JP2012508582A - β−カテニンの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）介在遺伝子サイレンシング - Google Patents

β−カテニンの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）介在遺伝子サイレンシング Download PDF

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Abstract

細菌またはＢＴＰを用いて、真核細胞に１つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するための方法が記載されている。また、この細菌を使用して、ＲＮＡ干渉を用いて真核細胞内での遺伝子発現を制御するための方法ならびにウイルス疾患および障害の治療のための方法も記載されている。細菌またはＢＴＰは、１つ以上のｓｉＲＮＡまたは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む。また、本発明の細菌を用いて真核細胞においてＲＮＡ干渉を引き起こすためのベクターも記載されている。
【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１１月１４日に出願された米国特許出願第６１／１１４，６１０号に対する優先権およびその利益を主張するものである。
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用によるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を介した遺伝子サイレンシングは、分子生物学の強力なツールとして登場し、治療遺伝子サイレンシングに使用される可能性を秘めている。また標的細胞内の小分子ＤＮＡプラスミドから転写される短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も、安定した遺伝子サイレンシングを仲介し、化学合成ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションで得られる遺伝子サイレンシングに匹敵するレベルの遺伝子ノックダウンを達成することが示されている（非特許文献１，非特許文献２）。
治療目的でのＲＮＡｉ適用の可能性は広く、癌遺伝子またはウイルス遺伝子のような疾患遺伝子のサイレンシングおよびノックダウンを含む。ＲＮＡｉの治療用途に対する主な障害の１つは標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達である（非特許文献３）。実際、ＲＮＡｉに対する現在の主な障害として送達が記載されている（非特許文献４により引用）。
したがって、哺乳動物への干渉ＲＮＡの安全かつ予測可能な投与のための新規な方法が必要とされている。
Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．Ａｇａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，５５０（２００２） Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ａ．Ａ．Ｃａｕｄｉｙ，Ｇ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎ，ＰＮＡＳ ９９，１４４３（２００２） Ｚａｍｏｒｅ ＰＤ，Ａｒｏｎｉｎ Ｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，（３）：２６６−８（２００３） Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｗｓ ｆｅａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４２５，２００３，１０−１２
本発明は、原核生物ベクターを含む、少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの侵襲性細菌治療粒子（ＢＴＰ）を提供し、前記ベクターは、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーター、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座および少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子を含み、前記ｓｉＲＮＡが対象遺伝子標的のｍＲＮＡを阻害し、かつ前記侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性が野生型細菌に比べて低下している。好ましくは、侵襲性細菌は侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌である。好ましくは、ｓｉＲＮＡはβ−カテニンのｍＲＮＡを阻害する。本発明はまた、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーター、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座および少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子を含む、少なくとも１つの原核生物ベクターを提供し、前記ｓｉＲＮＡは対象遺伝子標的のｍＲＮＡを阻害する。好ましくは、ｓｉＲＮＡはβ−カテニンのｍＲＮＡを阻害する。
本発明はまた、本発明で提供される様々な侵襲性細菌、ＢＴＰおよびベクターを用いた方法を提供する。例えば、本発明は１つ以上のｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞に送達する方法を提供する。この方法は、原核生物ベクターを含む少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの侵襲性細菌治療粒子（ＢＴＰ）の導入を含み、前記ベクターは、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーター、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座および少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子を含み、前記ｓｉＲＮＡが対象遺伝子標的のｍＲＮＡを阻害し、かつ前記侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性が野生型細菌に比べて低下している。好ましくは、侵襲性細菌は侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌である。
本発明はまた、哺乳動物細胞における遺伝子発現の制御方法を提供する。この方法は、原核生物ベクターを含む少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの侵襲性細菌治療粒子（ＢＴＰ）の導入を含み、前記ベクターは、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーター、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座および少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子を含み、前記ｓｉＲＮＡが対象遺伝子標的のｍＲＮＡを阻害し、かつ前記侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性が野生型細菌に比べて低下しており、発現されたｓｉＲＮＡが対象遺伝子の少なくとも１つのｍＲＮＡを阻害することにより遺伝子発現を制御する。好ましくは、侵襲性細菌は侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌である。好ましくは、ｓｉＲＮＡはβ−カテニンのｍＲＮＡを阻害する。
本発明はまた、哺乳動物における疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。この方法は、原核生物ベクターを含む、少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの侵襲性細菌治療粒子（ＢＴＰ）を導入することにより、疾患または障害を引き起こすことが知られている（例えば、増殖、成長または異形成を増進することが知られている）細胞内の少なくとも１つの遺伝子の発現を制御することを含み、前記ベクターは、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーター、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座および少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子を含み、前記ｓｉＲＮＡが対象遺伝子標的のｍＲＮＡを阻害し、かつ前記侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性が野生型細菌に比べて低下しており、発現されたｓｉＲＮＡが、疾患または障害を引き起こすことが知られている遺伝子のｍＲＮＡを阻害する。好ましくは、侵襲性細菌は侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌である。好ましくは、ｓｉＲＮＡはβ−カテニンのｍＲＮＡを阻害する。
発現されたｓｉＲＮＡは、細胞の多酵素複合体ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を、１つ以上の対象遺伝子（例えば、β−カテニン）のｍＲＮＡとの相互作用へ導き得る。好ましくは、野生型のβ−カテニン発現に比べて、あるいは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む侵襲性細菌もしくはＢＴＰの投与またはそれによる治療の前のβ−カテニン発現に比べて、β−カテニン発現が減少する。β−カテニン発現減少は、β−カテニンｍＲＮＡの発現減少またはβ−カテニンタンパク質の発現減少であり得る。好ましくは、野生型のβ−カテニン発現に比べて（正常な健常細胞と比べて）、あるいは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む侵襲性細菌もしくはＢＴＰの投与またはそれによる治療の前のβ−カテニン発現に比べて、β−カテニン発現が少なくとも５０％減少しており；より好ましくは、野生型のβ−カテニン発現に比べて、あるいは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む侵襲性細菌もしくはＢＴＰの投与またはそれによる治療の前のβ−カテニン発現に比べて、β−カテニン発現が少なくとも７５％減少しており；最も好ましくは、野生型のβ−カテニン発現に比べて、あるいは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む侵襲性細菌もしくはＢＴＰの投与またはそれによる治療の前のβ−カテニン発現に比べて、β−カテニン発現が少なくとも９０％減少している。
好ましくは、疾患または障害はβ−カテニンの過剰発現に関連した疾患または障害であり得るが、これに限定されない。つまり、上記治療を必要とする細胞または哺乳動物におけるｂｃａｔの発現（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）が、正常な（非疾患）または野生型の細胞または哺乳動物に比べて増加していることを特徴とする、疾患または障害である。好ましくは、治療される疾患または障害は、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ガードナー症候群、肝細胞癌（ＨＣＣ）、基底細胞癌、毛母腫、髄芽腫および卵巣癌からなる群より選択される。
本発明はまた、少なくとも１つの侵襲性細菌またはＢＴＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
本発明の侵襲性細菌またはＢＴＰは、弱毒化、非病原性または非毒性細菌であり得る。
哺乳動物細胞は、エキソビボ、インビボまたはインビトロであり得る。哺乳動物細胞は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ヤギュウ、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、シカ、鳥類、トリ、ニワトリおよび霊長類の細胞であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの好適な実施形態では、哺乳動物細胞は、結腸上皮細胞、直腸上皮細胞、腸上皮細胞、肝細胞、皮膚上皮細胞、有毛細胞、神経細胞および卵巣細胞であり得るが、これらに限定されない。
哺乳動物細胞を約１０３〜１０１１個（または前記範囲の任意の整数個）の生存侵襲性細菌またはＢＴＰで感染させ得る。好ましくは、哺乳動物細胞を約１０５〜１０９個（または前記範囲内の任意の整数個）の生存侵襲性細菌またはＢＴＰで感染させ得る。哺乳動物細胞を約０．１〜１０６（または前記範囲内の任意の整数）の範囲の感染多重度で感染させ得る。好ましくは、哺乳動物細胞を約１０２〜１０４（または前記範囲内の任意の整数）の範囲の感染多重度で感染させ得る。
哺乳動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ヤギュウ、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、シカ、鳥類、トリ、ニワトリおよび霊長類であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
侵襲性細菌はＲＮアーゼIIIをコードする遺伝子の欠失を含む。好ましくは、侵襲性細菌はＲＮアーゼIIIをコードするｒｎｃ遺伝子の欠失を含む。好ましくは、侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性は、野生型細菌に比べて少なくとも９０％低下しており；より好ましくは、侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性は、野生型細菌に比べて少なくとも９５％低下しており；最も好ましくは、侵襲性細菌のＲＮアーゼIII活性は、野生型細菌に比べて少なくとも９９％低下している。好ましくは、侵襲性細菌は侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌である。
侵襲性細菌内で１つ以上のＤＮＡ分子が１つ以上のｓｈＲＮＡに転写され得る。好ましくは、１つ以上のｓｈＲＮＡは３’突出または平滑末端を含む。好ましくは、１つ以上のｓｈＲＮＡは５’突出を含ま（ｃｏｍｐｒｉｓｅ ｏｒ ｉｎｃｌｕｄｅ）ない（平滑末端を有する）。好ましくは、１つ以上のｓｈＲＮＡは２〜５塩基対の３’突出を含み；より好ましくは、１つ以上のｓｈＲＮＡは２塩基対以下の３’突出（１塩基対または２塩基対の突出）を含み；最も好ましくは、１つ以上のｓｈＲＮＡは３’突出を含ま（ｃｏｍｐｒｉｓｅ ｏｒ ｉｎｃｌｕｄｅ）ない（平滑末端を有する）。１つ以上のｓｈＲＮＡは、プロセシングされて１つ以上のｓｉＲＮＡになる。好ましくは、１つ以上のｓｈＲＮＡは、哺乳動物細胞内でプロセシングされて１つ以上のｓｉＲＮＡになる。
１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む原核生物ベクターは、１つ以上のプロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、侵襲因子配列または溶菌制御配列を含み得る。プロモーターは原核生物プロモーターであり得る。好ましくは、原核生物プロモーターは、Ｔ７プロモーター、ＰｇａｐＡプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ＰｌａｃＵＶ５プロモーターまたはｒｅｃＡプロモーターである。好ましくは、プロモーターは原核生物プロモーターである。好ましくは、原核生物プロモーターは改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターである。改変された改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターは配列番号：５７３の配列を含み得る。好ましくは、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターはＵＰエレメントを含み得る。ＵＰエレメントは配列番号：５７３のヌクレオチド７〜２６を含み得る。好ましくは、原核生物ベクターは少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む。好ましくは、ターミネーター配列は連続したチミジン塩基対を含む。より好ましくは、ターミネーター配列は少なくとも５つの連続したチミジン塩基対を含み得る。ターミネーター配列は、好ましくは、２０個未満の連続したチミジン塩基対を含む。原核生物ベクターは、第二のターミネーター配列をさらに含み得る。好ましくは、第二のターミネーター配列はｒｒｎＣターミネーター配列であり得る。好ましくは、ｒｒｎＣターミネーター配列は、配列番号：３０〜３１または配列番号：５７４の配列を含み得る。好ましくは、これら２つのターミネーター配列は、原核生物ベクター内で隣接している（これらは連続した配列である）。より好ましくは、２つのターミネーター配列は離れている。好ましくは、原核生物ベクターは確認されたｐＭＢＶ４３の配列を含む。好ましくは、確認されたｐＭＢＶ４３の配列は配列番号：５６４である。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書においては、文脈から明らかにそうでないことが示されない限り、単数形は複数形も包含する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で引用される刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、すべて参照により組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含めた本明細書が統制する。さらに、材料、方法および実施例は具体例であるに過ぎず、限定することを意図するものではない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
ＣＯＳ７細胞における３つの用量でのＣＥＱ２００とＣＥＱ２２１の比較を示すグラフである。 機能的アノテーションを有するＲＮアーゼIII基質ヘアピンＲＮＡ構造を示す模式図である。 細菌クラスIＲＮアーゼIIIによるヘアピン前駆体の切断作用を示す模式図である。 成熟の第二段階（第一のＤｉｃｅｒ切断段階）を示す模式図である。 第二のＤｉｃｅｒ切断段階および活性ｓｉＲＮＡへの成熟を示す模式図である。 パネルＡは、ＣＥＱ５０５が、Ｃｏｓ−７細胞において哺乳動物β−カテニンを用量依存的に９０％までサイレンシング可能であったことを示すグラフである。パネルＢは、ＣＥＱ２２１ｐＮＪＳＺｃラミン（ラミン遺伝子を標的とする同等株）が、ＳＷ４８０細胞において哺乳動物ラミンを用量依存的に６５％までサイレンシング可能であったことを示すグラフである。 鎖のゆらぎを有するＨ３−ｓｈＲＮＡを示す模式図である。 パネルＡは、ｏｐａ発現大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株のＭＯＩ１での侵襲能を示すグラフである。パネルＢは、ｏｐａ発現大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株のＭＯＩ１０での侵襲能を示すグラフである。 パネルＡは、ヒトＳＷ４８０細胞におけるＣＥＱ５０８を用いたβ−カテニンｍＲＮＡのサイレンシングを示すグラフである。パネルＢは、ヒトＳＷ４８０細胞におけるＣＥＱ５０８を用いたβ−カテニンタンパク質のサイレンシングを示す写真である。 ヒトＳＷ４８０細胞におけるＣＥＱ５０８を用いたβ−カテニンタンパク質のサイレンシングを示すイムノブロットの写真である。 ＣＯＳ−７細胞におけるＣＥＱ５０９ＢＴＰを用いたβ−カテニンｍＲＮＡのサイレンシングを示すグラフである。
本発明は、非病原性または治療用の細菌または細菌治療粒子（ＢＴＰ）株を用いて、真核細胞に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達する組成物および方法に関する。細菌またはＢＴＰは、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡまたはｓｉＲＮＡそれ自体を送達し、真核宿主細胞内に侵襲することによりＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす。一般に、標的細胞内でＲＮＡ干渉を誘発するためにはｓｉＲＮＡを細胞内に導入する必要がある。ｓｉＲＮＡは、直接的にまたはトランスフェクションにより標的細胞内に導入されるか、あるいは標的細胞内でヘアピン構造のｄｓＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）としてＲＮＡポリメラーゼIII適合性プロモーター（例えば、Ｕ６、Ｈ１）を有する特定のプラスミドから転写され得る（Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ａ．Ａ．Ｃａｕｄｉｙ，Ｇ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎ，ＰＮＡＳ ９９，１４４３（２００２），Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．Ａｇａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，５５０（２００２））。
本発明の干渉ＲＮＡは真核細胞内での遺伝子発現を制御する。それは標的細胞内の対象遺伝子をサイレンシングまたはノックダウンする（例えば、遺伝子活性を低下させる）。干渉ＲＮＡは、細胞所有の多酵素複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）を、サイレンシングするべき遺伝子のｍＲＮＡへ導く。ＲＩＳＣとｍＲＮＡの相互作用の結果、ｍＲＮＡの分解または隔離が生じる。これにより対象遺伝子の効果的な転写後サイレンシングが行われる。この方法は細菌介在遺伝子サイレンシング（ＢＭＧＳ）と呼ばれる。
ＤＮＡプラスミドを発現させる、ｓｉＲＮＡの送達を介したＢＭＧＳの場合、真核転写プラスミド遊離後にｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが標的細胞内で産生されて、高度に特異的なｍＲＮＡ分解プロセスを誘発し、これにより標的遺伝子のサイレンシングが生じる。さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現を特定の代謝状態にある特異的標的細胞または組織に限定する、１つ以上の細胞特異的真核生物プロモーターが使用され得る。この方法の一実施形態では、細胞特異的プロモーターはアルブミンであり、標的細胞または組織は肝臓である。この方法の別の実施形態では、細胞特異的プロモーターはケラチンであり、特異的標的細胞または組織は皮膚である。
本発明の非毒性細菌およびＢＴＰは、侵襲特性を有し（または侵襲特性を有するように改変されており）、様々な機序を介して哺乳動物宿主細胞に侵入し得る。専門の貪食細胞による細菌またはＢＴＰの取込みでは、通常、特化したリソソーム内で細菌またはＢＴＰの破壊が生じるのに対して、侵襲性細菌またはＢＴＰ株は、非食作用性の宿主細胞を侵襲する能力を有する。天然に存在するこのような細菌またはＢＴＰの例は、細胞内病原体、例えばエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）およびビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）などであるが、この特性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）またはビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）のような他の細菌に転移させることも可能であり、侵襲関連遺伝子の転移を介したプロバイオティクスも含まれる（Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ３１８，１２０７（１９９５））。本発明の他の実施形態では、干渉ＲＮＡを宿主細胞に送達するために使用される細菌またはＢＴＰとして、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｄ．Ｒ．Ｓｉｚｅｍｏｒｅ，Ａ．Ａ．Ｂｒａｎｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｃ．Ｓａｄｏｆｆ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，２９９（１９９５））、侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌（Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ３１８，１２０７（１９９５），Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｆ．Ｈｕｅｔｚ，Ｄ．Ｍ．Ｏｊｃｉｕｓ，Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，８６２（１９９８））、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（Ａ．Ａｌ−Ｍａｒｉｒｉ Ａ，Ａ．Ｔｉｂｏｒ，Ｐ．Ｌｅｓｔｒａｔｅ，Ｐ．Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｘ．Ｄｅ Ｂｏｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．Ｌｅｔｅｓｓｏｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０，１９１５（２００２））およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｍ．Ｈｅｎｓｅ，Ｅ．Ｄｏｍａｎｎ，Ｓ．Ｋｒｕｓｃｈ，Ｐ．Ｗａｃｈｈｏｌｚ，Ｋ．Ｅ．Ｄｉｔｔｍａｒ，Ｍ．Ｒｏｈｄｅ，Ｊ．Ｗｅｈｌａｎｄ，Ｔ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３，５９９（２００１），Ｓ．Ｐｉｌｇｒｉｍ，Ｊ．Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｏｅｎ，Ａ．Ｋｏｌｂ−Ｍａ（ウムラウト）ｕｒｅｒ，Ｇ．Ｇｅｇｉｎａｔ，Ｍ．Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｉ．Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ，Ｗ．Ｇｏｅｂｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０，２０３６（２００３））が挙げられる。侵襲性細菌またはＢＴＰはいずれも真核細胞内へのＤＮＡ転移に有用である（Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，Ｔ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２，４６７（２００１））。
ＢＭＧＳは、生来的に侵襲性の病原体サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を用いて行われる。この実施形態の一態様では、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株はＳＬ７２０７およびＶＮＰ２０００９（Ｓ．Ｋ．Ｈｏｉｓｅｔｈ，Ｂ．Ａ．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２９１，２３８（１９８１）；Ｐａｗｅｌｅｋ ＪＭ，Ｌｏｗ ＫＢ，Ｂｅｒｍｕｄｅｓ Ｄ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５３７−４４（Ｏｃｔ．１５ １９９７））を含む。本発明の別の実施形態では、ＢＭＧＳは、弱毒化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いて行われる。この実施形態の別の態様では、ＣＥＱ２０１株を、細胞侵襲特性を有するように侵襲性プラスミドを介して操作する。本発明の一態様では、このプラスミドはＴＲＩＰ（生物界間（ｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ）ＲＮＡ干渉プラスミド）プラスミドまたはｐＮＪＳＺである。
また、二重「トロイの木馬」技術も真核転写プラスミドを保持する侵襲性／栄養要求性の細菌またはＢＴＰと共に使用される。そしてこのプラスミドは、標的細胞により転写されて、ＲＮＡｉの細胞内プロセスを誘発する１つ以上のヘアピンＲＮＡ構造を形成する。本発明のこの方法は、様々な遺伝子の有意な遺伝子サイレンシングを誘導する。この実施形態のある態様では、遺伝子は導入遺伝子（ＧＦＰ）、変異癌遺伝子（ｋ−Ｒａｓ）および癌関連遺伝子（β−カテニン）をインビトロで含む。
本発明によるＢＭＧＳの別の態様は、生物界間（ｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ）ＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）と呼ばれる。本発明のこの態様では、ｓｉＲＮＡは、侵襲性細菌により直接産生されるか、または細菌内での産生後に標的細胞ではなくＢＴＰ中に蓄積される。原核生物プロモーター（例えば、Ｔ７）により制御される転写プラスミドが、標準的な形質転換プロトコールにより担体細菌内に挿入される。ｓｉＲＮＡは細菌内で産生され、栄養要求性または抗生物質の経時的な添加により誘発された細菌溶解の後、哺乳動物標的細胞内に遊離する。
大部分の細菌は、ＲＮＡ分解酵素であるＲＮアーゼを多数含有し、これらがｓｉＲＮＡを分解して、ｔｋＲＮＡｉの活性低下を引き起こし得る。特定の細菌のＲＮアーゼがこのようなｓｉＲＮＡ分解を示すような場合、対象とするＲＮアーゼをコードする遺伝子（例えば、ＲＮアーゼIIIをコードするｒｎｃ遺伝子）の標的欠損を行い、ｔｋＲＮＡｉ細菌当たりのｓｉＲＮＡレベルを引き上げることで、より多くのｓｉＲＮＡが標的細胞に送達されるだけでなく、標的細胞内での対象遺伝子のより効果的な遺伝子サイレンシングが生じる。
ＢＭＧＳおよびｔｋＲＮＡｉを含めた本発明のＲＮＡｉ法は、遺伝子操作されたノックアウトモデルではなく一過性の「ノックダウン」遺伝子動物モデルを作出して遺伝子機能を発見するために使用される。この方法はまた、研究および薬物開発のためのインビトロでのトランスフェクションツールとしても使用される。
これらの方法は、ＢＭＧＳおよびｔｋＲＮＡｉを行うのに望ましい特性（侵襲性、弱毒性、操作可能性）を有する細菌を使用する。本明細書でより詳細に記載されているプラスミド（例えば、ＴＲＩＰ）およびベクターを用いて、侵襲性のみならず、１つまたは複数のｓｈＲＮＡの真核または原核転写が細菌またはＢＴＰにもたらされる。
１．細菌および／または細菌治療粒子（ＢＴＰ）
本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡまたは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含む、少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの細菌治療粒子（ＢＴＰ）を提供する。
本発明に従えば、細胞膜の横断および細胞質への侵入などにより、分子、例えばＲＮＡ分子またはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を標的細胞の細胞質内に送達することが可能な任意の微生物を用いて、こうした細胞へＲＮＡを送達することができる。好適な一実施形態では、微生物は原核生物である。さらにより好適な一実施形態では、原核生物は細菌またはＢＴＰである。細胞へのＲＮＡ送達に使用可能な、細菌以外の微生物も本発明の範囲内にある。例えば、微生物は、真菌、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス（陰窩ｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、原虫、例えばトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）およびマラリア原虫であってもよい。
好適な一実施形態では、微生物は細菌またはＢＴＰである。好適な侵襲性細菌またはＢＴＰは、真核細胞の細胞質への侵入などにより、少なくとも１つの分子、例えばＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を標的細胞に送達することが可能である。好ましくは、ＲＮＡはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり、ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする。
ＢＴＰは、治療または予防目的で使用される細菌断片である。ＢＴＰは、ミニ細胞として当該技術分野で公知の粒子を含み得る。ミニ細胞は、極付近の不完全な細胞分裂により生じる小型の細胞である。これらは核様体がなく、したがって、増殖してコロニーを形成することができない（Ａｌｄｅｒら，（１９６７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５７，３２１−３２６；概説はＳｕｌｌｉｖａｎおよびＭａｄｄｏｃｋ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：Ｒ２４９−Ｒ２５２；Ｍａｒｇｏｌｉｎ，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１，Ｒ３９５−Ｒ３９８；ＨｏｗａｒｄおよびＫｒｕｓｅ，（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６８，５３３−５３６を参照されたい）。ミニ細胞形成は、細胞分裂の隔壁形成のための部位選択に異常を引き起こす突然変異による結果である。このような突然変異としては、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤのヌル対立遺伝子（Ｄａｖｉｅら，（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８，１２０２−１２０３；ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，２１０６−２１１２）および特定のｆｔｓＺ対立遺伝子（ＢｉおよびＬｕｔｋｅｎｈａｕｓ，（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，５４１４−５４２３）が挙げられる。ＦｔｓＺまたはＭｉｎＣ−ＭｉｎＤタンパク質の過剰発現がミニ細胞の形成を引き起こすことも報告されている（ＷａｒｄおよびＬｕｔｋｅｎｈａｕｓ，１９８５；ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８８）。ミニ細胞は核様体がないが、転写および翻訳は可能である（Ｒｏｏｚｅｎら，（１９７１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０７，２１−３３；Ｓｈｅｐｈｅｒｄら，（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，２５２７−３４）。
ＢＴＰは、細菌ゲノムを欠くという点で細菌とは異なるため、患者における細菌増殖のリスクの減少をもたらす。これは免疫低下患者に対して特に有用である。さらに、ＢＴＰが増殖不能であることから、敏感な組織、例えば、脳およびこれまでｓｉＲＮＡでは到達不可能とされていた他の身体領域での使用が可能となる。例えば、細菌の腹腔内送達は癒着および腹膜炎のリスクを伴い得るが、ＢＴＰの使用によりこれが除去される。しかし、本発明の細菌のように、ＢＴＰは細菌細胞壁、一部の細菌原形質内容および細胞内粒子、１つ以上の治療成分、例えば１つ以上のｓｉＲＮＡ、１つ以上の侵襲因子、１つ以上の食胞分解因子および特定組織標的化のための１つ以上の因子を含有する。ＢＴＰは、細菌内にｓｉＲＮＡを産生および蓄積し、次いで、細胞分裂の間に細菌断片（ＢＴＰ）を分離する細菌から生じる。本発明の一実施形態では、細菌を発酵させて、その間にＢＴＰを大量に形成させ、次いで、細菌を残してＢＴＰを通過および収集することのできる、サイズ差によるろ過を用いて、生存細菌からＢＴＰを単離することにより、ＢＴＰを得る。本発明の別の実施形態では、遠心分離によりＢＴＰを細菌から分離する。本発明の別の実施形態では、生存細菌細胞を死シグナル活性化により溶解させる。ＢＴＰは、一度単離すれば、使用のために凍結乾燥し製剤化することができる。
本明細書で使用されるとき、微生物、例えば細菌またはＢＴＰに関する場合、「侵襲性」という用語は、少なくとも１つの分子、例えばＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を標的細胞に送達することが可能な微生物を指す。侵襲性微生物は、細胞膜を横断することにより前記細胞の細胞質に侵入し、その内容物の少なくとも一部、例えばＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を標的細胞に送達することが可能な微生物である。少なくとも１つの分子を標的細胞内に送達するプロセスは、好ましくは侵襲装置をあまり変化させない。
侵襲性微生物は、細胞膜、例えば真核細胞膜を横断して細胞質に侵入することにより、少なくとも１つの分子を標的細胞に送達することが生来的に可能な微生物の他、生来的に侵襲性ではなく、侵襲性になるように改変、例えば遺伝子改変された微生物も包含する。別の好適な実施形態では、生来的に侵襲性ではない微生物を改変して、細菌またはＢＴＰを「侵入因子」または「細胞質標的因子」とも呼ばれる「侵襲因子」と連結することにより、侵襲性にすることができる。本明細書で使用される「侵襲因子」は、非侵襲性細菌またはＢＴＰにより発現された際にその細菌またはＢＴＰを侵襲性にする因子、例えばタンパク質またはタンパク質群である。本明細書で使用される「侵襲因子」は、「細胞質標的化遺伝子」によりコードされる。
本発明の一実施形態では、微生物は、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）を非限定的に含む群から選択される、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰである。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、インベイシンおよびＹａｄＡ（エルシニア・エンテロコリティカ・プラスミド接着因子）を非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、侵襲因子ＲｉｃｋＡ（アクチン重合タンパク質）を発現するリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、侵襲因子ＲａＩＦ（グアニン交換因子）を発現するレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、ＮａｄＡ（ナイセリア接着／侵襲因子）、ＯｐａＡ、ＯｐａＣおよびＯｐａ５２（混濁関連接着（ｏｐａｃｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ））を非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、ＩｎｌＡ（インターナリン因子）、ＩｎｌＢ（インターナリン因子）、Ｈｐｔ（ヘキソースリン酸輸送体）およびＡｃｔＡ（アクチン重合タンパク質）を非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、シゲラ分泌因子ＩｐａＡ（侵襲性プラスミド抗原）、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐｇＤ、ＩｐａＢ−ＩｐａＣ複合体、ＶｉｒＡおよびＩｃｓＡを非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、サルモネラ分泌／交換因子ＳｉｐＡ、ＳｉｐＣ、ＳｐｉＣ、ＳｉｇＤ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２およびＳｐｔＰを非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、フィブロネクチン結合タンパク質ＦｎＢＰＡおよびＦｎＢＰＢを非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、フィブロネクチン結合タンパク質ＡＣＰ、Ｆｂａ、Ｆ２、Ｓｆｂ１、Ｓｆｂ２、ＳＯＦおよびＰＦＢＰを非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現するストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）である。任意で、生来的な侵襲性細菌またはＢＴＰは、侵襲因子ＦｉｍＢ（インテグリン結合タンパク質線毛）を発現するポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である。
本発明の別の実施形態では、微生物は、生来的に侵襲性ではないが、侵襲性になるように改変、例えば遺伝子改変された細菌またはＢＴＰである。任意で、生来的に侵襲性ではない細菌またはＢＴＰは、インベイシン、ＹａｄＡ、ＲｉｃｋＡ、ＲａＩＦ、ＮａｄＡ、ＯｐａＡ、ＯｐａＣ、Ｏｐａ５２、ＩｎｌＡ、ＩｎｌＢ、Ｈｐｔ、ＡｃｔＡ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐｇＤ、ＩｐａＢ−ＩｐａＣ複合体、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＣ、ＳｐｉＣ、ＳｉｇＤ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＡＣＰ、Ｆｂａ、Ｆ２、Ｓｆｂ１、Ｓｆｂ２、ＳＯＦ、ＰＦＢＰおよびＦｉｍＢを非限定的に含む群から選択される侵襲因子を発現することにより侵襲性になるよう遺伝子改変されている。
本発明の別の実施形態では、微生物は、生来的に侵襲性であり得るが、１つ以上のさらなる侵襲因子を発現するように改変、例えば遺伝子改変された細菌またはＢＴＰである。任意で、侵襲因子は、インベイシン、ＹａｄＡ、ＲｉｃｋＡ、ＲａＩＦ、ＮａｄＡ、ＯｐａＡ、ＯｐａＣ、Ｏｐａ５２、ＩｎｌＡ、ＩｎｌＢ、Ｈｐｔ、ＡｃｔＡ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐｇＤ、ＩｐａＢ−ＩｐａＣ複合体、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＣ、ＳｐｉＣ、ＳｉｇＤ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＡＣＰ、Ｆｂａ、Ｆ２、Ｓｆｂ１、Ｓｆｂ２、ＳＯＦ、ＰＦＢＰおよびＦｉｍＢを非限定的に含む群から選択される。
生来的に侵襲性の微生物、例えば細菌またはＢＴＰは、特定の向性、すなわち好適な標的細胞を有し得る。あるいは、微生物、例えば細菌またはＢＴＰは、第二の微生物の向性を模倣するように、例えば遺伝的に改変され得る。任意で、細菌またはＢＴＰはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）であり、好適な標的細胞は、咽頭上皮細胞、舌の頬側上皮細胞および粘膜上皮細胞を非限定的に含む群から選択される。任意で、細菌またはＢＴＰはポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）であり、好適な標的細胞は、口腔上皮細胞を非限定的に含む群から選択される。任意で、細菌またはＢＴＰはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）であり、好適な標的細胞は粘膜上皮細胞である。任意で、細菌またはＢＴＰはナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）であり、好適な標的細胞は、尿道上皮細胞および子宮頸部上皮細胞を非限定的に含む群から選択される。任意で、細菌またはＢＴＰは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、好適な標的細胞は、腸上皮細胞、尿道上皮細胞および上部尿路細胞を非限定的に含む群から選択される。任意で、細菌またはＢＴＰはボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）であり、好適な標的細胞は呼吸上皮細胞である。任意で、細菌またはＢＴＰはビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）であり、好適な標的細胞は腸上皮細胞である。任意で、細菌またはＢＴＰはトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）であり、好適な標的細胞は粘膜上皮細胞である。任意で、細菌またはＢＴＰはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）であり、好適な標的細胞は呼吸上皮細胞である。任意で、細菌またはＢＴＰはヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）であり、好適な標的細胞は胃内皮細胞である。任意で、細菌またはＢＴＰはクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）であり、好適な標的細胞は、結膜細胞および尿道上皮細胞を非限定的に含む群から選択される。
本発明の別の実施形態では、微生物は、特定の向性を有するように改変、例えば遺伝子改変された細菌またはＢＴＰである。任意で、好適な標的細胞は、咽頭上皮細胞、舌の頬側上皮細胞、粘膜上皮細胞、口腔上皮細胞、尿道上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、腸上皮細胞、呼吸上皮細胞、上部尿路細胞、胃上皮細胞および結膜細胞を非限定的に含む群から選択される。任意で、好適な標的細胞は、異形成または癌性上皮細胞である。任意で、好適な標的細胞は、活性化または静止免疫細胞である。
標的細胞内への少なくとも１つの分子の送達は、当該技術分野で公知の方法により判定することができる。例えば、分子の存在は、それによりサイレンシングされるＲＮＡまたはタンパク質の発現の減少により、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法により、あるいは抗体の使用を含み得る免疫学的方法により判定することができる。
微生物が本発明での使用において十分に侵襲性であるか否かの判定は、宿主細胞と接触させた微生物数に対して十分なｓｉＲＮＡが宿主に送達されたか否かの判定を含み得る。使用された微生物数に対してｓｉＲＮＡの量が少なければ、微生物をさらに改変してその侵襲ポテンシャルを増加させることが望まれ得る。
細菌またはＢＴＰの細胞内への侵入は、様々な方法により測定することができる。細胞内の細菌またはＢＴＰがアミノグリコシド抗生物質による処置を生き延びるのに対して、細胞外の細菌は速やかに死ぬ。細菌またはＢＴＰ取込みの量的推定は、細胞単層を抗生物質ゲンタマイシンで処理して細胞外の細菌またはＢＴＰを不活性化し、次いで前記抗生物質を除去した後、生き残った細胞内微生物を弱い界面活性剤を用いて遊離させ、標準的な細菌培地上の生菌数を判定することにより遂行することができる。さらに、細菌またはＢＴＰの細胞内への侵入は、例えば、細胞層の薄切片透過型電子顕微鏡または免疫蛍光技術により直接観察することができる（Ｆａｌｋｏｗら（１９９２）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３３３）。このようにして、様々な技術を用いて、特定の細菌またはＢＴＰが特定タイプの細胞に侵襲可能か否かを判定する、あるいは細菌の向性が第二の細菌の向性を模倣するように細菌またはＢＴＰを改変した後の細菌侵襲を確認することができる。
本発明の方法に従ってＲＮＡ送達に使用することができる細菌またはＢＴＰは、好ましくは非病原性である。しかし、病原性の細菌またはＢＴＰも、その病原性を弱毒化して、それを投与される被検体に対してその細菌を非毒性にする限り使用することができる。本明細書で使用される「弱毒化細菌またはＢＴＰ」という用語は、被検体に対するその毒性が著しく減少するまたは除去されるように改変された細菌またはＢＴＰを指す。病原性の細菌またはＢＴＰは、以下に述べる様々な方法により弱毒化することができる。
特定の作用機序に限定することを望むわけではないが、真核細胞内にＲＮＡを送達する細菌またはＢＴＰは、細菌またはＢＴＰのタイプによって、様々な細胞区画に侵入し得る。例えば、細菌またはＢＴＰは小胞中、例えば食胞中に存在し得る。一度細胞内に入れば、細菌またはＢＴＰが破壊または溶解されて、その内容物が真核細胞に送達される。細菌またはＢＴＰを、食胞分解タンパク質を発現して食胞からＲＮＡが漏出できるように操作することができる。本発明の一実施形態では、細菌またはＢＴＰは、生来的にまたは改変、例えば遺伝子改変により、食胞のポア形成、破損または分解に寄与するタンパク質を発現する。任意で、タンパク質はコレステロール依存性細胞溶解素である。任意で、タンパク質は、リステリオリシン、イバノリシン、ストレプトリシン、スフィンゴミエリナーゼ、パーフリンゴリジン、ボツリノリシン、ロイコシジン、炭疽毒素、ホスホリパーゼ、ＩｐａＢ（侵襲性プラスミド抗原）、ＩｐａＨ、ＩｃｓＢ（細胞間伝播）、ＤＯＴ／Ｉｃｍ（オルガネラ輸送欠損／細胞内増殖欠損）、ＤＯＴＵ（ＤＯＴ／Ｉｃｍ複合体の安定化因子）、ＩｃｍＦおよびＰｍｒＡ（多剤耐性流出ポンプ）からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、細菌は真核細胞内で様々な時間の間生存し続けることができ、ＲＮＡを産生し続け得る。次いで、ＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡが、例えば漏出により、細菌から細胞内に放出される。本発明の特定の実施形態では、細菌は真核細胞内で複製することもできる。好適な一実施形態では、細菌複製は宿主細胞を殺さない。本発明は、ＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡの特定の機序による送達に限定されず、送達機序とは関係なく、ＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡの細菌よる送達を可能にする方法および組成物を包含することが意図される。
一実施形態では、本発明で使用される細菌またはＢＴＰは非病原性または非毒性である。この実施形態の別の態様では、細菌またはＢＴＰは治療用である。この実施形態の別の態様では、細菌またはＢＴＰは、非限定的にはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）から選択される弱毒化株またはその類縁体である。任意には、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株はエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種の弱毒化株である。任意で、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株はエルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）種の弱毒化株である。任意で、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）株はリケッチア・コロニイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｒｏｎｉｉ）種の弱毒化株である。任意で、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株はレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）種の弱毒化株である。任意で、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株はマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種の弱毒化株である。任意で、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株はマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ種の弱毒化株である。任意で、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）株はヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）種の弱毒化株である。任意で、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）株はコクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）の弱毒化株である。任意で、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）株はヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）種の弱毒化株である。任意で、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株はクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）種の弱毒化株である。任意で、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株はクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）種の弱毒化株である。任意で、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株はナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）種の弱毒化株である。任意で、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株はナイセリア・メニンジティデイス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）種の弱毒化株である。任意で、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉａ）株はブルコルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）の弱毒化株である。任意で、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）株はボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）種の弱毒化株である。任意で、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）株はボレリア・ハームシイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｈｅｒｍｉｓｉｉ）の弱毒化株である。任意で、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種の弱毒化株である。任意で、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株はリステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）種の弱毒化株である。任意で、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株はサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）種の弱毒化株である。任意で、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株はサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）種の弱毒化株である。任意で、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株はＳＬ７２０７またはＶＮＰ２０００９である。任意で、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）株はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）種の弱毒化株である。任意で、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株はストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）種の弱毒化株である。任意で、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）種の弱毒化株である。任意で、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株はストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）種の弱毒化株である。任意で、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株はストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）種の弱毒化株である。任意で、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）株はポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）種の弱毒化株である。任意で、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）はシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種の弱毒化株である。任意で、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）株はトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）種の弱毒化株である。任意で、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）株はビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）種の弱毒化株である。任意で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はＭＭ２９４である。
生来的に侵襲性であるとして文献に記載されている細菌（１．１節）、および生来的な非侵襲性細菌であるとして文献に記載されている細菌（１．２節）、および生来的に非病原性であるかまたは弱毒化されている細菌の例を以下に挙げる。一部の細菌は非侵襲性であるとして記載されている（１．２節）が、これらは、本発明に従った使用に関しては依然十分に侵襲性であり得る。生来的に侵襲性または非侵襲性として従来記載されているか否かに関わらず、いずれの細菌も改変してその侵襲特性を調節する、特に増大させることができる（例えば、１．３節に記載されているように）。
１．１ 生来的に侵襲性の細菌
本発明で使用される特定の生来的に侵襲性の細菌が本発明にとって重要であるというわけではない。このような天然の侵襲性細菌としては、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）菌種および腸管侵襲性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
使用される特定のシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株の例としては、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９９０３）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９９３０）およびシゲラ・ディセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅ）が挙げられる。弱毒化シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株、例えばシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ ２４５７Ｔ ａｒｏＡ ｖｉｒＧ変異株ＣＶＤ１２０３（Ｎｏｒｉｅｇａら，上記）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）Ｍ９０Ｔ ｉｃｓＡ変異株（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：５６６４−５６６８（１９９４））、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）Ｙ ＳＦＬ１１４ ａｒｏＤ変異株（Ｋａｒｎｅｌｌら，Ｖａｃｃ．，１０：１６７−１７４（１９９２））およびシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ａｒｏＡ ａｒｏＤ変異株（Ｖｅｒｍａら，Ｖａｃｃ．，９：６−９（１９９１））などが本発明で好適に使用される。あるいは、弱毒化突然変異を単独でまたは１つ以上のさらなる弱毒化突然変異と共に導入することにより、新規な弱毒化シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種を構築することができる。
送達ベクターとしてのシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌の少なくとも１つの利点は、結腸粘膜表面中のリンパ組織に対するその向性である。さらに、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）複製の原発部位は樹状細胞およびマクロファージ内であると考えられており、これらは粘膜リンパ組織のＭ細胞基底側面に最もよく見られる（ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：３６９；Ｐａｓｃｕａｌ，Ｄ．Ｗ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ５：５６で概説されている）。したがって、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ベクターは、これら専門の抗原提示細胞にＲＮＡ干渉を標的化する、または治療分子を送達するための手段を提供し得る。シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ベクターの別の利点は、弱毒化シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株がインビトロおよびインビボで核酸レポーター遺伝子を送達するということである（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９；Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｐ．ら（１９９５）Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅ １ Ａｃａｄｅｍｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅ III−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｖｉｅ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１８：１２０７；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９６）Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆ．Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｎｏｒｒｂｙ，Ｄ．ＢｕｒｔｏｎおよびＪ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９７）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ９７ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅ．）。実用的側面では、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の厳しく限定された宿主特異性により、中間宿主を介した食物連鎖内へのシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ベクター伝播を防止できる。さらに、げっ歯類、霊長類および志願者において高度に弱毒化された弱毒化株が開発されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）上記；Ｌｉ，Ａ．ら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：３９５；Ｌｉ，Ａ．ら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１８０；Ｋａｒｎｅｌｌ，Ａ．ら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：８８；Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，Ｐ．Ｊ．およびＪ．Ａｒｏｎｄｅｌ（１９８９）Ｖａｃｃｉｎｅ ７：４４３；Ｆｏｎｔａｉｎｅ，Ａ．ら（１９９０）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：９０７；Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４１６；Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ｒ．ら（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２：５１６８；Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ｒ．ら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：３０５５；Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ｒ．ら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：２３；Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ｒ．ら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：３０５５；Ｋｏｔｌｏｆｆ，Ｋ．Ｌ．ら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：４５４２）。この後者の知見により、ヒトでの使用に十分耐え得るシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ベクターの開発が可能となるであろう。
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような薬剤を使用した非特異的突然変異誘発を用いて化学的に、あるいは組換えＤＮＡ技術；Ｔｎ１０突然変異誘発、Ｐ２２仲介形質導入、λファージ仲介乗換えおよび接合伝達のような古典的遺伝子技術；または組換えＤＮＡ技術を使用した部位特異的突然変異誘発を用いて、弱毒化突然変異を細菌内に導入することができる。組換えＤＮＡ技術は、組換えＤＮＡ技術により構築された株の方がはるかによく定義されるため好ましい。このような弱毒化突然変異の例としては、以下のものが非限定的に挙げられる：
（ｉ）栄養要求性突然変異、例えばａｒｏ（Ｈｏｉｓｅｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ，２９１：２３８−２３９（１９８１））、ｇｕａ（ＭｃＦａｒｌａｎｄら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈ．，３：１２９−１４１（１９８７））、ｎａｄ（Ｐａｒｋら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７０：３７２５−３７３０（１９８８）、ｔｈｙ（Ｎｎａｌｕｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：９５５−９６２（１９８７））およびａｓｄ（Ｃｕｒｔｉｓｓ，上記）などの突然変異；
（ｉｉ）全体的な制御機能を不活性化する突然変異、例えば、ｃｙａ（Ｃｕｒｔｉｓｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：３０３５−３０４３（１９８７））、ｃｒｐ（Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８７），上記）、ｈｏＰ／ｐｈｏＱ（Ｇｒｏｉｓｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：７０７７−７０８１（１９８９）；およびＭｉｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：５０５４−５０５８（１９８９））、ｐｈｏｐｃ（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７２：２４８５−２４９０（１９９０））またはｏｍｐＲ（Ｄｏｒｍａｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７：２１３６−２１４０（１９８９））などの突然変異；
（ｉｉｉ）ストレス応答を改変する突然変異、例えばｒｅｃＡ（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，７：９３３−９３６（１９９３））、ｈｔｒＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，５：４０１−４０７（１９９１））、ｈｔｐＲ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１００：８９４−９００（１９８１））、ｈｓｐ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：２９５−３２９（１９８４））およびｇｒｏＥＬ（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒら，Ｓｃｉ．，２４８：７３０−７３２（１９９０））などの突然変異；
（ｉｖ）特定の毒性因子における突然変異、例えば、ＩｓｙＡ（Ｌｉｂｂｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：４８９−４９３（１９９４））、ｐａｇまたはｐｒｇ（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０），上記；およびＭｉｌｌｅｒら（１９８９），上記）、ｉｓｃＡまたはｖｉｒＧ（ｄ’Ｈａｕｔｅｖｉｌｌｅら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，６：８３３−８４１（１９９２））、ｐｌｃＡ（Ｍｅｎｇａｕｄら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：３６７−７２（１９９１）；Ｃａｍｉｌｌｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１７３：７５１−７５４（１９９１））およびａｃｔ（Ｂｒｕｎｄａｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１８９０−１１８９４（１９９３））などの突然変異；
（ｖ）ｔｏｐＡ（Ｇａｌａｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１８７９−１８８５（１９９０））のようなＤＮＡトポロジーに影響を与える突然変異；
（ｖｉ）ｍｉｎ（ｄｅ Ｂｏｅｒら，Ｃｅｌｌ，５６：６４１−６４９（１９８９））のような細胞周期を乱すまたは改変する突然変異；
（ｖｉｉ）自殺システムをコードする遺伝子、例えばｓａｃＢ（Ｒｅｃｏｒｂｅｔら，Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，５９：１３６１−１３６６（１９９３）；Ｑｕａｎｄｔら，Ｇｅｎｅ，１２７：１５−２１（１９９３））、ｎｕｃ（Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚら，Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，６０：３７４６−３７５１（１９９４））、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌまたはｐｈｌＡ（Ｍｏｌｉｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：１３９−１６６（１９９３））などの導入；
（ｖｉｉｉ）リポ多糖および／または脂質Ａの生合成を変化させる突然変異、例えばｒＦｂ（Ｒａｅｔｚ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，編，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．ｐｐ１０３５−１０６３（１９９６））、ｇａｌＥ（Ｈｏｎｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５６：１６４−１６７（１９８７））およびｈｔｒＢ（Ｒａｅｔｚ，上記）、ｍｓｂＢ（Ｒｅａｔｚ，上記）など；
（ｉｘ）バクテリオファージ溶解システム、例えばＰ２２にコードされる溶原菌（Ｒｅｎｎｅｌｌら，Ｖｉｒｏｌ，１４３：２８０−２８９（１９８５））、λムレイントランスグリコシラーゼ（Ｂｉｅｎｋｏｗｓｋａ−Ｓｚｅｗｃｚｙｋら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１８４：１１１−１１４（１９８１））またはＳ−遺伝子（Ｒｅａｄｅｒら，Ｖｉｒｏｌ，４３：６２３−６２８（１９７１））の導入。
弱毒化突然変異は、恒常的に、あるいは温度感受性熱ショックプロモーターファミリー（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，上記）のような誘導性プロモーター、または嫌気的に誘導されるｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，６：２８０５−２８１３（１９９２））、またはｕａｐＡ（Ｇｏｒｆｉｎｋｉｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２３３７６−２３３８１（１９９３））もしくはｇｃｖ（Ｓｔａｕｆｆｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７６：６１５９−６１６４（１９９４））のような抑制性プロモーターの制御下で、発現させることができる。
使用される特定のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株の例としては、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５３１３）が挙げられる。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ａｃｔＡ変異株（Ｂｒｕｎｄａｇｅら，上記）またはＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７５１−７５４（１９９１））のような弱毒化リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株が本発明で好適に使用される。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株を構築することができる。
使用される特定のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株の例としては、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７２５１）およびＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３３１１）が挙げられる。弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用され、かつＳ．チフィ−ａｒｏＣ−ａｒｏＤ（Ｈｏｎｅら，Ｖａｃｃ．９：８１０（１９９１）およびＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ａｒｏＡ変異株（Ｍａｓｔｒｏｅｎｉら，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：４７７（１９９２））を含む。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を構築することができる。
使用される特定のリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）株の例としては、リケッチア・リケッチアエ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１４９およびＶＲ８９１）、リケッチア・プロワセキイ（Ｒｉｃｋｅｔｓｉａ ｐｒｏｗａｓｅｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ２３３）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ３１２、ＶＲ１５０およびＶＲ６０９）、リケッチア・モーセリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１４４）、リケッチア・シビリカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１５１）およびロシャリメア・クイターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｔａｎａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ３５８）が挙げられる。弱毒化リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定の腸管侵襲性エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得る腸管侵襲性エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株４６０８−５８、１１８４−６８、５３６３８−Ｃ−１７、１３−８０および６−８１（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉら，Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ），１３２Ａ：３５１−３５５（１９８２））が挙げられる。弱毒化腸管侵襲性エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
さらに、細菌以外の特定の微生物も細胞取り込みのためにインテグリン分子（特定の侵襲因子に対する受容体である）と相互作用することができるため、このような微生物も標的細胞内へのＲＮＡ導入に使用することができる。例えば、ウイルス、例えば口蹄疫ウイルス、エコーウイルスおよびアデノウイルス、ならびに真核病原体、例えばヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）および森林型熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）はインテグリン分子と相互作用する。
１．２ 弱侵襲性細菌
本発明で使用することができ、非侵襲性または少なくとも前節（１．１）に記載の細菌よりも弱い侵襲性であるとして文献に記載されている細菌の例としては、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌種、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）菌種、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）菌種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）菌種、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）菌種、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）菌種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）菌種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種およびエリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）菌種が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細菌は、改変してその侵襲ポテンシャルを増加させる必要があり得る。
使用される特定のエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株の例としては、Ｙ．エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．９６１０）またはＹ．ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２８）が挙げられる。Ｙ．エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）Ｙｅ０３−Ｒ２（ａｌ−Ｈｅｎｄｙら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：８７０−８７５（１９９２））またはＹ．エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ａｒｏＡ（Ｏ’Ｇａｏｒａら，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，９：１０５−１１６（１９９０））が本発明で好適に使用される。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株を構築することができる。
使用される特定のエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ１９１７、ＭＭ２９４、Ｈ１０４０７（Ｅｌｉｎｇｈｏｒｓｔら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：２４０９−２４１７（１９９２））および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＦＣ４、ＣＦＴ３２５およびＣＰＺ００５（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：８３１−８３８（１９９４））が挙げられる。弱毒化シチメンチョウ病原菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０２ｃａｒＡＢ変異株（Ｋｗａｇａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：３７６６−３７７２（１９９４））またはＣＥＱ２０１のような弱毒化エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株が本発明で好適に使用される。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株を構築することができる。
使用される特定のクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）株の例としては、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３８８４）が挙げられる。弱毒化クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）株の例としては、Ｂ．ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９３９５）が挙げられる。弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株の例としては、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３０７７）およびＮ．ゴノレー（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）が挙げられる。Ｎ．ゴノレー（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＭＳ１１ａｒｏ変異株（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１５：５１−６３（１９９３））のような弱毒化ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株が本発明で好適に使用される。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株を構築することができる。
使用される特定のエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）株の例としては、Ａ．ユークレノフィラ（Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３３０９）が挙げられる。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）株を構築することができる。
使用される特定のフランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るフランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）株の例としては、Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５４８２）が挙げられる。弱毒化フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の例としては、Ｃ．シュードツベルクロシス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４１０）が挙げられる。弱毒化コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）株の例としては、Ｃ．フロインデイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄII）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８０９０）が挙げられる。弱毒化シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株の例としては、Ｃ．ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１３１０）が挙げられる。弱毒化クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の例としては、Ｈ．ソルヌス（Ｈ．ｓｏｒｎｎｕｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３６２５）が挙げられる。弱毒化ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）株の例としては、Ｂ．アボルタス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３４４８）が挙げられる。弱毒化ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の例としては、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３９５０）およびＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７２９４）が挙げられる。弱毒化マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株の例としては、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３１５６）が挙げられる。Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ｍｉｐ変異株（Ｏｔｔ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．，１４：１６１−１７６（１９９４））のような弱毒化レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用される。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株を構築することができる。
使用される特定のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株の例としては、Ｒ．エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９３９）が挙げられる。弱毒化ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株の例としては、Ｐ．エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２６７）が挙げられる。弱毒化シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）株の例としては、Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３７７２）が挙げられる。弱毒化ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）株が本発明で好適に使用され、かつシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより構築することができる。
使用される特定のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株の例としては、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７２５１）およびＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３３１１）が挙げられる。弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が本発明で好適に使用され、かつＳ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ａｒｏＣ ａｒｏＤ（Ｈｏｎｅら，Ｖａｃｃ．，９：８１０−８１６（１９９１））およびＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ａｒｏＡ変異株（Ｍａｓｔｒｏｅｎｉら，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ，１３：４７７−４９１（１９９２）））を含む。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を構築することができる。
使用される特定のビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）株の例としては、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１４０３５）およびビブリオ・シンシンナティエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３５９１２）が挙げられる。弱毒化ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）株が本発明で好適に使用され、かつＶ．コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＲＳＩ毒性変異株（Ｔａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：１５１８−１５２３（１９９４））およびＶ．コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）ｃｔｘＡ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｅｐ変異株（Ｗａｌｄｏｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：２７８−２８３（１９９４））を含む。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）株を構築することができる。
使用される特定のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の例としては、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６０５１）が挙げられる。弱毒化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株が本発明で好適に使用され、かつＢ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）変異株ｐＸ０１（Ｗｅｌｋｏｓら，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ，１４：３８１−３８８（１９９３））および弱毒化ＢＣＧ株（Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔ．，３５１：４５６−４６０（１９９１））を含む。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株を構築することができる。
使用される特定のエリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）株が本発明にとって重要であるというわけではない。本発明で使用され得るエリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）株の例としては、エリジペロトリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４１４）およびエリジペロトリックス・トンシラルム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３３３９）が挙げられる。弱毒化エリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）株が本発明で好適に使用され、かつＥ．ルジオパシエ（Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）Ｋｇ−１ａおよびＫｇ−２（Ｗａｔａｒａｉら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５５：５９５−６００（１９９３））ならびにＥ．ルジオパシエ（Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）ＯＲＶＡＣ変異株（Ｍａｒｋｏｗｓｋａ−Ｄａｎｉｅｌら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｖｉｒｏｌ．Ｐａｒｉｓｉｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２７７：５４７−５５３（１９９２））を含む。あるいは、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種に関する上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）群の１つ以上の弱毒化突然変異を導入することにより、新規な弱毒化エリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）株を構築することができる。
１．３ 細菌株の侵襲特性増大のための方法
微生物が侵襲性または非侵襲性として従来記載されている否かに関わらず、これらの微生物を操作して、例えばシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）菌種または腸管侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌種を模倣することにより、その侵襲特性を増大させることができる。例えば、微生物が細胞、例えば前記非侵襲性細菌の天然の宿主内の細胞の細胞質に接近することを可能にする１つ以上の遺伝子を、その微生物内に導入することができる。
本明細書で「細胞質標的化遺伝子」と呼ばれるこのような遺伝子の例としては、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）による侵襲を可能にするタンパク質をコードする遺伝子、または腸管侵襲性エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のリステリオリシンＯの類似した侵襲遺伝子が挙げられ、上述の技術は多様な侵襲性細菌の動物細胞細胞質への侵襲および侵入を可能にすることが知られている。（Ｆｏｒｍａｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４６：４６５（１９８４）；Ｂｉｅｌｅｃｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：１７５−１７６（１９９０）；Ｓｍａｌｌら，Ｉｎ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８６，ｐ．１２１−１２４，Ｌｅｖｉｎｅら，編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８６）；Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙら，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏ．，１１：６１９−６２７（１９９４）；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３：４２０２；Ｉｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｒ．およびＳ．Ｆａｌｋｏｗ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２６２；ならびにＩｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｒ．ら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５０：７６９）。上記細胞質標的化遺伝子を細菌株内に転移するための方法は、当該技術分野で公知である。細菌の侵襲特性を増大させるために細菌内に導入し得る別の好適な遺伝子は、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のインベイシンタンパク質をコードする（Ｌｅｏｎｇら，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１９７９（１９９０））。また、インベイシンをリステリオリシンと組み合わせて導入することにより、細菌の侵襲特性を、これら遺伝子の一方の導入に比べてさらに増大させることができる。上記遺伝子は例示を目的として記載されている；しかし、分子、特にＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子の微生物から細胞、例えば動物細胞の細胞質内への送達に関与する、１つ以上の源由来の任意の遺伝子または遺伝子の組合せで十分であることは、当業者に明らかであろう。したがって、このような遺伝子は細菌遺伝子に限定されず、エンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）を促進するインフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ−２（Ｐｌａｎｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））のようなウイルス遺伝子を包含する。
上記細胞質標的化遺伝子は、例えば、所望の細胞質標的化遺伝子を保有する侵襲性細菌から単離されたＤＮＡからＰＣＲ増幅により得ることができる。ＰＣＲ用のプライマーは、例えば、上記参考文献および／またはＧｅｎＢａｎｋ（インターネット上で公表されている（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／））にある、当該技術分野において入手可能なヌクレオチド配列から設計することができる。ＰＣＲプライマーを細胞質標的化遺伝子、細胞質標的化オペロン、細胞質標的化遺伝子クラスターまたは細胞質標的化遺伝子レギュロンを増幅するように設計することができる。使用されるＰＣＲストラテジーは、細胞質標的化遺伝子または標的侵襲性細菌の遺伝子の遺伝子構成によって決まる。ＰＣＲプライマーを、標的ＤＮＡ配列の始めと終わりのＤＮＡ配列と相同な配列を含むように設計する。次いで、細胞質標的化遺伝子を標的細菌株内に、例えばＨｆｒ転移またはプラスミド可動化（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｔｈｗｅｌｌら，上記；およびＡｕｓｕｂｅｌら，上記）、バクテリオファージ仲介形質導入（ｄｅ Ｂｏｅｒ，上記；Ｍｉｌｌｅｒ，上記；およびＡｕｓｕｂｅｌら，上記）、化学的形質転換（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら，上記；Ａｕｓｕｂｅｌら，上記）、エレクトロポレーション（Ｂｏｔｈｗｅｌら，上記；Ａｕｓｕｂｅｌら，上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）および物理的形質転換技術（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，上記；およびＢｏｔｈｗｅｌｌ，上記）を用いて導入することができる。細胞質標的化遺伝子は、溶原性バクテリオファージ（ｄｅ Ｂｏｅｒら，Ｃｅｌｌ，５６：６４１−６４９（１９８９））、プラスミドベクター（Ｃｕｒｔｉｓｓら，上記）内に組み込む、または標的株の染色体内にスプライスする（Ｈｏｎｅら，上記）ことができる。
上記のように細菌およびＢＴＰを遺伝子操作してその侵襲特性を増大させることに加え、侵襲因子を細菌と連結することにより細菌およびＢＴＰを改変することもできる。したがって、一実施形態では、細菌を侵襲因子、例えばタンパク質インベイシン、インベイシン誘導体または侵襲性に十分なそれらのフラグメントで共有結合的または非共有結合的にコーティングすることにより侵襲性を増大させる。実際、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の精製インベイシンまたはインベイシンのカルボキシル末端１９２アミノ酸でコーティングした非侵襲性細菌細胞は哺乳動物細胞への侵入が可能であることが示されている（Ｌｅｏｎｇら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：１９７９）。さらに、インベイシンのカルボキシル末端領域でコーティングされたラテックスビーズが哺乳動物細胞により効率的に内部移行され、抗体固定化インベイシンでコーティングされたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）も同様である（ＩｓｂｅｒｇおよびＴｒａｎ ｖａｎ Ｎｈｉｅｕ（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：３９５で概説されている）。あるいは、細菌を、細菌侵入因子により認識される表面分子と特異的に結合する抗体、そのバリアントまたはそのフラグメントでコーティングすることもできる。例えば、細菌をインテグリン分子、例えば、細菌インベイシンタンパク質と相互作用する表面分子であることが知られているα５β１に対するモノクローナル抗体でコーティングすると、その細菌は内部移行されることが示されている（ＩｓｂｅｒｇおよびＴｒａｎ ｖａｎ Ｎｈｉｅｕ，上記）。このような抗体は当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる。抗体の効力は、例えば上記の方法に従って、細菌をその抗体でコーティングし、細菌をその抗体により認識される表面受容体を有する真核細胞と接触させて、細胞内細菌の有無を観察することにより試験することができる。侵襲因子を細菌表面と連結させるための方法は当該技術分野で公知であり、架橋を含む。
３．プラスミドおよびベクター
本発明はまた、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子および少なくとも１つのプロモーターを含む、少なくとも１つのベクターを提供し、ここでは、発現されたｓｉＲＮＡが対象遺伝子の少なくとも１つのｍＲＮＡを阻害する。好適な一実施形態では、本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子および少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼIII適合性プロモーターもしくは少なくとも１つの原核生物プロモーターを含む、少なくとも１つの原核生物ベクターを提供し、ここでは、発現されたｓｉＲＮＡが対象遺伝子の少なくとも１つのｍＲＮＡを阻害する。
本発明のＴＲＩＰ（生物界間（ｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ）ＲＮＡ干渉プラスミド）ベクターおよびプラスミドは、多重クローニング部位、プロモーター配列およびターミネーター配列を含む。ＴＲＩＰベクターおよびプラスミドはまた、非侵襲性細菌またはＢＴＰの哺乳動物細胞への侵入を可能にする侵襲因子をコードする１つ以上の配列（例えば、細菌またはＢＴＰのβ１−インテグリン陽性哺乳動物細胞への侵入を可能にする侵襲をコードするＩｎｖ遺伝子座）（Ｙｏｕｎｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６，１９７−２０７（１９９２））および遺伝物質の侵入小胞回避を可能にする１つ以上の配列（例えば、リステリオリシンＯをコードするＨｌｙＡ遺伝子）（Ｍａｔｈｅｗら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０，１１０５−１１１５（２００３）およびＧｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，８６２−８６６（１９９８））も含む。ＴＲＩＰは国際公開第０６／０６６０４８号にも記載されている（ベクター／プラスミドの模式図も含む）。好適な実施形態では、ＴＲＩＰベクターおよびプラスミドは、適当なプロモーター配列およびターミネーター配列の制御下で短鎖ヘアピンＲＮＡをコードするヘアピンＲＮＡ発現カセットを組み込む。
これらの構築物の設計に際しては、アルゴリズムを用いて、ｓｉＲＮＡ開発に関する既知のいくつかの問題点、すなわち：（１）不適格な特性（ＳＮＰ、インターフェロンモチーフ）の排除；（２）ｒｅｆ ｓｅｑ中に相同性があった場合（１９／２１、他の任意の遺伝子と隣接する＞１７）の配列の排除；（３）著しいｍｉＲＮＡのシードタイプ一致が存在した場合の配列の排除を考慮に入れた。
本明細書に記載されるように、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子が真核標的細胞内で転写されるか、あるいは細菌またはＢＴＰ内で転写される。
ＤＮＡが真核細胞内で転写される実施形態では、１つ以上のｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡとして真核細胞内で転写される。真核細胞はインビボ、インビトロまたはエキソビボであってよい。この実施形態の一態様では、１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子は真核生物プロモーターを含む。任意で、真核生物プロモーターはＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターである。任意で、ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターはＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターである。
ＤＮＡが細菌またはＢＴＰ内で転写される実施形態では、１つ以上のＤＮＡ分子は原核生物プロモーターを含む。任意で、原核生物プロモーターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターである。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターはＴ７プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、改変ｌａｃＵＶ５プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｐＡ１プロモーター、ｌａｃ制御性プロモーター、ａｒａＣ＋ＰａｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｐｔａｃプロモーター（Ｅｓｔｒｅｍら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，９７６１−９７６６；Ｍｅｎｇら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９，４１６６−４１７；Ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＬ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，２１−２５）またはｒｅｃＡプロモーターであり得る。
好適なプロモーター配列を表１に挙げる。
ＤＮＡが細菌またはＢＴＰ内で転写される実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターはターミネーターを伴う。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ターミネーターはＴ７ターミネーター、ｌａｃＵＶ５ターミネーター、Ｒｈｏ非依存性ターミネーター、Ｒｈｏ依存性ターミネーターまたはＲＮＡポリメラーゼターミネーターであり得る。
好適なターミネーター配列を表２に挙げる。
さらなる実施形態では、本発明のベクターおよびプラスミドは、１つ以上のエンハンサー配列、選択マーカーまたは溶菌制御システム配列をさらに含む。
本発明の一態様では、１つ以上のＤＮＡ分子は原核生物エンハンサーを含む。任意で、原核生物エンハンサーはＴ７エンハンサーである。任意で、Ｔ７エンハンサーは配列ＧＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号：２２）を有する。この実施形態の別の態様では、１つ以上のＤＮＡ分子は原核生物ターミネーターを含む。
本発明の別の態様では、１つ以上のＤＮＡ分子は１つ以上の選択マーカーを伴う。この実施形態の一態様では、選択マーカーは、１つ以上の突然変異を含むアンバーサプレッサーまたは１つ以上の突然変異を含むジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）である。任意で、ｄａｐ遺伝子は、非限定的にｄａｐＡおよびｄａｐＥから選択される。
好適な選択マーカー配列を表３に挙げる。
任意で、アンバーサプレッサーはプロモーターまたはターミネーターを伴う。任意で、プロモーターはリポタンパク質プロモーターである。好適なプロモーター配列を表４に挙げる。
任意で、ターミネーターはｒｒｎＣターミネーターである。好適なターミネーター配列を表５に挙げる。
細菌およびＢＴＰ送達は、それらが遺伝子操作の影響を受けやすく、特定の適用に特異的に適合させたベクター株の生産が可能であるという理由から、ウイルス送達よりも魅力的である。本発明の一実施形態では、本発明の方法を用いて組織特異的な方法でＲＮＡｉを引き起こす細菌またはＢＴＰを作出する。
ｓｉＲＮＡをコードするプラスミドまたは１つ以上のｓｉＲＮＡの細胞内細菌またはＢＴＰからの遊離は、能動的な機序を介して起こる。１つの機序としては、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｍ）におけるIII型排出システムが挙げられ、これは細菌またはＢＴＰの細胞膜にわたり存在する特化した多タンパク質複合体であり、その機能には、標的細胞に向けたシグナル伝達を可能にする、毒性因子の細胞外への分泌が含まれるが、これは標的細胞内に抗原を送達するためにも使用することができ（Ｒｕｓｓｍａｎｎ Ｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２９３：１０７−１２（２００３））、あるいは溶菌および細菌またはＢＴＰ内容物の細胞質内への遊離を介するものが挙げられる。細胞内の細菌またはＢＴＰの溶解は、細胞内で活性な抗生物質（テトラサイクリン）の添加を含めた様々な機序を介して、細菌代謝の減弱化（栄養要求性）を介して、あるいは環境、例えばｐＨ、マグネシウム濃度、リン酸塩濃度、第二鉄イオン濃度、モル浸透圧濃度、嫌気条件、栄養不足および標的細胞もしくは宿主食胞全般のストレスに感受性のある細菌レギュレーター、プロモーターおよびセンサーを含む溶菌制御システムまたは細菌自殺システムを介して自然に誘発される。細菌またはＢＴＰの溶菌制御システムが１つ以上の上記環境条件を感知した場合、生来的にまたは改変により細菌またはＢＴＰが発現する抗菌性タンパク質、バクテリオファージ溶菌酵素および自己溶菌酵素、あるいは生来的にまたは改変、例えば遺伝子改変により細菌またはＢＴＰが発現するポア形成タンパク質（細菌またはＢＴＰを含有する食胞を破壊して、ｓｉＲＮＡをコードするプラスミドまたは１つ以上のｓｉＲＮＡを遊離する）を非限定的に含む１つ以上の機序により、細菌またはＢＴＰ溶解が誘発される。
溶菌制御システムのレギュレーターは、ＯｍｐＲ、ＡｒｃＡ、ＰｈｏＰ、ＰｈｏＢ、Ｆｕｒ、ＲｓｔＡ、ＥｖｇＡおよびＲｐｏＳを非限定的に含む群から選択され得る。好適な溶解レギュレーター配列を表６に挙げる。
溶菌制御システムのプロモーターは、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ、ｆａｄＢ、ｐｈｏＰＱ、ｍｇｔＡ、ｍｇｒＢ、ｐｓｉＢ、ｐｈｎＤ、Ｐｔｒｐ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｌｔＡ、ｓｌｔＢ、ａｓｒ、ｃｓｇＤ、ｅｍｒＫＹ、ｙｈｉＵＶ、ａｃｒＡＢ、ｍｄｆＡおよびｔｏｌＣを非限定的に含む群から選択され得る。好適な溶菌制御システムプロモーター配列を表７に挙げる。
溶菌制御システムのセンサーは、ＥｎｖＺ、ＡｒｃＢ、ＰｈｏＱ、ＰｈｏＲ、ＲｓｔＢおよびＥｖｇＳを非限定的に含む群から選択され得る。好適な溶菌制御システムセンサー配列を表８に挙げる。
溶菌制御システムは、１つ以上の上記レギュレーター、プロモーターおよびセンサーの任意の組合せを含み得る。
この実施形態の一例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＯｍｐＲ、プロモーターとしてｏｍｐＦおよびセンサーとしてＥｎｖＺを含み、刺激はモル浸透圧濃度の減少である。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＯｍｐＲ、プロモーターとしてｏｍｐＣおよびセンサーとしてＥｎｖＺを含み、刺激はモル浸透圧濃度の減少である。
この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＡｒｃＡ、プロモーターとしてｆａｄおよびセンサーとしてＡｒｃＢを含み、刺激は嫌気条件である。
この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＰｈｏＰ、プロモーターとしてｐｈｏＰＱおよびセンサーとしてＰｈｏＱを含み、刺激はマグネシウム濃度の減少である。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＰｈｏＰ、プロモーターとしてｍｇｔＡおよびセンサーとしてＰｈｏＱを含み、刺激はマグネシウム濃度の減少である。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＰｈｏＰ、プロモーターとしてｍｇｒＢおよびセンサーとしてＰｈｏＱを含み、刺激はマグネシウム濃度の減少である。
この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＰｈｏＢ、プロモーターとしてｐｓｉＢおよびセンサーとしてＰｈｏＲを含み、刺激はリン酸塩濃度の減少である。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＰｈｏＢ、プロモーターとしてｐｈｎＤおよびセンサーとしてＰｈｏＲを含み、刺激はリン酸塩濃度の減少である。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＲｓｔＡ、プロモーターとしてａｓｒおよびセンサーとしてＲｓｔＢを含む。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＲｓｔＡ、プロモーターとしてｃｓｇＤおよびセンサーとしてＲｓｔＢを含む。
この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＥｖｇＡ、プロモーターとしてｅｍｒＫＹおよびセンサーとしてＥｖｇＳを含む。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＥｖｇＡ、プロモーターとしてｙｈｉＵＶおよびセンサーとしてＥｖｇＳを含む。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＥｖｇＡ、プロモーターとしてａｃｒＡＢおよびセンサーとしてＥｖｇＳを含む。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＥｖｇＡ、プロモーターとしてｍｄｆＡおよびセンサーとしてＥｖｇＳを含む。この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＥｖｇＡ、プロモーターとしてｔｏｌＣおよびセンサーとしてＥｖｇＳを含む。
この実施形態の別の例では、溶菌制御システムは、レギュレーターとしてＦｕｒを、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｌｔＡまたはｓｌｔＢを含む群から選択されるプロモーターと組み合わせて含む。
抗菌性タンパク質は、α−およびβ−デフェンシン、プロテグリン、カテリシジン（例えば、インドリシジンおよびバクテネシン）、グラニュリシン、リゾチーム、ラクトフェリン、アズロシジン、エラスターゼ、殺菌性透過性誘導ペプチド（ＢＰＩ）、アドレノメデュリン、ブレビニン、ヒスタチンならびにヘプシジンを非限定的に含む群から選択され得る。さらなる抗菌性タンパク質が、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる以下のものに開示されている：Ｄｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ａ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，８，７０３−７１４（２００２）；Ｊａｃｋ Ｒ．Ｗ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５９（２），１７１−２００（Ｊｕｎｅ １９９５）。
任意で、抗菌性タンパク質はα−デフェンシン、β−デフェンシンまたはプロテグリンである。好適な抗菌性タンパク質配列を表９に挙げる。
バクテリオファージ溶菌酵素は、ホリン、エンドリシンまたはリシン（例えば、リゾチーム、アミダーゼおよびトランスグリコシラーゼ）を非限定的に含む群から選択され得る。さらなるリシンが、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる以下のものに開示されている：Ｋｌｏｏｓ Ｄ．−Ｕ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７６（２３），７３５２−７３６１（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４）；Ｊａｉｎ Ｖ．ら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６８（２），９８６−９８９（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０００）；Ｓｒｉｖｉｄｈｙａ Ｋ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．，３２，９７９−９９０（２００７）；Ｙｏｕｎｇ Ｒ．Ｖ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５６（３），４３０−４８１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９２）。
自己溶菌酵素は、ペプチドグリカンヒドロラーゼ、アミダーゼ（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）、トランスグリコシラーゼ、エンドペプチダーゼおよびグルコサミニダーゼを非限定的に含む群から選択され得る。さらなる自己溶菌酵素が、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる以下のものに開示されている：Ｈｅｉｄｒｉｃｈ Ｃ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１（１），１６７−１７８（２００１）；Ｋｉｔａｎｏ Ｋ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６７（３），７５９−７６５（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８６）；Ｌｏｍｍａｔｚｓｃｈ Ｊ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７９（１７），５４６５−５４７０（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９７）；Ｏｓｈｉｄａ Ｔ．ら，ＰＮＡＳ，９２，２８５−２８９（Ｊａｎｕａｒｙ １９９５）；Ｌｅｎｚ Ｌ．Ｌ．ら，ＰＮＡＳ，１００（２１），１２４３２−１２４３７（Ｏｃｔｏｂｅｒ １４，２００３）；Ｒａｍａｄｕｒａｉ Ｌ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７９（１１），３６２５−３６３１（Ｊｕｎｅ １９９７）；Ｋｒａｆｔ Ａ．Ｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８０（１２），３４４１−３４４７（Ｊｕｌｙ １９９８）；Ｄｉｊｋｓｔｒａ Ａ．Ｊ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６６，１１５−１１８（１９９５）；Ｈｕａｒｄ Ｃ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，６９５−７０５（２００３）．
本発明の一態様では、溶菌制御システムがもたらす制御は、細菌またはＢＴＰ株特異的制御によりさらに増強され得る。この実施形態の一態様では、株特異的制御は、栄養遺伝子の欠失により引き起こされる減弱化である。栄養遺伝子は、ｄａｐＡ、ａｒｏＡおよびｇｕａＢＡを非限定的に含む群から選択され得る。この実施形態の一例では、ｄａｐＡ減弱化によりリジンおよびペプチドグリカンの生合成の欠乏が生じる。この特定の実施形態では、ｌｙｓＣを非限定的に含めた遺伝子の転写が、転写誘導、抗転写終結およびリボスイッチのような機序により活性化される。この実施形態の別の例では、ａｒｏＡ減弱化により、芳香族アミノ酸の欠乏、ならびにＴｒｐＲおよびＴｙｒＲのようなレギュレーターによる、ａｒｏＦ、ａｒｏＧおよびａｒｏＨを非限定的に含めた１つ以上の遺伝子の抑制解除が生じる。この実施形態の別の例では、ｇｕａＢＡ減弱化により、ＰｕｒＲにより抑制される１つ以上の遺伝子の抑制解除が生じる。
溶菌制御システムおよび株特異的制御に加え、細菌またはＢＴＰは、臨床医が所望する時間に細菌またはＢＴＰ溶解を促進するＴｅｔ−ｏｎ発現システムを非限定的に含めた誘導性システムをさらに含み得る。Ｔｅｔ−ｏｎプロモーターを活性化するテトラサイクリン投与の際に、細菌またはＢＴＰは、細菌またはＢＴＰの溶解を誘発するタンパク質を発現する。この実施形態の一例では、Ｔｅｔ−ｏｎ発現システムの下で発現されるタンパク質は、デフェンシンおよびプロテグリンを非限定的に含む群から選択される。
本発明はまた、株特異的弱毒化（例えば、栄養的減弱化）と組み合わせた溶菌制御システムも提供する。国際公開第２００８／１５６７０２号の図３０に示されるように、包括的レギュレーターは細胞外条件を感知し、転写、過剰な栄養素の存在下での実験的増殖とは対照的なアミノ酸などの特定の栄養素に対するインビボでの飢餓、および飢餓に応答したポジティブまたはネガティブレギュレーターを制御することができる。国際公開第２００８／１５６７０２号の図３１に示される模式図では、３つのカセットが存在し得、そのいずれもが細菌染色体上またはプラスミド上に位置し得る。
記載されるように、本発明は、レギュレーターとしてＯｍｐＲ、プロモーターとしてｏｍｐＦまたはｍｐＣおよび抗菌性タンパク質としてプロテグリンまたはβ−デフェンシンを、２つのレベルの溶菌制御をもたらすＴｅｔ−ｏｎ発現システムと共に含む、溶菌制御システムを含むプラスミドを提供する。この実施形態は、国際公開第２００８／１５６７０２号の図３２において図示されている。
本発明の別の態様では、ＤＮＡ挿入物は、それぞれがＨＰＶ標的配列、ヘアピン配列ならびにＴＲＩＰプラスミドのヘアピンＲＮＡ発現カセット内への組込みを促進するＢａｍＨ１およびＳａｌ１制限部位を含む、表１０に示される以下の構築物を１つ以上含む。
４．細胞および遺伝子標的
本発明はまた、本発明で提供される様々な細菌、ＢＴＰおよびベクターの使用法も提供する。例えば、本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞に送達する方法を提供する。この方法は、１つ以上のｓｉＲＮＡまたは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含有する、少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの細菌治療粒子（ＢＴＰ）を哺乳動物細胞に導入することを含む。
本発明はまた、哺乳動物細胞内での遺伝子発現を制御する方法も提供する。この方法は、１つ以上のｓｉＲＮＡまたは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含有する、少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの細菌治療粒子（ＢＴＰ）を哺乳動物細胞に導入することを含み、ここでは、発現されたｓｉＲＮＡが対象遺伝子の少なくとも１つのｍＲＮＡを阻害することにより遺伝子発現を制御する。
本発明は、任意のタイプの標的細胞にＲＮＡを送達するための方法を提供する。本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、細菌に侵襲され得る細胞、すなわち、細菌による認識に必要な表面受容体を有する細胞を指す。
好適な標的細胞は真核細胞である。さらにより好適な標的細胞は動物細胞である。「動物細胞」は、分類学的位置が動物界内にある多細胞生物に由来または存在する、有核の、葉緑体を含まない細胞と定義される。細胞は、無傷動物、初代細胞培養、移植片培養および形質転換細胞系内に存在し得る。特定組織の細胞源が本発明に重要であるというわけではない。
本発明で使用されるレシピエント動物細胞が本発明にとって重要であるというわけではなく、動物界内のすべての生物、例えば哺乳類科、魚類科、鳥類科、爬虫類科の生物などに存在または由来する細胞を包含する。
好適な動物細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマおよび霊長類の細胞である。最も好適な哺乳動物細胞はヒト細胞である。細胞はインビボ、インビトロまたはエキソビボであり得る。
本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、子宮頸部上皮細胞、直腸上皮細胞または咽頭上皮細胞、マクロファージ、胃腸上皮細胞、皮膚細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、毛包、結腸癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、咽頭癌細胞、直腸癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、膵臓癌細胞、肝細胞、肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、神経細胞、リンパ腫または白血病細胞のような血液癌細胞である。この実施形態の一態様では、結腸癌細胞はＳＷ４８０細胞である。この実施形態の別の態様では、膵臓癌細胞はＣＡＰＡＮ−１細胞である。
好適な一実施形態では、標的細胞は粘膜表面内にある。特定の腸管病原体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、宿主粘膜表面に付着し侵襲する能力を有する（Ｋｒｅｉｇら，上記）ため、生来的に本願に適合する。したがって、本発明では、このような細菌は宿主粘膜区画内の細胞へＲＮＡ分子またはＲＮＡをコードするＤＮＡを送達することができる。
特定のタイプの細菌は、特定の向性、すなわち好適な標的細胞を有し得るが、特定のタイプの細胞へのＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡの送達は、所望の細胞タイプに対する向性を有するか、または所望の細胞タイプを侵襲できるように改変された細菌を選択することにより達成される。したがって、例えば、上述のように細菌を遺伝子操作して粘膜組織への向性および侵襲特性を模倣させることにより、前記細菌に粘膜組織を侵襲させて、これらの部位の細胞にＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡを送達させ得る。
また細菌を他のタイプの細胞に標的化することもできる。例えば、細菌を改変し、その表面上に、ヒトおよび霊長類の赤血球と特異的に結合するプラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）網状赤血球結合タンパク質−１および−２のいずれかまたは両方を発現させることにより、細菌をヒトおよび霊長類の赤血球に標的化することができる（Ｇａｌｉｎｓｋｉら，Ｃｅｌｌ，６９：１２１３−１２２６（１９９２））。別の実施形態では、表面上に、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドであるアシアロオロソムコイドを有するように細菌を改変する（Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８））。さらに別の実施形態では、インスリン受容体を有する細胞へプラスミド取込みを標的化することが示されているインスリン−ポリ−Ｌ−リジンで、細菌をコーティングする（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚら，Ｅｘｐｔ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９９：３２３−３２９（１９９２））。肝細胞に対する向性を可能にするリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のｐ６０（Ｈｅｓｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３：２０４７−２０５３（１９９５））あるいはヘパリン、ヘパリン硫酸およびコラーゲンと結合することにより哺乳動物の細胞外マトリックスとの特異的結合を引き起こすトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）由来の６０ｋＤ表面タンパク質（Ｏｒｔｅｇａ−Ｂａｒｒｉａら，Ｃｅｌｌ，６７：４１１−４２１（１９９１））を表面上に有するように改変された細菌も本発明の範囲内である。
さらに別の実施形態では、細胞を改変してＲＮＡ送達のための細菌の標的細胞にすることができる。したがって、細胞を改変して、細菌の細胞内侵入のために細菌により認識される表面抗原、すなわち侵襲因子の受容体を発現させることができる。表面抗原が所望の条件で発現されるように、侵襲因子の受容体をコードする核酸を細胞内に導入することによって細胞を改変することもできる。あるいは、細胞を侵襲因子の受容体でコーティングすることができる。侵襲因子の受容体としては、インテグリン受容体スーパーファミリーに属するタンパク質が挙げられる。様々な細菌およびその他の微生物により認識されるインテグリン受容体のタイプのリストを、例えば、ＩｓｂｅｒｇおよびＴｒａｎ Ｖａｎ Ｎｈｉｅｕ（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：３９５に見出すことができる。インテグリンサブユニットのヌクレオチド配列を、例えば、インターネット上で公表されているＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる。
上記のように、さらに別の標的細胞としては、魚類、鳥類および爬虫類の細胞が挙げられる。魚類、鳥類および爬虫類の細胞に対して生来的に侵襲性である細菌の例を以下に挙げる。
魚類細胞の細胞質に生来的に接近可能な細菌の例としては、エロモナス・サルミノシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｉｎｏｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３６５８）およびエロモナス・シュベリイ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｃｈｕｂｅｒｉｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３７００）が非限定的に挙げられる。弱毒化細菌が本発明で好ましく使用され、かつＡ．サルモニシディア（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄｉａ）ｖａｐＡ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３７：４５２−４６３（１９９４））またはＡ．サルモニシディア（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄｉａ）芳香族依存性変異株（Ｖａｕｇｈａｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：２１７２−２１８１（１９９３））を含む。
鳥類細胞の細胞質に生来的に接近可能な細菌の例としては、サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．９１８４）、サルモネラ・エンテリディティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４９３１）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９４）が非限定的に挙げられる。弱毒化細菌が本発明には好ましく、かつＳ．ガリナルム（Ｓ．ｇａｌｉｎａｒｕｍ）ｃｙａ ｃｒｐ変異株（Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８７）上記）またはＳ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ａｒｏＡ芳香族依存性変異株ＣＶＬ３０（Ｃｏｏｐｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：４７３９−４７４６（１９９４））のような弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を含む。
爬虫類細胞の細胞質に生来的に接近可能な細菌の例としては、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９４）が非限定的に挙げられる。弱毒化細菌が本発明には好ましく、かつＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｉｒｕｍ）芳香族依存性変異株（Ｈｏｒｍａｅｃｈｅら，上記）のような弱毒化株を含む。
本発明はまた、他の真核細胞、例えば植物細胞へのＲＮＡ送達を、生来的にまたは侵襲性になるよう改変された後にそのような細胞を侵襲可能な微生物が存在する限り提供する。植物細胞を侵襲可能な微生物の例としては、アグロバクテリウム・ツメルファシウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）が挙げられ、この微生物は、特異的受容体を介して植物細胞と結合する線毛様構造を用い、次いで、細菌接合に似たプロセスを介してその内容物の少なくとも一部を植物細胞に送達する。
本発明の方法に従ってＲＮＡが送達され得る細胞系の例を以下に挙げる。
ヒト細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６２、ＣＣＬ１５９、ＨＴＢ１５１、ＨＴＢ２２、ＣＣＬ２、ＣＲＬ１６３４、ＣＲＬ８１５５、ＨＴＢ６１およびＨＴＢ１０４が挙げられる。
ウシ細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６０２１、ＣＲＬ１７３３、ＣＲＬ６０３３、ＣＲＬ６０２３、ＣＣＬ４４およびＣＲＬ１３９０が挙げられる。
ヒツジ細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６５４０、ＣＲＬ６５３８、ＣＲＬ６５４８およびＣＲＬ６５４６が挙げられる。
ブタ細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＬ１８４、ＣＲＬ６４９２およびＣＲＬ１７４６が挙げられる。
ネコ細胞系の例としては、ＣＲＬ６０７７、ＣＲＬ６１１３、ＣＲＬ６１４０、ＣＲＬ６１６４、ＣＣＬ９４、ＣＣＬ１５０、ＣＲＬ６０７５およびＣＲＬ６１２３が挙げられる。
ヤギュウ細胞系の例としては、ＣＣＬ４０およびＣＲＬ６０７２が挙げられる。
イヌ細胞の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２１３、ＣＣＬ３４、ＣＲＬ６２０２、ＣＲＬ６２２５、ＣＲＬ６２１５、ＣＲＬ６２０３およびＣＲＬ６５７５が挙げられる。
ヤギ由来細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７３およびＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２７０が挙げられる。
ウマ由来細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ５７およびＣＲＬ６５８３が挙げられる。
シカ細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６１９３〜６１９６が挙げられる。
霊長類由来細胞系の例としては、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３１２、ＣＲＬ６３０４およびＣＲＬ１８６８のようなチンパンジー由来の細胞系；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７６，ＣＣＬ２６およびＣＣＬ１６１のようなサル細胞系；オランウータン細胞系ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１８５０；ならびにゴリラ細胞系ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１８５４が挙げられる。
本発明はまた、１つ以上の遺伝子の発現を制御する方法も提供する。好ましくは、１つ以上の遺伝子の発現制御は、その遺伝子の発現の減少または低下ならびに／あるいはその遺伝子の活性およびその対応する遺伝子産物の減少または低下を意味する。
一実施形態では、発現されたｓｉＲＮＡは、細胞の多酵素複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）を、制御するべきＲＮＡと相互作用するように導く。この複合体はｍＲＮＡを分解または隔離する。これにより遺伝子の発現が減少するか、または阻害される。
いくつかの実施形態では、遺伝子は動物遺伝子である。好適な動物遺伝子は、哺乳動物遺伝子、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマおよび霊長類の遺伝子などである。最も好適な哺乳動物遺伝子はヒト細胞である。
制御される遺伝子は、ウイルス遺伝子、抗炎症遺伝子、肥満遺伝子または自己免疫疾患もしくは障害遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝子が単一のプラスミドまたはベクターから制御される。
好適な実施形態では、遺伝子は、ｒａｓ、β−カテニン、１つ以上のＨＰＶ癌遺伝子、ＡＰＣ、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、ＨＥＲ−２、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＤＲ−１、ＭＲＰ−２、ＦＡＴＰ４、ＳＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−２、ＧＬＵＴ−５、ａｐｏｂｅｃ−１、ＭＴＰ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒａ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−３２α、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニット、ＬＹ６Ｃ、ｐ３８／ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ、ｐ６５／ＮＦ−κＢ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、クローディン−２、キチナーゼ３様−１、ａｐｏＡ−ＩＶ、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIであり得るが、これらに限定されない。この実施形態の一態様では、ｒａｓはｋ−Ｒａｓである。この実施形態の別の態様では、ＨＰＶ癌遺伝子はＥ６またはＥ７である。
好適なβ−カテニン標的遺伝子配列を表１１に挙げる。表１１の配列は、ヒト、マウス、ラット、イヌおよびサルにおけるβ−カテニン遺伝子（ＣＴＮＮＢ１）のサイレンシングが可能であるため異種間標的配列である。
好適なＨＰＶ標的遺伝子配列を表１２に挙げる。表１２の配列は、ＨＰＶＥ６癌遺伝子のサイレンシングが可能な標的配列である。
さらなる好適なＨＰＶ標的遺伝子配列を表１３に挙げる。表１３の配列は、ＨＰＶＥ７癌遺伝子のサイレンシングが可能であるため標的配列である。
さらなる好適なＨＰＶ標的遺伝子配列を表１４に挙げる。表１４の配列は、ＨＰＶのＥ６およびＥ６両方に共通する標的配列である。
好適なＭＤＲ−１標的遺伝子配列を表１５に挙げる。表１５の配列は、ヒトにおけるＭＤＲ−１遺伝子のサイレンシングが可能である。
好適なｋ−Ｒａｓ標的遺伝子配列を表１６に挙げる。表１６の配列は、ヒトにおけるｋ−Ｒａｓ遺伝子のサイレンシングが可能である。
好適なＩＬ−６Ｒ標的遺伝子配列を表１７に挙げる。表１７の配列は、ヒトにおけるＩＬ−６Ｒのサイレンシングが可能である。
参照可能なＩＬ−６Ｒ標的遺伝子配列をさらに表１８に挙げる。表１８の配列は、マウスにおけるＩＬ−６Ｒ遺伝子のサイレンシングが可能である。
好適なＩＬ−７標的遺伝子配列を表１９に挙げる。表１９の配列は、ヒトにおけるＩＬ−７遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＩＬ−７標的遺伝子配列を表２０に挙げる。表２０の配列は、マウスにおけるＩＬ−７遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＩＬ−７標的遺伝子配列を表２１に挙げる。表２１の配列は、ヒトおよびマウスにおけるＩＬ−７遺伝子のサイレンシングが可能であるため異種間配列である。
好適なＩＬ−１３Ｒａ−１標的遺伝子配列を表２２に挙げる。表２２の配列は、ヒトにおけるＩＬ−１３Ｒａ−１遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＩＬ−１３Ｒａ−１標的遺伝子配列を表２３に挙げる。表２３の配列は、マウスにおけるＩＬ−１３Ｒａ−１遺伝子のサイレンシングが可能である。
好適なＩＬ−１８標的遺伝子配列を表２４に挙げる。表２４の配列は、ヒトにおけるＩＬ−１８遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＩＬ−１８標的遺伝子配列を表２５に挙げる。表２５の配列は、マウスにおけるＩＬ−１８遺伝子のサイレンシングが可能である。
好適なＣＣＬ２０標的遺伝子配列を表２６に挙げる。表２６の配列は、ヒトにおけるＣＣＬ２０遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＣＣＬ２０標的遺伝子配列を表２７に挙げる。表２７の配列は、マウスにおけるＣＣＬ２０遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＣＣＬ２０標的遺伝子配列を表２８に挙げる。表２８の配列は、ヒトおよびマウスにおけるＣＣＬ２０遺伝子のサイレンシングが可能であるため異種間配列である。
好適なＣＣＬ２０標的遺伝子配列を表２９に挙げる。表２９の配列は、ヒトにおけるＣＣＬ２０遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なＣＣＬ２０標的遺伝子配列を表３０に挙げる。表３０の配列は、マウスにおけるＣＣＬ２０遺伝子のサイレンシングが可能である。
好適なキチナーゼ−３標的遺伝子配列を表３１に挙げる。表３１の配列は、ヒトにおけるキチナーゼ−３遺伝子のサイレンシングが可能である。
さらなる好適なキチナーゼ−３標的遺伝子配列を表３２に挙げる。表３２の配列は、マウスにおけるキチナーゼ−３遺伝子のサイレンシングが可能である。
５．疾患および障害の治療
本発明はまた、哺乳動物における疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。この方法は、哺乳動物細胞に、１つ以上のｓｉＲＮＡまたは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含有する、少なくとも１つの侵襲性細菌または少なくとも１つの細菌治療粒子（ＢＴＰ）を導入することにより、疾患または障害を引き起こすことが知られている細胞内の少なくとも１つの遺伝子の発現を制御することを含み、ここでは、発現されたｓｉＲＮＡが、対象とする疾患または障害を引き起こすことが知られている遺伝子のｍＲＮＡを阻害する。
ＢＭＧＳおよびｔｋＲＮＡｉを含めた本発明のＲＮＡｉ法は、遺伝子発現制御が有効であり得る任意の疾患または障害を治療するために使用される。この方法は、１つ以上の疾患および障害に関与する遺伝子のサイレンシングまたはノックダウン（減少）により遂行される。
対象とする疾患または障害を治療または予防するために制御される遺伝子は、ｒａｓ、β−カテニン、１つ以上のＨＰＶ癌遺伝子、ＡＰＣ、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、ＨＥＲ−２、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＤＲ−１、ＭＲＰ−２、ＦＡＴＰ４、ＳＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−２、ＧＬＵＴ−５、ａｐｏｂｅｃ−１、ＭＴＰ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３ Ｒａ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−３２α、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニット、ＬＹ６Ｃ、ｐ３８／ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ、ｐ６５／ＮＦ−κＢ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、クローディン−２、キチナーゼ３様−１、ａｐｏＡ−ＩＶ、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIであり得るが、これらに限定されない。この実施形態の一態様では、ｒａｓはｋ−Ｒａｓである。この実施形態の別の態様では、ＨＰＶ癌遺伝子はＥ６またはＥ７である。
本発明は、ｒａｓ、β−カテニン、１つ以上のＨＰＶ癌遺伝子、ＡＰＣ、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、ＨＥＲ−２、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＤＲ−１、ＭＲＰ−２、ＦＡＴＰ４、ＳＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−２、ＧＬＵＴ−５、ａｐｏｂｅｃ−１、ＭＴＰ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒａ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−３２α、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニット、ＬＹ６Ｃ、ｐ３８／ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ、ｐ６５／ＮＦ−κＢ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、クローディン−２、キチナーゼ３様−１、ａｐｏＡ−ＩＶ、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIを非限定的に含めた遺伝子の過剰発現に関連する疾患または障害の治療または予防の方法を提供する。好ましくは、遺伝子はβ−カテニンであり、治療される疾患障害はβ−カテニンの過剰発現に関連するものである。本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、正常なまたは野生型の発現と比べて増加している発現（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）を指す。好ましくは、治療される疾患または障害は、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ガードナー症候群、肝細胞癌（ＨＣＣ）、基底細胞癌、毛母腫、髄芽腫および卵巣癌からなる群より選択される。
好ましくは、本発明は、細菌またはＢＴＰを細胞に導入することにより、疾患または障害の発症、伝播または延長と関連することが知られている１つまたは複数の遺伝子の発現を制御することによる、哺乳動物における癌もしくは細胞増殖障害、ウイルス疾患、炎症性疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、自己免疫性疾患もしくは障害、または皮膚もしくは毛髪における疾患、障害もしくは美容的問題の治療または予防の方法を提供する。細菌またはＢＴＰは、１つ以上のｓｉＲＮＡまたは１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子を含有し、ここでは、発現されたｓｉＲＮＡが、対象とする疾患または障害の発症、伝播または延長を引き起こすことが知られている遺伝子のｍＲＮＡを阻害する。
いくつかの好適な実施形態では、ウイルス疾患は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、またはＨＰＶ感染もしくはＨＰＶ誘導性形質転換により引き起こされる、子宮頸癌、直腸癌および咽頭癌を含めた上皮異形成もしくは癌であり得るが、これらに限定されない。
いくつかの好適な実施形態では、炎症性疾患または障害は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、アレルギー、関節リウマチまたは気道疾患であり得るが、これらに限定されない。
いくつかの好適な実施形態では、自己免疫性疾患または障害は、セリアック病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは脳脊髄炎であり得るが、これらに限定されない。
いくつかの好適な実施形態では、疾患、障害または美容的問題は、乾癬、湿疹、白皮症、脱毛または白髪であり得るが、これらに限定されない。
哺乳動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマまたは霊長類を含めた任意の哺乳動物であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「治療すること」および「治療」という用語は、不都合な状態、疾患または障害に罹患している、臨床症状を示す個人に、症状の重症度および／もしくは頻度を低減させる、症状および／もしくはその根本原因を除去する、および／または損傷の改善もしくは修正を促進するように、薬剤または製剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する細菌および／またはＢＴＰ）を投与することを指す。
「予防すること」および「予防」という用語は、特定の不都合な状態、疾患または障害に感受性のある、臨床的に無症状の個人に薬剤または組成物を投与することを指し、症状の発生および／またはその根本原因の予防に関連する。
６．医薬組成物および投与方法
本発明の好適な一実施形態では、ＲＮＡ分子および／またはそれをコードするＤＮＡを含有する侵襲性細菌またはＢＴＰは、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内、経口、鼻腔内、眼内、直腸内、腟内、骨内、経口、浸漬および尿道内の接種経路により動物内に導入される。
被検体に投与される本発明の侵襲性細菌またはＢＴＰの量は、被検体の種類および治療される疾患または状態により異なる。一般に、使用される投与量は、被検体当たり約１０３〜１０１１個の生存微生物、好ましくは、約１０５〜１０９個の生存微生物である。
本発明の侵襲性細菌またはＢＴＰは一般に、薬学的に許容される担体および／または希釈剤と共に投与される。使用される特定の薬学的に許容される担体および／または希釈剤が本発明にとって重要であるというわけではない。希釈剤の例としては、リン酸緩衝生理食塩水、胃内の胃酸緩衝のための緩衝液、例えばスクロースを含有するクエン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ７．０）単独など（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：８８８−９０２（１９８７）；およびＢｌａｃｋら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：１２６０−１２６５（１９８７））、またはアスコルビン酸、ラクトースおよび任意でアスパルテームを含有する炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ７．０）（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｌａｎｃｅｔ，II：４６７−４７０（１９８８））が挙げられる。担体の例としては、タンパク質（例えば、脱脂乳中に見られるもの）、糖（例えば、スクロース）またはポリビニルピロリドンが挙げられる。通常、これらの担体は約０．１〜３０％（ｗ／ｖ）の濃度で、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で使用されるであろう。
送達特異的経路に使用され得るその他の薬学的に許容される担体または希釈剤を以下に記載する。このような担体または希釈剤はいずれも、細菌またはＢＴＰが標的細胞を侵襲することが依然可能である限り、本発明の細菌の投与に使用することができる。侵襲性に関するインビトロまたはインビボ試験を行って、適当な希釈剤および担体を決定することができる。本発明の組成物は、全身および局所もしくは局部投与を含めた様々なタイプの投与用に製剤化することができる。標的細胞との接触または被検体への投与の際に細菌が侵襲性である限り、凍結乾燥形態も含まれる。技術および製剤は一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出し得る。全身投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下を含めた注射が好ましい。注射用に、組成物、例えば本発明の細菌またはＢＴＰを溶液、好ましくは、Ｈａｎｋ’ｓ溶液またはリンガー溶液のような生理的に適合する緩衝液中で製剤化することができる。
経口投与には、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される添加剤、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などと共に従来の手段により調製される、錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は当該技術分野で公知の方法によりコーティングされ得る。経口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとり得るか、または使用前に水もしくは他の適切な媒体との構築のための乾燥製品として提供され得る。このような液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸）などと共に従来の手段により調製され得る。調製物はまた、適当な緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
経口投与用の調製物は、活性化合物の放出制御をもたらすように適切に製剤化され得る。バッカル投与には、組成物は従来の方法で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
吸入による投与には、本発明による使用のための医薬組成物は、エアロゾルスプレー調製物の形態で、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧パックまたは噴霧器から適宜送達される。加圧エアロゾルの場合、定量送達するためのバルブを装備することにより投与単位を定め得る。吸入器または吹入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、組成物の粉末混合物、例えば細菌とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤とを含有させて製剤化し得る。
医薬組成物は、注射による、例えば、ボーラス注入または持続注入よる非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、単位投与剤形、例えば、保存剤を添加したアンプルまたは複数回投与容器で提供され得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤または乳剤のような形態をとり得、懸濁化、安定化および／または分散剤のような製剤用剤を含有し得る。あるいは、有効成分は、使用前に適切な媒体、例えば滅菌無発熱物質水との構築用の粉末形態であり得る。
医薬組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸のような直腸内、腟内または尿道内組成物にも製剤化され得る。
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与には、浸透するバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は一般に当該技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用の胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を使用し得る。経粘膜投与は、経鼻スプレー剤による、または坐剤を用いるものであり得る。局所投与には、細菌が標的細胞との接触の際に依然侵襲性である限り、本発明の細菌を一般に当該技術分野で公知の軟膏剤、塗布剤、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化する。
組成物は、必要であれば、パックもしくはディスペンサ装置および／または有効成分を含有する１つ以上の単位投与剤形を含み得る、キットで提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスティックのホイルを含み得る。パックもしくはディスペンサ装置には、投与説明書が付属し得る。
導入されるＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する侵襲性細菌またはＢＴＰは、被検体から得られる細胞のような、インビトロで培養される動物細胞に感染させるために使用することができる。次いで、これらのインビトロ感染した細胞を、動物、例えば最初に細胞を得た被検体に、静脈内、筋肉内、皮内または腹腔内であるいは細胞が宿主組織に侵入できる任意の接種経路で導入することができる。個々の細胞にＲＮＡを送達する場合、生存微生物の投与量は、細胞当たり約０．１〜１０６個、好ましくは約１０２〜１０４個の細菌の範囲の感染多重度である。
本発明のさらに別の実施形態では、細菌は、タンパク質をコードするＲＮＡ分子を細胞、例えば動物細胞に送達することも可能であり、後にそこからタンパク質を回収および精製することができる。例えば、タンパク質は組織培養細胞中で産生され得る。
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、上記説明は説明を意図するものであり、添付の特許請求の範囲の範囲により規定される本発明の範囲の限定を意図するものではない。その他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これら実施例は限定するものとして決して解釈されるべきではない。本願全体にわたり引用されている参考文献、発行済み特許、公表された特許出願を含めたすべての引用参考文献の内容は、明示的に参照により本明細書に組み込まれる。本発明の実施は、特に明示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用し、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ ＩおよびII（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕら，編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。
以下の非限定的な実施例は、本発明の好適な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するものとして解釈してはならない。
実施例１：β−カテニンおよびｋ−Ｒａｓのノックダウン
本明細書に開示されるｓｉＲＮＡノックダウン技術の強力な特性がこれまでの研究で示されている。例えば、細菌送達を用いたβ−カテニンおよびｋ−ｒａｓのインビトロおよびインビボノックダウンが、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第０６／０６６０４８号に記載されている。
実施例２：多重ｓｈＲＮＡ発現カセットを有するＴＲＩＰ
本明細書に記載され、かつ国際公開第０６／０６６０４８号にさらに詳細に記載されているＴＲＩＰを改変して、複数遺伝子の同時標的化または一遺伝子内の複数配列の同時標的化を可能にするプラスミドを産生することができる。例えば、ｓｈＲＮＡを産生する複数のヘアピン発現カセットを有するＴＲＩＰは、同時の細菌処置により、所与の一遺伝子内の異なる配列を標的化するか、または複数の遺伝子を標的化することができる。
ＴＲＩＰプラスミドは、複数（１０個以下）のクローニング部位を組み込んで、異なるｓｈＲＮＡ構築物を発現することができる（国際公開第２００８／１５６７０２号の図１に示されている）。このようなプラスミドの目的は、単一の治療用細菌により様々な遺伝子のサイレンシングを可能にすることであり、この治療用細菌は、多重発現カセット−ＴＲＩＰ（ｍｅｃ−ＴＲＩＰ）により、同時に様々な標的に対して短鎖ヘアピンＲＮＡを合成することができる。
これらの異なるヘアピンは、同じ高レベルのプロモーター（Ｔ７プロモーターまたは異なる高レベルの細菌プロモーター）の使用により競合的に高レベルで発現され得るか、または異なる活性レベルのプロモーターの使用により異なるレベルで発現され得るが、これは、意図されるプラスミドの使用および標的遺伝子の所望の相対的サイレンシングレベルに依存する。
このｍｅｃ−ＴＲＩＰは、本明細書に記載の複数の標的（例えば、結腸癌の場合におけるｋ−ｒａｓとβ−カテニンまたは乳癌におけるＨＥＲ−２とＭＤＲ−１のような複数の癌遺伝子、あるいはその他の組合せ）の同時サイレンシング（標的化）により、本発明に記載の複合疾患（例えば、炎症性疾患または癌）の治療に有用であり得る。
実施例３：オペレーターリプレッサータイトレーションシステム
ＴＲＩＰシステム（細菌およびプラスミド）がＣｏｂｒａ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ｋｅｅｌｅ，ＵＫ）のＯＲＴ（オペレーターリプレッサータイトレーション）Ｓｙｓｔｅｍを含むように改変されている。これを適用することにより、選択的抗生物質の非存在下で適切な株内にプラスミドを維持するのに役立つ。したがって、細菌担体株は、ＯＲＴシステムが機能できるように改変されている（ＤＡＰ遺伝子の欠失およびＯＲＴ制御ＤＡＰ遺伝子発現システムとの置換）。プラスミドは、ＯＲＴシステムを補助するために、抗生物質選択配列が除去されるように改変されている。さらなる変更が細菌ゲノムに導入されており、例えば、（ａ）特に、栄養不足により細菌が死滅する細胞区画内における栄養貯蔵に対して、細菌をより感受性にするためのａｒｏＡ遺伝子（一部のＣＥＱ株における）欠失；（ｂ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体内への挿入および／または（ｃ）染色体内へのＴ７プロモーター下でのｓｈＲＮＡ発現カセット組込みを含む。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２は、細菌株開発の例を示している。さらなる開発された株として、ＣＥＱ９２２（ａｒｏＡ欠失のないＣＥＱ９１９）、ＣＥＱ９２３（ａｒｏＡ欠失のないＣＥＱ９２０）、ＣＥＱ９２４（ａｒｏＡ欠失のないＣＥＱ９２１）が挙げられるが、これらに限定されない。
実施例４：腸管遺伝子送達
Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を、それが腸管を裏打ちする上皮細胞内へのＲＮＡｉ送達用のベクターとして使用可能か否かを判定するために調べた。マウスを１０８個の単回用量ＳＬ７２０７で経口的に処置し、投与後の様々な時点で屠殺した。次いで、サルモネラ特異的抗体を用いてＳＬ７２０７を染色した。処置の２時間後、多数のＳＬ７２０７が腸上皮層を侵襲しているのが見られ（赤染されたサルモネラ）、ＳＬ７２０７の経口投与が、腸および結腸粘膜にペイロードを送達するための有用なツールであり得ることを示していた。フォローアップ実験では、マウスをＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰＣ１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を保持するＳＬ７２０７で処置した。単回処置の２４時間後に、ごく一部（約１％）の細胞がＧＦＰを発現しているのが明確に見出された。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図３は、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）による腸粘膜内への効率的な侵襲およびプラスミド送達を示している。経口投与６時間後にＳＬ７２０７を赤色の蛍光抗体を用いて染色した。インタクトのＳＬ７２０７およびＳＬ７２０７のフラグメントが上皮細胞のみならず、固有層の裏打ち細胞にも見られた（上部左／右）。ＳＬ７２０７は発現ＤＮＡを腸粘膜内へ良好に送達する：腸粘膜細胞が、ＧＦＰの真核発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）を保有するＳＬ７２０７での処置後にＧＦＰを発現している（左下方）。蛍光顕微鏡用に、ＳＬ７２０７を赤色の蛍光抗体で染色し、核をヘキスト３７１１１で対比染色した。
ＳＬ７２０７が腸管内の標的遺伝子へのＲＮＡｉ送達に使用され得るか否かを試験するために、ＧＦＰトランスジェニックマウス（一群当たり４匹）を、ＧＦＰ（ＳＬ−ｓｉＧＦＰ）に対するｓｈＲＮＡ発現プラスミドまたはｋ−ＲＡＳ（ＳＬ−ｓｉＲＡＳ）に対するｓｈＲＮＡ発現プラスミドを保持するＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）で処置した。１０８ｃ．ｆ．ｕを週３回で２週間、強制経口投与により投与した。次いで、結腸組織を蛍光顕微鏡法（データ不掲載）で概観し、特異的抗体（Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｏｌｏｒｓ（登録商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧＦＰ発現に関して免疫組織化学染色した後、染色解析を行った。ＳＬ−ｓｉＧＦＰ処置動物において、ＳＬ−ｓｉＲＡＳ処置動物と比べて、全体的なＧＦＰ発現レベルの有意な減少およびＧＦＰ発現陰窩の数の有意な減少が見られ（３３．９％対５０％、ｐ＜０．０５）、この方法が結腸上皮内に治療用ＲＮＡｉを送達するのに有用であり得ることを示していた。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図４は、細菌介在ＲＮＡ干渉が胃腸管上皮における標的遺伝子発現を減少させることを示している。ＧＦＰ標的化発現プラスミドを保有するＳＬ７２０７（ＳＬ−ｓｉＧＦＰ、右下パネル）での処置後に、結腸組織は低レベルのＧＦＰ発現を示し、ＳＬ−ｓｉＲＡＳで処置した動物（左下パネル）と比べて、ＧＦＰに関して陽性染色された結腸陰窩は少なかった。スライドはＧＦＰ−特異的抗体で染色した。
実施例５：ＣＥＱ５０３細菌株の構築
ＣＥＱ５０３（ＣＥＱ２０１（ｐＮＪＳＺ）株）の誘導および記載
ＣＥＱ５０３は、弱毒化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＣＥＱ２０１）と特別に操作されたＴＲＩＰプラスミド（ｐＮＪＳＺ）との組合せからなる。プラスミドは、ｔｋＲＮＡｉを誘導するのに必要な能力（この場合：侵襲性、侵入小胞の回避、短鎖ヘアピンＲＮＡの発現）を付与する。ＣＥＱ５０３（ｐＮＪＳＺ）株の記載：
１．遺伝子型：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＥＱ２０１［ｇｌｎＶ４４（ＡＳ）、ＬＡＭ−、ｒｆｂＣ１、ｅｎｄＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、（ｒｋ −ｍｋ ＋）、ｃｒｅＣ５１０ΔｄａｐＡ、ΔｒｅｃＡ］
２．ＣＥＱ２０１の誘導
３．プラスミド：国際公開第２００８／１５６７０２号の図５に模式的に示されるｐＮＪＳＺは、本発明者らの細菌株（ＣＥＱ５０３）にカナマイシン耐性を付与する１０．４ｋｂプラスミドである。このプラスミドは、２つの遺伝子ｈｌｙおよびｉｎｖならびにＨ３ヘアピン配列：ｇｇａｔｃｃＡＧＧＡＧＴＡＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＴＴＴｇｔｃｇａｃ（配列番号：３８３）を含み、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限部位を含む。このプラスミドの存在を確認するために、ＰＣＲを行ってｄａｐＡの染色体欠失を確認し、ミニプレップおよび／またはＰＣＲを行ってプラスミド上のｉｎｖ、ｈｌｙおよび３４１−Ｈ３を確認した。
４．栄養要求量：Ａｌｔｈｅａ Ｍｅｄｉａ ＢｒｏｔｈまたはＬＢ，Ｍｉｌｌｅｒ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ｂｒｏｔｈ（Ａｍｒｅｓｃｏ；カタログ番号：Ｊ１０６−２ＫＧ）および５０μｇ／ｍｌのＤＬ−Δ；ε−ジアミノペミリン酸（Ｄｉａｍｉｎｏｐｅｍｉｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＡＰ）（ＳＩＧＭＡ；カタログ番号Ｄ１３７７−１０Ｇ）。
５．増殖条件：３７℃
実施例６：ＢＴＰ産生
ＴＲＩＰのような適当なプラスミドを含有するＢＴＰまたはミニ細胞がｔｋＲＮＡｉ送達のために設計されている。これらの細胞は哺乳動物細胞内への侵入を可能にするインベイシンまたはＯｐａを発現し、リステリオリシンがミニ細胞の分解／溶解に続いて食胞を溶解させる。さらに、ミニ細胞を製造する方法が開発されており、この方法では、ミニ細胞の精製を助けるために無傷細胞を殺すための自殺構築物を用いる。このような自殺プラスミドは文献に記載されている（Ｋｌｏｏｓら，（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，７３５２−６１；ＪａｉｎおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ，（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８，９８６−９８９）。簡潔には、穿孔およびリゾチームをコードするラムダＳおよびＲ遺伝子を細菌染色体上の誘導性プロモーターの制御下に置く。誘導の際に、それらは無傷細胞を溶解するが、ミニ細胞は染色体を欠くため溶解しない。多くの異なるタイプのレギュレーター、例えばｌａｃＩ、ａｒａＣ、ラムダｃＩ８５７およびｒｈａＳ−ｒｈａＲなどを誘導性自殺遺伝子構築物の開発に使用することができる。同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）自己溶菌遺伝子および抗菌低小分子ペプチドを含めた数多くの異なるタイプの自殺遺伝子を同様のスキームに使用することができる。線維化を誘導する処置または突然変異により精製が増進される（例えば、ＷａｒｄおよびＬｕｔｋｅｎｈａｕｓ，（１９８５）Ｃｅｌｌ ４２，９４１−９４９；ＢｉおよびＬｕｔｋｅｎｈａｕｓ，１９９２を参照されたい）。最初の精製は、無傷細胞を分離して上清中にミニ細胞を残す低速遠心分離を含む。この後に、密度勾配精製またはろ過を行うことができる（例えば、Ｓｈｕｌｌら，（１９７１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０６，６２６−６３３）。
ＢＴＰおよび細菌を含有する混合物からＢＴＰを得るために、抗菌性タンパク質、バクテリオファージ溶菌酵素または自己溶菌酵素をコードする遺伝子を非限定的に含めた自殺遺伝子としても知られる任意の細胞死誘発遺伝子を、この方法に使用することができる。自殺遺伝子は、細胞溶解を非限定的に含めた機序により、あるいは染色体ＤＮＡのような細胞成分または線維成分の破壊、分解または毒害により、生存細菌を殺すことができる。任意の誘導性プロモーターをこのシステムと共に使用し得る。本発明の一実施形態では、自殺遺伝子が染色体内に組み込まれるが、ＢＴＰまたはミニ細胞は、染色体ＤＮＡを保有しないためこれらの遺伝子を組み込まないことから、自殺遺伝子の存在は無傷細菌細胞内に限定される。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図６に示されるように、自殺遺伝子の誘導は無傷細菌細胞を溶解する。ラムダＳおよびＲ遺伝子（自殺遺伝子）はＰｌａｃＵＶ５（誘導性プロモーター）の制御下に置かれている。リーキーな定常活性は、ＰｇａｐＡ（強力なプロモーター）上のｌａｃＩｑ遺伝子によりコードされる「スーパーリプレッサー」により抑制されている。このカセットはｍｉｎＣＤ遺伝子座に置かれている。
実施例７：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）癌遺伝子のｓｉＲＮＡ阻害
細胞培養：Ｈｅｌａ細胞を、抗生物質：１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を添加した、１０％ＦＢＳを含む最小必須培地（ＭＥＭ，ＡＴＣＣＮｏ．３０−２００３）中で培養した。
細菌培養：プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。細菌を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ Ｂｒｏｔｈ中３７℃で増殖させた。細菌細胞密度（ＣＦＵ／ｍＬ）をＯＤ６００測定を用いて計算した。細胞感染では、一晩培養物を新たな培地内に接種し、６００ｎｍにおける吸光度［ＯＤ６００］が０．６に達するまで２〜３時間さらに増殖させた。
侵襲試験：細菌侵襲では、Ｈｅｌａ細胞を６ウェルディッシュ内で２００，０００細胞／ウェルで播き、２ｍＬの完全増殖培地中で一晩インキュベートさせた。細菌細胞を、アンピシリンを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ中で、６００ｎｍにおける吸光度［ＯＤ６００］０．６の中間対数期まで増殖させ、次いで、４℃で１０分間、３，４００ｒｐｍで遠心分離した。細菌ペレットを、血清または抗生物質を含まないＭＥＭ中に再懸濁し、細菌を１：１０００、１：５００、１：２５０、１：１２５または１：６２．５のＭＯＩで細胞に添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で２時間、Ｈｅｌａ細胞を侵襲させた。細胞を１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１ｍＬ当たり、１００ＩＵのペニシリンおよび１００μｇのストレプトマイシン）を含有するＭＥＭで４回洗浄した。細胞を新たな完全培地中で、５％ＣＯ２中、３７℃でさらに４８時間インキュベートし、次いで、オンカラムＤＮアーゼ消化を用いたＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙシステムにより、またはＴＲＩＺＯＬ抽出法により全ＲＮＡを単離した。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション：トランスフェクション１日前に、細胞がトランスフェクション時に３０〜５０％コンフルエントになるように、細胞を抗生物質を含まない完全増殖培地中に播いた。２０μＭのストックから様々な濃度のｓｉＲＮＡを１７５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。４ｍＬのオリゴフェクタミンを別に１５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に混合した。穏やかに混合し、室温で５〜１０分間インキュベートした。希釈ｓｉＲＮＡを希釈オリゴフェクタミンと混合し、室温で１５〜２０分間インキュベートした。複合体が形成される間に、細胞から増殖培地を除去し、細胞を含む各ウェルに、血清を含まない培地８００μＬを添加した。細胞に２００μＬのｓｉＲＮＡ／オリゴフェクタミン複合体を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を除去せずに、通常の３倍の濃度の血清を含有する増殖培地を１ｍＬ添加した。４８時間で遺伝子サイレンシングを試験した。
ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７転写産物検出のために、以下のプライマーおよびプローブセットを用いて、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）をＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った：
順方向プライマー：５’−ＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡ−３’（１４８〜１６８）（配列番号：３８４）
逆方向プライマー：５’−ＴＧＴＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡ−３’（４３９〜４６３）（配列番号：３８５）
プローブ：５’−ＴＴＧＧＡＡＣＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＧＣ−３’（２１９〜２３３および４１６〜４２５）（配列番号：３８６）。
プローブの５’末端をレポーター蛍光色素であるＦＡＭで標識し、３’末端を蛍光色素クエンチャーであるＴＡＭＲＡで標識した。ＧＡＰＤＨを用いて標準化のためのヒトＧＡＰＤＨ転写産物を検出した。
ＨＰＶｓｈＲＮＡ配列：
Ｈ１（有効な配列）
５’−ｇｇＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＴＴｇＴＣｇＡＣ（配列番号：３８７）
５’−ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号：３８８）
Ｈ２（無効な配列）
５’−ｇｇＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴｇＴＣｇＡＣ（配列番号：３８９）
５’−ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号：３９０）
ウエスタンブロット：Ｈｅｌａ細胞を１×Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号９８０３）を用いて溶解した。電気泳動では、２×ローディング緩衝液中の総タンパク質５０μｇを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各ウェルに負荷した。転写後、ブロットをブロッキングし、２時間で一次抗体でプローブした後、ＨＲＰ結合二次抗体でインキュベートし、ＥＣＬにより検出した。一次抗体は、ＨＰＶ１８Ｅ７抗体を１／２５０希釈で使用した以外は、すべて１／１０００希釈で使用した。
抗ヒトｐＲｂ抗体：ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カタログ番号５５４１３６），Ｓｅｃ Ａｂ：ＨＲＰ−抗マウス
ＨＰＶ１８Ｅ７：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号ｓｃ−１５９０），Ｓｅｃ Ａｂ：ロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ カタログ番号ｓｃ２０２０
ｐ５３：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号ｓｃ−１２６），Ｓｅｃ Ａｂ：ＨＲＰ−抗マウス
ｐ２１：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号ｓｃ−３９７），Ｓｅｃ Ａｂ：ＨＲＰ−抗ウサギ
ｃ−Ｍｙｃ：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号９４０２），Ｓｅｃ Ａｂ：ＨＲＰ−抗ウサギ
コロニー形成試験：Ｈｅｌａ細胞を２時間の細菌侵襲後に回収した。対照処置またはＨＰＶｓｈＲＮＡ処置細胞中の細胞を完全ＭＥＭで３回、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞をトリプシン処理し、カウントした。各処置からの５００個の細胞を、完全増殖培地２ｍＬを含む６ウェルプレートの単一ウェルに添加した。細胞を１０日間増殖させた後、コロニーをギムザ（ＧＥＩＭＳＡ）染色で固定した。
ＭＴＴ試験：Ｈｅｌａ細胞を２時間の細菌侵襲後に回収した。対照処置またはＨＰＶｓｈＲＮＡ処置細胞中の細胞を完全ＭＥＭで３回、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞をトリプシン処理し、カウントした。各処置からの５０００個の細胞を、９６ウェルプレートの単一ウェルの完全増殖培地１００μＬ中に３つ組みで添加した。細胞を３７℃で４８〜７２時間インキュベートした後、１０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬＭＴＴを各ウェルに添加した。プレートをさらに３７℃で３時間インキュベートし、ウェルから培地を吸引除去し、インキュベーション後、１００μＬのＭＴＴ可溶化溶液［酸性イソプロポナール（ｉｓｏｐｒｏｐｏｎａｌ）中１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．１Ｎ ＨＣｌ）］を各ウェルに添加して反応を停止させた。プレートリーダー上で５７０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
この実施例では、ＨＰＶ１８Ｅ６およびＥ７癌遺伝子に対する短鎖ヘアピンＲＮＡの抑制効果を調べた。ヒト子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）を、短鎖ヘアピンＲＮＡを産生する細菌株に感染させて短鎖ヘアピンＲＮＡを送達した。ｓｈＲＮＡ発現カセットは、ループ配列（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）が後に続く標的配列の１９ヌクレオチド（ｎｔ）およびその１９ｎｔに対する逆相補配列を含んでいた（配列番号：３９１）。１９ｎｔに関して、ｓｉＲＮＡ送達および遺伝子サイレンシング効率の測定のために、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３，１０２３−１０３２で公開されている２つのｓｈＲＮＡ配列を用い、６ウェルフォーマットのオリゴフェクタミン試薬を使用した。簡潔には、Ｈｅｌａ細胞を無抗生物質培地で、約４０％コンフルエンスの細胞密度で播いた。翌日、ｓｉＲＮＡを５０、１００、２００ｎＭの様々な濃度で６ウェルプレートに添加した。対照ｓｉＲＮＡを１００ｎＭの単一濃度で添加した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図７に示されるように、オリゴフェクタミントランスフェクション法の結果、Ｈｅｌａ細胞におけるＥ６ｍＲＮＡが対照ｓｉＲＮＡに対して減少した。ｓｉＲＮＡ（Ｈ１）は、約４０％までのＥ６ｍＲＮＡの減少を示した。ノックダウン応答は用量依存的ではなかった。
次に、ｓｉＲＮＡ（Ｈ１）のヘアピンをＴＲＩＰベクター内にクローニングした。遺伝子サイレンシングが生物界間（ｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ）システムにより達成され得るか否かを判定するために、ヒト子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）中のｓｈＲＮＡを侵襲試験で試験した。簡潔には、Ｈｅｌａ細胞を、２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播き、一晩増殖させ、翌日、ヘアピンＲＮＡを産生するように操作された細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と共に異なるＭＯＩで２時間インキュベートした。１０％ＦＢＳおよびＰｅｎ Ｓｔｒｅｐを含有する培養液で細菌を４回洗い流し、哺乳動物細胞を完全倍地中、追加で４８時間さらにインキュベートした。ＲＮＡまたはタンパク質を細菌から単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図８および９は、ｓｉＲＮＡがＨｅｌａ細胞におけるＨＰＶＥ６発現を下方制御することを示している。細胞を６ウェルプレートに播き、４０％のコンフルエンス（約４０，０００個の細胞）まで増殖させた。オリゴフェクタミン４μＬとｓｉＲＮＡを混合することにより、オリゴフェクタミン／ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地中に調製した（培地１８５μＬ中の最終濃度は５０、１００、２００ｎＭ）。トランスフェクション後４８時間の細胞を回収し、標的およびＧＡＰＤＨ両方のｍＲＮＡレベルに関してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。データをＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。２つの異なる陰性対照ｓｉＲＮＡを２００ｎＭの単一濃度で使用した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１０、パネルＡ〜Ｃは、Ｈｅｌａ細胞の侵襲試験後のリアルタイムＰＣＲの結果を示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間で細胞を回収し、標的およびＧＡＰＤＨ両方のｍＲＮＡレベルに関してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。データをＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。次いで、これらのデータを未処置対照細胞に対してさらに標準化した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１１は、腫瘍サプレッサー経路およびその他の下流標的に対するＨＰＶＥ６およびＥ７遺伝子の下方制御の影響を示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間の細胞を回収し、ウエスタンブロット法により解析した。各レーンに５０μｇのタンパク質を負荷して、ゲル電気泳動により分離し、膜に転移して、図に示されるＨＰＶ１８Ｅ７、ｐ５３、アクチン、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ２１およびｃ−ｍｙｃに対して特異的な抗体でプローブした。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１２および１３は、それぞれコロニー形成およびＭＴＴ試験を示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後２時間の細胞を洗浄してトリプシン処理し、カウントし、各ＭＯＩに対して同数の細胞を６ウェルプレートの１ウェルに添加した（ＣＦＡでは６ウェルプレートの各ウェルに５００個の細胞を添加し、ＭＴＴでは９６ウェルプレートの各ウェルに５０００個の細胞を添加した）。コロニー形成では、細胞を１０日間増殖させてギムザ（Ｇｅｉｍｓａ）で染色し、播種後７２時間でＭＴＴ試験を解析した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１４および１５は、Ｈｅｌａ細胞の侵襲試験後のリアルタイムＰＣＲの結果を示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間の細胞を回収し、標的およびＧＡＰＤＨ両方のｍＲＮＡレベルに関してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。データをＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。次いで、これらのデータを未処置対照細胞に対してさらに標準化した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１６は、腫瘍サプレッサー経路およびその他の下流標的に対するＨＰＶＥ６およびＥ７遺伝子の下方制御の影響を示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間の細胞を回収し、ウエスタンブロット法により解析した。各レーンに５０μｇのタンパク質を負荷して、ゲル電気泳動により分離し、膜に転移して、図に示されるＨＰＶ１８Ｅ７、ｐ５３、アクチン、ｐ１１０Ｒｂに対して特異的な抗体でプローブした。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１７は、ＢＬ２１（ＤＥ３）中の陰性ｓＨＲＮＡ対照およびＨＰＶｓＨＲＮＡの凍結アリコートによるＨｅｌａ細胞侵襲試験後のリアルタイムＰＣＲの結果を示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間の細胞を回収し、標的およびＧＡＰＤＨ両方のｍＲＮＡレベルに関してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。データをＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。次いで、これらのデータを未処置対照細胞に対してさらに標準化した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１８は、ＢＬ２１（ＤＥ３）中の陰性ｓＨＲＮＡ対照およびＨＰＶｓＨＲＮＡの凍結アリコートの平板効率を示している。凍結細菌を解凍し、３．３８×１０８細胞／ｍＬの最終濃度まで再懸濁した。２ｍＬの３．３８×１０８細胞／ｍＬを１０００のＭＯＩとするこの濃度で侵襲試験を行った。対照細菌またはＨＰＶ細菌の一部ストックを連続的に希釈し（１：１００）てＬＢプレート上に播き、４８時間での細菌処置細胞の数および生存率を評価した。遺伝子サイレンシングを、ΔΔＣｔ相対定量法を用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより、またはウエスタンブロット解析により解析した。ＨＰＶＥ６のｍＲＮＡレベルを内在性対照であるＧＡＰＤＨに対して標準化した。最終データを未処置細胞からのＲＮＡに対してさらに標準化した。タンパク質解析では、細胞溶解物をＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に調製し、ＢｉｏＲａｄのＢＣＡキットを用いてタンパク質濃度を測定した。電気泳動では、タンパク質発現をアクチン負荷対照に対して標準化した。
実施例８：ＨＰＶ１８Ｅ７抗体でのウエスタンブロット法により評価したＨＰＶＥ６遺伝子ノックダウン
Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）（以下、ＨＰＶＨ１構築物）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間の細胞を回収し、ウエスタンブロット法により解析した。ＨＰＶＥ６特異的ノックダウンを陰性ｓｈＲＮＡ対照と比較した。簡潔には、各レーンに５０μｇのタンパク質を負荷して、ゲル電気泳動により分離し、膜に転移して、図に示されるＨＰＶ１８Ｅ７およびアクチンに対して特異的な抗体でプローブした。
ＨＰＶＨ１
５’−ＧＡＴＣＣ ＴＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴ ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ ＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＴＴ Ｇ−３’（配列番号：３９２）
３’−Ｇ ＡＴＣＣＡＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＣＧＴＡ ＡＡＧＴＴＣＴＣＴ ＴＡＣＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡ ＣＡＧＣＴ−５’（配列番号：３９３）
国際公開第２００８／１５６７０２号の図１９は、ＨＰＶ１８Ｅ７抗体でのウエスタンブロット法により評価したＨＰＶＥ６遺伝子ノックダウンを示している。Ｈｅｌａ細胞をｓｈＲＮＡ発現ＢＬ２１（ＤＥ３）と共に様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間インキュベートした。感染後４８時間の細胞を回収し、ウエスタンブロット法により解析した。ＨＰＶＥ６特異的ノックダウンを陰性ｓＨＲＮＡ対照と比較した。簡潔には、各レーンに５０μｇのタンパク質を負荷して、ゲル電気泳動により分離し、膜に転移して、図に示されるＨＰＶ１８Ｅ７およびアクチンに対して特異的な抗体でプローブした。
実施例９：ＣＭＴ９３細胞におけるＣＣＬ２０発現の阻害
１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から８ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、３２ｍＬの１０％ＤＭＥＭを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、２５０μＬを４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、約７０％コンフルエントの付着細胞を得た。翌日、ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を以下の方法により作成した。
プレアニールされたｓｉＲＮＡ二本鎖として配列をＱｉａｇｅｎに発注した。各ウェルを２５０ｕｌのｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎより）中に再懸濁して２０ｕＭのストック濃度を得た。次いで、プレートを９５℃で５分間水浴中に置き、次いで、徐冷して二本鎖を再懸濁し、凝集物を分離した。次いで、懸濁された二本鎖を、標準的なプロトコールに記載されているトランスフェクション実験に使用した。定式化は、２５０ｕＬの培地を含む、４８ウェルプレートの１ウェル当たりとし；各スクリーニングを生物学的三重反復で行ったため、溶液を４ウェル分；トランスフェクション用に３ウェルおよび追加で１ウェル作成した。
０．３ｕＬの適当なｓｉＲＮＡ（２０ｕＭストック溶液から）を無血清／抗生物質培地で４７ｕＬまで希釈し、混合した。この溶液に３ｕＬのＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した後、短時間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。混合物を含有する複合体５０ｕＬを、ＣＭＴ９３細胞を含む４８ウェルプレートの３つのウェルそれぞれに添加した。３７℃で２４時間トランスフェクションを行った時点で、培地を除去して、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬ含有する４００ｕＬのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに入れ替えた。刺激後、細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ法（製造者プロトコールを参照）による５０サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２０は、ＣＭＴ９３細胞における様々なｓｉＲＮＡ配列によるＣＣＬ２０発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３３に挙げる。
実施例１０：ＣＭＴ９３細胞におけるクローディン−２発現の阻害
１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から８ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、３２ｍＬの１０％ＤＭＥＭを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、２５０μＬを４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、約７０％コンフルエントの付着細胞を得た。翌日、ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を以下の方法により作成した。
プレアニールされたｓｉＲＮＡ二本鎖として配列をＱｉａｇｅｎに発注した。各ウェルを２５０ｕｌのｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎより）中に再懸濁して２０ｕＭのストック濃度を得た。次いで、プレートを９５℃で５分間水浴中に置き、次いで、徐冷して二本鎖を再懸濁し、凝集物を分離した。次いで、懸濁された二本鎖を、標準的なプロトコールに記載されているトランスフェクション実験に使用した。定式化は、２５０ｕＬの培地を含む、４８ウェルプレートの１ウェル当たりとし；各スクリーニングを生物学的三重反復で行ったため、溶液を４ウェル分；トランスフェクション用に３ウェルおよび追加で１ウェル作成した。
０．３ｕＬの適当なｓｉＲＮＡ（２０ｕＭストック溶液から）を無血清／抗生物質培地で４７ｕＬまで希釈し、混合した。この溶液に３ｕＬのＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した後、短時間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。混合物を含有する複合体５０ｕＬを、ＣＭＴ９３細胞を含む４８ウェルプレートの３つのウェルそれぞれに添加した。３７℃で２４または４８時間トランスフェクションを行った時点で、細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ法（製造者プロトコールを参照）による５０サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２１は、トランスフェクション２４時間後のＣＭＴ９３細胞における、様々なｓｉＲＮＡ配列によるクローディン−２発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３４に挙げる。
実施例１１：ＣＭＴ９３細胞におけるＩＬ６−Ｒａ発現の阻害
１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から８ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、３２ｍＬの１０％ＤＭＥＭを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、２５０μＬを４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、約７０％コンフルエントの付着細胞を得た。翌日、ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を以下の方法により作成した。
プレアニールされたｓｉＲＮＡ二本鎖として配列をＱｉａｇｅｎに発注した。各ウェルを２５０ｕｌのｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎより）中に再懸濁して２０ｕＭのストック濃度を得た。次いで、プレートを９５℃で５分間水浴中に置き、次いで、徐冷して二本鎖を再懸濁し、凝集物を分離した。次いで、懸濁された二本鎖を、標準的なプロトコールに記載されているトランスフェクション実験に使用した。定式化は、２５０ｕＬの培地を含む、４８ウェルプレートの１ウェル当たりとし；各スクリーニングを生物学的三重反復で行ったため、溶液を４ウェル分；トランスフェクション用に３ウェルおよび追加で１ウェル作成した。
０．３ｕＬの適当なｓｉＲＮＡ（２０ｕＭストック溶液から）を無血清／抗生物質培地で４７ｕＬまで希釈し、混合した。この溶液に３ｕＬのＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した後、短時間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。混合物を含有する複合体５０ｕＬを、ＣＭＴ９３細胞を含む４８ウェルプレートの３つのウェルそれぞれに添加した。３７℃で２４、４８または７２時間トランスフェクションを行った時点で、細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ法（製造者プロトコールを参照）による４０サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２２は、トランスフェクション２４時間後のＣＭＴ９３細胞における、様々なｓｉＲＮＡ配列によるＩＬ６−ＲＡ発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３５に挙げる。
実施例１２：ＣＭＴ９３細胞におけるＩＬ１３−Ｒａ１発現の阻害
１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から８ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、３２ｍＬの１０％ＤＭＥＭを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、２５０μＬを４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、約７０％コンフルエントの付着細胞を得た。翌日、ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を以下の方法により作成した。
プレアニールされたｓｉＲＮＡ二本鎖として配列をＱｉａｇｅｎに発注した。各ウェルを２５０ｕｌのｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎより）中に再懸濁して２０ｕＭのストック濃度を得た。次いで、プレートを９５℃で５分間水浴中に置き、次いで、徐冷して二本鎖を再懸濁し、凝集物を分離した。次いで、懸濁された二本鎖を、標準的なプロトコールに記載されているトランスフェクション実験に使用した。定式化は、２５０ｕＬの培地を含む、４８ウェルプレートの１ウェル当たりとし；各スクリーニングを生物学的三重反復で行ったため、溶液を４ウェル分；トランスフェクション用に３ウェルおよび追加で１ウェル作成した。
０．３ｕＬの適当なｓｉＲＮＡ（２０ｕＭストック溶液から）を無血清／抗生物質培地で４７ｕＬまで希釈し、混合した。この溶液に３ｕＬのＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した後、短時間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。混合物を含有する複合体５０ｕＬを、ＣＭＴ９３細胞を含む４８ウェルプレートの３つのウェルそれぞれに添加した。３７℃で２４または７２時間トランスフェクションを行った時点で、細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ法（製造者プロトコールを参照）による４０サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２３は、トランスフェクション２４時間後のＣＭＴ９３細胞における、様々なｓｉＲＮＡ配列によるＩＬ１３−ＲＡ１発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３６に挙げる。
実施例１３：ＣＭＴ９３細胞におけるＩＬ−１８発現の阻害
１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から８ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、３２ｍＬの１０％ＤＭＥＭを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、２５０μＬを４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、約７０％コンフルエントの付着細胞を得た。翌日、ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を以下の方法により作成した。
プレアニールされたｓｉＲＮＡ二本鎖として配列をＱｉａｇｅｎに発注した。各ウェルを２５０ｕｌのｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎより）中に再懸濁して２０ｕＭのストック濃度を得た。次いで、プレートを９５℃で５分間水浴中に置き、次いで、徐冷して二本鎖を再懸濁し、凝集物を分離した。次いで、懸濁された二本鎖を、標準的なプロトコールに記載されているトランスフェクション実験に使用した。定式化は、２５０ｕＬの培地を含む、４８ウェルプレートの１ウェル当たりとし；各スクリーニングを生物学的三重反復で行ったため、溶液を４ウェル分；トランスフェクション用に３ウェルおよび追加で１ウェル作成した。
０．３ｕＬの適当なｓｉＲＮＡ（２０ｕＭストック溶液から）を無血清／抗生物質培地で４７ｕＬまで希釈し、混合した。この溶液に３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、短時間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。混合物を含有する複合体５０ｕＬを、ＣＭＴ９３細胞を含む４８ウェルプレートの３つのウェルそれぞれに添加した。３７℃で２４時間トランスフェクションを行った時点で、細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ法（製造者プロトコールを参照）による４０サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２４は、トランスフェクション２４時間後のＣＭＴ９３細胞における、様々なｓｉＲＮＡ配列によるＩＬ１８発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３７に挙げる。
実施例１４：ＣＭＴ９３細胞におけるＩＬ−７発現の阻害
１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から８ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、３２ｍＬの１０％ＤＭＥＭを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、２５０μＬを４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、約７０％コンフルエントの付着細胞を得た。翌日、ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を以下の方法により作成した。
プレアニールされたｓｉＲＮＡ二本鎖として配列をＱｉａｇｅｎに発注した。各ウェルを２５０ｕｌのｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎより）中に再懸濁して２０ｕＭのストック濃度を得た。次いで、プレートを９５℃で５分間水浴中に置き、次いで、徐冷して二本鎖を再懸濁し、凝集物を分離した。次いで、懸濁された二本鎖を、標準的なプロトコールに記載されているトランスフェクション実験に使用した。定式化は、２５０ｕＬの培地を含む、４８ウェルプレートの１ウェル当たりとし；各スクリーニングを生物学的三重反復で行ったため、溶液を４ウェル分；トランスフェクション用に３ウェルおよび追加で１ウェル作成した。
０．３ｕＬの適当なｓｉＲＮＡ（２０ｕＭストック溶液から）を無血清／抗生物質培地で４７ｕＬまで希釈し、混合した。この溶液に３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、短時間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。混合物を含有する複合体５０ｕＬを、ＣＭＴ９３細胞を含む４８ウェルプレートの３つのウェルそれぞれに添加した。３７℃で２４時間トランスフェクションを行った時点で、細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ法（製造者プロトコールを参照）による４０サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを単離した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２５は、トランスフェクション２４時間後のＣＭＴ９３細胞における、様々なｓｉＲＮＡ配列によるＩＬ−７発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３８に挙げる。
実施例１５：ＣＭＴ９３細胞におけるキチナーゼ３様−１（ＣＨ１３Ｌ１）発現の阻害
１．７ｍＬ微小遠心管中に、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ溶液（Ｑｉａｇｅｎより）２．４μＬを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３９４μＬ中に希釈して、掻き混ぜ、室温で１０分間インキュベートしてトランスフェクション複合体の形成を可能にした。この混合物１００μＬを２４ウェル組織培養皿の３つのウェルそれぞれに添加し、その上にＣＭＴ−９３細胞を５００μＬ体積で播き、１ウェル当たりの最終体積６００μＬおよび最終ＲＮＡ濃度２０ｎＭを得た。２４時間のトランスフェクション後、リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ）０．１μｇ／ｍＬを各ウェルに添加し、細胞を２４時間インキュベートしてＣＨＩ３Ｌ１産生を刺激した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡ抽出用に回収した。ＣＭＴ−９３細胞をトランスフェクション用に以下のように調製した。１つのコンフルエントなＴ−１７５フラスコのＣＭＴ９３細胞を、細胞が剥離するまで１０ｍＬでトリプシン処理した。３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）添加によりトリプシンを不活性化し、細胞をピペッティングにより十分に混合した。この溶液から１０ｍＬを滅菌５０ｍＬチューブ内に移し、４０ｍＬのＤＭＥＭ１０％ＦＢＳを添加した。細胞をよく掻き混ぜて、５００μＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。この細胞濃度は、２４時間の増殖後に約７０％の集密度になった。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２６は、トランスフェクション２４時間後のＣＭＴ９３細胞における、様々なｓｉＲＮＡ配列によるＣＨ１３Ｌ１発現のノックダウンを示している。試験したｓｉＲＮＡ配列を表３９に挙げる。
実施例１６：ＣＥＱ２００の構築
ＣＥＱ２００は以下の遺伝子型を有する：ｇｌｎＶ４４（ＡＳ）、ＬＡＭ−、ｒｆｂＣ１、ｅｎｄＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、（ｒｋ −ｍｋ ＋）、ｃｒｅＣ５１０ΔｄａｐＡ。ＭＭ２９４は以下の遺伝子型を有する：ｇｌｎＶ４４（ＡＳ）、ＬＡＭ−、ｒｆｂＣ１、ｅｎｄＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、（ｒｋ −ｍｋ ＋）、ｃｒｅＣ５１０。本発明者らは、ＣＧＳＣからプラスミドを購入した（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，６６４０−６６４５を参照されたい）。
ＣＥＱ２００の誘導
実施例１７：ＣＥＱ２０１の構築
ＣＥＱ２０１は以下の遺伝子型を有する：ＣＥＱ２００［ｇｌｎＶ４４（ＡＳ）、ＬＡＭ−、ｒｆｂＣ１、ｅｎｄＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、（ｒｋ −ｍｋ ＋）、ｃｒｅＣ５１０ΔｄａｐＡΔｒｅｃＡ。ＭＭ２９４は以下の遺伝子型を有する：ｇｌｎＶ４４（ＡＳ）、ＬＡＭ−、ｒｆｂＣ１、ｅｎｄＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、（ｒｋ −ｍｋ ＋）、ｃｒｅＣ５１０。本発明者らは、ＣＧＳＣからプラスミドを購入した（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，６６４０−６６４５を参照されたい）。
ＣＥＱ２００の誘導
実施例１８：ＭＭ２９４からのｍｉｎＣおよび／またはｍｉｎＤ遺伝子欠失によるＢＴＰ（ＣＥＱ２１０）の構築
実施例１９：ｐＭＢＶ４０、ｐＭＢＶ４３およびｐＭＢＶ４４プラスミドの記載
予測されるｐＫＳII−ｉｎｖ−ｈｌｙの配列を表４０に示す。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２７に示されるｐＭＢＶ４０（ａｍｐ選択、Ｈ３ヘアピンを有する）あるいはｐＭＢＶ４３およびｐＭＢＶ４４（ｋａｎ選択、Ｈ３ヘアピンを有する）プラスミドは、以下のそれぞれの配列である。
表４２は、予測されたｐＭＢＶ４３プラスミドの８４２７塩基対配列を含む。配列は以下の領域を含む：ｈｌｙ ｏｒｆ（６８２〜２２７１ｂｐ）；ｉｎｖ ｏｒｆ（２９９４〜５９５４ｂｐ）（６２１２〜６２８２ｂｐ）（６４８３〜６５３４ｂｐ）；ｓｈＲＮＡプロモーター（６３０３〜６３６１ｂｐ）；センス鎖（６３６２〜６３８３ｂｐ）；ループ（６３８４〜６３９０ｂｐ）；アンチセンス鎖（６３９１〜６４１２ｂｐ）；ターミネーターＩ（６４１３〜６４２２ｂｐ）；ターミネーターII（６４２３〜６４６０ｂｐ）；複製起点（６７２０〜７３０７ｂｐ）；およびｋａｎ ｏｒｆ（７４９８〜８２９２ｂｐ）。
表４３は、確認されたｐＭＢＶ４３プラスミドの８４４３塩基対配列を含む。配列は以下の領域を含む：ｈｌｙ ｏｒｆ（６８２〜２２７１ｂｐ）；ｉｎｖ ｏｒｆ（２９９２〜５９５２ｂｐ）；ｓｈＲＮＡプロモーター（６３１７〜６３７５ｂｐ）；センス鎖（６３７６〜６３９７ｂｐ）；ループ（６３９８〜６４０４ｂｐ）；アンチセンス鎖（６４０５〜６４２６ｂｐ）；ターミネーターＩ（６４２７〜６４３７ｂｐ）；ターミネーターII（６４３８〜６４７５ｂｐ）；複製起点（６７３５〜７３２２ｂｐ）；およびｋａｎ ｏｒｆ（７５１３〜８３０７ｂｐ）。
実施例２３：ｐＮＪＳＺｃプラスミドの構築
ｐＮＪＳＺは、ｔｋＲＮＡｉを誘導するために必要とされる能力を付与する１０．４ｋｂのプラスミドである。それには、細菌が哺乳動物細胞を侵襲し、侵入空胞を回避することを可能にする２つの遺伝子、ｉｎｖおよびｈｌｙが含まれている。元のＴｒｉｐプラスミドとｐＮＪＳＺとでは短鎖ヘアピンＲＮＡの発現が異なる。ｐＮＪＳＺでは、ｓｈＲＮＡの発現が恒常的細菌プロモーターの制御下にあるため持続的な発現が可能である。これは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するＩＴＰＧ誘導性プロモーターを有する元のＴｒｉｐプラスミドと異なる。さらに、ｐＮＪＳＺと元のＴｒｉｐプラスミドとでは、異なる抗生物質耐性遺伝子を含んでいる。ｐＮＪＳＺがカナマイシン耐性遺伝子を有するのに対し、元のＴｒｉｐプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。ｐＮＪＳＺｃは、その維持またはｔｋＲＮＡｉ誘導能に必要とされないｐＮＪＳＺの任意の領域を除去することによりｐＮＪＳＺから構築された。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２８に示される段階１：ｐＮＪＳＺをＳｐｅＩ（９７８４）およびＸｍａＩ（９７７２）の両方で消化することにより余分なＢａｍＨ１部位を除去し、これら２つの部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより埋め、次いで、プラスミドを自己連結させて、ｐＮＪＳＺΔＢａｍＨ１を作出した。
国際公開第２００８／１５６７０２号の図２９に示される段階２：ｐＮＪＳＺΔＢａｍＨ１をＢｇｌＩ（２０８）およびＰｍｅＩ（９８２）で消化することにより９７２における余分なＳａｌＩ部位およびｆ１複製起点の両方を除去し、これら２つの部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより埋め、プラスミドを自己連結させて、ｐＮＪＳＺｃを作出した。
ｐＮＪＳＺｃのＤＮＡ配列を表４５に示す。
実施例２４：ＣＥＱ２００（ＣＥＱ２２１Δｒｎｃ）におけるＲＮアーゼIIIをコードするｒｎｃの欠失
大部分の細菌は、ＲＮＡ分解酵素であるＲＮアーゼを多数含有し、これらがｓｉＲＮＡを分解し、ｔｋＲＮＡｉの活性低下を引き起こし得る。特定の細菌のＲＮアーゼがこのようなｓｉＲＮＡ分解を示すような場合、対象とするＲＮアーゼをコードする遺伝子（例えば、ＲＮアーゼIIIをコードするｒｎｃ遺伝子）の標的欠損を行い、ｔｋＲＮＡｉ細菌当たりのｓｉＲＮＡレベルを高めることで、より多くのｓｉＲＮＡが標的細胞に送達されるだけでなく、標的細胞内での対象遺伝子のより効率的な遺伝子サイレンシングが生じる。
Δｒｎｃの構築
１ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，６６４０−６６４５より。これらのプラスミドはＣＧＳＣから購入した。
示されたゲル解析により、ＣＥＱ２２１の構築およびΔｒｎｃ遺伝子型の検証が確認された。ゲル解析により、Δｒｎｃ株におけるプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）２３ＳｒＲＮＡの発現および２３ＳｄｓＤＮＡのプロセシング不能が確認された。ｐＰＭ２を有するＣＥＱ２００およびＣＥＱ２２１由来の全細胞ＲＮＡを抽出し、１．５％アガロースゲル上で泳動させた。ｐＰＭ２から転写された２３ＳｒＲＮＡは、へリックス２５内に介在配列を有し、成熟の間にこれがＲＮアーゼIIIによりプロセシングされ、２３ＳｒＲＮＡ断片化：２３Ｓ’および２３Ｓ”を生じる。ＲＮアーゼIII欠損株ＣＥＱ２２１は、このようなへリックスをプロセシングすることができないため、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）２３ＳｒＲＮＡは無傷であると思われる。これは、Δｒｎｃ株ＣＥＱ２２１がＲＮアーゼIII活性を喪失したことの証拠である。
Δｒｎｃ株ＣＥＱ２２１は、ｓｈＲＮＡ産生の増加およびｓｈＲＮＡの標的細胞内へのより大量の送達増加を示した。同じプラスミドｐＮＪＳＺｃ−Ｈ３で形質転換した場合、Δｒｎｃ細菌（ＣＥＱ２２１）は、同じプラスミドで形質転換されたｗｔ−ｒｎｃ細菌（ＣＥＱ２００）に比べて、有意に多くのｓｈＲＮＡを含有する。Δｒｎｃ細菌は、インビトロ侵襲試験の実験において、より多量のｓｈＲＮＡを細胞内へ送達する。
ＣＥＱ２２１（Ｈ３−Δｒｎｃ）で処置した細胞は、同量のＣＥＱ２００（Ｈ３）で処置した細胞に比べて、より高レベルのｓｈＲＮＡを含有する。ＳＷ４８０細胞を、遺伝子標的（β−カテニンＨ３）に対するｔｋＲＮＡｉプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Δｒｎｃで、またはβ−カテニンに対する同じｔｋＲＮＡｉプラスミド（Ｈ３）を保有する野生型ｒｎｃ遺伝子を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で処置した。細胞を所定の時点で回収し、細胞抽出物を解析して、担体細菌により細胞内に堆積されたｓｈＲＮＡの量を測定した。Δｒｎｃ株（ＣＥＱ２２１−赤のカラム）は、その野生型ｒｎｃ対応物（青のカラム）に比べて、有意に多量のｓｈＲＮＡを標的細胞内に堆積することが可能であった。
図１は、遺伝子サイレンシングの効力（最大効果）および有効性（ＩＣ５０）の増大を示す。ＣＥＱ２２１（Δｒｎｃ）処置により、ＣＥＱ２００（ｗｔ−ｒｎｃ）処置に比べて有意に高いレベルの遺伝子抑制が達成される。図１に示されるように、Ｃｏｓ−７細胞を、プラスミドｐＮＪＳＺｃ−Ｈ３（または対照プラスミドｐＮＪＳＺｃ−ＨＰＶｂ）を保有する細菌で用量を増加させながら処置し、４８時間後に標的遺伝子β−カテニンの発現を解析した。β−カテニン遺伝子発現（ｍＲＮＡ）レベルを、同じ細菌用量で対照細菌（プラスミドｐＮＪＳＺｃ−ＨＰＶｂを含有し、ウイルスＨＰＶに対してｓｈＲＮＡを産生する）により処置した細胞と関連させて示す。結果は、β−カテニン遺伝子発現の用量依存的減少（「ノックダウン」）が見られることを示している。Δｒｎｃ株（ＣＥＱ２２１）の効力は、ｗｔ−ｒｎｃ株（ＣＥＱ２００）の効力よりも有意に高く、遺伝子サイレンシングの最大レベルは５７％に対して７６％であった。これらの結果は、ＣＥＱ２２１の有効性がＣＥＱ２００に比べて約１０倍高いことを示している：ＣＥＱ２００のＩＣ５０が１０７ｃｆｕ／ｍＬであるのに比べ、ＣＥＱ２２１のＩＣ５０は１０６ｃｆｕ／ｍＬである。
実施例２５：ｔｋＲＮＡで使用する機能性ｓｈＲＮＡの前駆体としてのＲＮアーゼIII基質の設計
上記実施例では、送達細菌内でのＲＮアーゼ活性を制限することが、ｓｈＲＮＡの望ましくないプロセシングおよび分解を防ぐのに有益であることが示された。別の実施形態では、効果的なＲＮＡ干渉に不可欠な改善された、より正確かつ効率的なＤｉｃｅｒプロセシングを可能とするヘアピンＲＮＡ分子を設計することが有益である。ＤｉｃｅｒはｄｓＲＮＡに対して特異的活性を有するＲＮアーゼ酵素であり、それによるＲＮアーゼIII切断産物は、５’リン酸および３’ヒドロキシル末端ならびに３’末端の２−ｎｔオーバーハンド（ｏｖｅｒｈａｎｄ）を含む。Ｄｉｃｅｒ産物は、個々の約２１ｎｔの大きさによりさらに特徴付けられる。したがって、この実施例では、細菌（ｔｋＲＮＡｉ）担体内のＲＮアーゼIIIによるプロセシングのための基質を供給して、宿主標的細胞内でのＤｉｃｅｒプロセシングのための基質をもたらす、ヘアピンＲＮＡ分子を提供する。
ＲＮアーゼIII酵素は３つのクラスに分けることができる。クラスI酵素は、細菌、バクテリオファージおよび真菌において見られ、単一のＲＮアーゼIIIドメインおよびｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含む。クラスIIおよびIII酵素はそれぞれ、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒを特徴とする。Ｄｉｃｅｒは最も複雑なＲＮアーゼIII酵素であり、通常、ＤＥｘＤ／Ｈボックスヘリカーゼドメイン、機能未知の小ドメイン（ＤＵＦ２８３）、ＰＡＺ（Ｐｉｗｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ Ｚｗｉｌｌｅ）ドメイン、２つのタンデムＲＮアーゼIIIドメイン（ＲＮアーゼIIIａおよびIIIｂ）ならびにｄｓＲＢＤを含む。下等な真核生物由来の一部のＤｉｃｅｒまたはＤｉｃｅｒ様タンパク質は、より単純なドメイン構造を有する；例えば、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）由来のＤｉｃｅｒタンパク質はＰＡＺおよび２つのＲＮアーゼIIIドメインのみを含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼIIIおよびヒトＤｉｃｅｒに関するこれまでの突然変異および酵素の研究により、ＲＮアーゼIII切断の「単一プロセシング中心モデル」が得られた。このモデルは、触媒二量体を形成する２つのＲＮアーゼIIIドメイン：クラスI酵素に対する分子間ホモ二量体ならびにＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａに対するＲＮアーゼIIIａドメインおよびIIIｂドメイン間の分子内偽二量体を軸とする。この二量体形成によりｄｓＲＮＡ切断のための単一のプロセシング中心が形成され、ＲＮアーゼIIIドメインがそれぞれｄｓＲＮＡの鎖を１本切断する。２つの切断部位間の距離が特徴的な２−ｎｔ３’突出形成を決定する。Ｄｉｃｅｒでは、末端結合ＰＡＺドメインとＲＮアーゼIIIドメインの間の距離が切断産物の長さを決定する（Ｄｕ，Ｌｅｅ，Ｔｊｈｅｎら，ＰＮＡＳ １０５（７）２００８）。
細菌は、ｄｓＲＮＡを切断するクラスIＲＮアーゼIII酵素を含有する。このクラスIＲＮアーゼIIIはｄｓＲＮＡが切断される場所を決定する特定のモチーフを認識するという証拠がある。この酵素は、２ｎｔ３’突出を残すように前記切断を行う（ＰｅｒｔｚｅｖおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．３４（１３）２００６を参照のこと、またＮｉｃｈｏｌｓｏｎによりＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３ １９９９で概説されている）。さらに、ＲＮアーゼIIIによる結合および切断を排除する配列；いわゆる抗決定因子が記載されている。
以下の実施例では、哺乳動物細胞質内への放出前に、ｔｋＲＮＡｉ細菌内のヘアピンＲＮＡの細菌クラスIＲＮアーゼIIIプロセシングを利用する。細菌ＲＮアーゼIIIに必要とされる明確な近位および遠位のボックス配列は、シュードテトラループ構造の「下位」に位置していたが、この設計のバリアントは、シュードテトラループの「上位」のループ、およびヘアピン配列を約２１ヌクレオチドだけ伸長するための「スペーサー」配列があってもなくても構築され得るため、この構造は任意である。近位／遠位ボックスモチーフは約１０ｎｔしか含まないため、サイレンシング配列に隣接する残りの１１ｎｔストレッチは、すべての抗決定因子塩基対から構成されなければならない。細菌ＲＮアーゼIIIは遠位および近位ボックス配列を認識し、近位ボックスの位置またはそれより２ｎｔ下位でｄｓＲＮＡを切断して（図２）、より長い（すなわち、より安定な）ヘアピン構造を残す。さらに、近位／遠位ボックスモチーフの「上位」に抗決定因子塩基対が存在することにより、さらなるプロセシング／分解からヘアピンが保護され、かつＤｉｃｅｒが標的細胞内でヘアピンをプロセシングする際に２１ｎｔサイレンシングｓｉＲＮＡが産生されるように、ヘアピンが適当な長さに維持される。
図２は、機能的アノテーションを有するＲＮアーゼIII基質ヘアピンＲＮＡ構造の模式図を示す。
図３は、細菌クラスIＲＮアーゼIIIのヘアピン前駆体切断作用の模式図を示す。切断は、理想的なＤｉｃｅｒ基質前駆体を生じるようにシュードテトラループの約１０ｎｔ遠位で起こるよう明確に方向付けられる。この段階は、標的細胞への送達前に細菌内で生じる。クラスIＲＮアーゼIIIによる切断で、３’末端に２−ヌクレオチド突出を含む約１００ヌクレオチドのヘアピンが生じ、これが次の酵素的プロセシング段階を方向付ける（図４を参照）。
図４は、成熟の第二段階（第一のＤｉｃｅｒ切断段階）の機能的アノテーションを示す。この段階は、標的細胞の細胞質内へのＲＮＡヘアピン分子の放出後に起こる。クラスIＲＮアーゼIIIプロセシングにより残されたヘアピンＲＮＡ構造の３’末端の２−ヌクレオチド突出は、２１ヌクレオチド上流でのＤｉｃｅｒによるＲＮＡ構造切断の方向付けおよび誘発を促進する（切断部位を「第一Ｄｉｃｅｒ切断部位」という矢印で示す）。
図５は、第二のＤｉｃｅｒ切断段階および活性ｓｉＲＮＡへの成熟を示す。この第二のＤｉｃｅｒ切断は、宿主細胞の細胞質内で起こり、ヘアピンループを除去して、ＲＩＳＣ複合体内に取り込まれる機能的ｓｉＲＮＡを残す。この場合も、ＲＮＡの３’末端での第一のＤｉｃｅｒ切断により残された２−ｎｔ突出が、Ｄｉｃｅｒの方向付けを促進する。
１５０ｎｔＲＮＡから１００ｎｔＲＮＡへの減少を生じる、経時的実験細菌クラスIＲＮアーゼIIIによるヘアピンＲＮＡの切断。ヘアピン配列を含む一本鎖ＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてプラスミド鋳型から合成した。次いで、ＲＮＡを、所定の時間の間、精製細菌ＲＮアーゼIIIに曝露し、１０％ＴＢＥ−尿素ゲル上を泳動させて、臭化エチジウム染色により可視化した。消化の４分後に約１００ｎｔのＲＮＡ種の出現が見られた。
実施例２６：ＣＥＱ５０５の構築
薬剤候補ＣＥＱ５０５は、ｄａｐＡ遺伝子およびｒｎｃ遺伝子欠失によりＭＭ２９４から誘導される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からなる。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の内部名は、プラスミドｐＮＪＳＺｃ−Ｈ３で形質転換されたＣＥＱ２２１であり、このプラスミドは、ｉｎｖ遺伝子によるインベイシン、ｈｌｙ遺伝子によるリステリオリシンＯ、およびヘアピン配列Ｈ３を含むｓｈＲＮＡ発現カセットによるβ−カテニンｍＲＮＡ標的化のための短鎖ヘアピンＲＮＡの発現をコードする、発現プラスミドである。
ＣＥＱ２００ΔｒｎｃｐＮＪＳＺｃＨ３は、哺乳動物細胞への侵入のためにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）インベイシンの表面発現を必要とすることが、ＦＡＣＳ解析により示された。エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびＣＥＱ２００ΔｒｎｃｐＮＪＳＺｃＨ３は共にインベイシンの表面発現を有する。
ｓｈＲＮＡが哺乳動物細胞エンドソームを回避するために、ＣＥＱ２００ΔｒｎｃｐＮＪＳＺｃＨ３はＬＬＯ活性を必要とする。溶血素試験によりＬＬＯ活性が検出され、このことは、ＣＥＱ５０５が溶血素活性有するのに対し、プラスミドを有さないＣＥＱ２２１は溶血素活性を有さないことを示していた。
哺乳動物細胞においてβ−カテニンをサイレンシングするためには、ｓｈＲＮＡＨ３が必要である。相対的Ｈ３ヘアピン発現がＰＫにより判定され、このことは、ＣＥＱ５０５がＨ３ｓｈＲＮＡを発現するのに対し、非形質転換株ＣＥＱ２２１は発現しないことを示していた。
図６は、ＣＥＱ５０５を用いた遺伝子のサイレンシングを示す。パネルＡは、ＣＥＱ５０５がＣｏｓ−７細胞において、哺乳動物β−カテニンを用量依存的に９０％までサイレンシング可能であったことを示している。パネルＢは、ＣＥＱ２２１ｐＮＪＳＺｃラミン（ラミン遺伝子を標的とする同等の株）がＳＷ４８０細胞において、哺乳動物ラミンを用量依存的に６５％までサイレンシング可能であったことを示している。
実施例２６：５’または３’テールのないヘアピンを産生するためのｐＭＢＶ４０、４３および４４の改変
元のＴＲＩＰプラスミドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、エンハンサーおよびターミネーターの制御下でｓｈＲＮＡを発現した。このフォーマットでは、転写がＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列内で開始される。その結果、Ｔ７エンハンサー、ＢａｍＨＩ部位、ＳａｌＩ部位および大部分のターミネーターが転写される。ｓｈＲＮＡヘアピンが長さ約５５ｎｔであるのに対し、得られる転写産物は長さ約１１５塩基であることが予測される。クローニングに使用されるエンハンサーおよび制限部位ＢａｍＨＩは５’テールを形成し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーターは３’テールを形成する。
したがって、５’または３’テールのないヘアピンの作成のために、ｐＭＢＶ４０、４３および４４（実施例１９を参照）で使用するための新たなプロモーター−ターミネーター構築物を設計した。ヘアピンのクローニングに使用するＢａｍＨＩ部位を、−１０コンセンサス配列の直後のプロモーターエレメント内に含めた（ＬｉｓｓｅｒおよびＭａｒｇａｌｉｔ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，１５０７−１５１６）。ＵＰエレメントを含めることにより、プロモーターをより強力にした（Ｅｓｔｒｅｍら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，９７６１−９７６６；Ｍｅｎｇら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９，４１６６−４１７８）。効率的な終止のために、ヘアピンのクローニングに使用するＳａｌＩ部位の前のヘアピン末端に、連続したＴを付加した（ターミネーターI）。Ｒｈｏ依存性ターミネーターは、Ａリッチ配列、その後に４〜１８ｂｐのステムループ、その後に連続したＴを含む（例えば、Ｌｅｓｎｉｋら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９，３５８３−３５９４）。Ａリッチ配列がないため、ｓｈＲＮＡステムループは１９〜２１ｂｐの長さであり、遺伝子は非常に小型であるため、このターミネーターの効率を予測することは困難であった。したがって、フラジェリン由来の別のｒｈｏ依存性ターミネーターも含めた（ターミネーターII）。２つのターミネーターがあるため、２つの転写産物が予測された。転写産物IおよびIIはそれぞれ、ターミネーターＩおよびターミネーターIIにより終止される。
実施例２７：ｔｋＲＮＡｉで使用するためのアラビノース誘導性インベイシン遺伝子のクローニング
ｔｋＲＮＡｉでは、宿主細胞表面受容体との相互作用により細菌が宿主標的細胞に侵入することを可能にする侵襲性タンパク質を担体細菌に備えることで、治療用ｓｈＲＮＡの細胞内送達が達成される。エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）のｉｎｖ遺伝子によりコードされるインベイシンタンパク質は、β−１−インテグリンと呼ばれる宿主細胞表面タンパク質との相互作用後の細菌の宿主細胞内への取り込みを誘発する侵襲性タンパク質の一例である。しかし、高レベルのインベイシンタンパク質発現は、細菌担体株にとって有害であり得る。したがって、ｔｋＲＮＡｉ介在遺伝子サイレンシングの有効性および効力を増加させる目的で、細菌増殖培地にアラビノースを添加することにより誘導性インベイシン発現が可能な細菌株を構築した。
アラビノースオペロンリプレッサー−アクチベーターである、ＡｒａＣタンパク質をコードするａｒａＣ遺伝子；カタボライトリプレッサータンパク質（ＣＲＰ）およびＡｒａＣタンパク質の制御下にあるアラビノースプロモーターであるＰａｒａＢＡＤ；ならびにＰａｒａＢＡＤプロモーター下でクローニングされるｉｎｖ遺伝子を含む、アラビノース誘導性インベイシンカセットを有するプラスミドを構築した。
インベイシン発現の異なる状態が存在する：（１）グルコースの存在およびアラビノースの不在下で、カタボライト抑制およびＡｒａＣ介在抑制の両方によりプロモーターが抑制される；（２）任意の糖の非存在下（無グルコースおよび無アラビノース）で、カタボライト抑制およびＡｒａＣ介在誘導がなく、非誘導状態が生じる；ならびに（３）グルコースの非存在かつアラビノースの存在下で、ＡｒａＣ介在誘導はあるがカタボライト抑制がなく、誘導状態が生じる。
以下のプロトコールにより、これらの状態をインベイシンに関して試験した。細胞をグルコース存在下で一晩増殖させ、次いで希釈し、グルコース存在下（抑制されている）または任意の糖の非存在下（２つの培養）で４時間増殖させた。アラビノース非存在下で増殖させた培地の１つをアラビノース（１０ｍＭ）で２時間誘導した。細胞を遠心分離により回収し、ＦＡＣＳによりインベイシン発現を測定した。任意のプラスミドを欠く大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を陰性対照として使用し、２６℃で増殖させたエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）を陽性対照として使用した。
アラビノース存在下では、ＦＡＣＳのよる測定で、陽性対照（エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ））で観察されたインベイシン発現レベルに匹敵する高レベルのインベイシン発現が見らた。アラビノースによる２時間のインベイシン誘導の間に、ＯＤによる測定では、細菌増殖が停止したようであった。また、本発明者らの初期の仮説と一致する、２時間以内での１００倍の生存率低下も見られた。次いで、本発明者らは、良好なインベイシン発現だけでなく、良好な生存率も得られるように試験条件を最適化した。本発明者らは、０．３〜１ｍＭのアラビノースにより、検出可能な生存率低下はなくなるが、増殖率の測定可能な減少が生じることを見出した。また、これらの条件では、ＦＡＣＳによる１０ｍＭアラビノースとの区別が不可能なインベイシン誘導が見られた。これらの結果は、細胞増殖（ＯＤによる測定）が侵襲のアラビノース誘導の作用であることを示している。
実施例２８：ｔｋＲＮＡｉのための別のｓｈＲＮＡ構造
生物界間（ｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ）ＲＮＡ干渉（ｔｋＲＮＡｉ）では、ベクター細菌を用いて、標的細胞の細胞質内に堆積される短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成し送達する。これを達成するために、細菌は、少なくとも３つの新たな特性である表面発現侵襲マーカー（例えば、ｉｎｖ遺伝子によりコードされるエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）インベイシンタンパク質）、エンドソーム放出機能（例えば、ｈｌｙ遺伝子によりコードされるリステリオリシンＯタンパク質、すなわちＬＬＯ）および治療ペイロード、すなわち宿主細胞細胞質内に送達されるとＲＮＡ干渉を誘発するｓｈＲＮＡを発現することが可能となる、発現プラスミドまたは染色体組込みを備えている。多量のヘアピンＲＮＡ発現は細菌に負担をかけ、増殖低下および／または細菌によるプラスミドもしくはヘアピンの改変を引き起こすことが実験により示されている。より高い構造エネルギーを有するｓｈＲＮＡ設計により細菌の転写機構による２本鎖の分離がより困難になるが、このようなｓｈＲＮＡは、より低い構造エネルギーのｓｈＲＮＡよりもクローニングが難しい。この実施例では、本発明者らは、より低いエネルギー係数を有し、細菌内でプラスミドを発現するｓｈＲＮＡの維持をより容易にする一方で、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングを誘導する能力を維持する、別のヘアピンＲＮＡの発現方法を開示する。
図７に示される設計が既存のｓｈＲＮＡを上回る利点は、主として、構造エネルギーが著しく低く、ｔｋＲＮＡｉプラスミドの容易なクローニングが可能であり、細菌内のプラスミド維持がより安定し、かつプラスミドの配列決定が容易であるという点にある。センス鎖の３’末端内にゆらぎ［３’（Ｓ）ゆらぎ］の導入が許容され、かつ構築物のサイレンシング能を変化させない一方で、５’（Ｓ）ゆらぎの導入はサイレンシング能を低下させ得る。従来の二本鎖構造を有さないｓｈＲＮＡによりＲＮＡｉを誘発することができる。さらに、アンチセンス（ＡＳ）鎖が完全長（１９ｎｔ）であり、かつ５’末端がセンス鎖で覆われている限り、半オーバーラップ構造が遺伝子サイレンシングを誘導し得る。
実施例２９：ＴＲＩＰおよびｐＮＪＳＺｃプラスミドにおけるｉｎｖ発現の抑制解除
エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）表面発現インベイシンタンパク質は、β−１インテグリンファミリーメンバーとの結合によりヒト細胞内への侵入を仲介する。このため本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のヒト腸上皮細胞内への内部移行を仲介するように、生来のプロモーターを有するインベイシン遺伝子（ｉｎｖ）一式をｐＴＲＩＰおよびｐＮＪＳＺｃプラスミド内にクローニングした。Ｈ−ＮＳ（ヒストン様タンパク質）が、ＹｍｏＡと複合したｉｎｖプロモーター領域に結合すると、Ｙ．シュードツベルクロシス（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるインベイシン発現が抑制される。この２つのタンパク質が一緒になって抑制複合体を形成し、ｉｎｖの発現を基底レベルまで減少させる。温度制御性ＲｏｖＡ（毒性Ａ制御因子）が同じｉｎｖプロモーター領域内でＨ−ＮＳ／ＹｍｏＡと置換して結合すると、ｉｎｖ発現の上方制御が起こる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内にはＨ−ＮＳおよびＹｍｏＡのホモログが存在する。しかし、ＲｏｖＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に存在しないため、恒常的な基底レベルのインベイシンの発現が生じる。ｉｎｖのプロモーター内の制御因子結合領域を除去することにより、ｉｎｖの恒常的な上方制御が生じることが報告された。この実施例では、本発明者らは、ｐＴＲＩＰおよびｐＮＪＳＺｃ中にクローニングされたｉｎｖプロモーターから制御因子結合領域を除去してｉｎｖの恒常的な上方制御を可能にする方法を記載する。
表４６に示されるプライマーを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抑制と関連すると考えられる、Ｙ．シュードツベルクロシス（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｉｎｖプロモーター領域内に位置する１５３ヌクレオチドが欠失するように設計した。プライマーをｐＴＲＩＰ（鋳型）およびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）と組み合わせて用い、Ｈ３またはラミンヘアピンを含むｐＴＲＩＰ中にクローニングされたｉｎｖプロモーター領域内の、表４６に示される制御因子結合領域を欠失させた。
得られたｉｎｖ抑制解除遺伝子を配列決定して確認し、ｐＮＪＳＺｃ内へＮｒｕＩおよびＳｃａＩ部位内にクローニングした。
インベイシン発現をＦＡＣＳにより試験し、ここでは、ＣＥＱ２２１／ｐＴＲＩＰおよびＣＥＱ２２１／ｐＮＪＳＺｃを３７℃で一晩増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、抗ｉｎｖモノクローナル抗体３Ａ２でプローブした。陽性対照は、インベイシンの最適発現のために２６℃で増殖させたＹ．シュードツベルクロシス（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であった。
ｉｎｖ制御領域を除去することにより、ｐＴＲＩＰ（抑制解除変異株をｐＧＢ６０と呼ぶ）およびｐＮＪＳＺｃ（抑制解除変異株をｐＧＢ６９と呼ぶ）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）両方において侵襲発現の増加を生じることが、ＦＡＣＳ解析により示された。元のプラスミドおよび抑制解除プラスミドを、Ｖｅｒｏ細胞内での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内部移行を誘発するその能力に関して、標準的なゲンタマイシン防御試験により試験した。データは、ｉｎｖ抑制解除によりＶｅｒｏ細胞内での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内部移行が増加することを示していた。
実施例３０：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴ８４ヒト腸上皮細胞内へのＯｐａ５２仲介による侵襲
ｔｋＲＮＡｉを送達するための腸上皮細胞の頂部の広範囲な標的化での使用のためにＯｐａ５２を操作した。Ｏｐａ５２は、ＣＥＡＣＡＭ１、３、５および６と結合し、うちＣＥＡＣＡＭ１、５および６が上皮細胞により発現される。これにより、健常で極性化した上皮細胞内へのｔｋＲＮＡｉ送達が可能となる。以下の実施例は、高度に極性化したＴ８４ヒト腸上皮細胞内への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）侵襲のためのＯｐａ５２細菌発現ベクターの構築および使用を記載する。
ｏｐａ５２遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：Ｚ１８９２９）から入手し、開始コドン、シグナル配列および停止コドンを含むように改変した。シグナル配列は、他のいくつかのＯｐａタンパク質の天然の分泌シグナルと同一であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現に関してコドン最適化されていた。次いでこの遺伝子を、転写抑制増強を可能にするために第二のｌａｃＯ部位を含む改変ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下に置いた。ラムダｔ０ターミネーター配列はｏｐａ５２停止コドンの上流に含まれていた。この完全ＤＮＡフラグメントをＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で合成し、ｐＵＣ１９上にクローニングして確認した。低コピーのＣｏｌＥ１適合性プラスミド上でのＯｐａ５２発現を促進するために、本発明者らは、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎからの完全合成カセットを、ｐＪＳ１５と称するｐＡＣＹＣ１７７の改変バージョン内にサブクローニングした。これは、ＣｏｌＥ１プラスミドと適合性のある、小型で（２ｋｂ）、低コピー（細胞当たり１０〜１２コピー）のカナマイシン耐性ベクターである。ｐＪＳ３４と命名された得られたｏｐａ５２構築物は、長さ１０４０塩基対であり、表４７に示される。配列は：ＫｐｎＩ（１〜６）、ＳｐｅＩ（１０１〜１０６）、ＮｄｅＩ（９２２〜９２７）、ＮｏｔＩ（１０２３〜１０３０）およびＰｍｅＩ（１０３３〜１０４０）に対する制限部位；ｌａｃＯ部位（ＬａｃＩ結合のため）（７〜２５および７０〜８８）；ＲＢＳ（９５〜１００）；ｐｔａｃ−３５（３２〜３７）および−１０（５６〜６２）；リーダー配列（１０９〜１７７）およびラムダｔ０ターミネーター配列（９２８〜１０２２）を含む。
表４８は、リーダー２３アミノ酸ペプチドが付加された、翻訳された２７０アミノ酸配列を示す。リーダーペプチドはアミノ酸１〜２３である。
高度に極性化したＴ８４細胞から放出された細菌の播種および培養により、ｏｐａ発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の侵襲能がインベイシン発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に比べて有意に高いことが示された。図８は反復実験のデータを示している。
ｔｋＲＮＡｉによる健常な（非異形成性の）上皮の標的化を可能にするために、本発明者らは、共に上皮細胞表面受容体を標的とする腸管侵襲性病原体由来の単一のタンパク質に基づく、２つの別の侵襲ストラテジーを開発した。
第一のものは、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種により発現されるＯｐａファミリータンパク質のメンバーであり、使用するＯｐａバリアントに応じて、上皮細胞の頂面上で発現される癌胎児抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）の異なるメンバーを標的とする。最初の付着は線毛により、次いで、細菌外膜内に存在する混濁（ｏｐａｃｉｔｙ）（Ｏｐａ）タンパク質を介したより親密な相互作用により仲介される。Ｏｐａタンパク質は上皮細胞上に存在する特異的な受容体を認識する。あるＯｐａタンパク質は、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）シンデカン−１および−４と結合するのに対し、別のＯｐａタンパク質は、最近ＣＥＡＣＡＭファミリーと改名された癌胎児抗原（ＣＥＡ）またはＣＤ６６ファミリーのメンバーと結合する。ＣＥＡＣＡＭは、自然感染の際にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株により標的化される２つの細胞タイプである、上皮細胞および好中球上に見ることができる。Ｏｐａタンパク質とＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの間の相互作用は、高度に特異的である；すなわち、各ＯｐａバリアントはＣＥＡＣＡＭ受容体ファミリーの特定のメンバーに対してのみ特定の向性を示す。
これらの標的化タンパク質の第二のものは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来し、インターナリンＡまたはＩｎｌＡと呼ばれ、接着結合のＥ−カドヘリンタンパク質構成要素を標的とする。ＩｎｌＡはＩｎｌＢと共に、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が感受性宿主の広範な非食細胞を侵襲することを可能にする。ＩｎｌＡは、接着結合複合体中の主要分子であるＥ−カドヘリンのＮ末端ドメインを標的とすることにより、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の腸上皮細胞内への侵入を促進する。最近の研究では、天然のＩｎｌＡが、腸上皮成熟および絨毛先端での脱落の間に一時的な窓を利用して宿主内へ侵入することが示されている。つまり、腸上皮細胞は、絨毛陰窩の基底にある自己更新性の幹細胞様細胞により産生され、陰窩から絨毛先端へ移動しながら徐々に成熟する。腸上皮細胞が絨毛先端に到達すると、通常のターンオーバープロセスで、または傷害誘導性アポトーシスにより脱落する。いずれの場合にも、次いで接着結合タンパク質（すなわち、Ｅ−カドヘリン）が一時的に露出し、ＩｎｌＡ結合およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の細胞内への侵入が可能となる。さらに、ＩＢＤのような病的状態では、上皮バリアの完全性が病変部位のみならず、周囲の無関係な領域においても損なわれる。この場合、損なわれたバリアが接着結合、ひいてはＥ−カドヘリンを露出し、ＩｎｌＡ発現送達株が、炎症性病巣のみならず周囲の上皮内の細胞と接触することが可能となる。このことは、炎症の活発な拡大の間に送達株が好適に侵襲して、炎症／損傷バリア部位において目的とする標的をサイレンシングする一方で、正常な上皮の領域は無傷のままであるという点で有利である。したがって、標的化のためにＩｎｌＡに依存するいずれのｔｋＲＮＡｉ送達プラットフォームも、活発な炎症中の治療のための治療薬剤として有用であろう。
結果は、インベイシン発現プラスミドに比べて、Ｏｐａ発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の侵襲能が有意に増加したことを示した。
実施例３１：β−カテニンの上方制御により仲介される障害の治療のためのＣＥＱ５０８
薬剤候補ＣＥＱ５０８は、ｐＭＢＶ４３−Ｈ３プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＥＱ２２１からなる。ＣＥＱ２２１株は、ＣＧＳＣから購入されるＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，２０００（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，６６４０）の５−株遺伝子破壊セットを用いたバクテリオファージラムダＲｅｄ組換えシステムを使用してｄａｐＡおよびｒｎｃ遺伝子を順次欠失させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９４から誘導される。この実施例におけるプラスミドｐＭＢＶ４３は、ヘアピン配列「Ｈ３」（既に開示）、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）インベイシン（ｉｎｖ遺伝子によりコードされる）およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）（ｈｌｙ遺伝子によりコードされる）を含むｓｈＲＮＡ発現カセットによりβ−カテニンｍＲＮＡを標的化するためのｈＲＮＡヘアピンをコードする。ｐＭＢＶ４３プラスミドは、以下の変更によりｐＵＣ１９から誘導される：
１．ヘアピンカセットは、ＵＰエレメントおよび２つのターミネーターのセットと連結された改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターを有する。
２．別の既存のプラスミドｐＫＳII−ｉｎｖ−ｈｌｙ由来のｉｎｖおよびｈｌｙ遺伝子を含むフラグメントのクローニング。
３．抗生物質耐性マーカーとしてのａｍｐのカナマイシン（ｋａｎ）との置換。
この実施例おいてｐＭＢＶ４３プラスミドに使用される改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターは、これまで使用されたｐＮＪＳＺプラスミドで使用されたＰｌａｃＵＶ５プロモーターとの重要な相違点を少なくとも３つ含む：
１．−３５コンセンサスエレメント（網掛け部分はＴＴＴＡＣＡからＴＴＧＡＣＡへの変異；
２．−３５エレメント上流にＵＰエレメントが付加されている；
３．ＰｌａｃＵＶ５由来のｌａｃＯ（ｌａｃオペロンオペレーター）が欠失し、ＢａｍＨＩ部位と置換されている。
ＰｌａｃＵＶ５プロモーターは長さ８７塩基対であり、表４９に示される。ＰｌａｃＵＶ５プロモーターの−３５および−１０コンセンサスエレメントはそれぞれ、塩基対７〜１２および３１〜３７である。ｌａｃＯ（ｌａｃオペロンオペレーター）は塩基対４３〜６４で示される。
改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターは長さ６５塩基対であり、表４９に示される。ＰｌａｃＵＶ５プロモーターの−３５および−１０コンセンサスエレメントはそれぞれ、塩基対３０〜３５および５４〜６０である。ＵＰエレメントは塩基対７〜２６で示される。
ｐＭＢＶ４３プラスミドのさらなる相違点は、それが２つのセットのターミネーターを有するということである：
１．ターミネーター１は、ｓｈＲＮＡヘアピンの直後にある場合にターミネーターとして機能する連続したＴである。
２．ターミネーター２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｒｎＣターミネーターと同じであり、以下の配列を有する：ＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号：５７４）。
さらに、ｐＮＪＳＺプラスミドは、約８塩基の５’突出、５１塩基対のｓｈＲＮＡおよび約７２〜７６塩基からなる３’突出からなる全長約１３１〜１３５の塩基を含む、ｓｈＲＮＡを産生する。これに対し、ｐＭＢＶ４３プラスミドは５’突出を産生せず、２〜５塩基からなる著しくより短い３’突出を産生し、かつ５１塩基対のｓｈＲＮＡを産生し、ｓｈＲＮＡの全長が５３〜７０塩基の範囲にある。適切に機能するためには、３’突出は少なくとも２塩基を必要とする。したがって、ｓｈＲＮＡの全長は、長さ５３〜７０ヌクレオチド、好ましくは長さ５３〜６５ヌクレオチド、より好ましくは長さ５３〜５８ヌクレオチド、および最も好ましくは長さ５３〜５５ヌクレオチドの範囲である。
ＣＥＱ２２１ｐＭＢＶ４３−Ｈ３の哺乳動物細胞侵入にはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）インベイシンの表面発現が必要であることが、ＦＡＣＳ解析により示された。エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびＣＥＱ２２１ｐＭＢＶ４３−Ｈ３は共に侵襲の表面発現を有する。ｐＭＢＶ４３プラスミドを有さないＣＥＱ２２１はインベイシン発現を示さない。陰性対照：抗体なしのエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）。
侵襲後に治療ペイロード（ｓｈＲＮＡ）が哺乳動物細胞エンドソームを回避できるためには、ＣＥＱ５０８はリステリオリシン（ＬＬＯ）活性を必要とする。ＬＬＯ活性は、上述の溶血試験により検出される。ＣＥＱ５０８が明確な溶血活性を示すのに対し、プラスミドを有さないＣＥＱ２２１またはＰＢＳは溶血活性を示さない。
相対的Ｈ３ヘアピンＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲにより、ＣＥＱ５０８がその前駆体であるＣＥＱ５０５に比べて約２０倍多いＨ３ｓｈＲＮＡを含有することが示された。すでに開示したように、ＣＥＱ５０５は、ｄａｐＡ遺伝子およびｒｎｃ遺伝子の欠失によりＭＭ２９４から誘導されてＣＥＱ２２１と称される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を生じ、次いで、ｉｎｖ遺伝子によるインベイシン、ｈｌｙ遺伝子によるリステリオリシンＯおよびヘアピン配列Ｈ３を含むｓｈＲＮＡ発現カセットによりβ−カテニンｍＲＮＡを標的化するための短鎖ヘアピンＲＮＡの発現をコードするプラスミドｐＮＪＳＺｃ−Ｈ３で形質転換された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からなる。これに対し、既に開示したように、ＣＥＱ５０８は、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）インベイシン（ｉｎｖ遺伝子によりコードされる）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）（ｈｌｙ遺伝子によりコードされる）およびｓｈＲＮＡヘアピン配列Ｈ３をコードするｐＭＢＶ４３−Ｈ３プラスミドを含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＥＱ２２１からなる。
図９は、ヒト細胞（ＳＷ４８０）におけるＣＥＱ５０８を用いた遺伝子のサイレンシングを示す。パネルＡは、ＣＥＱ５０８が、ＳＷ４８０細胞において用量依存的に９０％もの哺乳動物β−カテニンｍＲＮＡのサイレンシングが可能であったことを示す。対照はＣＥＱ２２１−ｐＭＢＶ４３−ラミンおよびＣＥＱ２２１−ｐＭＢＶ４３−ルシフェラーゼで処置した。パネルＢは、ＣＥＱ５０８が、ＳＷ４８０細胞において用量依存的に７２％もの哺乳動物β−カテニンタンパク質ｍＲＮＡのサイレンシングが可能であったことを示す。対照はＣＥＱ２２１−ｐＭＢＶ４３−ルシフェラーゼで処置した。ＤＬＤ−１細胞で行った同様の実験では、ＣＥＱ５０８が、５０％を上回るβ−カテニンｍＲＮＡのサイレンシングが可能であることが示された。さらなる実験では、ＣＥＱ５０８−Ｈ３を有するＨｅｌａ細胞におけるβ−カテニンサイレンシングが示された。Ｈｅｌａ細胞を標準ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中、３７℃で培養し、細胞が８０％コンフルエントになったときにＣＥＱ５０８−Ｈ３を培養物に添加した。対照を、同一の遺伝的背景であるがβ−カテニンではなくヒトラミン（ｈｌａｍ）に対してヘアピンＲＮＡを発現するの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で処置した。細胞を１：６．５〜１：５１の範囲の様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間処置した後、４回洗浄した。次いで、抗生物質テトラサイクリンおよびオフロキサシンを含有する新たな培地を加え、侵襲後４８時間で細胞を回収した。ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子発現解析を行った。ＣＥＱ５０８−Ｈ３で処置したＨｅｌａ細胞では、β−カテニンの用量依存的サイレンシングが観察されたが、対照株で処置した細胞では観察されなかった。最高度のＭＯＩでは、β−カテニン発現がベースラインの４５％まで減少した。
図１０は、ＣＥＱ５０８による単回処置後のタンパク質レベル（ウエスタンブロット法による）で確認される、ＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニン遺伝子発現の減少を示すものであり、この減少はいずれの対照株でも観察されない。ＳＷ４８０細胞を標準ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中、３７℃で培養した。細胞が７０％コンフルエントになったときにＣＥＱ５０８を培養物に添加した。対照を、同一の遺伝的背景であるが、次のいずれかを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で処置した：（ａ）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に対するヘアピンＲＮＡ、（ｂ）インベイシンおよびリステリオリシンを発現するがヘアピンＲＮＡは発現しない、侵襲特性を有する細菌あるいは（ｃ）ｐＭＢＶ４３プラスミドを保有しない空の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＥＱ２２１（非侵襲性）。細胞を、１：５０〜１：１５０の範囲の様々な感染多重度（ＭＯＩ）で２時間処置した後、４回洗浄した。抗生物質テトラサイクリンおよびオフロキサシンを含有する新たな培地を加え、侵襲後４８時間で細胞を回収し、次いで、標準的なプロトコールを用いて全タンパク質を抽出した。ＣＥＱ５０８で処置したＳＷ４８０細胞では、β−カテニンの用量依存的サイレンシングが観察されたが、対照株で処置した細胞では観察されなかった。最高度のＭＯＩでは、β−カテニン発現がほぼ検出不可能なレベルまで減少した。
さらに、経時的実験を行い、ＣＥＱ５０８による単回処置後のＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニン発現の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、および最も好ましくは少なくとも８０％の長期のサイレンシングが投与後少なくとも１日、好ましくは少なくとも２日間、より好ましくは少なくとも３日間、および最も好ましくは少なくとも４日間示された。ＳＷ４８０細胞を標準ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中、３７℃で培養した。細胞が７０％コンフルエントになったときにＣＥＱ５０８を培養物に添加した。対照を、ｐＭＢＶ４３プラスミドを保有しない同一の遺伝的背景（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＥＱ２２１）の細菌株（すなわち、侵襲のための遺伝子を保有しないため非侵襲性である）で処置した。細胞をＭＯＩ１：２００で２時間処置した後、４回洗浄した。抗生物質テトラサイクリンおよびオフロキサシンを含有する新たな培地を加え、細胞を増殖させて、９０％コンフルエンスに達したときに継代した。侵襲後、所定の時点で並行ウェルから細胞を回収した。ＴＲＩＺＯＬを用いてＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子発現解析を行った。結果は、ＣＥＱ５０８による単回処置後に強力な（＞８０％）遺伝子サイレンシングを示し、これが少なくとも４日間持続した後、β−カテニンレベルが徐々に正常に戻った。１０日目前後の明白な「オーバーシュート」は、細胞系の継代により生じたアーティファクトであると解釈される。
２つの異なる用量（低−１０７個／ｍＬおよび高−１０８個／ｍＬ）でのＣＥＱ５０８（ＣＥＱ２２１／ｐＭＢＶ４３Ｈ３）処置では、ヒト細胞（ＳＷ４８０）におけるラミンの遺伝子発現の有意な変化（定量的リアルタイムＰＣＲを用いた測定された）は得られず、他の遺伝子に対する悪影響は確認されなかった。対照処置を、プラスミドを有さない１０８個／ｍＬのＣＥＱ２２１細菌（無プラスミド高）で、それぞれ１０７個／ｍＬおよび１０８個／ｍＬ（ｐＭＢＶ４３ｌｕｃ高および低）のＣＥＱ２２１−ｐＭＢＶ４３−ルシフェラーゼで、ならびにそれぞれ１０８個／ｍＬおよび１０７個／ｍＬの短鎖ヘアピンＲＮＡを発現しないＣＥＱ２２１−ｐＭＢＶ４３（ｐＭＢＶ４３無ヘアピン高／低）で行った。これらのデータは、ＣＥＱ５０８処置が他の遺伝子に対して問題を引き起こさないことを示している。
野生型マウスおよびポリープ発生ＡＰＣｍｉｎマウスにおいて、ＣＥＱ５０８の単回経口摂取後０時間〜１２時間の炎症性サイトカイン存在の有無を評価するために、経時的プロファイルを行った。動物（野生型およびＡＰＣｍｉｎマウス、一時点当り１群３〜７匹）をＣＥＱ５０８の単回投与で処置し、所定の時点で血清を採取した。陽性対照に使用した動物には、４００μｇのＬＰＳを静脈内注射した。炎症性サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＦＮγ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１０を、経口投与ＣＥＱ５０８に対する炎症性応答の指標として解析した。全般的に、試験した炎症性サイトカインはいずれもＣＥＱ５０８経口処置後の増加を示さなかったが、これは、野生型またはポリープ発生ＡＰＣｍｉｎマウスにおけるＣＥＱ５０８処置後の全身性の炎症性サイトカイン応答がないことを示している。
表５０は、ＣＥＱ５０８またはＣＥＱ５０１の経口摂取後の胃腸管粘膜におけるｓｈＲＮＡの薬物動態を示す。
マウスにＣＥＱ５０８またはＣＥＱ５０１の１回または反復処置を与え、胃腸管粘膜組織を解析して、処置後の様々な時点においてＧＩ粘膜内に堆積されたｓｈＲＮＡ量を定量化した。ＣＥＱ５０１またはＣＥＱ５０８を投与したマウスの腸粘膜中ではＨ３ｓｈＲＮＡが検出されたのに対し、ＰＢＳ／グリセロール処置マウスではＨ３ｓｈＲＮＡが見られなかった。さらに、粘膜中に検出されたＨ３ｓｈＲＮＡ量は、ＣＥＱ５０１に比べてＣＥＱ５０８処置後の方が有意に高く、このことは、Δｒｎｃ突然変異がＨ３ｓｈＲＮＡのより高い産生量および安定性を付与することと一致する。最終投与（複数１日１回レジメン）後２４時間における試験では、ＣＥＱ５０１およびＣＥＱ５０８は共に同程度の腸粘膜中Ｈ３ｓｈＲＮＡレベルを示し、このことは、両送達プラットフォームにおいて、同等の安定状態レベルのヘアピン送達が得られること示唆している。
表５１は、マウスにおける経口処置後の生存ＣＥＱ５０８細菌の薬物動態評価のための実験群を示す。
マウスにＣＥＱ５０８を強制経口投与により１、３および７回処置した。各用量には５×１０９ｃｆｕのＣＥＱ５０８が含まれていた。最終投与２４時間後に組織を解析した。組織を無菌的に摘出し、生存治療用ＣＥＱ５０８細菌の存在を調べた。陽性対照はＣＥＱ５０８の静脈内注射で処置した。
表５２は薬物動態を示し、これらの単回または複数回（１日１回７日以下）の経口処置後に、調べたいずれの器官からも生存ＣＥＱ５０８が回収されなかったことを示している。
これらの結果から、ＣＥＱ５０８がマウスの消化管を脱出することが不可能であることが確認される（強制経口投与による傷害後の偽陽性細菌を示す２匹の動物は除く）。これは野生型マウス（無傷の消化管バリアを有する正常な健常マウス）および異形成により上皮バリアの完全性が損なわれたＡＰＣｍｉｎマウスの両方で観察された。しかし、投与５時間後に採取された便試料からはＣＥＱ５０８が回収され、生存細菌が腸管の全長にわたって通過することが確認された。予想された通り、便中で回収された生存ＣＥＱ５０８数は、投与後２４時間までに急速に減少した。尾静脈から単回静脈内注射を行ったマウスから生存ＣＥＱ５０８が回収された。これらの動物では、注射２時間後に調べた血液および器官においてＣＥＱ５０８が回収された。生存細菌数はその後減少したが、肝臓では投与（ｉｖ）後９６時間までの間、回収が可能であった。
ＣＥＱ５０８の単回経口投与（総量０．２ｍＬの強制経口投与による５．０×１０９ｃｆｕ）後に動物から便試料を収集した。便試料を、最初の６時間は１時間ごとに、次いで２４時間までは２時間ごとに、次いで１０８時間までは１２時間ごとに収集した。計画に従って便試料を総数２４個収集できるように、マウスを各１２匹のマウスの２つのコホートに細分し、１２時間シフトでＣＥＱ５０８の単回経口投与を行った。便試料を滅菌ＰＢＳ中に再懸濁して、滅菌ＰＢＳで１０ｍＬまで希釈し、次いでこの懸濁液５０μＬを、便試料由来のすべての細菌が増殖すると予想される非選択的ＬＢ／ＤＡＰプレート上、および便試料由来の治療用ＣＥＱ５０８細菌のみが増殖すると予想される選択的ＬＢ／Ｋａｎ／ＤＡＰ含有プレート上に播いた。次いで、細菌コロニーをカウントした。便試料中のＣＥＱ５０８量に従って、マウスを以下の群に細分した：０ＣＦＵ、＜１００ＣＦＵ、＜１０００ＣＦＵ、＞１０００ＣＦＵ。最終的に、表５３に示すように、特定の定義された量の細菌を有するマウスの百分率を計算した。
表５３は、ＣＥＱ５０８による単回経口処置の後、マウスが生存細菌を２時間という早さで排出し始めることを示している。便試料中のＣＥＱ５０８量は、投与後５時間までにピークに達し（すなわち、すべてのマウスが＞１０００ＣＦＵの生存ＣＥＱ５０８を排出する）、投与後８時間まで高値が維持され、その後徐々に減少する。投与後２４時間では、処置マウスの大部分が低い数のＣＥＱ５０８のみを排出する（すなわち、３３％の＜１０００ＣＦＵおよび６３％の＜１００ＣＦＵ）。総処置マウス数の３分の１のみ（３３．３％）が、処置後３６時間に生存ＣＥＱ５０８（＜１００ＣＦＵ）を便試料中に排出し続け、さらに、処置後４８、６０、７２、８４、９６または１０８時間で生存ＣＥＱ５０８を排出する動物はいない。まとめると、これらのデータは、ＣＥＱ５０８は消化管を無傷で通過するのみならず、速やかに排出され、消化管内に定住して増殖することができないことを示している。ＣＥＱ５０８は便試料中において投与後５時間までにピークに達し、８時間後まで高値が維持され、その後徐々に減少し、さらに、処置後４８、６０、７２、８４、９６または１０８時間で生存ＣＥＱ５０８を排出する動物はいない。
実施例３２：β−カテニンの上方制御により仲介される障害治療のためのＣＥＱ５０９
薬剤候補ＣＥＱ５０９は、ｐＮＪＳＺｃプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＥＱ２１０から誘導されたミニ細胞である細菌治療粒子（ＢＴＰ）からなる。ＣＥＱ２１０株は、ＣＧＳＣから購入されるＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，２０００（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，６６４０）の５−株遺伝子破壊セットを用いたバクテリオファージラムダＲｅｄ組換えシステムを使用してｍｉｎＣ遺伝子を順次欠失させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９４から誘導される。ｐＮＪＳＺｃプラスミドは、ｓｈＲＮＡヘアピン、ｉｎｖ遺伝子によりコードされるエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）インベイシンおよびｈｌｙ遺伝子によりコードされるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）をコードする。ＢＴＰを低速遠心分離により精製し、そのコロニー形成能に基づく＞９９．９％の純度を得た。
ＣＥＱ５０９のｔｋＲＮＡｉ活性を評価するために、ｐＮＪＳＺｃプラスミドのｈｌｙ遺伝子によりコードされるＬＬＯタンパク質に関する試験を含めた数多くの試験が行われてきた。ＣＥＱ５０９ＢＴＰは、等量のＢＴＰ（等しい生物量）を用いた場合、ＣＥＱ５０１と同量のＬＬＯ活性を示す。
ＣＥＱ５０９が細胞質内で食胞を回避してヘアピンを放出するためには、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）活性が必要である。ＬＬＯ活性はｐＨ５．５における溶血により試験される。溶血を視覚的に観察し、５４０ｎｍにおける吸光度測定により定量化した。吸光度測定には、ＰＢＳ処置試料を用いて分光光度計のブランクとした。ＣＥＱ５０９−Ｈ３およびＣＥＱ５０９−ＨＰＶは、β−カテニンおよびＨＰＶＥ６タンパク質（ここでは対照として使用）に対するＨ３ｓｈＲＮＡを含有するＢＴＰである。
ＦＡＣＳ解析により、ＣＥＱ５０９ＢＴＰ表面上にインベイシンの存在が示された。
ＣＥＱ５０９によるエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）インベイシンの表面発現は、ＣＥＱ５０９ＢＴＰによる哺乳動物細胞への侵入に必要である。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析により、ＣＥＱ５０９ＢＴＰはＨ３ｓｈＲＮＡを全く含有せず、バックグラウンドシグナルのみを生成することが示された。
最後に、図１１に示されるように、ＢＴＰをｔｋＲＮＡｉ試験において試験した。図１１は、ＣＥＱ５０９を用いたβ−カテニンのサイレンシングを示している。ＣＯＳ−７細胞を、図示される感染多重度（ＭＯＩ）でＣＥＱ５０９−Ｈ３またはＣＥＱ５０９−ＨＰＶのＢＴＰに感染させた。４８時間後に細胞由来のＲＮＡを回収し、ｑＰＣＲによるβ−カテニンｍＲＮＡ定量化に供した。対応するＭＯＩにおいて、ＣＥＱ５０９−ＨＰＶ感染細胞の相対定量（ＲＱ）に対するＣＥＱ５０９−Ｈ３感染細胞の相対定量（ＲＱ）の比を上にプロットした。このおよび他のデータは、ＣＥＱ５０９による３０〜５０％のβ−カテニンサイレンシングを示している。これらの実験は、インベイシン発現レベルが遺伝子サイレンシング介在ｔｋＲＮＡｉを誘導するのに十分であったことを示している。

Claims (35)

  1. 原核生物ベクターを含む侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌であって、前記ベクターが１つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターと、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座と、少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子とを含み、前記ｓｉＲＮＡがβ−カテニンのｍＲＮＡを阻害し、かつ前記侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌が野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌と比べてＲＮアーゼIII活性が減少している侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  2. １つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と、改変ＰｌａｃＵＶ５プロモーターと、少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子座と、少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子とを含み、前記ｓｉＲＮＡがβ−カテニンのｍＲＮＡを阻害する原核生物ベクター。
  3. 哺乳動物細胞に１つ以上のｓｉＲＮＡを送達する方法であって、請求項１に記載の少なくとも１つの侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を前記哺乳動物細胞に導入することを含む方法。
  4. 哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御する方法であって、請求項１に記載の少なくとも１つの侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を前記哺乳動物細胞に導入することを含む方法。
  5. β−カテニンの過剰発現に関連した疾患または障害の治療または予防を、それを必要とする哺乳動物において行う方法であって、請求項１に記載の少なくとも１つの侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を前記哺乳動物細胞に導入することを含む、前記哺乳動物におけるβ−カテニン発現の制御を含む方法。
  6. 前記細菌が、ＲＮアーゼIIIをコードするｒｎｃ遺伝子の欠失を含む、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  7. 前記ＲＮアーゼIII活性が野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌に比べて少なくとも９０％減少している、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  8. 前記ＲＮアーゼIII活性が野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌に比べて少なくとも９５％減少している、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  9. 前記ＲＮアーゼIII活性が野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌に比べて少なくとも９９％減少している、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  10. 前記１つ以上のＤＮＡ分子が侵襲性細菌内で１つ以上のｓｈＲＮＡに転写される、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  11. 前記１つ以上のｓｈＲＮＡが３’突出または平滑末端を含む、請求項１０に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  12. 前記３’突出が２〜５塩基対である、請求項１１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  13. 前記３’突出が２塩基対以下である、請求項１１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  14. 前記１つ以上のｓｈＲＮＡが１つ以上のｓｉＲＮＡにプロセシングされる、請求項１０に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  15. 前記原核生物ベクターが少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  16. 前記少なくとも１つのターミネーター配列が、少なくとも５つの連続したチミジン塩基対を含む、請求項１５に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  17. 前記細菌が第二のターミネーター配列をさらに含む、請求項１５に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  18. 前記第二のターミネーター配列がｒｒｎＣターミネーター配列である、請求項１７に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  19. 前記原核生物プロモーターが少なくとも１つのＵＰエレメントをさらに含む、請求項１に記載の侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌。
  20. 前記侵襲性細菌が弱毒化、非病原性または非毒性細菌である、請求項１に記載の侵襲性細菌。
  21. 請求項１に記載の侵襲性細菌と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
  22. 前記哺乳動物細胞を約１０３〜１０１１個の侵襲性細菌に感染させる、請求項５に記載の方法。
  23. 前記哺乳動物細胞を約１０５〜１０９個の侵襲性細菌に感染させる、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記哺乳動物細胞を約０．１〜１０６の範囲の感染多重度で感染させる、請求項５に記載の方法。
  25. 前記哺乳動物細胞を約１０２〜１０４の範囲の感染多重度で感染させる、請求項２５に記載の方法。
  26. 前記β−カテニン発現が、野生型のβ−カテニン発現に比べて、または前記侵襲性細菌の前記細胞への導入前のβ−カテニン発現に比べて減少する、請求項５に記載の方法。
  27. 前記β−カテニン発現減少がβ−カテニンｍＲＮＡの発現減少である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記β−カテニン発現減少がβ−カテニンタンパク質の発現減少である、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記β−カテニン発現が、野生型のβ−カテニン発現に比べて、または前記侵襲性細菌の前記細胞への導入前のβ−カテニン発現に比べて少なくとも５０％減少する、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記β−カテニン発現が、野生型のβ−カテニン発現に比べて、または前記侵襲性細菌の前記細胞への導入前のβ−カテニン発現に比べて少なくとも７５％減少する、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記β−カテニン発現が、野生型のβ−カテニン発現に比べて、または前記侵襲性細菌の前記細胞への導入前のβ−カテニン発現に比べて少なくとも９０％減少する、請求項２６に記載の方法。
  32. 哺乳動物におけるβ−カテニンの過剰発現に関連した前記疾患または障害が、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ガードナー症候群、肝細胞癌（ＨＣＣ）、基底細胞癌、毛母腫、髄芽腫および卵巣癌からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  33. 前記哺乳動物細胞が、結腸上皮細胞、直腸上皮細胞、腸上皮細胞、肝細胞、皮膚上皮細胞、有毛細胞、神経細胞および卵巣細胞からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  34. 前記哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ヤギュウ、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、シカおよび霊長類からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  35. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３４に記載の方法。
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