CN101213294A - 可放大的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达通过自装配形成VLP的噬菌体衣壳蛋白的高效的发酵方法，其中该方法可放大至商业生产规模，并且其中控制衣壳蛋白的表达速率以获得提高的可溶性衣壳蛋白的产量。这可通过将补料分批培养和乳糖诱导表达系统的优点与特定过程参数相结合而获得，所述参数提供在生长期中提高的启动子阻遏和贯穿该过程的高质粒保持。

Description

可放大的发酵方法
发明领域
本发明涉及蛋白质表达和发酵技术的领域。描述了一种在细菌宿主中有效表达重组噬菌体衣壳蛋白的方法。该方法导致高产量的重组衣壳蛋白，该衣壳蛋白可以通过自装配形成病毒样颗粒(VLP)。而且，该方法可从试验室规模放大(scalable)为大于50升的发酵罐体积。
发明背景
最近的接种策略利用病毒或病毒样颗粒(VLP)以增强对抗原的免疫应答。例如，WO02/056905说明了利用VLP作为载体呈递以高度有序重复的阵列形式连接到其上的抗原。所述抗原阵列能引起针对连接的抗原的强烈的免疫应答，特别是抗体应答，甚至能够破坏免疫系统对于自身抗原的固有耐受性。所述抗原阵列因此可用于生产治疗感染性疾病和变态反应以及有效诱导自身特异性免疫应答的疫苗，例如，用于治疗癌症、类风湿性关节炎和多种其他疾病。
如在WO02/056905中所述的，噬菌体的衣壳蛋白特别适合作为抗原载体。它们已经显示在细菌宿主中表达后有效地自装配为VLP(Kastelein等人.1983，Gene 23：245-254；Kozlovskaya等人.1986，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455)。而且，例如源于fr(Pushko等人.1993，Protein Engineering 6(8)883-891)、Qβ(Kozlovska等人.1993，Gene137：133-137；Ciliens等人.2000，FEBS Letters 24171：1-4；Vasiljeva等人1998，FEBS Letters 431：7-11)和MS-2(WO92/13081；Mastico等人.1993，Journal of General Virology 74：541-548；Heal等人.2000，Vaccine18：251-258)的噬菌体衣壳蛋白已经利用诱导型启动子例如trp启动子或trp-T7融合子(在fr和Qb的情况中)或tac启动子、利用IPTG作为诱导物质(在MS-2的情况中)在细菌宿主中产生。诱导型启动子的利用是有益的，用于避免可能的重组衣壳蛋白的毒性效应和蛋白质表达的代谢负担，这两者都可能降低细菌表达宿主的生长，并且最终降低表达蛋白质的产量。
然而，迄今为止用于表达噬菌体的衣壳蛋白的表达系统以小规模发酵应用，也就是说，体积典型地明显小于1升的实验室规模的小批培养。50升和更大体积的这些系统的放大预期会很大程度地减少相应的衣壳蛋白产量，这是由于提高的启动子泄漏和/或降低的质粒保持。
与商业上期望的噬菌体重组衣壳蛋白的高水平表达和快速累积相关的另一个问题是不正确折叠的蛋白质种类的形成和所谓的包涵体的形成，即，蛋白质聚集体，它们是不溶的并且其可能进一步妨碍下游的过程。因此，对于噬菌体MS-2外壳蛋白，报道了当蛋白质在强T7启动子的控制下，在IPTG诱导之后，利用pET表达系统表达时，蛋白质聚集体和丧失自装配为VLP的能力的蛋白质种类的形成(Peabody和Al-Bitar 2001，Nucleic Acid Research 29(22)：e113)。
重组衣壳蛋白的高表达率可能因此对正确装配的VLP的产量具有负面影响。基于VLP的疫苗在商业规模上的生产因此需要建立一种有效的、特别是可放大的用于表达噬菌体重组衣壳蛋白的发酵方法，该方法产生质量和纯度恒定的具有自装配为VLP的能力的产物，由此减少或避免了衣壳蛋白的不溶部分的形成。
因此，本发明的一个目的是提供一种噬菌体重组衣壳蛋白的表达方法，其避免或减少了现有技术方法的一种或多种缺陷，特别是，其可放大为商业规模，并仍然产生质量和纯度恒定的、能够自装配为VLP的产物，并且其中衣壳蛋白的不溶部分的形成被减少或被避免。
发明概述
本发明涉及一种表达能够通过自装配形成VLP的噬菌体重组衣壳蛋白或其突变体或片断的方法，所述方法包括步骤：a)将一种表达质粒导入细菌宿主中，其中所述表达质粒包含一种表达构建体，其中所述表达构建体包含(i)编码所述重组衣壳蛋白或其突变体或片段的第一核苷酸序列，和(ii)可被乳糖诱导的启动子；b)在包含主碳源的培养基中培养所述细菌宿主；其中所述培养以分批培养的方式在所述启动子被lacI阻遏的条件下进行，其中所述细菌宿主过量表达所述lacI；c)用所述主碳源向所述分批培养物中补料；和d)利用一种诱导物诱导所述启动子，其中优选地继续用主碳源向所述分批培养物中补料。
本发明提供了一种表达通过自装配形成VLP的噬菌体衣壳蛋白的高效的发酵方法，其中该方法可放大为商业生产规模并且其中衣壳蛋白的表达速率导致可溶性衣壳蛋白产量的提高。特别地，这通过在生长阶段提高的启动子阻遏和在整个过程中的高质粒保持而获得。该表达系统通过限制生产阶段出现的最大表达速率而进一步避免了不溶性蛋白质聚集体的形成。
在一个优选实施方式中，所述噬菌体是一种RNA噬菌体。更优选地，所述RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体AP205；c.)噬菌体fr；d.)噬菌体GA；e.)噬菌体SP；f.)噬菌体MS2；g.)噬菌体M11；h.)噬菌体MX1；i.)噬菌体NL95；j.)噬菌体f2；k.)噬菌体PP7和1.)噬菌体R17。优选地，所述RNA噬菌体是Qβ。更优选地，所述重组衣壳蛋白包含或由选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。更优选地，所述重组衣壳蛋白包含SEQ ID NO：5，最优选地，所述重组衣壳蛋白由SEQ ID NO：5组成。
在一个进一步优选的实施方式中，所述重组衣壳蛋白包含或由选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成。更优选地，所述重组衣壳蛋白包含SEQ ID NO：12，更优选地，所述重组衣壳蛋白由SEQ ID NO：12组成。
在本发明的另一实施方式中，所述表达构建体包含第一终止密码子，其中所述第一终止密码子是TAA，并且其中优选地所述TAA直接定位于所述第一核苷酸序列的3’侧。
在一个进一步的实施方式中，所述表达构建体包含第一终止密码子和第二终止密码子，其中所述第一终止密码子直接定位于所述第一核苷酸序列的3’，并且所述第二终止密码子直接定位于所述第一终止密码子的3’，并且所述第一或第二终止密码子的至少一个是TAA。
在一个进一步的实施方式中，所述表达构建体包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码一种重组衣壳蛋白，优选QβCP，或其突变体或片段，并且其中所述第二核苷酸序列编码任何其他蛋白质，优选QβA1蛋白或其突变体或片段，并且其中所述第一和第二核苷酸序列通过正好一个包含至少一个TAA终止密码子的一段序列而分离。在一个优选实施方式中，所述表达构建体包含或由核苷酸序列SEQ ID NO：6组成。
在一个进一步的实施方式中，所述表达质粒包含或更优选地由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成。
在本发明的一个实施方式中，所述启动子选自a)tac启动子；b.)trc启动子；c.)tic启动子；d.)lac启动子；e.)lacUV5启动子；f.)Psyn启动子；g.)lppa启动子；h.)lpp-lac启动子；i.)T7-lac启动子；j.)T3-lac启动子；k.)T5-lac启动子；和l)与SEQ ID NO：2具有至少50％序列同源性的启动子。在一个优选实施方式中，所述启动子与SEQID NO：2具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％、优选98％到100％、最优选99％的序列同源性。在一个进一步优选的实施方式中，所述启动子选自tic启动子，trc启动子和tac启动子。更优选地，所述启动子是tac启动子。最优选地，所述启动子包含或由核苷酸序列SEQ ID NO：2组成。
在一个实施方式中，所述主碳源是葡萄糖或甘油，优选甘油。
在一个实施方式中，所述分批培养的补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，其中优选地所述指数系数μ低于μmax。
在一个进一步的实施方式中，所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)以恒定的流速向所述分批培养物中共补料而进行。
在一个进一步的实施方式中，所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)以渐增的流速向所述分批培养物中共补料而进行。
在一个进一步的实施方式中，所述诱导物是乳糖，其中优选地所述乳糖和所述主碳源以大约2∶1到1∶4(w/w)的比例向所述分批培养物中共补料。
在一个进一步的实施方式中，所述诱导物是IPTG，其中优选地所述培养基中所述IPTG的浓度是0.001到5mM，优选0.001到1mM，更优选0.005到1mM，更优选0.005到0.5mM。在一个非常优选的实施方式中，所述IPTG的浓度是大约0.01mM，最优选0.01mM。
在一个实施方式中，所述细菌宿主过量表达所述lacI，其中所述过量表达由lacIq或lacQ1引起，优选地由lacIq引起。在一个实施方式中，所述细菌宿主在其染色体上包含所述lacIq基因或所述lacQ1基因，优选所述lacIq基因。在一个进一步优选的实施方式中，所述细菌宿主在质粒上、优选地在高拷贝数的质粒上包含所述lacIq基因或所述lacQ1基因，优选所述lacIq基因。在一个进一步优选的实施方式中，所述细菌宿主在所述表达质粒上包含所述lacIq基因或所述lacQ1基因，优选所述lacIq基因。
在一个实施方式中，所述细菌宿主选自菌株大肠杆菌RB791、大肠杆菌DH20和大肠杆菌Y1088。优选地，所述细菌宿主是大肠杆菌RB791。
在一个实施方式中，所述细菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。
在一个实施方式中，所述培养和所述分批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在低于所述细菌宿主的最适生长温度的温度下进行。优选地所述温度在23℃到35℃之间，更优选25到33℃之间，更优选27到32℃之间，更优选28到31℃之间。更优选地所述温度为大约30℃，最优选地所述温度是30℃。
在一个实施方式中，所述培养和所述分批培养物的补料在低于所述细菌宿主的最适生长温度的温度下进行，优选地所述温度在23℃到35℃之间。更优选25到33℃之间，更优选27到32℃之间，更优选28到31℃之间。更优选地所述温度为大约30℃，最优选地所述温度是30℃，并且所述启动子的所述诱导在细菌宿主的最适生长温度下进行，优选地在大约37℃下进行。
在一个实施方式中，所述培养和所述批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在没有抗生素的条件下进行。
在一个特别的实施方式中，所述表达质粒包含或由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成，所述主碳源是甘油，所述分批培养物的补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，并且其中优选地所述指数系数μ低于μmax，通过向所述批培养基中共补料使所述启动子的所述诱导以一种恒定流速进行，其中乳糖和甘油以大约2∶1到大约1∶4(w/w)、优选大约1∶1到大约1∶4(w/w)、最优选大约1∶3(w/w)的比例向分批培养物中共补料，并且其中所述培养和所述分批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在27到32℃之间、优选大约30℃、最优选30℃的温度下进行。
在一个进一步特别的实施方式中，所述表达质粒包含或由核苷酸序列SEQ ID NO：30组成，所述主碳源是甘油，所述分批培养物的补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，并且其中优选地所述指数系数μ低于μmax，通过向所述分批培养物中共补料使所述启动子的所述诱导以一种恒定流速进行，其中乳糖和主碳源以大约2∶1到大约1∶4(w/w)、优选大约1∶1到大约1∶4(w/w)、最优选大约1∶3(w/w)的比例向分批培养物中共补料，并且其中所述培养和所述分批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在27到32℃之间、优选大约30℃、最优选30℃的温度下进行。
附图说明
图1：RB791中的pTac-nSD-Qb-mut(SEQ ID NO：1)在2升培养基中的发酵图。在生产阶段的共补料用包含20％甘油和20％乳糖的培养基进行。显示的是相对于时间[小时]的甘油浓度[g/l](圆形)、乳糖浓度[g/l](三角形)，β-Gal活性[U/ml*OD＝1](正方形)和OD600(菱形)。
发明详述
除非另外定义，此处所用的所有技术和科学词语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。
“大约”：在本申请的含义内，表述“大约”表示+/-10％的意思。例如大约100应该表示90到110。
此处使用的“可被乳糖诱导的启动子”指一种包含lac操纵子的调节元件的启动子。所述启动子被lacI阻遏并且可以被乳糖或合成诱导物IPTG诱导。熟练技术人员知道乳糖诱导启动子需要细菌宿主中的β-半乳糖苷酶活性。
“直接定位于3”’：直接定位于另一核苷酸序列N1的3’的核苷酸序列N2指具有5’-N1-N2-3’的构造的连续序列，其中N1和N2直接连接并且不被另外的序列元件分离。
“一段序列(sequence stretch)”：如此处所用的“一段序列”是指由少于50个、优选地少于20个、更优选地少于10个、更优选地少于5个核苷酸组成的连续核苷酸序列。在一个进一步优选的实施方式中，一段序列包含或由至少一个、优选一个TAA终止密码子组成。在另一实施方式中，一段序列包含或由至少一个、优选一个TAA和至少一个、优选一个TGA终止密码子组成。在进一步优选的实施方式中，一段序列包含或由SEQ ID NO：32组成。
“细菌宿主”：如此处所用的“细菌宿主”是指作为本发明的表达质粒的宿主或能够作为这种宿主的细菌生物体，其中“作为宿主”涉及表达质粒的复制和在细胞分裂过程中表达质粒的保持。
“培养物”：在本发明上下文中，“培养物”包含在培养基中的细菌宿主(“细菌培养物”)，其中典型地，所述培养基支持所述细菌宿主的生长。
如此处使用的“分批培养”涉及一种培养，也就是，在培养基中的细菌宿主，其中所述培养由一种封闭系统组成，也就是，典型并优选地，在培养过程中不添加或去除培养基。因此，与连续培养不同，典型并优选地，分批培养中的细菌宿主的密度随着培养时间的进行而连续增长。分批培养不排除添加过程控制需要的化合物，例如，诱导物、氧和控制pH的碱或酸。
“补料分批培养”：如此处使用的，是指用额外的培养基提供的培养，所述培养基包含底物，优选细菌宿主的主碳源(补料或共补料培养基)。在本申请的上下文中，该过程用术语“向所述分批培养物中补料”(培养基包含主碳源)和“向所述分批培养物中共补料”(培养基包含主碳源和诱导物，优选乳糖)表示。典型和优选地，在补料分批的培养过程中除了分析目的之外不去除任何培养基。
“预培养”：一种培养，优选分批培养，用于产生用于较大体积培养的接种物，例如其中生产重组衣壳蛋白的培养(生产培养)。预培养可以分两个或更多个步骤进行，其中第二预培养用第一预培养物等接种，以生产充分大量的用于生产培养的接种物。第一和/或随后的预培养物可包含抗生素以提高质粒稳定性。
“底物”：如此处使用，指在培养基中有助于细菌宿主的碳和能量供应的化合物。术语“底物”因此包括包含在培养基中的有助于细菌宿主碳供应的任何化合物。对于细菌的典型底物是糖、淀粉、甘油、醋酸酯和任何其他可被细菌代谢的有机化合物。因此，术语“底物”包括主碳源，而且，例如，乳糖。
此处使用的“主碳源”指培养基中在生长阶段对细菌宿主的碳和能量供应贡献最大的化合物。主碳源因此是细菌宿主的主要底物。主碳源典型地是糖，例如蔗糖或葡萄糖，或甘油，并且优选葡萄糖或甘油。尽管乳糖原则上可作为细菌宿主的主碳源，但是在本发明的上下文中，术语“主碳源”典型且优选地不包括乳糖。
本发明方法的阶段：本发明的特征是不同的阶段，不同的阶段是指细菌宿主就其生长和表达构建体的阻遏/诱导状态而言的不同生理条件。
“生长期”：生长期起始于在培养基中培养所述细菌。优选地，生长期的特征是驱动重组衣壳蛋白表达的启动子被阻遏的条件，而生长期终止于利用诱导物诱导所述启动子。生长期可进一步划分为“分批期”和“补料期”。所述分批期起始于在培养基中培养所述细菌宿主。分批期包括“延迟期”，在该期内细菌宿主不生长或以非指数速率生长，典型地和优选地以线性速率生长。生长期进一步包括一个直接在延迟期之后的“指数生长期”。在分批期不向所述培养物补料，因此指数生长期终止于底物被细菌宿主耗尽之时。生长期进一步包括一个直接位于分批期之后的“补料期”，补料期起始于向所述分批培养物中补加所述主碳源。补料期的特征是细菌宿主的生长速率直接依赖于包含主碳源的补料培养基的流速。
“生产期”：生长期之后是生产期，生产期起始于用一种诱导物诱导所述启动子，其中典型地和优选地继续向所述分批培养物中补加所述主碳源。
“启动子被阻遏的条件”：应当理解，启动子的阻遏是阻遏物-操纵子复合物的形成和解离的一种平衡，并且甚至被严格阻遏的启动子可能也在不存在诱导物的情况下显示出一定的表达率。因此，如本申请所用，术语“启动子被阻遏的条件”涉及在生长期的最后，也就是直接在向培养物中添加诱导物之前，重组衣壳蛋白的表达达到在培养基中的浓度不超过200mg/l、优选150mg/l、更优选100mg/l的水平的条件，所述浓度通过实施例17的HLPC方法测定。最优选地，重组蛋白的浓度低于所述方法的检测限度。
“诱导物”：在本发明中，术语“诱导物”涉及任何直接或间接与一种诱导型启动子相互作用并因此促进由所述启动子开始表达的物质；例如，“可被乳糖诱导的启动子”如lac或tac启动子的诱导物是IPTG、乳糖和异乳糖。
“外壳蛋白”/“衣壳蛋白”：术语“外壳蛋白”和在本申请中可互换使用的术语“衣壳蛋白”是指一种病毒蛋白，优选病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚单元，其可结合入病毒衣壳或VLP内。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物被称为“Qβ CP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”或“衣壳蛋白”包含“Qβ CP”和A1蛋白。
“重组衣壳蛋白”：由重组宿主细胞合成的衣壳蛋白。
“多肽”：如此处所用的术语“多肽”是指由氨基酸残基(通常是天然氨基酸残基)通过肽键互相连接组成的聚合体。尽管多肽可能在大小上没有限制，但术语多肽通常用于表示大小为大约10个到大约50个氨基酸的肽。
“蛋白质”：如此处所用的术语蛋白质是指通常大小在20个氨基酸残基以上、更特别地在50个氨基酸残基以上的多肽。蛋白质通常有确定的三维结构，虽然它们并不一定需要这样，并且通常被称为折叠的，这与通常不具有确定的三维结构而是能够采用大量不同的构象并且被称为非折叠的肽和多肽相反。
“重组宿主细胞”：如此处所用的术语“重组宿主细胞”是指一种或多种本发明的核酸分子已经被导入其中的宿主细胞。
“重组VLP”：如此处所用的术语“重组VLP”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。如此处所用的术语“重组生产的VLP”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。因此，“重组VLP”和“重组生产的VLP”在此是可互换使用的，应具有同等含义。
“RNA噬菌体”：如此处所用的术语“RNA噬菌体”是指感染细菌的RNA病毒，优选地指感染细菌的单链正义RNA病毒。
“病毒样颗粒(VLP)”：如此处所用的术语“病毒样颗粒”指一种类似于病毒颗粒的结构或指非复制的或非感染的、优选地非复制并且非感染的病毒颗粒，或指非复制或非感染的、优选非复制并且非感染的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。如此处所用的术语“非复制”是指不能复制VLP包含的基因组。如此处所用的术语“非感染”是指不能进入宿主细胞。优选地，根据本发明的病毒样颗粒是非复制和/或非感染的，因为它缺乏全部或部分病毒基因组或基因组功能。典型地，一种病毒样颗粒缺乏病毒基因组的全部或部分复制和感染成分。根据本发明的病毒样颗粒可以包含不同于它们的基因组的核酸。一种典型和优选的根据本发明的病毒样颗粒是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体、优选RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚单元组成的大分子装配体。典型地，有60、120、180、240、300、360和多于360个病毒蛋白亚单元。典型和优选地，这些亚单元的相互作用导致具有固有重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构的形成，其中所述结构典型地是球形或管状的。例如，RNA噬菌体衣壳或HBcAg具有二十面对称的球状形式。
“RNA噬菌体的病毒样颗粒”：如此处所用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指一种病毒样颗粒，其包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，或优选地基本由这些物质组成或由这些物质组成。另外，类似于RNA噬菌体结构的RNA噬菌体的病毒样颗粒是非复制的和/或非感染的，并且至少缺乏编码RNA噬菌体的复制机制的一种或多种基因，一般还缺乏编码负责病毒附着于宿主或进入宿主的一种或多种蛋白质的一种或多种基因。来源于RNA噬菌体的优选的VLP呈现为二十面对称体并且由180个亚单元组成。一种使RNA噬菌体的病毒样颗粒成为非复制和/或非感染的优选方法是通过基因操作。
一种：当本说明书中使用术语“一种”时，它们表示“至少一种”或“一种或一种以上”，除非有相反的说明。
“序列同一性”：多肽的氨基酸序列同一性可通过常规使用已知的计算机程序如Bestfit确定。当使用Bestfit或其他序列比对程序时，优选地利用Bestfit来确定一种特定序列是否与一种参考氨基酸序列(例如)95％相同，参数设置为在参考氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且参考序列中可达氨基酸残基总数的5％的同源性缺口是被允许的。前述确定多肽之间同一性百分比的方法对于本发明中公开的所有蛋白质、多肽或其片段是适用的。
“序列同源性”：核苷酸序列的同源性例如可通过blastn程序确定，该程序是BLAST算法的执行程序，优选地应用该软件的默认设置。
如此处所用的“蛋白质片段”，特别是重组蛋白或重组外壳蛋白的片段，定义为一种多肽，其分别具有野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且优选地保持形成VLP的能力。该片段优选地通过至少一个内部缺失、至少一个截短或至少一个其组合而获得。更优选地，该片段通过最多10个、最多9个、最多8个、最多7个、最多6个、最多5个、最多4个、最多3个或最多2个内部缺失；通过最多10个、最多9个、最多8个、最多7个、最多6个、最多5个、最多4个、最多3个或最多2个截短；或通过最多3个、优选最多2个、最优选正好一个其组合而获得。最优选地，该片段通过正好一个内部缺失、正好一个截短或通过其组合而获得。
术语“重组蛋白片段”或“外壳蛋白片段”应该进一步包括分别具有与如上定义的“重组蛋白片段”或“外壳蛋白片段”至少80％、优选90％、甚至更优选95％的氨基酸序列同一性并且优选地能够装配成病毒样颗粒的多肽。
在本发明中可互换使用的术语“突变重组蛋白”或术语“重组蛋白突变体”，或在本发明中可互换使用的术语“突变外壳蛋白”或术语“外壳蛋白突变体”，是指分别具有衍生于野生型重组蛋白或外壳蛋白的氨基酸序列的多肽。其中该氨基酸序列与野生型序列至少85％、90％、95％、97％或99％相同，优选地保持装配成VLP的能力。
本发明涉及一种生产噬菌体VLP的有效发酵方法。该方法提升了VLP的产量，并且可放大至商业生产规模。该方法包括噬菌体重组衣壳蛋白在允许衣壳蛋白自发自装配为VLP的条件下在细菌宿主中表达。
可通过本发明的方法生产的VLP的具体例子是噬菌体的VLP，优选RNA噬菌体的VLP。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的病毒样颗粒包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，或基本由这些物质组成，或由这些物质组成。优选地，RNA噬菌体选自a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7和m)噬菌体AP205。
在本发明的一个优选实施方式中，生产了包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的VLP，其中该外壳蛋白具有选自以下序列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：5，指QβCP；(b)SEQ ID NO：5和SEQID NO：15的混合物(QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：16(R17衣壳蛋白)；(d)SEQ ID NO：17(fr衣壳蛋白)；(e)SEQ ID NO：18(GA衣壳蛋白)；(f)SEQ ID NO：19(SP衣壳蛋白)；(g)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的混合物；(h)SEQ ID NO：21(MS2衣壳蛋白)；(i)SEQ ID NO：22(M11外壳蛋白)；(j)SEQ ID NO：23(MX1衣壳蛋白)；(k)SEQ ID NO：24(NL95衣壳蛋白)；(l)SEQ ID NO：25(f2衣壳蛋白)；(m)SEQ ID NO：26(PP7衣壳蛋白)；和(n)SEQ ID NO：12(AP205衣壳蛋白)。
在大肠杆菌中表达时，Qβ外壳蛋白的N-末端甲硫氨酸通常被去除(Stoll，E.等人.J.Biol.Chem.252：990-993(1977))。由N-末端甲硫氨酸已被去除的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或包含N-末端甲硫氨酸被切除或仍然存在的Qβ外壳蛋白混合物的VLP也在本发明的范围之内。
在本发明的一个优选实施方式中，VLP是一种嵌合VLP，其包含或由RNA噬菌体外壳蛋白、其突变体或片段的多于一种氨基酸序列、优选两种氨基酸序列组成。
在一个非常优选的实施方式中，VLP包含或由两种不同的RNA噬菌体外壳蛋白组成，所述两种外壳蛋白具有氨基酸序列SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。
在本发明的优选实施方式中，生产的VLP包含、或基本由、或由RNA噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。
在一个优选实施方式种，VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。Qβ的衣壳或病毒样颗粒显示出具有25nm直径和T＝3准对称的二十面体噬菌体样衣壳结构。该衣壳包含衣壳蛋白的180个拷贝，它们通过二硫桥以共价五聚体和六聚体连接(Golmohammadi，R.等人.Structure4：543-5554(1996))。
优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒，特别是根据本发明的Qβ和fr的病毒样颗粒，在WO02/056905中公开，该公开文本在此全文引入作为参考。WO02/056905的实施例18给出了由Qβ制备VLP颗粒的详细描述。
在另一个优选实施方式中，VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。AP205VLP的有装配能力的突变体形式，包括在氨基酸5位的脯氨酸被替换为苏氨酸的AP205外壳蛋白，也可用于本发明的实践中，并且导致了本发明的其他优选实施方式。WO2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP，由此特别描述了其表达和纯化。WO2004/007538在此引入作为参考。
在一个优选实施方式中，VLP包含或由病毒、优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中该突变外壳蛋白已经通过取代和/或缺失而去除了至少一个赖氨酸残基而被修饰。在另一优选实施方式中，本发明的VLP包含或由病毒、优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中该突变外壳蛋白已经通过取代和/或插入而添加了至少一个赖氨酸残基而被修饰。缺失、取代或添加至少一个赖氨酸残基允许改变与抗原的偶联程度。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面上展示限定数量的赖氨酸残基，其限定的拓朴学结构为三个赖氨酸残基指向衣壳内部并与RNA相互作用，并且另外四个赖氨酸残基暴露于衣壳外部。
暴露的赖氨酸残基被精氨酸取代的Qβ突变体也包含在本发明中。优选地，这些突变外壳蛋白包含或由选自下组的氨基酸序列组成：a)Qβ-240(SEQ ID NO：7，Lys13→Arg)；b)Qβ-243(SEQ ID NO：8，Asn10→Lys)；c)Qβ-250(SEQ ID NO：9，Lys2→Arg)；d)Qβ-251(SEQID NO：10，Lys16→Arg)；和e)Qβ-259(SEQ ID NO：11，Lys2→Arg，Lys16→Arg)。上述提到的Qβ突变外壳蛋白、突变的Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别描述于WO02/056905中。特别参考上述申请的实施例18。
在一个进一步优选的实施方式中，重组衣壳蛋白是具有SEQ IDNO：12所示氨基酸序列的噬菌体AP205的衣壳蛋白或其突变体，它能够形成VLP，例如蛋白质AP205P5T(SEQ ID NO：13)或AP205N14D(SEQ ID NO：14)。
在一个非常优选的实施方式中，所述重组衣壳蛋白由大肠杆菌RNA噬菌体Qβ的133个氨基酸的外壳蛋白C组成，该外壳蛋白C包含或优选地由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成，其中优选地所述重组衣壳蛋白能够通过自装配形成VLP。
在一个实施方式中，表达构建体包含第一终止密码子和第二终止密码子，其中所述第一终止密码子直接定位于所述第一核苷酸序列的3’，并且所述第二终止密码子直接定位于所述第一终止密码子的3’，并且其中第一或第二终止密码子中的至少一个是TAA。例如，质粒pTac-nSDAP205(SEQ ID NO：30)包含天然存在的TAA终止密码子作为第一终止密码子和附加的直接位于第一终止密码子3’的TGA终止密码子。
在一个优选实施方式中，表达构建体包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码一种重组衣壳蛋白，优选QβCP，或其突变体或片段，最优选地是SEQ ID NO：5，并且其中所述第二核苷酸序列编码任一其他蛋白质，优选Qβ A1蛋白或其突变体或片段，最优选地是SEQ ID NO：15，并且其中所述第一和第二核苷酸序列被正好一个包含至少一个TAA终止密码子的一段序列隔开。在一个实施方式中，所述TAA终止密码子通过将天然存在的终止密码子(优选TGA)置换为序列TAA而产生。可选地并且更优选地，所述TAA终止密码子通过将天然存在的终止密码子(优选TGA)置换为序列TAATGA(SEQ ID NO：32)而产生。
例如，Qβ基因C区域对应于NCBI genebank登录号M99039(核苷酸46-1062)。基因C包含编码133个氨基酸的Qβ外壳蛋白(SEQ IDNO：5)的第一核苷酸序列和编码329个氨基酸的通读蛋白A1((SEQ IDNO：15)的第二核苷酸序列。SEQ ID NO：6的核苷酸1-399(NCBI
GenBank登录号M99039的核苷酸46-444)对应于所述编码133个氨基酸的QβCP的所述第一核苷酸序列，SEQ ID NO：6的核苷酸400到402对应于强TAA终止密码子，并且SEQ ID NO：6的403到405对应于渗漏TGA终止密码子，其后紧跟着是所述第二核苷酸序列(QβA1)。令人吃惊的是，发现在表达构建体中与A1有关的核苷酸序列的存在导致更高的RNA稳定性，因此，导致与A1序列缺失的构建体相比提高的QβCP和VLP的产量。
重组蛋白的表达可显著降低细菌宿主的生长速率，这是由于累积的蛋白质的毒性效应和由蛋白质合成引起的代谢负担。特别地，可能会发生细胞裂解和低质粒保持。诱导型启动子提供了将发酵过程的生长期与生产期分开的可能性。诱导型启动子在细菌宿主的生长期中被一种阻遏物分子阻遏，在生产期中通过将细菌宿主暴露于诱导环境而被诱导。诱导型启动子因此允许细菌宿主快速生长，优选地在生长期内以对数速率生长并到达高细胞密度。因此，诱导型启动子在生产期结束时提供了表达产物的高产量。因此，优选地将诱导型启动子用于重组蛋白的表达。
诱导型启动子的一种公知的例子是lac启动子，其形成了lac操纵子的一部分，并可通过添加乳糖或强合成诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)到细菌宿主的生长培养基中而被诱导。Donavan等人.2000(Can.J.Microbiol 46：532-541)报道了一种在lac启动子的控制下表达单克隆抗体的改进的方法。诱导型启动子的进一步的例子在Makrides 1996(Microbiological Reviews，p.512-538)的表1中提供。
基于诱导型启动子的表达系统的一个典型缺陷是启动子的“渗漏性”，意思是启动子在生长期中被不充分地阻遏而引起重组蛋白的一定的表达率。这典型地导致细胞密度降低或导致质粒的不稳定性，并且，结果导致重组蛋白的产量降低。Makrides 1996(MicrobiologicalReviews，p.512-538)。倾向于不充分阻遏的启动子的一个例子是VHb启动子，其在高氧条件下被阻遏并且在缺氧时被诱导。
为了本发明的目的，优选被严格阻遏的启动子。在一个实施方式中，启动子被阻遏物lacI阻遏。所述启动子的例子公开于Makrides1996(Microbiol.Rev.60：512-538)、Goldstein和Doi 1995(Biotechnology Annual Review 1：105-128)、Hannig和Makrides 1998(TIBTECH 16：54-60)和Stevens 2000(Structures 8，R177-R185)中。在一个优选实施方式中，启动子被乳糖诱导，更优选地选自lac、lacUV5、tac、trc、Psyn lppa、lpp-lac、T7-lac、T3-lac和T5-lac。对于本发明的目的特别优选的是tac启动子(SEQ ID NO：2)或其突变体或变体。在本发明的范围内包括与SEQ ID NO：2具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％、优选98％到100％、最优选99％的序列同源性的tac启动子的突变体或截短或缺失变体。其中所述突变的截短或缺失变体的启动子的强度与SEQ ID NO：2的启动子强度相当。熟练技术人员可以利用标准方法通过比较表达研究确定给定序列的启动子强度。在一个本发明的特定实施方式中，驱动重组衣壳蛋白表达的启动子包含或由SEQ ID NO：2组成。Tac启动子是lacUV5启动子的-10区和trp启动子的-35区的融合产物，并且将trp的高转录效率和lac启动子的调节元件结合起来(de Boer等人.1983，PNAS 80：21-25；Amann等人.1983 Gene 25：167-178)。它提供了充分的高表达率和高蛋白产量，同时避免了在使用更强的启动子例如T7启动子时可能出现的不溶性的或不正确折叠的重组蛋白的形成。Trc和tic启动子是tac启动子的突变形式(Brosius等人.1985，The Journal of BiologicalChemistry 260(6)：3539-3541)。在一个进一步优选的实施方式中，启动子选自tic、trc和tac。
为了为本发明目的构建表达构建体，启动子通过核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列，SD)与所述编码重组衣壳蛋白的第一核苷酸序列有效连接，典型地在其3’末端包含ATG起始密码子。适合本发明目的的Shine-Dalgarno序列是本领域公知的
Figure A20068002362000221
等人.1988，DNA7(6)：399-405；Ringquist等人.1992，Mol.Micr.6：1219-1229)。在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含SEQ ID NO：4所示的
Figure A20068002362000222
等人.1988(DNA 7(6)：399-405)的SD序列。在另一个优选的实施方式中，表达构建体包含Ringquist等人.1992(Mol.Micr.6：1219-1229，SEQID NO：3，nSD)的Shine-Dalgarno序列。令人吃惊的是，发现SEQ IDNO：3特别适合于本发明，因为它导致重组衣壳蛋白的表达水平提高和产量提高。SEQ ID NO：3特别适合提高AP205衣壳蛋白的表达。在一个本发明的优选实施方式中，表达构建体包含选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的Shine-Dalgarno序列，优选地所述Shine-Dalgarno序列是SEQ ID NO：3。
转录终止子是表达构建体的功能型元件。熟练技术人员将可以从广泛的来源中选择适当的终止子序列。在一个本发明的优选实施方式中，所述表达构建体包含一种终止子序列，其中优选地所述终止子序列与所述第一核苷酸序列有效连接，其中进一步优选地，所述终止子序列是rRNB终止子序列，最优选SEQ ID NO：28。
为了质粒选择的目的，熟练技术人员一般利用抗生素抗性标记基因。广泛用于本领域并且适于本发明目的的抗生素抗性基因的例子是抗生素氨苄青霉素、四环素、卡那霉素抗性基因。通常优选利用卡那霉素作为生产VLP的方法中的选择试剂，因为卡那霉素与可选的抗生素相比具有更低的变应原潜力，并且利用VLP作为疫苗导致更低的安全性问题。而且，卡那霉素与可选的抗生素如氨苄青霉素相比提供了更好的质粒保持。源于转座子Tn903的卡那霉素3’-磷酸转移酶基因(SEQ ID NO：29)因此是特别有用的选择性标记基因。
出于成本和安全方面的原因，向培养基中添加抗生素通常在商业生产过程中是不期望的。在本发明的上下文中，选择表达株典型且优选地使用抗生素，优选卡那霉素。生产过程中使用的培养基基本上没有抗生素，特别是卡那霉素。然而，添加抗生素到用于生产接种物(用于生产培养)的预培养物中可在整个过程中提高质粒的保持(实施例10)。
熟练技术人员通过利用分子生物学的标准方法结合上述基因元件可产生包含表达构建体的表达质粒，所述构建体对于生产噬菌体的VLP是有用的。对于本发明目的特别有用的表达质粒是用于Qβ VLP生严的pTac-nSDQb-mut(SEQ ID NO：1)和用于AP205 VLP生产的pTac-nSDAP205(SEQ ID NO：30)。这些特定表达质粒的构建在实施例部分详细描述。
通过任何本领域已知的方法，优选地通过电穿孔，将表达质粒转化入细菌表达宿主中。在细胞裂解后通过SDS-PAGE根据重组衣壳蛋白的最大表达选出包含表达质粒的宿主的个别克隆。选出的包含表达质粒的表达宿主的克隆可储存为冷冻的甘油培养物。
所述细菌宿主可以选自任何在细胞分裂过程中能够复制和保持所述表达质粒的细菌菌株。优选的细菌宿主是具有以下部分描述的特定特征的大肠杆菌菌株。
细菌宿主过量表达阻遏物可增强启动子的阻遏。在一个实施方式中，所述细菌宿主的所述培养以分批培养的方式在所述启动子被lacI阻遏的条件下进行。在一个优选实施方式中，引起所述lacI在所述细菌宿主中过量表达的基因定位于质粒上，优选地定位于所述表达质粒上。可选地，所述基因定位于包含在所述细菌宿主中的分离质粒上，其中所述分离质粒优选地是高拷贝数的质粒。可选地，并且最优选地，所述基因定位于所述细菌宿主的染色体上。
导致lacI过量表达的一个例子是lacIq(Menzella等人.2003，Biotechnology and Bioengineering 82(7)809-817)，其在lacI启动子区域的-35处有一个CG到TA的改变，引起lacI表达的提高10倍。另一个例子是lacIQ1(Glascock和Weickert 1998，Gene 223(1-2)：221-231)。在生长期中增强的启动子阻遏导致增强的质粒保持和更高的细胞密度，最终导致提高的蛋白质产量。例如，包含lacIq基因的细菌菌株过量表达lacI阻遏物分子并且因此在生长期比包含野生型基因的菌株相比更有效地阻止重组蛋白的形成。在一个优选实施方式中，导致所述lacI过量表达的基因是lacIQ1或lacIq，优选lacIq。在一个特别优选的实施方式中，所述细菌宿主在其染色体上包含lacIq基因。
在一个实施方式中，所述启动子的所述诱导利用诱导物进行，其中所述诱导物优选地选自IPTG和乳糖，最优选地所述诱导物是乳糖。细菌宿主暴露于诱导物时，阻遏物被灭活而启动子成为有活性的。添加强诱导物IPTG到培养基中导致重组蛋白的表达率立即上升到高水平，因为IPTG通过扩散直接进入细胞并且结合并灭活活性阻遏物lacI。失活的lacI阻遏物分子从操纵子上解离下来，并且允许从启动子开始高水平转录。IPTG不被细胞代谢并且转录以高比率持续直到其他代谢参数成为限制性的。
如以前提到的，高表达率可能导致不能通过自装配形成VLP的不溶性重组蛋白的形成。利用高浓度IPTG诱导蛋白质表达特别倾向于形成不溶性蛋白质。因此，启动子的诱导优选地通过以低于导致发生最大表达率表达的浓度的浓度添加IPTG来实现(Kopetzki等人.1989，Mol Gen Genet 216：149-155)。
在一个优选实施方式中，所述启动子的所述诱导利用IPTG进行，其中培养基中所述IPTG的浓度为大约0.001到5mM，优选0.001到1mM，更优选0.005到1mM，更优选0.005到0.5mM。在一个特别优选的实施方式中，所述IPTG的浓度为大约0.001mM，最优选0.001mM。
可选地，启动子的诱导通过添加乳糖而实现。利用乳糖诱导重组蛋白表达需要细菌宿主能够从培养基中吸收乳糖，例如，通过Lac通透酶吸收乳糖，并且需要细菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。细胞依赖Lac通透酶吸收乳糖的动力学比通过扩散吸收IPTG遵循更慢。而且，乳糖不直接与lac操纵子作用，但是被β-半乳糖苷酶转化为异乳糖(1-6-O-β-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖)，异乳糖是启动子的实际上的诱导物。通过添加乳糖诱导重组蛋白表达是有益的，因为它避免了表达率在添加诱导物后立即增加到最大值，因而降低了不溶性蛋白质形成的风险。
异乳糖在生产期被细菌宿主代谢，并且对细菌代谢贡献碳和代谢能量。与用IPTG诱导相比这可以进一步有助于提高蛋白质产量。而且，乳糖诱导在一定程度上允许通过培养基中的乳糖浓度控制重组蛋白在生产期中的表达率。乳糖诱导进一步在药物生产过程中是优选的，因为IPTG是昂贵的并且被认为是有毒的。它的去除需要在生产过程的最后进行证明。
在一个优选实施方式中，所述启动子的所述诱导是通过添加乳糖到所述分批培养物中进行的，其中优选地所述细菌宿主能够从培养基中吸收乳糖，并且其中进一步优选地所述细菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。所述细菌菌株可以获自，例如，菌株保藏机构，如ATTC(http://www.atcc.org)。在一个优选实施方式中，所述细菌宿主是大肠杆菌菌株，优选地是选自RB791、DH20、Y1088、W3110和MG1655的大肠杆菌菌株。最优选地，所述细菌宿主是大肠杆菌RB791。在一个更优选的实施方式中，所述启动子是tac启动子或其突变体或变体，并且所述细菌宿主是进一步包含导致tac启动子的阻遏物过量表达的基因的大肠杆菌菌株，其中所述基因优选地是lacIq。细菌宿主的培养基的pH可在发酵过程中控制，通过利用本领域公知的方法添加酸性或碱性溶液而调整。在一个实施方式中，所述细菌宿主的培养和所述分批培养物的补料在控制培养基的pH的条件下进行。在一个优选实施方式中，所述pH在5.5到8.0之间，更优选在6.5到7.5之间，更优选在6.7到7.0之间，最优选地所述培养基的pH是6.8。所述培养基的pH可在过程中保持恒定，或可在过程的不同阶段在上述pH范围内遵循某种分布。在一个优选实施方式中，所述pH保持恒定在6.7到7.0之间的值，优选地所述pH保持恒定在6.8。
本发明的方法包含生长期，其中所述生长期包含分批期和补料期，其中所述生长期和同时的所述分批期起始于所述细菌宿主的培养，并且其中所述补料期起始于用所述主碳源对所述分批培养物的补料。
细菌细胞的氧化能力是有限的，底物的高浓度可能导致还原产物例如醋酸盐的形成，其可能导致不期望的培养基的酸化，并导致细菌的生长减慢。因此，细菌宿主在具有有限量的底物的基本培养基上以补料分批培养的方式生长。在一个实施方式中，所述细菌宿主的培养在包含所述主碳源的培养基中进行，其中所述培养基优选地是一种基本培养基，优选一种化学成分确定的基本培养基。最优选地所述培养基是如实施例5所述的R27培养基。
在分批期的最后，当包含在培养基中的底物几乎被耗尽时，用包含主碳源的培养基(补料培养基)以与期望的细菌宿主生长速率相同的速率向所述分批培养物中补料，即，细菌宿主的生长速率被底物的补料速率所限制。熟练技术人员可以理解决定性的参数是底物(优选主碳源)和其他保持生长所需的营养成分的实际物质流量。由于在实践中可以设定补料培养基的恒定组成，流速是指培养基的体积流量。对共补料培养基有同样的考虑(见下面)。
因此，在一个实施方式中，用所述主碳源对所述分批培养物的补料以一定的流速进行，其中所述流速限制了所述细菌宿主的生长速率。
在补料期，如果不发生抑制，生长速率可在几乎高达最大生长速率(μmax)的宽范围内自由选择。μmax的实际值高度依赖于细菌菌株、表达构建体和生长条件。熟练技术人员将能理解μmax的确定在启动子被阻遏的条件下进行。
对于给定的试验设置，μ可通过以下步骤由培养生长曲线确定：将例如根据OD600或细胞湿重(CWW)确定的生物量浓度(x)对培养时间作图，并基于等式x＝x0eμt确定指数生长系数μ。μmax的实际值被确定为当不发生底物限制时，即在不通过补料提供附加培养基的情况下，指数生长的分批培养物在分批培养期开始时的生长速率μ。生长速率μ可通过计算在时间t2测量的总生物量X2的自然对数和在时间t1测量的总生物量X1的自然对数的差与时间差(t2-t1)的比值来确定：μ＝(lnX2-lnX1)/(t2-t1)。
补料分批培养允许保持恒定的生长速率(μ)。在一个优选实施方式中，底物，优选主碳源，在补料期根据生物量(x)的指数增长而补加。如果在补料期以与消耗速率相同的速率提供底物，则培养处于准稳定状态，类似于在连续培养中的培养。由于生物量的形成和底物消耗是以参考底物的产率系数Yx/s(生物量[g]/底物[g])相互联系，每时间单元(t)待提供的底物量(s)根据公式ds/dt＝μ/Yx/sx0toteμt计算，其中x0tot是在补料开始时的总生物量。
因此，在一个优选实施方式中，利用所述主碳源对所述分批培养物的补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，并且其中优选地所述指数系数μ低于μmax。因此，所述细菌宿主在补料期的生长速率设定为低于μmax的数值。在一个优选实施方式中，所述指数系数μ大约为μmax的30％到70％，最优选地大约为μmax的50％。在本发明的一个特定实施方式中，μ被设定为0.15到0.45h-1、更优选0.25到0.35h-1的绝对值、最优选地μ为0.3h-1，只要该方法的设置使这些数值小于μmax。
细菌能够利用广泛范围的不同底物。对于本发明的目的，优选的主碳源是葡萄糖和甘油，优选甘油。虽然可以达到的表达宿主的最大比生长速率(μmax)在利用葡萄糖时比利用甘油时更高，但是甘油引起更少的醋酸盐形成并提供每份底物更高的生物量(Yx/s)，并且最终提供更高的重组蛋白产量。而且，液体底物甘油的处理比固体碳源如葡萄糖更容易，固体碳源的处理需要在一个独立的步骤中溶解。
如前面提到的，质粒的保持，即表达质粒在发酵过程中在细菌宿主中的保持，对于重组蛋白的最优生产是关键的。质粒保持的评价可通过将细菌细胞涂布在固体培养基上形成单个菌落，并测试各个菌落的抗生素抗性。例如，100％的质粒保持意味着100个测试菌落中有100个包含由表达质粒赋予的特定抗生素抗性。对于本发明的目的，在发酵过程的最后质粒保持高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，甚至更优选高于97％，最优选为100％。
细菌菌株的最适生长温度是其达到最大生长速率(μmax)时的温度。在其他的非限制性条件下，对于大多数大肠杆菌菌株，该温度为大约37℃。然而，包含表达构建体的细菌菌株在最适生长温度和没有选择性抗生素条件下的生长可能促进表达质粒的损失，而当表达菌株在较低的温度下生长时质粒保持通常被提高。尽管与在最适生长温度下生长时相比，菌株在低于其最适生长温度的温度下生长时表达菌株的最大生长速率较低，但是由于质粒保持提高，在较低温度下重组蛋白的产量可能相同或甚至更好。
在本发明的一个实施方式中，所述细菌宿主的培养和/或利用所述主碳源对所述分批培养物的补料和/或利用诱导物诱导所述启动子在低于所述细菌宿主的最适生长温度的温度下进行。在一个优选实施方式中，所述温度在20到37℃之间，优选地在23到35℃之间，更优选地在25到33℃之间，甚至更优选地在27到32℃之间，更优选在28到31℃之间。更优选地所述温度大约是30℃，最优选地所述温度是30℃。
本发明的方法包含生产期，其中所述生产期起始于用一种诱导物诱导所述启动子。所述生产期起始的时间点可基于培养时间和/或生长参数而确定。
在发酵过程中细菌宿主的生长可通过测定在600nm下的光密度(OD600)、细胞湿重(CWW[g/l])和细胞干重(CDW[g/l])而评价。这些参数可用于确定通过向培养基中添加诱导物(优选乳糖)启动生产期的最佳时间点。熟练技术人员显然知道，一方面在生产期起始时较高的CWW可通过延长补料期而获得并且可导致重组蛋白的产量提高，但是另一方面，过于老化的培养物可能表现出不充分的蛋白表达。因而需要对特定生产条件确定通过用诱导物诱导所述启动子而启动的生产期起始的最佳时间点。例如，对于总体积为2升的大肠杆菌RB791中的Qβ CP表达，诱导开始于大约14小时之后，当OD600达到大约40到60时。令人惊讶的是，在50升规模的同样过程中发现了类似的参数，其中诱导也开始于大约14小时之后，当OD600达到大约50时。
因此，在本发明的一个实施方式中，利用所述诱导物对所述启动子进行所述诱导在开始所述生长期后10小时到16小时进行，优选地在12小时到15小时之后，更优选地在13小时到15小时之后，最优选地在大约14小时之后进行，其中优选地在OD600达到大约40到60、优选大约50时利用所述诱导物对所述启动子进行所述诱导。
在一个进一步的实施方式中，利用所述诱导物对所述启动子的所述诱导在延长的补料期之后进行，其中优选地在开始在培养基中培养所述细菌宿主14小时到20小时之后，优选地在15到18小时之后，更优选地在16小时到17小时之后，最优选地在大约16.5小时之后，利用所述诱导物对所述启动子进行所述诱导，其中优选地在OD600达到大约80到90时、优选大约85时利用所述诱导物对所述启动子进行所述诱导。
在本发明的一个实施方式中，利用所述诱导物对所述启动子的所述诱导在OD600达到数值25到60、优选25到55、更优选30到50、最优选30到40时进行。在一个特别优选的实施方式中，利用所述诱导物对所述启动子的所述诱导在OD600为35时进行。
在本发明的另一实施方式中，利用所述诱导物对所述启动子的所述诱导在延长的补料期之后，当OD600达到值60到120、优选70到110、更优选80到100、最优选80到90时进行。在一个特别优选的实施方式中，在延长的补料期之后，当OD600为大约85时，优选为85时，开始诱导。
利用IPTG的诱导：在本发明的一个实施方式中，利用诱导物对所述启动子的所述诱导通过添加IPTG实现，其中优选地继续用主碳源对培养物进行补料。由于IPTG不被细菌宿主代谢，可通过单次添加IPTG达到期望的浓度而实现诱导。可选地，可通过将IPTG连续流加到培养物中而实现诱导。在一个优选实施方式中，可通过以单次添加或连续流加的方式添加IPTG进行诱导，其中用主碳源向分批培养物中的所述补料以所述主碳源的恒定的或渐增的流速持续，主碳源的流速以指数增加。
利用乳糖的诱导：如上所述，蛋白质表达的诱导可选地通过添加乳糖到培养基中而获得。在本发明的一个实施方式中，在生产期开始时，中断底物的指数补料，并且以恒定流速向培养物中提供包含100到300g/l、优选100g/l乳糖作为唯一碳源的诱导培养基(乳糖补料培养基)。优选地，乳糖的恒定流速大约等于在补料期最后的底物流速。
在本发明的一个优选实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过添加乳糖而获得，其中优选地所述乳糖以连续流加方式补加到所述分批培养物中，并且优选地，不继续用所述主碳源对所述分批培养物进行补料。
在添加乳糖到培养物中后，β-半乳糖苷酶活性增加，乳糖转化为异乳糖，异乳糖诱导tac启动子，启动了重组衣壳的表达。平行地，异乳糖进一步被代谢并且有助于对细菌宿主的能量供应。诱导培养基的补料速率和细胞的乳糖消耗的平衡因此决定了表达率。该级联中涉及的酶反应允许以包涵体形成被最小化的方式控制该过程。诱导步骤的进程可通过确定培养物中的β-半乳糖苷酶活性而监测，例如，通过使用β-半乳糖测试试剂盒(Invitrogen，K1455-01)。
在本发明的一个更优选的实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过添加乳糖而获得，其中优选地所述乳糖以连续流加方式补加到所述分批培养物中，并且其中优选地，继续用所述主碳源对所述分批培养物进行补料。
诱导物的不连续添加：所述诱导物可通过在生产期开始时单次添加或通过在生产期中少数几次随后的添加而不连续地添加到培养物中。当诱导物是IPTG时，诱导物的不连续添加，特别是单次添加是特别适合的，因为IPTG不被细菌宿主所代谢。因此，典型地和优选地，在生产期中替换被代谢的IPTG是不必要的。在一个实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过添加所述诱导物到培养基中而进行，所述诱导物优选为IPTG或乳糖，最优选为IPTG，其中所述诱导物在生产期开始时通过单次添加马上添加到大约其最终浓度，其中优选地继续用所述主碳源对所述分批培养物进行补料。在一个优选实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过添加IPTG到所述培养基中进行，其中所述IPTG通过单次添加马上添加到大约其最终浓度，其中优选地，继续用所述主碳源对所述分批培养物进行补料。可选地，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过添加所述诱导物到所述培养基中而进行，所述诱导物优选为IPTG或乳糖，最优选为乳糖，其中所述添加在生产期中分几个步骤进行，优选为1到5个，更优选2到4个，最优选3个步骤，其中优选地继续用所述主碳源对所述分批培养物进行补料。
诱导物的连续添加(补料)：优选地，所述诱导物以连续流加方式添加到培养基中，优选地贯穿生产期之中。诱导物的连续添加特别适合于乳糖，因为乳糖被细菌宿主代谢，因此在生产期中连续添加乳糖允许在培养基中保持一定的乳糖浓度，这允许启动子的有效诱导。在一个优选实施方式中，用所述诱导物对所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物向所述分批培养物中补料而进行，其中优选地所述诱导物是IPTG或乳糖，最优选乳糖，并且其中所述补料以连续流加方式进行，其中进一步优选地所述补料在整个生产期之中进行。
诱导物和主碳源的共补料：重组蛋白的表达是一种需要能量的过程。为防止可能由细菌宿主过度消耗诱导物引起的产量损失和其导致的低表达率，可在生产期中向培养物中另外补充底物，优选主碳源，其中诱导物和/或主碳源的流速是恒定的或渐增的，优选是恒定的。当在生产期中以渐增的流速向培养物中补充底物时，流速优选地以指数速度增长。
以恒定流速共补料：在一个优选实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物和所述主碳源向所述分批培养物中共补料而进行，其中所述诱导物优选是IPTG或乳糖，最优选是乳糖，并且其中所述主碳源是葡萄糖或甘油，优选甘油，其中所述诱导物，优选乳糖和所述主碳源，优选甘油，以一定流速向所述分批培养物中共补料，其中所述流速优选地是大约恒定的。在一个进一步优选的实施方式中，选择所述流速以允许以与生长期最后大致相同的速率补加所述主碳源到所述分批培养物中。在一个进一步优选的实施方式中，所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)包含在同一培养基(共补料培养基)中。在一个进一步优选的实施方式中，所述共补料培养基以一定的流速补加到所述分批培养物中，其中所述流速优选大约是恒定的，并且其中进一步优选地选择所述流速以允许以与生长期最后大约相同的速率补加所述主碳源到所述分批培养物中。在一个非常优选的实施方式中，所述培养物是乳糖并且所述主碳源是甘油，其中所述乳糖和所述甘油以大约2∶1到1∶4的比例(w/w)向所述分批培养物中共补料。
在本发明的进一步优选的实施方式中，乳糖和所述主碳源，优选甘油，以0∶1到1∶0(w/w)、优选大约2∶1到大约1∶4(w/w)、更优选大约1∶1到1∶3(w/w)、最优选大约1∶3(w/w)的比例向所述分批培养物中共补料。在一个优选实施方式中，乳糖和主碳源(优选甘油)的比例是1∶1(w/w)。在另一个优选实施方式中，乳糖和主碳源(优选甘油)的比例是1∶3(w/w)。在一个更优选的实施方式中，所述共补料培养基包含大约200g/l乳糖和大约200g/l甘油。在一个更优选的实施方式中，共补料培养基包含大约100g/l乳糖和大约300g/l甘油。
以渐增的流速共补料：可选地，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物和所述主碳源向所述分批培养物中共补料而进行，其中所述诱导物优选是IPTG或乳糖，最优选乳糖，并且其中所述主碳源是葡萄糖或甘油，优选甘油，其中所述诱导物，优选乳糖和所述主碳源，优选甘油，以一定的流速向所述分批培养物中补料，其中所述流速是渐增的，其中所述流速可以线性或指数特征增加，其中优选地选择起始流速以允许以与生长期最后大约相同的速率将所述主碳源补加到所述分批培养物中。
进一步可选地，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物和所述主碳源向所述分批培养基中共补料而进行，其中所述诱导物优选为IPTG或乳糖，最优选为乳糖，并且其中所述主碳源是葡萄糖或甘油，优选甘油，其中所述诱导物，优选乳糖，以第一流速补加到所述分批培养物中，并且其中所述主碳源，优选甘油，以第二流速补加到所述分批培养物中，其中所述第一流速是恒定的或渐增的，优选恒定的，并且其中所述第二流速是恒定的或渐增的，优选渐增的，其中优选地选择所述第二流速的起始流速，以允许以与生长期最后大约相同的速率将所述主碳源补加到所述分批培养物中。在一个非常优选的实施方式中，所述诱导物是乳糖并且所述主碳源是甘油，其中所述乳糖和所述甘油以大约2∶1到1∶4(w/w)的比例向所述分批培养物中共补料。
通过CDW、CWW或OD600确定的细菌宿主的生长在生产期过程中以低于生长期并且随时间降低的生长速率持续。在本发明的一个进一步的实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过以渐增的流速用所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)向所述分批培养物中共补料而进行，优选地流速的增加适合培养物的实际生长速率。在一个进一步优选的实施方式中，所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)包含在同一培养基(共补料培养基)中，其中优选地乳糖和甘油在所述培养基(共补料培养基)中的比例范围是从大约0∶1到1∶0(w/w)，优选大约2∶1到大约1∶4(w/w)，更优选大约1∶1到1∶3(w/w)，最优选的比例是大约1∶3(w/w)。在一个优选实施方式中，乳糖和主碳源(优选甘油)的比例是1∶3(w/w)。在一个更优选的实施方式中，所述培养基(共补料培养基)包含大约200g/l乳糖和大约200g/l甘油。在一个更优选的实施方式中，诱导培养基包含大约100g/l乳糖和大约300g/l甘油。
在本发明的一个实施方式中，用诱导物对所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)向所述分批培养物中共补料而进行，其中所述诱导物(优选乳糖)和所述主碳源(优选甘油)包含在分别的培养基中，所述培养基分开补加到所述培养物中。
在生产期结束时，通过离心收获细胞。一般在诱导起始后大约5小时，当最终OD600达到90到130时收获细胞。生产期的进一步延长导致更高的OD600和CWW值，并且因此导致表达构建体的产量进一步提高。
收获的细胞可在储存缓冲液中悬浮，并且储存在-80℃下，用于进一步的处理。
在细胞裂解后通过SDS PAGE或LDS PAGE并与蛋白标准比较而确定细胞的总蛋白质含量。可溶性蛋白质的含量通过HPLC确定。表达的衣壳蛋白的身份通过western blotting确定。装配的VLP的浓度可通过大小排阻色谱法进行分析(实施例18)。VLP可通过色谱方法从裂解的细胞中制备纯化。
仅仅只进行小的修改就可将本发明的方法放大为大体积。本发明包括在100毫升到6000升范围内的培养体积。优选的培养体积是40到100升，最优选地是大约50升。熟练技术人员显然知道更大的培养体积特别需要更大体积的用于接种的预培养物。例如，预培养可以分两个或多个预培养体积渐增的步骤进行。为了确保在大培养体积中的质粒保持，用作接种物的预培养物可包含一种抗生素以保持选择压力。熟练技术人员意识到，可通过降低达到期望的最终细胞密度所必需的代数而进一步提高质粒保持。因此，以高细胞密度接种预培养物和分批培养物是有利的。在一个优选实施方式中，预培养物的起始OD600是0.1到0.4，优选大约0.3。
在一个实施方式中，在所述培养步骤之前，所述方法进一步包括将所述细菌宿主导入到培养基中的步骤，其中所述导入利用接种物进行，其中所述接种物在预培养过程中生产，该预培养过程包括所述细菌宿主在含有抗生素(优选卡那霉素)的培养基中生长的步骤。更优选地，所述预培养过程包括所述细菌宿主在第一培养基中生长的步骤，所述第一培养基包含一种抗生素，优选卡那霉素，并且用第二培养基稀释含有细菌宿主的所述第一培养基到OD600为0.1到0.4，优选大约0.3，其中所述第二培养基基本上不含抗生素，并且进一步培养所述细菌宿主。
而且，熟练技术人员显然知道，本发明的发酵过程是一种需氧过程，其需要向培养中的细菌充分供应氧气。细菌宿主的氧气需求尤其随着细胞密度和生长速率的增加而增加。根据总体积和细菌宿主的氧气需求，例如，可以通过搅拌和/或通过通气提供氧气。或者，也可通过用纯氧或纯氧和任何其他气体(优选空气)的混合物进行通气而提供氧气，其中纯氧指通常为技术目的可获得的技术上纯化的气体。给细菌宿主提供氧气的另一个可能性是通过提高发酵罐中的压力提高培养基中的氧分压。
在本发明的一个优选实施方式中，所述细菌宿主的所述培养和/或对所述分批培养物的所述补料和/或利用诱导物对所述启动子的所述诱导在一定条件下进行，其中对所述细菌宿主供应氧气，优选地通过利用空气通气，最优选地通过利用空气以恒定速率通气，其中优选所述氧气的供应贯穿整个过程中，最优选地贯穿延迟期、生长期和生产期，并且其中进一步优选地监测培养基中的氧分压，并且其中可选地或另外通过用纯氧通气给细菌宿主提供氧气，优选地当培养基中的氧分压(pO2)低于某一阈值时。在一个特别优选的实施方式中，所述pO2的阈值在范围0％到6％之间，优选10％到50％之间，更优选20％到45％之间，最优选地所述阈值为大约40％。
在本发明的方法中，优选地对于2升或更高的培养体积，常规应用于氧气供应，优选地通过空气和/或纯氧通气供氧，以维持上述优选的pO2。在放大的过程中，最优选地在40升到100升及以上时，以所述方式进行氧气通气是特别优选的。
因此，本发明的一个实施方式是一种表达能够通过自装配形成VLP的噬菌体重组衣壳蛋白或其突变体或片段的方法，所述方法包括以下步骤：a)将表达质粒导入细菌宿主，其中所述表达质粒包含一种表达构建体，其中所述表达构建体包含(i)编码所述重组衣壳蛋白或其突变体或片段的第一核苷酸序列，和(ii)可被乳糖诱导的启动子；b)在包含主碳源的培养基中培养所述细菌宿主；其中所述培养以分批培养方式在所述启动子被lacI阻遏的条件下进行，其中所述细菌宿主过量表达所述lacI；c)用所述主碳源向所述分批培养物中补料；和d)用一种诱导物诱导所述启动子，其中继续用所述主碳源对所述分批培养物进行补料；其中贯穿所述过程的步骤b)到d)，向所述细菌宿主中供氧，使所述培养基中的pO2至少为大约10％到50％，优选大约40％，并且其中进一步优选地通过用空气、纯氧或两者的混合物、优选用空气和纯氧的混合物通气而提供所述氧气。
实施例
实施例1
表达质粒pTac-nSD-Qb-mut(SEQ ID NO：1)的克隆策略
大肠杆菌RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白编码基因(C)从质粒pSDQb-mut(SEQ ID NO：33)中扩增。质粒中包含编码133-aa Qβ外壳蛋白(CP)和329-aa通读蛋白(A1)的基因C的序列。为防止通读，NCBI GenBank登录号M99030的核苷酸445-450，TGAACA(SEQ ID NO：31)，被序列TAATGA(SEQ ID NO：32)取代。
来自质粒pSDQb-mut的外壳蛋白编码基因C通过PCR扩增。具有内部EcoRI位点和合成Shine-Dalgarno(SD，SEQ ID No：4)序列的寡核苷酸Qb-FOR3/2(SEQ ID NO：34)与Qβ CP基因的5’末端退火。寡核苷酸Qblang-REV2/2(SEQ ID NO：35)包含内部HindIII位点，并且作为引物与基因C的非编码区的3’末端杂交。1054bp的扩增PCR片段包括NCBI GenBank登录号M99039(除了上述核苷酸改变以外)的核苷酸46-1062和合成的SD序列。PCR片段用限制性酶HindIII/EcoRI消化，并且将产生的1036bp片段插入到修饰的pKK223-3载体(Pharmacia，NCBI GenBank登录号：M77749，SEQ ID NO：27)的HindIII/EcoRI限制性位点。在这种修饰的pKK223-3载体中，氨苄青霉素抗性基因被载体pUC4K(Pharmacia，NCBI GenBank登录号：X06404，SEQ ID NO：37)的卡那霉素抗性基因取代。
载体pTac-nSDQb-mut(SEQ ID NO：33)与载体pTacQb-mut在Shine-Dalgarno序列上不同。经PCR通过由质粒pTacQb-mut扩增Qβ外壳蛋白编码基因C而导入Shine-Dalgarno序列(nSD，SEQ ID NO：3)。具有内部EcoRI位点和相应合成的Shine-Dalgarno(nSD)序列的寡核苷酸nSDQb-mutEcoRIfor(SEQ ID NO：36)与Qβ CP基因的5’末端退火。寡核苷酸Qblang-REV2/2(SEQ ID NO：35)包含一个内部HindIII位点，并且作为引物与基因C的非编码区的3’末端杂交。1054bp扩增的PCR片段包括NCBI GenBank登录号M99039(除了上述核苷酸改变之外)的核苷酸46-1062和合成的nSD序列。PCR片段用限制性酶HindIII/EcoRI消化，并且将产生的1036bp片段插入到修饰的pKK223-3载体(Pharmacia，NCBI GenBank登录号：M77749，SEQ IDNO：27)的HindIII/EcoRI限制性位点。在这种修饰的pKK223-3载体中，氨苄青霉素抗性基因被载体pUC4K(Pharmacia，NCBI GenBank登录号：X06404，SEQ ID NO：37)的卡那霉素抗性基因所取代。
实施例2
表达质粒pTac-nSD-AP205(SEQ ID NO：30)的克隆策略
不动杆菌(Acinetobacter)噬菌体AP205的外壳蛋白编码基因从质粒pAP205-58中扩增。该质粒包含编码噬菌体AP205的131个氨基酸的衣壳蛋白的外壳蛋白基因序列(相应于NCBI GenBank登录号AF334111的核苷酸1908-2303)。
外壳蛋白编码基因通过PCR扩增。具有内部EcoRI位点和合成的Shine-Dalgarno(nSD)序列的寡核苷酸nSDAP238-EcoRIfor(SEQ IDNO：38)与外壳蛋白基因的5’末端退火。寡核苷酸AP238HindIIIrev(SEQ ID NO：39)包含内部HindIII位点，并且作为引物与外壳蛋白基因的3’末端杂交。该寡核苷酸在外壳蛋白的天然存在的终止密码子之后导入第二终止密码子。438bp扩增的PCR片段包括NCBI GenBank登录号AF334111的核苷酸1908-2303和合成的nSD序列。PCR片段利用限制性酶HindIII/EcoRI消化，并且将得到的420bp片段插入到修饰的载体pKK223-3(Pharmacia，NCBI GenBank登录号：M77749，SEQ ID NO：27)的HindIII/EcoRI限制性位点。在这种修饰的pKK223-3载体中，氨苄青霉素抗性基因被载体pUC4K(Pharmacia，NCBIGenBank登录号：X06404，SEQ ID NO：37)的卡那霉素抗性基因所取代。
实施例3
在tac启动子和nSD控制下的Qβ CP的表达
大肠杆菌菌株RB791用质粒pTac-nSD-Qb-mut(SEQ ID NO：1)转化。克隆在摇瓶中生长。每个摇瓶中包含100ml含有卡那霉素(25μg/ml)的R40培养基(主培养基，Hypep 7455，甘油，见实施例5)，并且用过夜培养物接种，起始OD600为0.3。摇瓶于30℃和220rpm搅拌下培养4小时(OD600在4和5之间)。诱导用0.5％的乳糖进行4小时。蛋白质产量通过SDS-PAGE确定。显示出强烈的蛋白条带的凝胶被鉴定为Qβ CP。
实施例4
在tac启动子和SD(与nSD对比)的控制下的AP205 CP的表达
在摇瓶中筛选出pTac-nSDAP205(SEQ ID NO：30)的9个克隆和pTac-SDAP205的6个克隆。pTac-SDAP205(SEQ ID NO：40)除了包含SEQ ID NO：4的Shine-Dalgarno序列而不是SEQ ID NO：3的Shine-Dalgarno序列之外与pTac-nSDAP205相同。每个摇瓶包含50ml含有卡那霉素(25μg/ml)的R40培养基(主培养基，Hypep 7455，甘油，见实施例5)，用过夜培养物接种，起始OD600为0.3(对于pTac-nSDAP205)或0.4(对于pTac-SDAP205)。摇瓶在30℃和220rpm搅拌下培养4小时。用0.5％乳糖进行诱导。蛋白质产量通过SDS-PAGE确定。对于所有测试克隆，源于pTac-nSDAP205的AP205CP表达显著强于源于pTac-SDAP205的表达。
实施例5
培养基的组成
培养基的组成如表1所述
表1：培养基的组成
Figure A20068002362000401
实施例6
在补料分批过程中Qβ CP的表达(2升规模)
发酵过程在生物反应器(Applikon 5L凹底)中进行，其配备2个盘式搅拌器(
Figure A20068002362000411
6cm)、隔板(3×16cm)，具有pH-、pO2-和温度控制，以及发酵软件BioXpert Version 2.22。
将质粒pTac-nSD-Qb-mut转化的RB791的5μL低温培养物接种到包含50ml培养基R40(25μg/mL卡那霉素)的100ml锥形烧瓶中，并在30℃和220RPM下培养14小时过夜。14小时之后OD600值达到6.0。对于分批发酵，将2升培养基(R40)泵入生物反应器中。表2中列出了培养参数。
表2：分批阶段的参数设定点
Figure A20068002362000412
生物反应器用100mL接种物接种。采集2mL样品，测量OD600，并且以14,000RPM离心。分离沉淀物和上清液，冷冻以进一步分析。生物量浓度[g/L]使用下式计算：
OD600×0.45[g×L-1×OD600 -1]＝生物量[g/L].
总蛋白质含量中的Qbeta百分含量如下计算，假定大肠杆菌生物量中的50％为蛋白质：
生物量[g×L-1]/2＝总蛋白质[g×L-1]
Qbeta[g×L-1]/总蛋白质[g×L-1]×100＝Qbeta/总蛋白质[％]。
在补料分批模式中，其按照分批模式增加一个补料期。在补料期中，按照限定的分布向反应器中的细胞供应底物。补料分布依赖于选择的生长速率μ、产率系数生物量比甘油(Yx/甘油)、体积(Vf)、补料中底物的浓度(cf)。底物浓度。补料利用下式计算：
补料公式
mf＝(μ/Yx/s+m)Vf×Xf×eμt
泵＝(mf/cf+b)/a
mf＝质量流速[g/h]
μ＝比生长速率[l/h]
Yx/Glycerol＝生物物质产量比甘油[g/g]
m＝能量保持[g*g-1*h-1]
Vf＝在补料开始的体积
Xf＝在补料开始的生物量
cf＝补料中的底物浓度[g/mL]
a+b＝泵校准公式的偏移/斜率
为了确定校准参数a和b，进行泵校准。另外，具有补料瓶的补料管被钳在补料泵中，泵以7％、14％和21％的泵性能运行。记录每次泵入的补料体积。在泵性能[％]与被泵入的补料液的关系的结果图表中，确定斜率(a)和Y-轴(b)。对于补料分批培养，在生物反应器中设定表3的参数。
表3：生物反应器中的补料分批培养参数
Figure A20068002362000421
在达到大约7小时的过程时间之后(分批结束)，补料泵自动开启。在进一步培养7小时之后，当OD600达到55-60时，将补料培养基(用于生物物质的繁殖)更换为诱导培养基R42(用于生物物质的繁殖和诱导)。5小时之后停止R42补料，通过离心收获培养物。
过程参数的分析：
常规分析下述过程参数。在整个过程时间中联机测量pO2、pH、温度和搅拌速度。脱机测量600nm的光密度。β-半乳糖苷酶活性的确定利用β-半乳糖测试试剂盒(Invitrogen，目录号K1455-01)进行。活性用单位每ml表示，OD600＝1.0。其定义为每分钟每mL细菌悬浮液(OD600＝1.0)水解邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的量(以nmol表示)。累积的产物通过SDS-PAGE分析，确定总蛋白质含量(可溶性和不溶性蛋白质)，并且利用HPLC分析测定可溶性部分。大肠杆菌的细胞裂解在裂解缓冲液(50mM葡萄糖，25mM tris/HCl(pH 8)，15mM EDTA(pH 8.0))中利用超声匀浆器(Bandlin Sonoplus，HD2070)进行。OD600为50的250μL细菌悬浮液以1400RPM离心10分钟。沉淀物在250μL裂解缓冲液中重悬浮(涡旋)，置于室温下5分钟。然后，利用超声波在10％装置性能下裂解细胞20秒(细胞置于冰上)，然后将细胞悬浮液在14000RPM下离心10分钟。上清液(可溶性蛋白质)通过SDS-PAGE和HPLC进行分析。
诱导之前和生产期最后(5小时诱导之后)的样品从生物反应器中取出以通过标准化为OD5.0的SDS-PAGE分析Qβ的形成。在培养最后，收获1.9升的培养物。离心之后，在三个独立的反应流程中获得下列细胞沉淀物：1)最终OD600为84：194g CWW；2.)最终OD600为88：200g CWW；3.)最终OD600为86：201g CWW。
在反应1和2中的质粒保持在诱导开始时为100％，在收获时为100％。基于在SDS-PAGE上与QβCP标准的对比，产量大概估计为大约5g/l QβCP。HPLC分析揭示了浓度大约为6g/l QβVLP。
实施例7
碳源和细菌菌株的选择
比较了作为碳源的葡萄糖和甘油。为了测试菌株DH20和RB791中的每一个在这些碳源上的生长表现，利用包含葡萄糖的培养基(R27)和包含甘油的培养基(R40)进行了摇瓶试验。两种培养基中都补充了25μg/ml的卡那霉素。每种培养在起始OD600为0.3时开始。通过添加0.5％乳糖进行诱导。确定的最大比生长速率(μmax)和产率系数(Yx/s)列于表4中。RB791在葡萄糖和甘油两者中都生长较快。另外，获得的产率系数较高。虽然葡萄糖允许更高的最大比生长速率(μmax)，但是甘油的产率系数(Yx/s)更高。
表4：使用RB791和DH20在葡萄糖和甘油上的培养实验的最大比生长速率和产率系数
实施例8
最适温度的确定
研究了温度对于产物形成的影响。接种了两个摇瓶培养物，在30℃和220rpm下培养。在OD600达到5之后，用乳糖诱导培养物。随后，一种培养物在37℃下继续培养，而另一种培养物在23℃下培养。SDS-PAGE的结果显示了在诱导后4和5小时的表达水平在37℃诱导的培养物中更高。在23℃诱导的培养物中培养物诱导19小时显示了较高的Qβ水平。
实施例9
通过乳糖和甘油共补料的诱导
配制由20％甘油和20％乳糖组成的补料溶液(R42)，在诱导开始时加于实施例6描述的发酵中。图1提供了贯穿整个过程时间的相关过程参数的概要。在13.5小时在OD600大约为5.5时诱导表达。诱导后，将补料泵速设定为恒定的。甘油不随补料而累积。乳糖累积到4g/l，然后开始减少。β-半乳糖苷酶活性上升到10U/ml，然后降低。与以前的发酵流程相比：a)乳糖在诱导起始时单次添加，不补料；b)连续补加没有甘油的乳糖，与流程a)和b)进行4小时相比，活性高于7U/ml并且在2小时后达到最大活性。
实施例10
质粒保持
下述操作条件对质粒保持的影响在实施例6描述的过程中进行检测：1)预培养物初始体积，2)在预培养物中的卡那霉素，3)在37℃相比30℃时的生长和/或诱导。结果总结在表5中。预培养由来自细胞储存小瓶的5μl体积开始。小体积的接种允许预培养物生长过夜。用于QT0103F8的预培养物包含25mg/l的卡那霉素，而用于QT0103的预培养物不包含任何卡那霉素。这两种发酵都在30℃下进行，诱导5小时。从5小时诱导之前和之后的质粒保持判断，向预培养物中补充卡那霉素对于质粒保持具有积极效果。在5小时诱导之前和之后质粒保持为98％。相反，当预培养物中省略卡那霉素时，质粒保持仅仅达到80％。对于随后的流程，QT0203F7，预培养也以5μl开始，在包含卡那霉素的培养基中生长。在生物反应器中的发酵从一开始就在37℃下进行。在37℃运行对于质粒稳定性具有有害的影响。诱导之前的质粒保持为99％，而在5小时诱导后降低到0％。为了测试较短的预培养和因此较少的代数是否在5小时诱导之后提高质粒保持，一系列预培养从来自解冻的细胞储存小瓶的300μl体积开始并在没有卡那霉素的培养基中生长。两个发酵罐在30℃下进行整个流程。另外两个发酵罐首先在30℃下进行细胞生长，然后切换到37℃进行生产阶段。得到的质粒稳定性在诱导之前和5小时之后都为100％。
表5：根据预培养的代数，预培养中有或没有卡那霉素，在37℃的生长和/或诱导的不同操作条件下在诱导之前或5小时之后获得的质粒保持力的概述
Figure A20068002362000461
实施例11
诱导时间点的变化
在基本上如实施例6所述的过程中，指数补料分布编程为在生物反应器接种后7小时开始。在标准条件下，诱导的预定时间为14小时过程时间。为了测试诱导时间点的变化对于最终细胞密度的影响，在13.5小时诱导(导致6.5小时的指数补料)一种培养物，并且在14.5小时(导致7.5小时的指数补料)诱导另一种培养物。在常规14小时时间点诱导的培养物作为对照(7小时的指数补料)。结果总结在表6中。细胞密度随着补料时间的延长而增加。从可获得的最终CWW数据点的线性回归分析判断，存在线性相关(r2＝0.92)。
表6：诱导时间点的变化：根据OD600和CWW对最终细胞密度的影响
Figure A20068002362000471
实施例12
收获时间点的变化
在基本上如实施例6所述的过程中的培养物收获以手工进行。在标准条件下，收获的预定时间为19小时过程时间。“收获”的操作涉及手工终止生物反应器的运行。为测试收获时间点的变化对最终细胞密度的影响，一种培养物在18.8小时收获(导致4.8小时的诱导)，另一种在19.5小时收获(导致5.5小时的诱导)。一种培养物在常规的19小时时间点收获作为对照(5小时的诱导)。结果总结在表7中。细胞密度随着诱导时间的延长而增加，因为细胞在诱导时仍然生长。
表7：收获时间点的变化：根据OD600和CWW对最终细胞密度的影响
Figure A20068002362000472
实施例13
温度的影响
在基本如实施例6所述的过程中发酵温度的影响通过在5个不同温度设定点进行6次发酵进行研究。结果总结在表8中。最终细胞密度对于发酵温度是敏感的，最适温度是30℃。
表8：不同温度设置点对根据OD600和CWW的最终细胞密度的结果总结
实施例14
放大的发酵(50升)
将实施例6所述的过程放大到50升体积以评价从2升工作体积生物反应器系统到更大体积的放大能力。放大过程的关键的过程参数总结在表9中。
表9：在50L生物反应器中的过程参数
  培养步骤   描述   时间[h] OD600
  预培养1   将300μl从细胞储存小瓶转入100ml包含在500ml摇瓶中的预培养基中并培养16小时 -11* 5.0
预培养2   计算为了在750ml中以0.3的起始OD600开始所需转移的体积。将计算的体积(如50ml)转移到包含在5000ml摇瓶中的750ml预培养基中。 -5* 4.0
  生物反应器的接种 将合并的计算出的体积(例如，1.4L)转移到50L生物反应器中。起始体积＝40L 0
  诱导开始 指数补料分布转为恒定的，补料转为诱导补料 14 46
  培养结束 在诱导5小时后完成培养 19 128
*相对于预生物反应器接种的时间
两个预培养扩增步骤是必要的。在第一步骤中，细胞如2L过程(实施例6)中所建立的那样扩增。在此步骤之后，将细胞分到两个5000ml摇瓶培养物中，每个包含750ml培养基。进一步扩增5小时。在50L生物反应器中的培养按照与2L系统(实施例6)所述相同的时间分布进行。在诱导开始时OD600是46，最终OD600是128。质粒保持在诱导前是100％，在培养最后是98％。培养结束时培养基中QβCP蛋白的浓度利用SDS-PAGE大概估计为8g/l。该反应器运行的Qβ的总量估计是大约300g。
实施例15
延长的指数补料的效果
根据实施例6或14进行的发酵的指数补料期为7小时。在此时间之后，细胞达到诱导的密度，其在诱导过程中增加到大约100到130的目标最大OD600作为最终细胞密度。确定如实施例6和14所述、优选如实施例14所述进行的反应器运行的最终OD600、最终CWW、最终CDW、在诱导开始和收获时的质粒保持、培养结束时的Qβ浓度，其中指数补料期延长到高达11小时、优选10小时的持续时间。
实施例16
在生产过程中增加补料的效果
实施例9证实了甘油在生产期不累积，表明了生产可以不受诱导培养基的补料速率的限制。在如实施例6和14所述、优选如实施例14所述的反应器运行中，确定增加诱导培养基的补料速率对最终OD600、最终CWW、最终CDW、诱导开始和收获时的质粒保持、培养结束时的Qβ浓度的影响，其中在生产过程中提高补料速率。可选地或另外，补料培养基中乳糖和甘油的比例转向更高的甘油和更低的乳糖浓度。
实施例17
QβCP的HPLC分析
QβCP利用HPLC系统如下测定：将包含QβCP的样品在包含10mM 1，4-二硫-DL-苏糖醇的1x反应缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液，pH8.0)中适当地稀释，并在50℃下在热混合器中温育15分钟。温育之后，将样品离心，在2℃到10℃储存上清液直到HPLC分析。注射10到100μl的样品。
从50℃热平衡的C4反相柱300，5μm，4.6×150mm，Vydac Inc.Hesperia，USA(目录号214TP5415)上洗脱后，利用对215nm处检测的HPLC峰面积回归的已知Qβ标准的回归曲线，对Qβ进行定量。通过系统的流速是1ml/min，由流动相A(0.12％三氟醋酸水溶液)和流动相B(在乙腈中的0.12％的三氟醋酸)组成，流动相B具有下述梯度：0到2分钟恒定在40％，2到8分钟线性增加到50％，8到10分钟恒定在50％，10到10.1分钟线性降低到40％，10.1到12分钟恒定在40％。
实施例18
通过分析性大小排阻色谱确定Qβ VLP
通过分析性大小排阻色谱对Qβ颗粒的分析利用TskgelG5000PWXL-柱(10μm，7.8×300mm，TosoH Biosep；目录号08023)进行，该柱用磷酸缓冲液(20mM Na2HPO4/NaH2PO4，150mM NaCl pH 7.2)平衡。以0.8ml/min在磷酸缓冲液中进行等度梯度洗脱20分钟。根据对260nm下检测的HPLC峰面积回归的已知Qβ标准的回归曲线确定Qβ浓度。
实施例19
延长的指数补料的效果
根据实施例6或14进行的发酵的指数补料期是7小时。在此时间之后，细胞达到诱导密度，其在诱导过程中增加到大约100到130的目标最大OD600作为最终细胞密度。确定如实施例6和14所述、优选如实施例14所述进行的反应器运行的最终OD600、最终CWW、诱导之前和收获时的质粒保持和培养结束时的Qβ浓度，其中指数补料期延长到高达12小时的持续时间。另外，在诱导补料中的甘油和乳糖的浓度分别改变为300g/L和100g/L。结果总结在表10中。
表10：培养结束时的OD600和CWW，诱导之前和培养结束时的质粒保持，以及氧质量流量峰值。在不同的指数补料持续时间内进行培养。
Figure A20068002362000511
根据LDS-PAGE分析，除了利用12小时指数补料的培养外，所有培养的特定的Qβ浓度是相同的。最佳的绝对Qβ产量和氧消耗在9.5小时的指数补料中发现。因此，优选进行具有9.5小时的指数补料期的过程。
实施例20
放大的发酵(50升)
将实施例6中描述的过程和如实施例19中所述的具有300g/l甘油和100g/l乳糖的9.5小时指数补料期的过程放大到50L体积，以评价从2L工作体积的生物反应器系统到更大体积的放大能力。该放大的过程的关键过程参数总结在表11中。
表11：50L规模的过程参数
培养步骤 描述   时间[h]
预培养   从细胞储存小瓶中转移200μl到包含在3000mL摇瓶中的800ml预培养基中，并培养18小时(2瓶) -18*
  生物反应器的接种   将合并的总体积(大约1.6L)转移到50L生物反应器中。起始体积＝35L 0
  诱导开始   指数补料分布转为恒定的，并且补料转为诱导补料   16.5
  培养结束   在诱导后5小时完成培养   21.5
*相对于生物反应器接种时间
为了在更大的反应器中接种大约相同的细胞密度，改变预培养步骤是必要的。在50L生物反应器中的培养利用如实施例19所述对2L规模优化的时间分布进行。六个培养的最终细胞湿重是188g/L±9。在培养结束时的质粒保持是97.3％±1.4。培养结束时培养基中Qβ CP蛋白的浓度通过C4反相HPLC(实施例17)确定为10.8g/L±0.3。对于一次50L的运转，Qβ CP的总量是540g。分析Qβ CP和Qβ VLP的大约两倍浓缩的生物量的粗提取物(实施例18)。Qβ CP的浓度是19.1g/L±0.4(C4反相HPLC)，Qβ VLP的浓度是18.8g/L±1.1。因此，在收获时估计发酵过程的VLP产率大约是9-11g/l发酵液。
序列表
<110>赛托斯生物技术公司
M·埃默林格
F·亨内克
H·普夫伦德
M·里尔
P·斯坦纳
<120>可放大的发酵方法
<130>P1049PC00
<150>EP05011416.4
<151>2005-05-26
<150>EP05106729.6
<151>2005-0721
<160>40
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>1
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg     60
gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt    120
gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca    180
ggaaacagaa ttctaaggag gaaaaaaaaa tggcaaaatt agagactgtt actttaggta    240
acatcgggaa agatggaaaa caaactctgg tcctcaatcc gcgtggggta aatcccacta    300
acggcgttgc ctcgctttca caagcgggtg cagttcctgc gctggagaag cgtgttaccg    360
tttcggtatc tcagccttct cgcaatcgta agaactacaa ggtccaggtt aagatccaga    420
acccgaccgc ttgcactgca aacggttctt gtgacccatc cgttactcgc caggcatatg    480
ctgacgtgac cttttcgttc acgcagtata gtaccgatga ggaacgagct tttgttcgta    540
cagagcttgc tgctctgctc gctagtcctc tgctgatcga tgctattgat cagctgaacc    600
cagcgtatta atgactgctc attgccggtg gtggctcagg gtcaaaaccc gatccggtta    660
ttccggatcc accgattgat ccgccgccag ggacaggtaa gtatacctgt cccttcgcaa    720
tttggtccct agaggaggtt tacgagcctc ctactaagaa ccgaccgtgg cctatctata    780
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caaagtggcg tgattgggat tctcggctta gttataccac gttccgcggt tgccgtggca    900
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agtatgatat tcgcgagggc aagaaacctg gtgctttcgg taacattgag cgattcattt   1020
atcttaagtc gataaatgct tattgctctc ttagcgatat tgcggcctat cacgccgatg   1080
gcgtgatagt tggcttttgg cgcgatccat ccagtggtgg tgccataccg tttgacttca   1140
ctaagtttga taagactaaa tgtcctattc aagccgtgat agtcgttcct cgtgcttagt   1200
aactaaggat gaaatgcatg tctaagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca   1260
gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg   1320
gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg    1380
ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa    1440
cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct    1500
ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga    1560
gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc    1620
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tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat    1740
aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggagtgtt atgagccata ttcaacggga    1800
aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa    1860
atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc    1920
cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga    1980
tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt    2040
tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt    2100
ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt    2160
cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt    2220
tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga    2280
tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc    2340
attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga    2400
cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca    2460
ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct    2520
ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct    2580
cgatgagttt ttctaaacgc gtgaccaagt ttactcatat gtactttaga ttgatttaaa    2640
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa    2700
aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg    2760
atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc    2820
gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac    2880
tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca    2940
ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt    3000
ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc    3060
ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg    3120
aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc    3180
cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac    3240
gagggagctc ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct    3300
ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc    3360
cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt    3420
tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac    3480
cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg    3540
cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac    3600
tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta  3660
cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg  3720
gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg  3780
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca  3840
gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt  3900
ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt  3960
tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata  4020
ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta  4080
ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc  4140
actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag  4200
cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc  4260
agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt  4320
ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta  4380
aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt  4440
ggccaggacc caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg  4500
atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg  4560
gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg  4620
aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg  4680
cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga  4740
cgatcagcgg tccaatgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct  4800
gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga  4860
tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg  4920
ccagcaagac gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc  4980
cgaaacgttt ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga  5040
ataccgcaag cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa  5100
tgacccagag cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa  5160
gtgcggcgac gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc  5220
tcaagggcat cggtcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta  5280
gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag gagatggcgc  5340
ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga  5400
gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa  5460
ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atccgggctt  5520
atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtat   5579
<210>2
<211>245
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子序列
<400>2
cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc     60
tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat    120
aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac    180
aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga    240
aacag                                                                245
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SD序列
<400>3
taaggaggaa aaaaaaatg                            19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SD序列
<400>4
aggaggtaaa aaacgatg                             18
<210>5
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>5
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
    100                     105                     110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>6
<211>1017
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达构建体
<400>6
atggcaaaat tagagactgt tactttaggt aacatcggga aagatggaaa acaaactctg     60
gtcctcaatc cgcgtggggt aaatcccact aacggcgttg cctcgctttc acaagcgggt    120
gcagttcctg cgctggagaa gcgtgttacc gtttcggtat ctcagccttc tcgcaatcgt    180
aagaactaca aggtccaggt taagatccag aacccgaccg cttgcactgc aaacggttct    240
tgtgacccat ccgttactcg ccaggcatat gctgacgtga ccttttcgtt cacgcagtat    300
agtaccgatg aggaacgagc ttttgttcgt acagagcttg ctgctctgct cgctagtcct    360
ctgctgatcg atgctattga tcagctgaac ccagcgtatt aatgactgct cattgccggt    420
ggtggctcag ggtcaaaacc cgatccggtt attccggatc caccgattga tccgccgcca    480
gggacaggta agtatacctg tcccttcgca atttggtccc tagaggaggt ttacgagcct    540
cctactaaga accgaccgtg gcctatctat aatgctgttg aactccagcc tcgcgaattt    600
gatgttgccc tcaaagatct tttgggcaat acaaagtggc gtgattggga ttctcggctt    660
agttatacca cgttccgcgg ttgccgtggc aatggttata ttgaccttga tgcgacttat    720
cttgctactg atcaggctat gcgtgatcag aagtatgata ttcgcgaggg caagaaacct    780
ggtgctttcg gtaacattga gcgattcatt tatcttaagt cgataaatgc ttattgctct    840
cttagcgata ttgcggccta tcacgccgat ggcgtgatag ttggcttttg gcgcgatcca    900
tccagtggtg gtgccatacc gtttgacttc actaagtttg ataagactaa atgtcctatt    960
caagccgtga tagtcgttcc tcgtgcttag taactaagga tgaaatgcat gtctaag      1017
<210>7
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>7
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
1           100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>8
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>8
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>9
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qb
<400>9
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35          40                          45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Il e Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                  125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>10
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>10
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>11
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>11
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>12
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>12
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Il e Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                   75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>13
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>13
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>14
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>14
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asp Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>15
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>15
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>16
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>16
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met G1n Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>17
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>17
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>18
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>18
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>19
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体
<400>20
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>21
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>21
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>22
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>22
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>23
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>23
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>24
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>24
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala LysAsp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>25
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>25
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                 85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>26
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>26
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>27
<211>4586
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克降载体
<400>27
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attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa    120
aaacattatc cagaacggga gtgcgccttg agcgacacga attatgcagt gatttacgac    180
ctgcacagcc ataccacagc ttccgatggc tgcctgacgc cagaagcatt ggtgcaccgt    240
gcagtcgata agctccggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc    300
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cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc    780
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catcagggac agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcactgga   1020
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gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaattcccc cttacacgga ggcatcaagt   1800
gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac   1860
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tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga   1980
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cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct   2520
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cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat    3120
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac    3180
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt    3240
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tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg    4020
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat    4080
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaaa gagtttgtag    4140
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cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc    4320
ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg gcagttccct actctcgcat    4380
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gctgcaggtc gacggatccc cgggaa                                         4586
<210>28
<211>425
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>终止序列
<400>28
ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag   60
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ctctt                                                              425
<210>29
<211>816
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗性基因
<400>29
ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat   60
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tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac  240
tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca  300
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cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga  420
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ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc  540
atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt  600
tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa  660
caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac  720
attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg  780
cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcat                            816
<210>30
<211>4963
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>30
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg   60
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ctacagcaaa taaaattgtg tggtcggatc caactcgttt atcaactaca ttttcagcaa  300
gtctgttacg ccaacgtgtt aaagttggta tagccgaact gaataatgtt tcaggtcaat    360
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ttatgccgaa tgaaaaccaa tccattcgca cagtgatttc agggtcagcc gaaaacttgg    480
ctaccttaaa agcagaatgg gaaactcaca aacgtaacgt tgacacactc ttcgcgagcg    540
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cttaatgaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa    660
atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt    720
cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg    780
gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga    840
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gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt   1020
ttgcgtttct acaaactctt ttgtttattt ttctagagcc acgttgtgtc tcaaaatctc   1080
tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac   1140
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tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat   1560
tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg   1620
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tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca   1740
gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata   1800
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ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct   2160
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt   2220
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg   2280
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct   2340
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc   2400
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tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa   2520
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg   2580
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gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc    3540
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agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac    3660
ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc    3720
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ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc    3840
tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc    3900
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tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc    4080
caacccgttc catgtgctcg ccgaggcggc ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccaat    4140
gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc    4200
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cagcgcgtcg gccgccatgc cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc    4380
gggaccagtg acgaaggctt gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag    4440
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<223>终止密码子
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<211>6
<212>DNA
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<220>
<223>终止密码子
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taatga                                                               6
<210>33
<211>4525
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>33
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tacttctgat cacgcatagc ctgatcagta gcaagataag tcgcatcaag gtcaatataa    720
ccattgccac ggcaaccgcg gaacgtggta taactaagcc gagaatccca atcacgccac    780
tttgtattgc ccaaaagatc tttgagggca acatcaaatt cgcgaggctg gagttcaaca    840
gcattataga taggccacgg tcggttctta gtaggaggct cgtaaacctc ctctagggac    900
caaattgcga agggacaggt atacttacct gtccctggcg gcggatcaat cggtggatcc    960
ggaataaccg gatcgggttt tgaccctgag ccaccaccgg caatgagcag tcattaatac   1020
gctgggttca gctgatcaat agcatcgatc agcagaggac tagcgagcag agcagcaagc   1080
tctgtacgaa caaaagctcg ttcctcatcg gtactatact gcgtgaacga aaaggtcacg   1140
tcagcatatg cctggcgagt aacggatggg tcacaagaac cgtttgcagt gcaagcggtc    1200
gggttctgga tcttaacctg gaccttgtag ttcttacgat tgcgagaagg ctgagatacc    1260
gaaacggtaa cacgcttctc cagcgcagga actgcacccg cttgtgaaag cgaggcaacg    1320
ccgttagtgg gatttacccc acgcggattg aggaccagag tttgttttcc atctttcccg    1380
atgttaccta aagtaacagt ctctaatttt gccatcgttt tttacctcct tctagagtca    1440
ttatggtttt gccatacatc agtatggtgt agcagcactt attataatct ttattgcctc    1500
ttaaaactta atccacatca aaactcaaat acttttaacc ccagcgtcct gtaagctctg    1560
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct    1620
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac    1680
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga    1740
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat    1800
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac    1860
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct    1920
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg    1980
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg    2040
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt    2100
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg    2160
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac    2220
ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga    2280
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt    2340
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt    2400
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga    2460
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc    2520
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct    2580
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata    2640
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca    2700
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga    2760
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga    2820
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg    2880
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga    2940
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt    3000
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct    3060
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtgggg ggggggggcg    3120
ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc    3180
atccagccag aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt    3240
ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat    3300
ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc    3360
agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg    3420
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa  3480
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc  3540
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg  3600
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat  3660
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca  3720
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga  3780
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg  3840
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg  3900
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata  3960
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca  4020
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg  4080
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat  4140
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt  4200
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt  4260
attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca  4320
acgtggcttt cccccccccc ccattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc  4380
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc  4440
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat  4500
aggcgtatca cgaggccctt tcgtc                                        4525
<210>34
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>34
gcgcgcgaat tcaggaggta aaaaacgatg gcaaaattag agactgttac tttagg       56
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>35
gcatgcaagc ttagacatgc atttcatcct tag                               33
<210>36
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>36
gcgcgcgaat tctaaggagg aaaaaaaaat ggcaaaatta gagactgtta ctttagg     57
<210>37
<211>3914
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆载体
<400>37
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc    240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccccggatcc gtcgacctgc    420
aggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc    480
ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt    540
gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc    600
gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg    660
ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat    720
tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata    780
ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat    840
aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct    900
attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact    960
gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag   1020
ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc   1080
gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa   1140
tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat   1200
tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca   1260
tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt   1320
agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac   1380
aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca   1440
ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc   1500
ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg   1560
taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag   1620
agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcgacgg atccggggaa   1680
ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca   1740
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact   1800
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct   1860
gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc   1920
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca   1980
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg   2040
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca  2100
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa  2160
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc  2220
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc  2280
gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct  2340
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg  2400
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag  2460
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta  2520
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg  2580
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt  2640
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt  2700
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag  2760
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat  2820
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc  2880
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat  2940
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc  3000
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag  3060
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag  3120
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt  3180
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg  3240
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt  3300
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc  3360
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc  3420
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa  3480
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg  3540
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc  3600
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag  3660
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt  3720
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt  3780
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc  3840
acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac  3900
gaggcccttt cgtc                                                    3914
<210>38
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>38
gcgcgcgaat tctaaggagg aaaaaaaaat ggcaaataag ccaatgcaac cgatcac      57
<210>39
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>39
gcatgcaagc ttcattaagc agtagtatca gacgatacga tagc                      44
<210>40
<211>4962
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达构建体
<400>40
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg     60
gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt    120
gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca    180
ggaaacagaa ttcaggaggt aaaaaacgat ggcaaataag ccaatgcaac cgatcacatc    240
tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta tcaactacat tttcagcaag    300
tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg aataatgttt caggtcaata    360
tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accggaaggt tgtgcagatg cctgtgtcat    420
tatgccgaat gaaaaccaat ccattcgcac agtgatttca gggtcagccg aaaacttggc    480
taccttaaaa gcagaatggg aaactcacaa acgtaacgtt gacacactct tcgcgagcgg    540
caacgccggt ttgggtttcc ttgaccctac tgcggctatc gtatcgtctg atactactgc    600
ttaatgaagc ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa    660
tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc    720
ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg    780
tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa    840
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tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg    960
cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt   1020
tgcgtttcta caaactcttt tgtttatttt tctagagcca cgttgtgtct caaaatctct   1080
gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac aataaaactg tctgcttaca   1140
taaacagtaa tacaaggagt gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctcgaggc   1200
cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg   1260
tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt   1320
ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa   1380
actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg   1440
atgcatggtt actcaccact gcgatccccg ggaaaacagc attccaggta ttagaagaat   1500
atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt   1560
cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc   1620
aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct    1680
ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt gccattctca ccggattcag    1740
tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag    1800
gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat    1860
ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta    1920
ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaaa    1980
cgcgtgacca agtttactca tatgtacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta    2040
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt    2100
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt    2160
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt    2220
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc    2280
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg    2340
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg    2400
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt    2460
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac    2520
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg    2580
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag ctcccagggg    2640
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat    2700
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt    2760
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg    2820
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa    2880
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc    2940
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct    3000
ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc    3060
tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc    3120
atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc    3180
gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga    3240
ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa    3300
tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga    3360
tgcctccgtg taagggggat ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag    3420
gatgctcacg atacgggtta ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg    3480
taaacaactg gcggtatgga tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca    3540
gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca    3600
gatccggaac ataatggtgc agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg    3660
gaaaccgaag accattcatg ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct    3720
tcacgttcgc tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc    3780
tagccgggtc ctcaacgaca ggagcacgat catgcgcacc cgtggccagg acccaacgct    3840
gcccgagatg cgccgcgtgc ggctgctgga gatggcggac gcgatggata tgttctgcca    3900
agggttggtt tgcgcattca cagttctccg caagaattga ttggctccaa ttcttggagt    3960
ggtgaatccg ttagcgaggt gccgccggct tccattcagg tcgaggtggc ccggctccat    4020
gcaccgcgac gcaacgcggg gaggcagaca aggtataggg cggcgcctac aatccatgcc    4080
aacccgttcc atgtgctcgc cgaggcggca taaatcgccg tgacgatcag cggtccaatg    4140
atcgaagtta ggctggtaag agccgcgagc gatccttgaa gctgtccctg atggtcgtca    4200
tctacctgcc tggacagcat ggcctgcaac gcgggcatcc cgatgccgcc ggaagcgaga    4260
agaatcataa tggggaaggc catccagcct cgcgtcgcga acgccagcaa gacgtagccc    4320
agcgcgtcgg ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg    4380
ggaccagtga cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg    4440
ccgatcatcg tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc    4500
ggcacctgtc ctacgagttg catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc    4560
atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga    4620
cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg    4680
agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc    4740
acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc    4800
cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg    4860
gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatccggg cttatcgact gcacggtgca    4920
ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt at                       4962

Claims (27)

1.一种表达能够通过自装配形成VLP的噬菌体重组衣壳蛋白或其突变体或片段的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将一种表达质粒导入细菌宿主中，其中所述表达质粒包含一种表达构建体，其中所述表达构建体包含(i)编码所述重组衣壳蛋白或其突变体或片段的第一核苷酸序列，和(ii)可被乳糖诱导的启动子；
b)在包含主碳源的培养基中培养所述细菌宿主；其中所述培养以分批培养方式在所述启动子被lacI阻遏的条件下进行，其中所述细菌宿主过量表达所述lacI；
c)用所述主碳源向所述分批培养物中补料；和
d)利用一种诱导物诱导所述启动子，其中继续用所述主碳源向所述分批培养物中补料。
2.权利要求1的方法，其中所述噬菌体是RNA噬菌体。
3.权利要求1或2的方法，其中所述噬菌体选自：
a.)噬菌体Qβ；
b.)噬菌体AP205；
c.)噬菌体fr；
d.)噬菌体GA；
e.)噬菌体SP；
f.)噬菌体MS2；
g.)噬菌体M11；
h.)噬菌体MX1；
i.)噬菌体NL95；
j.)噬菌体f2；
k.)噬菌体PP7；和
l.)噬菌体R17。
4.权利要求2的方法，其中所述RNA噬菌体是Qβ。
5.权利要求4的方法，其中所述重组衣壳蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO：5。
6.权利要求1到5任一项的方法，其中所述表达构建体包含第一终止密码子和第二终止密码子，其中所述第一终止密码子直接定位于所述第一核苷酸序列的3’，并且其中第二终止密码子直接定位于所述第一终止密码子的3’，并且其中所述第一或第二终止密码子的至少一个是TAA。
7.权利要求1的方法，其中所述表达构建体包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码QβCP，或其突变体或片段，并且其中所述第二核苷酸序列编码QβA1蛋白或其突变体或片段，并且其中所述第一和第二核苷酸序列通过正好一个包含至少一个TAA终止密码子的一段序列而隔开。
8.权利要求1的方法，其中所述表达构建体包含核苷酸序列SEQID NO：6或由核苷酸序列SEQ ID NO：6组成。
9.权利要求1的方法，其中所述表达质粒包含核苷酸序列SEQ IDNO：1或优选地由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成。
10.权利要求4的方法，其中所述第一核苷酸序列编码噬菌体的突变外壳蛋白。
11.权利要求1到7任一项的方法，其中所述启动子选自
a.)tac启动子；
b.)trc启动子；
c.)tic启动子；
d.)lac启动子；
e.)lacUV5启动子；
f.)Psyn启动子；
g.)lppa启动子；
h.)lpp-lac启动子；
i.)T7-lac启动子；
j.)T3-lac启动子；
k.)T5-lac启动子；和
l.)与SEQ ID NO：2具有至少50％序列同源性的启动子。
12.权利要求1到10任一项的方法，其中所述启动子包含核苷酸序列SEQ ID NO：2。
13.权利要求1到12任一项的方法，其中所述主碳源是甘油。
14.权利要求1到13任一项的方法，其中所述分批培养物的所述补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，并且其中优选地所述指数系数μ低于μmax。
15.权利要求1到14任一项的方法，其中所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物和所述主碳源以恒定的流速向所述分批培养物中共补料而进行。
16.权利要求1到14的任一方法，其中所述启动子的所述诱导通过用所述诱导物和所述主碳源以渐增的流速向所述分批培养物中共补料而进行。
17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述诱导物是乳糖，并且其中优选地所述乳糖和所述主碳源以大约2∶1到1∶4(w/w)的比例共补料到所述分批培养物中。
18.权利要求1到16任一项的方法，其中所述诱导物是IPTG，并且其中优选地所述IPTG在所述培养基中的浓度是0.001到5mM。
19.权利要求18的方法，其中所述IPTG在所述培养基中的浓度是大约0.01mM。
20.权利要求1到19任一项的方法，其中所述lacI被所述细菌宿主过量表达，其中所述过量表达由lacIq或lacQl引起，优选地由lacIq引起。
21.权利要求1到20任一项的方法，其中所述细菌宿主在其染色体上包含lacIq基因。
22.权利要求1到21任一项的方法，其中所述细菌宿主在质粒上包含lacIq基因。
23.权利要求1到17任一项的方法，其中所述诱导物是乳糖，并且其中所述细菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。
24.权利要求1到23任一项的方法，其中所述培养和所述分批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在比所述细菌宿主的最适生长温度低的温度下进行。
25.权利要求9的方法，其中：
a)所述主碳源是甘油；
b)所述分批培养物的所述补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，并且其中优选地所述指数系数μ低于μmax；
c)所述诱导物是乳糖；
d)并且所述乳糖和所述主碳源以2∶1到1∶4(w/w)、优选1∶1到1∶3(w/w)、最优选1∶3(w/w)的比例向所述分批培养物中共补料；
e)所述细菌宿主是大肠杆菌RB791；并且
f)所述培养和所述分批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在大约30℃的温度下进行。
26.权利要求1的方法，其中：
a)所述表达质粒包含或优选地由核苷酸序列SEQ ID NO：30组成；
b)所述主碳源是甘油；
c)所述分批培养物的所述补料以一定的流速进行，其中所述流速以指数系数μ增长，并且其中优选地所述指数系数μ低于μmax；
d)所述诱导物是乳糖；
e)所述乳糖和所述主碳源以2∶1到1∶4(w/w)、优选1∶1到1∶3(w/w)、最优选1∶3(w/w)的比例向分批培养物中共补料；
f)所述细菌宿主是大肠杆菌RB791；并且
g)所述培养和所述分批培养物的补料和所述启动子的所述诱导在大约30℃的温度下进行。
27.权利要求1到26任一的方法，其中贯穿所述方法的步骤b)到d)，以至少大约40％的培养基中的pO2为所述细菌宿主供应氧。
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