毒副作用小，对胚胎致死率低。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种获得神经管畸形小鼠模型的方法，其特征在于，包括：

提供孕鼠，在胚胎发育至开始形成神经管时，对孕鼠施加抗肌醇代谢药物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在胚胎发育7.5天时将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孕鼠选自C57BL/6J小鼠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗肌醇代谢药物为能够在小鼠体内解离出Li⁺的锂盐。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述锂盐为碳酸锂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述施加为腹腔注射。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抗肌醇代谢药物的给药剂量选自300-370mg/kg孕鼠体重。

9.一种抗肌醇代谢药物在构建神经管畸形小鼠模型中的应用，其特征在于，包括：在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述锂盐为碳酸锂，并且在胚胎发育7.5天时施加给C57BL/6J小鼠；抗肌醇代谢药物的给药剂量选自300-370mg/kg孕鼠体重。