JP2020202757A - 皮膚様組織の製造方法、及びそれにより得られる皮膚様組織 - Google Patents
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Abstract
Description
多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた前記、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度45%〜75%の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、
を含む、方法。
[2] 前記細胞培養容器が、前記細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する、[1]に記載の方法。
[3] 前記皮膚様組織が、単離された皮膚組織又は三次元培養皮膚である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 前記皮膚様組織が、
(1)多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程;
(2)前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程;及び
(3)前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程、
を含む工程によって作製される三次元培養皮膚である、[1]又は[2]に記載の方法。
[5] 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、[4]に記載の方法。
[6] 前記気相培養する工程において、培地がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7] 前記気相培養する工程において、培地がヘパラナーゼ阻害剤を含む、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法。
一実施態様において、本発明は、皮膚様組織の製造方法であって、
多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度45%〜75%(例えば、相対湿度約50%)の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、を含む方法を提供する。
(1)多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程;
(2)前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程;及び
(3)前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程、
を含む工程によって作製される三次元培養皮膚であってもよい(図2参照)。多孔膜を有する細胞培養容器(例えば、セルカルチャーインサート)の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する(工程(1))。本発明の一実施態様において用いられるセルカルチャーインサートとは、細胞は透過できないが、培地等は透過できる多孔性の孔を有する膜を備えた細胞培養容器をいう。多孔膜の培養表面の反対側、つまり、付着細胞の付着面の裏側からも培地等を供給することができる。本発明に用いられる細胞培養容器、例えばセルカルチャーインサートは、市販のものを使用してもよい。
一実施態様において、本発明の皮膚様組織に、対象物質を添加することによって、皮膚のバリア機能を改善及び/又は回復させる対象物質を評価する方法を提供することができる。
1.材料及び実験方法
1―1.三次元培養皮膚の作製方法
セルカルチャーインサート(φ12mm、多孔膜の平均孔径:0.4μm)にヒト真皮線維芽細胞(0.2×106個)を播種し、200μM アスコルビン酸―2−リン酸マグネシウム(APM)、10%FBS−DMEMを用いて2日に1回培地交換して1週間培養した。その上にヒト真皮線維芽細胞を含んだ0.5%I型コラーゲン−10%FBS−DMEM溶液を分注して、ヒト真皮線維芽細胞の上にコラーゲンゲルを作製し、3日間培養した。
1−1で作製した三次元培養皮膚を1週間程度、気液境界培養したところで、37℃・50%RH、又は37℃・100%RHの雰囲気に制御したインキュベータ内に入れて培養を行った。インキュベータ内の湿度は湿度制御装置(キッツマイクロフィルター社、AHCU−2)を用いて制御した。三次元培養皮膚を入れたプレートは蓋に穴をあけてクローニングリングをはめて、三次元培養皮膚の表面のみが外気に直接触れるようにした(図1参照)。
50%RHで培養した三次元培養皮膚は、100%RHで培養した三次元培養皮膚と比較して、ケラチノサイト層及び真皮層(コラーゲンゲル層)が薄くなっており、表皮細胞の形態が全体的により平らな形状を有していた(図3)。
1.材料及び実験方法
1―1.三次元培養皮膚の作製方法
実施例1と同じ材料及び作製方法により作製した。
1−1で作製した三次元培養皮膚を1週間程度、気液境界培養したところで、37℃・40%RH、37℃・70%RH、又は37℃・100%RHの雰囲気に制御したインキュベータ内に入れて培養を行った。インキュベータ内の湿度は湿度制御装置(キッツマイクロフィルター社、AHCU−2)を用いて制御した。三次元培養皮膚を入れたプレートは蓋に穴をあけてクローニングリングをはめて、三次元培養皮膚の表面のみが外気に直接触れるようにした(図1参照)。
70%RHで培養した三次元培養皮膚は、100%RHで培養した三次元培養皮膚と比較して、ケラチノサイト層及び真皮層(コラーゲンゲル層)が薄く、表皮細胞の形態が全体的により平らな形状を有しており、前述の50%RHで培養した三次元培養皮膚と同様の特徴を示した(図8)。一方で、40%RHで培養した三次元培養皮膚は、表皮細胞層、真皮層ともにほとんど存在しておらず、培養皮膚としての形状を維持していなかった(図9)。
Claims (8)
- 皮膚様組織の製造方法であって、
多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度45%〜75%の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、
を含む、方法。 - 前記細胞培養容器が、前記細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記皮膚様組織が、単離された皮膚組織又は三次元培養皮膚である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記皮膚様組織が、
(1)多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程;
(2)前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程;及び
(3)前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程、
を含む工程によって作製される三次元培養皮膚である、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記気相培養する工程において、培地がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記気相培養する工程において、培地がヘパラナーゼ阻害剤を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法により得られる、皮膚様組織。
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