CN107287151A

CN107287151A - 一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法

Info

Publication number: CN107287151A
Application number: CN201710460505.XA
Authority: CN
Inventors: 车景敏; 卢永波
Original assignee: Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-18
Filing date: 2017-06-18
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2037-06-18
Also published as: CN107287151B

Abstract

本发明公开了一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，使用人表皮角质形成细胞的培养基作为基础液，分别配置培养基a和培养基b；将角质形成细胞与黑素细胞分别采用培养基a制成细胞悬液，分别接种到均匀接种到Transwell小室中，再加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养1~5天，形成含黑色素细胞的表皮层结构；将其置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养5~15天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。该方法模型稳定性高，黑素细胞对外界的刺激更为灵敏，可准确用于化妆品的安全与功效评价的检测，同时原料成本低，制作周期短，稳定性良好，可大量生产。

Description

一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法

技术领域

本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法。

背景技术

皮肤是最大的人体器官，由外向内大致可分为3层：表皮层、真皮层和皮下组织。表皮层包括角质层和基底层，其中，角质层是皮肤的最外层，能耐受一定的物理、化学、机械性伤害，对内部组织起保护作用。基底层是表皮层的最底层，由基底细胞和黑色素细胞构成。黑素细胞在皮肤细胞中发挥着防御者的作用，黑素细胞通过生成黑素颗粒抵御紫外线以及环境污染对皮肤的伤害作用。

化妆品、药品等产品上市前都要进行大量的测试以保障产品的安全性与功效性。传统的功效性评价是使用动物进行。然而，动物实验本身存在如试验评分主观性强、结果重复性差、动物和人之间的种属差异等弊端均影响对待测样品正确评价。3R理论的提出以及国内外对3R研究的迅速发展，不再以动物模式为基础的评价方法成为的生物医学研究的重要方向。欧盟甚至制定法规来禁止销售采用动物做实验的产品和原料，这对体外检测的研究发展发挥着关键的推动作用。

“一白遮百丑”一直是爱美人士的对皮肤的追求，这使得美白化妆品在化妆品市场占有重要的地位。目前对于美白化妆品的安全以及功效评价是基于动物模型如豚鼠进行验证，但是随着欧盟对动物实验的严令禁止，美白化妆品的安全与功效评价成为的化妆品上市前的一大难题。所以急需开发一种能够评价美白化妆品安全与功效的皮肤模型填补漏洞，并最终完成美白功效性验证。

专利CN101538555A公开了一种采用I型胶原与成纤维细胞制备的真皮层类似物，然后接种角质形成细胞、黑色素细胞，并通过体外培养制备出功能性色素等同物。这种方法所制备的皮肤模型包含真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型含有的真皮层中的细胞外基质主要来源于其他动物如牛，而且影响角质形成细胞从培养基中汲取营养成分，导致后期表皮的生发只含有1层或是两层，这与人的表皮结构存在很大差异，并且难应用于长期稳定的检测中。

专利FR2689904和WO95/10600公开了一种含有角质形成细胞和黑素细胞的表皮类似物，但是模型在构建过程中使用的黑素细胞是具有TPA诱导，而TPA是一种致癌性物质，它的存在会影响黑素细胞的生长以及影响后期模型的生发。

专利CN105353114A公开了一种包含成纤维细胞，黑素细胞以及角质形成细胞共建的色素模型。这种构建方法所制备的皮肤模型含有真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型的真皮层只含有成纤维细胞，这样不利于成纤维细胞没有影响物质的供给，无法进行伸展以及基质的分泌，最终导致真皮层死亡，而表皮层与培养基之间存在空隙，最终导致表皮层不能接触营养物质导致死亡。

专利CN1493367A公开了一种可调节分泌的组织工程皮肤，此皮肤模型中包含角质形成细胞、成纤维细胞和黑素细胞。但是此制备的模型应用于临床损伤修复，模型过大并且没有形成封闭的空间而不利于化妆品以及药品的检测。

专利CN103983762A公开了一种含有黑素细胞和角质形成细胞的皮肤模型，这种皮肤模型的构建过程中，黑素细胞和角质形成细胞按照一定的比例接种到支架上，但是黑素细胞比角质形成细胞贴壁时间长，导致后期模型形成过程中，黑素细胞不位于表皮的基底层，这与人的皮肤结构存在很大的差异。

以上公布的皮肤模型，在其生长过程中使用的培养基都含有影响黑色素形成的物质如维生素C、维生素E等，而维生素C对黑素的形成具有还原作用，最终对评价结果产生一定的影响作用。

从以上的分析中可以看出，虽然现在已有相关的黑色素模型被开发，但是这些模型的种子细胞以及组织形态与天然皮肤的结构具有一定的差异性，对后期评价中存在一定的局限性。结合目前人们对药物及化妆品的长期功效具有较高的要求。因此，建立具有高稳定性的黑色素皮肤模型具有较好的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，解决了利用现有方法构建的皮肤测试模型不适用于人们对药物及化妆品的长期功效评价的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：配制培养基

使用人表皮角质形成细胞的培养基作为基础液，分别配置培养基a和培养基b；

培养基a：在基础液中添加对黑色素细胞促进黑色素生成的生长因子，制成基础培养基a；培养基b：以培养基a为基础液，添加促进表皮复层化的氯化钙，制成基础培养基b；

步骤二：表皮层的构建

将角质形成细胞与黑素细胞分别采用培养基a制成细胞悬液，分别接种到均匀接种到Transwell小室中，再加入培养基a进行浸没式培养，37℃、5%CO₂培养箱中培养1~5天，形成含黑色素细胞的表皮层结构；

步骤三、含黑色素的皮肤测试模型表皮层后期培养

将步骤三中含黑色素细胞的表皮层结构置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，使液面与表皮层结构的表面平齐，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养5~15天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。

本发明的特点还在于：

进一步地，上述基础液为模型培养所特有的细胞培养液—KC-Growth，培养液a为在KC—Growth（1L）中添加促细胞生长的特殊因子配制而成，配制好的培养液a中各因子的浓度分别为，氢化可的松0.2-0.8μg/mL，胰岛素0.8-1.8μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子0.05-0.15ng/mL，牛脑垂体提取物10~100μg/mL；培养液b以培养基a为基础液，添加促进表皮复层化的氯化钙配制而成，配制好的培养液b中氯化钙的浓度为0.47-0.6mmol/L。

进一步地，步骤2表皮层的构建前，先使用25μg/mL~75μg/mL的多聚赖氨酸对Transwell培养小室底膜进行过夜包被，可以解决黑素细胞贴壁性差的因素，提高贴壁效率。

进一步地，Transwell培养小室采用四周固定、底膜具有微孔结构的碳酸脂膜的小室，与传统的浸没式培养相比，表皮层的构建建立于具有微孔结构的培养小室薄膜上并进行浸没式培养，这样的培养方式更有利于角质形成细胞与黑素细胞从培养基中汲取营养成分，对表皮细胞的增殖分化以及发育生长提供了丰富的营养以及适宜的微环境，可提高模型的稳定性。

进一步地，将角质形成细胞与黑素细胞分别接种到均匀接种到Transwell小室中采用分步接种方式，所述分步接种方式为以下任一种：（1）先接种黑色素细胞，再接种角质形成细胞；（2）先接少量的角质形成细胞，一定时间后接种黑色素细胞，最后再接种角质形成细胞的方式。

进一步地，采用所述接种方式（1）时，接种黑色素细胞后先在37℃、5%CO₂培养箱中预培养，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再接种角质形成细胞；采用所述接种方式（2）时，先将接种的角质形成细胞在37℃、5%CO₂培养箱中预培养0.5小时，再接种黑素细胞，再在37℃、5%CO₂培养箱中预培养，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再最后接种角质形成细胞。两种接种方式都模拟了自然皮肤中黑素细胞位于表皮基底层的表皮干细胞之间，最终形成与自然皮肤相似的表皮结构。

更进一步地，采用所述接种方式（1）时，黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30；采用所述接种方式（2）时，先接种的角质形成细胞与黑素细胞的接种比例为1:10~1:1，黑色素细胞与最后接种的角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30。通过上述的皮肤模型两种细胞的接种比例可以模拟人体皮肤中黑素细胞与角质形成细胞的比例以及不同人种的两种细胞的比例。

更进一步地，步骤2所述黑色素细胞与角质形成细胞接种的细胞总密度为2~10×10⁶个/cm²。

本发明所构建的皮肤测试模型培养时间大大缩短，并且结构与真实皮肤的相似，具有清晰可见的复层化结构，包含基底层，棘层，颗粒层和角质层，并且黑素细胞位于基底层，分布于角质形成细胞中，并且在表皮的不同层可以看到清晰可见的黑素颗粒。

本发明所构建的黑色素皮肤检测模型后期培养稳定性好。在培养过程中，培养小室底层PC膜和基底层的细胞紧密连接，并可防止表皮层的收缩，更重要的是培养小室是相同外径的半封闭状态，作为化妆品功效的检测工具，更有利于检测的平行性与稳定性。本发明的检测模型不仅具有检测化妆品的功效，而且具有制作简单、成本低、产品稳定的优点。

本发明的色素皮肤模型，由于收缩率微乎其微，表皮层复层化结构含有黑素细胞成分，并且能合成和分泌黑色素，构建出的颜色有三种，与三种人的肤色相似，所以在美白化妆品的检测中主要功能有：（1）美白化妆品对黑素形成的抑制作用；（2）美白原料物的筛选评价；（3）化妆品对皮肤的安全性评价；（4）防晒化妆品的功效评价。本发明的色素皮肤模型可准确用于化妆品的安全与功效评价的检测。

与已有的皮肤模型相比，本发明的色素皮肤模型具有以下优点：可以通过不同比例的黑素细胞与角质形成细胞的接种比例形成不同色度的皮肤模型，以此模拟不同人种的皮肤，更加准确地反映针对不同人种的化妆品的美白以及防晒功效的评价。本发明的色素皮肤模型在整个培养过程中没有影响黑素细胞形成黑色素的成分，保证的模型中黑素细胞形成黑素颗粒的能力，提高了模型的稳定性。本发明的色素皮肤模型只含有黑素细胞以及角质形成细胞，这使得黑素细胞对外界的刺激更为灵敏，使化妆品功效与安全的快速准确检测得到保证。本发明的原料成本低，制作周期短，稳定性良好，可大量生产，所制备的色素皮肤模型可准确用于化妆品的安全与功效评价的检测。

附图说明

图1是本发明实施例提供的原代培养后传代培养第3代的黑素色细胞的镜下形态照片；

图2是本发明实施例提供的多聚赖氨酸处理小室底膜后黑素细胞贴壁改变的对比统计图；

图3是本发明实施例提供的不同接种方式的色素皮肤模型的表观图；

图4是本发明实施例提供的不同接种方式色素皮肤模型的组织学图片；

图5是本发明实施例提供的黑素细胞与角质形成细胞不同接种比的色素皮肤模型的表观图；

图6是本发明实施例提供的黑素细胞与角质形成细胞不同接种比的色素皮肤模型的组织学图片；

图7是本发明实施例提供的培养基（含有维生素C）与模型培养基（不含维生素C）的模型表观图；

图8是本发明实施例提供的色素皮肤模型体外检测化妆品的外观图；

图9是本发明实施例提供的色素皮肤模型体外检测化妆品的黑素含量图；

图10是本发明实施例提供的色素皮肤模型体外检测化妆品的黑素颗粒分布图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于这些实施方式。

其中，本发明的说明书中的术语“上”、“中”和“下”是一种基于附图的相对概念，用于区别不同对象，而不是用于限定特定顺序。

以下实施例所使用的原代黑色素细胞和角质形成细胞均来源于包皮环切术的正常皮肤组织，原代黑色素细胞的获取及传代详见刘源的《构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究》，得到的黑色素细胞见附图1，图片中显示的黑色素细胞具有较好的细胞状态，黑色素细胞胞核透光性好，细胞树突分支较少（树突量<3个），黑色素细胞分级为3级，具有较好的细胞活性及生物学功能。角质形成细胞的获取及传代详见马英智的《人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定》。

同时，以下实施例均使用人表皮角质形成细胞的培养基（KC-Growth）作为基础液，分别配置培养基a和培养基b。

培养基a：以KC-Growth为基础液（1L），添加对形成细胞增殖有重要作用的因子氢化可的松0.2-0.8μg/mL，胰岛素0.8-1.8μg/mL，牛脑垂体提取物10~100μg/mL；以及对添加对黑色素细胞（以下简称黑素细胞）生成黑色素具有重要作用的因子如碱性成纤维细胞生长因子0.05-0.15ng/mL；制成基础培养基a。

培养基b：以培养基a为基础液（1L），添加对角质形成细胞分化具有重要作用的氯化钙0.47-0.6mmol/L，制成基础培养基b。

实施例1 一种含黑色素的体外皮肤测试模型的构建

本实施例提供的培养基a：以KC-Growth为基础液（1L），添加对形成细胞增殖有重要作用的因子氢化可的松0.2μg/mL，胰岛素1.8μg/mL，牛脑垂体提取物100μg/mL；以及对添加对黑色素细胞（以下简称黑素细胞）生成黑色素具有重要作用的因子如碱性成纤维细胞生长因子0.05ng/mL；制成基础培养基a。

培养基b：以培养基a为基础液（1L），添加对角质形成细胞分化具有重要作用的氯化钙0.47mmol/L，制成基础培养基b。

本实施例的皮肤测试模型的构建，依下述步骤进行：

步骤一、含黑色素的皮肤测试模型表皮层的构建

采用浓度为25~75μg/mL的多聚赖氨酸进行小室底部的包被，实验显示，多聚赖氨酸包被可以解决黑素细胞贴壁性差的因素，与不进行包被预处理相比，贴壁效率提高了40%（附图2），将第3代或第4代黑色素细胞采用培养基a制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数）接种到Transwell小室进行皮肤模型的构建，首先将黑素细胞均匀接种到小室中，在37℃，5%CO₂培养箱中预培养5小时，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，将体外培养的第6代或第7代的角质形成细胞采用培养基a制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数），并接种到黑素细胞的上层，其中表皮层的构建中黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:10，接种的细胞总密度为5×10⁶cells/cm²，加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养2天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。

步骤二、含黑色素的皮肤测试模型表皮层后期培养

将步骤二中未成熟的表皮结构的体外测试皮肤模型置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，使液面与皮肤模型表面平齐，每天换液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养5-15天，本实施例选择12天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。

实施例2 一种含黑色素的体外皮肤测试模型的构建

本实施例培养基a、b同实施例1。

本实施例的皮肤测试模型的构建，依下述步骤进行：

步骤一、含黑色素的皮肤测试模型表皮层的构建

采用浓度为25~75μg/mL的多聚赖氨酸进行小室底部的包被，将体外培养的第6代或第7代的角质形成细胞采用培养基a制成细胞悬液接种到小室中，角质形成细胞与黑素细胞的接种比例为1:10~1:1，本实施例选择1:5。然后将接种了角质形成细胞的小室在37℃，5%CO₂培养箱中预培养0.5小时，然后将第3代或第4代黑素细胞采用培养基a制成细胞悬液接种到小室中（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数），在37℃，5%CO₂培养箱中预培养3小时，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再将体外培养的第6代或第7代的角质形成细胞采用培养基a制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数）接种黑素细胞的上层，其中黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30，本实施例选择1:10，接种的细胞密度为5×10⁶cells/cm²，加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养2天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。

步骤二、含黑色素的皮肤测试模型表皮层后期培养

将步骤二中未成熟的表皮结构的体外测试皮肤模型置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，使液面与皮肤模型表面平齐，每天换液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养12天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。

含黑色素的皮肤测试模型的后期鉴定

对实施例1、2所构建的含黑色素的皮肤测试模型进行表观拍照，黑素含量检测并进行多聚甲醛溶液固定，包埋，脱水，切片，行HE染色，观察其结构（见附图3-4）。附图3结果显示：在黑素细胞与角质形成细胞相同比例的前提下，先接种黑素细胞，再接种角质形成细胞（图中A），或先接种角质形成细胞，再接种黑素细胞，最后再接种角质形成细胞（图中B），这两种不同的接种方式并不会影响后期黑素细胞的分泌黑素颗粒，以及皮肤的颜色。附图4结果显示：这两种接种方式所构建的黑色素的体外皮肤测试的模型的表皮层均是包含基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层结构的结构层次分明的表皮层结构。

实施例3 一种含黑色素不同肤色的体外皮肤测试模型的构建

本实施例培养基a：以KC-Growth为基础液（1L），添加对形成细胞增殖有重要作用的因子氢化可的松0.8μg/mL，胰岛素1.2μg/mL，牛脑垂体提取物50μg/mL；以及对添加对黑色素细胞（以下简称黑素细胞）生成黑色素具有重要作用的因子如碱性成纤维细胞生长因子0.15ng/mL；制成基础培养基a。

培养基b：以培养基a为基础液（1L），添加对角质形成细胞分化具有重要作用的氯化钙0.6mmol/L，制成基础培养基b。

本实施例的皮肤测试模型的构建，依下述步骤进行：

步骤一、含黑色素的不同肤色的皮肤测试模型表皮层的构建

采用浓度为25~75μg/mL的多聚赖氨酸进行小室底部的包被，将体外培养的第6代或第7代的角质形成细胞与第3代或第4代黑色素细胞采用培养基a分别制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数）接种到小室进行皮肤模型的构建，其中表皮层的构建中黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例分别按照1:4，1:10，1:30的比例接种（都采用先接种黑素细胞再接种角质形成细胞），接种的细胞密度为10×10⁶cells/cm²，加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养2天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。

步骤二、含黑色素的不同肤色的皮肤测试模型表皮层后期培养

含黑色素的不同肤色的皮肤测试模型的后期鉴定

对本实施例所构建的含黑色素的皮肤测试模型进行表观拍照，黑素含量检测并进行多聚甲醛溶液固定，包埋，脱水，切片，行HE染色，观察其结构（见附图5-6），图5为黑素细胞与角质形成细胞不同接种比的色素皮肤模型的表观图（A表示1:4，B表示1:10，C表示1:30），其结果显示：不同的接种比例会形成不同亮度的皮肤模型。图6为黑素细胞与角质形成细胞不同接种比的色素皮肤模型的组织学。其结果显示：不同的接种比例的色素皮肤模型，三种表皮层的各层都含有不同的黑素颗粒，随着接种比例的增大黑素颗粒变多。

实施例4 一种含黑色素不同肤色的体外皮肤测试模型的构建

培养基a：以KC-Growth为基础液（1L），添加对形成细胞增殖有重要作用的因子氢化可的松0.5μg/mL，胰岛素0.8μg/mL，牛脑垂体提取物10μg/mL；以及对添加对黑色素细胞（以下简称黑素细胞）生成黑色素具有重要作用的因子如碱性成纤维细胞生长因子0.15ng/mL；制成基础培养基a。

培养基b：以培养基a为基础液（1L），添加对角质形成细胞分化具有重要作用的氯化钙0.5mmol/L，制成基础培养基b。

本实施例的皮肤测试模型的构建，依下述步骤进行：

步骤一、含黑色素的不同肤色的皮肤测试模型表皮层的构建

采用浓度为25~75μg/mL的多聚赖氨酸进行小室底部的包被，将第3代或第4代黑色素细胞分别采用培养基a1（含有维生素C），培养基a2(不含有维生素C)制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数）接种到小室进行皮肤模型的构建，首先将黑素细胞均匀接种到小室中，在37℃，5%CO₂培养箱中预培养5小时，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，将体外培养的第6代或第7代的角质形成细胞采用培养基a1或a2制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数），并接种到黑素细胞的上层，其中表皮层的构建中黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30，优选1:10接种的细胞密度为1×10⁶cells/cm²，加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养5天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。

将步骤二中未成熟的表皮结构的体外测试皮肤模型置于培养器皿内的培养支架表面，分别加入培养基b1(含有维生素C)，培养基b2(不含有维生素C)进行气液面培养，使液面与皮肤模型表面平齐，每天换液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养5-15天，本实施例选择12天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。

含黑色素的不同肤色的皮肤测试模型的后期鉴定

对本实施例所构建的含黑色素的不同肤色的皮肤测试模型进行表观拍照，黑素含量检测并进行多聚甲醛溶液固定，包埋，脱水，切片，行HE染色，观察其结构（见附图7，其中A不含Vc，B含Vc），结果显示：使用含维生素C培养基构建的色素皮肤模型的表观颜色明显比使用不含维生素C构建的色素皮肤模型表观颜色浅。

实施例5 一种含黑色素的体外皮肤测试模型的构建

本实施例培养基a、b同实施例4。

本实施例的皮肤测试模型的构建，依下述步骤进行：

步骤一、含黑色素的皮肤测试模型表皮层的构建

采用浓度为5~75μg/mL的多聚赖氨酸进行小室底部的包被，将3代黑色素细胞采用培养基a制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数）接种到小室进行皮肤模型的构建，首先将黑素细胞均匀接种到小室中，在37℃，5%CO₂培养箱中预培养5小时，待黑素细胞完全贴壁，体外培养的7代的角质形成细胞采用培养基a制成细胞悬液（悬液总量＝每个小室接种量（100~300μL）×小室个数），并接种到黑素细胞的上层，其中表皮层的构建中黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:10，接种的细胞密度为5×10⁶cells/cm²，加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养1天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。

步骤二、含黑色素的皮肤测试模型表皮层后期培养

将步骤二中未成熟的表皮结构的体外测试皮肤模型置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，使液面与皮肤模型表面平齐，每天换液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养10天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。

含黑色素的皮肤测试模型的后期鉴定

黑色素模型构建完成后，进行UVB暴露（50mJ/cm²），然后进行采用氢氧化钠提取法(见徐宝军《天然产物增白作用的初步筛选》)进行黑色素的提取，并用酶联免疫印迹法检测黑色素含量的变化趋势，观察黑色素模型后期的反应情况。对照组为不进行UVB照射的结果，UVB组为每天采用UVB照射(剂量为50mJ/cm²)，UVB+样品组（化合物）为每天采用UVB照射(剂量为50mJ/cm²)并在培养基中加入功效性原料进行功效验证。结果见附图8-10，图8上排为气液面0天的皮肤模型，中排为气液面3天的皮肤模型，下排为气液面9天的皮肤模型，其结果显示：含黑色素的体外皮肤模型在受到外界刺激后会产生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成。图9结果与表观结果较吻合显示：含黑色素的体外皮肤模型在受到外界刺激后会产生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成。图10结果与表观以及黑素含量检测结果吻合显示：含黑色素的体外皮肤模型在受到外界刺激后会产生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成以及转移。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims

1.一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：配制培养基

步骤二：表皮层的构建

将角质形成细胞与黑素细胞分别采用培养基a制成细胞悬液，分别接种到均匀接种到Transwell小室中，再加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养1~5天，形成含黑色素细胞的表皮层结构；

步骤三、含黑色素的皮肤测试模型表皮层后期培养

2.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，所述基础液为KC-Growth细胞培养液，培养液a为在KC—Growth中添加促细胞生长的特殊因子配制而成，配制好的培养液a中各因子的浓度分别为，氢化可的松0.2-0.8μg/mL，胰岛素0.8-1.8μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子0.05-0.15ng/mL，牛脑垂体提取物10~100μg/mL；培养液b以培养基a为基础液，添加促进表皮复层化的氯化钙配制而成，配制好的培养液b中氯化钙的浓度为0.47-0.6mmol/L。

3.根据权利要求1或2所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2表皮层的构建前，先使用25μg/mL ~75μg/mL的多聚赖氨酸对Transwell培养小室底膜进行过夜包被。

4.根据权利要求1或2所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，步骤2所述将角质形成细胞与黑素细胞分别接种到均匀接种到Transwell小室中采用分步接种方式，所述分步接种方式为以下任一种：（1）先接种黑色素细胞，再接种角质形成细胞；（2）先接少量的角质形成细胞，一定时间后接种黑色素细胞，最后再接种角质形成细胞的方式。

5.根据权利要求4所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，采用所述接种方式（1）时，接种黑色素细胞后先在37℃、5%CO₂培养箱中预培养，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再接种角质形成细胞；采用所述接种方式（2）时，先将接种的角质形成细胞在37℃、5%CO₂培养箱中预培养0.5小时，再接种黑素细胞，再在37℃、5%CO₂培养箱中预培养，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再最后接种角质形成细胞。

6.根据权利要求5所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，采用所述接种方式（1）时，黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30；采用所述接种方式（2）时，先接种的角质形成细胞与黑素细胞的接种比例为1:10~1:1，黑色素细胞与最后接种的角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30。

7.根据权利要求1或2所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，步骤2所述黑色素细胞与角质形成细胞接种的细胞总密度为2~10×106个/cm²。