CN111117945A - 含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用 - Google Patents
含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种含黑色素的表皮皮肤模型,所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学生物材料领域，具体涉及一种含有黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用。
背景技术
在生物医学研究中，化妆品、药品、化学品等产品上市前都要进行大量的测试以保障产品的安全性与功效性。动物实验一直是该研究领域的主要模式，但由于动物与人的种属差异，实验动物不能准确模拟人体皮肤，使实验结果存在偏差。并且由于3R原则（减少、优化和替代）的提出，促使研究者寻找更合适的检测的方法。目前体外替代方法已经成为现代毒理学研究系统的主要模式和生物医学发展的新方向之一，被欧洲政府及国际法规所接受并推行。
目前，国际上已有多种皮肤模型，用于替代动物模型来研究皮肤的不同生物学功能，以及皮肤对化妆品或药物制剂的反应。例如表皮模型、全层皮肤模型（含表皮及真皮层）等。这些重组皮肤模型能够应用于基于皮肤的各类安全性及功效性研究中，如皮肤刺激、屏障渗透、保湿等。
目前具有美白功效的化妆品、药物目前深受广大消费者的欢迎，这类产品大多具有多种功效，例如美白保湿。而这些产品在应用于人体前，需要对其安全性及功效性加以验证。目前可用于美白功效检测的皮肤模型较少，原料及化妆品的美白与其它功效多采用不同模型进行验证，检测成本较高，且结果易出现一定的偏差。
专利CN200910138703.X公开了一种采用胶原、层粘连蛋白、成纤维细胞制备的支架结构即真皮层，然后接种角质形成细胞、黑色素细胞，并通过体外培养制备出功能性色素等同物。这种方法所制备的皮肤模型可包含真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型含有的真皮层中的细胞外基质主要来源于其他动物如牛，后期培养中这些胶原会有较快的降解，易发生结构收缩，从而导致整体模型的损坏，难以应用于长期稳定的检测中。
专利CN201019018002.2公开了一种采用生物可降解材料支撑膜模拟真皮层，表皮层利用角质形成细胞、黑色素细胞共同接种，构建的含黑色素细胞的皮肤模型。但该模型中黑色素细胞的分布、活性及功能的发挥不能非常好地反映正常皮肤的反应，而且这种模型结构非常单一，容易受到外界环境的影响而导致模型质量的下降，在后期功效性检测过程中会产生批次间差异从而影响功效结果的判断。
专利CN105353114A公开了一种包含成纤维细胞、黑素细胞及角质形成细胞的色素模型。该方法所构建的皮肤模型含有真皮层和表皮层，但其真皮层只含有成纤维细胞，不利于成纤维细胞的伸展及基质分泌，最终导致真皮层死亡，而表皮层未直接与培养基接触，其与培养基之间存在空隙，最终导致表皮层死亡。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用。
一方面，提供一种含黑色素的表皮皮肤模型,所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。
优选地，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15 分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。
优选地，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。
优选地，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。
优选地，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。
优选地，所述终止液为含10%血清的DMEM。
优选地，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。
优选地，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素细胞的比例为40:1～9:1。
优选地，所述第一培养基的配方为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/106cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。
优选地，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105～5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
优选地，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 10～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。
优选地，所述气液面培养的过程为：将所述模型细胞层的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6~8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
优选地，所述第三培养液的组分为：以含有KC-Growth基础液500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松50～100μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 为30～60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50～100ng和CaCl2 50～100mg。
另一方面，包含以下步骤：采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物进行体外共培养、液下培养和气液面培养，获得具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
优选地，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15 分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。
优选地，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。
优选地，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。
优选地，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。
优选地，所述终止液为含10%血清的DMEM。
优选地，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。
优选地，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素优选地，所述第一培养基的配制方法为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/106cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。
优选地，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105～5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
优选地，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 10～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。
优选地，所述气液面培养的过程为：将所述模型细胞层的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6~8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
优选地，所述第三培养液的组分为：以含有KC-Growth基础液500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松50～100μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 为30～60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50～100ng和CaCl250～100mg。
再一方面，提供上述的含黑色素的表皮皮肤模型在药品、化学品或化妆品的表皮相关安全性检测或功效性检测中的应用。
优选地，所述表皮相关安全性检测包含皮肤刺激性检测、皮肤屏障修复检测、保湿性检测、抗炎功效检测；所述功效性检测包含美白功效检测、防晒功效检测。
相对于现有技术，上述技术方案中的一个技术方案的有益效果如下：
上述提供的含有黑色素的表皮皮肤模型是应用细胞生物学和组织工程学原理，将少量种子细胞经体外扩增后构建而成，其结构与正常表皮结构高度类似，由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘层和基底层，具有完整的上皮结构，并且含有黑素细胞，能高度模拟正常表皮中黑色素的合成、分泌及转运。
所构建的含黑色素的表皮皮肤模型，同时具有表皮皮肤模型的功能及正常的黑色素细胞的响应，可用于各种药物及化妆品的表皮相关安全及功效性检测（皮肤刺激性、屏障、保湿、抗炎功效等），及美白功效的体外长期检测 。
采用人表皮角质形成细胞和黑色素细胞进行共提取、共培养，并同时接种至模型培养小室中，与传统的分别获取并培养两种细胞的方法相比，该操作简化了操作流程，缩短了整体模型构建时间，从材料、时间等各方面均降低了生产成本，并有利于黑色素细胞与表皮角质形成细胞均匀分布。
基础培养基KC-Growth不含血清，排除血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高后期检测的适用性和准确度。
所述第一培养基、第二培养基、第三培养液中均添加了整合素α3β1及12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯，能够促进黑色素细胞的贴壁及增殖，有利于黑色素细胞与表皮角质形成细胞均匀分布，黑色素细胞突起伸入到角质形成细胞之间。
模型构建阶段各因子的添加，在保证了表皮角质形成细胞的营养需求的同时，促进了表皮角质形成细胞分泌ET-1、bFGF等因子，这种细胞微环境的影响可进一步促进黑色素细胞的增殖及黑色素的生成及转运。
液下培养及气液面培养阶段添加了不同浓度的氢化可的松及CaCl2，保证了细胞不同时期的需求，有利于复层化表皮结构的形成。
附图说明
图1 显示了人表皮角质形成细胞与黑色素细胞共培养后的人原代表皮角质形成细胞及黑色素细胞显微图；
图2 为含黑色素的表皮皮肤模型的表观拍照；
图3 为含有黑色素的表皮皮肤模型的组织学切片H&E染色；
图4 为含有黑色素的表皮皮肤模型的银染结果；
图5A为出厂时含有黑色素的表皮皮肤模型的美白功效表观色度检测结果；
图5B-5G为含有黑色素的表皮皮肤模型辐射6天后的美白功效表观色度检测结果；
图6 含有黑色素的表皮皮肤模型的美白功效L*值检测结果；
图7含有黑色素的表皮皮肤模型的美白功效黑素含量检测结果。
具体实施例
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：
本实施例介绍一种含黑色素的表皮皮肤模型,所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。本实施例提供的含有黑色素的表皮皮肤模型是应用细胞生物学和组织工程学原理，将少量种子细胞经体外扩增后构建而成，其结构与正常表皮结构高度类似，由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘层和基底层，具有完整的上皮结构，并且含有黑素细胞，能高度模拟正常表皮中黑色素的合成、分泌及转运。所述含黑色素的表皮皮肤模型，同时具有表皮皮肤模型的功能及正常的黑色素细胞的响应，可用于各种药物及化妆品的表皮相关安全及功效性检测（皮肤刺激性、屏障、保湿、抗炎功效等），及美白功效的体外长期检测 。
所述含黑色素的表皮皮肤模型培养过程中采用人表皮角质形成细胞和黑色素细胞进行共提取、共培养，并同时接种至模型培养小室中，与传统的分别获取并培养两种细胞的方法相比，该操作简化了操作流程，缩短了整体模型构建时间，从材料、时间等各方面均降低了生产成本，并有利于黑色素细胞与表皮角质形成细胞均匀分布。
利用该方法共培养的人原代表皮角质形成细胞及黑色素细胞显微镜下形态照片见图1. 图片中显示的角质形成细胞与黑色素细胞均具有较好的细胞状态，黑色素细胞胞核透光性好，细胞树突分支较少（树突量<3个），具有较好的细胞活性及生物学功能。
实施例2
本实施例着重介绍一种含有黑色素的表皮皮肤模型的体外构建方法，包括以下步骤：
步骤一、原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞获取：
将离体的人体皮肤组织用质量分数为75%的乙醇浸泡30秒，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗干净，将组织表皮面向下铺展于平皿中，弯头剪剥离去除皮下疏松结缔组织，暴露致密结缔组织，后转入新鲜PBS中浸洗干净，后将组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1%的Dispase酶消化液中，37℃浸泡2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中，37℃消化10分钟，加入15 mL终止液，用弯头吸管轻柔吹打100次，无菌条件下用200目筛网过滤，800 转/分钟离心6分钟，弃上清，得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，备用。
上述100mL的胰酶/EDTA消化液中含0.025g胰酶、0.01g的EDTA。终止液为含10%血清的DMEM。
步骤二、原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞共培养：
在步骤一所得原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物中，加入第一培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育5天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物，所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞比例为30:1，备用。
上述第一培养基的组分为在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10μL/106cells的整合素α3β1、10ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯（12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯）。
步骤三、含黑色素的表皮皮肤模型的液下培养：
将步骤二所得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
上述第二培养基的组分为：在500mL KC-Growth基础培养基中，添加表皮生长因子0.5μg、腺嘌呤5mg、转铁蛋白2.5μg、角质形成细胞生长因子1μg、胰岛素2μg、氢化可的松10μg、牛脑垂体提取物10mg、整合素α3β1为10μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为10ng。
步骤四、含黑色素的表皮皮肤模型的气液面培养：
将模型细胞层中第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
上述第三培养液为：在500mL KC-Growth基础液中，添加表皮生长因子0.5μg、腺嘌呤5mg、转铁蛋白2.5μg、角质形成细胞生长因子1μg、胰岛素2μg、氢化可的松50μg、牛脑垂体提取物10mg、整合素α3β1为30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50ng、CaCl2为50mg。
利用该方法共培养的人原代表皮角质形成细胞及黑色素细胞显微镜下形态照片见图1. 图片中显示的角质形成细胞与黑色素细胞均具有较好的细胞状态，黑色素细胞胞核透光性好，细胞树突分支较少（树突量<3个），具有较好的细胞活性及生物学功能。
实施例3：
本实施例着重介绍一种含有黑色素的表皮皮肤模型的体外构建方法，包括以下步骤：
步骤一、原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞获取：
将离体的人体皮肤组织用质量分数为75%的乙醇浸泡30秒，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗干净，将组织表皮面向下铺展于平皿中，弯头剪剥离去除皮下疏松结缔组织，暴露致密结缔组织，后转入新鲜PBS中浸洗干净，后将组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1%的Dispase酶消化液中，37℃浸泡2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中，37℃消化12分钟，加入15 mL终止液，用弯头吸管轻柔吹打150次，无菌条件下用200目筛网过滤，800 转/分钟离心6 分钟，弃上清，得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，备用。
上述100mL的胰酶/EDTA消化液中含0.03g胰酶、0.01g的EDTA。终止液为含10%血清的DMEM。
步骤二、原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞共培养：
在步骤一所得原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物中，加入第一培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以4.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物，所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞比例为20:1，备用。
上述第一培养基为在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加20μL/106cells的整合素α3β1、30ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯（12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯）。
步骤三、含黑色素的表皮皮肤模型的液下培养：
将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.5×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育2天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
上述第二培养基为：在500mL KC-Growth基础培养基中，添加表皮生长因子2μg、腺嘌呤15mg、转铁蛋白4μg、角质形成细胞生长因子2.5μg、胰岛素4μg、氢化可的松20μg、牛脑垂体提取物30mg、整合素α3β1为20μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为30ng。
步骤四、含黑色素的表皮皮肤模型的气液面培养：
将步骤三所得模型细胞小室中培养液弃掉，并将培养皿中的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
上述第三培养液为：在500mL KC-Growth基础液中，添加表皮生长因子2μg、腺嘌呤15mg、转铁蛋白4μg、角质形成细胞生长因子2.5μg、胰岛素4μg、氢化可的松50μg、牛脑垂体提取物30mg、整合素α3β1为40μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为70ng、CaCl2为50mg。
利用该方法所构建的含黑色素的表皮皮肤模型的表观拍照见图2，该模型的组织学切片H&E染色照片见图3。其结果显示：所构建的含有黑色素的表皮皮肤模型包含基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层结构，具有完整的上皮结构，且黑色素大部分处于模型的底层，接近于天然皮肤结构中黑色素的定位。
实施例4：
本实施例着重介绍一种含有黑色素的表皮皮肤模型的体外构建方法，包括以下步骤：
步骤一、原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞获取：
将离体的人体皮肤组织用质量分数为80%的乙醇浸泡30秒，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗干净，将组织表皮面向下铺展于平皿中，弯头剪剥离去除皮下疏松结缔组织，暴露致密结缔组织，后转入新鲜PBS中浸洗干净，后将组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1%的Dispase酶消化液中，37℃浸泡1小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中，37℃消化15 分钟，加入15 mL终止液，用弯头吸管轻柔吹打100次，无菌条件下用200目筛网过滤，800 转/分钟离心5分钟，弃上清，得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，备用。
上述100mL的胰酶/EDTA消化液中含0.05g胰酶、0.01g的EDTA。终止液为含10%血清的DMEM。
步骤二、原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞共培养：
在步骤一所得原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物中，加入第一培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育5天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物，所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞比例为9:1，备用。
上述第一培养基为在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加30μL/106cells的整合素α3β1、50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯（12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯）。
步骤三、含黑色素的表皮皮肤模型的液下培养：
将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育2天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
上述第二培养基为：在500mL KC-Growth基础培养基中，添加表皮生长因子5μg、腺嘌呤25mg、转铁蛋白6μg、角质形成细胞生长因子5μg、胰岛素10μg、氢化可的松50μg、牛脑垂体提取物100mg、整合素α3β1为30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50ng。
步骤四、含黑色素的表皮皮肤模型的气液面培养：
将步骤三所得模型细胞小室中培养液弃掉，并将培养皿中的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
上述第三培养液为：在500mL KC-Growth基础液中，添加表皮生长因子5μg、腺嘌呤25mg、转铁蛋白6μg、角质形成细胞生长因子5μg、胰岛素10μg、氢化可的松100μg、牛脑垂体提取物100mg、整合素α3β1为60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为100ng、CaCl2为100mg。
利用该方法所构建的含黑色素的表皮皮肤模型的银染照片见图4. 其结果显示：黑色素大部分处于模型的底层，接近于天然皮肤结构中黑色素的定位。
实施例5：
本实施例着重介绍一种利用含有黑色素的表皮皮肤模型的体外美白检测方法：
采用本发明制备的模型出厂后，记为0d，进行表观拍照，图5参考图5A，用UVB进行辐照，并在模型表面进行给药暴露，连续照射并给药6天，之后收集模型（记为6d），进行表观拍照，参考图5B-图5G、L*值如图6所示、黑素含量如图7所示。
根据表观色度（图5B-图5G）、L*值（图6）和黑素含量（图7）结果显示，与Control组相比，阳性对照组（KA）给药处理后，表观明显变白，L值极显著提升（p<0.01），黑素含量显著下降（p<0.01），说明美白检测体系正常；与Control组相比，样品S1、S2、S3和S4给药处理后，表观色度变白，L值均显著提升（p<0.05），黑素含量除样品S1以外，均显著降低（p<0.05）。
由此可知，所构建的含有黑色素的表皮皮肤模型经过UVB的暴露后会生成黑色素，该模型在黑色素的生成、转运方面具有与正常皮肤类似的生理功能，可用于化妆品、药品、化学品等产品的美白功效检测。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出多种形式的变化，这些均属于本发明保护之列。
Claims (28)
1.含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。
2.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15 分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。
3.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。
4.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。
5.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。
6.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述终止液为含10%血清的DMEM。
7.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。
8.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素细胞的比例为40:1～9:1。
9.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第一培养基的配方为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/106cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。
10.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105～5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
11.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 10～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。
12.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述气液面培养的过程为：将所述模型细胞层的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6~8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
13.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第三培养液的组分为：以含有KC-Growth基础液500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松50～100μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 为30～60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50～100ng和CaCl250～100mg。
14.含黑色素的表皮皮肤模型的体外构建方法，其特征在于，包含以下步骤：采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物进行体外共培养、液下培养和气液面培养，获得具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15 分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。
17.根据权利要求15所述的方法,其特征在于，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。
18.根据权利要求15所述的方法,其特征在于，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。
19.根据权利要求15所述的方法,其特征在于，所述终止液为含10%血清的DMEM。
20.根据权利要求14所述的方法,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO2、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。
21.根据权利要求20所述的方法,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素细胞的比例为40:1～9:1。
22.根据权利要求20所述的方法,其特征在于，所述第一培养基的配制方法为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/106cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。
23.根据权利要求14所述的方法,其特征在于，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的Transwell小室中，接种密度为2.0×105～5.0×105/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。
24.根据权利要求14所述的方法,其特征在于，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 10～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。
25. 根据权利要求14所述的方法,其特征在于，所述气液面培养的过程为：将所述模型细胞层的第二培养基替换为第三培养液，进行气液面培养，在5% CO2、37℃、95%相对湿度的细胞培养箱中孵育6~8天，每天换液，制备成具有完整上皮结构的含黑色素的表皮皮肤模型。
26.根据权利要求14所述的方法,其特征在于，所述第三培养液的组分为：以含有KC-Growth基础液500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松50～100μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 为30～60μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯为50～100ng和CaCl250～100mg。
27.权利要求1-13任一项所述的含黑色素的表皮皮肤模型在药品、化学品或化妆品的表皮相关安全性检测或功效性检测中的应用。
28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述表皮相关安全性检测包含皮肤刺激性检测、皮肤屏障修复检测、保湿性检测、抗炎功效检测；所述功效性检测包含美白功效检测、防晒功效检测。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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