CN111073844A - 一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,包括以下步骤:(1)体外构建3D皮肤模型插件;(2)体外2D皮肤细胞培养物制备;(3)皮肤单器官芯片的装配和维持培养;(4)给药或染毒;(5)采样、换液和检测。该方法通过微流控技术,结合传统的细胞培养和组织工程技术,在体外构建一种组织和多种细胞的皮肤单器官芯片,可以实现皮肤器官在体外的长期、动态培养。

Description

一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法
技术领域
本发明属于皮肤细胞培养技术领域,具体涉及一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,也是人体与外界环境隔离的屏障。一方面防止有害物质侵入人体,另一方面也起到一定的吸收和代谢功能。传统的皮肤研究以离体皮肤、皮肤细胞为主要研究材料,离体皮肤虽具有天然皮肤的结构和功能,较常用的离体皮肤来自于猪和鼠,而来自人体的皮肤受到伦理和供体差异的极大限制。体外培养的皮肤细胞,如角质细胞、成纤维细胞等,在体外可维持一定的结构功能,具有通量高、操作简便、培养稳定等优点,但其培养周期较短、细胞层次单一、细胞容易老化、给药方式与人体存在一定的差异,仅在二维水平进行单层细胞培养,其结果外推具有不确定性。组织工程技术结合细胞培养技术发展起来的重组人皮肤类似物,也称为3D皮肤模型。这种在体外重组具有三维结构的皮肤组织,一定程度上解决了离体皮肤和体外皮肤细胞培养的局限性,在给药方式上也更接近人体皮肤的实际情况。目前已经有商品化的多种3D皮肤模型,用于替代传统的动物实验进行皮肤相关毒性测试、药物研究和皮肤生物学机制研究。
目前的皮肤模型只含有一种或两种细胞,即仅实现了表皮、真皮和全皮(表皮-真皮)模型的稳定构建,而含有黑色素、免疫细胞、感觉神经元、皮脂腺、汗腺和毛发的复杂皮肤模型还没有成熟的技术,而缺少了后者的皮肤模型,其实用性受到很大局限。另一方面,目前的皮肤模型多数在静态条件下进行培养制备或应用,只能够作为一种短期(一般为7天)的测试系统,无法长期培养,也不能用于慢性或亚慢性的毒性和药理研究。
以微流控技术为核心发展起来的器官/组织芯片,是通过精准控制液体流速,模拟人体循环,将不同细胞、组织或器官连接起来,形成一种动态的培养环境,一方面给药或染毒方式更接近人体的实际情况,另一方面可以对细胞、组织和器官的相互作用进行研究,从整体上反映毒物或药物的作用机制。从简单的单器官芯片、双器官芯片,到复杂的多器官芯片,可用于复杂的研究和检测。如皮肤-肺-肝-肾的仿生理四器官芯片系统,模拟构建了外源化学物的吸收、分布、代谢和排泄的过程,可用于毒物动力学(ADME)研究。
可见,基于微流控制下的器官芯片系统接近人体实际情况,科学性有了本质提升;芯片的微型化设计,减少成本消耗,便于高通量操作;采用来源于人体的组织材料,减少了结果外推到人的不确定性;采用多孔设计,可以集成2种以上的细胞,研究多种细胞间的相互作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,该方法通过微流控技术,结合传统的细胞培养和组织工程技术,在体外构建一种组织和多种细胞的皮肤单器官芯片,可以实现皮肤器官在体外的长期、动态培养。
本发明的上述目的可以通过如下技术方案来实现的:一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,包括以下步骤:
(1)体外构建3D皮肤模型插件:采用插入式装置培养制备或选取市售的表皮、真皮或全皮3D皮肤模型插件;
(2)体外2D皮肤细胞培养物制备:采用人来源的离体皮肤细胞,体外制备2D培养物;
(3)皮肤单器官芯片的装配和维持培养:所述皮肤单器官芯片包括培养室a和培养室b,培养室a和培养室b之间通过管道相连接,所述管道中设有培养液和微流控动力系统,将3D皮肤模型插件置于培养室a中,将2D皮肤细胞培养物置于培养室b中,设定微流控动力系统参数,将皮肤单器官芯片置于细胞培养环境下长期培养,同时设置对照组;
(4)给药或染毒:以人体皮肤实际局部接触外源物质的情形为加样方式,或模拟静脉注射外源物质的方式加样;
(5)采样、换液和检测:采用隔天更换1/3-2/5体积培养液的方式,定量分析取出的培养液,实验期间观察细胞和组织形态;实验结束后,取3D皮肤模型插件、2D皮肤细胞检测分析其与活性、毒性相关的基因、蛋白或代谢的关键参数的变化。
在上述皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法中:
优选的,步骤(1)中所述插入式装置为插入式培养皿,所述表皮、真皮或全皮3D皮肤模型插件的原料来源于人来源的离体皮肤分离细胞,所述离体皮肤分离细胞包括但不限于角质细胞或成纤维细胞。
优选的,市售的表皮、真皮或全皮3D皮肤模型插件,可以是商品化购置的三维重建人体皮肤,如Episkin、EpiDerm、SkinEthic和Altskin,包括表皮、真皮、含表皮和真皮的全层皮肤替代物。
优选的,3D皮肤模型插件还可以是实验室制备的3D皮肤模型,采用从儿童或成人来源的皮肤(符合伦理,如手术后遗弃)分离制备细胞,如角质细胞和成纤维细胞。其中,采用插入式培养皿,将角质细胞接种于插入式培养皿的支持膜上,通过7-14天气液界面培养可形成具有多层角质细胞的3D表皮模型插件;其中,采用插入式培养皿,在皿底放置多孔海绵或胶原薄膜,将成纤维细胞接种于薄膜中,经过5-10天培养,成纤维细胞可融合进入多孔海绵或胶原薄膜支架内部形成3D类真皮结构。
由于市售模型有它的缺陷,例如3D全皮模型中没有黑色素细胞、免疫细胞、感觉神经元和皮脂腺细胞等,因此在实验中可以将这些细胞联系在一起来真实模拟人体皮肤。另外,3D全皮模型没有办法对其中的单一类型细胞做检测,如果有些指标需要测定成纤维细胞的胞内物变化时,实际操作时的最佳做法是选用3D表皮模型,然后连接成纤维细胞来进行实验。
因此,优选的,步骤(2)中所述离体皮肤细胞包括角质细胞、成纤维细胞、黑色素、免疫细胞、感觉神经元、皮脂腺汗腺和毛发中的一种或几种。
即采用步骤(1)中的3D皮肤模型插件和步骤(2)中的2D皮肤细胞培养物可以真实模拟人体皮肤。
优选的,步骤(3)中所述皮肤单器官芯片为市售或自制材料,所述微流控动力系统包括空压机,所述空压机通过压缩空气驱动管道中的培养液流动。
作为本发明一种优选的实施方式,步骤(3)中所述单器官皮肤芯片可实验室自己制备,也可以商业化购买。单器官皮肤芯片结构可以分为2个培养室,其中一个培养室用于植入3D皮肤模型插件,其直径为1~4cm,另一个培养室用于植入2D培养的皮肤黑色素细胞、免疫细胞、神经元或皮肤附属器官(皮脂腺、汗腺)等,其直径为1~3cm,两个培养室通过管道连接,管径500~1300μm,培养液在气体推动作用下可在管道内循环。
优选的,步骤(3)中将3D皮肤模型插件置于培养室a中,先加入培养液,然后将3D皮肤模型插件植入,移除多余培养液,避免培养液进入模型表面,然后将3D皮肤模型插件下压使所述3D皮肤模型插件的底部与培养液接触,并固定。
作为本发明的一种优选的实施方式,步骤(3)中皮肤单器官芯片的装配中3D皮肤模型插件植入时,取出单器官皮肤芯片,无菌条件下开启培养室a,先加入600~1000μL培养液,再将3D皮肤模型插件植入,移除多余的培养液,约200~400μL,避免培养液进入3D皮肤模型插件表面,再次将模型下压,3D皮肤模型插件底部与培养液接触,使其固定。
优选的,步骤(3)中将2D皮肤细胞培养物置于培养室中前,先制备2D皮肤细胞的单一细胞悬液,调整细胞密度为0.5~5×104个/mL,然后将单一细胞悬液加入培养室b中,然后静置于培养箱中4~5个小时,待细胞贴壁后,更换为新鲜培养液。
作为本发明的一种优选的实施方式,步骤(3)中将2D皮肤细胞培养物置于培养室中前,先制备2D皮肤细胞的单一细胞悬液,调整细胞密度为0.5~5×104个/mL,无菌条件下开启培养室b,然后将100~600μL单一细胞悬液加入培养室b中,静置于培养箱中4~5个小时,待细胞贴壁后,更换为新鲜培养液。
皮肤单器官芯片中培养液在管道中的流动依赖于精准的控制系统,通过压缩空气,驱动管道中的液体流动。
优选的,步骤(3)中设定微流控动力系统参数为:设置压力范围为+300~400mbar,真空范围为-300~400mbar,设置频率20~60bpm/min,即每分钟系统控制液体泵动20-60次;设置液体流向为顺时针或逆时针。
优选的,步骤(3)中长期培养时,将皮肤单器官芯片置于CO2培养箱中培养,调节温度为36~38℃,饱和湿度,CO2的体积百分含量为3.5~7.5%。
优选的,步骤(3)中所述对照组是指对3D皮肤模型插件和2D皮肤细胞培养物进行常规静态共培养,或仅对3D皮肤模型插件进行常规静态培养,或仅对2D皮肤细胞培养物进行常规静态培养。
作为本发明的一种优选的实施方式,对照组是指仅用插入式培养方式进行3D皮肤模型与2D细胞的常规静态共培养,或仅有2D细胞的常规培养,或仅有3D组织的常规培养。
优选的,步骤(4)中通过培养室a的加样方式为模拟皮肤局部给药方式加样,通过培养室b的加样方式为模拟静脉注射方式加样,加样为一次性给药,模拟皮肤单次暴露的过程给药;或加样为2-5次多次给药,模拟多次暴露的过程,多次暴露的样品浓度与第一次相同或不相同,但不能超过第一次的浓度,其中培养室a的单次加样量为1-10μL,培养室b的单次加样量为100-200μL。
可以采用模拟皮肤局部给药方式加样给3D皮肤模型插件,或采用类似静脉注射的方式2D皮肤细胞培养物进行加样,选择任意一种即可。
优选的,步骤(4)中所述外源物质包括与皮肤接触后进入体内,并且有生物活性导致一定生物学作用的化学物质。包括但不限于化妆品原料、化妆品、药物、PM2.5等。
优选的,步骤(5)中采样、换液时,从培养室a中取样150-200μL,并更换新鲜培养液150-200μL,从培养室b中取样30-80μL,并更换新鲜培养液30-80μL,取出的培养液用于检测;检测包括:在倒置显微镜下每天观察细胞形态,并拍照记录和分析;对每次取出的培养液进行细胞因子、酶含量的分析,检测培养液中的样品及其可能的代谢产物;取出培养室a中的3D皮肤模型插件进行组织学切片和染色分析、细胞活性分析、屏障功能分析或基因表达分析;用胰酶消化培养室b中的2D皮肤细胞培养物,离心后对细胞特征染色进行形态分析、基因表达分析。
上述所列的检测指标是可预计的,可选择的,可根据需求进行上述检测指标选择。
本发明具有如下有益效果:
(1)本发明所使用的材料均源于人体,具有良好的相关性;
(2)本发明通过整合多种皮肤细胞,结合了3D和2D两种培养模式,构建多细胞的皮肤单器官芯片,可研究细胞间相互作用;
(3)本发明通过微型化仿生装置,在动态环境下进行微流控制培养,具有能够长期维持的优点,且接近人体实际的生理情况;
(4)本发明所构建的皮肤单器官芯片,可以研究外源化学物对皮肤的作用,适用于长期毒理、药理作用的研究。
附图说明
图1是实施例1-2中皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法的流程示意图;
图2是实施例1中培养液中IL-1α水平变化情况;
图3是实施例1中培养液中PGE-2水平变化情况;
图4是实施例1中培养液中LDH水平变化情况;
图5是实施例2中细胞MTT水平变化;
图6是实施例2中THP-1细胞表面标志物活性;
图7是实施例2中细胞内ROS水平变化。
具体实施方式
以下实施例中采用的各原料,如无特殊说明,均为市售产品。
如图1中的示意图所示,本发明中的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,包括以下步骤:
(1)体外构建3D皮肤模型插件:采用插入式装置培养制备表皮或真皮3D培养插件,如表皮、真皮或全皮,或直接购买市售的3D皮肤模型插件;
(2)体外2D皮肤细胞培养物制备:采用不同于步骤(1)中的人来源的离体皮肤细胞,体外制备2D培养物,包括角质细胞、成纤维细胞、黑色素、免疫细胞、感觉神经元和皮脂腺等;
(3)皮肤单器官芯片装配和维持培养;装配3D皮肤与2D皮肤细胞于皮肤单器官芯片中,设定微流控动力学参数,将含有组织和细胞的芯片置于细胞培养环境下长期培养;以常规2D皮肤细胞、3D皮肤组织或两者的静态共培养为对照组。
(4)给药/染毒:以人体皮肤实际局部接触外源物质的情形为首选加样方式,也可以模拟静脉注射的方式加样,定期更新培养液时可以重复加样过程。
(5)采样换液和检测:采用隔天更换1/3~2/5体积的培养液的方式,定量分析取出的培养液;实验期间观察细胞和组织形态;实验结束后,取3D皮肤模型、2D细胞检测分析与活性、毒性相关的基因、蛋白和代谢的关键参数的变化。可根据研究需要设计采样的时间点和检测参数。
步骤(1)体外构建3D皮肤模型插件,可以是实验室制备的3D皮肤模型,采用从儿童或成人来源的皮肤分离制备细胞,如角质细胞和成纤维细胞。其中,采用插入式培养皿,将角质细胞接种于培养皿的支持膜上,通过7~14天气液界面培养可形成具有多层角质细胞的3D表皮模型;其中,采用插入式培养皿,在皿底放置多孔海绵或胶原薄膜,将成纤维细胞接种于薄膜中,经过5~10天培养,成纤维细胞可融合进入支架内部形成3D类真皮结构。
步骤(1)体外构建3D皮肤模型插件,可以是商品化购置的三维重建人体皮肤,如Episkin、EpiDerm、SkinEthic和Altskin,包括表皮、真皮、含表皮和真皮的全层皮肤替代物。
步骤(2)体外2D细胞培养物制备:是指采用人来源的皮肤或相关组织分离除不同于步骤(1)中的皮肤细胞,体外制备2D培养物,包括角质细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、免疫细胞、感觉神经元和皮脂腺细胞等。
步骤(3)皮肤单器官芯片装配和维持培养:所述单器官皮肤芯片可实验室自己制备,也可以商业化购买。芯片结构分为2个培养室,其中一个培养室用于植入3D皮肤模型,其直径为1~4cm,另一个培养室用于植入二维培养的皮肤黑色素细胞、免疫细胞、神经元或皮肤附属器官(皮脂腺、汗腺),其直径为1~3cm,两个培养室通过管道连接,管径500~1300μm,培养液在气体推动作用下可在管道内循环。
步骤(3)皮肤单器官芯片装配和维持培养:所述单器官芯片的装配中皮肤模型的植入,取出芯片,无菌条件下开启培养室a,先加入600~1000μL培养液,再将皮肤模型植入,移除多余的培养液,约200~400μL,避免培养液进入模型表面。再次将模型下压,模型底部与培养液接触,使其固定。
步骤(3)皮肤单器官芯片装配和维持培养:所述单器官芯片的装配中2D皮肤细胞的植入:分别常规制备单一细胞悬液,调整细胞密度0.5~5×104/mL,无菌条件下开启培养室b,加入细胞悬液,100~600μL。静置于培养箱中4~5个小时。待细胞贴壁后,更换为新鲜培养基。
步骤(3)皮肤单器官芯片装配和维持培养:皮肤芯片中培养液在管道中的流动依赖于精准的控制系统。通过压缩空气,驱动管道中的液体流动。控制系统参数设置:设置压力范围为+300到400mbar,真空范围为-300到400;设置频率20~60bpm/min,即每分钟系统控制液体泵动20~60次;设置液体流向为顺时针或逆时针。
单器官芯片的维持培养是指将皮肤芯片置于CO2培养箱中培养,温度36~38℃,饱和湿度,CO2浓度3.5~7.5%(体积分数)。
步骤(3)实验对照组,指仅用插入式培养方式进行3D皮肤模型与2D细胞的静态共培养,或仅有2D细胞的常规培养,或仅有3D组织的常规培养。
步骤(4)给药或染毒:可以采用培养室a加样(模拟皮肤局部给药)和培养室b加样(模拟静脉注射)两种方式。
步骤(4)给药或染毒:可以一次性给药,模拟皮肤单次暴露的过程;也可以2~5次多次给药,模拟多次暴露的过程,多次暴露的样品浓度可以与第一次相同或不相同,但不能超过第一次的浓度,取样量为培养室a 150~200μL,培养室b取样30~80μL。
步骤(5)采样、换液和检测:采样操作与培养液更换同步,从培养室a和培养室b取样后等量更换为新鲜培养液,取出的培养液用于分析。
步骤(5)采样、换液和检测:检测可能包括:在倒置显微镜下每天观察细胞形态,并拍照记录和分析;对每次取出的培养液进行细胞因子、酶含量的分析、检测培养液中的样品及其可能的代谢产物;直接取出培养室a的插入皿,对支持膜上的3D皮肤模型进行组织学切片和染色分析、细胞活性分析、屏障功能分析或基因表达分析;用胰酶消化培养室b的2D细胞,离心后对细胞特征染色进行形态分析、基因表达分析等。
其中步骤(1)~步骤(5)中的时间可不严格按照图1中的时间,图1中的时间是推荐的较佳的时间顺序。
以下以两个具体的实施例案例来说明本申请中的利用皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法的具体过程:
实施例1利用皮肤单器官芯片检测化学品单次皮肤刺激后的恢复作用
1、试验材料
1.1皮肤模型:商品化的表皮模型Episkin,购自上海斯安肤诺生物科技有限公司。
1.2人真皮成纤维细胞:原代培养。
1.3培养试剂:高糖DMEM,含有10%FBS,PBS。
1.4化学品:质量体积比为1%的SDS溶液。正式实验前先进行预实验,保证化学品导致表皮模型的组织活性约在(40±5)%的范围内,过高或过低要调整SDS的浓度。
2、试验过程。
2.1体外构建3D皮肤模型插件
3D皮肤模型插件为商品化采购的表皮模型,实验前一天送达实验室,去除保护琼脂,转移至含有300μLDMEM培养液的24孔板中,培养过夜。
2.2体外2D细胞培养物制备
取符合伦理要求的成人来源离体皮肤,原代分离培养成纤维细胞。取5~11代细胞进行试验。
2.3皮肤单器官芯片的装配和培养
2.3.1芯片支架预处理
取双器官芯片,打开培养室a,移除原有PBS,加入600μL培养基,关闭培养室a。打开培养室b,移除原有PBS,加入300μL培养基,关闭培养室b。换液完成后,开启控制系统,接入气体管道,设置参数:压力范围320mbar,真空范围-320mbar;设置频率30bpm/min,设置液体流向顺时针。开启控制系统,将芯片置于二氧化碳培养箱中过夜。
双器官芯片支架为市售,微流控动力系统包括空压机,空压机通过压缩空气驱动管道中的培养液流动。
2.3.2皮肤芯片装配
取出芯片,打开培养室a,加入600μL培养液,将(2.1)中3D皮肤模型插件转移至培养室a,移除多余液体,剩余约400μL,继续将模型放置平稳。将(2.2)中培养好的成纤维细胞制备成细胞悬液,调整细胞密度为2×104/mL。取出芯片,打开培养室b,移除原有培养液,加入300μL细胞悬液。返回培养箱培养3h后,移除原培养液加入300μL新鲜培养液。
在CO2培养箱中培养时,调节温度为36~38℃,饱和湿度,CO2的体积百分含量为3.5~7.5%即可。
2.4加样
打开培养室a,直接将3μL浓度为1%的SDS溶液加入3D皮肤模型插件表面。关闭培养室a,重新连接控制系统,置于培养箱中作用30分钟,30分钟后取出芯片,断开连接装置,取出插入式培养皿,用无菌水或超纯水轻轻洗去皮肤模型表面的化学品及残留,然后再将整个芯片重新联通,放入培养箱继续培养至7天。
实验对照组为静态培养的表皮模型,将相同浓度的SDS溶液加入3D皮肤模型插件表面,培养箱中作用30分钟,30分钟后取出皮肤模型,用无菌水或超纯水轻轻洗去皮肤模型表面的化学品及残留,加入新的培养基,将皮肤模型放入培养箱继续培养至7天。
2.5重复采样和换液
每48±2h换液一次。换液时,打开培养室a,收集约180μL培养液,同时补充等量的新鲜培养液;打开培养室b,收集约50μL培养基,同时补充等量的新鲜培养基。实验结束后对细胞培养液进行分析。
2.6检测和分析
2.6.1培养液分析
收集换下的液体,采用ELISA方法,检测培养液中与刺激相关的细胞因子IL-1α、PGE-2和细胞释放酶(LDH)水平等。
3结果
培养液中IL-1α水平变化情况如图2所示,培养液中PGE-2水平变化情况如图3所示,培养液中LDH水平变化情况如图4所示。
4结论
从图2-4可以看出,器官芯片组在刺激后IL-1α、PGE-2、LDH均显著升高,随后从第24小时开始下降至与刺激前水平无统计学显著差异。而静态培养组同样出现了升高和下降,但升高过程和恢复过程比较缓慢。说明皮肤单器官芯片可以更好地研究皮肤刺激后的恢复作用,通过两种细胞之间信号的传导使得表皮恢复的作用表现更明显,更能够有效模拟人体皮肤在受损伤之后的修复过程中组织之间的相互作用。
实施例2利用微流控皮肤单器官芯片测试五味子醇提高婴儿皮肤免疫力
1、试验材料
1.1婴儿皮肤:在符合伦理要求的条件下,从临床医院外科手术中获得少量婴儿皮肤。
1.2 THP-1细胞:购自美国ATCC,编号:TIB202。
1.3培养试剂:高糖DMEM,含有10%FBS,PBS。
1.4五味子醇(schisandrin),为中药五味子的提取物。
1.5培养环境:温度37±1℃,5%CO2浓度,饱和相对湿度。
2、试验过程
2.1体外构建3D皮肤模型插件;
采用机械方法分离婴儿皮肤的表皮和真皮,取表皮部分用常规方法分离角质细胞,将角质细胞接种于24孔插入式培养皿(市售)的支持膜上,膜的孔径为0.4μm,用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养7天,第10-12天改用气液界面培养,形成具有多层角质结构的3D表皮模型插件。
2.2体外2D细胞培养物制备
取人来源的树突状细胞THP-1,采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,培养液含300μg/mL谷氨酰胺、0.05mMβ-巯基乙醇和20μg/ml庆大霉素。取3-8代细胞进行试验。
2.3婴儿型皮肤单器官芯片的装配和培养
2.3.1皮肤单器官芯片预处理
取皮肤单器官芯片,打开培养室a,移除原有PBS,加入600μL培养基,关闭培养室a。打开培养室b,移除原有PBS,加入300μL培养基,关闭培养室b。换液完成后,开启控制系统,接入气体管道,设置参数:压力范围320mbar,真空范围-320mbar;设置频率50bpm/min,设置液体流向顺时针。开启控制系统,将芯片置于二氧化碳培养箱中过夜。
2.3.2皮肤芯片装配
试验前一天,将制备好的3D皮肤模型插件转移至含有300μL培养液的24孔板中,培养过夜。
取出芯片,打开培养室a,加入600μL培养液,将皮肤模型转移至培养室a,移除多余液体,剩余约400μL,继续将模型放置平稳。将培养好的THP-1细胞制备成细胞悬液,调整细胞密度为2×104/mL。取出芯片,打开培养室b,移除原有培养液,加入300μL细胞悬液。
2.4加样
实验前准备五味子醇的储备液,浓度为20mM。实验时加样浓度为25μM、50μM和75μM三个浓度。加样时,打开培养室a,将3μL样品直接加入皮肤模型表面。关闭培养室a,重新连接控制系统,置于培养箱中进行培养。
2.5采样和换液
每两天进行皮肤芯片采样和换液,第2天到第14天共换液7次。打开培养室a,收集约180μL培养基,同时补充等量的新鲜培养基;打开培养室b,收集约80μL培养基,收集前,芯片应静置约2~3分钟使悬浮的细胞沉积于培养室底部,避免吸到细胞,同时补充等量的新鲜培养基。实验结束后,收集培养室b中的THP-1细胞。取下培养室a中的表皮模型,进行后续分析。
实验对照组为采用插入式培养方式,表皮模型与THP-1细胞的静态共培养,因静态培养的最长时间(7天),为实验结束时间,其它操作与器官芯片操作类似。
2.6检测和分析
2.6.1培养液分析
收集换下的液体,采用ELISA方法,检测培养液中细胞因子IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-13、IFN-γ的水平。
2.6.2细胞和组织分析
2.6.2.1用MTT法检测表皮模型的细胞活性;
2.6.2.2用流式细胞法检测THP-1细胞表面标志物的变化,包括CD54、CD86、HLA-DR;
2.6.2.3用超声波裂解细胞,用流式细胞仪检测ROS的含量。
3结果
3.1培养液细胞因子水平
五味子醇暴露后的器官芯片中细胞因子IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-13、IFN-γ的含量相对稳定,未出现波动。但共培养组的这些因子含量呈现显著性波动,另外整体有下降趋势。说明共培养模型同器官芯片模型相比,细胞/组织间关系模拟较弱,尤其是细胞之间相互调节能力。
3.2细胞和组织活性
3.2.1皮肤模型活性
图5中的MTT结果显示,三个浓度下细胞增殖活性与共培养模型相比,均差异极显著(P<0.01)。说明器官芯片模型中细胞活性远远优于共培养模型。因此器官芯片可进行长期培养实验,更好地模拟人体代谢过程。
图6中的三个浓度下THP-1细胞表面分子CD86、CD54的表达与空白对照相比,均有统计学差异。但HLA-DR在三个浓度下无显著差异,而CD86和CD54在三个浓度下出现增长趋势,但皮肤单器官芯片组不同浓度之间的波动较小,与共培养组相比,标志物的水平偏低,表明免疫细胞的耐受性更加稳定。
3.2.3胞内ROS含量
如图7所示,同空白对照相比,器官芯片组细胞内的ROS含量显著降低;而共培养组的含量在低浓度时有显著下降,但在高浓度反而升高。因此皮肤单器官芯片组比共培养组有更好的浓度适应性,细胞内自由基水平低,抗氧化和抗京派能力较共培养组有明显改善。
4结论
五味子醇作为一种细胞营养保护剂,能通过皮肤模型的作用间影响免疫细胞,使其抗应激能力提高,细胞内ROS显著降低。使用器官芯片培养方式与共培养方式相比,皮肤模型和免疫细胞均能耐受更高的浓度,细胞ROS水平更低,细胞表面标志的变化更小,皮肤模型的活性更高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围。本发明虽然仅列举了部分植物提取物、刺激性化学品应用于皮肤单器官芯片的情况。但本发明中提到的其他受试物,如药品、有害物质、活性成份也可以用本发明所述方法进行药理、毒理、细胞间相互作用等生物学体外评价。此处不再一一列举。

Claims (10)

1.一种皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是包括以下步骤:
(1)体外构建3D皮肤模型插件:采用插入式装置培养制备或选取市售的表皮、真皮或全皮3D皮肤模型插件;
(2)体外2D皮肤细胞培养物制备:采用人来源的离体皮肤细胞,体外制备2D培养物;
(3)皮肤单器官芯片的装配和维持培养:所述皮肤单器官芯片包括培养室a和培养室b,培养室a和培养室b之间通过管道相连接,所述管道中设有培养液和微流控动力系统,将3D皮肤模型插件置于培养室a中,将2D皮肤细胞培养物置于培养室b中,设定微流控动力系统参数,将皮肤单器官芯片置于细胞培养环境下长期培养,同时设置对照组;
(4)给药或染毒:以人体皮肤实际局部接触外源物质的情形为加样方式,或模拟静脉注射外源物质的方式加样;
(5)采样、换液和检测:采用隔天更换1/3~2/5体积培养液的方式,定量分析取出的培养液,实验期间观察细胞和组织形态;实验结束后,取3D皮肤模型插件、2D皮肤细胞检测分析其与活性、毒性相关的基因、蛋白或代谢的关键参数的变化。
2.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(1)中所述插入式装置为插入式培养皿,所述表皮、真皮或全皮3D皮肤模型插件的原料为人来源的离体皮肤分离细胞,所述离体皮肤分离细胞包括但不仅限于角质细胞或成纤维细胞;步骤(2)中所述离体皮肤细胞包括角质细胞、成纤维细胞、黑色素、免疫细胞、感觉神经元、皮脂腺汗腺和毛发中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(3)中所述皮肤单器官芯片为市售或自制材料,所述微流控动力系统包括空压机,所述空压机通过压缩空气驱动管道中的培养液流动。
4.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(3)中将3D皮肤模型插件置于培养室a前,先加入600~1000μL培养液,再将3D皮肤模型植入,移除多余的培养液,200~400μL,避免培养液进入模型表面,再次将3D皮肤模型插件下压,所述3D皮肤模型插件底部与培养液接触,使其固定;步骤(3)中将2D皮肤细胞培养物置于培养室中前,先制备2D皮肤细胞的单一细胞悬液,调整细胞密度为0.5~5×104个/mL,然后将100~600μL单一细胞悬液加入培养室b中,静置于培养箱中4~5个小时,待细胞贴壁后,更换为新鲜培养液。
5.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(3)中设定微流控动力系统参数为:设置压力范围为+300~400mbar,真空范围为-300~400mbar,设置频率20~60bpm/min,即每分钟系统控制液体泵动20~60次;设置液体流向为顺时针或逆时针。
6.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(3)中长期培养时,将皮肤单器官芯片置于CO2培养箱中培养,培养箱中温度为36~38℃,饱和湿度,CO2的体积百分含量为3.5~7.5%。
7.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(3)中所述对照组时指对3D皮肤模型插件和2D皮肤细胞培养物进行静态共培养,或仅对3D皮肤模型插件进行静态培养,或仅对2D皮肤细胞培养物进行静态培养。
8.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(4)中通过培养室a的加样方式为模拟皮肤局部给药方式加样,通过培养室b的加样方式为模拟静脉注射方式加样,加样为一次性给药,模拟皮肤单次暴露的过程给药;或加样为2~5次多次给药,模拟多次暴露的过程,多次暴露的样品浓度与第一次相同或不相同,但不能超过第一次的浓度,其中培养室a的单次加样量为1~10μL,培养室b的单次加样量为100~200μL。
9.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(4)中所述外源物质包括但不限于妆品原料、化妆品、药物和PM2.5。
10.根据权利要求1所述的皮肤单器官芯片长期培养模型的制备方法,其特征是:步骤(5)中采样、换液时,从培养室a中取样150-200μL,并更换新鲜培养液150-200μL,从培养室b中取样30-80μL,并更换新鲜培养液30-80μL,取出的培养液用于分析检测;分析检测包括:在倒置显微镜下每天观察细胞形态,并拍照记录和分析;对每次取出的培养液进行细胞因子、酶含量的分析,检测培养液中的样品及其可能的代谢产物;取出培养室a中的3D皮肤模型插件进行组织学切片和染色分析、细胞活性分析、屏障功能分析或基因表达分析;用胰酶消化培养室b中的2D皮肤细胞培养物,离心后对细胞特征染色进行形态分析、基因表达分析。
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