KR20230046960A - 인공피부의 배양에서 표피층의 조직학적 완성도를 향상시키는 방법 - Google Patents
인공피부의 배양에서 표피층의 조직학적 완성도를 향상시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인공피부 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법은 1형 콜라겐(Type Ⅰ Collagen) 용액을 포함하는 기질용액을 겔화시켜 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)을 생성하는 단계, 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20) 상에, 4형 콜라겐(Type Ⅳ Collagen)을 코팅하여 코팅층(30)을 형성하는 단계, 및 코팅층(30)이 형성된 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)에 표피 각질형성세포(40)를 접종하고 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 인공피부 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인공피부모델의 배양에서 표피층의 조직학적 완성도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
피부는 신체를 감싸고 있는 넓은 기관이며, 최외곽에서부터 크게 나누어 표피층과 진피층 등 두 개의 층으로 구성되어 있다. 표피층은 적층구조를 이루고 있는 표피 각질형성세포(Epidermal Keratinocyte)가 대부분을 차지하고 있으며, 진피층은 콜라겐 섬유와 탄력섬유 등의 기질단백질 내부에 진피 섬유아세포가 포함된 기질을 기반으로 혈관, 신경, 피지샘 등이 존재한다. 피부에서는 표피층이 갖는 피부 장벽기능이 가장 중요하며, 피부 장벽기능은 외부로부터의 오염원, 자극원의 침투를 차단하여 신체를 보호하고, 신체 내부의 수분증발을 막아줌으로써 체액의 손실을 방지한다.
하기 선행기술문헌의 특허문헌에 개시된 바와 같이, 인공피부(Reconstructed human Skin, RhS)는 바닥면이 다공질의 박막(Porous Membrane)으로 구성된 특수한 배양용기(Filter Membrane Insert)를 이용하여 진피 섬유아세포(Dermal Fibroblast)를 포함하는 1형 콜라겐 기반의 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질로 구성된 진피모사체(Dermis Equivalent)를 위치시키고, 그 위를 표피세포(Epidermal Keratinocyte)로 덮은 뒤, 상층부를 공기에 노출시켜 표피세포의 분화를 유도하여 피부 장벽기능을 갖도록 성숙한 표피모사체(Reconstructed Epidermis)를 구현함으로써 제작된 피부모사체(Skin Equivalent)이다. 이러한 인공피부모델은 화상, 외상 등의 피부 손상부위를 대체하는데 이용되거나, 피부 생리연구, 특정 물질의 피부에 대한 자극 평가 또는 기능개선 효능 평가 등에서 활용되고 있다.
피부에서 표피층은 표피 각질형성세포가 분화하여 형태적 기능적 다양성을 가진 세포층이 적층된 구조를 이루어져 있으며, 이는 통상적으로 분열 및 생장하여 표피층이 존속 가능하게 하는 기저층(Stratum Basale, SB), 분화하여 변형되는 과정에 있는 유극층(Stratum Spinosum, SS)과 과립층(Stratum Granulosum, SG), 완전히 분화하여 세포막의 지질성분만 남아 지질층을 이루어 장벽기능의 큰 부분을 차지하는 각질층(Stratum Corneum, SC) 등 4개의 층으로 구분한다. 인공피부의 제작시 표피층의 구현에 있어 상기 4개 층이 모두 존재하는 적층구조를 형성하는 것이 기본적으로 충족해야 하는 조직학적 완성도의 척도이다. 각 층을 구성하는 세포의 상태에 따라 발현하는 특이적 표지자(Specific Marker)가 있으며, 해당 표지자들이 특정 세포층에서만 발현하는 것이 조직학적 완성도의 중요한 척도 중 하나이다.
그러나 인공피부모델은 배양과정에서 제조되는 진피모사체는 1형 콜라겐 단일 성분으로 구성된 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질이 주로 사용되는데, 이는 피부의 가장 중요한 기능인 장벽기능을 발휘하는 표피층의 조직학적 완성도에서 중요한 역할을 하는 기저막(Basement Membrane)의 구성 성분이 결여되어 있다. 상기 조건에서는 특히 장벽기능에 있어 중요한 표지자로 여겨지는 것으로서 로리크린(Loricrin)의 과립층 제한적 발현이 잘 관찰되지 않는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서, 인공피부 제작시 표피층이 구현되기 위해 기질로 사용하는 세포를 포함하지 않은 진피기질 또는 진피모사체에 기저막 구성 성분 중 하나인 4형 콜라겐을 추가하여 표피층의 조직학적 완성도를 보다 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인공피부 제조방법은 (a) 1형 콜라겐(Type Ⅰ Collagen) 용액을 포함하는 기질용액을 겔화시켜 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질을 생성하는 단계; (b) 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질 상에, 4형 콜라겐(Type Ⅳ Collagen)을 코팅하여 코팅층을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 코팅층이 형성된 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질에 표피 각질형성세포를 접종하고 배양하여 표피층을 형성하는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법에 있어서, 상기 기질용액은, 진피 섬유아세포를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법에 있어서, 상기 코팅층은, 상기 4형 콜라겐이 1 ~ 20㎍/㎠ 농도로 코팅될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계는, 상기 4형 콜라겐이 희석된 4형 콜라겐 희석용액을 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질 상에 도포하여 코팅할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계는, 상기 표피 각질형성세포를 포함하는 배양액을 공급하여, 상기 표피 각질형성세포를 접종 및 배양할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법에 있어서, 상기 배양액을 제거하고, 접종된 상기 표피 각질형성세포를 공기에 노출시켜 상기 표피 각질형성세포를 분화할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 의한 인공피부 배양기술은 표피층이 구현되기 위해 기질로 사용하는 세포 미포함 진피기질 또는 진피모사체에 기저막 성분을 추가하여 인체 피부의 주변환경과 유사한 환경을 만들어 줌으로써 표피층의 조직학적 특성을 보다 인체 피부에 가깝도록 향상시킬 수 있다.
표피층은 피부에서 가장 중요한 기능적 역할인 피부 장벽기능을 발휘하기 때문에, 표피층의 조직학적 완성도는 기저층, 유극층, 과립층, 각질층의 정상적인 구현 여부에 따라 판별하며, 더 나아가서는 특이적 표지자의 발현 형태를 통해 심층적으로 판별할 수 있다. 표피층이 구현되기 위해 기질로 사용하는 세포 미포함 진피기질 또는 진피모사체에 기저막 성분을 추가하여 표피층의 각 층별 특이적 표지인자의 발현 양상이 인체 피부와 유사해짐으로써, 표피층의 조직학적 완성도를 향상시킬 수 있다.
도 1 내지 도 2는 본 발명에 따른 인공피부 제조방법의 순서도이다.
도 3a는 비교예 1, 도 3b는 비교예 2, 도 3c는 실시예 1, 도 3d는 실시예 2에 따라 각각 완성된 인공피부의 단면을 Hematoxylin-Eosin(H&E) staining에 의해 염색한 광학현미경 이미지이다.
도 4a는 비교예 1, 도 4b는 비교예 2, 도 4c는 실시예 1, 도 4d는 실시예 2에 따라 각각 완성된 인공피부의 단면을 Loricrin 항체를 이용해 면역염색한 광학현미경 이미지이다.
도 3a는 비교예 1, 도 3b는 비교예 2, 도 3c는 실시예 1, 도 3d는 실시예 2에 따라 각각 완성된 인공피부의 단면을 Hematoxylin-Eosin(H&E) staining에 의해 염색한 광학현미경 이미지이다.
도 4a는 비교예 1, 도 4b는 비교예 2, 도 4c는 실시예 1, 도 4d는 실시예 2에 따라 각각 완성된 인공피부의 단면을 Loricrin 항체를 이용해 면역염색한 광학현미경 이미지이다.
본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.
도 1 내지 도 2는 본 발명에 따른 인공피부 제조방법의 순서도이다.
도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법은 1형 콜라겐(Type Ⅰ Collagen) 용액을 포함하는 기질용액을 겔화시켜 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)을 생성하는 단계, 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20) 상에, 4형 콜라겐(Type Ⅳ Collagen)을 코팅하여 코팅층(30)을 형성하는 단계, 및 코팅층(30)이 형성된 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)에 표피 각질형성세포(40)를 접종하고 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명은 인공피부 제조방법에 관한 것으로, 인공피부모델의 배양에서 표피층의 조직학적 완성도를 향상시키고자 개발되었다. 여기서, 인공피부라 함은 좁게는 진피 구성물질인 1형 콜라겐을 기반으로 하고 진피 섬유아세포를 포함하는 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질 상부에서 표피층을 구현한 것을 의미하며, 실제 피부와 유사한 구조적 기능적 특성을 나타내는 고분자 복합체라면 모두 포함하는 최광의로 해석되어야 한다. 일례로, 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질에 진피 섬유아세포가 포함되지 않은 경우에도 인공피부에 해당할 수 있다.
이러한 인공피부는 배양용기에서 배양될 수 있다. 일례로, 배양용기(10)는 내부 챔버(11)를 외부 챔버(13)가 감싸는 이중 구조로 형성될 수 있다. 여기서, 내부 챔버(11)는 내벽 및 바닥면에 의해 내부 공간이 형성되는데, 바닥면은 다수의 관통홀이 형성된 다공성 박막으로 이루어질 수 있고, 그 내부 공간에서 인공피부가 배양되며, 외부 챔버(13)는 외벽 및 바닥면으로, 내부 챔버(11)와 이격되어 그 내부 챔버(11)를 감싸도록 형성될 수 있다. 이하에서는, 편의를 위해 상기 배양용기(10)에 의해 인공피부를 배양하는 것으로 설명하지만, 본 발명에 따른 인공피부가 반드시 상기 구조의 배양용기(10)에 의해서만 제조되어야 하는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인공피부 제조방법은 기질 생성단계, 코팅층 형성단계, 및 표피층 형성단계를 포함한다.
기질 생성단계는 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)을 생성하는 공정이다. 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)을 생성하기 위해서는, 1형 콜라겐 용액을 포함하는 기질용액을 겔화시킨다. 이때, 기질용액은 내부 챔버(11)에 주입될 수 있다. 기질용액은 1형 콜라겐을 2.0 ~ 6.0㎎/㎖ 농도로 포함하도록 제조할 수 있으나, 그 농도가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 기질용액에는 진피 섬유아세포가 포함되지 않거나, 또는 포함될 수 있다. 이로써, 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)은 진피 섬유아세포가 포함되지 않은 세포 미포함 진피기질, 또는 진피 섬유아세포가 포함된 진피모사체를 이루게 된다. 진피 섬유아세포를 포함하는 경우에, 진피 섬유아세포 수는 1.0×105 ~ 3.0×105cells/㎖일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
코팅층 형성단계는 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20), 즉 상기 세포 미포함 진피기질 또는 진피모사체 상에 4형 콜라겐을 코팅하는 공정이다. 4형 콜라겐은 피부의 기저막 성분 물질로서, 피부의 표피층과 진피층 사이에 평면처럼 존재한다. 이러한 기저막 성분 물질은 다양한 조직의 표면 또는 경계면에서도 발견되는 고분자 단백질의 혼합물로서, 라미닌, 4형 콜라겐, heparan sulfate proteoglycans, entactin/nidogen을 주 성분으로 하고 다양한 생장인자를 포함하는 물질일 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 것으로 쥐의 육종(Sarcoma)으로부터 분리 정제한 Corning社의 Matrigelⓡ이 대표적이다. 본 발명에서는 4형 콜라겐을 세포 미포함 진피기질(Acellular Dermal Matrix) 또는 진피모사체의 상부에 코팅하여 코팅층(30)을 형성한다. 일례로, 인공피부의 세포 미포함 진피기질 또는 진피모사체을 구성하는 1형 콜라겐 기반의 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)의 상층부에 4형 콜라겐 희석액을 도포하여 코팅층(30)을 형성할 수 있다. 여기서, 4형 콜라겐은 1 ~ 20㎍/㎠ 농도로 코팅될 수 있다. 다만, 그 농도가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
표피층 형성단계는 코팅층(30)이 형성된 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질(20)에 표피 각질형성세포(40)를 접종하고 배양하는 공정이다. 이때, 접종되는 표피 각질형성세포(40)의 수는 100,000 ~ 400,000cells/cm2일 수 있으나, 그 수는 조절 가능하다. 여기서, 내부 챔버(11)에는 표피 각질형성세포(40)를 포함하는 제1 배양액(50)을, 외부 챔버(13)에는 표피 각질형성세포(40)를 포함하지 않는 제1 배양액(50)을 공급한 다음에, 일정 시간(예를 들면, 12 ~ 24시간) 방치하여 표피 각질형성세포(40)를 부착시킬 수 있다. 또는, 표피 각질형성세포(40)를 접종한 후, 표피 각질형성세포(40)가 부착되도록, 내부 챔버(11) 및 외부 챔버(13)에 제1 배양액(50)을 더 공급할 수 있다.
이렇게 표피 각질형성세포(40)가 도입되면, 그 세포의 분화를 유도하여 표피층을 형성할 수 있다. 인공피부에서 피부 장벽기능이 갖춰진 표피층을 구현하기 위해서는, 표피 각질형성세포(40)가 도입된 배양용기(10) 내부의 배양액을 제거하여 공기에 노출시킴으로써, 표피 각질형성세포(40)의 분화를 유도할 수 있다. 일례로, 배양용기(10) 내의 상기 제1 배양액(50)을 제거하고, 외부 챔버(13)에 표피 각질형성세포(40)의 분화를 위한 제2 배양액을 공급할 수 있다. 이후 주기적으로 배양액을 교체하면서 10일간 분화를 유도할 수 있다. 다만, 분화를 유도하는 기간이 반드시 10일에 한정되는 것은 아니다.
이하에서는 구체적인 실시예와 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
실시예 1
본 발명의 제1 실시예로서, 1형 콜라겐을 6.0mg/mL의 농도로 포함하고 상층부가 4형 콜라겐으로 코팅된 세포 미포함 진피기질을 준비하였다. 이때. 제조되는 세포 미포함 진피기질은 1형 콜라겐 기반의 3차원 스캐폴드를 이용하여 형성했다. 먼저, 1X PBS(Phosphate Buffered Saline), pH 7.6 용액 기반의 1형 콜라겐 용액을 만들기 위해 Type I Collagen(Corning)을 10X PBS, 1.0M NaOH, DDW(Distilled Deionized Water) 용액을 적정비율로 혼합하여 6.0mg/mL의 1형 콜라겐 용액을 제조하였다. 상기 용액을 다공질 박막을 바닥으로 하는 배양용기에 150μL를 넣고 5% CO2, 37℃배양기에서 30분간 보관하여 겔화시켰다. 상기 제작된 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질의 상층부에, 50μg/mL의 농도로 PBS에 희석된 4형 콜라겐(Type IV Collagen, Corning) 용액을 157μL 도포하고 상온에서 1시간 동안 보관하여 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질의 상층부를 최종 농도 10μg/Cm2의 4형 콜라겐으로 코팅하였다.
실시예 2
본 발명의 제2 실시예로서, 1형 콜라겐을 6.0mg/mL, 진피 섬유아세포를 1.0x105cells/mL로 포함하고 상층부가 4형 콜라겐으로 코팅된 3차원 진피모사체를 준비하였다. 이때, 제조되는 진피모사체는 진피 섬유아세포(Normal Human Dermal Fibroblasts, LONZA)를 포함하는 1형 콜라겐 기반의 3차원 스캐폴드를 이용하여 형성하였다. 먼저, 진피 섬유아세포, 1X PBS(Phosphate Buffered Saline), pH 7.6 용액 기반의 1형 콜라겐 용액을 만들기 위해 Type I Collagen(Corning)을 10X PBS, 1.0M NaOH, DDW(Distilled Deionized Water), 진피 섬유아세포를 적정비율로 혼합하여 6.0mg/mL의 1형 콜라겐과 1.0x105cells/mL의 진피 섬유아세포를 갖는 콜라겐-섬유아세포 혼합용액을 제조하였다. 상기 용액을 다공질 박막을 바닥으로 하는 배양용기에 150μL를 넣고 5% CO2, 37℃배양기에서 30분간 보관하여 겔화시켰다. 제작된 진피모사체의 상층부에 50μg/mL의 농도로 PBS에 희석된 4형 콜라겐(Type IV Collagen, Corning)용액을 157μL 도포하여 상온에서 1시간 동안 보관하여 진피모사체의 상층부를 최종 농도 10μg/Cm2의 4형 콜라겐으로 코팅하였다.
비교예 1
본 발명의 제1 비교예로서, 1형 콜라겐을 6.0mg/mL로 포함하여 제작된 세포 미포함 진피기질을 준비하였다. 이때, 제조되는 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질은 1형 콜라겐 기반의 3차원 스캐폴드를 이용하여 형성하였다. 먼저, 1X PBS(Phosphate Buffered Saline), pH 7.6 용액 기반의 1형 콜라겐 용액을 만들기 위해 Type I Collagen(Corning)을 10X PBS, 1.0M NaOH, DDW(Distilled Deionized Water), 진피 섬유아세포를 적정비율로 혼합하여 6.0mg/mL의 1형 콜라겐 용액을 제조하였다. 상기 용액을 다공질 박막을 바닥으로 하는 배양용기에 150μL를 넣고 5% CO2, 37℃배양기에서 30분간 보관하여 겔화시켰다.
비교예 2
본 발명의 제2 비교예로서, 1형 콜라겐을 6.0mg/mL, 진피 섬유아세포를 1.0x105cells/mL로 포함하여 제작된 3차원 진피모사체를 준비하였다. 이때, 제조되는 진피모사체는 진피 섬유아세포(Normal Human Dermal Fibroblasts, LONZA)를 포함하는 1형 콜라겐 기반의 3차원 스캐폴드를 이용하여 형성하였다. 먼저, 1X PBS(Phosphate Buffered Saline), pH 7.6 용액 기반의 1형 콜라겐 용액을 만들기 위해 Type I Collagen(Corning)을 10X PBS, 1.0M NaOH, DDW(Distilled Deionized Water), 진피 섬유아세포를 적정비율로 혼합하여 6.0mg/mL의 1형 콜라겐과 1.0x105cells/mL의 진피 섬유아세포를 갖는 콜라겐-섬유아세포 혼합용액을 제조하였다. 상기 용액을 다공질 박막을 바닥으로 하는 배양용기에 150μL를 넣고 5% CO2, 37℃배양기에서 30분간 보관하여 겔화시켰다.
실험예 1
상기 제조된 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2의 상부에 표피모사체를 하기의 방법에 따라 각각 배양하였다.
상기 실시예1, 실시예2, 비교예 1, 비교예 2를 챔버 내부에 위치시킨 다음, 각각의 상부에 각질형성세포(Normal Human Epidermal Keratinocytes, LONZA)를 250,000cells/cm2 로 심고, 배양용기의 내부와 외부 챔버에 배양액(Keratinocyte Growth Medium-GOLD, LONZA)을 넣고 하루 밤 동안 부착시켰다. 이후 배양용기 내부의 배양액을 제거하고, 외부의 챔버에는 표피층 형성을 위한 배양액을 넣어 각질형성세포의 분화를 유도하였다. 이후 매일 배양액을 교체해 주면서 10일간 분화를 유도하여 표피층을 생성시켰다.
상기와 같이 배양되어 최종적으로 완성된 인공표피와 인공피부의 단면을 Hematoxylin-Eosin(H&E) staining에 의해 염색하여 광학현미경으로 관찰한 결과를 도 3a ~ 도 3d에 나타내었다. 도 3a는 비교예 1, 도 3b는 비교예 2, 도 3c는 실시예 1, 도 3d는 실시예 2에 따라 각각 완성된 인공피부의 단면을 Hematoxylin-Eosin(H&E) staining에 의해 염색한 광학현미경 이미지이다.
상기와 같이 배양되어 최종적으로 완성된 인공표피와 인공피부의 단면을 Loricrin 항체를 이용한 면역염색 결과를 도 4a ~ 도 4d에 나타내었다. 도 4a는 비교예 1, 도 4b는 비교예 2, 도 4c는 실시예 1, 도 4d는 실시예 2에 따라 각각 완성된 인공피부의 단면을 Loricrin 항체를 이용해 면역염색한 광학현미경 이미지이다.
그 결과, 도 3a ~ 도 3d와 같이 본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2를 이용하여 제조된 인공피부는 비교예 1, 비교예 2를 이용하여 제조된 인공피부에 비해 표피층의 적층구조가 보다 뚜렷하게 형성되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4a 및 도 4b와 같이 비교예 1 및 비교예 2에서 Loricrin이 과립층을 중심으로 모든 층에 발현하고 있는 것과 달리, 도 4c 및 도 4d와 같이 실시예 1 및 실시예 2에서는 Loricrin이 과립층에 제한적으로 발현하고 있음을 확인할 수 있었다.
이는 실제 피부에서의 Loricrin 발현 양상에 부합하는 것으로, 이를 통해 실시예 1, 실시예 2를 이용하여 제조된 인공피부 표피층의 조직학적 완성도가 높음을 확인할 수 있다.
이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
10: 배양용기
11: 내부 챔버
13: 외부 챔버 20: 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질
30: 코팅층 40: 표피 각질형성세포
50: 배양액
13: 외부 챔버 20: 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질
30: 코팅층 40: 표피 각질형성세포
50: 배양액
Claims (6)
- (a) 1형 콜라겐(Type Ⅰ Collagen) 용액을 포함하는 기질용액을 겔화시켜 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질을 생성하는 단계;
(b) 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질 상에, 4형 콜라겐(Type Ⅳ Collagen)을 코팅하여 코팅층을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 코팅층이 형성된 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질에 표피 각질형성세포를 접종하고 배양하여 표피층을 형성하는 단계;를 포함하는 인공피부 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 기질용액은, 진피 섬유아세포를 더 포함하는 인공피부 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 코팅층은, 상기 4형 콜라겐이 1 ~ 20㎍/㎠ 농도로 코팅되는 인공피부 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 (b) 단계는,
상기 4형 콜라겐이 희석된 4형 콜라겐 희석용액을 상기 3차원 하이드로겔 스캐폴드 기질 상에 도포하여 코팅하는 인공피부 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 (c) 단계는,
상기 표피 각질형성세포를 포함하는 배양액을 공급하여, 상기 표피 각질형성세포를 접종 및 배양하는 인공피부 제조방법.
- 청구항 5에 있어서,
상기 배양액을 제거하고, 접종된 상기 표피 각질형성세포를 공기에 노출시켜 상기 표피 각질형성세포를 분화하는 인공피부 제조방법.
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| KR20190003060A (ko) | 2017-06-30 | 2019-01-09 | (주)아모레퍼시픽 | 인공피부 제조방법 및 인공피부 |
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