CN117230114A - 一种dsRNA表达框及载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因表达框，其包括：基因模板DNA序列；对称地相向设置于所述基因模板DNA序列两端的相同启动子；与所述启动子反向相连的串联终止子，所述串联终止子包括两个以上互不相同的终止子。本发明还公开了包含上述基因表达框的重组质粒，可以高效合成dsRNA。

Description

一种dsRNA表达框及载体

技术领域

本发明属于基因工程领域和生物农药领域，具体涉及一种基因表达框，尤其是一种用于高效合成dsRNA的表达框、以及包含该表达框的载体。

背景技术

RNAi在基因沉默方面具有简便、高效的优势，是基因功能研究的重要工具。利用RNAi技术可抑制靶标基因的转录与表达，这种功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF)方法更具优势，可用于模拟药物作用。因此，RNAi在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。

在药物标靶发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。如果所用基因属于可用药的靶标，例如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌到细胞外，就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于多种疾病的临床测试性治疗，如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法。在肿瘤治疗方面RNA干扰方法也已经取得了一些重要进展和成果。

此外，RNAi技术还被用于农业病虫害防治领域，RNA生物农药能够特异沉默目的基因的表达，具有效率高、专一性强的特点。其原理是利用生物体内源功能基因特异的片段，在体外合成之后导入目标物种体内，抑制基因的表达，从而阻碍基因的功能的发挥，并最终影响目标物种的生长发育、直至死亡的机制。因其具有目标物种专一性、靶标开发便捷性和易于降解等特性，具备了绿色农药所需要的绝大多数功能，引起了众多科学家和农药公司的关注，被称为农药生产史上的第三次革命。当前，国际上很众多农药公司，例如拜耳-孟山都、陶氏益农和先正达等都在利用该技术，投入大量的人力和物力进行有针对性的杀虫剂研发，据报道，已经有相应的产品上市或者即将上市。

基于喷洒型的RNA生物农药的大规模应用，最为核心的问题是靶标基因筛选和规模化生产，目前常用的生产方式为利用HT115-L4440表达生产dsRNA，然而质粒L4440表达产率较低，严重影响了RNA生物农药的应用。

发明内容

为了克服生产dsRNA的现有技术的缺陷，促进RNAi技术的广泛应用，发明人对于dsRNA的表达系统进行了优化，构建出可高效合成dsRNA的表达框和载体。为实现上述目的，本发明包含如下技术方案。

一种基因表达框，其包括：基因模板DNA序列，也可称为货物基因(Cargo gene)、靶标基因(Target gene)等；对称地相向设置于所述基因模板DNA序列两端的相同启动子；与所述启动子反向相连的串联终止子，所述串联终止子包括两个以上互不相同的终止子。这种表达框是一种DNA分子，可以表达的任意长短的基因片段，包括但不限于各种大小的dsRNA。

上述基因表达框的结构形式一般为：

ter1-ter2-…-terN-启动子-模板DNA-启动子-terN-…-ter2-ter1，

其中，ter是终止子terminator的简写，N为2以上的自然数，是终止子ter的编号，如图1所示。

优选N为2或3，即该基因表达框结构形式为：

ter1-ter2-启动子-Cargo gene-启动子-ter2-ter1，或者

ter1-ter2-ter3-启动子-Cargo gene-启动子-ter3-ter2-ter1。

在一种实施方式中，上述启动子可以是T7启动子(SEQ ID NO.4)，也可以是其他RNA聚合酶III型启动子比如U6启动子、H1启动子、thl启动子、200-1启动子、1200-9-15启动子等等，但不限于此。

优选地，上述终止子可以选自VSV终止子(SEQ ID NO.1，ter1)、T7U终止子(SEQ IDNO.2，ter2)、T7终止子(SEQ ID NO.3，ter3)、t3终止子和sp6终止子等，但不限于此。

一种优选的实施方式中，上述基因模板DNA序列(Cargo gene)一侧的ter1-ter2-ter3-T7的序列是SEQ ID NO.5，而另一侧的T7-ter3-ter2-ter1的序列是SEQ ID NO.6。这种分子结构的表达框特别适合于表达dsRNA双链分子，合成效率很高。

优选地，上述表达框中，所述基因模板DNA序列在两端还引入限制性内切酶位点，以方便进行后续目标基因(Target gene)的替换。

上述在基因模板DNA序列两端引入的限制性内切酶包括、但不限于NheI、NcoI、EcoRI、HindIII、PstI、BamHI、XhoI、KpnI、BglII、SacI、XbaI、XhoI、NotI等。酶切位点依据目标基因的序列进行选择，避免在序列内部具有同样的酶切位点。

上述待表达的目标基因(Target gene)可以是dsRNA基因，所述的基因模板DNA序列是dsRNA转录模板。

例如，上述dsRNA基因序列可以是SEQ ID NO.7。该基因转录合成的dsRNA可以高效率地靶向棉铃虫基因组中羧酸酯酶(Carboxyleterase)基因Car，本文中称为dsCar。

本发明的第二个目的在于提供一种重组质粒，质粒载体上包含上述的基因表达框，如图2所示。

当待表达的目标基因(Target gene)是dsRNA基因时，质粒优选是pUC57质粒，重组质粒可简称为pT7Pro，能高效合成出dsRNA比如上述dsCar。本领域技术人员容易理解，上述的基因表达框可以克隆到任何质粒载体上，用于在合适的宿主细胞中表达目的基因。

因此，本发明的另一个目的在于提供上述的基因表达框、上述的重组质粒在表达外源基因比如dsRNA中的用途。

实验证明，pT7Pro表达载体能够显著提高dsRNA的合成产量，可以作为体外大量生产dsRNA的模板。本发明通过上述基因工程手段，对pUC57载体进行改造，获得了pT7Pro重组质粒，并利用棉铃虫羧酸酯酶Carboxylesterase(Car)基因对这一系统进行了测试。结果表明，本发明构建的pT7Pro-dsCar-HT115(DE3)生产系统，极大地提高了dsRNA的产率，比L4440-HT115(DE3)产率(1.30μg/mL菌液)(Ma et al.,2020)提高了2.3倍(3.0μg/mL菌液)。

附图说明

图1是本发明的一种表达框实施例的结构示意图。

图2是本发明的一种重组质粒实施例的结构示意图。

图3是包含不同dsCar基因表达框的pUC57重组质粒表达的dsCar琼脂糖凝胶电泳照片。A：左一泳带是ter1-T7-dsCar基因-T7-ter1表达框中dsCar基因两端插入NheI/NcoI酶切位点，左二泳带是ter1-T7-dsCar基因-T7-ter1表达框中dsCar基因不含酶切位点，左三泳带是dsCar基因且不含T7启动子、但dsCar基因两端插入NheI/NcoI酶切位点；B：包含不同启动子/终止子组合方式的pUC57重组质粒表达的dsCar琼脂糖凝胶电泳照片，泳带1是ter1-T7-dsCar基因-T7-ter1表达框，泳带2是ter1-ter2-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter2-ter1表达框，泳带3是ter1-ter3-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter1表达框，泳带4是ter1-ter2-ter3-T7-dsCar基因-U6启动子-ter3-ter2-ter1表达框，泳带5是ter1-ter2-ter3-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter2-ter1表达框。

图4是琼脂糖凝胶电泳照片。A：包含ter1-ter2-ter3-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter2-ter1表达框的pT7Pro-dsCar重组质粒表达的dsCar琼脂糖凝胶电泳照片，最右侧泳带是Marker；B：dsCar产物注射4龄的棉铃虫48小时后PCR检测对靶标基因Car表达的抑制效率统计图，以dsGFP作为阴性对照(GFP基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.8)。

具体实施方式

提高外源目的基因的表达水平一直是基因工程领域的研究方向之一，采用的策略有多种，包括表达途径改造、生物元件比如启动子改进或强度变化、表达盒结构改变、质粒种类替换等等。为了提高质粒表达dsRNA的合成效率，发明人进行了多种技术方案的探索，并在dsRNA表达框即表达盒方面提出了新的设计构思，研究兴趣集中于基因表达框中启动子和终止子的特性匹配和改造上。

本发明首次提出了在dsRNA转录模板(目标基因)两端分别设置启动子+终止子的设计，形成结构为“终止子-启动子-dsRNA转录模板-启动子-终止子”的靶标基因表达框，参见图1，出发点是基于如下构思：

dsRNA本身和dsRNA转录模板都是由5’-3’正链和3’-5’负链组成的双链结构，启动子用于开启DNA链的合成转录进行基因表达；在dsRNA转录模板两侧相向地设置启动子，能够同时启动表达基因DNA片段的5’-3’正链和3’-5’负链，正向和反方同时进行合成，分别作为模板转录成RNA的5’-3’正链和3’-5’负链并形成互补RNA双链。

另一方面，在质粒中，基因表达在没有终止子的情况下，是一侧无限延伸的，因此，在目的基因末端加入终止子，可以有效地节约细菌在表达过程中的能耗，提供更多的能量给目的基因片段进行表达。

确定了基因表达框作为目的基因表达工具后，对其各组成元件进行考察。该表达框需要克隆到质粒载体在体内条件下进行目的基因表达，作为基因表达工具，通用性是本发明考虑的重要方面。于是，尝试在基因模板DNA序列的两端引入限制性内切酶位点比如NheI、NcoI等等，以方便进行后续目标基因的替换。参见图2。以这种方式构建的表达载体使得目的基因的替换非常方便，且简便易操作，仅需插入一个片段即可表达出双链RNA。实验还发现，在目的基因两端引入限制性内切酶位点还能够促进该目的基因的表达，参见图3中A所示的pUC57重组质粒表达的dsCar琼脂糖凝胶电泳照片：左一泳带是ter1-T7-dsCar基因-T7-ter1表达框中dsCar基因两端插入NheI/NcoI酶切位点，左二泳带是ter1-T7-dsCar基因-T7-ter1表达框中dsCar基因不含酶切位点，左三泳带是dsCar基因表达框中不含T7启动子。实验显示，左一泳带的dsCar基因表达量高于左二泳带，证明基因表达框中在目标基因两端插入NheI/NcoI酶切位点可促进基因表达；表达框中不含启动子无法进行目标基因表达。

本文中，术语“目标基因”、“目的基因”、“靶标基因”、“货物基因”、“Target gene”和“Cargo gene”等表示相同的意义，都是指待表达的基因。在表达框中是基因模板DNA序列，就dsRNA而言，是指dsRNA转录模板序列。

本领域技术人员容易理解，该目的基因不限于dsRNA基因，表达合成的产物不限于双链RNA分子。目的基因可长可短，跨度较大，可以表达任意长短的基因片段。

然后，根据dsRNA合成的需求和各种启动子、终止子的特性，我们设计了各种排列组合以及序列优化方式，比如启动子的种类、终止子的种类和数量。它们的组合方式多种多样。发明人通过使用包含不同表达框构建了多种pUC57重组质粒，以靶向棉铃虫羧酸酯酶Carboxylesterase(Car)基因的dsCar基因(SEQ ID NO.7)表达产量为考察指标。

考察结果总体来讲，表达框两侧的终止子选择VSV终止子(SEQ ID NO.1，ter1)、T7U终止子(SEQ ID NO.2，ter2)、T7终止子(SEQ ID NO.3，ter3)中的一个时，结构为“ter-启动子-dsRNA转录模板-启动子-ter”的表达框对于靶标基因dsCar的合成产量较低；随着两侧终止子数量变为2个、3个，合成产量会提高；但超过3个启动子后，dsCar合成产量不会再随之增加，一定程度上还会造成表达框构建成本的上升。

表达框两侧的终止子的对称结构“terN-启动子-dsRNA转录模板-启动子-terN”(N＝1、2或3)对于靶标基因dsCar的表达合成有一定优势，不对称结构“ter-启动子-dsRNA转录模板-启动子-terN”(N＝2或3)的合成产率相对较低，而且有不同大小的副产物(电泳中出现杂带)。当两侧都采用ter1、ter2和ter3这三种终止子串联的组合结构“ter1-ter2-ter3-”时，合成产率最高。

表达框两侧的启动子的对称结构“terN-启动子A-目标基因-启动子A-terN”对于靶标基因dsCar的表达合成效果最好，dsCar产率要高于不对称结构“terN-启动子A-目标基因-启动子B-terN”。

参见图3中B显示的包含不同启动子/终止子组合方式表达框的pUC57重组质粒表达的dsCar琼脂糖凝胶电泳照片，泳带1是ter1-T7-dsCar基因-T7-ter1表达框，泳带2是ter1-ter2-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter2-ter1表达框，泳带3是ter1-ter3-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter1表达框，泳带4是ter1-ter2-ter3-T7-dsCar基因-U6启动子-ter3-ter2-ter1表达框，泳带5是ter1-ter2-ter3-T7-dsCar基因-T7-ter3-ter2-ter1表达框。实验显示，泳带1的dsCar表达量最少，泳带5的dsCar表达量最多，说明串联两个以上终止子的左右对称结构对目的基因的表达效果要好于单个终止子的对称结构，串联两个以上终止子的左右对称结构对目的基因的表达效果要好于串联两个以上终止子的不对称结构，相同启动子的对称结构对目的基因的表达效果要好于不同启动子的不对称结构。

可见左右完全对称的“ter1-ter2-ter3-T7-目标基因-T7-ter3-ter2-ter1”结构表达框对于dsCar合成而言是较为理想的选择。

在基因表达框新结构创新的基础上，发明人进一步改造基因表达载体，见图2。通过众多质粒的筛选比较，在pUC57质粒上取得了突出的技术效果。利用这一质粒构建pT7Pro表达载体，能够显著提高dsRNA的合成产量，并可以作为体外大量生产dsRNA的模板。

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。

实施例

本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由铂尚生物技术(上海)有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L琼脂粉)。

主要仪器、试剂和材料：

PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)；琼脂糖凝胶电泳系统(Bio-Rad公司)。

实施例1：改造pUC57质粒及构建pT7Pro-dsCar质粒

改造pUC57质粒及构建pT7Pro-dsCar质粒的具体方法大致包括如下步骤：

1.合成ter1-ter2-ter3-T7序列SEQ ID NO.5，(图1中左侧的箭头所示)；

2.合成T7-ter3-ter2-ter1序列SEQ ID NO.6，(图1中右侧的箭头所示)；

3.将上述序列插入到pUC57质粒，按照先反向序列，再正向序列的方向进行质粒构建，获得pT7Pro重组质粒。

PCR模板由铂尚生物技术(上海)有限公司进行全基因合成获得，将其转化到pUC57质粒，其中酶切所用到的核酸内切酶均购自ThermoFisher(NheI：ER0975；NcoI:ER0571)。反应体系：质粒1μg，NheI 1μL，NcoI 1μL，10×H Buffer 1μL，无菌水补足10μL。反应温度37℃，酶切1小时30分钟，随后琼脂糖凝胶电泳检测。测序验证由上海铂尚生物技术有限公司完成。

4.获得靶标基因序列

(1)棉铃虫RNA的提取

以5龄的棉铃虫为材料，采用常规Trizol法提取，常规方法纯化，DNA酶处理，获得浓度≥300ng/μl、总量≥6μg、OD260/280为1.8～2.2的Total RNA样品。

(2)mRNA的分离及cDNA的合成

用带有oligo-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA，然后用随机6聚物和Invitrogen的Superscript II reverse transcriptase试剂盒合成cDNA第一链。

(3)基因的扩增及测序

利用靶标基因特异的引物进行扩增，将获得的基因片段纯化，连接到(Takara公司生产)PMD-18载体中，转化大肠杆菌Top10菌株，蓝白斑筛选，阳性菌株测序。

以上述cDNA作为PCR模板，采用下述双向引物对进行PCR扩增：

正向引物：CGATGCTAGCGACGGGTACAGCGCGGGTTC，

反向引物：ATCCATGGCCAGCCTCCGCGTGCAACTT。

其中正向引物下划线所示序列为NheI的酶切位点，反向引物下划线所示序列为NcoI的酶切位点。

PCT扩增获得用于合成双链RNA的Car基因片段序列(SEQ IDNO.7)(参见专利文献CN2021111799450)。

5.将Car基因片段序列(SEQ IDNO.7)克隆至pT7Pro重组质粒的NheI和NcoI位点，得到用于合成dsCar的重组表达载体pT7Pro-dsCar(图2)。

实施例2：dsRNA的生产

将载体pT7Pro-dsCar转入RNaseIII缺陷菌株E.coli HT115感受态，得到重组菌株pT7Pro-dsCar/HT115(DE3)，表达dsCar，具体的表达结果见图4中A。操作步骤包括：

(a)接种pT7Pro-dsCar/HT115(DE3)至1mL LB/Amp培养基，37℃过夜培养。

(b)转接500μL培养液至200mL 2xYT培养基(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母膏，5g/LNaCl，pH 7.0)，37℃培养约4小时至对数中期(OD600为0.4-0.5)。

(c)向培养基中添加IPTG至终浓度1mM，诱导表达，37℃继续培养4小时。

(d)参照文献(Posiri,P.,C.Ongvarrasopone and S.Panyim(2013).A simpleone-step method for producing dsRNA from E.coli to inhibit shrimp virusreplication.Journal of Virological Methods 188(1-2):64-69.)的方法提取dsRNA，并通过电泳检测，结果如图4中A所示，表明用该方法可以获得目的片段的dsCar。

(e)合成dsRNA的浓度测算：根据测算出提纯后每升发酵液可以获得10mL浓度为300ng/μL的dsRNA，即发酵液的dsRNA产率为3.0μg/mL菌液。

实施例3：dsCar对靶标基因的抑制效果测试

将纯化的dsCar产物溶解在无菌水中，注射4龄的棉铃虫(500ng/头)，48小时后用定量PCR检测Car基因抑制效率。使用dsGFP水溶液作为阴性对照。

实验结果如图4中B所示。结果表明，棉铃虫(H.armi)注射dsCar后，可显著抑制靶标基因Car的表达。

由上述实验可见，本发明的对称型基因表达框和包含该表达框的重组质粒pT7Pro能够高效合成dsRNA，并且目的基因的替换非常方便，显著提高dsRNA的合成产量，可作为体外大量生产dsRNA的模板，促进RNA生物农药的推广应用。

序列表

<110> 上海植生优谷生物技术有限公司

<120> 一种dsRNA表达框及载体

<130> SHPI2210117

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg 20

<210> 5

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctagttatt gctcagcggg ctagttattg ctcagcgggc tagttattgc tcagcggtaa 60

tacgactcac tataggg 77

<210> 6

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctatagtg agtcgtatta ccgctgagca ataactagcc cgctgagcaa taactagccc 60

gctgagcaat aactagc 77

<210> 7

<211> 650

<212> DNA

<213> cotton aphid

<400> 7

gacgggtaca gcgcgggttc tgtctcagta gatctgttaa tgttgtctaa gtcagcagaa 60

ggactattcc aaagagtcat acctgaaagt ggaggaaacc tggcagctct tgcaatccag 120

cgagatcctg tagagattgc aaaaacgcat gctaggaagt tgaacttcac taatgtagat 180

gatatctacg ctttagaaga tttctatagg aaagctccat tggagctatt attaacccca 240

gatgacttat ttgatagaac agattccata ttcaagtttt caccgtgtgt agaacgtgac 300

acaggagacg gagcgttcct aactgaatca cctctgacta tactcaagag tggcaactac 360

agaaaagtac cactattata tggtttcgca aatatggaag ggttgttacg cattggtttc 420

tttgatatct ggaagcataa gatgaatgaa aagttttctg atttcttgcc acctgactta 480

aagtttgatt ctgtcgaaga aagagaagaa gtggcaaata agattaagaa gttttacttt 540

ggtgacaagc cagtcgacaa tgacaatatt ttaaaatacg ttgatttctt ctcggacgtc 600

atctttgctt atcccatgct tagagctgta aagttgcacg cggaggctgg 650

<210> 8

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 60

accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 120

tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 180

tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 240

actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 300

tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 360

tggagttc 368

Claims (10)

1.一种基因表达框，其特征在于，包括：基因模板DNA序列；对称地相向设置于所述基因模板DNA序列两端的相同启动子；与所述启动子反向相连的串联终止子，所述串联终止子包括两个以上互不相同的终止子。

2.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，其结构形式为：ter1-ter2-…-terN-启动子-模板DNA-启动子-terN-…-ter2-ter1，其中N为2以上的自然数。

3.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，所述启动子是T7启动子(SEQ IDNO.4)，并且/或者所述终止子选自VSV终止子(SEQ ID NO.1)、T7U终止子(SEQ ID NO.2)、T7终止子(SEQ ID NO.3)。

4.如权利要求3所述的基因表达框，其特征在于，所述基因模板DNA序列一侧的ter1-ter2-ter3-启动子的序列是SEQ ID NO.5，另一侧的启动子-ter3-ter2-ter1的序列是SEQID NO.6。

5.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，所述基因模板DNA序列在两端还引入限制性内切酶位点。

6.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，所述的基因是dsRNA基因，所述的基因模板DNA序列是dsRNA转录模板。

7.如权利要求6所述的基因表达框，其特征在于，所述dsRNA基因序列是SEQ ID NO.7。

8.一种重组质粒，其特征在于，质粒载体上包含如权利要求1-7中任一项所述的基因表达框。

9.如权利要求8所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体是pUC57质粒。

10.如权利要求1-7中任一项所述的基因表达框、如权利要求8或9所述的重组质粒在表达外源基因中的用途。