KR102179476B1 - 줄기세포 배양액을 이용한 3차원 인공피부의 제조방법 - Google Patents

줄기세포 배양액을 이용한 3차원 인공피부의 제조방법 Download PDF

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Abstract

줄기세포 배양액을 이용한 3차원 인공피부의 제조방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 방법에 의하면, 세포외기질, 합성물질 등 외부 물질의 사용없이 성체 유래 세포를 사용하여, 피부 본연의 조직학적 구조와 생물학적 기능이 재현된 3차원 인공피부를 제조할 수 있다.

Description

줄기세포 배양액을 이용한 3차원 인공피부의 제조방법{Manufacturing method of 3D artificial skin using stem cell culture media}
줄기세포 배양액을 이용한 3차원 인공피부의 제조방법에 관한 것이다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로 바깥쪽에서부터 표피, 진피 및 피하지방층의 세 개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 중층편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다. 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어진 진피는 표피 아래에 위치하며, 진피에는 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 피하지방층은 지방세포로 구성되어 있다. 피부는 상기와 같은 다양한 세포들과 구성물질들이 상호작용하여 그 형태를 유지하며 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 나타낸다.
인공피부(artificail skin)는 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포와 각질형성세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다. 인공피부는 탄력, 강도, 물질 투과 등에 있어 피부와 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체로서, 피부와 같은 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이가 있다. 인공피부는 화상, 외상 등 손상을 입은 피부의 대체(영구생착형) 또는 재생(일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라, 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 효능평가 등 다양한 영역에서 이용되고 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 피부의 조직학적 구조와 생물학적 기능을 모사할 수 있는 인공 피부의 제조 기술에 대한 다양한 연구가 진행되고 있으나(한국공개특허 10-2017-0014678), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 진피섬유아세포(Dermal fibroblast)를 배양하여 진피층을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 진피층의 상부에, 각질형성세포(Keratinocytes)를 배양하여 표피층을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 진피섬유아세포 또는 각질형성세포를 배양하는 단계는 줄기세포 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 것인, 3차원 인공피부룰 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 3차원 인공피부를 제공하는 것이다.
일 양상은 진피섬유아세포를 배양하여 진피층을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 진피층의 상부에, 각질형성세포를 배양하여 표피층을 제조하는 단계를 포함하며,
상기 진피섬유아세포 또는 각질형성세포를 배양하는 단계는 줄기세포 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 것인, 3차원 인공피부를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 3차원 인공피부를 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 방법은 진피섬유아세포 또는 각질형성세포 각각을 줄기세포 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함함으로써, 세포외기질 성분 또는 합성물질 등과 같은 외부물질을 첨가하지 않는 조건에서도 피부의 조직학적 또는 생물학적 모사능이 우수한 3차원 인공피부를 제조할 수 있다. 따라서, 상기 3차원 인공피부는 피부 치료, 의학적 이식, 피부 접촉물질에 대한 피부독성 검사 및 화장품 효능 검사 등의 용도로 활용될 수 있다.
이하, 상기 3차원 인공피부를 제조하는 방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
우선, 진피섬유아세포(Dermal fibroblast)를 배양하여 진피층을 제조한다.
상기 진피층을 제조하는 단계는 진피섬유아세포를 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 진피섬유아세포를 줄기세포 배양액이 포함된 제1 혼합 배지에서 배양하여 진피섬유아세포 시트(sheet)를 제조하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기에서, 상기 제1 혼합 배지는 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지 및 줄기세포 배양액이 혼합된 것일 수 있다. 또한, 상기 단계는 상기 제조된 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 3 내지 5개의 진피섬유아세포 시트를 적층시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 일련의 과정은 자가조립(self-assmembly) 방법을 통해 세포외기질 성분 또는 구조를 자발적으로 형성하게 할 수 있다.
상기 줄기세포 배양액은 무혈청 EGM-2 배지에서 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포(Human embryonic stem cell derived endothelial precursor cell)를 배양하여 수득한 것일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포 배양액은 상피세포증식인자(Epidermal growth factor: EGF), 섬유모세포성장인자-2(Fibroblast growth factor-2: FGF-2), 프렉탈카인(Fractalkine), 과립구-큰포식세포 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 인터류킨-6(Interleukin-6: IL-6), 인터류킨-8(Interleukin-8: IL-8), 인터류킨-9(Interleukin-9: IL-9), 혈소판-유래 성장인자-AA(Platelet-derived growth factor-AA: PDGF), 및 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 포함할 수 있다.
상기 제1 혼합 배지는 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지 및 줄기세포 배양액이 혼합된 것이며, 상기 제1 혼합 배지는 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지 및 줄기세포 배양액이 2:1 내지 1:2, 또는 1.5:1 내지 1:1.5의 부피비율로 혼합되어 있을 수 있다. 상기 범위를 벗어나 줄기세포 배양액의 비율이 너무 높으면, 영양원의 충분한 공급이 이루어지지 않을 우려가 있고, 반대로 진피섬유아세포 배양 배지의 비율이 너무 높으면, 전술한 자가조립 과정이 충분히 진행되지 않을 수 있다.
상기 진피섬유아세포 배양 배지는 당업계에 알려진 DMEM, IDMEM, MEM, M199, RPMI 1640, Ham's F12, Ham's F10, NCTC 109, 또는 NCTC 135와 같은 통상의 기본 배지가 적용될 수 있으며, 일 실시예에 따르면, 상기 배지는 우태아혈청, 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지일 수 있다.
상기 진피층을 제조하는 단계에서, 진피섬유아세포는 자가피부조직으로부터 유래되거나, 동종의 다른 개체로부터 유래되거나, 또는 다른 종의 개체로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 진피아세포는 신생아뿐만 아니라 성체로부터 유래된 각질형성세포일 수 있다. 마이크로-웰당 분주되는 세포의 수는 1×103 내지 3×106, 또는 1×104 내지 1×105개일 수 있으나, 이는 사용 목적 또는 구체적인 조건에 따라 적의 변경 가능하다. 여기에서, 상기 개체는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 포함할 수 있다.
상기 진피층을 제조하는 단계에서, 진피섬유아세포를 배양하는 단계는 35 내지 39℃, 및 2 내지 7% CO2 조건에서 진행될 수 있다. 또한, 상기 진피섬유아세포를 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지에서 배양하는 기간은 2 내지 4주일 수 있고, 상기 배양된 진피섬유아세포를 줄기세포 배양액이 포함된 제1 혼합 배지에서 배양하는 기간은 1주 내지 2주일 수 있으나, 이 역시 사용 목적 또는 구체적인 조건에 따라 적의 변경 가능하다.
이후, 상기 제조된 진피층의 상부에, 각질형성세포를 배양하여 표피층을 제조한다.
상기 표피층을 제조하는 단계는 각질형성세포를 줄기세포 배양액이 포함된 제2 혼합 배지에서 배양하여 표피세포 시트를 제조하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 제2 혼합 배지는 표피세포 배양액 및 줄기세포 배양액이 혼합된 것일 수 있다. 또한, 상기 단계는 상기 제조된 진피층-표피세포 시트를 진피-표피세포 배양 배지에서 공기-액체 계면 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 일련의 과정은 표피층, 예를 들어, 각질층 등을 자발적으로 형성하게 할 수 있다.
상기 줄기세포 배양액은 상기 진피층을 제조하는 단계에서 기술한 바와 같다.
상기 제2 혼합 배지는 표피세포 배양액 및 줄기세포 배양액이 혼합된 것이며, 상기 제2 혼합 배지는 표피세포 배양액 및 줄기세포 배양액이 2:1 내지 1:2, 또는 1.5: 1 내지 1:1.5의 부피비율로 혼합되어 있을 수 있다. 상기 범위를 벗어나 줄기세포 배양액의 비율이 너무 높으면, 영양원의 충분한 공급이 이루어지지 않을 우려가 있고, 반대로 진피섬유아세포 배양 배지의 비율이 너무 높으면, 전술한 표피층의 형성이 충분히 진행되지 않을 수 있다.
상기 표피세포 배양액 또는 진피-표피세포 배양배지는 전술한 바와 같이 당업계에 알려진 통상의 배양액이 적용될 수 있으며, 일 실시예에 따르면, 표피세포 배양액은 ATCC의 HEKn 배지(ATCCⓡ PCS-200-010TM), 진피-표피세포 배양배지로는 태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신, 인슐린, 히드로코르티손, 및 콜레라독소가 첨가된 DMEM/F12 배지일 수 있다.
상기 표피층을 제조하는 단계에서, 각질형성세포는 자가피부조직으로부터 유래되거나, 동종의 다른 개체로부터 유래되거나, 또는 다른 종의 개체로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 각질형성세포는 신생아뿐만 아니라 성체로부터 유래된 각질형성세포일 수 있다. 한편, 마이크로-웰당 분주되는 세포의 수는 1×104 내지 1×108, 또는 1×105 내지 1×107개일 수 있으나, 이는 사용 목적 또는 구체적인 조건에 따라 적의 변경 가능하다. 여기에서, 상기 개체는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 포함할 수 있다.
상기 표피층을 제조하는 단계에서, 각질형성세포를 배양하는 단계는 35 내지 39℃, 및 2 내지 7% CO2 조건에서 진행될 수 있다. 또한, 진피층-표피세포 시트를 배양하는 단계는 공기-액체 계면(Air liquid interface: ALI) 배양하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 추가적으로 링 형태의 구조물을 이용하여 배양할 수 있다. 또한, 상기 각질형성세포를 배양하는 기간은 1 내지 2주일 수 있고, 상기 진피층-표피세포 시트를 배양하는 기간은 2 내지 4주일 수 있으나, 이 역시 사용 목적 또는 구체적인 조건에 따라 적의 변경 가능하다.
상기 방법에 의해 제조된 3차원 인공피부는 피부 본연의 조직학적 구조와 생물학적 기능을 효과적으로 재현할 수 있다. 특히, 신생아로부터 분리된 피부 세포뿐만 아니라, 성체 피부로부터 분리된 진피섬유아세포 및 각질형성세포를 사용하여 3차원 인공피부를 제조한 경우에 있어서도, 상기 3차원 인공피부는 진피층과 표피층이 연속적으로 형성되어 있었으며, 종래 피부 구조와 근사한 각질층, 투명층, 과립층, 가시층, 기저층의 5개의 층을 지닌 두꺼운 표피층이 형성되었다. 따라서, 상기 방법은 3차원 인공피부의 제조 효율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 피부 치료, 의학적 이식, 피부 접촉물질에 대한 피부독성 검사 및 화장품 효능 검사 등의 유효성을 향상시킬 수 있다.
일 양상에 따른 방법에 의하면, 세포외기질, 합성물질 등 외부 물질의 사용없이 피부로부터 분리된 세포를 사용하여, 피부 본연의 조직학적 구조와 생물학적 기능이 재현된 3차원 인공피부를 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 3차원 인공피부는 피부 치료, 의학적 이식, 피부 접촉물질에 대한 피부독성 검사 및 화장품 효능 검사에 사용될 수 있을 뿐 아니라 생리학적, 분자학적 연구에도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 일 실시예에 따른 3차원 인공피부의 제조 과정을 모식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 진피섬유아세포의 배양 과정을 육안으로 확인한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 의해 제조된 진피섬유아세포 시트를 육안으로 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 의해 제조된 진피층 안쪽에 링 구조물을 삽입한 모습을 육안으로 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 의해 제조된 3차원 인공피부의 조직학적 구조를 확인한 것으로서, (A) 인공피부를 육안으로 확인한 결과; 및 (B) 인공피부 내 층 형성 및 구조를 마손 삼색 염색법을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 신생아 피부로부터 분리한 진피섬유아세포 및 각질형성세포를 대상으로, 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 3차원 인공피부의 조직학적 구조를 확인한 결과이다.
도 7은 성체 피부로부터 분리한 진피섬유아세포 및 각질형성세포를 대상으로, 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 3차원 인공피부의 조직학적 구조를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포 배양액을 이용한 3차원 인공피부의 제조
일 실시예에 따른 인공피부의 제작은 도 1에 나타낸 바와 같이, 진피섬유아세포(Dermal fibroblast)를 이용하여 진피섬유아세포층(진피층)을 형성하는 단계, 및 상기 진피층에 각질형성세포(Keratinocytes)를 올려 배양하여 표피층을 형성하는 단계로 진행되었다. 또한, 세포의 배양시 배지 조성은 DMEM 또는 DMEM/F12와 같은 세포 배양용 기본 배지에 줄기세포 배양액을 1:1로 혼합하여 사용하였다. 또한, 줄기세포 배양액은, 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포를 무혈청 EGM-2(Lonza) 배지에서, 150mm 세포 배양 디쉬 내 상기 세포의 밀도가 80%에 이를 때까지 약 48시간 동안 인큐베이션시키고, 이를 원심분리시킨 후, 상기 원심분리된 배양액을 10kDa 컷오프 TFF 멤브레인 필터 시스템(Millipore)으로 농축시킴으로써, 준비되었다. 상기 배양액은 각각 50μL씩 분취하여 사용하였다. 상기 줄기세포 배양액은 배양액 전체의 부피를 기준으로, 12584pg/mL의 상피세포증식인자, 383pg/mL의 섬유모세포성장인자-2, 1605pg/mL의 프렉탈카인, 755pg/mL의 과립구-큰포식세포 자극인자, 4332pg/mL의 인터류킨-6, 239030pg/mL의 인터류킨-8, 435 pg/mL의 인터류킨-9, 6667 pg/mL의 혈소판-유래 성장인자-AA, 및 4265pg/mL의 혈관내피 성장인자를 포함하였다.
한편, 각각의 제조 단계에서의 기본 배지는 세포의 조성 및 배양 조건에 따라 하기 기술한 바와 같이 적절하게 변경하였다.
(1) 진피층의 제조
인간 피부로부터 분리된 진피섬유아세포는 진피섬유아세포 배양액(10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycine이 첨가된 DMEM 배지)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 준비되었다. 또한, 3M paper(6웰 플레이트에 맞추어 링 모양으로 제단), 포셉, 추, 링을 멸균하여 준비하였다.
진피섬유아세포를 6-웰 플레이트에 분주하기 일주일 전, 멸균건조된 3M paper를 6-웰 플레이트에 넣고 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 적셔준 뒤, 3M paper가 6-웰 플레이트 바닥에 고정되도록 추를 올려주었다. 이후, DPBS를 제거한 후, 진피섬유아세포를 각 well에 3×105의 농도로 분주하고, 진피섬유아세포 배양액에 ascorbic acid를 첨가한 뒤, 37℃, 5% CO2 조건에서 상기 세포를 배양하였다. 이때, 상기 배양은 진피섬유아세포 배양액을 2일에 한번씩 교체해주는 방식으로 3주 동안 진행하였다. 이후, 진피섬유아세포 배양 4 주차부터, 진피섬유세포는 줄기세포 배양액: 인공피부 진피섬유아세포 배양액 = 1:1 비율로 혼합한 제1 혼합 배지에 ascorbic acid를 첨가하여 2일에 한번씩 교체해주는 방식으로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양되었다. 배양 5 주째, 제조된 인공피부 진피섬유아세포 시트를 포셉을 이용하여 천천히 6웰 플레이트에서 떼어낸 뒤, 이들 각각을 60π dish에 포개어 주는 방법으로 3장을 겹쳐서 추로 이들을 고정하였다. 이후, 상기 제1 혼합 배지를 2 일에 한번씩 배지 교환하는 방식으로 1주 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하여 진피층을 형성시켰다.
(2) 표피층의 제조
진피섬유아세포를 배양한지 5 주째, 각질형성세포를 표피세포 배양액(ATCC의 HEKn 배지(ATCCⓡ PCS-200-010TM))에서 배양하여, 표피층 형성을 위한 각질형성세포를 준비하였다. 이후, 상기 제조된 진피층의 안쪽면에 링 구조물을 위치시킨 뒤, 준비한 각질형성세포를 각 웰당 1 X 106의 세포로 분주하였다. 이후, 상기 각질형성세포를 줄기세포 배양액: 표피세포 배양액 = 1:1 비율로 혼합한 제2 혼합 배지에서 1 주 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이로부터 일주일 뒤, 링 구조물을 제거하고, 상기 세포를 표피세포 배양액으로 2일에 한번씩 배지를 교환하는 방식으로 1 주일 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후, 제조된 진피층-표피세포 시트 (실시예 1-(1)의 진피층, 및 상기 진피층 상부에 형성된 표피세포 시트)에 링 구조물을 올려둔 뒤, 여기에 진피-표피세포 배양 배지(5% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 5㎍/ml Insulin, 1ug/ml Hydrocortisone, 5ng/ml Cholera toxin이 첨가된 DMEM/F12 배지)를 상기 진피층-표피세포 시트의 세포 아래 부분만 닿을 정도로 첨가시킨 상태로, 37℃, 5% CO2 조건에서 공기-액체 계면 배양(Air liquid interface: ALI)을 실시하였다. 이때, 상기 진피-표피세포 배양 배지는 2일에 한번씩 교환되었으며, 총 2주 동안 진행되었다.
실험예 1. 3차원 인공피부의 형성 확인
본 실험예에서는 상기 실시예 1에 의해 제조된 3차원 인공피부의 형성을 육안으로 확인하였으며, 총 2주에 걸쳐, 상기 제조된 3차원 인공피부의 조직학적 구조를 마손 삼색(Masson trichrome) 염색법을 통해 확인하였다. 또한, 신생아 피부로부터 분리한 진피섬유아세포 및 각질형성세포를 대상으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 3차원 인공피부를 제조한 뒤, 이들의 조직학적 구조를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본연의 피부 조직을 모사한 진피층 및 표피층의 형성을 확인하였다. 특히, 진피표피경계(dermoepidermal junction) 부위의 상부에 위치하는 표피 기저층에서, 종래 피부 조직과 유사한 원주형 또는 입방형 세포가 관찰되었으며, 시간의 경과에 따라 표피층의 두께가 증가되어 각질층(Stratum corneum)이 정상적으로 형성되었다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 3차원 인공피부는 진피층과 표피층간 분리없이 종래 피부 조직과 매우 유사한 조직학적 구조를 지니고 있었다.
한편, 성체 피부로부터 분리된 진피섬유아세포 및 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 인공피부의 제조방법에 있어서, 줄기세포 배양액의 첨가에 따른 피부 구조의 모사능 변화를 확인하였다. 또한, 대조군으로는 줄기세포 배양액이 포함된 혼합배지가 진피섬유아세포 및 각질형성세포의 배양에 사용되지 않았다는 점만을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 인공피부를 대조군으로 설정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 성체 유래의 세포를 이용한 인공피부의 제조 과정에서, 배양 배지로서 진피/표피세포 배양액만 사용하여 제조된 인공피부는 진피층과 표피층 사이에 빈 공간이 형성됨에 따라 각각의 층이 분리되어 있었고, 피부의 표피층은 매우 얇게 형성되어 있었다. 반면, 상기 실시예 1에 의해 제조된 3차원 인공피부는 진피층과 표피층이 연속적으로 형성되어 있었으며, 각질층, 투명층, 과립층, 가시층, 기저층의 5개의 층을 지닌 두꺼운 표피층이 형성되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (15)

  1. 진피섬유아세포(Dermal fibroblast)를 배양하여 진피층을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 진피층의 상부에 각질형성세포(Keratinocytes)를 배양하여 표피층을 제조하는 단계를 포함하는 3차원 인공피부를 제조하는 방법으로서,
    상기 진피섬유아세포 또는 각질형성세포를 배양하는 단계는 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포(Human embryonic stem cell derived endothelial precursor cell) 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 것인, 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액은 상피세포증식인자(Epidermal growth factor: EGF), 섬유모세포성장인자-2(Fibroblast growth factor-2: FGF-2), 프렉탈카인(Fractalkine), 과립구-큰포식세포 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 인터류킨-6(Interleukin-6: IL-6), 인터류킨-8(Interleukin-8: IL-8), 인터류킨-9(Interleukin-9: IL-9), 혈소판-유래 성장인자-AA(Platelet-derived growth factor-AA: PDGF), 및 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 포함하는 것인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 진피층을 제조하는 단계는,
    진피섬유아세포를 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 진피섬유아세포를 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액이 포함된 제1 혼합 배지에서 배양하여 진피섬유아세포 시트(sheet)를 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 제1 혼합 배지는 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지 및 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액이 혼합된 것인, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 진피섬유아세포 배양 배지는 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS), 및 페니실린/스트렙토마이신 (Penicillin/Streptomycine)이 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지인 것인, 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 제1 혼합 배지는 아스코르브 산이 첨가된 진피섬유아세포 배양 배지 및 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액을 1.5:1 내지 1:1.5의 부피비율로 포함하는 것인, 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 배양하는 단계는 35 내지 39℃, 및 2 내지 7% CO2 조건에서 배양하는 것인, 방법.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 진피층을 제조하는 단계는 상기 제조된 진피섬유아세포 시트를 적층시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 표피층을 제조하는 단계는,
    각질형성세포를 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액이 포함된 제2 혼합 배지에서 배양하여 진피층-표피세포 시트를 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 제2 혼합배지는 표피세포 배양액 및 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액이 혼합된 것인, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 제2 혼합 배지는 표피세포 배양액 및 인간 배아줄기세포 유래 내피 전구체 세포 배양액을 1.5:1 내지 1:1.5의 부피비율로 포함하는 것인, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 배양하는 단계는 35 내지 39℃, 및 2 내지 7% CO2 조건에서 배양하는 것인, 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 표피층을 제조하는 단계는 상기 제조된 진피층-표피세포 시트를 진피-표피세포 배양 배지에서 공기-액체 계면 배양(Air liquid interface: ALI)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 진피-표피세포 배양 배지는 우태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신, 인슐린, 히드로코르티손 (Hydrocortisone), 및 콜레라독소(Cholera toxin)가 첨가된 DMEM/F12(Dulbeco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mixture F-12) 배지인 것인, 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 진피섬유아세포 또는 각질형성세포는 자가피부 조직으로부터 유래인 것인, 방법.
  15. 청구항 1 및 3 내지 14 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 3차원 인공피부.
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