CN109097394A

CN109097394A - Tctp基因组织特异性敲减的动物模型、其制备方法及应用

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Publication number: CN109097394A
Application number: CN201810991546.6A
Authority: CN
Inventors: 窦科峰; 刘薇; 陶开山; 王琳; 林智斌; 刘奇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2018-12-28

Abstract

本身申请公开了基于重组酶识别系统的TCTP基因时空特异的条件性和组织特异性基因敲减的小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及其打靶载体的构建方法、小鼠TCTP基因的组织特异性基敲减动物模型、其精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞，及上述产品和方法在免疫学研究、免疫毒理学、免疫排斥反应及其机理的研究、研究癌症细胞凋亡机制和癌症靶点、癌症靶向治疗的研究、安全性评价和在药效学评价方面的用途、制作肿瘤病理模型、在治疗疾病的药物制备中的应用。利用同源重组技术以及胚胎干细胞技术构建稳定遗传的TCTP基因全身敲除小鼠，避免了全身敲除该基因造成的胚胎致死，对于研究TCTP基因的癌症发生发展和癌症治疗具有重大意义。

Description

TCTP基因组织特异性敲减的动物模型、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及制作组织特异性基因敲减动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备TCTP基因全组织特异性敲减的小鼠的方法及应用。

背景技术

癌症是影响我国居民健康的主要慢性病之一，列城市死因的第一位。在中国，每年新发癌症病例达429万，也就是说全国每天约1万人确诊癌症，每 1分钟约7人确诊患癌。若中国人均预期寿命是85岁，那么每个人的累计患癌风险高达36％。在世界范围内，大约22％的新增癌症病例和27％的癌症死亡发生在中国。肺癌是中国乃至全世界最常见的恶性肿瘤以及首位的癌症死亡原因。随着我国工业化、城市化进程的进一步加速所导致的空气污染以及吸烟率的居高不下，肺癌的危害将继续加剧。肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51％。预计在未来几十年内，我国癌症发病率和死亡率将整体继续呈上升趋势。严峻的形势给我国的社会和医疗带来了沉重的负担。沉重的癌症负担需要采用综合化的防治策略来解决。从分子生物学机理调控和遏制癌症进展的方法研究成为癌症治疗研究的重要方向。

翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)又称P21小鼠TCTP)，是一类广泛存在于动物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族，其编码基因为TPT1tumor。TCTP又称为Histamine－releasi ngfactor(HRF)。人类TPT1基因编码的蛋白称fortili n，是一类新的抗凋亡蛋白质。近年的研究提示TCTP可能具有非常重要的生物学功能，包括调节细胞周期的进程和恶性转移、钙结合蛋白、细胞外组胺释放蛋白、抗凋亡及抗疟疾作用、抗炎症反应和保护细胞免受多种应激性损伤、肿瘤逆转等。

TCTP基因具有许多非常重要的生物学功能，包括钙离子结合，围观结合、钻释放、调节细胞周期，抗凋亡和干细胞分化等。参与细胞内生许多重要生理过程，包括细胞生长、细胞周期的进程、肿瘤的恶性转化和调节细胞凋亡。鉴于上述机理，TCTP蛋白在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤等多种癌症的调控发育中扮演了重要的角色，也是肝癌细胞逆转过程的重要生物标记物。研究TCTP基因的癌症发生发展过程中发挥的作用，对癌症治疗具有重大意义。 TCTP基因对肿瘤细胞增殖和凋亡的双重作用以及在逆转的肿瘤细胞中的强烈下调，使其有望成为肿瘤上治疗的一个理想靶标，具有潜在的应用价值。

目前，如何评价TCTP基因的抗肿瘤细胞增殖和促凋亡作用尚存在着瓶颈。由于野生型低等动物都表达TCTP基因，因此无法利用野生型低等动物去评价 TCTP基因相关的肿瘤细胞凋亡。只能用狒狒作为受体来考察TCTP基因阳性动物的肿瘤进展，而这种动物稀少很难普及使用。缺少相关的动物模型作为研究平台,因此，如何评价TCTP基因于和动物肿瘤发展的关系.存在着瓶颈。

TCTP基因的全身敲除会导致小鼠胚胎致死，目前国内没有针对这一基因进行基因改造的基因工程鼠在，在国内无法得到相关的模型动物。针对现有技术的不足和缺陷.TCTP基因在癌症发生发展中的基础研究领域急需一种可用于研究 TCTP作用的动物模型研究平台。TCTP基因的全身敲除会导致小鼠胚胎致死，目前国内没有针对这一基因进行基因改造的基因工程鼠。TCTP基因作为一个多功能原癌基因，其在各类癌症的相关机制研究，需要可以避免TCTP基因全身敲除和敲减致死的组织特异性TCTP基因敲减工程鼠作为平台，国内目前尚无此类小鼠产品。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型及其构建试剂盒、构建方法、打靶载体及构建方法、动物模型、子代、胚胎或细胞及其制备方法，以及上述产品和方法在在免疫学研究、免疫毒理学、免疫排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用、在在药效学评价方面的用途、在制作肿瘤病理模型的用途和在治疗疾病的药物制备中的用途。

第一方面，本发明提供了一种基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型，所述TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型由TCTP基因全身敲减的小鼠模型与FLP工具鼠杂交获得。

在一实施例中，所述FLP工具鼠为B6；SJL-Tg(ACTFLPe)9205Dym/J工具鼠。

在一实施例中，所述TCTP基因全身敲减小鼠为fl-neo-loxp-TCTP)

在一实施方试在，所述TCTP基因全身敲减的小鼠模型为父本，所述FLP 工具鼠为母本；在一实施方式中，所述TCTP基因全身敲减的小鼠模型为母本，所述FLP工具鼠为父本。

在一实施方式中，

所述TCTP基因全身敲减的小鼠模型的构建试剂盒包括打靶载体元件克隆引物，所述打靶载体元件克隆引物包括：

LRJ-072-A-F(Seq ID.No.5)：cgatGAATTCGTATACAAGATCCGGGAGATCGC，

LRJ-072-A-R(Seq ID.No.6)：cgatAGCGCTAGTACTAAGTTGCTGTGGCCTCTCTC，

LRJ-072-B1-F(Seq ID.No.7)：cgatGCGATCGCGGTTCCGCTTGATGAGAGTGAC，

LRJ-072-B1-R(Seq ID.No.:8)：cgatGTCGACTAGCCATGTTGGCACACACC，

LRJ-072-B2-F(Seq ID.No.:9)： cgatACGCGTGATATCGCATATGTGTTATTTTTGAGAACTAGG，

LRJ-072-B2-R(Seq ID.No.:10)：cgatCCGCGGTATACTTACACACATGACCCTGAG；

LRJ-072-C-F(Seq ID.No.:11)：cgatCTCGAGTACGTACCACCATGCCCAGTTTAGA，

LRJ-072-C-R(in)(Seq ID.No.:12)： CATGGAGAGACTGCTTGAAAGATATCTAGCAGTTACTCAGTCTCAC，

LRJ-072-C-F(in)(Seq ID.No.:13): GTGAGACTGAGTAACTGCTAGATATCTTTCAAGCAGTCTCTCCATG

LRJ-072-C-R(Seq ID.No.:14):cgatGCGGCCGCCTTGGTGTTCATAGTTATGCCG。

在一些实施方式中，所述小鼠模型构建试剂盒中还包括TCTP基因全身敲减打靶载体的构成片段的验证引物、检测探针制备引物、测序引物、打靶载体的 PCR筛选引物、基因分型引物。其中

所述中间片段验证引物包括

LRJ-072-Atest-F(Seq ID.No.:15):GTCACCATGATCATCTACCGG，

LRJ-072-Atest-R(Seq ID.No.:16):acgggttcttctgttagtcc，

LRJ-072-Btest-F(Seq ID.No.:17):atgctatacgaagttatacgcg，

LRJ-072-Btest-R:(Seq ID.No.:18):acactgaaacatcctattgcatg，

LRJ-072-C1test-F(Seq ID.No.:19:gctttccgattgagcccagg,

LRJ-072-C1test-R(SeqID.No.:20):tctctagagtcacagaacttatgg，

LRJ-072-C2test-F(Seq ID.No.:21):gctttccgattgagcccagg，

LRJ-072-C2test-R(Seq ID.No.:22)：agctagcttggctggacgta，

所述测序引物包括：

LRJ-072-B1-616F(Seq ID.No.:23)：gctagaagacattacctattggagc和

LRJ-072-B1-713R(Seq ID.No.:24)：ggtttctgctcttcaagtttgc；

所述探针制备引物包括

LRJ-072-5'Probe-F(Seq ID.No.25)gctatctatggggaaagaatat)和

LRJ-072-5'Probe-R((Seq ID.No.26)gagcacttcatctgtcagca)，

LRJ-072-3'Probe-F(Seq ID.No.27)agctagggagcaggttagaag)和

LRJ-072-3'Probe-R((Seq ID.No.28)ctctggtgagctcatctctg)；

所述基因分型引物对包括：

LRJ-072-B1 Loxp-F(Seq ID.No.29)：tcattgagactgttatctgtagaccagact，

LRJ-072-B1 Loxp-R(Seq ID.No.30)：agcaaccataccatctggattcatgt；’

所述PCR引物组包括5’端筛选引物对和对3’端筛选引物对，所述5’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F1(Seq ID.No.:1)：cactactctaccagctgtggcac和

LRJ-072-PCR-R1(Seq ID.No.:2)：caactgaccttgggcaagaacat

所述3’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F2(Seq ID.No.:3)：GCTCGACTAGAGCTTGCGGA，

LRJ-072-PCR-R2(Seq ID.No.:4)：gttatggagcaaaggttacttagtgg。第二方面，本发明提供了一种用于构建第一方面的基于重组酶识别的构建TCTP基因组织特异敲减的小鼠模型的打靶载体，其中，所述打靶载体用于构建作为亲本之一的TCTP基因的全身敲减小鼠模型，其中

所述TCTP基因的全身敲减哺乳动物亲本中，所述TCTP基因全身敲减是基于外显子2被同源重组引起的移码突变产生外显子3和外显子4产物为截短蛋白；

所述TCTP基因组织特异性敲减的小鼠的打靶载体pDTA-LRJ-072从5‘到3’顺序包含顺次连接的B1片段、B2片段、B3片段和C1和C2片段融和成的C片段连接而成的B2-B1-A-C1-C2序列连接物；所述B2片段序列如SEQ ID NO:33所示，所述B1片段序列如SEQ ID NO:32所示，所述A片段序列如SEQ ID NO:31所示，所述C1片段序列如SEQ ID NO:34所，所述C2片段如SEQ ID NO:35所示；，所述TCTP基因全身条件性敲除打靶载体pDTA-LRJ-072序列如SEQID NO:36所示。

所述B1片段包含正筛选元件，其中，所述正筛选元件包括顺次连接的5’重组酶识别序列1-报告基因盒-正筛选标记基因盒-3’重组酶识别序列1，在一些实施方式中，所述报告基因盒带有一个组成型剪切受体，可以介导所述报告基因mRNA的强制剪切，使所述报告基因能够在打靶基因启动子的驱动下表达从而示踪所述TCTP基因的表达；所述报告基因盒中包含多聚腺苷酸(Poly A)可提前终止此打靶基因的转录，从而敲除TCTP基因；所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒二联体的5‘和3’分别为5‘重组酶识别序列1和3 ‘重组酶识别序列1，所述所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒中间为重组酶识别序列2，所述重组酶识别序列1可以被重组酶识别，从而实现所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒的删除。

在一些实施方式中，所述B1片段包含从5‘到3’连接的5‘重组酶识别序列1，正筛选元件、‘重组酶识别序列2、抗性筛选基因盒、3重组酶识别序列 1、5-‘重组酶识别序列2、T小鼠TCTP基因外显子3-4，所述B1片段的5‘和3’分别是ScaI和Salt,EcoV酶切位点；

所述B2片段包含从5‘到3’连接的3-‘重组酶识别序列2(3’- lox P)小鼠TCTP基因外显子5-6、3‘同源臂；所述B12片段的5‘和3’分别是Salt,ScaI酶切位点；

所述A片段包含从5‘到3’连接的，5’同源臂、小鼠TCTP基因外显子1- 2，所述A片段的5‘和3’分别是EcoI和ScaI和酶切位点，

所述C1片段的5‘和3’分别是SnaBI和EcoV酶切位点，包含负筛选标记基因；

所述C2片段的5‘和3’分别是EcoV和EcoI酶切位点，C1和C2融合片段包含负筛选标记基因。

在一些实施方式中，所述正筛选标记基因包括编码新霉素磷酸转移酶(Neo)、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因；所述负筛选标记基因包括编码白喉毒素(DAT)或胸腺去氧核苷的基因。

在一些实施方式中，所述重组酶基因包括编码Cre酶或Flp酶的基因。

在一具体的示例性实施例中，所述正筛选元件中，所述重组酶识别序列 1为FRT位点，所述报告基因为EGFR-PA，所述报告基因盒为为En2 SA-IRES-eGFP-PA，所述抗生素抗性基因为Neo，所述重组酶识别序列2为LoxP 位点，所述打靶载体的核苷酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:36所示。

在一具体的示例性实施例中，所述小鼠为小鼠，所述5’端同源臂序列分和所述3’端的同源臂序列分别为5.6kb和5.0kb取自所述小鼠第14号染色体上TCTP基因第2外显子的内含子3’端到第5外显子的内含子5’端，所述小鼠TCTP基因的5’同源臂和3’同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:37 和SEQ ID NO:38所示。

本发明在构建TCTP的基因全身敲减的打靶载体时，采用的是正负筛选策略，因此能够很大程度上排除随机整合的细胞，提高打靶细胞富集效率。通过在正筛选基因两侧引入重组酶识别序列，实现所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒的删除。

在一些实施方式中，所述正筛选标记基因包括编码新霉素磷酸转移酶(Neo)、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因；所述负筛选标记基因包括编码白喉毒素(DAT)或胸腺去氧核苷的基因。在一些实施方式中所述重组酶基因是编码Cre酶的基因，或在一些实施方式中所述重组酶基因是编码Flp酶的基因。

在一具体示例性实施例中，所述正筛选元件中，所述重组酶识别序列1 为FRT位点，所述报告基因为EGFR-PA，所述报告基因盒为为En2 SA-IRES-eGFP- PA，所述抗生素抗性基因为Neo，所述重组酶识别序列2为LoxP位点，所述打靶载体的核苷酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:36所示。

在一具体示例性实施例中本发明涉及的负筛选基因是编码白喉毒素(DTA)或胸腺去氧核苷等的基因；优选的，所述负筛选基因为DTA。

在一具体示例性实施例中，所述小鼠为小鼠，所述5’端同源臂序列分和所述3’端的同源臂序列分别为5.6kb和5.0kb取自所述小鼠第14号染色体上TCTP 基因第2外显子的内含子3’端到第5外显子的内含子5’端，所述小鼠TCTP基因的5’同源臂和3’同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38 所示。

在一具体实施方式中，所述重组酶识别系统为Cre-LoxP系统。所述TCTP 基因基于重组酶识别系统的条件性基因敲减小鼠模型构建的打靶载体的序列如 SEQ ID NO.36所示，所述TCTP基因条件性敲减的打靶载体命名为pDTA-LRJ-072 打靶载体。

在一具体实施例中，所述重组酶1作用序列为Frt，所述重组酶2作用序列2为LoxP位点，所述报告基因盒为为En2 SA-IRES-eGFP-PA，所述抗生素抗性基因为Neo。

优选的，所述重组酶基因为带有tACE特异性启动子的Cre基因。

第三方面，本发明提供了第二方面所述TCTP基因组织特异性基因敲减打靶载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)从用正常小鼠组织提取的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增所述片段A、所述片段B1、所述片段B2，和片段C1和C2；

(2)连接，构建中间载体：将酶切鉴定、测序正确的B1或B2片段和A片段依次连接到正向筛选初始载体1得到中间载体-B1-B2-A；同时，通过 Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合为C片段后连接到负筛选基因初始载体2获得负筛选基因中间载体2-TCTP-C；

(3)将连接正确的中间载体1-TCTP-B1-B2-A，用限制性内切酶切出并回收回收目的片段A-NeoR-B，转化含pBCTG的BAC菌进行重组得到TCTP-NeoR BAC；菌落PCR检测TCTP-NeoR BAC，鉴定扩增条带正确；

(4)负筛选基因初始载体2-TCTP-C的线性化和转化AB重组BAC

即酶切处理负筛选基因初始载体2-TCTP-C，回收目的条带负筛选基因-TCTP-C，电转已经重组了NeoR的的BAC菌；负筛选基因-TCTP-C拯救TCTP-NeoR BAC，得到含TCTP的B,A和C片段的打靶载体转化的重组菌；对拯救后获得的打靶载体-TCTP-BAC转化的重组菌落进行PCR检测鉴定，将正确重组克隆进行扩增，经纯化后酶切验证。

在一些实施方式中所述重组酶基因是编码Cre酶的基因，或在一些实施方式中所述重组酶基因是编码Flp酶的基因。

在一具体示例性实施例中，所述正筛选元件中，所述重组酶识别序列1为 FRT位点，所述报告基因为EGFR-PA，所述报告基因盒为为En2 SA-IRES-eGFP-PA，所述抗生素抗性基因为Neo，所述重组酶识别序列2为LoxP位点，所述打靶载体的核苷酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:36所示。

在一示例性实施例中，所述正向筛选初始载体1为pKFCR-EGF，所述中间载体1-TCTP-B1-B2-A为pKFCR-EGFP-TCTP-B1-B2-A,所述负筛选基因初始载体2 为pDTA-Down载体，所述负筛选标记基因为编码白喉毒素(DAT)的基因dat, 所述负筛选基因初始载体2-TCTP-C为pDTA-Down-C，所述含TCTP的B,A 和C片段的打靶载体为pDTA-LRJ-072。

在一示例性实施例中，所述基于重组酶识别的TCTP基因组织特异性敲减打靶载体的构建方法，包括以下步骤

(1)从正常小鼠分离基因组DNA为模板，用PCR方法扩增所述片段A、所述片段B1、所述片段B2，和片段C；

(2)将经过酶切鉴定、测序验证正确的B1或B2片段和A片段依次连接到pKFCR-EGFP载体得到pKFCR-B2-B1-A中间载体，同时，通过重叠PCR将测序正确的C1、C2片段融合为C片段后连接到pDTA-Down载体获得pDTA-Down- TCTP-C；

(3)将连接正确的pKFCR-EGFP-TCTP-B1-B2-A，用限制性内切酶切出pKFCR-EGFP-B1-B2-A条带，回收目的片段A-NeoR-B，转化含pBCTG的BAC 菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片段重组的BAC，鉴定扩增条带正确；

(4)pDTA-down-TCTP-C的线性化处理，即酶切处理pDTA-Down-TCTP-C，回收目的条带，电转已经重组了NeoR的的BAC菌；用pDTA-TCTP-C 拯救TCTP-NeoR BAC；对拯救后的重组菌落携带打靶载体pDTA-LRJ-072。进行 PCR检测鉴定，将正确重组克隆进行扩增，经Stbl3纯化后酶切验证,。

本发明的第四方面提供了一种基于重组酶识别的非人哺乳动TCTP基因组织特异性敲减的动物模型、其精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞。

本发明的第五方面提供了第四方面的基于重组酶识别的小鼠TCTP基因组织特异性敲减动物模型、子代、胚胎或细胞的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：构建TCTP基因全身敲减哺乳动物模型；

步骤二：基因全身敲减小鼠与FLP工具鼠杂交，去除转基因小鼠插入的 reporter而保留loxp位点；

步骤三：对后代进行检测，筛选双阳性小鼠；

步骤四：对双养性小鼠与野生型进行多代交配，获得稳定型小鼠；

步骤五：表型稳定型子代小鼠自交。

步骤六：对获得的后代再次筛选具有LoxP的杂合子和纯合子；

步骤七：纯合子或杂合子与组织特异性表达的Cre或条件诱导的Cre工具鼠杂交，后代可得到组织特异性敲除TCTP和条件特异性敲除TCTP的转基因小鼠；其中，其中所述步骤一包括

(1)将第二方面所述的TCTP基因全身条件敲减打靶载体转入小鼠胚胎干细胞；

(2)重组了TCTP基因全身敲减打靶载体的胚胎干细胞的筛选及鉴定；

(3)制备TCTP基因全身条件基因敲减嵌合小鼠；将重组胚胎细胞显微注射入代孕小鼠胚胎中，移植到假孕小鼠体内，与正常动物交配；

(4)基因型鉴定和TCTP基因全身敲减阳性嵌合体动物的筛选：对得到的嵌合体动物进行基因型验证和蛋白表达水平验证，筛选阳性的TCTP基因全身敲减的嵌合体动物；

在一优选实施方式中，所述步骤(1)是采用BAC载体构建打靶载体 pDTA-LRJ-072。打靶载体的构建过程包括利用含有小鼠TCTP的BAC载体套取得到所述小鼠TCTP的同源重组臂，通过同源重组的方式将5‘第一重组酶识别位点插入外显子2的内含子下游非保守和3‘上游内含子非保守区插入两个反向的第一重组酶识别位点，在一个正向的第二重组酶识别位点，3‘上游内含子非保守区和外显子5的5’内含子上游游非保守区分别插入5‘第二重组酶识别位点和3’第二重组酶识别位点。将人工合成的含报告基因和抗生素筛选基因的打靶片段通过同源重组方式插入初始载体，从而获得TCTP基因在外显子2和3之间被5‘第1重组酶识别位点-报告基因盒-第二重组酶识别位点-抗生素抗性基因盒-3‘第一重组酶识别位点插入打断；在外显子4和5之间被3‘第二重组酶识别位点插入打断的TCTP基因全身敲减打靶载体。用PCR和、PstⅠ酶切鉴定。

在一优选实施方式中，所述步骤(2)是采用电穿孔法将打靶载体pDTA-LRJ- 072转到小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中进行打靶，使其发生同源重组，通过PCR及 Southern blot筛选出中靶克隆。其中，所述5’端筛选的PCR反应引物对为

LRJ-072-PCR-F1(Seq ID.No.:1)：cactactctaccagctgtggcac和

LRJ-072-PCR-R1(Seq ID.No.:2)：caactgaccttgggcaagaacat，

所述3’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F2(Seq ID.No.:3)：Neo-PCR-F

LRJ-072-PCR-R2(Seq ID.No.:4)：gttatggagcaaaggttacttagtgg。

优选地，5’端筛选的PCR反应条件为95℃10秒、68℃6分钟，共35个循环；3’端筛选的PCR反应条件为95℃30秒、58℃30秒，72℃40秒，共35 个循环。

优选地，3’端筛选的PCR反应条件为95℃10秒、68℃6分钟，共40个循环；3’端筛选的PCR反应条件为95℃30秒、58℃30秒，72℃40秒，共35 个循环。

一些实施方式中所述步骤(3)是注射用囊胚采用C57BL/6N近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受体子宫，假孕受体为C57BL/6N与CBA的杂交一代，生育出嵌合率大于 50％的嵌合雄鼠。

一些实施方式中所述步骤二是将获得的嵌合率高的嵌合雄鼠先后与Flper 小鼠及野生型C57BL/6N小鼠交配，获得完全删去报告基因和Neo抗性基因的 TCTP条件性特异性敲减嵌合体小鼠。

一些实施方式中所述步骤七是与Cre工具鼠杂交，得到可以时空特异性表达TCTP基因敲减突变的小鼠嵌合体，所述TCTP基因全身性敲减的小鼠嵌合体，再与野生型C57BL/6N背景雌性回交，经提取尾基因组DNA进行PCR反应鉴定基因型，根据电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子，得到TCTP基因组织特异性敲减的F1代杂合子。

在一具体实施例中，用于F1代TCTP基因全身敲减杂合子小鼠基因型鉴定的 PCR反应的引物分别为：①检测5‘loxP：LRJ-072-B1 Loxp-F (5’-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3’(SEQID NO.29)。

②检测3‘loxP：LRJ-072-B2Loxp-R(AGCAACCATACCATCTGGATTCATGT) (SEQ IDNO.30)

反应条件为：95℃30秒；58℃30秒；72℃30秒；35个循环。

在一具体实施例中，用于本申请的TCTP基因组织特异性敲减的杂合子小鼠鉴定的引物件下表

表1：TCTP基因组织特异性潜能杂合子小鼠的鉴定引物及产物大小

表2具有组织特异性敲除潜能的纯合子鉴定引物及产物大小

表3：组织特异性敲除/敲减TCTP的小鼠的鉴定引物及产物大小

第五方面，本发明提供一种小鼠TCTP基因组织特异性敲减前体细胞系。其是用本申请第二方面的TCTP基因组织特异性敲减的打靶载体转染小鼠胚胎干细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为小鼠TCTP基因组织特异性敲减的前体细胞系。其中，用于鉴定所述中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物包括短PCR筛选引物和长PCR筛选引物，其中短PCR筛选引物包括

LRJ-072-B1 Loxp-F(Seq ID.No.29)：tcattgagactgttatctgtagaccagact

LRJ-072-B1 Loxp-R(Seq ID.No.30)：agcaaccataccatctggattcatgt。；

所述长PCR筛选引物组包括5’端筛选引物对和对3’端筛选引物对，所述5’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F1(Seq ID.No.:1)：cactactctaccagctgtggcac和

LRJ-072-PCR-R1(Seq ID.No.:2)：caactgaccttgggcaagaacat

所述3’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F2(Seq ID.No.:3)：GCTCGACTAGAGCTTGCGGA

LRJ-072-PCR-R2(Seq ID.No.:4)：gttatggagcaaaggttacttagtgg。

第六方面，本发明提供一种本发明第一方面所述的动物模型，第二方面所述的打靶载体，第三方面所述的基于重组酶识别的TCTP基因组织特异敲减打靶载体的构建方法，第四方面所述的小鼠精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或前体细胞系，第五方面所述的基于重组酶识别的小鼠TCTP基因的组织特异性敲减动物模型、子代、胚胎或细胞的制备方法在免疫学研究、免疫毒理学、免疫排斥反应及其机理的研究、药物安全性评价、药效学评价中的应用。

第七方面本发明提供一种本发明第一方面所述的试剂盒，第二方面所述的打靶载体，第三方面所述的基于重组酶识别的TCTP基因组织特异性敲减打靶载体的构建方法，第四方面所述的小鼠胚胎、子代、组织或前体细胞系、精子、卵细胞、受精卵、，第五方面所述的基于重组酶识别的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠动物模型、子代、胚胎或细胞的制备方法、小鼠TCTP基因敲除前体细胞在治疗疾病、不适的药物中的应用。

优选地，所述疾病为肿瘤疾病。

在一具体实施例中，所述疾病为肝肿瘤疾病。

本发明的TCTP基因全身条件性敲减打靶载体删除了TCTP基因的功能区第 3和4外显子，并产生一个73aa的截短蛋白(34aa来自N端，39aa来自 C端)。

本发明采取先全身敲除，后条件性敲除的设计方案，这种设计策略是在常规条件性敲除的基础上，在5’loxP上游插入一个两侧带有Frt序列的报告基因盒Reportercassette和新霉素抗性基因盒(Neo cassette)，Reporter cassette带有一个组成型剪切受体(En2 SA)，可以介导mRNA的强制剪切，使 Reporter能够在打靶基因启动子的驱动下表达，因此可用来示踪打靶基因的表达情况。同时由于Reporter cassette中polyA的存在，提前终止了此打靶基因的转录，从而达到了敲除此基因的目的。另外由于Reporter cassette和Neo cassette的两侧为Frt位点，可以被Flp重组酶识别，去除Reporter cassette 和Neocassette后会转变成常规的条件性敲除。综上，这种设计方案可获得保留条件性敲除潜能的全敲小鼠模型，即KO first,conditional ready。

附图说明

图1.TCTP基因全身条件性基因敲减动物模型制备流程图

图2.TCTP基因全身条件性基因敲减打靶载体构建策略图

图3.TCTP基因全身条件性基因敲减打靶载体LRJ-072打靶载体元件连接示意图

图4.TCTP基因全身条件性基因敲减靶载体酶切验证策略示意图

图5.TCTP基因全身条件性基因敲减靶载体构建过程的A,B1,B2,C1,C2 和C片段的PCR产物酶切后琼脂糖凝胶电泳5-A验证图

5-A,5-B,5-C,5-D，5-E,5-F,分别为A,B1,B2,C1,C2和C2和C片段示意图

5-G,5-H分别为3‘探针和5’探针

图6限制性内切酶分析:pDTA-down-C载体限制性内切酶酶切后琼脂糖凝胶电泳

pDTA-down-C载体r

限制性内切酶:XbaI，预期产物:1859bp+4492bp限制性内

切酶:EcoRV+SalI，预期产物1415bp+4936bp 3952bp

图7 pKFCR-B2载体用酶切验证的结果

用PstI酶切,泳道1-4产物大小为261bp+525bp+1418bp+5728bp

用SacI酶切泳道1-4用SacI酶切产物大小为922bp+3058bp+3952bp

泳道M:DNA标记物

图8用来自鼠ES细胞的DNA检测Southern BLOT探针(A用ScaI酶消化探针，B用EcoRV,消化探针)

图9 A-Neo-B vector的限制性内切酶分析限制性

内切酶:ScaI,期待产物s:1478bp+7905bp限制性

内切酶:BstZ17I，期待产物s:2895bp+6488bp

图10 LRJ-072 BAC AB重组载体的PCR验证

(引物：Atest-F/R；Btest-F/RExpected，产物长度：713bp；580bpB)

图11 pDTA-LRJ-072-靶向载体的限制性内切酶切后琼脂糖凝胶电泳图

图12 pDTA-LRJ-072-打靶载体大量制备产物限制性内切酶切割后琼脂糖凝胶电泳

1.限制性内切酶:SnaBI，期望产物21822bp

2.限制性内切酶:HindIII，期望产物:471bp+5197bp+6342bp+9812bp

3.限制性内切酶:EcoRI+EcoRV，期望产物: 1251bp+2646bp+4078bp+4939bp+8908bp

4限制性内切酶:SalI+ScaI，期望产物: 1495bp+2717bp+4582bp+5626bp+7402bp

图13 LRJ-072打靶载体的PCR筛选,

模板：改造的BAC,野生型基因组DNA

PCR-F1/PCR-R1

1.200ng BAC，2.100ng BAC，3.50ng BAC,4.10ng BAC,5.1ng BAC, 6.500pg BAC；7.WT；8.p-DAT ABC,

PCR-1.200ng BAC，2.100ng BAC，3.50ng BAC,4.10ng BAC,5.1ng BAC, 6.500pgBAC；7.WT；8.p-DAT ABC F2/PCR-R2

图14阳性ES克隆的LR-PCR筛选

图15SR-PCR筛选阳性ES克隆

图16 5’,3’和3’Neo探针SOUTHERN blot验证阳性ES克隆

图17 ES克隆的基因分型引物设计

图18 F1杂合子的基因分型

图19.TCTP基因组织特异性敲除小鼠品系的建立原理图

图20 Flp重组酶作用位点Frt在TCTP基因上的插入位点示意图

图21 TCTP基因全身敲减小鼠与FLP工具鼠交配TCTP基因全身敲减小鼠与 FLP工具鼠交配，在F1代中表达FLP酶，从而去除转基因染色体中Frt位点间的插入报告基因(GFP)和抗性筛选标记(neo)而保留exon2和3之间与4和5之间的 loxp位点的策略图。

图22具有组织特异性敲除潜能的杂合子基因型PCR检测结果

(野生型289bp vs杂合子341bp+289bp)

图23.具有组织特异性敲除潜能的杂合子基因型PCR检测结果

(野生型+未移除reporter的杂合子273bp vs移除reporter 的杂合子273+385)

图24.具有TCTP基因组织特异性敲除潜能的纯合子检测结果

FRT-F/R(野生型+未移除reporter的杂合子273bp vs移除 reporter的杂合子273bp+385bp vs移除reporter的纯合子385bp)

图25小鼠肝脏基因组DNA表达检测

(野生型289bp vs全身敲减289bp+341bp vs杂合子0bp+289bp vs 纯合子0bp)

图26小鼠肝脏基因组DNA(引物：FRT-F/TCTP-B2 Loxp-R(组织特异性敲除/敲减516bp，未敲除/敲减0bp))

图27 TCTP组织特异性TCTP敲除/敲减的小鼠进行组织表达蛋白检测

图28肝原位瘤活体成像(A野生型，B组织特异性敲除品系)

图29肿瘤活体成像肝肿瘤大小(A野生型，B组织特异性敲除品系)

具体实施方式

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本发明涉及一种制作基因敲除动物模型的方法，以及该动物模型在癌细胞凋亡，癌症治疗其机理的研究、临床前安全性评价(如免疫学评价、植入实验等)中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细胞、组织、器官及胚胎在上述领域。

本发明的小鼠模型被人为地剔出了TCTP基因的功能区第3和4外显子。利用了细菌人工染色体同源重组技术，以抗生素耐药基因和附加在5`端(上游)与 3`端(下游)的同源臂构成打靶载体，替换TCTP基因的功能区第3和4外显子。实施该发明的途径主要包括打靶载体构建、重组胚胎细胞克隆和囊胚显微注射。首先从C57BL小鼠的基因组DNA中分离TCTP基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，再与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；打靶载体策略构建如图2所示。从C57BL小鼠的胚胎中分离胚胎细胞，短期扩增培养后用于打靶载体的电穿孔，筛选、获得阳性中靶TCTP基因全身敲减的胚胎细胞克隆；经显微注射方法将重组胚胎细胞注入鼠胚胎中，然后移植到假孕鼠体内；获得黑斑状TCTP基因全身敲减嵌合体小鼠。TCTP基因全身敲减嵌合体小鼠进一步与FLP工具鼠交配，在F1代中表达FLP酶，从而去除转基因染色体中Frt位点间的插入报告基因 (GFP和neo)而保留exon2和3之间与4和5之间的loxP位点，去除Reporter cassette和Neo cassette，构建具有组织特异性敲除潜能的杂合子。将在盒子小鼠与野生型小鼠杂交三代以上，得到稳定组织特异性敲除潜能性状的杂合子或纯合子。进一步与组织特异性表达的Cre小鼠交配，TCTP基因组织特异性敲除/ 敲减的小鼠。利用分子生物学方法对得到的组织特异性敲除/敲减TCTP小鼠进行基因型验证，筛选具有TCTP基因组织特异性敲除潜能的杂合子小鼠和纯合子小鼠，并比较检测TCTP基因组织特异性敲减小鼠和全身敲减小鼠的组织DNA，结果表明；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子小鼠； Southern Blot方法进行基因型鉴定后，建系获得基因敲除动物种群。在此基础上，可以进一步获得该动物模型的细胞、器官及胚胎。Western blot检测了TCTP基因组织特异性敲除后组织中蛋白表达量。

具体的，本发明提出了一种从小鼠基因组中剔除TCTP基因的功能区第3 和4外显子的小鼠特别是啮齿类基因组织特异性敲除动物模型的制作方法(图 2)。本发明所用的TCTP基因全长约4.08kb，野生型模板基因序列选自 C57BL/6J小鼠第14染色体基因组DNA。TCTP基因含有6个外显子，其功能区位于第3-4外显子。本发明所构建的TCTP基因敲除打靶载体如图3所示长度为21.822kb，有5‘到3’顺次含有5`(上游)同源臂(5.6kb)、外显子1和外显子2，(Frt序列的-报告基因盒-loxP-正筛选标记基因盒- Frt序列的、5’loxP、外显子3-4和3‘loxP、外显子5和外显子6和 3`同源臂(5.0kb)、和负筛选标记DAT。其中所述报告基因盒带有一个组成型剪切受体(En2 SA)，可以介导mRNA的强制剪切，使报告基因能够在打靶基因启动子的驱动下表达，所述FRT序列可被Flp重组酶识别；所述报告基因盒中包含多聚腺苷酸(Poly A)。用NeoR-PA取代第5外显子。

将TCTP基因5’ScaI酶切片段克隆的中间载体pKFCR-EGFR,5`(上游) 同源臂(5.6kb)包括TCTP基因外显子1和2；3‘EcoV酶切片段克隆到载体，3‘同源臂包含TCTP基因的外显子3，4,5和6。Neo进作为阳性筛选标记放在第2和第3外显子之间的内含子中NEO基因两侧各有一个LoxP 序列；阴性筛选标记基因放在5‘同源臂外侧，载体可用PstI酶切线性化。

利用两侧带有Frt序列的-报告基因盒-loxP-正筛选标记基因盒--Frt剔除TCTP基因的第3和4外显子2，最上端为野生型基因位点(WT locus)，含有6个外显子(Exon1-6)；插入的抗生素耐药基因 (neo,PGK-gb2-neomycin selection cassette)取代了外显子2的部分3’端序列；打靶载体包括含2～4外显子2-4，插入了Frt序列的-报告基因盒-loxP- 正筛选标记基因盒-Frt序列的、5’loxP、exon外显子3-4和3‘loxP的上游同源臂和插入了负筛选基因的下游同源臂；重组完成后脱掉neo序列，其示意图如图2所示。

通过显微注射(Microinjection)生产基因敲除动物的过程包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵；重组胚胎细胞的制备；将重组阳性的胚胎细胞导入受精卵；受精卵的移植；嵌合体小鼠的获得，进一步与野生型小鼠交配，获得杂合子小鼠(首建鼠)；首建鼠(Founder)中重组DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。

本发明获得的TCTP基因敲除嵌合体小鼠具有新的表型。一般生命指征正常，生长发育正常。由于TCTP基因剔除动物模型的报道极少，其表型特征有待进一步观察。

采用如下方案交配建系：对于雌性嵌合体小鼠则与表达重组酶的雄鼠交配，选择周龄在10周，具有交配经历、身体健壮的C57BL小鼠与之交配。同居1 周后开始检查受孕情况，如果发现怀孕即将雌鼠单独饲养，直至生产。如果为雄性嵌合体小鼠，则选择8周以上，健壮的雌鼠与之交配。每一只纯合子小鼠的后代单独标记，作为一个系对待。检测发现基因剔出能在后代中稳定遗传，每窝产仔数量与正常小鼠无异，一般能成功喂养，少有吃仔等母性不良现象。这些有利特性为下一步大规模繁殖建系打下了基础。

TCTP的基因水平表型鉴定采用TCTP mRNA的RT-PCR鉴定法。TCTP的蛋白质水平表型鉴定采用TCTP western blot鉴定。TCTP全身敲减小鼠TCTP基因表达的缺失将会导致全身各组织TCTP表达降低。TCTP剔除动物的生命周期与野生型动物无显著差异，未见生命周期不同的报道。本发明中，嵌合体小鼠的生命周期未见缩短现象，且一般状态正常。

本发明涉及制作基因敲除动物模型的方法，以及该动物模型在多种生物源性材料(动物源性、取自人体的)、组织或器官的免疫学研究、免疫排斥反应及其机理的研究、临床前安全性评价(如免疫学评价、植入实验等)中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细胞、组织、器官及胚胎及其在上述领域中的用途。

本发明在构建的基因打靶载体时，采用的是正负筛选策略，因此能够很大程度上排除随机整合的细胞，提高打靶细胞富集效率。通过在正筛选基因两侧引入重组酶识别序列，以方便后续的标记基因的删除。

本申请获得人为地剔出了TCTP的功能区第3和4外显子动物模型。目前，尚未人研究用来作为研究癌症细胞凋亡机制和癌症靶点的一种工具和方法；本发明利用同源重组技术以及胚胎干细胞技术构建稳定遗传的TCTP基因全身敲除小鼠，用于研究癌症细胞凋亡机制和癌症靶点的研究；癌症靶向治疗的研究，避免了全身敲除该基因造成的胚胎致死，对于研究TCTP基因的癌症发生发展过程中发挥的作用，对癌症治疗具有重大意义。

本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。

以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，其它可以参考本领域相应的PCR和基因测序的实验手册。

以下实施例中载体设计由本申请人完成，序列测定由北京华大基因完成， Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、均购自北京NEB公司，其他试剂为进口分装。体细胞克隆所用试剂均购自Sigma公司。

LIF(白细胞抑制因子)，DMEM高汤培养基，L-谷氨酰胺，非必须氨基酸、新霉素蓉儿，巯基乙醇，胎牛血清(ES小认证)，撕裂霉素C,二甲亚砜(DMSO),PBS缓冲液(Ph7.2),EDTA-胰蛋白酶，G418,明胶，Brinster BMOC-3

培养液等试剂分别购自Sigma和HyClone公司。

TCTP打靶载体pDTA-LRJ-072：实验室构建；

ES细胞株TC1为本实验室筛选分离；G418抗性的小鼠胚胎或成纤维细胞为本实验室建立。小鼠C57BL/6J购自昆明军事医学科学院试验动物中心。

酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1打靶载体的构建

1.打靶载体元件和打靶策略设计

本实施例小鼠TCTP基因敲减打靶载体采用先全敲，再条件性敲除的设计方案，这种设计策略是在常规条件性敲除的基础上，在5’loxP上游插入一个两侧带有Frt序列的报告基因盒(Reporter cassette)和抗生素抗性基因盒(Neo基因盒)，报告基因盒Reportercassette带有一个组成型剪切受体(En2 SA)，可以介导mRNA的强制剪切，使报告基因盒Reporter cassette能够在打靶基因启动子的驱动下表达，因此可用来示踪打靶基因的表达情况。同时由于报告基因盒 Reporter cassette中polyA的存在，提前终止了此打靶基因的转录，从而达到了敲除此基因的目的。另外由于Reporter cassette loxP-Neo cassette的两侧为 Frt位点，可以被Flp重组酶识别，从而去除(Reporter cassette)和抗生素抗性基因盒(Neo cassette)后会转变成常规的条件性敲除。综上，这种设计方案可获得保留条件性敲除潜能的全敲小鼠模型，即KO first,conditional ready。

打靶位点示意图如图2所示：TCTP基因序列选自C57BL/6J小鼠第4染色体基因组DNA(GRCm38.p1C57BL/6J)。敲减的小鼠目标基因的TCTP基因全部长度为4.08Kb，其受到删除的功能区位于小鼠TCTP基因外显子3和4，其长度包括第3外显子功能区区和第4外显子功能区区加上5`上游，产生一个73aa 的截短蛋白(34aa来自N端，39aa来自C端)。

本发明所用打靶载体长度为21.822kb(图1-A)，命名为pDTA-LRJ-072- 打靶载体KO，含有(上游)同源臂(5.6kb):5`UTR-外显子1和2、 5‘Frt-En2-SA-IRES-eGFP-PA-LoxP-Neo-3‘Frt、 5‘LoxP’-外显子3-外显子4-3’LoxP、 3`(下游)同源臂(5.0kb):外显子5-外显子6-3’UTR。

其中476bp的B2片段(SEQ ID No.33)：5‘LoxP位点-外显子2的3 ‘内含子非保守区-’TCTP基因外显子3-外显子3-外显子4的3‘内含子非保守区，1120bp的B1片段(SEQ IDNo.32)：5‘Frt序列-带组成型剪切受体(En2 SA)的报告基因盒-LoxP位点-抗生素筛选标记基因盒-3‘Frt序列；

391bp的A片段(SEQ ID No.31)：5`(上游)同源臂(5.6kb)-TCTP基因1和2-5‘Frt位点-；

467bp的C1片段(SEQ ID No.34)：TCTP基因第4外显子的3‘非保守区内含子-外显子5-外显子6；

462bp的C2片段(SEQ ID No.35)：TCTP基因第外显子6的3‘非保守区和DAT 基因-3-下游区

敲除外显子3和外显子4后TCTP基因预测翻译为：

MIIYRDLISHDELFSDIYKIREIADGLCLEVEGKFFIGENMNPDGMVALLDYREDGVTPFMIFFKDGLEMEKC

2.设计合成带限制性内切酶切位点的引物

上述片段的序列和扩增上述片段所用的引物如表4

3.用正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA为模板，用步骤2设计的引物扩增步骤1设计的TCTP基因的打靶载体的构成片段B1(112bp)、B2(476bp), C1(467bp)、C2(462bp)片段he B片段和5‘探针(350bp)和3’探针 (452bp)，克隆A片段体系和程序如表5所示

表5A片段PCR反应体系和程序

克隆B1片段的扩增体系和程序如表6所示：

表6：克隆B1片段的扩增体系和程序

克隆B2片段的扩增体系和程序如表7所示：

表7：克隆B2片段的扩增体系和程序

克隆C1片段的扩增体系和程序如表8所示：

表8：克隆C1片段的扩增体系和程序

克隆C2片段的扩增体系和程序如表9所示：

表9：克隆C2片段的扩增体系和程序

4.TCTP基因打靶载体的构成片段的PCR扩增产物的回收和测序、酶切、电泳验证，连接到pBlunt载体，构建中间载体。回收操作按本领域通用《分子克隆(第三版)》相关实验章节，电泳验证结果如图5所示

用PCR产物回收试剂盒回收，将回收的片段分别连接到pBlun(来自)，酶切后，琼脂糖凝胶电泳，紫外成像结果如图5的A～I所示。

pBlunt-A:1#和2#正确，1#用于下步测序。

pBlunt-B1:1#和3#正确3#用于下步测序。

pBlunt-B2:1#和正确1#用于下步测序。

pBlunt-C:1#正确，1#用于下步测序。

pBlunt-5’探针:1#和2#正确，1#用于下步测序。

pBlunt-3’探针:1#和2#正确，1#用于下步测序。

片段B1测序引物

表10

引物	序列
		LRJ-072-B1-616F	GCTAGAAGACATTACCTATTGGAGC
LRJ-072-B1-713R	GGTTTCTGCTCTTCAAGTTTGC

其他片段测序引物：M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R:CAGGAAACAGCTATGACCATG

5.构建中间载体

(1)酶切和连接

根据在B1的正向和反向引物分别添加AsisI和SalI酶切位点，或B2 片段的正向和反向引物分别添加有MluI/EcoRV和ScaII/BstZ酶切位点，A片段的正向和反向引物添加有EcoRI/BstZ171位点和Eco47III/Sca酶切位点，分别用相同的限制性内切酶酶切pKFCR-EGFP。

用PCR回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司，货号：GK2043-200)回收上述片段，琼脂糖凝胶电泳(北京君意东方电泳设备有限公司，货号： JY300HC)检测结果如图5所示。

(2)连接：按上述酶切位点分别酶切B1.B2,A片段，将片段B1或B2 先后连接到pKFCR-EGFP，再连接A片段，

可用AsisI和Eco47III/ScaI或MluI/EcoRV和Eco47III/ScaI酶切将 B1-NEO-A或B2-NEO-A将B-Neo-A从连接正确的中间载体pKFCR-EGFP-B1-A或pKFCR-EGFP-B2-A用AsisI和Eco47III/ScaI或MluI/EcoRV和Eco47III/ScaI酶切。

根据C1的5‘和3’两端分别添加XhoI/SnaBI和EcoRV和C2片段的5 ‘和3’两端分别添加EcoRV和Not位点。通过融合PCR将C1和C2片段融合为C片段，C片段的5‘为SnaBI位点，3‘为EcoRV位点’。’pDTA-down 的5‘用SnaBI，3‘用EcoRV位点’作用。

然后采用PCR方法分别扩增第5外显子5’端探针A(391bp)和3’端探针B1(112bp)、B2(476bp),C1(467bp)、C2(462bp)片段，扩增片段再用验证引物进行PCR验证，验证引物如表5所示，中间载体的PCR验证结果琼脂糖凝胶电泳如图5所示。

表11中间载体的PCR验证引物

限制性内切酶:ScaI，产物:1478bp+7905bp

限制性内切酶::BstZ17I，产物:2895bp+6488bp。

5：TCTP全身性基因敲减打靶载体构建

(1)将酶切鉴定和测序正确的B1或B2片段和A片段依次连接到pKFCR 载体，得到pKFCR-EGFP-TCTP-B1-A或pKFCR-TCTP-EGFP-B2-A，酶切和然后测序。根据扩增引物中带的酶切位点，通过酶切连接方法将片段B1或B2连接入pKFCR-EGFP载体(本发明人构建)中得到pKFCR-EGFP-B2或pKFCR-EGFP-B1 (酶切验证结果如图7所示)，全部克隆正确，1号克隆用于下步。然后将片段A 连接，得到中间载体pKFCR-EGFP-B2-B1A(酶切验证结果如图9)，

将重组了B的pKFCR-EGFP载体进行PCR验证(表12)。

表12 pKFCR-EGFP-B1-B2-A载体PCR验证A片段的反应体系和程序

所有克隆都正确，1号克隆用于下一步。

将重组了AB的pKFCR-EGFP载体进行PCR验证B片段(表13)。

表13重组了AB的pKFCR-EGFP-B1-B2-A进行PCR验证B片段的反应体系和程序

其PCR反应产物的验证结果如图12.。除了2号，其他克隆都正确连接，1 号克隆用于下步。

PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图10所示。

PCR验证结果1号克隆正确。

(2)6通过重叠PCR将测序正确的C1和C2片段融合为C片段(883bp) 克隆连接到pDTA-down载体(本实验室构建)，得到pDTA-down-C，通过PCR 和酶切验证结果如图6。1号克隆正确，用于下步。

构建好的载体同时通过PCR

(3)将pDTA-down-TCTP-C的线性化处理，即XhoI/SnaBI和NotI酶切处理pDTA-Down-TCTP-C，回收目的条带为线性化的pDTA-down-TCTP-C，酶切验证结果如图6。

(4)通过网页www.ensembl.org搜索小鼠TCTP基因的外显子信息，我们选择敲除该基因的3，4号外显子(如图3所示)。所敲掉的3和4号外显子序列包含TCTP基因重要功能结构域，根据敲除位点选择左右同源臂。我们选择的5’同源臂有5.5kb(长臂)，5.0kb的3’同源臂长(短臂)，分别在同源臂的外侧各选500bp的序列，设计扩增TCTP基因5‘同源臂和3‘同源臂的引物(表14)，。

表14 PCR扩增TCTP基因的同源臂所用的引物

5.转化感受态细胞

通过电穿孔仪(供应商：BTX，型号：ECM-630)将目的片段A-NeoR-B转入含pBCTG的BAC菌种(RP23-212C13，购自invitrogen)。

(1)C57BL/6J小鼠品系的BAC查询和订购：通过网页www.ensembl.org搜索C57BL/ 6J小鼠TCTP基因在4号染色体4号的，选取包含TCTP基因全部基因组的BAC(RP23-212C13，购自invitrogen)下订单。外显子信息，我们选择敲除该基因的3和4号外显子(如图2打靶策略所示)。

(2)BAC的抽提及纯化、验证

所定购的C57BL/6J小鼠品系BAC克隆(RP23-212C13，购自 invitrogen)被装入TOP10菌株(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB104-02)以琼脂为载体邮寄过来，我们将菌种进行扩增，来提取BAC。

表15.BAC的抽提及纯化所需要的试剂

(3).制备电转感受态细菌(按本领域试验手册)及将目的片段A-NeoR-B 电转入含pBCTG的BAC菌进行重组。

将Stbl3感受态(北京全式金生物技术有限公司，货号：CD521-01)细胞与100～400ng DNA(必须溶于MilliQ)混合并转入预冷的0.1cM电转杯中，置于冰上准备转化；设置BIORAD电转仪，1.75kV，25μF，200Ω，进行电转；电击后，迅速加入500μl SOC并于32℃保温30分钟；菌液均匀涂在相应的抗生素抗性LB琼脂板上，于32℃保温12～20小时，后提质粒PCR和电泳、凝胶紫外成像验证。结果如图7和9所示。LRJ-072 BAC AB重组载体的PCR 验证产物电泳成像图如图10的A和B所示。

用XhoI/SnaBI和NotI酶切处理pDTA-Down-TCTP-C回收的目的条为线性化的pDTA-down-TCTP-C电转重组了B-Neo-A的BAC,得到重组了含TCTP- B-A-C片段连接物的打靶载体的BAC菌。

6.打靶载体LRJ-072 B-A-C的酶切验证分析

经转化Stbl3感受态细胞后，少量提质粒和大量提质粒，酶切TCTP-打靶载体验证结果分别如图11所示和图12所示

(1)HindIII酶切预期产物：

471bp+5197bp+6342bp+9812bp；

(2)EcoRI+EcoRV酶切

预期产物1251bp+2646bp+4078bp+4939bp+8908bp；

(3)SalI+ScaI酶切

预期产物495bp+2717bp+4582bp+5626bp+7402bp。

7.打靶载体LRJ-072 B-A-C的大量制备产物的酶切验证分析如图12所示。 PCR引物：LRJ-072-PCR-F1/PCR-R1；Neo-PCR-F/PCR-R2

模板：改造的BAC；野生型基因组DNA产物：6016bp；6475bp

模板：改造的BAC；野生型基因组DNA Neo-PCR-F/PCR-R2引物可用于下一步PCR筛选。PCR-F1/PCR-R1引物不能用于下一步PCR筛选。

打靶载体pDTA-TCTP-A-B-C1号质粒大提后酶切检测(图12)：

酶及酶切产物列表

SnaBI酶切产物：21822bp；

HindIII酶切产物:471bp+5197bp+6342bp+9812bp

EcoRI+EcoRV酶切产物：1251bp+2646bp+4078bp+4939bp+8908bp

SalI+ScaI酶切产物：1495bp+2717bp+4582bp+5626bp+7402bp。

8.打靶载体的PCR引物优化筛选，PCR产物的电泳凝胶成像分析如图13所示引物采用PCR扩增TCTP基因的同源臂所用的引物LRJ-072-PCR-F1/PCR-R1；

Neo-PCR-F/PCR-R2为引物，

表16打靶载体的PCR引物优化筛选

产物大小6016bp；6475bp。修饰的BAC和野生型基因组DNA为模板。

结果,Neo-PCR-F/PCR-R2引物可用于下一步PCR筛选。PCR-F1/PCR-R1引物不能用于下一步PCR筛选。

实施例2向ES细胞显微注射TCTP基因全身条件性敲减打靶载体和中靶克隆筛选(1)滋养层细胞的制备备和ES细胞培养

取小鼠原代胚胎成纤维细胞，扩增后用丝裂霉素C处理3小时，丝裂霉素C终浓度为10μg/Ml,最后分装冻存与-80度。解冻ES前一天用滋养层铺好0.1％明胶处理过的培养皿，ES细胞的培养采用添加LIF的培养液(LIF 浓度1000U/Ml)

(2).ES细胞的电转和克隆筛选

转染前将打靶载体用MluI/EcoRV和NotI酶线性化。或者根据打靶策略图选ScaII和EcoRV两种酶。线性化酶切反应体系和反应程序为 ES细胞用胰蛋白酶消化后重悬与PBS中，将线性化的打靶载体DNA(45μ g)与1mL细胞(2*10^7、/mL)混匀装入电穿孔槽，电击参数600V,25Μf,电击后细胞种入4个长满滋养层的培养皿，24h后换成含G418(280μ g/Ml)，GAN(2μmol/L)的ES细胞筛选培养液。(3)中靶ES克隆挑取和扩增

转染后7-8天开始挑取中靶克隆。在低倍显微镜下挑取单个未分化的ES 克隆置于96孔板，每个克隆分为二，一份冻存，一份培养后转至24孔培养板扩增。

在显微镜观察共挑取200个表观中靶克隆。

(4).TCTP条件性基因打靶载体的中靶ES细胞的Southern blot鉴定将pDTA-LRJ-072打靶载体线性化并电穿孔转入ES细胞

Southern blot探针的制备

用来自鼠ES细胞的DNA测定Southern blot探针(TCTP条件性基因敲减的5’和3‘探针).

打靶载体用Scal酶切消化后电泳检测5‘探针，用EcoRV消化后用3‘探针检测3‘探针。

TCTP基因打靶载体用ScaI消化后,用5‘探针进行Southern blot，如图10A所示，产物大小为11.2bp。TCTP基因打靶载体用EcRV消化后,用3‘探针进行Southern blot，如图10B所示产物大小为21bp。结果表明，5‘探针和3‘探针都可用于随后中靶克隆的Southernblots筛选’’

用G418筛选阳性克隆，提200个克隆，与96孔板冷冻，进行PCR筛选和 Southerblot鉴定。

挑取抗G418/GANC阳性克隆扩增，提取染色体组DNA，酶切消化，用验证过的TCTP打靶载体3‘和5’的外侧探针和3’Neo探针进行Southern blot，结果如图16所示，野生型和TCTP中靶ES细胞带型有差别。

表17 Souther blot验证TCTP基因条件性敲减打靶载体的中靶ES细胞克隆

用从小鼠ES细胞分离的DNA测试Southern blot探针.探针序列见表18。

5‘探针(短同源臂)和3‘探针(长同源臂)都能用于下列 Southern筛选.

表18-1

LR-PCR筛选阳性克隆引物和产物片段大小

表18-2 SR-PCR筛选阳性克隆引物和产物片段大小

用5‘探针在野生型和中靶克隆中分别检测到11.2kb和8.7Kb的片段，用3‘探针在野生型和中靶克隆中分别检测到21kb和10.2Kb的片段。可见分别用Scal酶切和EcoRV作用后，分别产生的同源臂的片段长度不同。总共获得9个阳性克隆。#1板:C2,C5,C7，#2板:A5,A11,B12,C7,E2,E4。选 C7,C2,C5和B12号克隆进行计数。

根据Southern blot检测结果最后选取正确的克隆C7,C2,C5和B12 进行注射。

探针1(Probe1)位于5`端同源臂的外侧，在B片段3’端引入了的酶切位点。5‘探针用ScaI消化，3‘探针用EcoRV消化。因此，野生型和突变型ScaI 和EcoRV酶切后和探针结合序列的产物不同，分别为如表19所示。

获得9个阳性克隆，这些阳性克隆将用于鼠胚的囊胚注射。

(5)中靶阳性克隆的PCR检测

将挑取的200克隆分别进行LR-PCR和SR-PCR筛选。

表19 LR-PCR和SR-PCR筛选的引物和片段大小

LRJ-072 PCR-F2和LRJ-072 PCR-R2进行LR-PCR筛选，结果如图14、6所示，共筛选出17个阳性克隆，A1,B7,C2,C5,C7,C11,D9,E7,F11,H4 10个阳性克隆在板 1，,A5,A11,B12,C7,D11,E2,E4等7个阳性克隆在板2 SR-LRJ-072-B1 Loxp-F和 LRJ-072-B1 Loxp-R进行SR-PCR筛选，结果如图15所示，共筛选出35个阳性克隆，板1的21个,A1,B7,C2,C5,C7,C11,D9,E7,F11,H4,H2,H3，板2的14个， A5,A11,B12,C7,D11,E2,E4,B2,B7,C8,D5,E5。阳性克隆的核型分析见表20.

实施例3、中靶的重组胚胎细胞的囊胚注射和嵌合体的培养

通过对囊胚的显微注射(Microinjection)生产基因敲除动物，其主要过程包括以下步骤：

3.1制备不育雄鼠和假孕雌

鼠不育雄鼠制备

3.1.1麻醉准备：选择7周龄雄鼠称重并经腹腔注射0.7％戊巴比妥钠溶液。

3.1.2准备手术器械：眼科镊3把，眼科剪1把，剪毛剪1把，酒精灯，酒精喷壶一个，三棱针，缝合线，消毒滤纸片(直径15cm左右)。

3.1.3雄鼠结扎：将已麻醉雄鼠腹部距生殖器2cm处剪毛，70％酒精棉擦拭消毒后，分别开口皮肤层和肌肉层，用眼科镊夹住睾丸脂肪团拉出睾丸、附睾、输精管，选取输精管中间部分，用缝合线将输精管及毛细血管扎紧，间隔1cm处再次扎紧，用简单将缝合线扎紧的中间部分剪掉，一侧的结扎手术完成，用同样方式再结扎另外一侧，两侧完成用镊子夹住脂肪团将其送回腹腔，缝合肌肉层和皮肤层，复苏后单笼饲养。

3.1.4术后复苏：结扎完成饲养两周后，用6周龄发情雌鼠合笼交配，翌日检栓后单独饲养，15日后确认妊娠与否，检查结扎成功与否。

假孕雌鼠准备：

3.1.5发情雌鼠挑选：挑选发情前期和发情期雌鼠，组织表征为阴道裂缝，组织为淡红色到粉色，较湿润，在阴道背唇和腹唇上都出现许多纵横的皱纹。

3.1.6与结扎雄鼠交配后选择假孕雌鼠取囊胚：将已选发情雌鼠1:1结扎雄鼠交配，次日检查阴栓，单笼饲养备用，见栓当天为0.5天，输卵管移植用见栓 0.5天假孕鼠，子宫移植用见栓3天假孕鼠。去除子宫用BMOC-3培养液冲洗出囊胚，在60mm培养皿上滴数滴培养液，用矿物油覆盖，将囊胚转移到液滴中培养。

3.2超排卵

3.2.1激素准备：用0.9％生理盐水稀释孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性激素(hCG)，国产激素稀释为10IU/0.1ml，进口激素稀释为5IU/0.1ml。

3.2.2激素注射：准备4-6周龄雌鼠，间隔48小时，每只分别腹腔注射PMSG 和hCG10IU。hCG注射后与同品系性成熟雄鼠合笼交配，次日检栓，单笼饲养备用，见栓当日为0.5天，3.5天后处死雌鼠采集囊胚。

3.3采集囊胚

3.3.1培养液准备：M2培养液放到37℃水浴锅温育，KSOM培养液和1mg/ml透明质酸酶在超净工作台内做成培养液滴，放到37℃二氧化碳培养箱温育备用。

3.3.2解剖动物：颈椎脱臼处死见栓3.5天雌鼠，70％酒精棉消毒擦拭腹部后，打开腹腔，取其子宫，放到已温育有1ml M2培养液的35mm培养皿中。

3.3.3采集胚胎：取原核胚是将输卵管放到300μl透明质酸酶液滴中，在实体显微镜下，找到输卵管膨大部，用1ml注射器针头将其刺破，释放卵母细胞团， 3～4分钟后在显微镜下观察，卵母细胞周围的颗粒细胞已消化，就可以收集卵母细胞，洗涤干净后放到KSOM培养液滴，放到二氧化碳培养箱中备用。取囊胚是将子宫放到60mm培养皿中，用1ml注射器吸取M2培养液，在实体显微镜下，将注射器针头插入子宫一端，冲洗子宫，并在镜下收集囊胚，洗涤干净后放到KSOM培养液滴，放到二氧化碳培养箱中培养备用。

3.4将重组的胚胎细胞导入囊胚

囊胚显微注射：用M2培养液在60mm培养皿上做椭圆形注射滴，覆盖石蜡油，将培养皿放到显微操作仪镜下，取30个囊胚放到注射滴中，再吸取干细胞加入注射滴中，调整显微镜物镜，在合适倍数下，调整注射针，吸入50～100个干细胞，在镜下找到囊胚，操作持卵针，固定囊胚，操作注射针将10～15个干细胞注射到1个囊胚腔中，完成注射。显微注射记录如表21所示。一批囊胚注射完成后放回KSOM培养液滴中，于二氧化碳培养箱培养，恢复30分钟后挑选好的囊胚进行子宫移植。

表21显微注射记录总结

3.5受精卵的移植

囊胚移植：假孕鼠背部距尾部3～4cm的背中线处被毛，用70％酒精棉擦拭消毒后剪开皮肤层，再找到卵巢部位，剪开肌肉层，将卵巢、输卵管和子宫取出，用止血钳固定，在实体显微镜下吸取8个囊胚，同时将已经固定好卵巢、输卵管的假孕鼠放到显微镜下，找到子宫和输卵管连接处血管少的部位，用1ml注射器针头刺一小口，将有囊胚的吸卵管沿口插入，把胚胎吹入，用同样方式移植另一侧。

术后缝合皮肤层，动物苏醒后单笼饲养，等待注入重组胚胎细胞的受精卵着床，母鼠的受孕。

实施例4、交配、繁育与TCTP基因全身敲除小鼠种系获得

将实施例3获得的ES细胞(C57BL/6ES细胞TCTP^mut/+)(黑色)阳性克隆经显微注射技术注入Balb/C小鼠(白色)的囊胚中，再移植入代孕母鼠(昆明鼠，白色)的子宫内，获得TCTP基因全身敲除的子代F0嵌合体小鼠。嵌合鼠确认：在移植17日后产子，记录产子数量，在10～15天据毛色确认是否有嵌合鼠。胚胎细胞来源于C57BL/6，黑色；囊胚供体Balb/C是白色的，所以得到黑色斑点的花斑嵌合体小鼠。通过杂交繁育获得TCTP基因全身敲除小鼠种系：：Balb/C(TCTPmut/+，(fl-neo-loxp-TCTP)

实施例5 TCTP基因时空特异性敲减小鼠品系的建立

采用如下方案交配建TCTP基因时空特异性敲减小鼠品系：

(1)剔除报告基因盒和抗生素抗性基因盒的条件性基因敲减小鼠的获得。全身敲减小鼠(fl-neo-loxp-TCTP，专利申请中)与Flp- deleter小鼠(B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1(FLP1)Dym/RainJ)交配，去除Reporter cassette和Neo cassette，构建具有组织特异性敲除潜能的杂合子(命名为)。Flp 酶的作用位点如图20，构建策略如图21，PCR验证结果如图22。

对于雌性全身敲减小鼠(fl-neo-loxp-TCTP，专利申请中)与Flp- deleter雄性小鼠(B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1(FLP1)Dym/RainJ)交配，去除Reporter cassette和Neocassette，构建具有组织特异性敲除潜能的杂合子。嵌合体小鼠则与Flp重组酶阳性雄鼠交配，选择周龄在10周，具有交配经历、身体健壮的C57BL/6(Flp(+)/Flp(+))重组酶阳性C57BL/6雄鼠小鼠与之交配。同居1周后开始检查妊娠情况，如果发现怀孕即将雌鼠单独饲养，直至生产。如果用雄性TCTP基因全身敲减嵌合体小鼠，则选择8周以上，健壮的Flp重组酶阳性C57BL/6Flp(+)/Flp(+)雌鼠与之交配，获得剔除抗生素抗性基因和报告基因盒的嵌合体小鼠(Balb/C((Flp+/Flp,Neo- /Neo-.报告基因缺失/报告基因缺失)。

(2)将杂合子小鼠与野生型小鼠杂交三代以上，以稳定杂合子性状。

(3)稳定性状的杂合子小鼠互交，获得具有组织特异性敲除潜能的纯合子。

(4)将组织特异性表达的Cre(+)小鼠与具有组织特异性敲除潜能的纯合子/杂合子交配，通过筛选，即可获得组织特异性敲除/敲减TCTP的小鼠，并不影响小鼠的正常发育。

通过Cre酶的作用，获得剔除TCTP基因功能区的外显子3和4的TCTP 时空特异性性基因敲减小鼠。

表22嵌合体育种总结

5、中靶小鼠基因型鉴定

5.1剔除TCTP外显子基因功能区的外显子3和4的TCTP条件性基因敲减小鼠中目的重组DNA整合情况的检测：

将野生型小鼠Balb/C 6作为为对照，从剔除报告基因盒和抗性基因的 TCTP条件性基因敲减杂合子小鼠的尾尖组织提取DNA，通过高保真PCR扩增 TCTP基因的部分片段进行基因型的鉴定。用于基因型鉴定的引物设计见B表 23-1和表23-2

表23-1用于嵌合体基因型鉴定的PCR引物

引物	序列	Tm(℃)	产物大小
				LRJ-072-B1	TCATTGAGACTGTTATCTGTAGACCAGACT	60	WT:289bp
LRJ-072-B2	AGCAACCATACCATCTGGATTCATGT	60	Mut:341bp

其PCR反应体系和程序为表23-2

TCTP基因条件性全身敲减鼠的基因分型PCR.扩增基因片段的电泳图如图18 所示为

图18中显示获得，3号和4号2个杂合子克隆为杂合子阳性克隆。经

多次繁殖，合计获得4号为阳性中靶杂合子小鼠，用于纯合子小鼠的育种繁育。

纯合子基因型鉴定后，同时利用5’Probe、3’Probe和Neo Probe进行ES细胞筛选。确认敲除基因的正确性和稳定性。Southern blot筛选策略的示意图如图19，其中用短线表示了出5’Probe和3’Probe的位点。所示探针1和探针2的引物设计同表9；具体设计如下：

在5’端为Frt位点上游引入5’端Southern酶切位点，3’端loxP位点下游引入3’端Southern酶切位点，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；若未正确重组，将只会出现野生型条带。

通过5’Probe和3’Probe的southern blot检测TCTP基因敲除杂合子小鼠(Mut/WD)只会产生突变型条带，杂合子小鼠(Mut/WT)会产生野生型和突变型条带，而TCTP基因未敲除的野生型小鼠(WT/WT)只会产生野生型条带。各条带的大小见表24。

表24.Southern杂交检测杂合子中目标敲除基因片段的大小

限制性酶	探针	WT	杂交靶序列
				ScaI	5’	11.2	8.7kb
EcorRV	3’	21.0	15.4kb
				NdeI	Neo(5’)	--	14.5kb
MfeI	Neo(3’)	--	10.2kb

Southern Blot合计检测只小鼠(杂合子和野生型各只)，提取TCTP基因敲减合子小鼠(Mut/WT)以及野生型小鼠(WT/WT)鼠尾基因组DNA。其Southern Blot 鉴定结果分别如见图10(5’Probe)所示，证实了纯合子小鼠已经获得了稳定的遗传。

实施例5 TCTP基因组织特异性敲减小鼠的基因型检测

1.全身敲减小鼠(fl-neo-loxp-TCTP，专利申请中)与Flp-deleter小鼠(B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1(FLP1)Dym/RainJ)交配，去除Reporter cassette和Neocassette，构建具有组织特异性敲除潜能的杂合子小鼠鉴定的引物和产物大小见下表

表25：TCTP基因组织特异性潜能杂合子小鼠的鉴定引物及产物大小

引物：TCTP-B1 Loxp-F/R(野生型289bp vs杂合子341bp+289bp)，检测结果如图22和23。

结论：

1/2/3/6/9/12/13/15/16/17是转基因小鼠(杂合子)其中，

1/2/3/9/12/15/16是具有FLP工具酶，移除了reporter

表26具有组织特异性敲除潜能的纯合子鉴定引物及产物大小见下表

引物：FRT-F/R(野生型+未移除reporter的杂合子273bp vs移除reporter 的杂合子273+385)检测结果如如23

检测结果如图24

结论：5,6为杂合子；1,2是纯合子。

表27：组织特异性敲除/敲减TCTP的小鼠的鉴定引物及产物大小

检测结果如图25和26.

结论：4,5为杂合子；8,14为杂合子

其余为非组织特异性敲除

7、表型鉴定

本发明获得的TCTP基因敲减小鼠具有新的表型。一般生命指征正常，生长发育正常。由于TCTP基因敲减动物模型的报道极少，其表型特征有待进一步观察。

(1)TCTP基因的基因表达水平表型鉴定：Westhern blot

试剂配制步骤参照本领域实验手册。

检测结果如图27表明，与野生型相比，在纯合子(敲除)中，TCTP基因特异性在肝脏中被敲除。在杂合子(敲减)中，TCTP基因特异性的在肝脏中被敲减。而在脑组织中，该基因的表达与野生型相比并无变化。

(2)TCTP全身敲减小鼠各组织的蛋白质表达水平表型鉴定

采用Westhern blot进行TCTP蛋白表达的检测。

TCTP基因Westhern blot检测所用的试剂和检测条件

如图19所示TCTP蛋白TCTP全身敲减小鼠全身各组织TCTP表达降低实施例：肝原位瘤注射活体成像

将Hepa 1-6细胞系以含luciferase的lenti-virus包装并筛选扩增至对数增长期。1*105细胞悬浮于25ul无血清的DMEM，加入25ul的 matri-gel，混匀，置于冰上备用。选择不同基因型8周龄雄性小鼠，在无菌环境下，进行手术。将50ul悬浮肿瘤细胞注射入最接近体表的肝叶，缝合。手术后2周，对小鼠腹腔注射活体成像底物(VivoGloTM Luciferin,InVivo Grade，15ug/g体重)十分钟后，对小鼠进行麻醉，进行luciferae发光检测。结果见28

实施例肝脏体外成像检测肝肿瘤大小

如图29所示，肝脏特异性敲除TCTP后，原位接种的肿瘤增殖比野生型更快。

7、基因剔出动物的生命周期，见表28

表28

小鼠ID

克隆ID

父系ID

母系ID

DOB

性别

基因表型

1D37-4

1-C7

D37-3

C57BL/6

2015-01-13

♂

mut/+

2D37-2

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-04-10

♀

mut/+

2D37-4

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-04-10

♀

mut/+

2D37-6

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-04-10

♂

mut/+

2D37-7

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-04-10

♂

mut/+

2D37-10

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-04-10

♂

mut/+

2D37-13

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-05-15

♀

mut/+

2D37-14

1-C7

1D37-4

C57BL/6

2015-05-15

♂

mut/+

TCTP基因剔除动物的生命周期与野生型动物无显著差异，未见生命周期不同的报道。本发明中TCTP基因剔除小鼠的生命周期未见缩短现象，且一般状态正常。

以上实施例表明，本申请发明人已经成功建立了TCTP基因肝脏组织特异性敲减小鼠。

TCTP进的完全删除导致小鼠胚胎早期死亡，为进一步研究TCTP基因的体内功能，TCTP分子生物学领域需要TCTP基因条件性基因打靶小鼠。本申请中，在NEO基因插入来影响TCTP基因正常表达，一方面，可以TCTP实现基因的全身敲除，同时利用NEO基因两侧方向相同的LoxP序列，通过Cre重组酶的识别和删除LoxP序列提出NEO序列，在需要的时候，消除NEO基因的影响，从而实现了TCTP基因时空特异性条件打靶小鼠模型的建立。

序列表

<110> 窦科峰；李霄

<120> TCTP基因组织特异性敲减的动物模型、其制备方法及应用

<130> 20180828

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> designed

<400> 1

cactactcta ccagctgtgg cac 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> designed

<400> 2

caactgacct tgggcaagaa cat 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 3

gctcgactag agcttgcgga 20

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> designed

<400> 4

gttatggagc aaaggttact tagtgg 26

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> designed

<400> 5

cgatgaattc gtatacaaga tccgggagat cgc 33

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> designed

<400> 6

cgatagcgct agtactaagt tgctgtggcc tctctc 36

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> designed

<400> 7

cgatgcgatc gcggttccgc ttgatgagag tgac 34

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> designed

<400> 8

cgatgtcgac tagccatgtt ggcacacacc 30

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> designed

<400> 9

cgatacgcgt gatatcgcat atgtgttatt tttgagaact agg 43

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> designed

<400> 10

cgatccgcgg tatacttaca cacatgaccc tgag 34

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> designed

<400> 11

cgatccgcgg tatacttaca cacatgaccc tgag 34

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> designed

<400> 12

catggagaga ctgcttgaaa gatatctagc agttactcag tctcac 46

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> designed

<400> 13

gtgagactga gtaactgcta gatatctttc aagcagtctc tccatg 46

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> designed

<400> 14

cgatgcggcc gccttggtgt tcatagttat gccg 34

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> designed

<400> 15

gtcaccatga tcatctaccg g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 16

acgggttctt ctgttagtcc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> designed

<400> 17

atgctatacg aagttatacg cg 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> designed

<400> 18

acactgaaac atcctattgc atg 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 19

gctttccgat tgagcccagg 20

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> designed

<400> 20

tctctagagt cacagaactt atgg 24

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 21

gctttccgat tgagcccagg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 22

agctagcttg gctggacgta 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> designed

<400> 23

gctagaagac attacctatt ggagc 25

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> designed

<400> 24

ggtttctgct cttcaagttt gc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> designed

<400> 25

gctatctatg gggaaagaat at 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 26

gagcacttca tctgtcagca 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> designed

<400> 27

agctagggag caggttagaa g 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> designed

<400> 28

ctctggtgag ctcatctctg 20

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> designed

<400> 29

tcattgagac tgttatctgt agaccagact 30

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> designed

<400> 30

agcaaccata ccatctggat tcatgt 26

<210> 31

<211> 391

<212> DNA

<213> designed

<400> 31

cgatgaattc gtatacaaga tccgggagat cgcggacggg ctgtgcctgg aggtggaggg 60

caaggtgagc ggggcgccgc gcgcggggag gctggccgcc tgcctgccgg gtcggccgag 120

ccgggccggg ctgggctggg cgccgcgggg aggccgctgg aactcgtgca atcctcgctg 180

ccgcctccag gcggaggaga cgctcttgcg gaccttgggt ttttctagaa aagtggaggc 240

ggagccgagc ctggaaatag gtccgcgaac tcagcgccat cctctttccg ggcgaacggg 300

gacatattgt ctataagaca ggtttgcgct gtgcgcgctt aacccgtggc gactcgagag 360

aggccacagc aacttagtac tagcgctatc g 391

<210> 32

<211> 1120

<212> DNA

<213> designed

<400> 32

cgatgcgatc gcggttccgc ttgatgagag tgaccacctc tctcagtccg ggcagcgact 60

atttgggggg aggttaagat gtttcaggga gctgactgat cgttgccgga cctttttttt 120

tttttctctt tttttctttt tttttttttt tttttgcccc ttcgactaag ttgtattgtc 180

tttttgtttt gttttgtttt cttctaaatg tagatggtca gtagaacaga gggtgccatc 240

gatgactcgc tcatcggtgg aaatgcttcc gctgaaggtc cggagggcga aggtaccgaa 300

agcacagtag tcaccggtgt tgacattgtc atgaaccatc acttacaaga aaccagcttc 360

acaaaagagg cttacaaaaa gtacatcaaa gactacatga aatcgtaagt gacataaaca 420

ccccgttttg gtggtcagct tcctagaaga agttggttgc ttaggtagga agggcttaag 480

aaaggagggt cttttgttat acagtgaagg ttgattttca ataatgtgag caagccggta 540

gaaagttact ttaaaggtaa tataggaatt acattctttt aaatggtttc ttgtcaccta 600

gtaaactatc attttgctag aagacattac ctattggagc ttatattctt actttactga 660

aagattattc agtattttga tgacctgtta ctttactgtt ttagactcaa aggcaaactt 720

gaagagcaga aaccagaaag agtaaagcct tttatgactg gagctgcaga gcagattaag 780

cacatccttg ctaatttcaa taactaccag gtaaatggac caaagggttg tataataact 840

gtgggatccg aaaaagtctg tttgctgtct cgtacatggc tctggctgtc ctggaacacc 900

cttagaccca gttacctcag ccttctgaga tgaaagtctc agcccatttt gtgtagcacc 960

acaccaggca aggagctggt attaaaatga taggcattgc tttcttttca ttgagactgt 1020

tatctgtaga ccagactagc cttgaaccca gaggtctacc tgccagtgcc tcttaattgc 1080

tgggattaaa ggtgtgtgcc aacatggcta gtcgacatcg 1120

<210> 33

<211> 476

<212> DNA

<213> designed

<400> 33

cgatacgcgt gatatcgcat atgtgttatt tttgagaact aggggttttt cttgccaaat 60

tttggccagg ggttattctg gatctgcttt ttatagtttg attttatatt tgtgtgtata 120

agatagtcta attgtaggtt tttgttacgt gtttcttaag ttttttattg gtgaaaacat 180

gaatccagat ggtatggttg ctctcctgga ctaccgtgaa gatggtgtga ctccattcat 240

gattttcttt aaggatggct tagagatgga gaaatgtgta agtatcttta aattagtagt 300

gtcaagacag ggagtgcagc agtgattctt tgccatctgc aggtggcagg ccttgtagat 360

tgtgagatct ttatcctgtg ggagagtaga gccttgaaca tgaaaggggc ttgaagatga 420

gattagctgg cttgctagag tgctcagggt catgtgtgta agtataccgc ggatcg 476

<210> 34

<211> 467

<212> DNA

<213> designed

<400> 34

cgatctcgag tacgtaccac catgcccagt ttagagaaaa gtttttcagt caggtcttcc 60

tccctcagga aacactccct cagccggctg tagtggctat tcctggttgt caacttgaca 120

atatttggaa tgaactacaa tccggaattg gaaggctcac cagtgaccct tatctggagg 180

cttggagatc cttatctgga tcttggtttg aagatcttga gccatagtgg ctatggattc 240

cagaagattg aatctccgag ttaaggaaca cacctttaat ctgggctatg cctttcatct 300

gggattaaag gtgtggtgga acacaccttt aatctgggct acaccttctg ctggagacaa 360

tataaggaca ttggaagaag ggagtctagc tcttgctctt gctccttcgc ctgcttgctg 420

cgtgagactg agtaactgct agatatcttt caagcagtct ctccatg 467

<210> 35

<211> 462

<212> DNA

<213> designed

<400> 35

gtgagactga gtaactgcta gatatctttc aagcagtctc tccatgcgtc agcacttttg 60

tccttggtgt agtatcctct ctagatacct tttctgaacg gtttgagagg aggttgaaat 120

tatgatgcga ctttaccata aaatgtcagt atgtatagtt ttttttttaa tttttttttt 180

tatgtgtagg tgtgttttgc ctgcatttat gtatgtgcac catgtgtgtg cttggtgcca 240

gtggaggtca gaaagggcat ctggtcccct atgactggag tttcagacag ttgtgacctg 300

cattatgggt actatgagcc aaacccaggt cctcttccag agcagcaagt gctgctagcc 360

acagagtcat ctctctagcc ccatagtacg ttcttctgaa aaagcaaaag cagtttactt 420

tatagtcacg gcataactat gaacaccaag gcggccgcat cg 462

<210> 36

<211> 21780

<212> DNA

<213> designed

<400> 36

ggcgcgcctc gagtacgtac caccatgccc agtttagaga aaagtttttc agtcaggtct 60

tcctccctca ggaaacactc cctcagccgg ctgtagtggc tattcctggt tgtcaacttg 120

acaatatttg gaatgaacta caatccggaa ttggaaggct caccagtgac ccttatctgg 180

aggcttggag atccttatct ggatcttggt ttgaagatct tgagccatag tggctatgga 240

ttccagaaga ttgaatctcc gagttaagga acacaccttt aatctgggct atgcctttca 300

tctgggatta aaggtgtggt ggaacacacc tttaatctgg gctacacctt ctgctggaga 360

caatataagg acattggaag aagggagtct agctcttgct cttgctcctt cgcctgcttg 420

ctgcgtgaga ctgagtaact gctagatcct tggacttcca ttcacagctg cgactgaacc 480

attgttggga attgggctgc cgactgtaag tcatcaataa attcctttac tatttagaaa 540

ttatccataa gttctgtgac tctagagaac cctgactaat acagaaattg gtaccagcag 600

agtggggtat tcctgtgaca acctgaccat gttttgggga ggtctgtgga aggactttgg 660

aactttggtc ttgaagatcc atttgttgtt aagagctctg tgggatgttg tgtaggagct 720

tggaagataa tgttgagaac agtgcagaag atggaggcct ggcttgtgaa atttcagagg 780

gaaaattaaa gactcttttc agggccattg ctgttttgat tgtgaagatt ctgtagttct 840

ggttagctgg ggctgaagaa tcagctgtga ttaacaagat accagaacta ctaaagcaaa 900

aactttgcat tactgggact attgatgctg gttagctgga gctaagaaat tagcggtgat 960

taagaagaga ccagcatcat tgaggtgaca tcttctggga agtgttttct gaaagcacaa 1020

agaggctgtg ttccagagat agccaaggtt gcactcctgc tgcagcggga cttggtaata 1080

tgtaagggtc acccaggtgg tactggtttt gaaggcatgg acttacccgc ctttgagatg 1140

gatatctaca ggaacttggg cagtgtggac ttcccacgca ctgcggatgg tgacctggct 1200

ggcactgtgc accctcaact gcaggaccat gactttgagc cactgaggcc tggtgaaccc 1260

atcttcaagc ttttcagcgg agaagacgta ctgtatgagg gggactccat tgtgtaccct 1320

gtgttcatta atgaggcaag ccagtaaaga acatccctcc atggcctctg catcagctcc 1380

tgctccctga cctgcttgag ttccagtcct gacttccttt ggtgatgaac agcagcatgg 1440

aagtgtaagc cgaataaacc ctttcctccc caacttgctt cttggtcatg atgtttgtgc 1500

aggaatagaa accctgacta agacagccgg ctaacctgcc aaaagcaggc cattgagcaa 1560

cttcctgctc agggaaaatc agctgatctg ccagccccat ccacaagggc tggcttgagg 1620

ctttctctct tcagcacctg cactttgaaa gggtatcaag ttctttcttt tggttactat 1680

tttggtctct ctcaacctgg ctgcacatgg acattctctg aagatttaaa aaactcagat 1740

gcctggatcc cacccccaga atttctaact ctactgaact tgtgtgccgg cttgacatca 1800

ttttttcccc tcaagttccg actgccaggc aggtggacta cagatctatt gacctctaga 1860

ctgttcacca ctgtcaatgt gactttaaca gccctcaata ttaagttaga gctcagctca 1920

ccactagata agtcccgctg tccattagag taccggtcac tgatctgacc actacactac 1980

agtttcacct ggatcattat agttccaccg tgggccctta aactacagtc cagcccccct 2040

tgactactgg tgatgggcac gcttgcctgg aacttgctac tgccaggccg gaggccagtt 2100

tccccatact gtagcacaca ctgtttactt ttactatggt ccattgtctt ctgtgtcttt 2160

tttttttttc ctttgttttt tcaagacagg gtttttctgt gtagatcagg ttggtcttca 2220

actcagctct gcctgcttct acctccctag tgctgaaatt aaaggagtgc agtaccacca 2280

tgtccagctg gattcactgt attttttttt ttcattcaga gtttgagcca ggcagtgttg 2340

gcccaactca tttaatccca gcacttggga ggtagaggta ggtggatttc tgaattcaag 2400

gccagcctgg tctacaaagt gagttccagg acatccaggg ctacacagag aaatcctgtc 2460

tcgaacccca ccccccaaaa atgtgtattt gaacagagtc attaggcact ctcagaataa 2520

gggaataatc acagaaatgc tattctattt tttttattat ttatttaatt atttattttt 2580

gaaacaagct ctcacatagt ctagaacttg tgtggctgaa aagggcctca aactcctgct 2640

cctctggtct tcacctctgc atccctggga ttatgtgtgc tgcaatacag ctagtcctcc 2700

ccttcattca ttttcatagt tactcactag tcacttagtt ttctcaacct tgatttaaaa 2760

agcactgtgg tgtcagatgc tatgcatgtc tttgtcccag gactgagaaa gcagatgtgg 2820

ggggcggggg ggggggcggg agaatgagag aatatcacat tttctcaaag gaatagtcca 2880

ggttgcctgg ttctttatcc attttctgac ccaaggagtg ttccaaattc acctatgttc 2940

taatcacgag accacatcct gagtgatact ttctactcca gcctgtaagg cttttctcac 3000

tattaatggt attctgagat aagaatggtt ggctcacacc tgtaatccta gccctattga 3060

agctaaggca ggagaatttt gatttccagg cctgtctggc ctccgaaatc agttcaagac 3120

tggtttgggc tatgcaagca gaggaggtga gaggagaggt taactgaaca aaaggctttt 3180

ggacctgaca gtaataactt caggaatatt atgaaaaaaa atcgggaatt gcatacatat 3240

cccacatatt atttatcacc tgttaagtat gtcagcctct cactcatctt attaaattca 3300

cagaaattcc atttcatact aaagctcaaa gagggtgaac ttcctgagat cgtgggactg 3360

gtaacacaga caagatgcca gcactgctta gcttcaaatc ttcagctctc tttcaccatg 3420

gttttgtttt tttttttgtt tttttttttt gttttttttt gttttttaat tcttcaatga 3480

gccggacggt ggtggtgcac atctttaatc ccagcacttg ggaggcagag gcaggcggat 3540

ttctgagttc aaggccagtc tggtctataa agtgagttcc aggacagcca ggactataca 3600

gagaaaccct gtctcgaaaa aacaaaaaca aaaaaaaatt tttaatgatg ttaaaaaaat 3660

acatttgggc ataaaactgg agaaaataac agaaaaatcc aaaaagaata tgtttgggga 3720

tctatgtaaa tgagcatttt tgaataattt gaaaatgaat acctgggatg tgcaaataag 3780

attcacataa ctcagaaata actgagtttt gagactgcta agtcatagcc cctcggttct 3840

atgtctacgt tttctgatgt ccttcacttt tttactgtta ccccgtgtcc tttagagtat 3900

ctaggaaagc agcagaccac cgcatcttaa gtggacggtt tttcttctgc tctttggcta 3960

gagttttatt cctgaatggt ttactctgtg cttgtaacac tttgttagtg tgaactgcct 4020

tctcctttga catactaacc taaccttctg tccgagggca ggcagggctg gctatgtcct 4080

tcttaagcga gaaaattgca acactagggt tacaacggac tataaccaaa tctggaaggg 4140

aagaaactgt gatttcatcc tgccatacat gtttacctga acggtgggtc tcggaagttg 4200

tatgttgtac ttcgtggtgg atgcgaaagc ccttcaagtg acccgggcaa gtgggaagct 4260

ccttattttg ggtctgttta gtcctgcatc gccaggaata aaagggataa aagtgacaat 4320

acagaactgt cctaacaaag gacaccgttt gcgaccaaga gcagaacagg ccagcgaaga 4380

gctgtccggc cagacccacc gcaggctttc actttcggaa cccactagag gaccagtccc 4440

caggacatct ccctccgcga gcaaaaccgg tgcagtctgt gggcagccaa ggaccggagg 4500

tcggagaccc gggacaccag cccggcgcca tccccgtagt ccccgcaggc tcagcggcgc 4560

gcccgacaac agtcatccga ttctgctgac attttctttc cgagaaaggg gtgggaactg 4620

aagcggcgtg gcgggaggcg gggcgcagtc acaccctggc cacgcccggg cggcgactca 4680

agcgtccggc catcggtcgg ccgcaagtcc cttcccgtcc cagcatgccc cgggcgcact 4740

atccgcacac cgcccccgtt gccccgcgca cccaggggca ctccgcattg tgtcccagca 4800

gagtccccgg atgccctccc ggggccggcc gggcgtagcc acgcccccgc accgccctgc 4860

gttcacgtca ccgctgacga cagttccggg ggagccgcgg acggtgacgt agccgagcgt 4920

gccctctata tgaggttggg gagcgcccgc gtcggccttt tccgcccgct cccccctccc 4980

cccgcgcgcc gctccggctg caccgcgctc gcttccgcgc tgtcaggcta gcgccgccgt 5040

ccccagccgt caccatgatc atctaccggg acctcatcag ccgtaagtcc cggcgcccgc 5100

gggcctgggt gcgggtgggc accggggagg ccggggacac gagcgcagag cttgggccgg 5160

gagccgccgc gtgcgccgag cccggcgcgg gaaatggcgg gccttcgctc gctcacgggc 5220

ggctctctct gttcgctttc agatgacgag ctgttctccg acatctacaa gatccgggag 5280

atcgcggacg ggctgtgcct ggaggtggag ggcaaggtga gcggggcgcc gcgcgcgggg 5340

aggctggccg cctgcctgcc gggtcggccg agccgggccg ggctgggctg ggcgccgcgg 5400

ggaggccgct ggaactcgtg caatcctcgc tgccgcctcc aggcggagga gacgctcttg 5460

cggaccttgg gtttttctag aaaagtggag gcggagccga gcctggaaat aggtccgcga 5520

actcagcgcc atcctctttc cgggcgaacg gggacatatt gtctataaga caggtttgcg 5580

ctgtgcgcgc ttaacccgtg gcgactcgag agaggccaca gcaacttagt actagcgctg 5640

aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcgaaccct ttcccacacc accctccaca 5700

cttgccccaa acactgccaa ctatgtagga ggaaggggtt gggactaaca gaagaacccg 5760

ttgtggggaa gctgttggga gggtcacttt atgttcttgc ccaaggtcag ttgggtggcc 5820

tgcttctgat gaggtggtcc caaggtctgg ggtagaaggt gagagggaca ggccaccaag 5880

gtcagccccc ccccccctat cccataggag ccaggtccct ctcctggaca ggaagactga 5940

aggggagatg ccagagactc agtgaagcct ggggtaccct attggagtcc ttcaaggaaa 6000

caaacttggc ctcaccaggc ctcagccttg gctcctcctg ggaactctac tgcccttggg 6060

atccccttgt agttgtgggt tacataggaa gggggacggg attccccttg actggctagc 6120

ctactctttt cttcagtctt ctccatctcc tctcacctgt ctctcgaccc tttccctagg 6180

atagacttgg aaaaagataa ggggagaaaa caaatgcaaa cgaggccaga aagattttgg 6240

ctgggcattc cttccgctag cttttattgg gatcccctag tttgtgatag gccttttagc 6300

tacatctgcc aatccatctc attttcacac acacacacca ctttccttct ggtcagtggg 6360

cacatgccca gcctcaagtt tatatcacca cccccaatgc ccaacacttg tatggccttg 6420

ggcgggtcat cccccccccc ccacccccag tatctgcaac ctcaagcttg ggtgcgtggg 6480

ttgtggataa gtagctagac tccagcaacc agtaacctct gccctttctc ctccatgaca 6540

accaggtccc aggtcccgaa aaccaaagaa gaagaaccct aacaaagagg acaagcggcc 6600

tcgcacagcc ttcactgctg agcagctcca gaggctcaag gctgagtttc agaccaacag 6660

gtacctgaca gagcagcggc gccagagtct ggcacaggag ctcggtaccg cccctctccc 6720

tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc 6780

tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc 6840

cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt 6900

ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct 6960

gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa 7020

aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt 7080

tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag 7140

gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt 7200

acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt 7260

ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg gtgagcaagg gcgaggagct 7320

gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt 7380

cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat 7440

ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg 7500

cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc 7560

catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa 7620

gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg 7680

catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag 7740

ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat 7800

ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc 7860

catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct 7920

gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc 7980

cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaagc ggccgcgact ctagatcata 8040

atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc 8100

ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat 8160

aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 8220

cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt aataacttcg tataatgtat 8280

gctatacgaa gttataggtc tgaagaggag tttacgtcca gccaagctag cttggctgca 8340

ggtcgtcgaa attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg 8400

ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt 8460

ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt 8520

ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt 8580

gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat 8640

ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg 8700

ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg 8760

cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg 8820

ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac ctgcagcctg ttgacaatta 8880

atcatcggca tagtatatcg gcatagtata atacgacaag gtgaggaact aaaccatggg 8940

atcggccatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 9000

attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 9060

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 9120

actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 9180

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 9240

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 9300

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 9360

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 9420

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc 9480

cgacggcgat gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 9540

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 9600

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 9660

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 9720

tcttgacgag ttcttctgag gggatcaatt ctctagagct cgctgatcag cctcgactgt 9780

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 9840

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 9900

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 9960

agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac 10020

cagctggggc tcgactagag cttgcggaac ccttcgaagt tcctattctc tagaaagtat 10080

aggaacttca tcagtcaggt acataatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta 10140

tatcgatgcg atcgcggttc cgcttgatga gagtgaccac ctctctcagt ccgggcagcg 10200

actatttggg gggaggttaa gatgtttcag ggagctgact gatcgttgcc ggaccttttt 10260

ttttttttct ctttttttct tttttttttt ttttttttgc cccttcgact aagttgtatt 10320

gtctttttgt tttgttttgt tttcttctaa atgtagatgg tcagtagaac agagggtgcc 10380

atcgatgact cgctcatcgg tggaaatgct tccgctgaag gtccggaggg cgaaggtacc 10440

gaaagcacag tagtcaccgg tgttgacatt gtcatgaacc atcacttaca agaaaccagc 10500

ttcacaaaag aggcttacaa aaagtacatc aaagactaca tgaaatcgta agtgacataa 10560

acaccccgtt ttggtggtca gcttcctaga agaagttggt tgcttaggta ggaagggctt 10620

aagaaaggag ggtcttttgt tatacagtga aggttgattt tcaataatgt gagcaagccg 10680

gtagaaagtt actttaaagg taatatagga attacattct tttaaatggt ttcttgtcac 10740

ctagtaaact atcattttgc tagaagacat tacctattgg agcttatatt cttactttac 10800

tgaaagatta ttcagtattt tgatgacctg ttactttact gttttagact caaaggcaaa 10860

cttgaagagc agaaaccaga aagagtaaag ccttttatga ctggagctgc agagcagatt 10920

aagcacatcc ttgctaattt caataactac caggtaaatg gaccaaaggg ttgtataata 10980

actgtgggat ccgaaaaagt ctgtttgctg tctcgtacat ggctctggct gtcctggaac 11040

acccttagac ccagttacct cagccttctg agatgaaagt ctcagcccat tttgtgtagc 11100

accacaccag gcaaggagct ggtattaaaa tgataggcat tgctttcttt tcattgagac 11160

tgttatctgt agaccagact agccttgaac ccagaggtct acctgccagt gcctcttaat 11220

tgctgggatt aaaggtgtgt gccaacatgg ctagtcgaca taacttcgta taatgtatgc 11280

tatacgaagt tatacgcgtg atatcgcata tgtgttattt ttgagaacta ggggtttttc 11340

ttgccaaatt ttggccaggg gttattctgg atctgctttt tatagtttga ttttatattt 11400

gtgtgtataa gatagtctaa ttgtaggttt ttgttacgtg tttcttaagt tttttattgg 11460

tgaaaacatg aatccagatg gtatggttgc tctcctggac taccgtgaag atggtgtgac 11520

tccattcatg attttcttta aggatggctt agagatggag aaatgtgtaa gtatctttaa 11580

attagtagtg tcaagacagg gagtgcagca gtgattcttt gccatctgca ggtggcaggc 11640

cttgtagatt gtgagatctt tatcctgtgg gagagtagag ccttgaacat gaaaggggct 11700

tgaagatgag attagctggc ttgctagagt gctcagggtc atgtgtgtaa gtagtttgac 11760

actggcctgg gataaactca cgtagaatga gtgtggtctc tgccccacgg tagttcaagt 11820

ccatttcata ttacatgcaa taggatgttt cagtgtttac tgaggtcagt aagaaggaat 11880

acagaaatgt ctgttttata agggactggt ggagacagtg ttccttgtcc tagattttgg 11940

aggctttttt tgtaagcaca gtagaaggtg agtttagaga tgtactggag aaagtgggtg 12000

accgcctggg acagtggggt aggagtgtta ttcagacaac agctggtgtt tgtcagtaga 12060

gcactggagt gggcaggaag atgggtgagt gctgccaact cggtgagggt ctgcatccac 12120

tgatagacct cgaacagttt gtggttgttc ttctggtttg cactaggatg caaaaggaaa 12180

ctctccctgc gcttcctgcc tgcctttgtg gcagttcaga ttgaattagg gagtacatct 12240

acatgctagg acagttataa gctcaggctg gggcagttgt taatgccatc tctttgtttt 12300

gcagtaacaa attggatcta tcacctgtca ccataattgg ctgctgctta ccatccatac 12360

aacaccagga cttaggacaa atgggactga tgtcatcttg agcttttatt ttgaccgtga 12420

tttatttgga gtggtggcat tgttttttta aggaaaaaaa acatgtcatg tgggttgtct 12480

aaaaataaag tgcatttaaa tccacttaag aactctttgc tgtgattgtg ctgaccctgt 12540

agtctgagaa gctagagcct ggttgagcat cgctagaaag ctaagcctct tcagttaact 12600

gctgcagtgg ggactctaca agactggagt gtgtgaactc aagaatctca gttacagtga 12660

agggagaggt gagaagtgga ccctgacttt catcacctcc agtggaagag cttaccaaaa 12720

gcacaaaaag accaactagt tggagacaag tactgtctgc tcctggacta atgtcagatt 12780

cctggtaact agaatagagg ttgccaagcc tggcctgtgc cactttagag ttgtacaaac 12840

agggcacaga tccatcgggg agttcggtac ctggtggggt gggatacagt gaatacagcg 12900

tagttccttc ccgggagtgc cagcagccca tgcttactgg ggtaaggtta gatgacccag 12960

tcacctgcgg gaattgggtc ttggaaagcc tagaactgca tagtctgctg taggagtatt 13020

aacatgcttt gctgtctaag gtttgtccag tgatagaagc cttaaaaagg tactaaactt 13080

aagagggtac tagcacctct gcaatatgaa gcccaaataa ctggatacta ggtattgtga 13140

tgaaggggaa gtgttgctag gtctaggaag ccacttagct gtctttgaat tttaatgggt 13200

cttgaggtca ctggtcagaa agaaacttga gaaaagttct agtgctagcc ctagagaagt 13260

gaacacaaga cagcagaagc ttggtagggg aggaagacca gaactcaata gtatacacat 13320

ttcagattat gagtaagcat atatgtgttt gtgcacgtgg ctgcagatgc ccattgtcaa 13380

aggagagatt tcctggagat ggacataagt atagggtacc aaagggccct gctgagcctt 13440

ccttgactgg tttgggttgt ttgttgagag tttctctgta ttcctgtctt ggaacttgtt 13500

ttgtaatctc ttgagctcaa ggcctcccaa gtgctgggat taaagtgaac aacaaacagg 13560

ctgggaagat tggtttttga gacagctttt acatccaagg ttgaccttaa attgctgagg 13620

atactttgcc gtcaccaccc atgacaatag gcacgtgact cttgcttagt tgatttggtc 13680

ctgaagttga atctagggat tatggggtta gcggcacagc accaaacctt gagcttcgtt 13740

ctcaaacctt ggcttttttt tttttttgcc ttgatagacc ttgaactcct caaccttagt 13800

gctaggaccg gaggcttgcc ctaccatacc aggttcctaa cttttgaaga caacttttcc 13860

taattgtctc tgcagttttc tgcagtcctg ttgagtccta gtgtgtgcct tgtgttttat 13920

atatggcctt atttcagaag ggcaggaatt catgaattaa gttgtcttga gtgtgctatt 13980

ttattataac ttactttcta gttattaagc acccatgctt tctgcatagg tcaggagagt 14040

gcagcacttg atctttctga tgtttggtga aaacaggttt tgagtaactg tgttctgggc 14100

tttgttgtat gtgtggaaca atggggtgat gagaagaaag gttttggtgt ttgtgaaagc 14160

cttcgcagtg tgccacttga atgtaggtgt gaaggagcag ctatggggct atctgaaagc 14220

agaccgtgca agccgcaaga gtgaacatct tcatcaacgt gttgtgggta tccagacaga 14280

ggcttccagc tgtacctagg aactcttgaa cctgtcttag tctttggagt taggatctga 14340

aggatggcag caatcctact ctaagatgag ctaactttgc ctttgctcag ctggtagcca 14400

agataggcat ccttgctgtg ttggttgctt ttgtcagctt gtcagttgga cacaccctag 14460

tgttgccaca actgagaaaa tgccaccttg agattgatcg gtaaacaagg atataagaca 14520

ttttcttggg aagtgggagg catagctcat tgtgaggggt gtcacctgtg ggcaggtgtc 14580

ctggtgtgta ttagaaagca aactgagaag ccatggaaag caagcaagcc tgtgggcagc 14640

actcctccat ggcatctgct tcagttcctc caggttcctg tgttgagtca cagctctaac 14700

ctctctccat gtgtgatgtg gaggtggaag ctaaataagc cctttctccc caggttcttc 14760

atcgtggtgt ttcatcacat tgtgttgtta gtcaggcctc tctagattta ttctagagaa 14820

tgaatctgtc tcgtgtattt tatattttgc ttacataaca taattatgtt cattgatata 14880

attataaaat atataatgag acaaattata catcatatgc tataacacag ggtttcaaac 14940

aatggaaaca gcatttaatg atctttcaca tgctgggcca tgaggacctc tggaaaggat 15000

gtgggattgg gggcgggccg tgtcaatgtt tcagttaaaa aaaccatcga ctgtgcacct 15060

agaggattct tttcaagtag cttgctcagt gatggctcct cggctctctt ctccagcttg 15120

tgagacttct ctgtatttat gtgcacactg tgcttccctg ggtgtcacag cagagagcgc 15180

aacagacccc tctgcagaac tgtggccctg agatagtcag tggctcactg gagggcacag 15240

cccagagacc acataaagcc actattgtta gtcagcaatt aaaatgcagg gatttgggtt 15300

cgttttgtat gtgtgctgcg atgaacccag ggctccatgt caatcacctc tcagtgagca 15360

acgcccccag ccctgagtcc aatgttttta attataacat tgagtcctgg gtttctgtca 15420

gttctttctt gtctcttttt tgtttatttt tttctttttg ttttttcttc tttggggaca 15480

cagtttctct gtgtagcctg cctgtcctcg gaatcactct attgatcagg gtagcctcaa 15540

actcagagat ccacctgtct ccgcctcctg agtgctgggt taaaagtatg tgcttcccag 15600

cttgagtttc tgccttgggt tatcattgct gtgatgacca tggccaaaaa caagatggag 15660

aggaaaaggt ttatttattt ggtttatgct tacacatcca tcactgaagg atgtcagggc 15720

agcagcctgc tgatgcagag gccatggatg ggtgctgctt actggcttgc tccccatggc 15780

ttgctcagcc tgctttccga ttgagcccag gaccaccagc ccatttatgt caatattcac 15840

aagtacaaag ttattttttt ggactttgga attaatgatt tagggggaaa aaaatcacaa 15900

aaatagcaca aaacacaaat ctttcaagca gtctctccat gcgtcagcac ttttgtcctt 15960

ggtgtagtat cctctctaga taccttttct gaacggtttg agaggaggtt gaaattatga 16020

tgcgacttta ccataaaatg tcagtatgta tagttttttt tttaattttt ttttttatgt 16080

gtaggtgtgt tttgcctgca tttatgtatg tgcaccatgt gtgtgcttgg tgccagtgga 16140

ggtcagaaag ggcatctggt cccctatgac tggagtttca gacagttgtg acctgcatta 16200

tgggtactat gagccaaacc caggtcctct tccagagcag caagtgctgc tagccacaga 16260

gtcatctctc tagccccata gtacgttctt ctgaaaaagc aaaagcagtt tactttatag 16320

tcacggcata actatgaaca ccaaggcggc cgccaggtct gaagaggagt ttacgtccag 16380

ccaagctagc ttggctgcag gtcgtcgaaa ttctaccggg taggggaggc gcttttccca 16440

aggcagtctg gagcatgcgc tttagcagcc ccgctgggca cttggcgcta cacaagtggc 16500

ctctggcctc gcacacattc cacatccacc ggtaggcgcc aaccggctcc gttctttggt 16560

ggccccttcg cgccaccttc tactcctccc ctagtcagga agttcccccc cgccccgcag 16620

ctcgcgtcgt gcaggacgtg acaaatggaa gtagcacgtc tcactagtct cgtgcagatg 16680

gacagcaccg ctgagcaatg gaagcgggta ggcctttggg gcagcggcca atagcagctt 16740

tgctccttcg ctttctgggc tcagaggctg ggaaggggtg ggtccggggg cgggctcagg 16800

ggcgggctca ggggcggggc gggcgcccga aggtcctccg gaggcccggc attctgcacg 16860

cttcaaaagc gcacgtctgc cgcgctgttc tcctcttcct catctccggg cctttcgacc 16920

tgcagcctgt tgacaattaa tcatcggcat agtatatcgg catagtataa tacgacaagg 16980

tgaggaacta aaccatggga gtcaaagttc tgtttgccct gatctgcatc gctgtggccg 17040

aggccaagcc caccgagaac aacgaagact tcaacatcgt ggccgtggcc agcaacttcg 17100

cgaccacgga tctcgatgct gaccgcggga agttgcccgg caagaagctg ccgctggagg 17160

tgctcaaaga gatggaagcc aatgcccgga aagctggctg caccaggggc tgtctgatct 17220

gcctgtccca catcaagtgc acgcccaaga tgaagaagtt catcccagga cgctgccaca 17280

cctacgaagg cgacaaagag tccgcacagg gcggcatagg cgaggcgatc gtcgacattc 17340

ctgagattcc tgggttcaag gacttggagc ccatggagca gttcatcgca caggtcgatc 17400

tgtgtgtgga ctgcacaact ggctgcctca aagggcttgc caacgtgcag tgttctgacc 17460

tgctcaagaa gtggctgccg caacgctgtg cgacctttgc cagcaagatc cagggccagg 17520

tggacaagat caagggggcc ggtggtgact aagcggcacg tgctacgaga tttcgattcc 17580

accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg 17640

atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca 17700

gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 17760

tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata 17820

ccgtccaatt gtttctagag gccggccgtc gagcagtgtg gttttcaaga ggaagcaaaa 17880

agcctctcca cccaggcctg gaatgtttcc acccaatgtc gagcagtgtg gttttgcaag 17940

aggaagcaaa aagcctctcc acccaggcct ggaatgtttc cacccaatgt cgagcaaacc 18000

ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 18060

cccaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 18120

aggtcctcgc catggatcct gatgatgttg ttgattcttc taaatctttt gtgatggaaa 18180

acttttcttc gtaccacggg actaaacctg gttatgtaga ttccattcaa aaaggtatac 18240

aaaagccaaa atctggtaca caaggaaatt atgacgatga ttggaaaggg ttttatagta 18300

ccgacaataa atacgacgct gcgggatact ctgtagataa tgaaaacccg ctctctggaa 18360

aagctggagg cgtggtcaaa gtgacgtatc caggactgac gaaggttctc gcactaaaag 18420

tggataatgc cgaaactatt aagaaagagt taggtttaag tctcactgaa ccgttgatgg 18480

agcaagtcgg aacggaagag tttatcaaaa ggttcggtga tggtgcttcg cgtgtagtgc 18540

tcagccttcc cttcgctgag gggagttcta gcgttgaata tattaataac tgggaacagg 18600

cgaaagcgtt aagcgtagaa cttgagatta attttgaaac ccgtggaaaa cgtggccaag 18660

atgcgatgta tgagtatatg gctcaagcct gtgcaggaaa tcgtgtcgcg atgtatgagt 18720

atatggctca agcctgtgca ggaaatcgtg tcaggcgatc tctttgtgaa ggaaccttac 18780

ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat 18840

ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg tgtattttag 18900

attccaacct atggaactga tgaatgggag cagtggtgga atgcagatcc cgcggtggag 18960

ctccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg 19020

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 19080

cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 19140

cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 19200

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 19260

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 19320

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 19380

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 19440

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 19500

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 19560

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc 19620

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 19680

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 19740

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 19800

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 19860

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 19920

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 19980

tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 20040

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 20100

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 20160

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 20220

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 20280

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 20340

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 20400

cgctcggcgc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 20460

gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 20520

ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 20580

tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 20640

tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 20700

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 20760

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 20820

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 20880

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 20940

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 21000

gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 21060

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 21120

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 21180

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 21240

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 21300

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 21360

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 21420

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 21480

agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 21540

ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 21600

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 21660

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 21720

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 21780

Claims

1.一种基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型，其特征是，所述TCTP基因组织特异性基因敲减的非人哺乳动物模型由TCTP基因全身敲减的非人哺乳动物模型与B6；SJL-Tg(ACTFLPe)9205Dym/J工具鼠杂交获得。

2.根据权利要求1所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型，其特征是，所述TCTP基因全身敲减的非人哺乳动物模型的构建试剂盒包括TCTP基因全身敲减打靶载体构成片段的克隆引物，所述打靶载体构成片段克隆引物包括：

LRJ-072-A-F(Seq ID.No.5)：cgatGAATTCGTATACAAGATCCGGGAGATCGC，

LRJ-072-A-R(Seq ID.No.6)：cgatAGCGCTAGTACTAAGTTGCTGTGGCCTCTCTC，

LRJ-072-B1-F(Seq ID.No.7)：cgatGCGATCGCGGTTCCGCTTGATGAGAGTGAC，

LRJ-072-B1-R(Seq ID.No.:8)：cgatGTCGACTAGCCATGTTGGCACACACC，

LRJ-072-B2-F(Seq ID.No.:9)：cgatACGCGTGATATCGCATATGTGTTATTTTTGAGAACTAGG，

LRJ-072-B2-R(Seq ID.No.:10)：cgatCCGCGGTATACTTACACACATGACCCTGAG；

LRJ-072-C-F(Seq ID.No.:11)：cgatCTCGAGTACGTACCACCATGCCCAGTTTAGA，

LRJ-072-C-R(in)(Seq ID.No.:12)：CATGGAGAGACTGCTTGAAAGATATCTAGCAGTTACTCAGTCTCAC

LRJ-072-C-F(in)(Seq ID.No.:13):GTGAGACTGAGTAACTGCTAGATATCTTTCAAGCAGTCTCTCCATG

LRJ-072-C-R(Seq ID.No.:14):cgatGCGGCCGCCTTGGTGTTCATAGTTATGCCG。

3.如权利要求2所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型，其特征在于，所述TCTP基因全身敲减的小鼠模型构建试剂盒中还包括TCTP基因全身敲减打靶载体构成片段的验证引物、检测探针制备引物、测序引物、打靶载体的PCR筛选引物、基因分型引物，

所述验证引物包括

LRJ-072-Atest-F(Seq ID.No.:15):GTCACCATGATCATCTACCGG，

LRJ-072-Atest-R(Seq ID.No.:16):acgggttcttctgttagtcc，

LRJ-072-Btest-F(Seq ID.No.:17):atgctatacgaagttatacgcg，

LRJ-072-Btest-R:(Seq ID.No.:18):acactgaaacatcctattgcatg，

LRJ-072-C1test-F(Seq ID.No.:19:gctttccgattgagcccagg,

LRJ-072-C1test-R(Seq ID.No.:20):tctctagagtcacagaacttatgg，

LRJ-072-C2test-F(Seq ID.No.:21):gctttccgattgagcccagg，

LRJ-072-C2test-R(Seq ID.No.:22)：agctagcttggctggacgta，

所述测序引物包括：

LRJ-072-B1-616F(Seq ID.No.:23)：gctagaagacattacctattggagc和

LRJ-072-B1-713R(Seq ID.No.:24)：ggtttctgctcttcaagtttgc；

所述探针制备引物包括

LRJ-072-5'Probe-F(Seq ID.No.25)gctatctatggggaaagaatat)和

LRJ-072-5'Probe-R((Seq ID.No.26)gagcacttcatctgtcagca)，

LRJ-072-3'Probe-F(Seq ID.No.27)agctagggagcaggttagaag)和

LRJ-072-3'Probe-R(Seq ID.No.28)ctctggtgagctcatctctg)；

所述基因分型引物对包括：

LRJ-072-B1Loxp-F(Seq ID.No.29)：tcattgagactgttatctgtagaccagact，

LRJ-072-B1Loxp-R(Seq ID.No.30)：agcaaccataccatctggattcatgt；

所述PCR筛选引物组包括5’端筛选引物对和对3’端筛选引物对，

所述5’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F1(Seq ID.No.:1)：cactactctaccagctgtggcac和

LRJ-072-PCR-R1(Seq ID.No.:2)：caactgaccttgggcaagaacat，

所述3’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F2(Seq ID.No.:3)：GCTCGACTAGAGCTTGCGGA，

LRJ-072-PCR-R2(Seq ID.No.:4)：gttatggagcaaaggttacttagtgg。

4.一种用于构建权利要求1所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型打靶载体，其特征在于，

所述打靶载体用于构建作为亲本之一的TCTP基因的全身敲减小鼠模型，其中所述的TCTP基因全身敲减亲本中，所述TCTP基因敲减是基于外显子2被同源重组引起的移码突变产生外显子3和外显子4产物为截短蛋白；

所述TCTP基因全身条件性基因敲减的小鼠的打靶载体从5‘到3’顺序包含

顺次连接的B1片段、B2片段、B3片段和C1和C2片段融和成的C片段连接而成的B2-B1-A-C1-C2序列连接物；所述B2片段序列如SEQ ID NO:33所示，所述B1片段序列如SEQ ID NO:32所示，所述A片段序列如SEQ ID NO:31所示，所述C1片段序列如SEQ ID NO:34所示，所述C2片段如SEQ ID NO:35所示，所述TCTP基因全身敲除打靶载体pDTA-LRJ-072序列如SEQ IDNO:36所示，

所述B1片段包含正筛选元件，其中，所述正筛选元件包括顺次连接的5’重组酶识别序列1-报告基因盒-正筛选标记基因盒-3’重组酶识别序列1。

5.根据权利要求4所述的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型打靶载体，其特征在于，

所述B1片段包含从5‘到3’连接的5‘重组酶识别序列1，正筛选元件、‘重组酶识别序列2、抗性筛选基因盒、3重组酶识别序列1、5-‘重组酶识别序列2、T小鼠TCTP基因外显子3-4，所述B1片段的5‘和3’分别是ScaI和EcoV酶切位点；

所述B2片段包含从5‘到3’连接的3-‘重组酶识别序列2(3’-lox P)小鼠TCTP基因外显子5-6、3‘同源臂；所述B12片段的5‘和3’分别是ScaI和EcoV酶切位点；

所述A片段包含从5‘到3’连接的，5’同源臂、小鼠TCTP基因外显子1-2，所述A片段的5‘和3’分别是EcoI和ScaI和酶切位点；

所述C1片段的5‘和3’分别是SnaBI和EcoV酶切位点，所述C2片段的5‘和3’分别是EcoV和EcoI酶切位点，所述C1和C2融合片段包含负筛选标记基因；

所述正筛选元件的5‘与所述小鼠TCTP基因的外显子2的下游内含子连接；所述正筛选元件的3端与所述5‘重组酶序列2连接，在所述小鼠TCTP基因的3’同源臂的外侧连接有负筛选标记基因。

6.根据权利要求4所述的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型打靶载体，其特征在于，所述报告基因盒带有一个组成型剪切受体，可以介导所述报告基因mRNA的强制剪切，使所述报告基因能够在打靶基因启动子的驱动下表达从而示踪所述TCTP基因的表达；所述报告基因盒中包含多聚腺苷酸(Poly A)可提前终止此打靶基因的转录，从而敲除TCTP基因；

所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒二联体的5‘和3’分别为5‘重组酶识别序列1和3‘重组酶识别序列1，所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒中间为重组酶识别序列2，所述重组酶识别序列1可以被重组酶识别，从而实现所述报告基因盒和所述抗生素抗性基因盒的删除。

7.权利要求4-6任一项所述的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型打靶载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：

(2)将酶切鉴定、测序正确的B1或B2片段和A片段依次连接到正向筛选初始载体1得到中间载体；同时，通过Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合为C片段后连接到负筛选基因初始载体2获得负筛选基因初始载体2-TCTP-C；

(3)将连接正确的中间载体1-TCTP-B1-B2-A，用限制性内切酶切出并回收回收目的片段A-NeoR-B，转化含pBCTG的BAC菌进行重组得到TCTP-NeoR BAC；菌落PCR检测TCTP-NeoRBAC，鉴定扩增条带正确；

(4)负筛选基因初始载体2-TCTP-C的线性化处理，即酶切处理负筛选基因初始载体2-TCTP-C，回收目的条带负筛选基因-TCTP-C，电转已经重组NeoR的的BAC菌；负筛选基因-TCTP-C拯救TCTP-NeoR BAC，得到含TCTP的B,A和C片段的打靶载体转化的重组菌；对拯救后获得的打靶载体-TCTP-BAC转化的重组菌落进行PCR检测鉴定，将正确重组克隆进行扩增，经纯化后酶切验证。

8.基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型、其胚胎、子代、组织或细胞、精子、卵细胞、受精卵。

9.权利要求8所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型、其胚胎、子代、组织或细胞、精子、卵细胞、受精卵的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：构建TCTP基因全身敲减哺乳动物模型；

步骤二：基因全身敲减小鼠与FLP工具鼠杂交，去除转基因小鼠插入的reporter而保留loxp位点；

步骤三：对后代进行检测，筛选双阳性小鼠；

步骤五：表型稳定型子代小鼠自交；

步骤六：对获得的后代再次筛选具有LoxP的杂合子和纯合子；

步骤七：纯合子或杂合子与组织特异性表达的Cre或条件诱导的Cre工具鼠杂交，后代可得到组织特异性敲除TCTP和条件特异性敲除TCTP的转基因小鼠；

其中所述步骤一包括

(1)将权利要求4-6任一项所述的TCTP基因全身敲减小鼠模型打靶载体转入小鼠胚胎干细胞；

(2)胚胎干细胞筛选及鉴定；

(3)制备嵌合小鼠；将重组胚胎细胞显微注射入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；

(4)基因型鉴定和TCTP基因敲减阳性嵌合体动物的筛选：对得到的嵌合体动物进行基因型验证和蛋白表达水平验证，筛选阳性的TCTP基因敲减的的嵌合体动物；

(5)获得剔除报告基因和正筛选标记的嵌合小鼠F1代杂合子小鼠；

(6)繁育TCTP基因全身基因敲减的F1代杂合子小鼠模型。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(1)是采用BAC载体构建所述TCTP基因全身敲减打靶载体pDTA-LRJ-072，将构建好的所述TCTP基因全身敲减打靶载体pDTA-LRJ-072用PCR及酶切鉴定，PCR鉴定的引物为，所述步骤(2)是将打靶载体TCTP-final vector采用电穿孔法转到胚胎干细胞中进行打靶，使其发生同源重组，通过PCR及Southern blot筛选出中靶克隆；其中所述5’端筛选的PCR反应引物对为：

LRJ-072-PCR-F1(Seq ID.No.:1)：cactactctaccagctgtggcac和

LRJ-072-PCR-R1(Seq ID.No.:2)：caactgaccttgggcaagaacat

所述3’端筛选引物对包括

LRJ-072-PCR-F2(Seq ID.No.:3)：GCTCGACTAGAGCTTGCGGA

LRJ-072-PCR-R2(Seq ID.No.:4)：gttatggagcaaaggttacttagtgg；

在所述步骤(3)注射用囊胚取自C57BL/6N近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受体子宫，假孕受体为C57BL/6N与CBA的杂交一代，生育出嵌合率大于50％的TCTP基因全身敲减嵌合鼠；

所述步骤(4)是将获得的嵌合率高的嵌合雄鼠先后与Flper小鼠及野生型C57BL/6N小鼠交配，获得完全删去报告基因和Neo抗性基因的嵌合体小鼠；

所述步骤(5)是再将完全删去报告基因和Neo抗性基因的嵌合体小鼠与全身性敲减cre品系交配获得全身性敲减TCTP的嵌合体小鼠，所述全身性敲减TCTP的嵌合体小鼠与野生型C57BL/6N背景雌鼠回交，得到全身性敲减TCTP基因的F1代杂合子；经提取尾基因组DNA进行PCR反应鉴定基因型，根据电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子。

11.权利要求1-3任一项所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型、权利要求4-6任一项所述的打靶载体、权利要求7所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型打靶载体的构建方法，权利要求8所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞、权利要求9或10所述TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型、子代、胚胎或细胞的制备方法在免疫学研究、免疫毒理学、免疫排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用，所述的安全性评价包括生物源性材料在临床试验前的安全性评价。

12.权利要求1-3任一项所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠模型试剂盒、权利要求4-6任一项所述的打靶载体、权利要求7所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减小鼠模型打靶载体的构建方法，权利要求8所述的基于重组酶识别系统的TCTP基因组织特异性敲减的小鼠精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞、权利要求9或10所述TCTP条件性基因组织特异性敲减的小鼠模型、子代、胚胎或细胞的制备方法在药效学评价方面的用途、在制作肿瘤病理模型的用途、在治疗疾病的药物制备中的用途。