KR102540981B1 - 인공피부 제조방법 및 인공피부 - Google Patents

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Abstract

일 구현예에 따르면, 섬유아세포 및 콜라겐을 혼합하여 진피 모사층을 형성하는 단계, 상기 진피 모사층 위에 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계, 상기 진피 모사층을 각질형성세포 배지인 제1 배지에서 배양하는 단계, 그리고 상기 제1 배지에서 배양된 진피 모사층을 DMEM 배지 및 F12 배지가 혼합된 제2 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인공피부 제조방법을 제공한다.

Description

인공피부 제조방법 및 인공피부 {PRODUCING METHOD OF ARTIFICIAL SKIN AND ARTIFICIAL SKIN}
본 기재는 인공피부를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 기재는 구체적으로 피부 색소 침착이 나타나는 인공피부의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 기재는 각질형성세포와 멜라닌형성세포를 모두 포함하는 인공피부를 제공한다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로 바깥쪽에서부터 표피, 진피 및 피하지방층의 세 개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 중층 편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다. 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어진 진피는 표피 아래에 위치하며, 진피에는 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 피하지방층은 지방세포로 구성되어 있다. 피부는 상기와 같은 다양한 세포들과 구성물질들이 상호작용하여 그 형태를 유지하며 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 나타낸다.
인공피부(artificial skin)는 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포와 각질형성세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다. 인공피부는 주로 피부와 탄력, 강도, 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체로, 피부와 같은 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이점이 있다. 인공피부는 화상, 외상 등 손상을 입은 피부의 대체(영구생착형) 또는 재생(일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라, 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 효능평가 등 다양한 영역에서 이용되고 있다.
색소 침착이 유도된 인공피부 모델은 예컨대 화장품의 미백 효능 평가에 이용될 수 있다. 피부의 색소 침착은 표피 내 멜라닌 색소의 존재에 주로 기인하는데, 멜라닌은 표피의 기저층에 위치하는 수지상 세포인 멜라닌 형성세포에 의해 합성된다. 기존에 알려진 색소 침착 인공피부는 각질형성세포와 멜라닌 형성세포를 각각 분리 배양 한 후 이를 함께 시딩(co-seeding)하여 배양함으로써 표피층의 발달을 유도시키는 방법을 이용하였다.
한편, 본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 국내등록특허공보 제10-1132578호, 국내등록특허공보 제10-1145394호, 국내공개특허공보 제10-2011-0087473호 등이 있다.
표피층을 형성함에 있어 각질형성세포와 멜라닌 형성세포를 각각 분리 배양 한 후 이들을 다시 함께 시딩(co-seeding)하는 방법은 인공피부 제작 과정을 복잡하게 만들 수 있다. 또한, 실질적으로 각질형성세포와 멜라닌 형성세포를 함께 배양할 수 있는 배양 조건을 설정하기가 어렵기 때문에, 최종 인공피부 모델에서 멜라노사이트가 온전히 존재하지 않게 되어 정상적인 색소침착 인공피부 모델로서 기능하기 어려운 문제점이 있었다.
이에, 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 각질형성세포만을 사용하여 색소 침착을 나타내는 인공피부를 제조함으로써 색소 침착된 실제 피부에 보다 근접하게 모사된 인공피부를 제공하려는 것이다.
일 구현예에 따르면, 섬유아세포 및 콜라겐을 혼합하여 진피 모사층을 형성하는 단계, 상기 진피 모사층 위에 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계, 상기 진피 모사층을 각질형성세포 배지인 제1 배지에서 배양하는 단계, 그리고 상기 제1 배지에서 배양된 진피 모사층을 DMEM 배지 및 F12 배지가 혼합된 제2 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인공피부 제조방법을 제공한다.
상기 각질형성세포는 멜라닌 형성세포의 줄기세포를 포함할 수 있다.
상기 제2 배지는 상기 멜라닌 형성세포의 줄기세포의 분화를 유도하는 성분을 함유할 수 있다.
상기 제1 배지는 상기 진피 모사층의 아래 면에 닿도록 설치되고, 상기 제1 배지가 설치된 면의 반대 면은 공기에 노출시키는 것일 수 있다.
상기 제2 배지에서의 배양 단계는 상기 제1 배지에서의 배양 단계가 종결된 후 바로 이어서 진행될 수 있다.
상기 제1 배지에서의 배양 기간 및 상기 제2 배지에서의 배양 기간의 합산은 20일 이내일 수 있다.
상기 제1 배지에서의 배양 기간은 상기 제2 배지에서의 배양 기간과 비교하여 길거나 동일할 수 있다.
상기 제2 배지는 상기 DMEM 배지 및 상기 F12 배지가 1:1 내지 4:1의 비율로 혼합된 것일 수 있다.
상기 제2 배지는 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine), 콜레라 독소(Cholera toxin), 아스코르빈산 (ascorbic acid) 및 염화칼슘(CaCl2) 중에서 선택되는 하나 또는 2 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 제2 배지에서의 배양 단계는 공기에 노출된 상태에서 진행될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 진피 모사층 및 상기 진피 모사층 위에 위치하는 표피 모사층을 포함하는 인공피부로서, 상기 표피 모사층은 상기 진피 모사층에 인접하여 있는 표피 기저층 부분 및 공기 중에 노출되어 있는 각질층 부분을 포함하고, 상기 각질층에 존재하는 각질형성세포와 상기 표피 기저층에 존재하는 멜라닌 형성세포는 동일 인간으로부터 유래한 것인 인공피부를 제공할 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 상술한 제조방법에 따라 제조된 인공피부, 또는 상술한 구조의 인공피부에 상기 색소화 조정제를 적용하는 단계, 그리고 상기 색소화 조정제가 적용된 인공피부의 색소 침착 정도와 상기 색소화 조정제가 적용되지 않은 인공피부의 색소 침착 정도를 비교하는 단계를 포함하는 색소화 조정제의 효능 평가방법을 제공할 수 있다.
상기 색소화 조정제는 상기 인공피부와 직접 접촉에 의해 적용될 수 있다.
일 구현예에 따른 제조방법은 각질형성세포들 사이에 존재하는 멜라닌형성세포의 줄기세포 분화를 유도함으로써 멜라닌 형성세포를 사용하지 않고도 색소 침착을 나타내는 인공피부를 제조할 수 있다. 상기 제조방법에 따라 제조된 인공피부는 실제 피부에 보다 근접하게 되어 피부 미백 평가용 모델로 사용할 경우 신뢰성이 향상된 평가 데이터를 제공할 수 있다.
도 1은 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법을 설명하기 위한 순서도이고,
도 2는 실시예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 H&E 조직 염색한 후의 현미경 사진이고,
도 3은 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 H&E 조직 염색한 후의 현미경 사진이다.
이하, 본 발명의 구현예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 "인공피부(artificial skin)"라 함은 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐 등을 이용하여 3차원적으로 피부를 재구성한 것을 의미하며, 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내는 고분자 복합체라면 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
본 명세서에서 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "위에" 있다고 할 때, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 어떤 부분이 다른 부분 "바로 위에" 있다고 할 때에는 중간에 다른 부분이 없는 것을 뜻한다.
이하 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법에 관하여 도 1을 참고하여 설명한다.
도 1은 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 1을 참고하면, 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 진피 모사층을 형성하는 단계(S1), 상기 진피 모사층 위에 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계(S2), 상기 진피 모사층을 제1 배지에서 배양하는 단계(S3), 그리고 상기 제1 배지에서 배양된 진피 모사층을 제2 배지에서 배양하는 단계(S4)를 포함한다.
먼저 진피 모사층을 형성하는 단계(S1)를 설명한다.
진피(dermis)는 연결 조직으로 이루어진 표피 밑의 피부 층으로, 완충작용을 하여 신체를 압력과 장력(stress and strain)으로부터 보호한다. 진피는 기저막(basement membrane)을 통해 표피와 단단히 연결되어 있다. 진피는 그 구조에 내재해 있는 혈관, 신경 등의 다양한 부속물들을 지지해주는 기질을 공급한다.
상기 진피 모사층은 실제 피부와의 인체 상관성의 관점에서 섬유아세포 및 콜라겐을 혼합한 재료를 사용하여 형성한다. 상기 진피 모사층은 2층 이상으로 구성할 수 있으며, 예컨대 포함할 수 있으며, 콜라겐을 함유하는 제1 진피층 및 섬유아세포를 함유하는 제2 진피층으로 나누어 구성할 수 있다. 이 경우 인공피부의 진피 수축 현상을 더 완화할 수 있다.
상기 제1진피층은 콜라겐을 함유할 수 있으며, 엘라스틴(Elastin), 키토산(Chitosan), 글리코사미노글루칸(GAGs; glycosaminoglycans), 히알루론산(HA; hyaluronic acid)과 같은 진피를 구성하는 세포외기질(extracellular matrix)을 더 함유할 수 있다.
상기 제2진피층은 상기 제1진피층의 상부에 위치할 수 있으며, 섬유아세포를 함유하고, 엘라스틴(Elastin), 키토산(Chitosan), 글리코사미노글루칸(GAGs; glycosaminoglycans), 히알루론산(HA; hyaluronic acid)과 같은 진피를 구성하는 세포외기질(extracellular matrix)을 더 함유할 수 있다.
사용되는 콜라겐은 소 기원, 레트 꼬리로부터 또는 어류로부터, 또는 천연 콜라겐 또는 유전 공학에 의해 생성된 콜라겐 중 임의의 다른 기원의 콜라겐일 수 있는데, 이는 섬유아세포의 존재 하에서 수축할 수 있다.
진피 모사층의 두께는 일반적으로 0.05 cm 이상, 특히 대략 0.05 내지 2 cm 이지만, 본 발명에 따른 인공피부의 유리한 특성에 손상을 주지 않는 한 증가 또는 감소될 수 있다.
상술한 바와 같이 섬유아세포 및 콜라겐을 혼합한 재료를 사용하여 진피 모사층을 제작한 후 예컨대 약 5일 내지 9일, 약 6일 내지 약 8일, 또는 약 7일간 배양할 수 있다.
진피 모사층이 형성되면 그 위에 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계(S2)를 거친다.
각질형성세포(keratinocyte)는 표피층 세포의 약 80% 내지 90%를 구성하며 표피층의 가장 깊은 층인 기저층에서의 유사분열을 통해 형성된 후 피부 표면을 향해 상층으로 올라온다.
각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계(S2)는 인공피부의 표피 모사층을 형성하기 위한 첫번째 단계로서, 여기서 사용되는 각질형성세포는 예컨대 인간으로부터 유래한 각질형성세포일 수 있다. 상기 각질형성세포는 상용되는 어떠한 각질세포라도 사용될 수 있으며, 인간으로부터 직접 분리 또는 분리된 후 배양된 각질형성세포뿐만 아니라 다른 세포로부터 유도된 각질형성세포도 사용 가능하다. 상업적으로 입수 가능한 인간 각질형성세포로는 Lonza 에서 제공하는 NHEK-Neo, Pooled(Neonatal Normal Human Epidermal Keratinocytes, Pooled: 제품번호 00192906, 조직 취득 번호 P867, 백인들), NHEK-Neo(제품번호 00192907, 조직 취득 번호: 20647, 백인), NHEK-Adult(제품번호 00192627, 조직 취득 번호: 21155, 백인), NHEK-Neo(제품번호 00192907, 조직 취득 번호: 18080, 흑인)를 들 수 있다. 그리고 Thermo Fisher에서 제공하는 HEKn (Human Epidermal keratinocytes, neonatal: 제품번호 C0015C, 조직 취득 번호 1781129, 백인), HEKn(제품번호 C0015C, 조직 취득 번호 1803827, 흑인)을 들 수 있다. 각질형성세포가 기저막(base membrane)에 붙어서 증식하는 성질을 유지하기 위해서, 디쉬는 0.1~0.2% 젤라틴 혹은 0.1~0.2 mg/ml 콜라겐 타입 IV으로 코팅해서 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세포는 35~37℃, 5~10% CO2 인큐베이터에서 배양될 수 있으며 약 70~80% 의 밀도가 되었을 때 계대 배양을 할 수 있다.
상기 각질형성세포는 예컨대 시딩(seeding)에 의해 상기 진피 모사층 위에 적용될 수 있으며, 배양 기간은 예컨대 1일 내지 4일, 1일 내지 3일, 또는 1일 내지 2일일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 각질형성세포들 사이에는 멜라닌 형성세포(melanocyte)의 줄기세포가 소량으로 포함될 수 있다. 멜라닌 형성세포의 줄기세포는 후술할 제1 배지 및 제2 배지의 배양단계를 거쳐 멜라닌 형성세포로 분화하게 된다.
각질형성세포의 적용 및 배양 단계(S2)를 거친 후 각질형성세포 배지인 제1 배지에서 배양하는 단계(S3)을 거친다.
여기서, "각질형성세포 배지"는 인간의 각질형성세포를 배양하기 위한 배지를 의미하며, 이는 당업계에 공지된 어떤 배지라도 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 각질형성세포 배지는 소 뇌하수체 추출물(Bovine Pitutary Extract, BPE), 인간의 상피성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 소의 인슐린(bovine Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 및 젠타마이신 및 암포테리신-B(GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B))을 포함하는 배지일 수 있다. 또한, 상기 성분에 에피네프린(Epinephrine) 및 트랜스페린(Transferrin)이 더 포함된 배지일 수도 있다. 상기 배지의 상업적 입수 가능한 예로서 CnT-3D-PR (CellnTEC사)를 들 수 있다.
상기 제1 배지는 상기 진피 모사층의 아래 면에 닿도록 설치되고, 상기 제1 배지가 설치된 면의 반대 면은 공기에 노출되도록 할 수 있다. 이러한 제1 배지에서의 배양은 예컨대 3일 내지 10일, 4일 내지 10일, 5일 내지 9일, 또는 4일 내지 8일의 기간 동안 진행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어서 상기 제1 배지에서 배양된 진피 모사층을 DMEM 배지 및 F12 배지가 혼합된 제2 배지에서 배양하는 단계(S4)를 거친다.
상기 혼합 배지는 상용되는 DMEM 배지 및 F12 배지가 혼합된 배지로서, 이들은 예컨대 1:1 내지 4:1 의 비율로 혼합될 수 있고, 보다 구체적으로 2:1 내지 3:1의 비율로 혼합될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. DMEM(Dubelco's modified Eagle medium) 배지는 일반적으로 사용되는 동물 세포 배양용 배지로서, 아미노산, 비타민, 무기염분, 포도당, 지질, 지시약, 혈청 등을 포함할 수 있다.
상기 제2 배지는 DMEM 배지 및 F12 배지를 총 배양액 기준으로 100%로 포함하되, 이에 추가로 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine), 콜레라 독소(Cholera toxin), 아스코르빈산 (ascorbic acid) 및 염화칼슘(CaCl2) 중에서 선택되는 하나 또는 2 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 제2 배지에서의 배양 단계는 제1 배지의 배양 단계와 마찬가지로 공기에 노출된 상태에서 진행될 수 있다.
상기 제2 배지에서의 배양 단계는 상기 제1 배지에서의 배양 단계가 종결된 후 바로 이어서 진행할 수 있으며, 배양 기간은 예컨대 4일 내지 15일, 5 내지 13일, 6일 내지 10일, 또는 7일 내지 9일의 기간 동안 진행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 상기 제1 배지에서의 배양 기간 및 상기 제2 배지에서의 배양 기간의 총 합은 예컨대 20일 이내로 조절할 수 있다. 예를 들어 상기 제1 배지에서의 배양 기간은 상기 제2 배지에서의 배양 기간과 비교하여 길거나 동일하게 설정할 수 있다.
상기 S2 내지 S4 단계를 거침에 따라 진피 모사층 위에 표피 모사층이 형성된 인공피부 구조를 얻는다.
일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 제1 배지에서의 배양 단계(S3)와 제2 배지에서의 배양 단계(S4)를 순차로 거침으로써, 그 전에 진피 모사층 위에 시딩되었던 각질형성세포들 사이에 존재하는 멜라닌 형성세포의 줄기세포를 멜라닌 형성세포로 분화시킬 수 있다.
이에 따라 상술한 방법에 따라 인공피부를 제조할 경우, 멜라닌 형성세포가 표피 기저층에 균질하게 분포하고, 이들의 분포 밀도가 진피 대체물의 표면에 대한 평행면에서 실질적으로 일정하며, 인간의 실제 피부에서 발견되는 것과 실질적으로 유사한 인공피부 모델을 얻을 수 있다.
즉, 별도로 멜라닌 형성세포를 배양하는 과정을 거치지 않고 각질형성세포에 존재하는 멜라닌 형성세포의 줄기세포 분화를 유도함으로써 각질형성세포와 멜라닌 형성세포가 유효하게 존재하는 인공피부 모델을 구현할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 진피 모사층 및 상기 진피 모사층 위에 위치하는 표피 모사층을 포함하는 인공피부로서, 상기 표피 모사층은 상기 진피 모사층에 인접하여 있는 표피 기저층 부분 및 공기 중에 노출되어 있는 각질층 부분을 포함하고, 상기 각질층에 존재하는 각질형성세포와 상기 표피 기저층에 존재하는 멜라닌 형성세포는 동일 인간으로부터 유래한 것인 인공피부를 제공한다.
상기 인공피부의 각질형성세포와 멜라닌 형성세포가 동일 인간으로부터 유래하는 것은 상기 인공피부의 제조과정에서 각질형성세포 및 멜라닌 형성세포를 따로 배양한 것이 아니라 각질형성세포 내에 존재하는 멜라닌 형성세포의 줄기세포 분화에 의해 멜라닌 형성세포를 얻었음을 의미하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 색소화 조정제의 효능 평가방법으로서, 상술한 인공피부, 또는 상술한 제조방법으로부터 얻어진 인공피부에 상기 색소화 조정제를 적용하는 단계, 그리고 상기 색소화 조정제가 적용된 인공피부의 색소 침착 정도와 상기 색소화 조정제가 적용되지 않은 인공피부의 색소 침착 정도를 비교하는 단계를 포함하는 색소화 조정제의 효능 평가방법을 제공한다.
"색소화 조정" 이란 용어는, 피부의 구성적 또는 유도적 색소화의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시키거나, 또는 감소시키거나 또는 억제함으로써 변경시키는 것을 의미한다. 상기 색소화 조정제는 색소화 증가제일수도 있고 색소화 감소제일 수도 있다.
상기 색소화 조정제는 상기 인공피부와 직접 접촉에 의해 적용되는 색소화 조정제일 수 있다. 상기 색소화 조정제는 예컨대 미백용 화장품일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통하여 상술한 본 발명의 구현예를 보다 상세하게 설명한다. 다만 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
인공피부 제작
실시예 1
(1) 1단계: 진피 모사층 제조
섬유아세포와 콜라겐을 섞어서 진피 모사층을 제작한 후 1주일간 배양하였다.
(2) 2단계: 각질형성세포 적용 및 배양 단계
상기 1단계 이후 단계 이후, 상기 진피 모사층 위에 각질형성세포 (HEKn, Thermo Fisher)를 얹고 2일간 배양하였다.
(3) 3단계: 제1 배지에서의 배양 단계
상기 2단계 이후 상기 진피 모사체의 아랫 부분에 제1 배지 (CnT-3D-PR, CellnTEC)가 닿도록 설치하고, 표피층 부분은 공기에 노출시키는 공기노출 8일간 배양하였다.
(4) 4단계: 제2 배지에서의 배양 단계
상기 3단계 이후, 제2 배지로 추가 공기노출 6일간 배양 진행하여 인공피부 모델을 얻었다. 제2 배지의 조성은 DMED 배지(Welgene, LM001-05)와 F12 배지(Welgene, LM010-01)를 2.5:1 비율로 혼합하고, 여기에 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine), 콜레라 독소(Cholera toxin), 아스코르빈산 (ascorbic acid) 및 염화칼슘(CaCl2) 을 포함한 것이다.
얻어진 인공피부 모델의 현미경 단면 사진을 도 2에 나타낸다.
비교예 1
제2 배지에서의 배양 단계(4단계)를 거치지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 하여 인공피부를 제작하였다.
얻어진 인공피부 모델의 현미경 단면 사진을 도 3에 나타낸다.
평가: 인공피부 모델의 단면 관찰
실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부 모델의 단면을 현미경으로 관찰한다.
도 2 및 3은 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 H&E 조직 염색한 후의 현미경 사진이다.
도 2 및 3을 참고하면, 인공피부를 배양하는 배지를 조절하여 각질형성 세포만을 사용하여 색소침착을 나타내는 인공피부를 제조할 수 있음을 알 수 있다. 보다 자세히 설명하면 동일한 각질형성세포를 사용했음에도 불구하고 본 발명에 의한 실시예 1에서는 표피층 기저부에 멜라닌형성세포 줄기세포로부터 분화된 멜라닌형성세포를 관찰할 수 있는 반면(도2), 일반적 방법에 의한 비교예 1에서는 표피층 기저부에서 멜라닌형성세포를 관찰할 수 없다(도3).
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예들에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구 범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리 범위에 속하는 것이다.

Claims (13)

  1. 섬유아세포 및 콜라겐을 혼합하여 진피 모사층을 형성하는 단계,
    상기 진피 모사층 위에 멜라닌 형성세포의 줄기세포를 포함하는 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계,
    상기 진피 모사층을 각질형성세포 배지인 제1 배지에서 배양하는 단계, 그리고
    상기 제1 배지에서 배양된 진피 모사층을 DMEM 배지 및 F12 배지가 1:1 내지 2.5:1의 비율로 혼합된 제2 배지에서 배양하는 단계
    를 포함하고,
    상기 진피 모사층은 제1 진피층 및 상기 제1 진피층 상에 위치하는 제2 진피층으로 구성되고,
    상기 제1 진피층은 ‘콜라겐’과 ‘엘라스틴 및/또는 키토산’을 포함하고, 상기 제2 진피층은 ‘섬유아세포’와 ‘엘라스틴 및/또는 키토산’을 포함하는
    인공피부 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에서,
    상기 제1 배지는 상기 진피 모사층의 아래 면에 닿도록 설치되고, 상기 제1 배지가 설치된 면의 반대 면은 공기에 노출시키는 인공피부 제조방법.
  5. 제1항에서,
    상기 제2 배지에서의 배양 단계는 상기 제1 배지에서의 배양 단계가 종결된 후 바로 이어서 진행되는 인공피부 제조방법.
  6. 제1항에서,
    상기 제1 배지에서의 배양 기간 및 상기 제2 배지에서의 배양 기간의 합산은 20일 이내인 인공피부 제조방법.
  7. 제6항에서,
    상기 제1 배지에서의 배양 기간은 상기 제2 배지에서의 배양 기간과 비교하여 길거나 동일한 인공피부 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에서,
    상기 제2 배지에서의 배양 단계는 공기에 노출된 상태에서 진행되는 인공피부 제조방법.
  11. 삭제
  12. 색소화 조정제의 효능 평가방법으로서,
    제1항, 제4항 내지 제7항 및 제10항 중 어느 한 항에 따라 제조된 인공피부에 상기 색소화 조정제를 적용하는 단계, 그리고
    상기 색소화 조정제가 적용된 인공피부의 색소 침착 정도와 상기 색소화 조정제가 적용되지 않은 인공피부의 색소 침착 정도를 비교하는 단계
    를 포함하는
    색소화 조정제의 효능 평가방법.
  13. 제12항에서,
    상기 색소화 조정제는 상기 인공피부와 직접 접촉에 의해 적용되는 색소화 조정제의 효능 평가방법.
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