CN114946767A - 一种饮食诱导的痛风性关节炎动物模型的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种痛风性关节炎动物模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：选取幼龄禽类为造模动物；给予造模动物高蛋白高钙饲料和糖水进行饲养；连续饲养至造模成功。
Description
技术领域
本发明提供一种痛风性关节炎动物模型的构建方法及其应用，属于动物实验模型技术领域。
背景技术
痛风性关节炎是长期高尿酸状态下致尿酸盐沉积于关节囊、滑囊、软骨等组织中而引发关节炎症及病损的一类代谢障碍性疾病。《高尿酸血症与痛风病证结合诊疗指南(2021-01-20)》指出在有症状的关节、关节滑液或痛风结节中发现MSU即可诊断为痛风性关节炎。随着人们饮食结构的改变，该病趋于年轻化，呈高病发率及高致残性，同时伴随着高血压、糖尿病、心脑血管等疾病，严重影响人们的日常生活。
现有的痛风性关节炎动物模型存在一定的局限性。在模型动物选择上，多选用啮齿类动物(大鼠、小鼠)，该类动物体内缺乏尿酸酶，其尿酸代谢途径与人类存在较大差异；在造模方法上，以关节尿酸盐注射方法较为常见，该法虽可较好模拟局部关节的疾病表现，但该法采用外源性注射MSU，会对实验动物形成创伤性后果，使关节局部的炎症水平(IL-1β、TNF-α等)升高，引起暂时的非特异性炎症反应、无法形成稳定的模型，且与人类痛风的发病机理大不相同。无法较好模拟临床发病病因的痛风模型，极大限制了痛风基础研究的发展进程。为解决这一现状，开展痛风性关节炎的发病机制及药物防治研究成为当下的研究重点，而这很大程度上依赖于痛风性关节炎动物模型的建立与应用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种模拟临床发病特点痛风性关节炎动物模型的构建方法以及所构建的动物模型在筛选或鉴定针对痛风性关节炎的药物中的应用。
作为本申请的一个方面，本申请提供一种痛风性关节炎动物模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：
选取幼龄禽类为造模动物；
给予造模动物高蛋白高钙饲料和糖水进行饲养；
连续饲养至造模成功。
优选的，所述禽类选自鹌鹑或鸡；进一步优选为鹌鹑。
优选的，所述幼龄为20～25日龄；进一步优选22～25日龄；最优选为25日龄。
优选的，所述糖水为8％～15％果糖水；进一步优选，所述糖水的日饮用水量为5～20ml。
优选的，所述饲养时间为20天～50天；进一步优选的，所述饲养时间为25天～40天；最优选的，所述饲养时间为30天。
优选的，饲养环境温度为20℃～25℃，湿度为40％～60％。
优选的，所述造模方法进一步包括模型评价。所述模型评价项目包括如下项目中的一项或多项：腕关节至足爪关节的肿胀程度观察；血清尿酸和膝关节液尿酸水平的检测；腕关节及足爪关节的病理观察；关节液的尿酸盐沉积情况。
本申请所述高蛋白高钙饲料是指在常规饲料中加入高蛋白和高钙成分。所述高蛋白高钙饲料的蛋白质百分含量为25％～40％，钙百分含量为5％～10％。优选的，所述的高蛋白高钙饲料由15％～30％酵母浸膏粉、25％～45％骨粉、40％～60％常规动物饲料组成。
作为本申请的第二个方面，本申请提供上述构建方法制备的动物模型在筛选或鉴定具有预防、缓解或治疗痛风关节炎作用的药物中的应用。
本申请的有益效果：
本申请弥补了现有模型造模方法的不足，从机体自身因素与饮食条件出发，饮食诱导鹌鹑的痛风性关节炎模型。提供了一种模拟人类临床发病特点的痛风性关节炎动物模型的构建方法。本申请所述的痛风性关节炎动物模型，可用于痛风相关的疾病机制研究、药物筛选及药理机制研究。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
①在造模动物方面，选取的模型动物鹌鹑与人类尿酸代谢途径一致，更好地模拟人类痛风性关节炎的病症特点。
②在造模剂设计上，模拟临床痛风性关节炎的发病因素(高蛋白物质、含果糖饮料的摄入)，以饮食自发诱导鹌鹑痛风性关节炎模型，贴合临床痛风的发病病因。
③在实验操作技术上，造模动物操作简便、造模方法简单可行、造模时长短，模型稳定、均匀，具有重要的临床应用价值。
④首次通过饮食诱导实现了关节内尿酸盐沉积，造模时间短，成功率高，模型具有持续性和稳定性。
附图说明
图1为实施例1痛风性关节炎模型成模后鹌鹑肾脏组织病理切片尿酸盐染色结果(×400)；其中，1-1为25日龄正常组肾脏，1-2为25日龄模型组肾脏，1-3为40日龄正常组肾脏，1-2为40日龄模型组肾脏。
图2为实施例1痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节液偏振光显微镜观察结果(×200)；其中，2-1为对照组，2-2为25日龄正常组关节液，2-3为25日龄模型组关节液，2-4为40日龄正常组关节液，2-5为40日龄模型组关节液。
图3为实施例2痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节和足爪关节外形观察；其中，3-1为正常组腕关节，3-2为模型组1腕关节，3-3为模型组2腕关节，3-4为正常组足爪关节，3-5为模型组1足爪关节，3-6为模型组2足爪关节。
图4为实施例2痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节和足爪关节病理切片HE染色结果(×200)，其中，4-1为正常组腕关节，4-2为模型组1腕关节，4-3为模型组2腕关节，4-4为正常组足爪关节，4-5为模型组1足爪关节，4-6为模型组2足爪关节。
图5为实施例2痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节液偏振光显微镜观察结果(×200)；其中，5-1为对照组，5-2为正常组关节液，5-3为模型组1关节液，5-4为模型组2关节液。
图6为实施例3痛风性关节炎模型成模后鹌鹑肾脏组织病理切片尿酸盐染色结果(×400)；其中，6-1为正常组肾脏，6-2为模型组1肾脏，6-3为模型组2肾脏。
图7为实施例3痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节液偏振光显微镜观察结果(×200)；其中，7-1为对照组，7-2为正常组关节液，7-3为模型组1关节液，7-4为模型组2关节液。
图8为实施例4痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节和足爪关节外形观察；其中，8-1为正常组腕关节，8-2为模型组腕关节，8-3为正常组足爪关节，8-4为模型组足爪关节，8-5为足爪关节解剖图。
图9为实施例4痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节和足爪关节病理切片HE染色结果(×200)，其中，9-1为正常组腕关节，9-2为模型组腕关节，9-3为正常组足爪关节，9-4为模型组1足爪关节。
图10为实施例4痛风性关节炎模型成模后鹌鹑足爪关节X线病理摄片；其中，10-1为正常组，10-2为模型组。
图11为实施例4痛风性关节炎模型成模后鹌鹑腕关节液偏振光显微镜观察结果(×200)；其中，11-1为对照组，11-2为正常组关节液，11-3为模型组关节液。
具体实施方式
以下实施例中所使用的的试剂包括分子生物学实验试剂和试剂盒等均可通过商业途径获得。如：酵母浸膏粉、骨粉、D-果糖、尿酸测定试剂盒、鸡细胞白介素1β测定试剂盒、尿酸标准品。
实施例1日龄对鹌鹑痛风性关节炎模型的诱导研究
本实验首先从日龄入手，探讨雏鹑与成鹑对关节尿酸盐沉积的影响，通过观察关节表征(外观形态、关节肿胀度)、尿酸盐沉积情况(偏振光显微观察、尿酸盐染色)、炎性因子表达(血清/关节组织IL-1β水平)等关键指标进行对比分析。
1实验方法
选取40日龄迪法克鹌鹑24只，25日龄迪法克鹌鹑24只，进行适应性饲养3d，按体质量随机分为4组，每组12只，分别为正常组(25日龄)、模型组(25日龄)，正常组(40日龄)、模型组(40日龄)。实验期间各组鹌鹑均给予清水，正常组(25日龄、40日龄)均给予足量清水，模型组(25日龄、40日龄)鹌鹑限制日饮水量为15mL/只/d。按照表1配制各组饲料，正常组(25日龄、40日龄)给予常规基础饲料，模型组(25日龄、40日龄)给予高蛋白高钙饲料，记录每日剩食量，实验持续30天。控制动物房室温20～25℃，湿度40％～60％。
表1实验日粮组成及营养水平(风干基础)％
注：预混料成分分析保证值(每千克含量)：维生素A 200000IU，维生素D360000IU，维生素E 380mg，维生素K3 56mg，维生素B1 56mg，维生素B2 200mg，维生素B660mg，维生素B12 300μg，生物素3mg，烟酸600mg，泛酸钙240mg，叶酸30mg，铜0.2g，铁1.8g，锰1.4g，锌1.1g，硒6mg，碘8.5mg，磷15～60g，钙100～250g，氯化钠50～150g，氨基酸28g。
2实验检测指标
实验期间，每日记录各组剩食量，以每10d为动态观察周期，采用皮尺测各组鹌鹑左右腕关节周径，取血前称重，禁食不禁水12h，于第10d对鹌鹑颈静脉取血，所取样本分离血清后，检测血清生化指标；第20d、30d随机选取各组5只鹌鹑剖取肾脏、腕关节、足爪组织固定、制作石蜡切片，实验第30d采用生理盐水0.2mL冲洗各组鹌鹑腕关节腔，所得腕关节液涂于载玻片上。
3实验试剂与药物
酵母浸膏粉，批号：2632703-02，500g，购自英国Oxoid公司；
骨粉，批号：20200820，500g，购自衡水爱宠商贸有限公司；
尿酸测定试剂盒，批号：191401，100T，购自中生北控生物科技股份有限公司；
尿素氮测定试剂盒，批号：20201117，96T，肌酐测定试剂盒，批号：20200910，96T，均购自南京建成生物工程研究所；
尿酸盐染色试剂盒，批号：20201012，4×50mL，购自北京索莱宝科技有限公司；
鸡细胞白介素1β测定试剂盒，批号：JL29727，96T，购自江莱生物科技有限公司。
4实验仪器与设备
SHZ88-1型台式水浴箱，太仓市光明实验分析仪器厂；3K1S低温高速离心机，德国Sigma公司；Sunrise酶标仪，瑞士TECAN公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱，北京鸿达天矩试验设备有限公司；Reichert Histo STAT石蜡组织切片机，美国AO公司；Olmpus BX53显微镜，日本奥林巴斯公司；Olmpus BX43生物显微镜，日本奥林巴斯公司；AHIMADZU B1-220H电子天平，日本岛津公司。
5实验数据分析
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，数据以平均数±标准差
表示，两组间数据比较根据方差齐与否采用独立样本T检验或非参数检验，多组间数据比较根据各组正态及方差齐与否采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较根据方差齐与否选择采用Dunnett-t检验或Dunnett’s T3检验。以P<0.05表示差异具有显著性差异，以P<0.01表示具有极显著性差异。
6实验结果
6.1体重
各组鹌鹑体重测定结果见表2。由表2可见，与正常组相比，25日龄下，实验20d、30d，模型组的体重显著降低(P<0.05)；40日龄下，实验10d～30d，模型组鹌鹑体重均显著降低(P<0.05或P<0.01)。
表2各组鹌鹑的体重(g，
)
注：与相同日龄同期正常组比，*P<0.05，**P<0.01。
6.2腕关节肿胀度
各组鹌鹑腕关节肿胀度见表3、4。由表3、4可见，与正常组相比，25日龄下，实验20d、30d，模型组鹌鹑左、右腕关节肿胀度均显著升高(P<0.05或P<0.01)；40日龄下，实验10d～30d，模型组鹌鹑左、右腕关节肿胀度均未见显著差异。
表3 25日龄鹌鹑的腕关节肿胀度变化(％，
)
注：与相同日龄同期正常组比，*P<0.05，**P<0.01。
表4 40日龄鹌鹑的腕关节肿胀度变化(％，
)
6.3血清尿酸水平
各组鹌鹑的血清尿酸水平见表5。由表5可知，与正常组相比，25日龄下，实验10d～30d，模型组鹌鹑的血清尿酸水平均显著升高(P<0.01)，40日龄下，实验10d～30d，模型组鹌鹑的血清尿酸水平均显著升高(P<0.01)。与25日龄模型组相比，实验0d，40日龄模型组鹌鹑的血清尿酸水平显著高于25日龄模型组(P<0.01)；实验30d，40日龄模型组鹌鹑的血清尿酸水平显著低于25日龄模型组(P<0.05)。
表5各组鹌鹑的血清尿酸水平(μmol/L，
)
注：与相同日龄同期正常组比，**P<0.01；与25日龄同期模型组比，#P<0.05，##P<0.01。
6.4炎性因子水平
各组鹌鹑的炎性因子白介素1β(IL-1β)水平见表6。由表6可知，与正常组相比，25日龄下，模型组鹌鹑的血清IL-1β水平显著升高(P<0.01)，模型组的腕关节组织IL-1β水平未见显著差异；40日龄下，模型组鹌鹑的血清与腕关节组织IL-1β水平均未见显著差异；与25日龄模型组相比，实验30d，40日龄模型组的腕关节组织IL-1β水平显著低于25日龄模型组(P<0.01)。
表6各组鹌鹑的炎性因子白介素1β(IL-1β)水平(pg/Ml，
n＝7)
注：与相同日龄同期正常组比，**P<0.01；与25日龄同期模型组比，##P<0.01。
6.5肾脏组织尿酸盐染色
结果见图1。由图1可见，25日龄与40日龄下，正常组鹌鹑肾组织无黑色尿酸盐结晶，模型组鹌鹑肾组织均可见明显的黑色尿酸盐结晶沉积于肾小管周围。实验第20d，25日龄模型组肾脏已见4例尿酸盐沉积，成功率达80％，40日龄模型组鹌鹑肾脏见3例尿酸盐沉积，成功率达60％。实验30d，25日龄与40日龄模型组肾脏尿酸盐沉积的成功率均达80％以上。
6.6腕关节液偏振光显微镜观察
结果见图2。由图2可见，采用3％尿酸盐溶液涂于载玻片作为对照组，黑色视野下，对照组可见蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体。25日龄下，正常组未见尿酸盐晶体，与对照组、正常组对比，模型组出现2例尿酸盐沉积，可见少量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体，成功率达29％；40日龄下，正常组未见尿酸盐晶体，与对照组、正常组对比，模型组亦未见尿酸盐晶体。
综上所述，选用25日龄鹌鹑造模更利于痛风性关节炎模型的诱导。该日龄条件可较好升高体内血清尿酸水平，实验30d可成功复制鹌鹑肾脏尿酸盐沉积，极大缩短了模型的塑造时长，且在一定程度上可诱发关节内尿酸盐沉积，致使血清炎性因子IL-1β高水平表达、腕关节与足趾关节肿胀变形等。但鹌鹑痛风性关节炎模型的成功率较低，尚不能较好应用于痛风的基础研究。由于本实验造模饮食条件仍沿用前期高蛋白高钙食饵结合限水条件，为更好实现鹌鹑痛风性关节炎模型的诱导，如何调整其造模饮食条件将是下一步的重点研究工作。
实施例2饮水对鹌鹑痛风性关节炎模型的诱导研究
本实验在此造模基础上，从饮食因素出发，重点考察不同饮水条件对模型鹌鹑的影响，即对比清水与10％果糖水(限制剂量饮用)对鹌鹑尿酸代谢及诱发关节型痛风的影响，以此进一步筛选合适的造模饲喂条件。
1实验方法
选取25日龄迪法克鹌鹑45只，适应性饲养3d，按体质量随机分为3组，每组15只，分别为正常组、模型组1(清水)，模型组2(10％果糖)。模型组1(清水)简称模型组1、模型组2(10％果糖)简称模型组2。实验期间，正常组给予足量清水，模型组1(清水)给予清水，模型组2(10％果糖)给予10％果糖水，均限制日饮水量为15mL/只/d。
2实验检测指标
实验期间，每日记录各组剩食量，以每10d为动态观察周期，采用皮尺测各组鹌鹑左右腕关节周径，取血前称重，禁食不禁水12h，于第10d对鹌鹑颈静脉取血，所取样本分离血清后，检测血清生化指标；取材前，收取12h鹌鹑粪尿混合物,检测粪尿上清液生化指标；第30d随机选取各组5只鹌鹑剖取相同部位肾脏、腕关节、足爪组织固定、制作石蜡切片，并采用生理盐水0.2mL冲洗各组鹌鹑腕关节腔、膝关节腔，所得腕关节液涂于载玻片上，膝关节液经处理后进入液相仪器检测。第80d，同实验第30d操作对剩余各组鹌鹑全部处死取材。
3实验试剂与药物
同实施例1“3实验试剂与药物”。
4实验仪器与设备
同实施例1“4实验仪器与设备”。
5实验数据分析
同实施例1“5实验数据分析”。
6实验结果
6.1体重
各组鹌鹑体重测定结果见表7。由表7可知，与正常组相比，实验10d～20d，模型组1(清水)鹌鹑体重呈下降趋势，但未见显著差异；实验10d、20d，模型组2(10％果糖)体重显著降低(P<0.05)。
表7各组鹌鹑的体重(g，
)
| 时间 | n | 正常组 | 模型组1(清水) | 模型组2(10％果糖) |
| 0d | 15 | 119.70±8.69 | 119.44±8.53 | 118.46±8.72 |
| 10d | 15 | 137.61±13.09 | 132.71±18.45 | 124.27±17.12<sup>*</sup> |
| 20d | 15 | 136.05±25.74 | 127.57±22.90 | 120.10±19.83<sup>*</sup> |
| 30d | 15 | 145.27±10.75 | 149.13±12.58 | 135.38±20.77 |
| 40d | 10 | 153.38±8.77 | 156.36±12.51 | 141.91±27.07 |
| 50d | 10 | 147.83±5.98 | 157.00±13.31 | 150.40±18.48 |
| 60d | 10 | 148.67±5.58 | 157.33±22.88 | 155.19±13.07 |
| 70d | 10 | 152.43±4.86 | 167.10±6.57 | 157.41±11.80 |
| 80d | 10 | 158.34±8.61 | 163.09±6.63 | 156.98±16.34 |
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝12)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
6.2腕关节肿胀度
各组鹌鹑的左、右腕关节肿胀度变化由见表8、9。由表8、9可知，与正常组相比，实验30d～80d，模型组2(10％果糖)鹌鹑的左腕关节肿胀度显著升高(P<0.05或P<0.01)，模型组1(清水)鹌鹑的左腕关节肿胀度未见显著差异；实验20d～80d，模型组2(10％果糖)右腕关节肿胀度显著升高(P<0.05或P<0.01)，实验30d～80d，模型组1(清水)的右腕关节肿胀度均显著升高(P<0.05或P<0.01)。
表8各组鹌鹑的左腕关节肿胀度变化(％，
)
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝12)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
表9各组鹌鹑的右腕关节肿胀度变化(％，
)
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝12)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
6.3血清尿酸水平
各组鹌鹑的血清尿酸水平见表10。由表10可知，与正常组相比，实验10d～80d，模型组1(清水)与模型组2(10％果糖)鹌鹑的血清尿酸水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)，且模型组1(清水)血清尿酸水平波动较大，模型组2(10％果糖)的血清尿酸水平波动较为平稳；与模型组1(清水)比，模型组2(10％果糖)血清尿酸水平未见显著差异。
表10各组鹌鹑的血清尿酸水平(μmol/L，
)
| 时间 | n | 正常组 | 模型组1(清水) | 模型组2(10％果糖) |
| 0d | 15 | 138.24±75.68 | 142.43±67.95 | 140.57±63.86 |
| 10d | 15 | 233.04±93.69 | 522.17±217.79** | 447.57±190.54** |
| 20d | 15 | 239.11±52.14 | 510.90±257.81** | 421.67±113.69** |
| 30d | 15 | 246.60±57.80 | 480.53±227.61** | 476.54±203.70** |
| 40d | 10 | 207.48±68.49 | 418.71±186.37** | 426.84±138.62** |
| 50d | 10 | 232.71±72.94 | 421.92±76.50* | 437.5±80.89* |
| 60d | 10 | 225.66±36.75 | 474.54±136.68** | 414.81±59.57* |
| 70d | 10 | 241.69±53.70 | 449.47±191.15* | 435.30±47.34* |
| 80d | 10 | 211.85±64.35 | 426.86±182.56* | 411.24±79.51* |
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝12)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
6.4粪尿尿酸含量
结果见表11。由表11可知，与正常组相比，实验30d、80d，模型组1(清水)与模型组2(10％果糖)鹌鹑的粪尿尿酸含量虽有降低趋势，但未见显著差异。
表11各组鹌鹑的粪尿尿酸含量(μmol/L，
)
| 组别 | 30d(n＝15) | 80d(n＝10) |
| 正常组 | 52429.70±15807.37 | 47489.22±10428.24 |
| 模型组1(清水) | 54844.05±6698.26 | 34120.85±9497.43 |
| 模型组2(10％果糖) | 51034.74±6033.90 | 48070.45±12990.27 |
6.5膝关节液尿酸含量
结果见表12。由表12可知，与正常组相比，实验30d、80d，模型组1(清水)膝关节液尿酸含量均未见显著差异；实验80d，模型组2(10％果糖)鹌鹑的膝关节液尿酸含量显著升高(P<0.05)。与模型组1(清水)比，模型组2(10％果糖)膝关节液尿酸含量未见显著差异。
表12各组鹌鹑的膝关节液尿酸含量(μmol/L，
)
| 组别 | 30d(n＝15) | 80d(n＝10) |
| 正常组 | 26.16±6.15 | 8.43±2.90 |
| 模型组1(清水) | 23.09±7.29 | 12.70±6.18 |
| 模型组2(10％果糖) | 21.83±9.46 | 12.86±2.69* |
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱情况存在死亡，30d，正常组、模型组1、模型组2均选取5例处死；80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
6.6炎性因子水平
结果见表13、14。由表13、14可知，与正常组相比，实验30d、60d、80d，模型组1(清水)与模型组2(10％果糖)的血清IL-1β水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组1(清水)相比，模型组2的血清IL-1β水平未见显著差异；实验30d、80d，模型组2(10％果糖)的爪关节组织IL-1β水平均极显著升高(P<0.01)；实验80d，模型组1(清水)的爪关节组织IL-1β水平显著升高(P<0.05)。与模型组1(清水)相比，实验30d，模型组2的爪关节组织IL-1β水平显著高于模型组1(P<0.01)。
表13各组鹌鹑的血清白介素1β水平(pg/mL，
)
| 组别 | 30d(n＝15) | 60d(n＝10) | 80d(n＝10) |
| 正常组 | 149.25±11.37 | 203.72±17.24 | 219.41±38.03 |
| 模型组1(清水) | 169.61±12.43* | 246.35±44.35** | 258.65±10.13** |
| 模型组2(10％果糖) | 170.59±17.11* | 252.23±34.48** | 261.02±23.32** |
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝12)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
表14各组鹌鹑的关节组织白介素1β水平(pg/mL，
)
注：①与相同时间正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与相同时间模型组1(清水)比较，##P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组、模型组1、模型组2随机选取5例处死；80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝6)，模型组2(n＝8)。
6.7腕关节和足爪关节外形观察
结果见图3。由图3可见，与正常组相比，实验30d，可见模型组1(清水)鹌鹑腕关节肿胀，足爪出现肿胀、足趾变形等症状；模型组2(10％果糖)鹌鹑腕关节红肿，足爪出现多个痛风石结节，甚至破溃、溢出白色石灰粉末状尿酸盐结晶。
6.8腕关节和足爪关节HE染色结果
结果见图4。由图4可见，正常组鹌鹑腕关节组织结构清晰，关节表面光滑平整，滑膜组织形态正常；模型组1鹌鹑腕关节组织可见滑膜纤维组织增生、血管翳形成，伴有炎性细胞浸润；模型组2腕关节组织可见滑膜组织增生至关节腔内、伴有炎性细胞浸润及组织水肿。鹌鹑足爪关节组织HE染色可见，正常组鹌鹑足爪关节组织结构清晰，滑膜组织形态正常；模型组1足爪关节组织可见明显炎性细胞浸润、滑膜组织增生及血管翳形成；模型组2足爪关节可见滑膜纤维组织增生，伴有大量炎细胞浸润。
6.9腕关节液偏振光显微镜观察
结果见图5。由图5可见，采用3％尿酸盐溶液涂于载玻片作为对照组，黑色视野下，对照组可见大量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体。正常组未见尿酸盐晶体，与对照组、正常组对比，模型组1(清水)可见少量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体；模型组2(10％果糖)可见大量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体、聚集成束。
综上所述，在25日龄鹌鹑基础上，选用高蛋白高钙食饵结合10％果糖限水方式于实验30d可初步诱导鹌鹑痛风性关节炎模型，其血清尿酸水平显著升高、关节内尿酸盐沉积成功率大大提升、肾脏尿酸盐沉积显著、炎性因子IL-1β高水平表达，且长期造模条件下，模型具一定的持续性和稳定性。
实施例3低温对鹌鹑痛风性关节炎模型的诱导研究
人类痛风多于夜间、寒冷冬季发作，低温环境是推动痛风性关节炎发病的重要因素。为进一步确定造模条件，本实验在此造模基础上，从低温环境出发，对比常温与低温条件对诱导鹌鹑痛风性关节炎模型的影响，最终确定最佳的造模条件。
1实验方法
选取25日龄迪法克鹌鹑45只，适应性饲养3d，按体质量随机分为3组，每组15只，分别为正常组、模型组1(10％果糖)简称模型组1，模型组2(10％果糖-低温)简称模型组2。实验期间，正常组给予足量清水，模型组1(10％果糖)给予10％果糖饮水，限制日饮水量为15mL/只/d；模型组2(10％果糖-低温)同模型组1给予10％果糖水限制饮水，同时参考文献寒冷刺激方法并改进，于每日下午将模型组2鹌鹑放置铺满碎冰的玻璃框内1.5h。
2实验检测指标
实验期间，每日记录各组剩食量，以每10d为动态观察周期，采用皮尺测各组鹌鹑左右腕关节周径，取血前称重，禁食不禁水12h，于第10d对鹌鹑颈静脉取血，所取样本分离血清后，检测血清生化指标；第30d随机选取各组5只鹌鹑剖取相同部位肾脏、腕关节、足爪组织固定、制作石蜡切片，并采用生理盐水0.2mL冲洗各组鹌鹑腕关节腔、膝关节腔，所得腕关节液涂于载玻片上，膝关节液经处理后进入液相仪器检测。第80d，同实验第30d操作对剩余各组鹌鹑取材处死。
3实验试剂与药物
同实施例1“3实验试剂与药物”。
4实验仪器与设备
同实施例1“4实验仪器与设备”。
5实验数据分析
同实施例1“5实验数据分析”。
6 实验结果
6.1 体重
结果见表15。由表15可知，与正常组相比，实验10d～30d，模型组1(10％果糖)鹌鹑体重显著降低(P<0.05或P<0.01)；实验20d，模型组2(10％果糖-低温)体重显著降低(P<0.01)。
表15各组鹌鹑的体重(g，
)
注：①与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑由于打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝13)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝8)，模型组2(n＝8)。
6.2腕关节肿胀度
结果见表16、17。由表16、17可知，与正常组相比，实验60d～80d，模型组1(10％果糖)鹌鹑的左腕关节肿胀度均显著升高(P<0.05或P<0.01)，实验70d、80d，模型组2(10％果糖-低温)鹌鹑的左腕关节肿胀度均显著升高(P<0.05)，与正常组相比，实验30d～80d，模型组1(10％果糖)与模型组2(10％果糖-低温)鹌鹑的右腕关节肿胀度均显著升高(P<0.05或P<0.01)。
表16各组鹌鹑的左腕关节肿胀度变化(％，
)
注：①与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑由于打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝13)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝8)，模型组2(n＝8)。
表17各组鹌鹑的右腕关节肿胀度变化(％，
)
注：①与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑由于打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝13)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝8)，模型组2(n＝8)。
6.3血清尿酸水平
结果见表18。由表18可知，与正常组相比，实验10d～80d，模型组1(10％果糖)与模型组2(10％果糖-低温)鹌鹑的血清尿酸水平均显著升高(P<0.01)；与模型组1(10％果糖)比，模型组2(10％果糖-低温)血清尿酸水平未见显著差异。
表18各组鹌鹑的血清尿酸水平(μmol/L，
)
注：①与相同时间正常组比，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑由于打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝13)，模型组2(n＝13)；40d～80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝8)，模型组2(n＝8)。
6.4膝关节液尿酸含量
结果见表19。由表19可知，与正常组相比，实验80d，模型组1(10％果糖)鹌鹑的膝关节液尿酸含量显著升高(P<0.05)；实验30d、80d，模型组2(10％果糖-低温)鹌鹑的膝关节液尿酸含量未见显著差异。与模型组1(10％果糖)相比，实验30d、80d，模型组2(10％果糖-低温)鹌鹑的膝关节液尿酸含量未见显著差异。
表19各组鹌鹑的膝关节液尿酸含量(μmol/L，
)
| 组别 | 30d(n＝5) | 80d(n＝8) |
| 正常组 | 26.16±6.15 | 8.43±2.90 |
| 模型组1(10％果糖) | 21.83±9.46 | 13.58±2.07* |
| 模型组2(10％果糖-低温) | 34.24±13.70 | 11.18±1.51 |
注：①与相同时间正常组比，*P<0.05；②实验期间，各组鹌鹑由于打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组、模型组1、模型组2随机选取5例处死；80d，正常组、模型组1、模型组2均剩余8例。
6.5炎性因子水平
结果见表20、21。由表20、21可知，对于血清IL-1β水平，与正常组相比，实验30d、60d、80d，模型组1(10％果糖)与模型组2(10％果糖-低温)的血清IL-1β水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；对于腕关节组织IL-1β水平，与正常组相比，实验80d，模型组1(10％果糖)与模型组2(10％果糖-低温)的腕关节组织IL-1β水平显著升高(P<0.05或P<0.01)；对于爪关节组织IL-1β水平，与正常组相比，实验30d、80d，模型组1(10％果糖)的爪关节组织IL-1β水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；实验80d，模型组2(10％果糖-低温)的爪关节组织IL-1β水平显著升高(P<0.01)。
表20各组鹌鹑的血清白介素1β水平(pg/mL，
)
| 组别 | 30d(n＝13) | 60d(n＝8) | 80d(n＝8) |
| 正常组 | 148.81±10.51 | 205.20±13.50 | 219.41±38.03 |
| 模型组1(10％果糖) | 170.59±17.11* | 250.02±16.66** | 261.02±23.32** |
| 模型组2(10％果糖-低温) | 171.52±17.47* | 238.36±25.21* | 257.92±19.04** |
注：①与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑由于打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组(n＝13)，模型组1(n＝13)，模型组2(n＝13)；60d、80d，正常组(n＝8)，模型组1(n＝8)，模型组2(n＝8)。
表21各组鹌鹑的关节组织白介素1β水平(pg/mL，
)
注：①与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01；②实验期间，各组鹌鹑因打架斗殴或造模瘦弱存在死亡，30d，正常组、模型组1、模型组2随机选取5例处死；80d，正常组、模型组1、模型组2均剩余8例。
6.6肾脏组织尿酸盐染色结果
见图6。由图6可见，鹌鹑肾脏组织尿酸盐染色可见，正常组鹌鹑肾组织无黑色尿酸盐结晶，模型组1、2鹌鹑肾组织均存在大量黑色的尿酸盐结晶沉积于肾小管周围。实验第30d、80d，模型组1、2的肾脏尿酸盐沉积成功率达100％，与模型组1(10％果糖)相比，实验30d，模型组2的肾脏尿酸盐沉积面积占比显著低于模型组1(P<0.01)。实验30d、80d，模型组1、2的肾脏尿酸盐沉积面积占比呈上升趋势。
6.7腕关节液偏振光显微镜观察
结果见图7。由图7可知，鹌鹑腕关节液于200倍偏振光显微镜下观察，采用3％尿酸盐溶液涂于载玻片作为对照组，黑色视野下，对照组可见大量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体。正常组未见尿酸盐晶体，与对照组、正常组对比，模型组1(10％果糖)与模型组2(10％果糖-低温)均可见大量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体。
综上，附加低温条件造模同样可诱导鹌鹑痛风性关节炎模型，但效果与常规饮食造模相比无显著差异，且长期寒冷刺激易影响鹌鹑的生活状态，未能达到理想的成模效果。仅以高蛋白高钙食饵结合10％果糖限水造模即可于实验30d初步诱导鹌鹑痛风性关节炎模型，且成模率高。因此，从造模条件的简便性、稳定性及成功率等方面考量，选择25日龄鹌鹑，以高蛋白高钙食饵结合10％果糖限水方式诱导鹌鹑痛风性关节炎模型更为适宜。
实施例4鹌鹑痛风性关节炎模型的病理特点研究
在上述鹌鹑关节型痛风模型的诱导研究中，通过充分考虑模型成功率、临床相似性、模型稳定性、造模简便性等条件，最终确定25日龄鹌鹑，以高蛋白高钙食饵结合10％果糖限水条件造模最佳，可于实验30d初步诱导鹌鹑关节型痛风模型。基于该造模条件，本实验深入探讨该模型的病理特点，以保证模型的成功复制。
1、实验方法
选取健康25日龄雄性迪法克系鹌鹑40只，适应性饲养3天后，按体质量随机分为正常组、模型组，每组20只；实验期间，正常组给予常规动物饲料与足量清水饲养，模型组给予高蛋白高钙饲料，同时结合10％果糖水限制剂量饮用进行饲养，日饮用量控制每只动物15～20mL，连续饲养50d。
2、实验检测指标
实验期间，以每10d为动态观察周期，采用皮尺测各组鹌鹑左右腕关节周径，计算鹌鹑左、右腕关节肿胀度；取血前称重，检测血清生化指标；第30d、40d、50d随机选取各组6只鹌鹑剖取肾脏、腕关节、足爪组织固定、制作石蜡切片，并采用生理盐水0.2mL冲洗各组鹌鹑腕关节腔、膝关节腔，所得腕关节液涂于载玻片上，膝关节液经处理后进入液相仪器检测。
3实验试剂与药物
同实施例1“3实验试剂与药物”。
4实验仪器与设备
同实施例1“4实验仪器与设备”。
5实验数据分析
同实施例1“5实验数据分析”。
6实验结果
6.1体重
结果见表22。由表22可知，实验10d～50d，与正常组相比，模型组鹌鹑的体重水平显著降低(P<0.01)，模型组整体状态较差，分析原因可能与自身机体因素、饮食条件有关。
表22各组鹌鹑的体重水平(g，
)
注：与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01。
6.2腕关节肿胀度
结果见表23。由表23可知，与正常组相比，实验20d～50d，模型组鹌鹑的左腕关节肿胀度显著升高(P<0.05或P<0.01)；实验10d～50d，模型组鹌鹑的右腕关节肿胀度均显著升高(P<0.05或P<0.01)。提示以该方法造模可显著影响鹌鹑的关节肿胀。
表23各组鹌鹑的左、右腕关节肿胀度变化(％，
)
注：与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01
6.3血清尿酸水平
结果见表24、25。由表24、25可知，与正常组相比，实验10d～50d，模型组鹌鹑的血清尿酸水平极显著升高(P<0.01)；实验30d、40d、50d，模型组鹌鹑的膝关节液尿酸水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；提示该模型具有较好的稳定性，可长期保持高尿酸水平状态。
表24各组鹌鹑的血清尿酸水平(μmol/L，
)
注：与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01。
表25各组鹌鹑的膝关节液尿酸水平(μmol/L，
)
| 组别 | 正常组 | 模型组 |
| 30d | 9.09±3.92 | 20.95±5.76<sup>**</sup> |
| 40d | 10.93±3.05 | 51.48±18.82<sup>**</sup> |
| 50d | 14.45±3.34 | 23.41±7.54<sup>*</sup> |
注：与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01。
6.4炎性因子水平
结果见表26。由表26可知，与正常组相比，实验30d、40d、50d，模型组鹌鹑的血清、腕关节组织及足爪关节组织IL-1β水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。提示该造模条件下可较好诱发机体的炎症反应。
表26各组鹌鹑的炎性因子白介素1β水平(pg/mL，
n＝6)
注：与相同时间正常组比，*P<0.05，**P<0.01。
6.5腕关节和足爪关节外形观察
见图8。由图8可见，正常组鹌鹑的腕关节、足爪形态正常，行动灵活。与正常组相比，模型组部分鹌鹑可见腕关节红肿、足爪处足趾关节肿胀显著、严重变形。
6.6腕关节和足爪关节HE染色结果
见图9。由图9可见，鹌鹑腕关节200倍光学显微镜下可见，正常组鹌鹑腕关节组织结构清晰，关节表面光滑平整，滑膜组织形态正常；模型组鹌鹑腕关节组织可见滑膜组织侵蚀软骨面、滑膜纤维组织增生，伴有大量炎性细胞浸润，血管翳形成及周围组织水肿；
鹌鹑足爪关节200倍光学显微镜下可见，正常组鹌鹑足爪关节组织结构清晰，滑膜组织形态完整；模型组足爪关节组织可见大量炎性细胞浸润，滑膜纤维组织增生及肉芽组织形成。
6.7足爪关节X线摄片形态
结果见图10。由图10可见，鹌鹑足爪经X光摄片显示，正常组鹌鹑的腕关节/足爪关节清晰、足趾骨头部骨密度正常、关节面完整，模型组鹌鹑的左爪第三末节指间关节可见广泛穿凿样骨质破坏，骨破坏边缘翘起，周围软组织明显肿胀，足趾骨头部骨密度减低，关节间隙变窄。
6.8腕关节液偏振光显微镜观察
结果见图11。由图11可见，鹌鹑腕关节液于200倍偏振光显微镜下观察，采用3％尿酸盐溶液涂于载玻片作为对照组，黑色视野下，对照组可见大量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体。正常组未见尿酸盐晶体，与对照组、正常组对比，模型组均可见大量蓝黄明亮、针状或细棒状尿酸盐晶体。
综上所述，以25日龄鹌鹑，高蛋白高钙饮食结合10％果糖限水条件可成功建立鹌鹑痛风性关节炎模型，且实验30d已见模型成功，实验持续至50d可见模型具稳定的高尿酸水平、关节肿胀明显、炎性因子IL-1β高水平表达、关节尿酸盐沉积显著，伴随一定的关节组织损伤及炎症反应。本发明建立的痛风性关节炎动物模型具有临床高度相似性、操作简便性、持久稳定性的优势，可应用于痛风相关的基础研究。
实施例5一种痛风关节炎动物模型的构建方法
步骤1，选取25日龄迪法克鹌鹑作为模型动物，适应性饲养3天；
步骤2，给予模型动物高蛋白高钙饲料和10％果糖水饲养，限制日饮水量为15mL/只；
步骤3，于温度20℃～25℃、湿度40％～60％环境下饲养30天，建立痛风关节炎动物模型。
Claims (10)
1.一种痛风性关节炎动物模型的构建方法，其特征在在于，所述方法包括如下步骤：
选取幼龄禽类为造模动物；
给予造模动物高蛋白高钙饲料和糖水饲养；
连续饲养至造模成功。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禽类选自鹌鹑或鸡。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禽类为鹌鹑。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼龄为20～25日龄。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述幼龄为22～25日龄。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述幼龄为25日龄。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高蛋白高钙饲料由15％～30％酵母浸膏粉、25％～45％骨粉、40％～60％常规动物饲料组成。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖水为8％～15％果糖水，所述糖水的日饮用水量为5～20ml。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲养时间为20天～50天；饲养环境温度为20℃～25℃，湿度为40％～60％。
10.如权利要求1-9任一项所述构建方法制备的动物模型在筛选或鉴定具有预防、缓解或治疗痛风关节炎作用的药物中的应用。
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