CN109196102A - 增加双链rna产生的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提出用于改善dsRNA的体内产生的方法和材料。在衣壳蛋白存在下，dsRNA的产量显著增加。dsRNA的改善产率不依赖于与所述dsRNA缔合的衣壳蛋白的特异性同源结合位点的存在，而是依赖于衣壳蛋白。

Description

增加双链RNA产生的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月15日提交的美国临时申请第62/308,381号的权益。
纳入序列表
在此提供序列表作为2017年3月3日创建的标题为“103827-5009_sequences_ST25”的文本文件，并且其大小为408KB。所述文本文件的内容以引用其全文的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于增加双链RNA的体内产生的方法和组合物。
背景技术
用与靶基因序列同源的RNA遏制基因表达的能力大大增加了对这类RNA的大规模产生的需求。然而，RNA的化学脆性限制了许多这些技术的商业发展。纯化RNA的大规模产生受到与体外合成方法相关的高成本以及与体内方法相关的低产率和复杂处理要求的限制。
RNA对酶促和环境降解的敏感性根据RNA分子的性质而广泛变化。单链RNA(ssRNA)对降解非常敏感，并且这类分子的体内产生需要使用缺乏内源RNAse的产生菌株，并且通过将RNA的产生与病毒衣壳内的衣壳化偶联以产生病毒样颗粒(VLP)而获益。衣壳化减少了产生过程中RNA的降解，并且允许在纯化过程中进行更积极的处理。通过在相对惰性的蛋白质壳内隔离RNA，VLP有效地保护这类易碎的RNA免于降解。双链RNA(dsRNA)稍微不易被细胞和环境RNAes降解，尽管dsRNA的最高体内产量也涉及缺乏RNAes的产生菌株，并且许多dsRNA也受益于衣壳化。不幸的是，dsRNA的双链茎区的半刚性性质限制了可以衣壳化的dsRNA的范围，因为双链茎结构的长度不能超过衣壳的内径。
在探索增加可被衣壳化的dsRNA茎的范围的技术的过程中，发明人发现在某些条件下可以直接从细胞裂解物中回收大量未衣壳化的dsRNA，但仅在宿主细胞共表达衣壳蛋白或其特定部分时。在粗细胞裂解物中存在大量完整的未衣壳化的dsRNA代表了产生商业量的这类RNA用于基因遏制和其它活性的能力的显著进步。
噬菌体衣壳蛋白的二聚体，例如左旋病毒MS2或Qβ的那些，识别并且结合对同源pac序列的亲和力。这类pae序列包含约19-21个核苷酸，其包含8个碱基对的凸出茎和4个能够形成离散发夹结构的碱基环。这类序列在本文中可称为pac位点、pac序列、pac位点序列、pac位点发夹或pac位点发夹序列。衣壳二聚体与其同源pac位点发夹的相互作用已被充分表征，并且已知在噬菌体生命周期中起至少两个关键作用。噬菌体编码的复制酶的程序性翻译阻遏需要衣壳二聚体与同源pac位点的结合，所述复制酶仅在感染早期表达。此外，衣壳蛋白与pac位点序列和具有同源外壳蛋白亲和力的多个分散和简并RNA位点结合(Dykeman等人描述的包装信号，《包装信号在两个单链RNA病毒中暗示保守组装机制和包装基因组的几何学(Packaging Signals in Two Single-Stranded RNA Viruses Imply aConserved Assembly Mechanism and Geometery of the Packaged Genome)》《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》425：3235-3249(2013))是适当组装成子代噬菌体所必需的。
衣壳二聚体与同源pac位点的相互作用是许多不同的发表在体外和体内方法的主题，所述方法设计成通过使所需的货物分子与pac位点序列结合，或者通过直接共价连接或通过各种亲和力方法使各种异源RNA衣壳化。本发明与这类方法的显著不同之处在于它包含衣壳蛋白的共表达以产生未衣壳化的dsRNA而不是衣壳化的RNA。此外，本发明允许体内产生完全缺乏pac或具有同源蛋白亲和力的任何公认的分散和简并RNA位点的dsRNA。这类dsRNA分子的体内产生是非常需要的，因为减少外来序列减少了脱靶RNAi相互作用的机会。
发明内容
在以下实施例中描述的本发明提供了用于在体内产生大量未衣壳化的dsRNA的方法和组合物。所公开的方法和组合物代表了对目前产生dsRNA的体内方法的显著改进。
在一实施例中，本发明包含含有编码由非互补序列分开的自身互补序列段的基因的微生物细胞，使得在互补序列杂交时形成茎-环结构，其中分子的茎部分在被引入目标生物体中时起RNAi前体的作用。微生物细胞还含有编码衣壳蛋白的噬菌体外壳蛋白基因。dsRNA基因和外壳蛋白基因的表达导致未降解的dsRNA和衣壳蛋白的积累增加。以这种方式产生的dsRNA的量大大超过不存在衣壳蛋白时产生的dsRNA的量。
在一个实施例中，噬菌体衣壳蛋白由光滑噬菌体科(leviviridae)的物种的外壳蛋白基因编码。在优选的实施例中，外壳蛋白基因编码噬菌体MS2的衣壳蛋白。在另一个优选的实施例中，外壳蛋白基因编码噬菌体Qβ的衣壳蛋白。
在一实施例中，衣壳蛋白包含MS2衣壳蛋白的N端。在另一个实施例中，衣壳蛋白包含MS2衣壳蛋白的N端41、35、25、21或12个氨基酸。在一实施例中，衣壳蛋白包含Qβ衣壳蛋白的N端。在另一个实施例中，衣壳蛋白包含Qβ衣壳蛋白的N端41、35、25、21或12个氨基酸。
在一实施例中，编码dsRNA的基因可以与诱导型转录启动子缔合并且从其表达。外壳蛋白基因可以与组成型或诱导型转录启动子缔合并且从其表达。与dsRNA表达相关的诱导型转录启动子可以是与外壳蛋白基因表达相关的转录启动子相同的诱导型转录启动子或不同的转录启动子。在一个实施例中，在诱导与dsRNA表达相关的诱导型转录启动子之前诱导与外壳蛋白基因表达相关的诱导型转录启动子，以在产生dsRNA之前使衣壳蛋白积累。在另一个实施例中，与外壳蛋白基因表达相关的转录启动子是组成型转录启动子。
在一实施例中，编码dsRNA的基因和编码衣壳蛋白的外壳蛋白基因存在于质粒或染色体外元件上。编码dsRNA和外壳蛋白基因的基因可以存在于相同的质粒或染色体外元件上，或者可以存在于单独的质粒或染色体外元件上。在另一个实施例中，编码dsRNA和外壳蛋白的基因中的一个或两个可以存在于一个或多个微生物宿主细胞染色体上。
在相关的实施例中，可以通过裂解细胞以产生裂解物并且从裂解物内的细胞成分中纯化dsRNA，然后处理用于应用的纯化dsRNA，从微生物宿主细胞中纯化dsRNA。这类处理可包括但不限于与赋形剂、粘合剂或填充剂混合以改善物理处理特征，与稳定剂混合以减少降解，或与其它活性剂(如化学杀虫剂、杀真菌剂、脱叶剂或其它RNAi分子)混合以拓宽应用目标的范围，并且可包括粒化、喷雾干燥或将材料溶解于液体载剂中。在另一个实施例中，dsRNA不从裂解物中进一步纯化，而是直接进行处理以用于应用。在再一个实施例中，微生物宿主细胞不裂解但直接处理以用于应用，并且dsRNA在经过处理的细胞内保持未纯化。
附图说明
图1描绘了具有三个pac位点发夹序列的RNA茎-环结构，一个位于茎-环结构的5′，一个在茎-环结构的环内，另一个在茎-环结构的3′。
图2描绘了单链(有义)序列，其两侧各有一个pac位点发夹序列。
图3描绘了单链(反义)序列，其两侧各有一个pac位点发夹序列。
图4描绘了具有两个pac位点发夹序列的RNA茎-环结构，一个位于茎-环结构的5′，并且另一个位于茎-环结构的3′。
图5描绘了RNA茎-环结构，其具有位于茎-环结构3′的单个pac位点发夹序列。
图6描绘了缺乏任何pac位点发夹序列的RNA茎环结构。
具体实施方式
本发明包含用于在体内产生大量dsRNA的组合物和方法，并且在一些实施例中，直接从细胞裂解物中回收这类dsRNA。在其最基本的形式中，本发明涉及将噬菌体衣壳蛋白或其部分与所需的dsRNA一起共表达一段时间，所述时间足以使dsRNA在宿主细胞中积累，裂解宿主细胞，并且任选地直接从细胞裂解物中回收完整的未衣壳化的dsRNA。在不存在噬菌体衣壳蛋白的情况下，如果有的话，完整的dsRNA在细胞裂解物中仅以非常少的量存在。相反，在存在噬菌体衣壳蛋白下，可以从细胞裂解物中回收相对大量的未衣壳化的dsRNA。
探索了许多RNA结构和外壳蛋白的排列以确定本发明的基本要素并且优化本发明产生的dsRNA的产量。这一工作总结于表1和以下实例中，所述表概述了详细描述的本发明的各种要素。表1的最左列是指代表由每种所列质粒构建体产生的预测RNA结构的卡通描绘的各个图。在每个图中，“S”代表有义链，“AS”代表反义链，并且小发夹结构代表pac位点序列。所述表还列出了外壳蛋白(如果有的话)和与每种所列质粒构建体缔合的dsRNA(或如所示的ssRNA)的产量。
表1.通过大肠杆(E.coli)HT115(DE3)的RNA的产生随RNA结构变化和外壳蛋白和外壳蛋白变体存在与否而变化(n.a.＝不适用；n.d.＝不确定)。
A.定义
如本文所用，术语“衣壳蛋白”或“衣壳”是指噬菌体MS2或Qβ的外壳蛋白，其能够以高亲和力结合噬菌体RNApac位点并且组装成复杂的中空三级结构，其中噬菌体RNA在中空三级结构内完全衣壳化。在VLP中，衣壳蛋白形成中空的三级结构，其中异源RNA被完全衣壳化。术语“衣壳”还指通过组装各个衣壳蛋白形成的中空三级结构。
如本文所用，“ssRNA”和“dsRNA”分别指“单链RNA和双链RNA”。ssRNA由任何长度的RNA序列构成，其缺乏足够的内部同源性以形成任何显著的二级结构，如发夹或依赖于内部互补序列通过互补序列之间的核苷酸碱基的瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对彼此杂交的其它结构。相反，dsRNA包含具有足够内部同源性的RNA序列，以形成显著的二级结构，例如发夹，这是由于内部互补序列通过互补序列内的核苷酸碱基的瓦特生-克里克碱基配对彼此杂交。显著的二级结构通常涉及大于约9个碱基的同源段，但确切的长度在某种程度上取决于背景以及这类二级结构是否赋予分子任何生物学功能。
如本文所用，“质粒”或“染色体外元件”是指能够在宿主细胞内复制或稳定维持的任何染色体外游离基因。这一定义尤其包涵质粒，例如pBR322、pCG1和pACYC184，它们代表所述质粒的主链。本领域普通技术人员将认识到，其它质粒或稳定维持的病毒游离基因可以提供相同的维持、表达和选择所需的功能，并且可以从这类其它质粒或稳定维持的病毒游离基因中产生本文所述的基本质粒的替代物而无不当实验。本发明的关键特征是表达编码dsRNA和衣壳蛋白的基因的能力，而不是特定的复制模式、表达或在含有编码dsRNA和衣壳蛋白的基因的游离基因上发现的选择性标记。
“基本相似的序列”是指要求保护的衣壳蛋白的序列变异体，其保留促进dsRNA在如本文所述的微生物宿主细胞中积累的能力。这类基本上相似的序列包括具有至少26％同一性和47％相似性的序列，如MS2与Qβ衣壳蛋白序列之间的差异所示(通过blastp测定)。因此，基本上相似的序列涵盖保守和同源取代，使具有与MS2或Qβ衣壳蛋白序列低至95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或25％同一性和95％、90％、80％、70％、60％、50％或40％相似性的序列变异体促进dsRNA在微生物宿主中积累。
B.常用材料和方法
常规微生物和分子克隆方法和工具，包括用于产生和纯化DNA、RNA和蛋白质以及用于转化宿主生物体和表达如本文所述的重组蛋白和核酸的那些，充分在本领域普通技术人员的能力范围之内并且在文献中有很好的描述。参见，例如Sambrook等人，《分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第2版，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)(1989)；Davis等人，《分子生物学基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》，爱思唯尔科学出版有限公司(Elsevier Science Publishing Co.，Inc.)，纽约(N.Y.)(1986)；和Ausubel等人，《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》，格林出版协会(Greene Publ.Assoc.)，威立国际科学(Wiley-Interscience)，纽约(NY)(1995)。每个文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
下文中进一步详细描述的每种重组DNA构建体是基于衍生自质粒pBR322的常见质粒载体系列。这一质粒载体系列的第一个含有常规的合成DNA片段(由PCR GenScript，Piscataway，NJ产生)，其包含能够驱使噬菌体MS2衣壳基因的单拷贝转录的T7启动子序列，随后是T7终止子。将这一合成序列作为BamHI-SphI限制性片段插入pBR322的相应位点，形成质粒pAPSE10118。包含T7启动子序列、随后是MS2pac位点序列、按顺序(5′到3′)含有AsiSI-PmeI-AscI-RsrII-NotI-PacI限制性位点的多克隆位点、第二高亲和力变异体MS2pac型序列(C-pac)、T7终止子和SphI限制性位点的第二个合成序列被合成(PCRGenscript，Piscataway，NJ)，并且插入pAPSE10118的EcoRV位点，形成pAPSE10136。这两个定向以使得T7启动子指导pAPSE10136的相同链的转录(在标准pBR322图谱上顺时针)，但是由单个T7终止子彼此分开。
通过分别在5′侧和3′侧上并入AsiSI和PmeI限制性位点的PCR扩增黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的ErkA基因的180个核苷酸片段(对应于核苷酸156-335之间的GenBank寄存号NM_001300706的序列)。将这一ErkA基因片段插入pAPSE10136的相应位点产生pAPSE10169。通过PCR扩增产生ErkA基因片段序列的第二个互补拷贝，其在5′末端并入PmeI限制性位点，随后是含有额外的MS2pac序列的合成环序列，随后是NotI限制性位点，随后是互补(反义)ErkA基因片段序列和PCR片段的3′末端上的PacI限制性位点。合成环序列包含不能与ErkA基因片段序列杂交的随机序列。将ErkA基因片段的这一互补(反义)拷贝插入pAPSE10136的PmeI和PacI限制性位点，形成pAPSE10180(SEQ ID NO：1)。缺乏MS2衣壳蛋白的第二系列质粒载体通过SphI限制性消化缺失MS2衣壳表达序列并且重新连接衍生自pAPSE10180，产生pAPSE10181(SEQ ID NO：2)。
质粒pAPSE10180和pAPSE10181代表本文讨论的RNA构建体表达的基本平台。预测这些质粒中ErkA盒的转录产生能够形成大的茎-环结构的RNA转录物其包含180个碱基对茎和139个碱基环，其中3个单独的MS2pac序列位于茎的5′和3′处，并且在环自身内。本领域普通技术人员将理解，通过标准克隆和亚克隆方法可以容易地实现由其它序列取代ErkA基因片段序列。
将质粒pAPSE10180或pAPSE10181或其任何衍生物转化到能够诱导型表达T7聚合酶的宿主细胞中产生能够表达RNA转录物的细胞系。诱导产生RNA转录物的所有这类菌株在本文中通常称为“表达菌株”。除非另外指示，否则本文所述的质粒中的每一个被电穿孔到大肠杆菌菌株HT115(DE3)中，其基因型为F-、mcrA、mcrB、IN(rrnD-rrnE)1、rnc14：：Tn10(λDE3溶源：lacUV5启动子-T7聚合酶))，并且所得重组转化体在含有12μg/ml四环素和/或100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上进行选择。分离单菌落，通过限制性酶分析确认完整质粒的存在，并且将确认的转化细胞存档以备将来使用。
标准表达研究包含将转化细胞接种至含有0.1％的葡萄糖、0.4％的乳糖、100μg/ml氨苄青霉素和/或12.5μg/ml四环素的100ml超级培养液中以及在37℃下剧烈振荡培育培养物。通过消耗可用的葡萄糖和乳糖诱导物的存在，通过自动诱导实现T7聚合酶的表达。这确保了所有培养物在相同的生长阶段被诱导。诱导后十二到十八小时(晚期静止期)通过在4℃下以3,000g离心30分钟收获细胞并且存储在冰上直到裂解。
通过将5ml当量的收获细胞的细胞培养物重新悬浮于包含Tris-HCl pH 7、10mMNaCl的超声缓冲液中并且在冰上超声处理悬浮细胞3分钟，从收获的细胞中分离RNA。通过以16,000g离心去除细胞碎片，立即处理上清液(澄清的裂解物)以如所述回收RNA和VLP。使用商业Purelink RNA Mini Kit方法(安必逊(Ambion)目录第12183018A号，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)，Waltham，MA)根据制造商的说明书从一半澄清的裂解物中回收RNA。
从剩余的一半澄清的裂解物中纯化VLP，将其稀释到总体积为1mL，并且用100单位的核酸酶(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，St.Louis，MO)在37℃下处理两小时。随后，加入0.15mg蛋白酶K，并且酶处理的澄清裂解物在37℃下再培养三小时。通过分步沉淀从酶处理的澄清裂解物中回收VLPS。通过向水中加入硫酸铵直到其达到饱和(约4.1M)来制备饱和硫酸铵溶液。将五十微升饱和硫酸铵溶液加入酶处理的澄清裂解物中，并且将混合物置于冰上并且培育两小时。通过以16,000g离心从混合物中去除不需要的沉淀物，并且将水溶液转移到干净的埃彭道夫管(Eppendorf tube)中。然后通过向水溶液中直接加入0.171g干燥硫酸铵使水溶液进行第二次沉淀。涡旋水溶液并且在冰上培育两小时。将沉淀物以16,000g旋转，丢弃水相，并且将表示纯化VLP的固体沉淀物重新悬浮于100微升超声缓冲液中。
通过加入3倍体积的Trizol LS试剂(安必逊目录第10296028号，赛默飞世尔科技公司)、剧烈涡旋混合物、加入1ml氯仿、进一步涡旋混合物、之后脉冲离心以分离混合物的水相和有机相，从重新悬浮的纯化VLP中回收RNA。将水相置于干净的埃彭道夫管中，并且用商业RNA Clean&ConcentratorTM试剂盒(目录第R1018号，Zymo Research，Irvine，CA)根据制造商的说明书纯化RNA。
将来自细菌和VLP样品的RNA溶解于50μl不含核酸酶的水中。为了测定样品中dsRNA的浓度，用RNAse A(Invitrogen目录第AM2274号，赛默飞世尔科技公司)处理样品以在制造商推荐的条件下降解单链RNA，通过测量OD260和1μg加载到Novex6％TBE-尿素凝胶(Invitrogen，赛默飞世尔科技公司)上用分光光度法测定dsRNA的浓度。每个凝胶的一个泳道加载有已知浓度的dsDNA尺寸标记，并且对样品进行电泳，用溴化乙锭染色凝胶，并且使用dsDNA标记作为标准曲线，通过光密度测定法对每个条带进行定量。
来自产生ssRNA的构建体的RNA产量通过将从诱导细胞或VLP回收的有义链或反义链用过量的同源链退火来确定。然后用RNAse A处理退火的混合物，并且如上所述测量并入目标ssRNA的dsRNA的量。
在收获样品的任何培养物之间观察到最终细胞密度的很小或没有差异，并且在所有情况下培养物似乎在收获前已达到静止期。为了使直接样品比较RNA产量，将所有dsRNA和ssRNA浓度报导为1L当量培养物中存在的这类RNA的量。
Northern印迹分析用于使用针对包含每个dsRNA构建体(5′-GGCCGGCGTCT-ATTAGTAGATGCC-3′，SEQ ID NO 3)的环的随机序列的DNA寡核苷酸探针来验证含有dsRNA转录物的条带的同一性。将来自6％聚丙烯酰胺变性尿素-TBE凝胶的RNA转移至带正电荷的BrightStar-Plus尼龙膜(安必逊目录第10102号，赛默飞世尔科技公司)，其使用半干燥反印迹(Trans-Blot)SD转移设备(伯乐(BioRad)，Hercules，CA)在0.3A的恒定电流下进行1小时。通过SpectroLinker XL-1500UV交联装置(Spectronics Corporation，Westbury，NY)使用“最佳交联”设置将RNA固定在膜上。将膜用水简单冲洗并且在50ml 5XSSC、0.1％SDS缓冲液中于45℃下预先杂交并且轻轻摇动。探针杂交在45℃下于3ml预杂交缓冲液中进行过夜，并且轻轻摇动。靶向发夹RNA环的寡核苷酸探针与TAMRA缀合。在室温下用100ml水完成三次洗涤(每次2分钟)，并且使用罗丹明通道用ChemiDoc MP成像系统(伯乐，Hercules，CA)进行印迹。
C.优选实施例
以下是本发明的优选实施例。
本发明的一个实施例包含含有编码所需dsRNA基因和噬菌体衣壳蛋白基因的质粒的细菌宿主细胞，从而转录dsRNA和衣壳蛋白基因，从而产生所需dsRNA并且翻译衣壳蛋白基因以产生衣壳蛋白，并且其中，在适当的一段时间后，未衣壳化的dsRNA在细胞内积累的程度比不存在衣壳蛋白时高得多。在其它实施例中，dsRNA基因和衣壳蛋白基因可以存在于分开的可相容质粒、自主维持的噬菌体或其它表观遗传元件上，或者一种或两种基因可以存在于细菌宿主细胞的染色体内。
在一实施例中，dsRNA基因和衣壳蛋白基因各自从转录启动子转录。转录启动子可以是诱导型的。在一个实施例中，转录启动子是相同的；在其它实施例中，启动子是不同的。在再其它实施例中，可以差异诱导转录启动子。在这类差异诱导型实施例中，可以优选在诱导dsRNA表达之前诱导衣壳蛋白的表达。
在另一个实施例中，衣壳蛋白和dsRNA可以作为来自单个启动子的单个转录物转录。启动子可以是诱导型的。在这类实施例中，通过转录后处理从含有衣壳蛋白编码序列的初始RNA转录物切割dsRNA，这类转录后处理可取决于细菌宿主细胞方法或可由其它RNA处理系统(如核酶或特异性核糖核酸酶)指导。
在一个实施例中，dsRNA和衣壳蛋白基因中的一个或两个可从转录启动子诱导转录，并且转录由转录终止子终止。在一实施例中，诱导型转录启动子是噬菌体T7基因1启动子。在其它实施例中诱导型转录启动子可以是噬菌体λPL或PR启动子、lac操纵子、trp操纵或合成tac启动子或噬菌体T5启动子。在一些实施例中，也可以使用本领域普通技术人员已知的其它转录启动子，包括组成型和诱导型。在一实施例中，转录终止子是噬菌体T7晚期终止子。在一些实施例中也可以使用本领域普通技术人员已知的其它rho依赖性和rho非依赖性转录终止子。
在一实施例中，外壳蛋白基因编码左旋病毒衣壳蛋白。外壳蛋白基因可以是编码MS2衣壳蛋白的MS2外壳蛋白基因或基本上相似的序列，其保留使dsRNA在微生物宿主细胞中积累的能力。外壳蛋白基因可编码编码Qβ衣壳蛋白的Qβ外壳蛋白基因或基本上相似的序列，其保留允许dsRNA在微生物宿主细胞中积累的能力。
在一实施例中，通过化学或机械方法从共表达噬菌体衣壳蛋白的细菌宿主细胞中回收dsRNA，以产生宿主细胞裂解物。在一实施例中，从宿主细胞裂解物中进一步纯化dsRNA以去除宿主细胞衍生的蛋白质、核酸和包括衣壳蛋白的膜。在另一个实施例中，直接处理宿主细胞裂解物而无需进一步纯化。在另一个实施例中，通过化学或热或其它方式杀死细菌宿主细胞而不裂解，并且未经进一步纯化处理完整的灭活细胞。
实例
实例1
在衣壳蛋白存在下，与不存在衣壳蛋白的情况相比，未衣壳化的dsRNA以更高的水 平产生。
构建含有pAPSE10180和pAPSE10181的表达菌株，并且通过上述标准表达程序诱导dsRNA产生。如所述测量每个菌株产生的衣壳化和未衣壳化的dsRNA的量。这一实验的最初推动力是确定具有180个碱基对双链茎结构的RNA分子是否可以包装在VLP内。180bp的dsRNA茎长为约60nm，而MS2衣壳的内径为约20nm。基于这种几何限制，预期很少或几乎没有衣壳化，并且由于宿主核酸酶活性，预期很少或几乎没有未衣壳化的dsRNA可从细胞裂解物中回收。如所预期的，仅从pAPSE10180表达细胞中回收少量衣壳化的dsRNA(在衣壳内)(＜2mg/L)。相反，令人惊讶的是，从pAPSE10180表达细胞中回收了大量未衣壳化的dsRNA(在衣壳外)(75-90mg/L)。甚至更令人惊讶的是，实际上没有从pAPSE10181表达细胞中回收未衣壳化的dsRNA。
为了确定RNA的积累是否是ErkA序列的特定特性或者是否是在衣壳蛋白存在下表达dsRNA的更一般特性，产生并且测试表达来自科罗拉多(Colorado)马铃薯甲虫的β肌动蛋白基因的294个碱基序列(马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)菌株Freeville，核苷酸156-335之间的GenBank寄存号NM_001300706)的一系列表达构建体。
最初，通过替换ErkA序列从pAPSE10180构建以有义和反义定向表达来自科罗拉多马铃薯甲虫的294个碱基β肌动蛋白序列的质粒，以分别产生pAPSE10189(SEQ ID NO：4和pAPSE10190(SEQ ID NO：5)。通过来自gBlock模板的PCR(Accuprime Pfx，Invitrogen目录第12344040号，赛默飞世尔科技公司)，使用分别在5′末端和3′末端引入AsiSI和PmeI限制性位点的引物(gBlock模板DNA和PCR引物由Integrated DNA Technologies，CoralvilleIA合成；所有限制性核酸内切酶都来自New England BioLabs，Beverly，MA)，扩增β肌动蛋白有义链和反义链序列。用AsiSI和PmeI限制性消化pAPSE10180和β肌动蛋白有义和反义PCR片段，产生可以以所需方式连接在一起的DNA片段。将缺乏ErkA序列的pAPSE10180质粒主链凝胶纯化，并且将有义和反义β肌动蛋白序列连接到凝胶纯化的载体中，分别产生pAPSE 10189和pAPSE 10190。当转化为合适的表达宿主，如HT115(DE3)时，在如上所述培养和诱导时，含有pAPSE10189的细胞产生ssRNA转录物以及共表达MS2衣壳蛋白，所诉转录物包含侧翼为pac序列的β肌动蛋白基因的有义链的294个碱基。同样地，当如所述转化到合适的表达宿主中、培养和诱导时，含有pAPSE10190的细胞产生ssRNA转录物以及共表达MS2衣壳蛋白，所诉转录物包含侧翼为pac序列的β肌动蛋白基因的相同区域的反义链的294个碱基。通过用如上所述的β肌动蛋白基因的有义和反义294个碱基片段替换pAPSE10181的ErkA序列，也产生了缺乏表达MS2衣壳蛋白的能力的第二组质粒。将这些质粒pASPE10274(SEQID NO：6)和pAPSE10275(SEQ ID NO：7)分别转化到HT115(DE3)中并且如所述进行培养和诱导。
无论是否与衣壳蛋白(如pAPSE10189和pAPSE10190一样)(pAPSE10274和pAPSE10275)共表达，从细胞中回收的未衣壳化RNA的分析显示实际上不能回收ssRNA。然而，从pAPSE10189和pAPSE10190回收的VLP分别产生至少20mg/L的有义或反义序列的ssRNA。这证实了质粒表达系统能够如预期的那样产生ssRNA和衣壳蛋白。
通过类似于针对dsRNA ErkA表达盒所述的方法构建包含294个碱基科罗拉多马铃薯甲虫β肌动蛋白基因的dsRNA表达盒。在这种情况下，包含β肌动蛋白序列的有义链与反义链之间的环的随机DNA序列包含166个碱基，包括与pAPSE10180和10181中发现的相同的内部pac位点序列。将这一β肌动蛋白表达盒克隆到pAPSE10180中，替换ErkA相关的茎环序列以形成质粒pAPSE10269(SEQ ID NO：8)，并且克隆到pAPSE10181中以形成质粒pAPSE10306(SEQ ID NO：9)。将质粒转化到HT115(DE3)中，如所述进行培养和诱导。对含有pAPSE10269菌株的细胞产生的衣壳化dsRNA的分析显示，可以从VLP中回收2-10mg/L dsRNA。然而，可以从含有未衣壳化形式(200mg/L)的pAPSE10269的细胞中回收更高水平的β肌动蛋白dsRNA。引人注目的是，对pAPSE10306菌株产生的RNA的分析显示，在不存在共表达的衣壳蛋白的情况下，仅可回收约3mg/L的dsRNA。
因此，高水平的未衣壳化的dsRNA与这类dsRNA未被有效包装的模型一致，但由于某种原因，似乎存在于共表达衣壳蛋白的细胞中，dsRNA的水平比缺乏衣壳蛋白的细胞高得多。考虑这一观察结果的一个模型是衣壳蛋白与pac位点的结合抑制宿主细胞核酸酶的降解。
实例2
高水平产生dsRNA不需要特异性pac位点-衣壳蛋白相互作用。
为了测试与dsRNA中的pac位点结合的衣壳蛋白是否导致观察到的共表达衣壳蛋白的细胞中dsRNA产生的增加，可能抑制结合的dsRNA的内源宿主核酸酶降解，包含上文所述的基本β肌动蛋白dsRNA的一系列构建体产生了不同数量和位置的pac位点。质粒pAPSE10216(SEQ ID NO：10)和pAPSE10305(SEQ ID NO：11)分别与pAPSE10269和pAPSE10306一致，除了它们缺乏内部环pac位点。质粒pAPSE10219(SEQ ID NO：12)和pAPSE10304(SEQ ID NO：13)分别与pAPSE10217和pAPSE10306意志，除了它们仅具有位于dsRNA茎的3′末端上的单个pac位点。质粒pAPSE10279(SEQ ID NO：14)和pAPSE10303(SEQID NO：15)与pAPSE10216和pAPSE10306一致，除了它们完全缺乏所有pac位点序列。将这些质粒中的每一种转化到大肠杆菌HT115(DE3)中，如所述进行培养和诱导。从pAPSE10216和pAPSE10219中的每一个的VLP中回收的衣壳化RNA的分析显示5-20mg/L的dsRNA被衣壳化。引人注目的是，即使含有完全缺乏pac位点的pAPSE10279的菌株也产生4mg/L的衣壳化dsRNA，表明这种衣壳化水平可能代表衣壳形成时细胞中存在的dsRNA的非特异性夹带。此外，含有pAPSE10216的菌株在衣壳蛋白存在下产生多达250mg/L的未衣壳化的dsRNA。含有pAPSE10219和pAPSE10279的菌株在衣壳蛋白存在下分别产生30-60mg/L和65mg/L的未衣壳化的dsRNA。所有含有包含表达盒而无衣壳蛋白的共表达的质粒的菌株产生＜4mg/L的dsRNA。
总之，这些结果表明衣壳蛋白增加可从细胞裂解物中回收的未衣壳化的dsRNA的量的能力不依赖于衣壳蛋白与其同源pac位点序列的特异性结合。尽管从含有至少5′和3′侧翼pac位点(约200mg/L)的构建体中回收了最高水平的未衣壳化的dsRNA，但是通过仅具有单个3′侧翼pac位点或完全缺乏pac位点的构建体产生显著量的未衣壳化的dsRNA。当衣壳蛋白与dsRNA共表达时，相对于完全缺乏衣壳蛋白的细胞系(3-4mg/L)，含有产生缺乏pac位点的dsRNA的质粒的细胞完全产生显著更高量的dsRNA(65mg/L)。共表达衣壳蛋白的细胞与缺乏衣壳蛋白的细胞之间可回收dsRNA的约16倍增加(65mg/L与3-4mg/L)远远超过由于pac位点的存在而增加约3倍-4倍(65mg/L与200-250mg/L)。衣壳蛋白共表达的作用似乎涉及除了仅与可能(或可能不)存在于dsRNA上的同源pac位点序列结合之外的事物。
实例3
环尺寸和结构与dsRNA的高水平产生无关。
为了测试在存在和不存在共表达的衣壳蛋白的情况下环序列的差异(如果存在的话)可能对dsRNA的产生有何种影响，在pAPSE10269的294个碱基有义和反义β肌动蛋白序列中的每一个之间插入具有不同长度的内部非同源环序列的一系列构建体。
质粒pAPSE10270(SEQ ID NO：16)、pAPSE10271(SEQ ID NO：17)、pAPSE10272(SEQID NO：18)和pAPSE10292(SEQ ID NO：19)分别具有116个碱基、136个碱基、156个碱基和166个碱基的非同源环尺寸。这些环序列中的每一个对于任何二级结构具有非常小的倾向，如通过m-折叠结构预测程式(Zucker和Stiegler(1981)《使用热力学和辅助信息的大RNA序列的最佳计算机折叠(Optimal computer folding of large RNA sequences usingthermodynamics and auxiliary information)》Nucl.Acids.Res.9(1)：133-48).)所确定。此外，发现与pAPSE10180中的ErkA茎序列缔合并且在环内具有稍高的结构相互作用倾向的139个碱基环序列也置于pAPSE10269的有义和反义β肌动蛋白序列之间，以形成pAPSE10292。另外，如所述合成并且构建pAPSE10291(SEQ ID NO：20)，其包含具有基于内部同源性形成二级结构的高度倾向的142个碱基环序列。
将这一实例中描述的每种质粒转化到大肠杆菌表达菌株HT115(DE3)中，培养和诱导，并且如所述测定衣壳化和未衣壳化的dsRNA的量。在每种情况下，从通过诱导质粒表达产生的VLP中回收2-10mg/L的dsRNA，表明环尺寸或结构对VLP衣壳化dsRNA的能力影响很小或几乎没有影响。同样地，来自每种质粒的表达在100与200mg/L未衣壳化的dsRNA之间产生，表明在衣壳蛋白存在下环尺寸或结构对未衣壳化的dsRNA的总体产生影响很小或几乎没有影响。
实例4
茎尺寸与dsRNA的高水平产生无关。
衍生自由pAPSE10180表达的表达的黑腹果蝇ErkA基因序列与由pAPSE10269表达的科罗拉多马铃薯甲虫β肌动蛋白基因序列的茎序列的差异在表达菌株产生大量未衣壳化的dsRNA的能力方面没有显著差异(来自pAPSE10180的75-90mg/L与来自pAPSE10269的200mg/L)。dsRNA茎的长度也没有显著差异(由pAPSE10180产生的dsRNA中的180个碱基对和由pAPSE10269产生的dsRNA中的294个碱基对)。为了更系统地测试在共表达的衣壳蛋白存在和不存在下茎序列长度的差异(如果有的话)可能对dsRNA的产生有何种影响，用形成pAPSE10269的有义和反义β肌动蛋白序列的294个碱基茎中的每一个取代一系列具有不同茎序列长度的表达构建体。
质粒pAPSE10276(SEQ ID NO：21)和pAPSE10277(SEQ ID NO：22)分别编码具有50和75个碱基对的潜在双链茎的dsRNA。由两种质粒表达的dsRNA包含非同源环序列的166个碱基。尽管这些dsRNA结构显著短于来自相应ErkA和β肌动蛋白构建体的dsRNA中的dsRNA结构，但它们仍然超过MS2VLP的内径。
当转化到如所述培养和诱导的大肠杆菌表达菌株HT115(DE3)中时，pAPSE 10276产生5-10mg/L的衣壳化dsRNA和80-120mg/L的未衣壳化的dsRNA。质粒pAPSE10277产生20-30mg/L衣壳化dsRNA和200-250mg/L未衣壳化的dsRNA。这些值类似于在这一实例中先前描述的pAPSE10180和pAPSE10269所观察到的值，表明茎长度和序列的差异在共表达衣壳蛋白的细胞中产生dsRNA中不起主要作用。
实例5
衣壳蛋白是高水平产生dsRNA所必需的。
为了证实对衣壳蛋白的需求，改变质粒pAPSE10216，其在衣壳蛋白存在下以高水平产生dsRNA产物，以用eGFP替换MS2外壳蛋白基因。设计、产生和用涵盖5′侧上的BamHI位点和3′侧上的SalI位点的引物扩增包含pAPSE10216的T7启动子序列到T7终止子序列(跨越质粒的独特BamHI与SalI位点之间的序列)的gBlock模板，其中用eGFP的编码序列替换MS2外壳蛋白的编码序列。将所得1kb片段用BamHI和SalI消化，然后连接到BamHI-SalI消化的pAPSE10216中以形成pAPSE10366(SEQ ID NO：24)。质粒pAPSE10366通过限制性消化证实，并且转化到如所述进行培养和诱导的大肠杆菌表达菌株HT115(DE3)中，与pAPSE10216产生的200mg/L相比，pAPSE10366产生＜2mg/L的未衣壳化的dsRNA。此外，细胞表达大量的eGFP，如通过诱导产生的强荧光(数据未显示)所证明，证实在这些研究中使用的基本双表达质粒正如预期进行。这一结果进一步证明衣壳蛋白对于在表达靶RNA基因的细胞中积累未衣壳化的dsRNA是必需的，否则在衣壳蛋白的存在下积累未衣壳化的dsRNA。
为了进一步证实衣壳蛋白的存在对于高水平的未衣壳化的dsRNA产生是必要的，构建了与pAPSE10181相容并且能够诱导型表达MS2衣壳蛋白的质粒。pAPSE10149(SEQ IDNO：23)是基于pACYC184。这种质粒包含P15A复制起点，其不被基于colE1的pAPSE10181复制起点和氯霉素乙酰转移酶抗生素标记排除，以使得选择含有pAPSE10181(编码氨苄青霉素抗性)和pAPSE10149(编码氯霉素抗性)的共转化体。质粒pAPSE10149还包含相同的T7启动子序列，其能够驱使噬菌体MS2衣壳基因的单拷贝转录，然后是如克隆到pACYC184的BamHI和SphI位点中的pAPSE10118中发现的T7终止子。将质粒pAPSE10149转化到已含有pAPSE10181的表达菌株中以产生氨苄青霉素和氯霉素抗性双转化体。这类双转化体的表达研究显示，来自pAPSE10149的衣壳蛋白与pAPSE10181的共表达产生200mg/L的未衣壳化的dsRNA，而仅含有pAPSE10181的细胞产生＜2mg/L的未衣壳化的dsRNA(参见实例1)。这表明反式提供衣壳蛋白足以促进对含有表达dsRNA靶的质粒的宿主细胞产生高水平的未衣壳化的dsRNA，否则在不存在衣壳蛋白的情况下不能积累未衣壳化的dsRNA。
实例6
其它衣壳蛋白可以诱导dsRNA的高水平产生。
为了测试未衣壳化的dsRNA的积累是否是噬菌体MS2衣壳蛋白的独特特性，或者其它衣壳蛋白是否具有这种特性，构建了类似于pAPSE10216的质粒表达系统。这种质粒pAPSE10359(SEQ ID NO：25)在β肌动蛋白dsRNA表达盒的5′末端和3′末端包含Qβ衣壳蛋白和Qβpac位点，但在所有其它方面与pAPSE10216相似。
简单地说，通过Integrated DNA Technologies，Coralville，IA合成Qβ外壳蛋白基因序列(核苷酸1343与1744之间的Genebank寄存号NC_001890)作为gBlock片段。用具有引物的PCR扩增合成片段，所述引物引入BamHI限制性位点，然后是Qβ外壳蛋白基因上游的T7启动子序列，接着是T7终止子和SphI限制性位点。将扩增的合成片段和质粒pBR322用BamHI和SphI消化，并且连接在一起形成中间质粒pAPSE10358。pAPSE10269的β肌动蛋白dsRNA序列通过具有引物的PCR扩增，所述引物引入EcoRI限制性位点，然后是Qβpac序列，接着是β肌动蛋白dsRNA序列，接着是Qβpac序列的第二个拷贝，接着是BamHI限制性位点。将含有这一扩增的β肌动蛋白的序列和质粒pAPSE10358用EcoRI和BamHI消化，并且连接在一起形成pAPSE10374。用AsiSI和NotI消化质粒pAPSE10374和pAPSE10216。这将pAPSE10374切割成4,713和113个碱基对的两个片段，并且将pAPSE10216切割成5,204和786个碱基对的两个片段。将4,713和786个碱基对片段分离并且连接在一起以产生pAPSE10359。
当转化到如所述培养和诱导的大肠杆菌表达菌株HT115(DE3)中时，相对于由缺乏衣壳蛋白的相似构建体(pAPSE10305)产生的dsRNA的量，pAPSE10359将产生大量未衣壳化的dsRNA。这种模式类似于实例1中描述的pAPSE10216和pAPSE10305所观察到的模式，将证实Qβ衣壳蛋白，如MS2衣壳蛋白的表达，足以增加体内产生的dsRNA的量。
实例7
除衣壳蛋白之外的RNA结合蛋白不足以高水平产生dsRNA。
为了测试未衣壳化的dsRNA的积累是否是一般RNA结合的功能或是否对噬菌体衣壳蛋白具有特异性，构建了质粒表达系统pAPSE10357(SEQ ID NO：26)，其包含人类U1A蛋白的RNA结合域和其来自β肌动蛋白dsRNA的有义和反义茎环结构的人类U1snRNA 5′和3′的发夹同源结合位点。质粒pAPSE10357类似于pAPSE10216，其中衣壳蛋白被人类U1A RNA结合蛋白和β肌动蛋白dsRNA表达盒的5′末端和3′末端的U1A结合位点序列替换，但在所有其它方面与pAPSE10216相似。
使用PCR引物由U1A蛋白的克隆拷贝(质粒pAV105，Kathleen Hall教授，华盛顿大学(Washington University)St.Louis，MO)扩增编码包含人类U1A蛋白的RNA结合域的N端102个氨基酸的DNA序列，所述引物引入BamHI限制性位点的引物，接着是U1A基因片段上游的T7启动子序列，接着是T7终止子和SphI限制性位点。将扩增的合成片段和质粒pBR322用BamHI和SphI消化，并且连接在一起形成中间质粒pAPSE10356。pAPSE10269的β肌动蛋白dsRNA序列通过具有引物的PCR扩增，所述引物引入EcoRI限制性位点，然后是来自人类U1snRNA序列的发夹结合位点序列，接着是β肌动蛋白dsRNA序列，接着是来自人类U1 snRNA序列的发夹结合位点序列的第二个拷贝，然后是BamHI限制性位点。将含有这一扩增的β肌动蛋白的序列和质粒pAPSE10356用EcoRI和BamHI消化，并且连接在一起形成pAPSE10373。用AsiSI和NotI消化质粒pAPSE10373和pAPSE10216。这将pAPSE10373切割成4,627和113个碱基对的两个片段，将pAPSE10216切割成5,204和786个碱基对的两个片段。将4,713和786个碱基对片段分离并且连接在一起以产生pAPSE10357。
当转化到如所述培养和诱导的大肠杆菌表达菌株HT115(DE3)中时，相对于由缺乏衣壳蛋白的类似构建体(pAPSE10305)产生的dsRNA的量，pAPSE10357不会产生显著量的未衣壳化的dsRNA。这将证实仅仅存在与dsRNA结合的RNA结合位点和结合蛋白不足以增加体内产生的dsRNA的量。或者，显著量的未衣壳化的dsRNA的产生将表明在5′末端和3′末端存在RNA结合位点和同源RNA结合蛋白足以增加dsRNA的体内产生。
实例8
衣壳蛋白的N端足以高水平产生dsRNA。
为了检查来自含有dsRNA基因和外壳蛋白基因两者的质粒的dsRNA增加的产生是否需要完整的衣壳蛋白或是否只需要一部分蛋白，将移码突变引入pAPSE10180的外壳蛋白基因序列中。。用限制性酶StuI和PmlI双重消化pAPSE10180产生两个限制性片段，一个具有5,485个碱基对的大片段和一个包含来自pAPSE10180外壳蛋白起始密码子的约40个密码子的约4个衣壳蛋白CDS密码子的小的十三个碱基对片段。限制性酶产生平末端并且重新连接较大的片段以产生质粒pAPSE10372(SEQ ID NO：27)，其除了产生完整的诱导型dsRNA ErkA特异性序列外，还包含诱导型的移码蛋白，其在终止于终止密码子(SEQ ID NO：28)之前包括MS2外壳蛋白的N端41个密码子，然后是移码序列的27个密码子。当将pAPSE10372转化到大肠杆菌表达菌株HTE115(DE3)中并且如所述进行培养和诱导时，产生75mg/L的dsRNA。这表明仅衣壳蛋白的N端足以增加dsRNA以及完整衣壳蛋白的产生(比较表1中pAPSE10180和pAPSE10372的产量)。
MS2衣壳蛋白的N端形成独特的三维结构，其由四个独立的β折叠(D.Peabody，《噬菌体MS2外壳蛋白的RNA结合位点(The RNA binding site of bacteriophage MS2 coatprotein)》，The EMBO Journal 12(2)595-600(1993))组成。这些折叠中的每一个：来自氨基酸31-35的βD、来自氨基酸22-25的βC、来自氨基酸19-21的βB和来自氨基酸8-11的βA可能在N端衣壳蛋白片段改善dsRNA产生的能力中起作用。。注意，所述术语是皮博迪(Peabody)的名称，并且编号包括皮博迪省略的N端蛋氨酸。这些结构基序中的每一个的逐步缺失可以确定改善dsRNA产生的最小序列要求。
实例9
补料分批发酵产生极高水平的dsRNA产生。
为了确定是否可以通过改善微生物生长条件来增加dsRNA的量，进行葡萄糖补料分批发酵。简单地说，补料分批发酵在37℃下在埃彭道夫BioFlo 115发酵罐中进行通过自动添加30％氢氧化铵来控制pH。通过拔出DO探针将溶解氧探针校准到0％，并且在空气饱和度下校准到100％。通过级联控制搅拌使容器在2vvm下充气并且溶解氧保持在30％。含有pAPSE10379的HT115(DE3)的过夜培养物在37℃下生长于含有100ug/ul的氨苄青霉素和12.5ug/ul的四环素的LB中以接种种子培养基。种子培养基是由pH值保持在7.0的5.68g/LNa2HPO4、1.34g/L KH2PO4、6.6g/L(NH4)2SO4、10g/L的葡萄糖、1×痕量金属和1×维生素溶液组成的确定的培养基。为了确保质粒稳定性，以100ug/ul氨苄青霉素和12.5ug/ul四环素加入抗生素。在饱和(OD6003-5)时，种子培养物用于为发酵罐提供10％的接种物。
在补料分批培养期间，根据碳限制DO stat进料策略加入50％(w/v)葡萄糖溶液。基础培养基由6g/L K2HPO4、3g/L NaHPO4、10g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4、1×痕量金属溶液组成，其中抗生素以100ug/ul氨苄青霉素和12.5ug/ul四环素加入。在葡萄糖提供的初始碳源耗尽时，以保持DO水平为饱和度的30％的方式自动添加进料溶液。
一旦细胞培养物达到OD600为60，通过将葡萄糖进料转换为乳糖进料，用1mM IPTG或20g/L乳糖的进料诱导细胞。诱导后，在诱导后的不同时间取1mL样品。通过将细胞小球超声处理到pH 7下的20mM Tris-HCl中裂解样品。使用众所周知的Trizol提取程序纯化来自细胞小球的总RNA。简单地说，将1体积的细胞裂解物加入1体积的Trizol RNA提取试剂中。加入1体积的氯仿导致RNA分配到水层中，留下蛋白和DNA污染物。
为了分析dsRNA的产量，将总RNA样品稀释到1μg/μl并且进行RNAseA处理。反应在pH 7.0和37℃下的20mM Tris中进行40分钟。一旦这完成，将蛋白酶K加入反应中以去除核酸酶，并且使其在37℃下反应40分钟。完成这一步骤后，将剩余的dsRNA稀释一半、四分之一和八分之一，以便使用凝胶光密度测定法测定dsRNA的浓度。
通过凝胶密度测定法对dsRNA产量的定量通过在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上比较dsRNA条带的强度与已知质量和重量的dsDNA条带进行。使用λ100bp可定量的DNA标记，并且产生标准曲线以确定可以可靠地定量来自发酵的dsRNA的范围。计算机程式计算加载在凝胶上的样品量中的dsRNA的量，并且进行考虑稀释步骤的反向计算。在这些条件下用IPTG和乳糖两者作为诱导剂计算了高达3g/L水平的dsRNA产量。这些结果表明通过改善发酵条件可以进一步增加dsRNA产生。
实例10
用于在革兰氏阳性细菌中dsRNA产生的组合物和方法。
通过衣壳蛋白的共表达，革兰氏阳性细菌产生增加水平的dsRNA的能力可以用以下方式检验。含有诱导型T7RNA聚合酶基因的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)MB001(DE3)菌株DSM 102071(描述于Kortmann等人，《用于谷氨酸棒状杆菌的染色体编码的T7 RNA聚合酶依赖性基因表达系统(A chromosomally encoded T7 RNApolymerase-dependent gene expression system for Corynebacterium glutamicum)》，《单细胞水平的构建和比较评估(construction and comparative evaluation at thesingle cell level)》.《生物技术通报(Microb Technol.)》8(2)：253-65.2015年3月)被修饰以基因敲除编码RNAse III的rnc基因同源物。简单地说，合成能够扩增与紧邻rnc基因上游的谷氨酸棒状杆菌菌株MB001(DE3)中存在的序列同源的1.2kb序列的PCR引物和能够扩增与紧邻rnc基因下游的序列同源的1.5kb序列的PCR引物。使用谷氨酸棒状杆菌菌株MB001(DE3)基因组DNA和所述引物的PCR扩增反应产生包含(通过标准重叠PCR方法)连接在一起的1.2kb和1.5kb靶序列的单个DNA片段以产生约2.7kb的SalI-BamHI合成DNA片段。这种SalI-BamHI DNA片段和质粒pK18mobsacB(ATCC87097，由Schafer等人描述，《衍生自大肠杆菌质粒pK18和pK19的小型可动员多用途克隆载体：谷氨酸棒状杆菌的染色体中确定的缺失的选择(Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from theEscherichia coli plasmids pK18 and pK19：selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum)》.Gene 145：69-73)用SalI和BamHI消化，并且产物连接在一起以产生质粒pAPSE10429(SEQ ID NO：29)。将质粒pAPSE10429转化到谷氨酸棒状杆菌菌株MB001中，并且在含有卡那霉素的固体LB培养基上选择转化体以鉴定染色体整合体。将卡那霉素抗性克隆转移到含有20％蔗糖的固体LB培养基中。sacB基因产物对蔗糖的转化对谷氨酸棒状杆菌菌株MB001是有毒的，因此只有那些随后从染色体中缺失sacB基因的染色体整合体才能在这类培养基上存活。使存活的菌落长大并且通过PCR筛选以确认伴随的染色体rnc基因座的丧失。所需的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)rnc。这种菌株具有诱导型T7RNA聚合酶并且缺乏rnc基因，并且适合于在存在和不存在衣壳蛋白的情况下测试dsRNA产生的功效。
通过合成包含革兰氏阳性质粒pCG1的复制起点的DNA(GeneBank寄存号第AB027714号；由Trautwetter和Blanco描述，《谷氨酸棒状杆菌质粒pCG100的结构组织(Structural organization of the Corynebacterium glutamicum plasmid pCG100)》.《普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)》137：2093-101 1991)和pK18mobsacB的卡那霉素抗性基因构建能够在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌两者中表达衣壳外壳蛋白和dsRNA的穿梭载体。将这种合成DNA(SEQ ID NO：30)在独特的NruI限制性位点连接到先前描述的含有dsRNA的质粒中，以使得测试革兰氏阳性谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)rnc菌株中衣壳蛋白的存在是否以如下所述的高水平产生dsRNA
通过用NruI消化pAPSE10279并且将磷酸化的合成DNA连接到质粒中以产生质粒pAPSE10430(SEQ ID NO：31)来实现插入包含pCG1复制起点和卡那霉素抗性基因的合成DNA。基于与由166个碱基非同源环分开并且完全缺乏任何pac序列的科罗拉多马铃薯甲虫β肌动蛋白基因同源的先前描述的294个碱基有义和反义序列，质粒pAPSE10430含有卡那霉素抗性基因、噬菌体MS2外壳蛋白和dsRNA构建体。以类似的方式，还将包含pCG1复制起点和卡那霉素抗性基因的合成DNA连接到NruI消化的pAPSE10303中以产生pAPSE10431(SEQ IDNO：32)。质粒pAPSE10431含有氨苄青霉素和卡那霉素的抗性基因，以及与pAPSE10430相同的诱导型dsRNA构建体。然而，pAPSE10431缺乏pAPSE10430的诱导型MS2外壳蛋白基因。pAPSE10430和pAPSE10431的相关特征示于表2中，并且这两种质粒与其亲本质粒pAPSE10279和pAPSE10303之间的关系可分别通过比较表2和表1来确定。
在存在和不存在MS2外壳蛋白的情况下，使用相同程序构建含有一个、两个和三个pac位点的额外的质粒。通过将合成DNA片段连接到pAPSE10219的NruI位点，产生含有β肌动蛋白茎环结构的单个pac位点3′并且编码MS2外壳蛋白基因的质粒pAPSE10432(SEQ ID NO：33)。通过将合成DNA片段连接到pAPSE10304的NruI位点产生质粒pAPSE10433(SEQ ID NO：34)。质粒pAPSE10433与pAPSE10432一致，只是它缺乏诱导型MS2外壳蛋白基因。通过将合成DNA片段连接到pAPSE10216的NruI位点，产生含有位于β肌动蛋白茎环两侧上的一侧的两个pac位点序列并且编码MS2外壳蛋白的质粒pAPSE10434(SEQ ID NO：35)。通过将合成DNA片段连接到pAPSE10305的NruI位点产生质粒pAPSE10435(SEQ ID NO：36)。质粒pAPSE10435与pAPSE10434一致，只是它缺乏诱导型MS2外壳蛋白基因。通过将合成DNA片段连接到pAPSE10269的NruI位点产生含有三个pac位点序列的质粒pAPSE10436(SEQ ID NO：37)，其中一个为β肌动蛋白茎环的每个5′和3′，一个在环序列本身内(如图1所描绘)并且编码MS2外壳蛋白。通过将合成DNA片段连接到pAPSE10306的NruI位点产生质粒pAPSE10437(SEQ IDNO：38)。质粒pAPSE10437与pAPSE104360一致，只是它缺乏诱导型MS2外壳蛋白基因。
在每种情况下，继合成DNA片段连接到靶质粒的NruI位点之后，将转化连接反应脱盐并且转化到谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)rnc中并且选择卡那霉素的抗性。随后将选择的克隆在32℃下在含有卡那霉素的100ml LB培养基中生长直到培养物达到OD600 0.8，此时加入异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷直到终浓度为1mM以诱导T7聚合酶定向转录MS2外壳蛋白和dsRNA，或仅缺乏外壳蛋白的质粒中的dsRNA前体。使诱导的培养物在诱导后生长至少4小时，以留出足够的时间积累MS2外壳蛋白和dsRNA靶。通过在4℃下以3,000g离心收集细胞。将每个小球存储在4℃下直到处理。
通过将每个小球重新悬浮于约0.1体积的含有10mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH7.0)中并且超声处理以裂解细胞来纯化dsRNA。通过以16,000g离心去除细胞碎片。将所得裂解物与3体积的Trizol(安必逊生命技术(Ambion Life Technologies))混合，并且通过加入1体积的氯仿提取RNA。向水层中加入NaCl直到最终浓度为500mM并且随后进行乙醇沉淀，得到含有294bp siRNA前体和来自谷氨酸棒状杆菌宿主的RNA的小球。
在存在和不存在MS2外壳蛋白的情况下，为了测定用含有各种pac位点构型的质粒转化的谷氨酸棒状杆菌产生的dsRNA的量，将乙醇小球重新悬浮并且用RNAseA在37℃下处理1小时，然后在37℃下进行蛋白酶K消化1小时。使用伯乐ChemiDoc MP成像系统通过凝胶光密度测定法来实现dsRNA的定量。在含有0.001％溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上进行经过处理的dsRNA的几种稀释。使用100bp可定量的dsDNA梯(QuantiBP DNA梯λ)作为标准曲线，并且在处于标准曲线的线性范围内的浓度下定量dsRNA。如Image Lab 4.1的软件确定加载在凝胶上的dsRNA的浓度，并且通过考虑与凝胶上存在的dsRNA样品相关的稀释度来确定dsRNA的最终产量。
表2总结了由谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)rnc和上文所述各种质粒所产生的科罗拉多马铃薯甲虫β肌动蛋白dsRNA的所述dsRNA产量测定的预测结果。这类结果证实，革兰氏阳性宿主(如谷氨酸棒状杆菌)通过共表达MS2外壳基因和目标dsRNA靶产生大量dsRNA。
表2.通过谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)rnc的dsRNA预测产生随dsRNA结构变异和外壳蛋白存在与否而变化。
实例11
用于酵母中dsRNA产生的组合物和方法。
为了利用MS2噬菌体外壳蛋白形成适用于dsRNA积累的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)产生宿主，根据Gardner和Jasperson的程序(Gardner，JM和Jaspersen，SL，《操纵酵母基因组：缺失、突变和由PCR标记(Manipulating the yeast genome：deletion，mutation and tagging by PCR)》.《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》1205：45-78，2014)基因敲除酿酒酵母YPH 500[1}([2][3][4]{5][6}ATCC 76626{7][1}[9]){5]的Rnt1基因。KanMx4基因由具有PCR引物的pML104-KanMx4质粒(Laughery等人，《用于在酿酒酵母中编辑的简单和流线型CRISPR-Cas9基因组的新载体(New vectors for simple andstreamlined CRISPR-Cas9 genome editing in Saccharomyces cerevisiae)》.《酵母(Yeast)》32(12)：711-20 2015年9月21日)扩增，所述引物包括酿酒酵母Rnt1基因上游区域(正向引物)的60个碱基对(bp)和下游区域的60个bp(反向引物)。按照建立的酿酒酵母转化方案，将所得PCR产物引入化学感受态酿酒酵母细胞中。将转化细胞在没有选择标记的情况下培育过夜，以使得发生同源重组，其中携带60bp的Rnt1上游和下游区域的kanMx4基因替换Rnt1基因。过夜培育后，将转化细胞接种在携带G418作为选择标记的YPD板上。通过PCR筛选G418抗性菌落以确认kanMx4基因的存在和YPH 500基因组中Rnt1基因的缺失。
酿酒酵母表达载体pESC-His、pESC-Leu、pESC-Ura和pESC-Trp广泛用于酿酒酵母中的重组蛋白表达。每个pESC载体(Agilent Technologies，Santa Clara CA)在相同的载体主链中含有四种不同的酵母选择标记(HIS3、TRP1、LEU2或URA3)中的一种，其使得在单个酵母细胞中表达两种不同的基因。使用具有酿酒酵母菌株YPH 500(MATαura3-52lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1)的pESC系列载体。在这个实例中，尽管使用类似方法可采用任何其它pESC载体，但针对MS2外壳蛋白和酿酒酵母内部的靶dsRNA序列的表达选择pESC-Trp载体，因为这些载体可以在酿酒酵母以及大肠杆菌中复制，它促进产生dsRNA所必需的分子操作。
pESC-Trp载体是通过将含有BamHI、SwaI、AsiSI、NotI、SacII和NheI位点、GAL1启动子的下游的50个碱基对的多克隆位点连接子克隆到现有的BamHI和NheI位点来修饰。此后，将pAPSE10279的β肌动蛋白茎环序列(dsRNA)切割为AsiS1/Not1片段，并且连接到修饰的pESC-Trp载体的AsiS1/Not1位点。这种质粒中dsRNA的表达处于半乳糖诱导型启动子GAL1的控制之下。新载体命名为pAPSE10439(SEQ ID NO：39)。另一种质粒pAPSE10440(SEQID NO：40)，其与pAPSE10439一致，但也包括MS2外壳蛋白。通过PCR扩增pAPSE10279的MS2外壳蛋白表达序列构建质粒pAPSE10440，其中正向引物在5′末端携带EcoRI限制性位点，并且反向引物在3′末端携带SacI位点。用EcoRI和SacI消化PCR产物，并且克隆到pAPSE10439的同源位点中。因此，pAPSE10439可诱导表达来自GAL1启动子的dsRNA，而pAPSE10440可诱导表达来自GAL1启动子的dsRNA序列和来自GAL10启动子的MS2外壳蛋白，
使用这种技术构建类似的质粒对。通过用AsiSI和NotI消化pAPSE10439和pAPSE10440并且分离载体片段来产生质粒pAPSE10441(SEQ ID NO：41)和pAPSE10442(SEQID NO：42)。还用AsiSI和NotI消化质粒pAPSE10219，并且分离dsRNA序列。将分离的dsRNA序列连接到pAPSE10439载体中以形成pAPSE10441，并且将分离的dsRNA序列连接到pAPSE10440载体中以形成pAPSE10442。通过用AsiSI和NotI消化pAPSE10439和pAPSE10440并且分离载体片段，产生质粒pAPSE10443(SEQ ID NO：43)和pAPSE10444(SEQ ID NO：44)。还用AsiSI和NotI消化质粒pAPSE10216，并且分离dsRNA序列。将分离的dsRNA序列连接到pAPSE10439载体中以形成pAPSE10443，并且将分离的dsRNA序列连接到pAPSE10440载体中以形成pAPSE10444。通过用AsiSI和NotI消化pAPSE10439和pAPSE10440并且分离载体片段，产生质粒pAPSE10445(SEQ ID NO：45)和pAPSE10446(SEQ ID NO：46)。还用AsiSI和NotI消化质粒pAPSE10269，并且分离dsRNA序列。将分离的dsRNA序列连接到pAPSE10439载体中以形成pAPSE10445，并且将分离的dsRNA序列连接到pAPSE10440载体中以形成pAPSE10446。
用上述每种质粒(pAPSE10439-46)分别转化化学感受态YPH 500DRnt1细胞，并且在合成右旋糖最小(SD)色氨酸(trp)脱落板上选择单个克隆。在接种100ml SD-Trp脱落培养液后，培养物生长12到16小时。然后通过以3000g离心5分钟收获来自培养物的细胞，用无菌水洗涤细胞小球一次，并且将细胞重新悬浮于缺乏色氨酸的合成半乳糖最小培养液(SG)中。细胞在SG-trp脱落培养液中生长过夜，以诱导dsRNA和MS2外壳蛋白的产生和积累(适当时)。通过在4℃下以3,000g离心收获细胞。在-20℃下存储每个小球直到处理。
通过将每个小球(10ml培养物)重新悬浮在约1.0ml酵母细胞裂解缓冲液(SigmaC4482)中来纯化dsRNA。将所得裂解物与3体积的Trizol(安必逊生命技术)混合，并且通过加入1体积的氯仿提取RNA。向水层中加入NaCl到最终浓度为500mM并随后进行乙醇沉淀，得到含有来自酿酒酵母宿主的dsRNA和RNA的小球。将所得RNA小球溶于pH 7.0的20mM TrisHCl中，并且测定样品的RNA浓度。为了确定酿酒酵母菌株产生的dsRNA的量，在37℃下用RNAseA消化已知量的来自pAPSE10439-pAPSE10446)的每个RNA样品的RNA(10μg)1小时，然后是在37℃下蛋白酶K消化1小时。所得样品仅含有dsRNA靶。使用BioRad ChemiDoc MP成像系统通过凝胶光密度测定法进行dsRNA的定量。在含有1.5％琼脂糖和0.001％溴化乙锭的凝胶上进行RNAse A反应的几种稀释。使用100bp可定量的dsDNA梯(QuantiBP DNA梯λ)作为标准曲线，并且在处于标准曲线的线性范围内的浓度下定量dsRNA。使用Image Lab 4.1软件，确定加载在凝胶上的dsRNA的浓度，并且通过计算加载在凝胶上的dsRNA的稀释度来计算dsRNA的最终产量。
表2总结了由酿酒酵母YPH-500和上文所述的各种质粒产生的科罗拉多马铃薯甲虫β肌动蛋白dsRNA的dsRNA产量测定的预测结果。这类结果证实，如酿酒酵母的酵母通过共表达MS2外壳基因和目标dsRNA靶产生大量dsRNA。
表2.通过酿酒酵母YPH 500的dsRNA的预测产生随dsRNA结构的变化和外壳蛋白存在与否而变化。

Claims (29)

1.一种在微生物细胞中产生未衣壳化的dsRNA的方法，其中所述dsRNA与编码衣壳蛋白的外壳蛋白基因共表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衣壳蛋白由光滑病毒科外壳蛋白基因编码。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述衣壳蛋白由噬菌体MS2的所述外壳蛋白基因编码。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述衣壳蛋白由噬菌体Qβ的所述外壳蛋白基因编码。
5.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述dsRNA的所述基因和编码所述衣壳蛋白的所述外壳蛋白基因由诱导型启动子表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其中编码所述衣壳蛋白的所述外壳蛋白基因由组成型启动子表达并且编码所述dsRNA的所述基因由诱导型启动子表达。
7.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述衣壳蛋白的所述外壳蛋白基因在编码所述dsRNA的所述基因之前或同时表达。
8.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述dsRNA的所述基因和编码所述衣壳蛋白的所述外壳蛋白基因存在于所述微生物细胞内的一个质粒或染色体外元件上。
9.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述dsRNA的所述基因和编码所述衣壳蛋白的所述外壳蛋白基因存在于所述微生物细胞内的单独的质粒或染色体外元件上。
10.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述dsRNA和所述衣壳蛋白的所述基因中的一个存在于质粒或染色体外元件上并且编码编码所述dsRNA和所述衣壳蛋白的所述基因中的另一个存在于所述微生物细胞的染色体上。
11.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述dsRNA的所述基因和编码所述衣壳蛋白的所述外壳蛋白基因存在于所述微生物细胞的染色体上。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述dsRNA是RNAi前体。
13.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述dsRNA后，所述微生物细胞随后被裂解并且所述dsRNA在处理以用于应用之前从所述裂解物纯化。
14.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述dsRNA后，所述微生物细胞被裂解并且处理以用于应用而不进一步纯化所述dsRNA。
15.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述dsRNA后所述微生物细胞被处理以用于应用而不裂解或进一步纯化所述dsRNA。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含截短的衣壳蛋白。
17.根据权利要求16所述的截短的MS2衣壳蛋白，其主要由所述衣壳蛋白的N端组成。
18.根据权利要求16所述的截短的衣壳蛋白，其包含所述衣壳蛋白的前41个氨基酸。
19.根据权利要求16所述的截短的衣壳蛋白，其包含所述衣壳蛋白的前35个氨基酸。
20.根据权利要求16所述的截短的衣壳蛋白，其包含所述衣壳蛋白的前25个氨基酸。
21.根据权利要求16所述的截短的衣壳蛋白，其包含所述衣壳蛋白的前21个氨基酸。
22.根据权利要求16所述的截短的衣壳蛋白，其包含所述衣壳蛋白的前11个氨基酸。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是细菌。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是革兰氏阴性细菌。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是大肠杆菌的菌株。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是革兰氏阳性细菌。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是谷氨酸棒状杆菌的菌株。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是酵母。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞是酿酒酵母的菌株。
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