CN112921054B - 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗β‑地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括HBB表达框；所述HBB表达框包括串联的DNase I高敏位点、启动子、HBB编码基因和增强子；所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；所述HBB编码基因包括T87Q突变。本发明通过精简顺式调控元件的长度、使用突变型HBG启动子、优化启动子长度、对潜在的转录终止信号进行沉默突变等多种手段，开发出了新型慢病毒载体，所述慢病毒载体能够实现β‑珠蛋白过表达，其中HBB表达模块总长度约5kb，与BB305载体相比，载体滴度提高了2～4倍，红系分化后β‑珠蛋白表达水平提高了2倍左右。

Description

一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

β-地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一，患者体内的β-珠蛋白(β-globin，HBB)编码基因发生突变，造成β-珠蛋白肽链合成不足。血红蛋白作为红细胞运输氧气的载体，是由两条α-珠蛋白链和两条β-珠蛋白链组成的四聚体。HBB基因突变使得血红蛋白的α、β两种亚基比例失衡，无法形成功能性血红蛋白，同时引发溶血性贫血，最终使机体氧气供应严重不足，造成多种器官损伤，重者可危及生命。

当前，临床上广泛实施的β-地中海贫血的治疗手段包括规范化输血、药物治疗、异体造血干细胞移植等。其中，规范化输血仅能缓解症状，不能根治疾病，病人还需长期依赖于祛铁治疗以降低铁过载损伤；此外，长期输血还存在感染病毒的可能性，同时治疗成本高昂。异体造血干细胞移植虽然可以达到根治地中海贫血的目的，但是80％以上的病人难以找到组织相容性抗原匹配的供者，若采用非全相合的造血干细胞进行移植，患者可能产生严重的移植物抗宿主反应，在治疗后需要长期使用免疫抑制剂，生存质量低下。目前普遍认为基因治疗是根治β-地中海贫血的重要替代方法。

针对β-地中海贫血的基因治疗有两种主流方法：1)基于珠蛋白的时空顺序性开关转换过程，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除或敲低该过程中参与调控的BCL11A等基因，从而重新激活HBG1/2(胎儿γ-珠蛋白)；2)通过慢病毒载体整合补偿策略过表达HBB(成人β-珠蛋白)。

其中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术再激活HBG表达的地中海贫血基因治疗应用研究已取得显著进展，但是该方案可能存在一些潜在的问题，基因编辑治疗方法虽然值得期待，但是其安全性和疗效需要进一步验证，目前尚不能取代传统的慢病毒载体基因治疗方法。

用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体根据β-珠蛋白基因簇的调控元件特征，将基因座控制区(locus control region，LCR)的相关核心序列(HS2-3-4，相当于超级增强子)与HBB基因表达框串联，组装成精简的HBB表达模块，反向装载到慢病毒载体上。慢病毒转导造血干细胞后，其装载的表达模块将整合到造血干细胞基因组中，在造血干细胞向红系分化过程中，红系特异性转录因子将识别并结合逐渐开放的HS4-3-2增强子和HBB启动子区域，激活外源性HBB基因的表达。

利用慢病毒载体进行地中海贫血的基因治疗已经有近二十年的研究历程，目前国际同行已经开发出多种慢病毒载体，如BB305、GLOBE、HPV56等，其中，蓝鸟公司基于BB305载体的药物Zynteglo已经获欧盟批准上市，报价177万美元，成为目前全球第二昂贵的药物。虽然慢病毒载体的HBB整合补偿策略已经在临床试验中取得显著成效，但是当前的商业化慢病毒载体存在诸如LCR元件较大导致慢病毒包装滴度低、载体生产成本高等问题，仍然有很大的改进空间。

目前使用的慢病毒载体基本上是10年前设计的，过去10年来由于基因组学、二代测序技术的进步和慢病毒生物学的不断发展，对慢病毒载体进行新的技术创新的条件已经成熟，有利于开发出效果更好、成本更低的慢病毒载体治疗药物。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用，通过对现有的HBB慢病毒载体进行改进，重新设计LCR元件、启动子形式和内含子组成，制备的新型HBB慢病毒载体结构精简，慢病毒包装滴度提高了2～4倍，红系分化后β-珠蛋白表达水平提高了2倍左右，不仅降低了生产成本，而且提高了治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括HBB表达框；

所述HBB表达框包括串联的DNase I高敏位点、启动子、HBB编码基因和增强子；

所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；

所述HBB编码基因在2号外显子上包括T87Q突变。

本发明中，利用UCSC Genome Browser、Encode、ReMap2020、JASPAR、MotifLab等公共数据库和软件，对基因座控制区(LCR)的核心序列DNA酶I核心高敏位点HS2、HS3、HS4、HS5进行了系统分析，精确界定了HS2、HS3和HS4的调控区域，并对最核心的调控区域进行了优化，构建了LCR截短型HBB慢病毒载体，其中HS4的长度为722bp、HS3的长度为705bp、HS2的长度为467bp，总长度为1.9kb，相比临床中的BB305载体共缩减了700bp。

同时，本发明在HBB编码基因2号外显子上中引入一个T87Q氨基酸突变，即将β-珠蛋白的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺，突变后的β-珠蛋白仍发挥正常功能，该突变的存在既可以抑制镰刀型血红蛋白(HbS)聚合来治疗镰刀型细胞贫血症，又可作为一种特殊标记：1)有利于通过高效液相色谱HPLC与其他亚型珠蛋白区分开；2)通过巧妙设计能结合到突变位点的引物，可利用RT-qPCR检测外源β-珠蛋白的RNA表达水平。

优选地，所述HS4包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

SEQ ID NO:1：

acaaagacaagcacgtggacctgggaggagggttattgtccatgactggtgtgtggagacaaatgcaggtttataatagatgggatggcatctagcgcaatgactttgccatcacttttagagagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttcttttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatacaa。

优选地，所述HS3包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；

SEQ ID NO:2：

agaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctataaagtaagagtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgcacactctctggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatg。

优选地，所述HS2包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；

SEQ ID NO:3：

caggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctccctctatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcctgttacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctggccaggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttctaagcaaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggcttagggtgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcaggatgcttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacctcaaacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatat。

优选地，所述启动子包括HBB启动子、野生型HBG2启动子或突变型HBG2启动子中的任意一种。

优选地，所述HBB启动子包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:4：

taatgcacagagcacattgatttgtatttattctatttttagacataatttattagcatgcatgagcaaattaagaaaaacaacaacaaatgaatgcatatatatgtatatgtatgtgtgtatatatacacacatatatatatatattttttcttttcttaccagaaggttttaatccaaataaggagaagatatgcttagaaccgaggtagagttttcatccattctgtcctgtaagtattttgcatattctggagacgcaggaagagatccatctacatatcccaaagctgaattatggtagacaaaactcttccacttttagtgcatcaacttcttatttgtgtaataagaaaattgggaaaacgatcttcaatatgcttaccaagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacac。

优选地，所述野生型HBG2启动子包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

SEQ ID NO:5：

ttcagtcttatattatattacataacattaatctattcctgcactgaaactgttgctttataggatttttcactacactaatgagaacttaagagataatggcctaaaaccacagagagtatattcaaagataagtatagcacttcttatttggaaaccaatgcttactaaatgagactaagacgtgtcccatcaaaaatcctggacctatgcctaaaacacatttcacaatccctgaacttttcaaaaattggtacatgctttaactttaaactacaggcctcactggagctacagacaagaaggtgaaaaacggctgacaaaagaagtcctggtatcttctatggtgggagaagaaaactagctaaagggaagaataaattagagaaaaattggaatgactgaatcggaacaaggcaaaggctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggccccttccccacactatctcaatgcaaatatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgccttgaccaatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggccaggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccacacactcgcttctggaacgtctgaggttatcaataagctcctagtccagacgcc。

在珠蛋白开关转换过程中，γ-珠蛋白的表达先于β-珠蛋白的表达，本发明提出假说HBG启动子的本底转录活性可能高于HBB启动子的本底转录活性。但理论上，在成人红系细胞中HBG启动子受BCL11A等转录因子的阻遏作用，不具有转录活性，因此为去除该阻遏过程，本发明采用突变型HBG2启动子，所述突变型HBG2启动子为将野生型HBG2启动子的BCL11A识别位点和KLF1识别位点进行突变获得的启动子，所述突变包括-202C>G、-198T>C、-195C>G、-175T>C、-117G>A、-114C>T及-113A>G七个位点联合突变，突变后的HBG2启动子长度约700bp，实现了对BCL11A识别位点的沉默和对KLF1识别位点的活化，从而在成人红系造血中再活化γ-启动子，这为HBB慢病毒载体的优化提供了一个绝佳的启动子模块。

优选地，所述突变型HBG2启动子HBG2(mt7)包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；

SEQ ID NO:6：

ttcagtcttatattatattacataacattaatctattcctgcactgaaactgttgctttataggatttttcactacactaatgagaacttaagagataatggcctaaaaccacagagagtatattcaaagataagtatagcacttcttatttggaaaccaatgcttactaaatgagactaagacgtgtcccatcaaaaatcctggacctatgcctaaaacacatttcacaatccctgaacttttcaaaaattggtacatgctttaactttaaactacaggcctcactggagctacagacaagaaggtgaaaaacggctgacaaaagaagtcctggtatcttctatggtgggagaagaaaactagctaaagggaagaataaattagagaaaaattggaatgactgaatcggaacaaggcaaaggctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggcgcctcccgcacactatctcaatgcaaacatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgccttaactgatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggccaggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccacacactcgcttctggaacgtctgaggttatcaataagctcctagtccagacgcc。

优选地，所述HBB编码基因包括串联的HBB 1号外显子、1号内含子、HBB 2号外显子、2号内含子和HBB 3号外显子。

优选地，所述1号内含子包括HBB 1号内含子或HBG2 1号内含子。

优选地，所述2号内含子包括HBB 2号内含子或HBG2 2号内含子。

优选地，所述HBB 1号外显子包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列；

SEQ ID NO:7：

atggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcag。

优选地，所述HBB 2号外显子包括SEQ ID NO:8所示的核酸序列；

SEQ ID NO:8：

gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaa gaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagg。

优选地，所述HBB 3号外显子包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列；

SEQ ID NO:9：

ctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggcta atgccctggcccacaagtatcac。

优选地，所述HBB 1号内含子包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列；

SEQ ID NO:10：

gttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgc ctattggtctattttcccacccttag。

优选地，所述HBB 2号内含子包括SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

SEQ ID NO:11：

gtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacagtttagaatgggaaacagacgaatgattgcatcagtgtggaagtctcaggatcgttttagtttctttctttgctgttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctttctttttttttcttctccgcaatttttactattatacttaatgccttaacattgtgtataacaaaaggaaatatctctgagatacattaagtaacttaaaaaaaaactttacacagtctgcctagtacattactatttggaatatatgtgtgcttatttgcatattcataatctccctacttcttttctttctttttaattgatacataatcattatacatatttatgggttaaagtgtaatgttttaatatgtgtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgctttcttttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag。

优选地，所述HBG2 1号内含子包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列；

SEQ ID NO:12：

gtaggctctggtgaccaggacaagggagggaaggaaggaccctgtgcctggcaaaagtccaggtcgcttctcaggatttgtggcaccttctgactgtcaaa ctgttcttgtcaatctcacag。

优选地，所述HBG2 2号内含子包括SEQ ID NO:13所示的核酸序列；

SEQ ID NO:13：

gtgagtccaggagatgtttcagcactgttgcctttagtctcgaggcaacttagacaactgagtattgatctgagcacagcagggtgtgagctgtttgaagatactggggttgggagtgaagaaactgcagaggactaactgggctgagacccagtggcaatgttttagggcctaaggagtgcctctgaaaatctagatggacaactttgactttgagaaaagagaggtggaaatgaggaaaatgacttttcttcttagatttcggtagaaagaactttcacctttcccctatttttgttattcgttttaaaacatctatctggaggcaggacaagtatggtcattaaaaagatgcaggcagaaggcatatattggctcagtcaaagtggggaactttggtggccaaacatacattgctaaggctattcctatatcagctggacacatataaaatgctgctaatgcttcattacaaacttatatcctttaattccagatgggggcaaagtatgtccaggggtgaggaacaattgaaacatttgggctggagtagattttgaaagtcagctctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgtgtgtttgtgtgtgtgtgagagcgtgtgtttcttttaacgttttcagcctacagcatacagggttcatggtggcaagaagataacaagatttaaattatggccagtgactagtgctgcaagaagaacaactacctgcatttaatgggaaagcaaaatctcaggctttgagggaagttaacataggcttgattctgggtggaagcttggtgtgtagttatctggaggccaggctggagctctcagctcactatgggttcatcttcttgtctcctttcatctcaacag。

优选地，所述增强子包括SEQ ID NO:14所示的核酸序列；

SEQ ID NO:14：

gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttaatttcattgcaatgatgtatttaaattatttctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatttaaaacataaagaaatgaagagctagttcaaaccttgggaaaatacactatatcttaaactccatgaaagaaggtgaggctgcaaacagctaatgcacattggcaacagcccctgatgcatatgccttattcatccctcagaaaaggattcaagtagaggcttgatttggaggttaaagttttgctatgctgtattttacattacttattgttttagctgtcctcatgaatgtcttttcactacccatttgcttatcctgcatctctcagccttgactccactcagttctcttgcttagagataccacctttcccctgaagtgttccttccatgttttacggcgagatggtttctcctcgcctggccactcagccttagttgtctctgttgtcttatagaggtctacttgaagaaggaaaaacaggggtcatggtttgactgtcctgtgagcccttcttccctgcctcccccactcacagtgacccggaatctgcagtgctagtctcccggaactatcactctttcacagtctgctttggaaggactgggcttagtatgaaaagttaggactgagaagaatttgaaaggcggctttttgtagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcataggcccaccccaaatggaagtcccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaagagatcagaggtctgctggctcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgcagttattagcatagtgttaccatcaaccaccttaacttcatttttctt。

优选地，所述慢病毒载体包括SEQ ID NO:15所示的核酸序列；

SEQ ID NO:15：

ggaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcgcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacgtctcgacgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttctggaatagctcagaggccgaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatagctagagccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttcctctcactctctgatattcatttctttgcaagttataaatactgaataataagatgacatgaactactactgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactacttgaagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagcagtgggttccctagttagccagagagctcccaggctcagatctggtctaaccagagagacccagtacaagcaaaaagcagatcttgtcttcgttgggagtgaattagcccttccagtccccccttttcttttaaaaagtggctaagatctacagctgccttgtaagtcattggtcttaaaggtaccacaaagacaagcacgtggacctgggaggagggttattgtccatgactggtgtgtggagacaaatgcaggtttataatagatgggatggcatctagcgcaatgactttgccatcacttttagagagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttcttttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatacaaactagtagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctataaagtaagagtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgcacactctctggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatggaattccaggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctccctctatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcctgttacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctggccaggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttctaagcaaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggcttagggtgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcaggatgcttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacctcaaacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatattctagattcagtcttatattatattacataacattaatctattcctgcactgaaactgttgctttataggatttttcactacactaatgagaacttaagagataatggcctaaaaccacagagagtatattcaaagataagtatagcacttcttatttggaaaccaatgcttactaaatgagactaagacgtgtcccatcaaaaatcctggacctatgcctaaaacacatttcacaatccctgaacttttcaaaaattggtacatgctttaactttaaactacaggcctcactggagctacagacaagaaggtgaaaaacggctgacaaaagaagtcctggtatcttctatggtgggagaagaaaactagctaaagggaagaataaattagagaaaaattggaatgactgaatcggaacaaggcaaaggctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggcgcctcccgcacactatctcaatgcaaacatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgccttaactgatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggccaggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccacacactcgcttctggaacgtctgaggttatcaataagctcctagtccagacgccgcgatcgccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacagtttagaatgggaaacagacgaatgattgcatcagtgtggaagtctcaggatcgttttagtttctttctttgctgttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctttctttttttttcttctccgcaatttttactattatacttaatgccttaacattgtgtataacaaaaggaaatatctctgagatacattaagtaacttaaaaaaaaactttacacagtctgcctagtacattactatttggaatatatgtgtgcttatttgcatattcataatctccctacttcttttctttctttttaattgatacataatcattatacatatttatgggttaaagtgtaatgttttaatatgtgtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatga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优选地，所述慢病毒载体在启动子的下游还可以包括荧光蛋白编码基因，优选为绿色荧光蛋白编码基因作为报告基因，以HBB启动子驱动绿色荧光蛋白(GFP)的表达，从而表征β-珠蛋白的表达，这样可以直接通过流式检测GFP阳性细胞百分比及平均荧光强度(MFI)来快速得到慢病毒载体滴度和β-珠蛋白表达强度的信息；完成初步筛选后，再将HBB编码基因装载到慢病毒载体中，并保留GFP基因，实现β-珠蛋白与GFP荧光蛋白共表达，通过流式结果分析添加HBB基因对病毒滴度是否产生影响；最后将GFP基因序列删除，得到真正的HBB慢病毒载体，可以利用RT-PCR或高效液相色谱(HPLC)继续探究不同载体之间的差异。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的慢病毒载体的制备方法，所述制备方法包括：

利用PCR扩增人类基因组，将扩增产物通过酶切连接和同源重组形成HBB表达框；

将所述HBB表达框连接入空载体，得到所述慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种慢病毒，所述慢病毒采用第一方面所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。

第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的慢病毒载体和/或第三方面所述的慢病毒。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的慢病毒载体、第三方面所述的慢病毒或第四方面所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备β-地中海贫血治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的新型用于β-地中海基因治疗的慢病毒载体中HBB基因表达模块总长约5kb，包含基因座控制区串联放置的DNA酶I核心高敏位点(HS4、HS3、HS2)、引入点突变的HBG启动子、HBB表达框与下游高敏位点，载体滴度相比于临床中最成功的BB305载体提高了2～4倍，红系分化后β-珠蛋白表达水平提高了2倍左右；

(2)本发明在HBG2启动子引入了7个联合突变，将该区域内BCL11A识别位点沉默的同时将KLF1等转录因子识别位点活化，从而在成人红系造血中再活化γ-启动子，为HBB慢病毒载体的优化提供了一个绝佳的启动子模块；

(3)本发明将β-、γ-珠蛋白内含子以不同组合方式装载到慢病毒载体中，发现HBB原始内含子组合(β1+β2)的效果最佳，同时二号内含子(β2)对载体滴度的影响更大；

(4)本发明考虑到在构建慢病毒载体时，HBB基因表达框是反向装载到慢病毒骨架上的，其中某些序列可能形成隐藏的转录终止信号、拼接供体和受体，使慢病毒RNA发生转录提前终止或异常剪接的情况，导致慢病毒载体结构不完整，从而影响β-珠蛋白的表达，利用Omni-PolyA软件分析了载体序列，在HS4、HBB 2号内含子、HBG2 2号内含子、3’非翻译区预测的polyA序列中引入变异，避免了转录提前终止或异常剪接的情况。

(5)本发明采用纳米孔测序技术研究了慢病毒载体在体内整合的完整性，结果表明整合后得慢病毒载体仍保持完整的HBB表达框以及其他调控序列，表明在载体包装过程中不存在异常拼接现象，这也为该新型载体在未来临床应用中的疗效提供了有力的保障。

附图说明

图1为含有GFP报告基因的HBB慢病毒载体HBBpro-GFP的结构示意图，其中，HS2、HS3和HS4表示3个关键的DNA酶I核心高敏位点，β-p表示HBB基因启动子，E表示3’增强子，下方数字表示各元件的大小(kb)；

图2为HS2的核心0.5kb高敏位点，其中，灰色峰为DNase I高敏信号，下方每一横线表示一个Chip-seq数据，竖线为结合基序位点；

图3为LCR截短型HBB慢病毒载体的结构示意图，其中，HS2、HS3和HS4表示3个关键的DNA酶I核心高敏位点，β-p表示HBB基因启动子，E表示3’增强子，下方数字表示各元件的大小(kb)，T87Q表示β珠蛋白第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺；

图4为含有HBG2(mt7)启动子的HBB慢病毒载体的结构示意图，其中，HS2、HS3和HS4表示3个关键的DNA酶I核心高敏位点，γ-mt表示引入7个突变的HBG2启动子，E表示3’增强子，下方数字表示各元件的大小(kb)，T87Q表示β珠蛋白第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺；

图5为利用HBB启动子驱动GFP表达以表征HBB表达水平的可行性结果；

图6为LCR截短型HBB慢病毒载体和BB305载体对HUDEP2的转导效率；

图7A为含有HBG2(mt7)启动子的载体与含有HBB原始启动子的载体转导HUDEP2细胞后的病毒滴度，图7B为含有HBG2(mt7)启动子的载体与含有HBB原始启动子的载体转导HUDEP2细胞后的GFP表达强度；

图8A为不同LCR长度和不同启动子长度对HBB慢病毒载体滴度的影响，图8B为不同LCR长度和不同启动子长度对HBB慢病毒载体表达强度的影响；

图9A为不同亚型珠蛋白基因内含子组合对HBB慢病毒载体滴度的影响，图9B为不同亚型珠蛋白基因内含子组合对HBB慢病毒载体表达强度的影响；

图10为HUDEP2分化后对HBG2(mt7)启动子载体的GFP表达强度和对HBB原始启动子载体的GFP表达强度；

图11为在潜在的polyA序列引入变异以确保载体包装后的完整性；

图12为含有HBG2(mt7)启动子的截短型HBB慢病毒载体整合于基因组后的完整性分析；

图13为C57小鼠体内实验结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1慢病毒载体的设计与构建

为了高效筛选改良的载体，本实施例首先设计含有GFP报告基因的HBB慢病毒载体HBBpro-GFP，如图1所示，HBB启动子启动GFP的表达，根据GFP表征HBB的表达水平，通过流式检测GFP阳性细胞百分比及平均荧光强度，得到病毒滴度和HBB表达强度的信息。

对HBB慢病毒载体的HS2进行分析，如图2所示，HS2包含多种反式因子结合位点，本实施例截取其中最核心的0.5kb HS2高敏位点(SEQ ID NO:3)用于构建新的HBB慢病毒载体；

采用类似的方法对HS3、HS4进行分析，并对HS3、HS4进行结构精简，得到SEQ IDNO:1～2所示的HS4和HS3，同时对HBB基因的2号外显子上进行T87Q突变，获得的突变型β珠蛋白具有正常功能，设计组装得到新的基因座控制区(locus control region，LCR)截短型HBB慢病毒载体，如图3所示，在该新型HBB慢病毒载体中，LCR总长度由BB305载体的2.6kb缩短成1.9kb，减少约700bp。

本实施例进一步将HBB启动子(SEQ ID NO:4)替换为点突变HBG2启动子HBG2(mt7)启动子(γ-mt，SEQ ID NO:6)，其中，HBG2(mt7)启动子为将HBG2启动子(SEQ ID NO:5)进行7位点联合突变以恢复其在成人体内的转录活性，由此构建的慢病毒载体如图4所示。

以上设计优化的慢病毒载体的制备方法为：

以人类基因组为模板，利用KAPA HiFi PCR扩增试剂盒获得相关DNA片段，然后使用NEBuilder HiFi DNA Assembly kit试剂盒将各个片段进行组装，所有载体序列都利用核酸内切酶和Sanger测序进行验证。

实施例2慢病毒包装

本实施例采用三质粒包装系统(VSV-G包膜质粒、gag-pol结构质粒和转基因质粒)和磷酸钙沉淀法在293T细胞中完成VSVG假型慢病毒的包装，具体方法为：

转染第0天，将多聚赖氨酸(poly-lysine)铺至15cm细胞培养板中并加入25mL含有3.0g/L NaHCO₃的DMEM培养基，接种293T细胞后待汇合度达到80％～90％时，进行磷酸钙转染，质粒用量为27μg包含目的基因的质粒、17.5μg gag-pol结构质粒pCMV.R8.74和9.5μgVSV-G包膜质粒pMD.G；

第1天上午更换15mL 3.4g/L NaHCO₃的DMEM培养基+10％FBS+10mM NaB，6h后弃上清，使用15mL PBS清洗一遍，更换18mL opti-MEM无血清培养基；

第3天收获病毒上清，经0.22μm滤膜过滤后进行超速离心，6000g离心24h弃上清，将沉淀使用1/100原培养体积的无血清培养基重悬，置于摇床室温500rpm摇动1h，反复轻柔吹打20次左右后，得到浓缩100倍的慢病毒，分装冻存于-80℃冰箱中。

实施例3慢病毒的滴度检测

提前一天将HT1080细胞复苏到组织培养(Tissue-culture)处理的12孔板中，加入DMEM培养基调整细胞密度为3×10⁴个细胞/孔；

第0天，待细胞增长至约5×10⁴个细胞/孔时进行慢病毒转导，更换800μL新鲜培养基，添加0.1％

F108，分别使用0.5μL、2μL两个体积梯度进行滴度检测；培养一天后弃上清，使用500μL PBS清洗一遍，再添加800μL新鲜培养基；

第3天，使用Accutase消化细胞，收获5×10⁴个细胞，离心得到细胞沉淀，加入10μLPK缓冲液(100mM NaCl、10mM Tris pH 8、5mM EDTA、0.5％吐温20、1％10mg/mL蛋白酶K)，56℃孵育1h，95℃处理10min得到基因组DNA；

取0.5μL DNA作为模板，使用KAPA

Fast Universal 2×qPCR Master Mix进行qPCR测定载体滴度，具体PCR程序为98℃预变性2min，98℃变性5s、60℃退火10s、72℃延伸10s、35个循环；

剩余细胞进行流式检测GFP％及荧光表达强度，最终综合qPCR结果和流式结果，计算得到慢病毒滴度。

实施例4HUDEP2细胞培养和慢病毒转导

使用SFEM无血清培养基培养HUDEP2，同时添加50ng/mL SCF、3U/mL EPO、1μM地塞米松、10μg/mL强力霉素等因子促进细胞增殖；用包装的慢病毒HBBpro-GFP以MOI＝3转导HUDEP2，第三天进行流式检测，如图5所示，GFP细胞阳性率达95％，说明HUDEP2可以被该慢病毒高效转导。

本实施例利用相同的方法向HUDEP2中转导LCR1.9k-HBB-GFP，步骤如下：

使用SFEM无血清培养基培养HUDEP2，同时添加50ng/mL SCF、3U/mL EPO、1μM地塞米松、10μg/mL强力霉素等因子促进细胞增殖；用包装的慢病毒LCR1.9k-HBB-GFP或LCR2.6k-HBB-GFP(模拟BB305载体)以MOI＝2对HUDEP2进行转导，并预先使用Retronectin处理细胞培养板以提高慢病毒转导效率；转导16小时后去除病毒，第4天进行流式检测。

如图6所示，LCR截短型HBB慢病毒载体和BB305载体对HUDEP2的转导效率基本一致，且HBB表达水平无明显区别，表明将LCR由2.6kb截短至1.9kb并不影响HBB的表达。

本实施例进一步利用相同的方法向HUDEP2中转导含有HBG2(mt7)启动子的慢病毒载体，步骤如下：

使用SFEM无血清培养基培养HUDEP2，同时添加50ng/mL SCF、3U/mL EPO、1μM地塞米松、10μg/mL强力霉素等因子促进细胞增殖；用包装的慢病毒HBB(HBB启动子)或HBG2-mt7(HBG2(mt7)启动子)以MOI＝0.01、0.03、0.1、0.3对HUDEP2进行转导，并预先使用Retronectin处理细胞培养板以提高慢病毒转导效率；转导16小时后去除病毒，第3天进行流式检测，根据GFP％计算病毒滴度。

如图7A和图7B所示，含有HBG2(mt7)启动子的载体比含有HBB原始启动子的载体的病毒滴度提高了4倍左右；以MOI＝0.3感染HUDEP2细胞，第三天进行流式检测，发现含有HBG2(mt7)启动子的载体比含有HBB原始启动子的载体的GFP表达强度提高了2倍左右。

由于LCR由2.6kb截短至1.9kb对HBB表达水平无明显影响，本实施例进一步系统分析了不同LCR长度(1.9kb、2.4kb)及不同点突变HBG2启动子长度350bp/700bp(SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:6)对HBB慢病毒载体滴度及表达强度的影响。

SEQ ID NO:16所示的核酸序列为对700bp突变HBG2启动子进行进一步删减、获得的长度约为350bp的启动子；

SEQ ID NO:16：

gctaaagggaagaataaattagagaaaaattggaatgactgaatcggaacaaggcaaaggctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggcgcctcccgcacactatctcaatgcaaacatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgccttaactgatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggccaggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccacacactcgcttctggaacgtctgaggttatcaataagctcctagtccagacgcc。

如图8A和图8B所示，在不同的LCR长度及突变HBG启动子长度条件下，HBB表达强度差异不大，但是当LCR为1.9kb、点突变HBG启动子为700bp时，包装的慢病毒滴度最高。

为探究将HBG2内含子装载到HBB表达框中是否能达到采用HBG2(mt7)启动子类似的效果，本实施例将HBG2γ1(SEQ ID NO:12)、HBG2γ2(SEQ ID NO:13)、HBBβ1(SEQ ID NO:10)、HBBβ2(SEQ ID NO:11)共四个内含子以不同的组合方式两两装载到HBB表达框中，HBB1～3号外显子如SEQ ID NO:7～9所示，结果如图9A和图9B所示，虽然表达强度无明显差异，但是通过滴度检测发现HBB原始内含子组合(β1+β2)的效果最佳，同时二号内含子(β2)对载体滴度的影响更大。

实施例5HUDEP2细胞的红系分化

采用慢病毒载体HBB(HBB启动子)或HBG2-mt7(HBG2(mt7)启动子)以MOI＝0.3转导HUDEP2细胞，在细胞未分化的第3、5、7、21天进行流式检测(第5天和第7天结果未显示)，同时将部分细胞于第13天开始分化，诱导分化6天后再分化2天进行流式检测；

为保证HUDEP2在分化后仍有一定的存活率，本实施例采用两步法进行分化：在分化第一阶段使用IMDM培养基并添加5％FBS、10μg/mL胰岛素、3U/mL肝素、3U/mL EPO、200μg/mL转铁蛋白、10ng/mL SCF、1ng/mL IL-3和10μg/mL强力霉素；在分化第二阶段使用IMDM培养基并添加5％FBS、10μg/mL胰岛素、3U/mL肝素、3U/mL EPO和500μg/mL转铁蛋白。

如图10所示，HUDEP2分化后对HBG2(mt7)启动子载体的GFP表达强度较对HBB原始启动子载体的GFP表达强度提高了2倍左右，相比于分化前，该差异在分化后更显著，说明HBG2(mt7)启动子可能更有利于对HBB的长期稳定表达。这一结果表明，在红细胞分化过程中，HBG2(mt7)的强度显著高于HBB启动子的强度。

实施例6RNA-seq分析载体的完整性

利用Omni-PolyA软件分析载体序列，在HS4、HBB 2号内含子、HBG2 2号内含子、3’非翻译区预测的polyA序列中引入变异，对包装细胞293T进行RNA-seq，分析慢病毒载体在包装过程中是否发生拼接错误或转录提前终止等转录异常现象，方法如下：

转染第3天提取293T RNA，进行RNA测序，用Seqkit grep命令行抓取与载体相关的序列，使用BWA-MEM软件与表达载体进行比对，最后利用IGV软件对结果进行可视化分析。

如图11所示，向polyA序列引入变异后，慢病毒载体经过包装未发现拼接错误或转录提前终止现象，说明该突变能够保证慢病毒载体具有完整的结构，且各部分序列在转录水平上能够保持均衡。

实施例7慢病毒载体整合至细胞基因组后的完整性分析

将慢病毒以MOI＝3感染HUDEP2细胞，第3天提取细胞基因组DNA，使用慢病毒ITR特异性引物进行长片段PCR，对得到的慢病毒整合片段进行Nanopore测序，用Seqkit grep命令行抓取与HBB表达框相关的序列，使用BWA-MEM软件与参考序列进行比对，最后利用IGV软件对结果进行可视化分析。

如图12所示，含有HBG2(mt7)启动子的截短型HBB慢病毒载体(SEQ ID NO:15)整合于基因组中后，仍然保持完整的HBB表达框，这也为该载体未来应用于临床提供了有力保障。

实施例8C57小鼠移植及跟踪观察

本实施例在野生型C57小鼠体内验证新型HBB慢病毒载体的表达性能，具体方法为：

从5～6周龄野生型C57小鼠的股骨和胫骨中收集骨髓细胞，磁珠分选得到Sca1⁺细胞；

在5因子培养基(含10％胎牛血清、100ng/mL人血小板生成素、100ng/mL小鼠SCF、100ng/mL FLT3L、10ng/mL人IL-3和10ng/mL人G-CSF的IMDM培养基)中对Sca1⁺细胞进行预刺激；预刺激两天后，将细胞转移到CH-296铺板的12孔板中，以MOI＝3转导HBB慢病毒载体，同时添加0.1％

F108以提高转导效率，该过程采用的培养基为3因子培养基(含10％胎牛血清、100ng/mL人血小板生成素、100ng/mL小鼠SCF、100ng/mL FLT3L的IMDM培养基)；培养5小时后，收集上清液进行离心，用新鲜的3因子培养基将上清液中的细胞重悬放回培养箱中继续培养；培养24小时左右，用Accutase消化细胞，离心后将细胞重悬在IMDM无血清培养基中，用于移植；

对6～8周龄C57小鼠进行9Gy全身照射，照射后24小时内通过尾静脉注射体外转导的Sca1⁺细胞(2×10⁵个细胞/小鼠)进行移植；移植后每周观察小鼠的身体状况，并于移植后4、6、8周分别对小鼠进行采血，检测红细胞中GFP％及平均荧光强度(MFI)，用于表征β-珠蛋白的表达水平。

如图13所示，体内红系分化后，含有HBG2(mt7)启动子的慢病毒载体较含有HBB原始启动子的慢病毒载体的GFP表达强度(即β-珠蛋白表达强度)提高了2倍，与体外实验结果一致。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用

<130> 20210406

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 722

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaaagacaa gcacgtggac ctgggaggag ggttattgtc catgactggt gtgtggagac 60

aaatgcaggt ttataataga tgggatggca tctagcgcaa tgactttgcc atcactttta 120

gagagctctt ggggacccca gtacacaaga ggggacgcag ggtatatgta gacatctcat 180

tctttttctt agtgtgagaa taagaatagc catgacctga gtttatagac aatgagccct 240

tttctctctc ccactcagca gctatgagat ggcttgccct gcctctctac taggctgact 300

cactccaagg cccagcaatg ggcagggctc tgtcagggct ttgatagcac tatctgcaga 360

gccagggccg agaaggggtg gactccagag actctccctc ccattcccga gcagggtttg 420

cttatttatg catttaaatg atatatttct tttaaaagaa ataacaggag actgcccagc 480

cctggctgtg acatggaaac tatgtagaat attttgggtt ccattttttt ttccttcttt 540

cagttagagg aaaaggggct cactgcacat acactagaca gaaagtcagg agctttgaat 600

ccaagcctga tcatttccat gtcatactga gaaagtcccc acccttctct gagcctcagt 660

ttctcttttt ataagtagga gtctggagta aatgatttcc aatggctctc atttcaatac 720

aa 722

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaagagtca agcatttgcc taaggtcgga catgtcagag gcagtgccag acctatgtga 60

gactctgcag ctactgctca tgggccctgt gctgcactga tgaggaggat cagatggatg 120

gggcaatgaa gcaaaggaat cattctgtgg ataaaggaga cagccatgaa gaagtctatg 180

actgtaaatt tgggagcagg agtctctaag gacttggatt tcaaggaatt ttgactcagc 240

aaacacaaga ccctcacggt gactttgcga gctggtgtgc cagatgtgtc tatcagaggt 300

tccagggagg gtggggtggg gtcagggctg gccaccagct atcagggccc agatgggtta 360

taggctggca ggctcagata ggtggttagg tcaggttggt ggtgctgggt ggagtccatg 420

actcccagga gccaggagag atagaccatg agtagagggc agacatggga aaggtggggg 480

aggcacagca tagcagcatt tttcattcta ctactacatg ggactgctcc cctatacccc 540

cagctagggg caagtgcctt gactcctatg ttttcaggat catcatctat aaagtaagag 600

taataattgt gtctatctca tagggttatt atgaggatca aaggagatgc acactctctg 660

gaccagtggc ctaacagttc aggacagagc tatgggcttc ctatg 705

<210> 3

<211> 467

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggtgcttc aaaaccattt gctgaatgat tactatactt tttacaagct cagctccctc 60

tatcccttcc agcatcctca tctctgatta aataagcttc agtttttcct tagttcctgt 120

tacatttctg tgtgtctcca ttagtgacct cccatagtcc aagcatgagc agttctggcc 180

aggcccctgt cggggtcagt gccccacccc cgccttctgg ttctgtgtaa ccttctaagc 240

aaaccttctg gctcaagcac agcaatgctg agtcatgatg agtcatgctg aggcttaggg 300

tgtgtgccca gatgttctca gcctagagtg atgactccta tctgggtccc cagcaggatg 360

cttacagggc agatggcaaa aaaaaggaga agctgaccac ctgactaaaa ctccacctca 420

aacggcatca taaagaaaat ggatgcctga gacagaatgt gacatat 467

<210> 4

<211> 722

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taatgcacag agcacattga tttgtattta ttctattttt agacataatt tattagcatg 60

catgagcaaa ttaagaaaaa caacaacaaa tgaatgcata tatatgtata tgtatgtgtg 120

tatatataca cacatatata tatatatttt ttcttttctt accagaaggt tttaatccaa 180

ataaggagaa gatatgctta gaaccgaggt agagttttca tccattctgt cctgtaagta 240

ttttgcatat tctggagacg caggaagaga tccatctaca tatcccaaag ctgaattatg 300

gtagacaaaa ctcttccact tttagtgcat caacttctta tttgtgtaat aagaaaattg 360

ggaaaacgat cttcaatatg cttaccaagc tgtgattcca aatattacgt aaatacactt 420

gcaaaggagg atgtttttag tagcaatttg tactgatggt atggggccaa gagatatatc 480

ttagagggag ggctgagggt ttgaagtcca actcctaagc cagtgccaga agagccaagg 540

acaggtacgg ctgtcatcac ttagacctca ccctgtggag ccacacccta gggttggcca 600

atctactccc aggagcaggg agggcaggag ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag 660

ccatctattg cttacatttg cttctgacac aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac 720

ac 722

<210> 5

<211> 716

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcagtctta tattatatta cataacatta atctattcct gcactgaaac tgttgcttta 60

taggattttt cactacacta atgagaactt aagagataat ggcctaaaac cacagagagt 120

atattcaaag ataagtatag cacttcttat ttggaaacca atgcttacta aatgagacta 180

agacgtgtcc catcaaaaat cctggaccta tgcctaaaac acatttcaca atccctgaac 240

ttttcaaaaa ttggtacatg ctttaacttt aaactacagg cctcactgga gctacagaca 300

agaaggtgaa aaacggctga caaaagaagt cctggtatct tctatggtgg gagaagaaaa 360

ctagctaaag ggaagaataa attagagaaa aattggaatg actgaatcgg aacaaggcaa 420

aggctataaa aaaaattaag cagcagtatc ctcttggggg ccccttcccc acactatctc 480

aatgcaaata tctgtctgaa acggtccctg gctaaactcc acccatgggt tggccagcct 540

tgccttgacc aatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat agtcttagag tatccagtga 600

ggccaggggc cggcggctgg ctagggatga agaataaaag gaagcaccct tcagcagttc 660

cacacactcg cttctggaac gtctgaggtt atcaataagc tcctagtcca gacgcc 716

<210> 6

<211> 716

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcagtctta tattatatta cataacatta atctattcct gcactgaaac tgttgcttta 60

taggattttt cactacacta atgagaactt aagagataat ggcctaaaac cacagagagt 120

atattcaaag ataagtatag cacttcttat ttggaaacca atgcttacta aatgagacta 180

agacgtgtcc catcaaaaat cctggaccta tgcctaaaac acatttcaca atccctgaac 240

ttttcaaaaa ttggtacatg ctttaacttt aaactacagg cctcactgga gctacagaca 300

agaaggtgaa aaacggctga caaaagaagt cctggtatct tctatggtgg gagaagaaaa 360

ctagctaaag ggaagaataa attagagaaa aattggaatg actgaatcgg aacaaggcaa 420

aggctataaa aaaaattaag cagcagtatc ctcttggggg cgcctcccgc acactatctc 480

aatgcaaaca tctgtctgaa acggtccctg gctaaactcc acccatgggt tggccagcct 540

tgccttaact gatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat agtcttagag tatccagtga 600

ggccaggggc cggcggctgg ctagggatga agaataaaag gaagcaccct tcagcagttc 660

cacacactcg cttctggaac gtctgaggtt atcaataagc tcctagtcca gacgcc 716

<210> 7

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60

gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc ag 92

<210> 8

<211> 223

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctgctggtg gtctaccctt ggacccagag gttctttgag tcctttgggg atctgtccac 60

tcctgatgct gttatgggca accctaaggt gaaggctcat ggcaagaaag tgctcggtgc 120

ctttagtgat ggcctggctc acctggacaa cctcaagggc acctttgccc agctgagtga 180

gctgcactgt gacaagctgc acgtggatcc tgagaacttc agg 223

<210> 9

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcctgggca acgtgctggt ctgtgtgctg gcccatcact ttggcaaaga attcacccca 60

ccagtgcagg ctgcctatca gaaagtggtg gctggtgtgg ctaatgccct ggcccacaag 120

tatcac 126

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcctgggca acgtgctggt ctgtgtgctg gcccatcact ttggcaaaga attcacccca 60

ccagtgcagg ctgcctatca gaaagtggtg gctggtgtgg ctaatgccct ggcccacaag 120

tatcac 126

<210> 11

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgagtctat gggacgcttg atgttttctt tccccttctt ttctatggtt aagttcatgt 60

cataggaagg ggataagtaa cagggtacag tttagaatgg gaaacagacg aatgattgca 120

tcagtgtgga agtctcagga tcgttttagt ttctttcttt gctgttcata acaattgttt 180

tcttttgttt aattcttgct ttcttttttt ttcttctccg caatttttac tattatactt 240

aatgccttaa cattgtgtat aacaaaagga aatatctctg agatacatta agtaacttaa 300

aaaaaaactt tacacagtct gcctagtaca ttactatttg gaatatatgt gtgcttattt 360

gcatattcat aatctcccta cttcttttct ttctttttaa ttgatacata atcattatac 420

atatttatgg gttaaagtgt aatgttttaa tatgtgtaca catattgacc aaatcagggt 480

aattttgcat ttgtaatttt aaaaaatgct ttcttctttt aatatacttt tttgtttatc 540

ttatttctaa tactttccct aatctctttc tttcagggca ataatgatac aatgtatcat 600

gcctctttgc accattctaa agaataacag tgataatttc tgggttaagg caatagcaat 660

atctctgcat ataaatattt ctgcatataa attgtaactg atgtaagagg tttcatattg 720

ctaatagcag ctacaatcca gctaccattc tgctttcttt tatggttggg ataaggctgg 780

attattctga gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct tatcttcctc 840

ccacag 846

<210> 12

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtaggctctg gtgaccagga caagggaggg aaggaaggac cctgtgcctg gcaaaagtcc 60

aggtcgcttc tcaggatttg tggcaccttc tgactgtcaa actgttcttg tcaatctcac 120

ag 122

<210> 13

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgagtccag gagatgtttc agcactgttg cctttagtct cgaggcaact tagacaactg 60

agtattgatc tgagcacagc agggtgtgag ctgtttgaag atactggggt tgggagtgaa 120

gaaactgcag aggactaact gggctgagac ccagtggcaa tgttttaggg cctaaggagt 180

gcctctgaaa atctagatgg acaactttga ctttgagaaa agagaggtgg aaatgaggaa 240

aatgactttt cttcttagat ttcggtagaa agaactttca cctttcccct atttttgtta 300

ttcgttttaa aacatctatc tggaggcagg acaagtatgg tcattaaaaa gatgcaggca 360

gaaggcatat attggctcag tcaaagtggg gaactttggt ggccaaacat acattgctaa 420

ggctattcct atatcagctg gacacatata aaatgctgct aatgcttcat tacaaactta 480

tatcctttaa ttccagatgg gggcaaagta tgtccagggg tgaggaacaa ttgaaacatt 540

tgggctggag tagattttga aagtcagctc tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cgcgcgtgtg 600

tttgtgtgtg tgtgagagcg tgtgtttctt ttaacgtttt cagcctacag catacagggt 660

tcatggtggc aagaagataa caagatttaa attatggcca gtgactagtg ctgcaagaag 720

aacaactacc tgcatttaat gggaaagcaa aatctcaggc tttgagggaa gttaacatag 780

gcttgattct gggtggaagc ttggtgtgta gttatctgga ggccaggctg gagctctcag 840

ctcactatgg gttcatcttc ttgtctcctt tcatctcaac ag 882

<210> 14

<211> 998

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

taatttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 180

gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat 240

acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 300

aacagcccct gatgcatatg ccttattcat ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg 360

atttggaggt taaagttttg ctatgctgta ttttacatta cttattgttt tagctgtcct 420

catgaatgtc ttttcactac ccatttgctt atcctgcatc tctcagcctt gactccactc 480

agttctcttg cttagagata ccacctttcc cctgaagtgt tccttccatg ttttacggcg 540

agatggtttc tcctcgcctg gccactcagc cttagttgtc tctgttgtct tatagaggtc 600

tacttgaaga aggaaaaaca ggggtcatgg tttgactgtc ctgtgagccc ttcttccctg 660

cctcccccac tcacagtgac ccggaatctg cagtgctagt ctcccggaac tatcactctt 720

tcacagtctg ctttggaagg actgggctta gtatgaaaag ttaggactga gaagaatttg 780

aaaggcggct ttttgtagct tgatattcac tactgtctta ttaccctgtc ataggcccac 840

cccaaatgga agtcccattc ttcctcagga tgtttaagat tagcattcag gaagagatca 900

gaggtctgct ggctccctta tcatgtccct tatggtgctt ctggctctgc agttattagc 960

atagtgttac catcaaccac cttaacttca tttttctt 998

<210> 15

<211> 10555

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg cgccattcgc cattcaggct 480

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600

ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac 660

gtctcgacgc aaaagcctag gcctccaaaa aagcctcctc actacttctg gaatagctca 720

gaggccgagg cggcctcggc ctctgcataa ataaaaaaaa ttagtcagcc atggggcgga 780

gaatgggcgg aactgggcgg agttaggggc gggatagcta gagccagaca tgataagata 840

cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga 900

aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttcctct 960

cactctctga tattcatttc tttgcaagtt ataaatactg aataataaga tgacatgaac 1020

tactactgct agagattttc cacactgact aaaagggtct gagggatctc tagttaccag 1080

agtcacacaa cagacgggca cacactactt gaagcactca aggcaagctt tattgaggct 1140

taagcagtgg gttccctagt tagccagaga gctcccaggc tcagatctgg tctaaccaga 1200

gagacccagt acaagcaaaa agcagatctt gtcttcgttg ggagtgaatt agcccttcca 1260

gtcccccctt ttcttttaaa aagtggctaa gatctacagc tgccttgtaa gtcattggtc 1320

ttaaaggtac cacaaagaca agcacgtgga cctgggagga gggttattgt ccatgactgg 1380

tgtgtggaga caaatgcagg tttataatag atgggatggc atctagcgca atgactttgc 1440

catcactttt agagagctct tggggacccc agtacacaag aggggacgca gggtatatgt 1500

agacatctca ttctttttct tagtgtgaga ataagaatag ccatgacctg agtttataga 1560

caatgagccc ttttctctct cccactcagc agctatgaga tggcttgccc tgcctctcta 1620

ctaggctgac tcactccaag gcccagcaat gggcagggct ctgtcagggc tttgatagca 1680

ctatctgcag agccagggcc gagaaggggt ggactccaga gactctccct cccattcccg 1740

agcagggttt gcttatttat gcatttaaat gatatatttc ttttaaaaga aataacagga 1800

gactgcccag ccctggctgt gacatggaaa ctatgtagaa tattttgggt tccatttttt 1860

tttccttctt tcagttagag gaaaaggggc tcactgcaca tacactagac agaaagtcag 1920

gagctttgaa tccaagcctg atcatttcca tgtcatactg agaaagtccc cacccttctc 1980

tgagcctcag tttctctttt tataagtagg agtctggagt aaatgatttc caatggctct 2040

catttcaata caaactagta gaagagtcaa gcatttgcct aaggtcggac atgtcagagg 2100

cagtgccaga cctatgtgag actctgcagc tactgctcat gggccctgtg ctgcactgat 2160

gaggaggatc agatggatgg ggcaatgaag caaaggaatc attctgtgga taaaggagac 2220

agccatgaag aagtctatga ctgtaaattt gggagcagga gtctctaagg acttggattt 2280

caaggaattt tgactcagca aacacaagac cctcacggtg actttgcgag ctggtgtgcc 2340

agatgtgtct atcagaggtt ccagggaggg tggggtgggg tcagggctgg ccaccagcta 2400

tcagggccca gatgggttat aggctggcag gctcagatag gtggttaggt caggttggtg 2460

gtgctgggtg gagtccatga ctcccaggag ccaggagaga tagaccatga gtagagggca 2520

gacatgggaa aggtggggga ggcacagcat agcagcattt ttcattctac tactacatgg 2580

gactgctccc ctataccccc agctaggggc aagtgccttg actcctatgt tttcaggatc 2640

atcatctata aagtaagagt aataattgtg tctatctcat agggttatta tgaggatcaa 2700

aggagatgca cactctctgg accagtggcc taacagttca ggacagagct atgggcttcc 2760

tatggaattc caggtgcttc aaaaccattt gctgaatgat tactatactt tttacaagct 2820

cagctccctc tatcccttcc agcatcctca tctctgatta aataagcttc agtttttcct 2880

tagttcctgt tacatttctg tgtgtctcca ttagtgacct cccatagtcc aagcatgagc 2940

agttctggcc aggcccctgt cggggtcagt gccccacccc cgccttctgg ttctgtgtaa 3000

ccttctaagc aaaccttctg gctcaagcac agcaatgctg agtcatgatg agtcatgctg 3060

aggcttaggg tgtgtgccca gatgttctca gcctagagtg atgactccta tctgggtccc 3120

cagcaggatg cttacagggc agatggcaaa aaaaaggaga agctgaccac ctgactaaaa 3180

ctccacctca aacggcatca taaagaaaat ggatgcctga gacagaatgt gacatattct 3240

agattcagtc ttatattata ttacataaca ttaatctatt cctgcactga aactgttgct 3300

ttataggatt tttcactaca ctaatgagaa cttaagagat aatggcctaa aaccacagag 3360

agtatattca aagataagta tagcacttct tatttggaaa ccaatgctta ctaaatgaga 3420

ctaagacgtg tcccatcaaa aatcctggac ctatgcctaa aacacatttc acaatccctg 3480

aacttttcaa aaattggtac atgctttaac tttaaactac aggcctcact ggagctacag 3540

acaagaaggt gaaaaacggc tgacaaaaga agtcctggta tcttctatgg tgggagaaga 3600

aaactagcta aagggaagaa taaattagag aaaaattgga atgactgaat cggaacaagg 3660

caaaggctat aaaaaaaatt aagcagcagt atcctcttgg gggcgcctcc cgcacactat 3720

ctcaatgcaa acatctgtct gaaacggtcc ctggctaaac tccacccatg ggttggccag 3780

ccttgcctta actgatagcc ttgacaaggc aaacttgacc aatagtctta gagtatccag 3840

tgaggccagg ggccggcggc tggctaggga tgaagaataa aaggaagcac ccttcagcag 3900

ttccacacac tcgcttctgg aacgtctgag gttatcaata agctcctagt ccagacgccg 3960

cgatcgccat ggtgcatctg actcctgagg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca 4020

aggtgaacgt ggatgaagtt ggtggtgagg ccctgggcag gttggtatca aggttacaag 4080

acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg catgtggaga cagagaagac tcttgggttt 4140

ctgataggca ctgactctct ctgcctattg gtctattttc ccacccttag gctgctggtg 4200

gtctaccctt ggacccagag gttctttgag tcctttgggg atctgtccac tcctgatgct 4260

gttatgggca accctaaggt gaaggctcat ggcaagaaag tgctcggtgc ctttagtgat 4320

ggcctggctc acctggacaa cctcaagggc acctttgccc agctgagtga gctgcactgt 4380

gacaagctgc acgtggatcc tgagaacttc agggtgagtc tatgggacgc ttgatgtttt 4440

ctttcccctt cttttctatg gttaagttca tgtcatagga aggggataag taacagggta 4500

cagtttagaa tgggaaacag acgaatgatt gcatcagtgt ggaagtctca ggatcgtttt 4560

agtttctttc tttgctgttc ataacaattg ttttcttttg tttaattctt gctttctttt 4620

tttttcttct ccgcaatttt tactattata cttaatgcct taacattgtg tataacaaaa 4680

ggaaatatct ctgagataca ttaagtaact taaaaaaaaa ctttacacag tctgcctagt 4740

acattactat ttggaatata tgtgtgctta tttgcatatt cataatctcc ctacttcttt 4800

tctttctttt taattgatac ataatcatta tacatattta tgggttaaag tgtaatgttt 4860

taatatgtgt acacatattg accaaatcag ggtaattttg catttgtaat tttaaaaaat 4920

gctttcttct tttaatatac ttttttgttt atcttatttc taatactttc cctaatctct 4980

ttctttcagg gcaataatga tacaatgtat catgcctctt tgcaccattc taaagaataa 5040

cagtgataat ttctgggtta aggcaatagc aatatctctg catataaata tttctgcata 5100

taaattgtaa ctgatgtaag aggtttcata ttgctaatag cagctacaat ccagctacca 5160

ttctgctttc ttttatggtt gggataaggc tggattattc tgagtccaag ctaggccctt 5220

ttgctaatca tgttcatacc tcttatcttc ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc 5280

tgtgtgctgg cccatcactt tggcaaagaa ttcaccccac cagtgcaggc tgcctatcag 5340

aaagtggtgg ctggtgtggc taatgccctg gcccacaagt atcactagta ggtttaaacg 5400

ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt gttccctaag tccaactact 5460

aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt ctgcctaata aaaaacattt 5520

aatttcattg caatgatgta tttaaattat ttctgaatat tttactaaaa agggaatgtg 5580

ggaggtcagt gcatttaaaa cataaagaaa tgaagagcta gttcaaacct tgggaaaata 5640

cactatatct taaactccat gaaagaaggt gaggctgcaa acagctaatg cacattggca 5700

acagcccctg atgcatatgc cttattcatc cctcagaaaa ggattcaagt agaggcttga 5760

tttggaggtt aaagttttgc tatgctgtat tttacattac ttattgtttt agctgtcctc 5820

atgaatgtct tttcactacc catttgctta tcctgcatct ctcagccttg actccactca 5880

gttctcttgc ttagagatac cacctttccc ctgaagtgtt ccttccatgt tttacggcga 5940

gatggtttct cctcgcctgg ccactcagcc ttagttgtct ctgttgtctt atagaggtct 6000

acttgaagaa ggaaaaacag gggtcatggt ttgactgtcc tgtgagccct tcttccctgc 6060

ctcccccact cacagtgacc cggaatctgc agtgctagtc tcccggaact atcactcttt 6120

cacagtctgc tttggaagga ctgggcttag tatgaaaagt taggactgag aagaatttga 6180

aaggcggctt tttgtagctt gatattcact actgtcttat taccctgtca taggcccacc 6240

ccaaatggaa gtcccattct tcctcaggat gtttaagatt agcattcagg aagagatcag 6300

aggtctgctg gctcccttat catgtccctt atggtgcttc tggctctgca gttattagca 6360

tagtgttacc atcaaccacc ttaacttcat ttttcttctc gaggctagtc tcgtgatcgg 6420

aaaattttga atttttgtaa tttgtttttg taattcttta gtttgtatgt ctgttgctat 6480

tatgtctact attctttccc ctgcactgta ccccccaatc cccccttttc ttttaaaagt 6540

taaccgatac cgtcgagatc cgttcactaa tcgaatggat ctgtctctgt ctctctctcc 6600

accttcttct tctattcctt cgggcctgtc gggtcccctc ggggttggga ggtgggtctg 6660

aaacgataat ggtgaatatc cctgcctaac tctattcact atagaaagta cagcaaaaac 6720

tattcttaaa cctaccaagc ctcctactat cattatgaat aattttatat accacagcca 6780

atttgttatg ttaaaccaat tccacaaact tgcccattta tctaattcca ataattcttg 6840

ttcattcttt tcttgctggt tttgcgattc ttcaattaag gagtgtatta agcttgtgta 6900

attgttaatt tctctgtccc actccatcca ggtcgtgtga ttccaatctg ttccagagat 6960

ttattactcc aactagcatt ccaaggcaca gcagtggtgc aaatgagttt tccagagcaa 7020

ccccaaatcc ccaggagctg ttgatccttt aggtatcttt ccacagccag gattcttgcc 7080

tggagctgct tgatgcccca gactgtgagt tgcaacagat gctgttgcgc ctcaatagcc 7140

ctcagcaaat tgttctgctg ctgcactata ccagacaata attgtctggc ctgtaccgtc 7200

agcgtcattg aggctgcgcc catagtgctt cctgctgctc ccaagaaccc aaggaacaaa 7260

gctcctattc ccactgctct tttttctctc tgcaccactc ttctctttgc cttggtgggt 7320

gctactccta atggttcaat ttttactact ttatatttat ataattcact tctccaattg 7380

tccctcatat ctcctcctcc aggtctgaag atcagcggcc gcttgctgtg cggtggtctt 7440

acttttgttt tgctcttcct ctatcttgtc taaagcttcc ttggtgtctt ttatctctat 7500

cctttgatgc acacaataga gggttgctac tgtattatat aatgatctaa gttcttctga 7560

tcctgtctga agggatggtt gtagctgtcc cagtatttgt ctacagcctt ctgatgtttc 7620

taacaggcca ggattaactg cgaatcgttc tagctccctg cttgcccata ctatatgttt 7680

taatttatat tttttctttc cccctggcct taaccgaatt ttttcccatc gcgatctaat 7740

tctcccccgc ttaatactga cgctctcgca cccatctctc tccttctagc ctccgctagt 7800

caaaattttt ggcgtactca ccagtcgccg cccctcgcct cttgccgtgc gcgcttcagc 7860

aagccgagtc ctgcgtcgag agagctctgg tttccctttc gctttcaggt ccctgttcgg 7920

gcgccactgc tagagatttt ccacactgac taaaagggtc tgagggatct ctagttacca 7980

gagtcacaca acagacgggc acacactact tgaagcactc aaggcaagct ttattgaggc 8040

ttaagcagtg ggttccctag ttagccagag agctcccagg ctcagatctg gtctaaccag 8100

agagacccgt ttattgtatc gagctaggca cttaaataca atatctctgc aatgcggcaa 8160

ttcagtggtt cgtccaatcc atgtcagacc cgtctgttgc cttcctaata aggcacgatc 8220

gtaccacctt acttccacca atcggcatgc acggtgcttt ttctctcctt gtaaggcatg 8280

ttgctaactc atcgttacca tgttgcaaga ctacaagagt attgcataag actacattaa 8340

gcttgcagct ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca 8400

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 8460

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 8520

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 8580

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 8640

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 8700

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 8760

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 8820

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 8880

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 8940

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 9000

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 9060

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 9120

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 9180

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 9240

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 9300

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 9360

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 9420

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 9480

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 9540

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 9600

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 9660

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 9720

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 9780

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 9840

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 9900

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 9960

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 10020

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 10080

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 10140

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 10200

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 10260

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 10320

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 10380

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 10440

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 10500

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctg 10555

<210> 16

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gctaaaggga agaataaatt agagaaaaat tggaatgact gaatcggaac aaggcaaagg 60

ctataaaaaa aattaagcag cagtatcctc ttgggggcgc ctcccgcaca ctatctcaat 120

gcaaacatct gtctgaaacg gtccctggct aaactccacc catgggttgg ccagccttgc 180

cttaactgat agccttgaca aggcaaactt gaccaatagt cttagagtat ccagtgaggc 240

caggggccgg cggctggcta gggatgaaga ataaaaggaa gcacccttca gcagttccac 300

acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gcc 353

Claims (9)

1.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括HBB表达框；

所述HBB表达框包括串联的DNase I高敏位点、启动子、HBB编码基因和增强子；

所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；

所述HS4的核酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述HS3的核酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

所述HS2的核酸序列如SEQ ID NO: 3所示；

所述启动子为突变型HBG2启动子，所述突变型HBG2启动子的核酸序列如SEQ ID NO: 6所示；

所述HBB编码基因由串联的HBB 1号外显子、HBB 1号内含子、HBB 2号外显子、HBB 2号内含子和HBB 3号外显子组成；

所述HBB 1号外显子的核酸序列如SEQ ID NO: 7所示；

所述HBB 2号外显子的核酸序列如SEQ ID NO: 8所示；

所述HBB 3号外显子的核酸序列如SEQ ID NO: 9所示；

所述HBB 1号内含子的核酸序列如SEQ ID NO: 10所示；

所述HBB 2号内含子的核酸序列如SEQ ID NO: 11所示。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述增强子的核酸序列如SEQ IDNO: 14所示。

3.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体的核酸序列如SEQID NO: 15所示。

4.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体在启动子的下游还可以包括荧光蛋白编码基因。

5.一种权利要求1-4任一项所述的慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

利用PCR扩增人类基因组，将扩增产物通过酶切连接和同源重组形成HBB表达框；

将所述HBB表达框连接入空载体，得到所述慢病毒载体。

6.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒采用权利要求1-4任一项所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的慢病毒载体和/或权利要求6所述的慢病毒。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

9.权利要求1-4任一项所述的慢病毒载体、权利要求6所述的慢病毒或权利要求7或8所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备β-地中海贫血治疗药物中的应用。

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