CN109303784A - 痛风性关节炎动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种痛风性关节炎动物模型的构建方法,包括以下步骤:(1)尿酸盐结晶混悬液的制备;(2)高尿酸血症基础动物模型的建立;(3)痛风性关节炎动物模型的建立;本发明选择SPF鸡作为实验动物,通过高蛋白高钙饲料喂养建立高尿酸血症模型,将尿酸盐晶体混悬液注入高尿酸血症模型鸡的膝关节腔,最大程度模拟痛风性关节炎病人的体内微环境,建立了一种更符合人体内环境的痛风性关节炎动物模型。
Description
技术领域
本发明涉及医学动物模型研究领域,具体涉及一种痛风性关节炎动物模型的构建方法。
背景技术
痛风性关节炎是因嘌呤代谢紊乱导致尿酸盐结晶体(monosodium uratecrystal,MUC)沉积于关节内外组织所引起的炎性反应性疾病。主要临床表现为反复发作性关节红、肿、热、痛与功能障碍,严重的会引起关节畸形。发病机制是关节内尿酸浓度过饱和形成结晶,脱落的结晶触发机体固有免疫反应,引起肥大细胞、单核巨噬细胞系统的活化,通过一系列复杂的细胞内级联反应分泌白细胞介素及肿瘤坏死因子,引发急性炎症反应。急性发作具有自限性的特点,但易反复发作,长期的 MUC 沉积于关节滑膜、软骨、关节囊等部位可导致其破坏溶解,从而逐渐产生对骨与关节的破坏。MUC 持续存在成为痛风性关节炎反复发作最直接的因素,如何彻底去除已沉积在关节腔内的 MUC 成为控制痛风性关节炎反复发作的关键。
痛风性关节炎动物模型是研究痛风发病及治疗的一种重要手段。目前,痛风的动物模型最经典的是微晶尿酸钠型大鼠痛风性关节炎模型和家兔急性痛风性关节炎模型。但是,啮齿、哺乳类动物体内尿酸代谢与人类有很大区别,它们体内的尿酸可以继续通过尿酸酶等进一步分解成尿囊素。尿囊素为无毒物质,水溶性良好,极易随尿排出体外,很少在体内蓄积,不产生结晶,也不会在组织内沉积形成痛风石而造成损害。而人体由于缺乏尿酸酶,尿酸是机体嘌呤代谢的最终产物,大部分以尿酸的形式从尿中排出,仅有很少一部分(约为 1/20)被分解为尿囊素、氨等。由于上述尿酸代谢差异存在,使得现有痛风性关节炎动物模型与人体内环境差异大,而影响研究效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更符合人体内环境的痛风性关节炎动物模型的构建方法。
为了实现上述目的,本发明的技术方案采用了一种痛风性关节炎动物模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)尿酸盐结晶混悬液的制备;
(2)高尿酸血症基础动物模型的建立;
(3)痛风性关节炎动物模型的建立;
所述步骤(1)中尿酸盐结晶混悬液由以下方法获得:a.将手术中从痛风病人手足处取得的痛风石,置于温箱内烘干,后将白色结晶置入洁净烧杯中,放入蒸馏水,用玻棒搅拌数分钟,待其基本完全溶解,用漏斗垫上滤纸过滤掉沉渣及杂质,后把溶液置于温箱内烘干,得到尿酸盐结晶;将尿酸盐晶体研磨粉碎后,用孔径 250um 的金属网筛过滤,制作成纯化尿酸盐结晶备用;
b.将上述纯化的尿酸盐结晶置于180℃高温灭菌箱3h,然后用体积分数为95%的乙醇洗涤,2000r/min离心15min 3次,室温自然干燥,于超净台上取500mg尿酸盐晶体加9ml生理盐水、1ml吐温80,加热搅拌,配成10ml 50mg/ml尿酸盐溶液。
所述步骤(2)中实验动物选择健康的 30 日龄雄性 SPF鸡,体重500g±50g,适应性喂养 2 周后,开始用高蛋白质高钙饲料饲喂,当SPF 鸡出现痛风的表现后抽取其翅静脉血,分离血清,磷钨酸比色法测血尿酸值,以血尿酸大于 80 mg/ L 的 SPF 鸡作为高尿酸血症基础模型鸡。
所述步骤(3)中实验动物选择步骤(2)中获得高尿酸血症基础模型鸡,麻醉后,消毒左侧膝关节,将 0.5ml 质量浓度为 50mg/ml 的尿酸盐晶体混悬液,注入膝关节腔,伸曲、旋转运动 10min。
本发明痛风性关节炎动物模型构建采用SPF鸡作为实验动物,鸡在尿酸合成和代谢方面与人类有共同之处:其一,鸡体内的核蛋白水解后的核酸在降解过程中也能产生嘌呤类化合物而生成尿酸,当饲料里蛋白质和核蛋白过高时,鸡体内尿酸的生成就大量增加;其二,鸡与人类一样缺乏尿酸酶,故尿酸是其嘌呤代谢的最终产物。因此动物模型选择鸡作为实验动物,通过高蛋白高钙饲料喂养建立高尿酸血症模型,将尿酸盐晶体混悬液注入高尿酸血症模型鸡的膝关节腔,最大程度模拟痛风性关节炎病人的体内微环境,建立了一种更符合人体内环境的痛风性关节炎动物模型。
附图说明
图1 建模前正常的滑膜组织。
图2 A组处理后滑膜组织。
图3 B组处理后滑膜组织。
图4 C组处理后滑膜组织。
具体实施方式
实施例1按照以下方法构建痛风性关节炎动物模型
1.尿酸盐结晶混悬液的制备:
步骤一:将手术中从痛风病人手足处取得的痛风石,置于温箱内烘干,后将白色结晶置入洁净烧杯中,放入适量蒸馏水,用玻棒搅拌数分钟,待其基本完全溶解,用漏斗垫上滤纸过滤掉沉渣及杂质,后把溶液置于温箱内烘干,得到尿酸盐结晶。将尿酸盐晶体研磨粉碎后,用孔径 250um 的金属网筛过滤,制作成纯化尿酸盐结晶备用。
步骤二:将上述纯化的尿酸盐结晶置于180℃高温灭菌箱3h,然后用体积分数为95%的乙醇洗涤,2000r/min离心15min 3次,室温自然干燥,于超净台上取500mg尿酸盐晶体加9ml生理盐水、1ml吐温80,加热搅拌,配成10ml 50mg/ml尿酸盐溶液。
2.高尿酸血症基础动物模型的建立:
选择健康的 30 日龄雄性 SPF 鸡 200 只,体重(500±50)g,特殊饲料指高蛋白质高钙饲料,主要成分比例为玉米粉 50%、豆粕 30%、进口鱼粉 6%、钙粉 7%、磷酸钙粉 7%。SPF鸡适应性喂养 2 周后,开始进行特殊饲料喂养,每日自由进食,每只鸡每日控制进水100ml 以内,约 2W 待 SPF 鸡出现痛风的表现(精神不振,羽毛松乱,闭眼发呆,排白色干粪,关节肿大,运动迟缓,疼痛跛行,站立不稳,趾部和足部肿胀增粗变形等)后,抽取其翅静脉血,分离血清,磷钨酸比色法测血尿酸值,以血尿酸大于 80 mg/ L 的 SPF 鸡作为高尿酸血症基础模型鸡。
3.痛风性关节炎动物模型的建立:
将步骤(2)中符合条件的高尿酸血症基础模型鸡,采用 1%戊巴比妥钠 15mg/kg 翼根静脉注射麻醉。麻醉成功后,75%酒精消毒左侧膝关节,用 7 号注射针将 0.5ml 质量浓度为 100mg/ml 的尿酸盐晶体混悬液,注入膝关节腔,伸曲、旋转运动 10min。
实施例2痛风性关节炎动物模型评价
1.实验分组
健康的 30 日龄雄性 SPF 鸡 120只,体重(500±50)g,随机分成3组,空白对照组(A组)、模型组1(B组)、模型组2(C组),每组40只。
2.造模方式
A组:普通饲料喂养,2周后左膝关节腔注射0.5ml蒸馏水。
B组:特殊饲料喂养,2周后左膝关节腔注射0.5ml蒸馏水。
C组:特殊饲料喂养,2周后左膝关节腔注射0.5ml 质量浓度为 100mg/ml 的尿酸盐晶体混悬液。
全部注射完毕后,膝关节屈伸、旋转运动 10min。继续各组饲料喂养1周。
特殊饲料指高蛋白质高钙饲料,主要成分比例为玉米粉 50%、豆粕 30%、进口鱼粉6%、钙粉 7%、磷酸钙粉 7%。
3.观察指标
3.1观察模型鸡的活动、进食、精神情况。
于1d,7d,14d,21d进每组随机选取10只动物进行形态观察。
3.2膝关节周径:于1d,7d,14d,21d选取10只动物测量左膝关节同一部位周径进行比较。
3.3血清尿酸:于1d,7d,14d,21d 选取10只动物抽取其翅静脉血,分离血清后测血尿酸值。
3.4于建模前,建模后处死选取的10只动物取关节滑膜切片,镜下观察病理改变。
4.统计处理
指标数据属计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用软件SPSS18.0对数椐进行统计分析,满足正态性和方差齐性,用多重比较的单因素方差分析LSD法;满足正态性但不满足方差齐性的,用Dunnett’S T3检验。以P<0.01差异有显著统计学意义,P<0.05差异有统计学意义,P>0.05差异无统计学意义。
5.实验结果
5.1形态观察
表1. 三组动物形态观察评分的比较(x±s,分)
组别 | n(只) | 1d | 7d | 14d | 21d |
A组 | 10 | 99.31±0.46 | 99.15±0.21 | 98.96±0.52 | 99.01±0.34 |
B组 | 10 | 98.92±0.61 | 80.26±12.25 | 73.52±13.37 | 55.98±4.82 |
C组 | 10 | 99.05±0.42 | 79.86±0.57 | 65.47±14.65 | 44.63±16.8 |
造模1d、7d、14d、21d,A组无明显形态改变(P>0.05);B、C组均发生明显形态改变(P<0.01);B、C组间亦存在差异,C组发生的形态改变较B组明显(P<0.05)。
5.2膝关节周径
表2. 三组动物关节周径的比较(x±s,cm)
组别 | n(只) | 1d | 7d | 14d | 21d |
A组 | 10 | 6.21±0.21 | 6.51±0.23 | 6.63±0.21 | 7.01±0.18 |
B组 | 10 | 6.32±0.61 | 6.93±0.24 | 7.52±0.31 | 8.78±0.42 |
C组 | 10 | 6.18±0.42 | 7.39±0.21 | 9.32±0.21 | 10.61±0.17 |
造模1d、7d、14d、21d,A组无明显周径变化(P>0.05);B、C组均有明显周径变化(PB<0.05,PC<0.01);B、C组间亦存在显著差异,C组周径改变较B组更明显(P<0.05)。
5.3血清尿酸
表3. 三组动物血尿酸水平的比较(x±s,umol/L)
组别 | n(只) | 1d | 7d | 14d | 21d |
A组 | 10 | 185.11±0.09 | 186.54±0.21 | 187.58±1.31 | 186.88±1.31 |
B组 | 10 | 180.30±0.89 | 245.83±3.52 | 272.53±4.89 | 353.65±4.81 |
C组 | 10 | 179.45±0.82 | 278.74±6.50 | 352.85±5.77 | 490.43±6.42 |
造模1d、7d、14d、21d,A组血尿酸水平无明显改变(P>0.05);B、C组血尿酸水平均明显升高(P<0.05);B、C组间亦存在差异,C组血尿酸升高较B组明显(P<0.05)。
5.4病理变化
5.4.1关节滑膜中中性粒细胞数量
表4. 三组动物关节滑膜中中性粒细胞数量的比较(x±s,个)
组别 | n(只) | 1d | 7d | 14d | 21d |
A组 | 10 | 2.30±0.10 | 2.10±0.60 | 2.40±0.70 | 2.20±0.50 |
B组 | 10 | 2.10±0.50 | 7.10±0.40 | 15.50±0.20 | 20.10±0.30 |
C组 | 10 | 2.40±0.40 | 10.70±0.80 | 21.20±0.40 | 29.00±0.20 |
造模1d、7d、14d、21d,A组中性粒细胞数量无明显变化(P>0.05);B、C组中性粒细胞均显著升高(P<0.01);B、C组间亦存在差异,C组中性粒细胞数量升高较B组明显(P<0.05)。
5.4.2动物关节滑膜中血管数量
表5. 三组动物关节滑膜中血管数量的比较(x±s,个)
组别 | n(只) | 1d | 7d | 14d | 21d |
A组 | 10 | 4.20±0.30 | 4.30±0.40 | 4.40±0.20 | 4.50±0.10 |
B组 | 10 | 4.30±0.10 | 5.60±0.60 | 6.80±0.90 | 7.90±0.30 |
C组 | 10 | 4.10±0.40 | 6.90±0.70 | 8.20±0.30 | 10.60±0.40 |
造模1d、7d、14d、21d,A组血管数量无明显变化(P>0.05);B、C组血管数量均明显增加(P<0.05);B、C组间亦存在差异,C组血管数量高于B(P<0.05)。
5.4.3三组动物滑膜的病理学改变
A组(如图2所示),滑膜层细胞性内膜由1~3层细胞组成,组织结构完整、层次清析。B组(如图3所示),滑膜组织结构破坏,稍增厚、层次紊乱,滑膜下层细胞数增多,部分成束状,少量血管增生并小血管充血扩张,伴大量中性粒细胞浸润。C组(如图4所示),滑膜组织结构严重破坏,增厚、层次紊乱,滑膜下层细胞数显著增多,部分成束状,大量血管增生并小血管充血扩张,伴大量中性粒细胞浸润。
结果
6.1本研究证明应用特殊饲料(指高蛋白质高钙饲料,主要成分比例为玉米粉 50%、豆粕 30%、进口鱼粉 6%、钙粉 7%、磷酸钙粉 7%)可建立高尿酸血症模型、痛风基础模型,关节腔注射尿酸盐结晶混悬液可快速建立更符合人体内环境的痛风性关节炎动物模型。
6.2此方法建立的痛风性关节炎动物模型,症状典型,各项指标显著,模型稳定复制度高,21天即可成功。
本发明克服了现有的模型构建技术的缺陷,提供一种与人类患病机理相似的,由长期高尿酸血症诱导形成的鸡痛风动物模型,用于痛风发病机理的研究,鸡体内的核蛋白水解后的核酸在降解过程中也能产生嘌呤类化合物而生成尿酸,当饲料里蛋白质和核蛋白过高时,鸡体内尿酸的生成就大量增加;另外,鸡与人类一样缺乏尿酸酶,故尿酸是其嘌呤代谢的最终产物。因此动物模型选择鸡作为实验动物,通过高蛋白高钙饲料喂养建立高尿酸血症模型,将取自痛风患者手足处的痛风石纯化后,制作尿酸盐晶体混悬液,注入高尿酸血症模型鸡的膝关节腔,最大程度模拟痛风性关节炎病人的体内微环境,建立一种全新的型痛风性关节炎动物模型。
本发明和现有技术相比具有以下优点:
(1)本发明在原有的技术基础上,选择鸡作为实验动物,其与人体均没有可降解尿酸的酶,通过高钙高蛋白质饮食建立高尿酸血症基础模型,与人痛风临床现象高度相似。
(2) 实验动物膝关节腔内注射人体尿酸盐结晶混悬液,缩短了建模时间,并且能更好的模仿人类痛风发病过程,且该方法操作简便,经济,易于操作。
(3)发明建立得到的动物模型使用方便,极具研究价值和医疗用途前景。
综合上述,本发明所涉及的鸡痛风动物模型建立的方法更接近人类痛风疾病的发病机制,可以最大程度上的模拟临床上形成的痛风疾病,有利于研究人类痛风疾病的发病机制以及治疗药物靶点的设计。本发明建立的动物模型使用方便,极具研究价值和医药用途的前景。
Claims (3)
1.一种痛风性关节炎动物模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)尿酸盐结晶混悬液的制备;
(2)高尿酸血症基础动物模型的建立;
(3)痛风性关节炎动物模型的建立;
所述步骤(2)中实验动物选择健康的 30 日龄雄性 SPF鸡,体重500g±50g,适应性喂养 2 周后,开始用高蛋白质高钙饲料饲喂,当SPF 鸡出现痛风的表现后抽取其翅静脉血,分离血清,磷钨酸比色法测血尿酸值,以血尿酸大于 80 mg/ L 的 SPF 鸡作为高尿酸血症基础模型鸡;
所述步骤(3)中实验动物选择步骤(2)中获得高尿酸血症基础模型鸡,麻醉后,消毒左侧膝关节,将 0.5ml 质量浓度为 50mg/ml 的尿酸盐晶体混悬液,注入膝关节腔,伸曲、旋转运动 10min。
2.根据权利要求1所述的痛风性关节炎动物模型的构建方法,其特征是所述步骤(1)中尿酸盐结晶混悬液由以下方法获得:
a.将手术中从痛风病人手足处取得的痛风石,置于温箱内烘干,后将白色结晶置入洁净烧杯中,放入蒸馏水,用玻棒搅拌数分钟,待其基本完全溶解,用漏斗垫上滤纸过滤掉沉渣及杂质,后把溶液置于温箱内烘干,得到尿酸盐结晶;将尿酸盐晶体研磨粉碎后,用孔径250um 的金属网筛过滤,制作成纯化尿酸盐结晶备用;
b.将上述纯化的尿酸盐结晶置于180℃高温灭菌箱3h,然后用体积分数为95%的乙醇洗涤,2000r/min离心15min 3次,室温自然干燥,于超净台上取500mg尿酸盐晶体加9ml生理盐水、1ml吐温80,加热搅拌,配成10ml 50mg/ml尿酸盐溶液。
3.根据权利要求1所述的痛风性关节炎动物模型的构建方法,其特征是高蛋白质高钙饲料主要成分比例为玉米粉 50%、豆粕 30%、进口鱼粉 6%、钙粉 7%、磷酸钙粉 7%。
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