CN109771647A - Dna甲基转移酶抑制剂在构建神经管畸形小鼠模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鼠神经管畸形模型的构建方法，在孕鼠胚胎神经管发育过程中，将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型；该小鼠模型可用于神经管畸形的生物医学研究，有助于神经管畸形的病因学及发病机制的研究，尤其是研究神经管畸形相关的所有分子和细胞的机制提供了良好的动物模型。本发明方法操作简单，可行性强，效果稳定，致畸率高。

Description

DNA甲基转移酶抑制剂在构建神经管畸形小鼠模型中的应用

技术领域：

本发明属于应用基础医学研究领域，涉及一种制备神经管畸形小鼠模型的方法，尤其涉及一种DNA甲基转移酶抑制剂的应用，以及使用该抑制剂构建神经管畸形小鼠模型的方法。

背景技术：

神经管畸形是人类最常见、最严重的出生缺陷性疾病之一，它是由于在胚胎发育过程中，神经管闭合不全所引起的一组缺陷，包括无脑畸形、脑膨出和脊柱裂等,虽然目前已经发现了大量与神经管畸形发生相关的因子，但其作用机制大都不是很清楚，这给针对性的预防和治疗神经管畸形带来了很大的困难，以发病机理为基础的预防和治疗方面的研究也受到了极大的限制。构建合适的神经管畸形动物模型，有助于有效地认识人类神经管畸形的发生发展规律，了解其病因、发病机制和病理特点，对孕前合理的预防干预减少神经管畸形的发生具有非常重要的意义。

神经管畸形是由遗传因素与环境因素共同作用而导致的复杂的多基因遗传病，大量研究发现叶酸缺乏和神经管畸形密切相关，补充0.4-4.0mg/d的叶酸能预防大约50-70％的神经管畸形的发生，但叶酸代谢异常诱发神经管畸形及补充叶酸预防神经管畸形发生的机制并不清楚。叶酸是合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的前体，SAM为机体甲基化的甲基供体。叶酸缺乏及代谢异常导致甲基供体缺乏，使胚胎发育早期定格的DNA甲基化模式发生改变，从而可能产生表观基因组(epigenome)损伤。大量研究已经证实DNA甲基化异常是各种出生缺陷以及肿瘤发生的原因之一，同时也是神经管畸形发展的重要因素。

本项目的研究宗旨是通过抑制母体DNA甲基转移酶进而影响机体的甲基化水平从而产生甲基化代谢异常的神经管畸形小鼠，影响基因组的稳定性，并进一步验证甲基化水平的异常与神经管畸形发生的关系。本发明所述DNA甲基转移酶抑制剂用于制备构建神经管畸形小鼠模型，迄今尚未见有相关报道。本发明的目的是，提供一种DNA甲基转移酶抑制剂在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种DNA甲基转移酶抑制剂在构建神经管畸形小鼠模型中的应用。

所述应用，是在孕鼠胚胎神经管发育过程中，将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

所述应用，是在孕鼠胚胎神经管发育过程中，将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠，DNA甲基转移酶抑制剂通过捕获DNA甲基转移酶，特异性抑制DNA甲基化，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

其中，所述DNA甲基转移酶抑制剂为5-阿扎胞苷。

其中，DNA甲基转移酶抑制剂的给药剂量为1-3mg/kg孕鼠体重，优选为1-2mg/kg，更优选为1.25mg/kg。

其中，所述孕鼠来源于近交系C57BL/6J小鼠。

其中，所述孕鼠为7-8周龄，19-21g成年小鼠

其中，所述孕鼠为SPF级小鼠。

其中，所述孕鼠为怀孕小鼠。

其中，所述给予方式为注射方式，优选为腹腔注射。

其中，DNA甲基转移酶抑制剂的干预时间点涵盖影响神经管发育的整个阶段，从孕6天到孕10.5天，最佳干预时间点在胚胎发育7.5-8天时将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠。

优选的，本发明所述应用，在孕鼠胚胎发育7.5-8天时，将1.25mg/kg的5-阿扎胞苷给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

本发明的另一个目的在于提供神经管畸形小鼠模型的构建方法。

本发明所述的构建方法，是在孕鼠胚胎神经管发育过程中，将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

其中，DNA甲基转移酶抑制剂选用胞苷的核苷类似物5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)。

其中，DNA甲基转移酶抑制剂的给药剂量为1-3mg/kg孕鼠体重，优选为1-2mg/kg，更优选为1.25mg/kg。

其中，所述孕鼠来源于近交系C57BL/6J小鼠。

其中，所述孕鼠为7-8周龄，19-21g成年小鼠

其中，所述孕鼠为SPF级小鼠。

其中，所述孕鼠为怀孕小鼠。

其中，所述给予方式为注射方式，优选为腹腔注射。

其中，在胚胎发育0.5-10天时将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠。优选，在胚胎发育7.5-8天时将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠。

优选的，本发明所述的构建方法，在孕鼠胚胎发育7.5-8天时，将1.25mg/kg的5-阿扎胞苷给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，所述胚胎发育计算时间为：发现阴拴的第二天早晨8：00定义胚胎发育0.5天，即孕0.5天。

本发明提供了一种获得神经管畸形小鼠模型的方法，该小鼠模型可用于神经管畸形的医学和生物学研究，有助于了解人类神经管畸形的病因及发病机制

本发明上下文内容中，没有特别说明情况下，剂量mg/kg体重均指的是mg/kg孕鼠体重。

本发明建立甲基化异常神经管畸形小鼠模型，进一步研究甲基化水平异常在神经管畸形发生中的作用机制提供模型。并且，本发明方法神经管畸形率高，致死率底，效果稳定，操作简单易行。

附图说明：

图1-正常胎鼠与神经管畸形胎鼠形态学观察其中：A-正常胚胎；B,C-露脑畸形(后脑)；D-颅面畸形。

图2-正常小鼠胚胎与神经管畸形小鼠胚胎HE染色其中：A-正常胎鼠后脑组织HE染色(50×)；B-神经管畸形的胎鼠后脑组织HE染色(50×)图3-血清中DNA甲基转移酶的检测结果

具体实施方式：

下面结合本发明实例的中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行描述，所描述实施例仅为本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1实验动物模型的建立

实验动物的使用遵循中华人民共和国卫生部令(第55号)-医学实验动物管理实施细则，遵循首都儿科研究所医学实验动物管理委员会章程。7-8周，体重19～21g SPF级C57BL/6J小鼠，繁殖饲料喂养，常规饮水。在晚6:00以1:1雌雄鼠合笼后，于第二天早上检查到阴拴者记为孕0.5天，孕鼠随机分为实验组和对照组，在孕7.5-8.5天，实验组孕鼠给予0.5mg/kg-3mg/kg剂量范围的5-阿扎胞苷溶液腹腔注射；正常对照组孕鼠给予等体积的生理盐水。孕13.5天时，断颈处死，剖腹取出妊娠子宫，放入盛有PBS(PH7.4)的培养皿，在体视显微镜下剥离出胎鼠，观察其畸形情况并拍照，计算致畸率。取正常胚胎和畸形胚胎固定于10％的中性甲醛进行固定。

实验结果表明,3mg/kg剂量组吸收胎高于80％，随着剂量的降低，吸收胎比例逐渐降低，1.25mg/kg剂量组吸收胎比例最低,小于10％，神经管畸形的比例最高，为最佳的造模剂量。畸形的大体表型如图1所示，A图是正常胚胎；B、C图是露脑畸形；D图是颅面部畸形。

实施例2病理形态学检查

2.1组织块包埋和切片

1)将固定好的胚胎组织取出流水过夜冲洗。

2)酒精梯度脱水：将组织块依次置于70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精各1.5h。

3)二甲苯透明：将脱水后的组织块依次置于二甲苯Ⅰ30min，二甲苯Ⅱ30min，直至标本完全透明。

4)组织块浸蜡：将透明后的胚胎组织浸入已熔化的石蜡Ⅰ2h，石蜡Ⅱ2h；。

5)组织块包埋：将浸蜡的胚胎组织块的待切面向下垂直放入包埋盒，加入已融化的100％石蜡，用镊子迅速调整组织块的位置，平放于冰上使石蜡迅速凝固。

6)切片：将组织块置于组织切片机上，进行调整后开始切片，切片厚度为5μm，将石蜡薄切片放于摊片机的水面上(水温40℃)，使其伸展；用载玻片进行捞片使延展完好的石蜡切片贴在玻片上，做好标记，60℃烘烤2h。

2.2HE染色

1)脱蜡至水：将待染色的石蜡切片脱蜡至水。

2)苏木素染色：将脱水后的石蜡切片置于苏木素染色液中10min，冲洗。

3)分化：将苏木素染完色的石蜡切片置于1％盐酸酒精中进行分化15s，

4)返蓝：将分化后的石蜡切片置于1％氨水返蓝30s。

5)酒精脱水：将返蓝后的石蜡切片分别置于75％、85％的酒精中各2min。

6)伊红染色：将脱水后的石蜡切片置于0.5％伊红染色液中1min。

7)脱水：将伊红染色后的石蜡切片分别置于如下酒精溶液中进行脱水，95％酒精Ⅰ5min，95％酒精Ⅱ5min，100％酒精Ⅰ5min，100％酒精Ⅱ5min。

8)透明：将脱完水的石蜡切片置于二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，进行透明。

9)封片：取中性树胶滴入载玻片的组织上，盖盖玻片，尽量避免产生气泡。

10)光学显微镜下观察结果。

镜下观察，结果如图2所示，胚胎后脑的形态学呈现改变。

HE染色结果显示，对照组胚胎神经管发育良好，管腔规则，神经上皮的内外界膜平整，细胞的排列规则整齐密集。神经管畸形胚胎的后脑发育异常，其结构紊乱，不规则。

实施例3DNA甲基转移酶活性检测将试剂盒中的标准品按照实验需要进行稀释，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。温育，洗涤。每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min.每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

酶活性结果显示：DNA甲基转移酶的活性随着药物干预后的时间延长而降低，在12h达到最低，干预后48小时该酶的活性仍低于正常对照组。

实施例4不同抑制剂构建神经管畸形动物模型的比较

近年来国内外学者从流行病学、遗传学、表观遗传学、细胞生物学及分子生物学等方面对叶酸缺乏引起神经管畸形的发病机制进行了大量的研究，也取得了很大的进展，提示表观遗传学的改变是其重要的发病机制之一，但详细机制尚不清楚。迄今为止，尚未见到通过单纯食物控制，制备成功叶酸缺乏导致NTDs动物模型的报道。根据叶酸在体内的代谢途径可知，叶酸是DNA代谢活动所必需的微量营养素，其代谢主要涉及DNA合成和DNA甲基化两个重要的生物化学过程：(1)叶酸以不同氧化态分别进入嘌呤合成、参与由dUMP合成dTMP的过程；(2)叶酸是合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的前体，SAM为机体的甲基化的甲基供体。本课题组依据叶酸的代谢规律，通过干扰叶酸的相关代谢模拟叶酸缺乏的状态，利用实施例1所述的方法通过抑制不同酶的活性而干扰叶酸相关代谢构建神经管畸形的动物模型，从表1，2可见不同的抑制剂均成功的构建出神经管畸形的动物模型，产生的畸形类型基本相同。本发明与其他构建的神经管畸形的模型相比，抑制的是DNA甲基转移酶，干预从S-腺苷甲硫氨酸转(SAM)化为S-腺苷同型半胱氨酸的过程，SAM是体内DNA、RNA、蛋白质甲基化和活性甲基化小分子的甲基供体。因此抑制DNA甲基转移酶，可使甲基循环受到抑制，从而使DNA、RNA、蛋白质、脂质及磷脂的甲基化受阻，严重影响神经管闭合及胎儿的生长发育，从而引起出生缺陷的发生。除此之外，本发明的用药剂量为1.25mg/kg体重，神经管畸形的发生率为51.61％，从数值上，与其他三种抑制剂相比，剂量低，畸形率高。

表1不同抑制剂构建神经管畸形模型情况

表2比较不同抑制剂构建神经管模型的情况

名称	最佳剂量(mg/kg)	抑制位点	畸形率	神经管畸形发生率
					5-阿扎胞苷	1.25	DNA甲基转移酶	93.55％	51.61％
甲氨喋呤	4.5	二氢叶酸还原酶	100％	31.4％
					5-氟尿嘧啶	12.5	胸苷酸合成酶	92.3％	42.31％
雷替曲塞	11.5	胸苷酸合成酶	96.88％	34.40％

Claims (10)

1.DNA甲基转移酶抑制剂在构建神经管畸形小鼠模型中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基转移酶抑制剂为5-阿扎胞苷。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，DNA甲基转移酶抑制剂的给药剂量为1-3mg/kg孕鼠体重，优选为1-2mg/kg，更优选为1.25mg/kg。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述给予方式为注射方式，优选为腹腔注射。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在孕鼠胚胎神经管发育过程中，将DNA甲基酶转移酶抑制剂给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

6.一种神经管畸形小鼠模型的构建方法，其特征在于，是在孕鼠胚胎神经管发育过程中，将DNA甲基转移酶抑制剂给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基转移酶抑制剂为5-阿扎胞苷。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，DNA甲基转移酶抑制剂的给药剂量为1-3mg/kg孕鼠体重，优选为1-2mg/kg，更优选为1.25mg/kg。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述给予方式为注射方式，优选为腹腔注射。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在孕鼠胚胎发育7.5-8天时，将1.25mg/kg的5-阿扎胞苷给予孕鼠，造成胎鼠甲基化代谢异常，从而建立神经管畸形小鼠模型。