CN102317457A - 大肠埃希氏菌介导的β-连环蛋白的基因干扰 - Google Patents

大肠埃希氏菌介导的β-连环蛋白的基因干扰 Download PDF

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Abstract

本发明提供了利用细菌或BTP向真核细胞递送一个或多个小干扰RNA(siRNA)的方法。本发明还提供了利用所述细菌通过RNA干扰调节真核细胞中基因表达的方法，以及治疗病毒性疾病和病变的方法。所述细菌或BTP包含一个或多个siRNA，或编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子。本发明还提供了与本发明的细菌一起使用以在真核细胞中引起RNA干扰的载体。

Description

大肠埃希氏菌介导的β-连环蛋白的基因干扰
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年11月14日提交的美国专利申请No.61/114,610号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
使用小干扰RNA(siRNA)通过RNAi(RNA干扰)的基因沉默已经成为分子生物学强有力的工具并具有用于治疗性基因沉默的潜能。已经证明由靶细胞内的小DNA质粒转录的短发夹RNA(shRNA)也介导稳定的基因沉默并且获得与通过转染化学合成的siRNA所获得的水平相当的基因敲减(T.R.Brummelkamp，R.Bernards，R.Agami，Science 296，550(2002)，P.J.Paddison，A.A.Caudiy，G.J.Hannon，PNAS 99，1443(2002))。
RNAi的用于治疗目的的可能应用是广泛的，并且包括沉默和敲减诸如癌基因或病毒基因的疾病基因。RNAi的治疗性应用的一个主要障碍在于siRNA向靶细胞内的递送(Zamore PD，Aronin N.Nature Medicine 9，(3)：266-8(2003))。实际上，递送已经被称为是目前RNAi的主要障碍(Phillip Sharp，citedby Nature news feature，Vol 425，2003，10-12)。
因此，需要安全且可预测地向哺乳动物施用干扰RNA的新方法。
发明概述
本发明提供了包含原核载体的至少一种侵袭性细菌或至少一种侵袭性细菌治疗颗粒(BTP)，所述载体包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因，其中所述siRNA干扰目标基因靶标的mRNA，并且与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低。优选地，所述侵袭性细菌是侵袭性大肠埃希氏细菌(E.coli)。优选地，所述siRNA干扰β-连环蛋白的mRNA。本发明还提供了包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因的至少一个原核载体，其中所述siRNA干扰目标基因靶标的mRNA。优选地，所述siRNA干扰β-连环蛋白的mRNA。
本发明还提供了使用本发明提供的各种侵袭性细菌、BTP和载体的方法。例如，本发明提供了向哺乳动物细胞递送一个或多个siRNA的方法。所述方法包括引入包含原核载体的至少一种侵袭性细菌或至少一种侵袭性细菌治疗颗粒(BTP)，所述载体包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因，其中所述siRNA干扰目标基因靶标的mRNA，并且与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低。优选地，所述侵袭性细菌是侵袭性大肠埃希氏细菌。
本发明还提供了调节哺乳动物细胞中的基因表达的方法。所述方法包括引入包含原核载体的至少一种侵袭性细菌或至少一种侵袭性细菌治疗颗粒(BTP)，所述载体包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因，其中所述siRNA干扰目标基因靶标的mRNA，并且与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低，其中所表达的siRNA干扰目标基因的至少一个mRNA并由此调节基因表达。优选地，所述侵袭性细菌是侵袭性大肠埃希氏细菌。优选地，所述siRNA干扰β-连环蛋白的mRNA。
本发明还提供了治疗或预防哺乳动物的疾病或病变的方法。所述方法包括通过向已知引起疾病或病变(例如已知提高增殖、生长或发育异常)的哺乳动物细胞中引入包含原核载体的至少一种侵袭性细菌或至少一种侵袭性细菌治疗颗粒(BTP)而调节所述细胞中的至少一个基因的表达，其中所述载体包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因，其中所述siRNA干扰目标基因靶标的mRNA，并且与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低，其中所表达的siRNA干扰已知引起疾病或病变的基因的mRNA。优选地，所述侵袭性细菌是侵袭性大肠埃希氏细菌。优选地，所述siRNA干扰β-连环蛋白的mRNA。
所表达的siRNA能够指导所述细胞的多酶复合体RNA诱导的沉默复合体与一个或多个目标基因的mRNA(例如β-连环蛋白)相互作用。优选地，与野生型β-连环蛋白的表达相比或与用包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子的侵袭性细菌或BTP给药或治疗前β-连环蛋白的表达相比，β-连环蛋白的表达降低。β-连环蛋白的表达降低可以是β-连环蛋白mRNA的表达降低或β-连环蛋白的表达降低。优选地，与野生型β-连环蛋白的表达相比(与正常的健康细胞相比时)或与用包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子的侵袭性细菌或BTP给药或治疗前β-连环蛋白的表达相比，β-连环蛋白的表达降低至少50％；更优选地，与野生型β-连环蛋白的表达相比(与正常的健康细胞相比时)或与用包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子的侵袭性细菌或BTP给药或治疗前β-连环蛋白的表达相比，β-连环蛋白的表达降低至少75％；最优选地，与野生型β-连环蛋白的表达相比(与正常的健康细胞相比时)或与用包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子的侵袭性细菌或BTP给药或治疗前β-连环蛋白的表达相比，β-连环蛋白的表达降低至少90％。
优选地，所述疾病或病变可以是，但不限于与β-连环蛋白的过表达相关的疾病或病变。也即，所述疾病或病变的特征在于，当与正常(非病变)或野生型细胞或哺乳动物相比，需要此治疗的细胞或哺乳动物中β-连环蛋白的表达(DNA、RNA或蛋白)提高。优选地，待治疗的疾病或病变选自由以下组成的组：结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、Gardner综合征、肝细胞癌(HCC)、基细胞癌、毛母质瘤、成髓细胞瘤和卵巢癌。
本发明还提供了包含至少一种侵袭性细菌或BTP和药学上可接受的载体的组合物。
本发明的侵袭性细菌或BTP可以是减毒的、不致病的或无毒的细菌。
所述哺乳动物细胞可以是离体的、体内的或体外的。所述哺乳动物细胞可以为，但不限于人、牛、绵羊、猪、猫、野牛、犬、山羊、马、驴、鹿、禽、鸟、鸡和灵长类的细胞。优选地，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些优选的实施方式中，所述哺乳动物细胞可以是，但不限于结肠上皮细胞、直肠上皮细胞、肠上皮细胞、肝细胞、皮肤上皮细胞、毛细胞、神经细胞和卵巢细胞。
可以用约103-1011(或所述范围内的任意整数)的活侵袭性细菌或BTP感染所述哺乳动物细胞。优选地，可以用约105-109(或所述范围内的任意整数)的活侵袭性细菌或BTP感染所述哺乳动物细胞。可以用范围在约0.1-106(或所述范围内的任一整数)的感染复数感染所述哺乳动物。优选地，可以用范围在约102-104(或所述范围内的任一整数)的感染复数感染所述哺乳动物。
所述哺乳动物可以为，但不限于人、牛、绵羊、猪、猫、野牛、犬、山羊、马、驴、鹿、禽、鸟、鸡和灵长类。优选地，所述哺乳动物是人。
所述侵袭性细菌中删除了编码RNaseIII的基因。优选地，所述侵袭性细菌中删除了编码RNaseIII的rnc基因。优选地，与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低至少90％；更优选地，与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低至少95％；最优选地，与野生型细菌相比，所述侵袭性细菌的RNase III活性降低至少99％。优选地，所述侵袭性细菌是侵袭性大肠埃希氏细菌。
所述一个或多个DNA分子可以在所述侵袭性细菌内转录成一个或多个shRNA。优选地，所述一个或多个shRNA包含3’悬端或平末端。优选地，所述一个或多个shRNA不包含或不包括5’悬端(具有平末端)。优选地，所述一个或多个shRNA包含2-5个碱基对的3’悬端；更优选地，所述一个或多个shRNA包含不大于2个碱基对的3’悬端(一个或两个碱基对的悬端)；最优选地，所述一个或多个shRNA不包含或不包括3’悬端(具有平末端)。所述一个或多个shRNA被加工成一个或多个siRNA。优选地，所述一个或多个shRNA在所述哺乳动物细胞内被加工成一个或多个siRNA。
包含编码所述一个或多个siRNA的一个或多个DNA的原核载体可以包含一个或多个启动子序列、增强子序列、终止子序列、侵袭因子序列或裂解调节序列。所述启动子可以是原核启动子。优选地，所述原核启动子是T7启动子，PgapA启动子、ParaBAD启动子、Ptac启动子、PlacUV5启动子或recA启动子。优选地，所述启动子是原核启动子。优选地，所述原核启动子是经修饰的PlacUV5启动子。所述经修饰的PlacUV5启动子可以包含SEQ ID NO：573的序列。优选地，所述经修饰的PlacUV5启动子可以包含UP元件。所述UP元件可以包含SEQ ID NO：573的7-26位核苷酸。优选地，所述原核载体进一步包含至少一个终止子序列。优选地，所述终止子序列包含一系列连续的胸苷碱基对。更优选地，所述终止子序列可以包含至少5个连续的胸苷碱基对。所述终止子序列优选包含少于20个连续的胸苷碱基对。所述原核载体可以进一步包含第二终止子序列。优选地，第二终止子序列可以是rrnC终止子序列。优选地，所述rrnC终止子序列可以包含SEQ ID NO：30-31或SEQ ID NO：574的序列。优选地，这两个终止子序列在所述原核载体中是相邻的(其为连续序列)。更优选地，所述两个终止子序列是分开的。优选地，所述原核载体包含经验证的pMBV43的序列。优选地，所述经验证的pMBV43序列是SEQ IDNO：564。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。在本说明书中，除非文中清楚指明，否则单数形式也可以包括复数形式。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本发明所述类似或等同的方法和材料，但合适的方法和材料如以下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考均通过引用并入本文。在有冲突的情况下，以包括定义在内的本发明说明书为准。此外，所述材料、方法和实例仅作为示例而非限制性的。
本发明的其它特征和优点体现于以下详述和权利要求书中。
附图说明
图1为显示三个剂量的CEQ200和CEQ221在COS7细胞内的比较图。
图2为具有功能注解的显示RNase III底物的发夹RNA结构的示意图。
图3为显示细菌I型RNase III对发夹前体的切割作用的示意图。
图4为显示熟化的第二步(第一Dicer切割步骤)的示意图。
图5为显示第二Dicer切割步骤和熟化为活性siRNA的示意图。
图6的A部分为显示CEQ 505能够在Cos-7细胞中以剂量依赖方式将哺乳动物β-连环蛋白沉默达90％的示意图。图6的B部分为显示CEQ221pNJSZc lamin(靶向核纤层蛋白基因的等同株)能够在SW480细胞中以剂量依赖方式将哺乳动物核纤层蛋白沉默达65％的示意图
图7为显示具有链摆动(strand wobble)的H3-shRNA的示意图。
图8的A部分为显示表达opa的大肠埃希氏菌株在MOI 1时的侵袭能力的示意图。图8的B部分为显示表达opa的大肠埃希氏菌株在MOI 10时的侵袭能力的示意图
图9的A部分为显示在人SW480细胞中利用CEQ508沉默β-连环蛋白mRNA的示意图。图9的B部分为显示在人SW480细胞中利用CEQ508沉默β-连环蛋白的示意图。
图10为显示在人SW480细胞中利用CEQ508沉默β-连环蛋白的免疫印迹照片。
图11为显示在COS-7细胞中利用CEQ509BTP沉默β-连环蛋白mRNA的示意图。
发明详述
本发明涉及利用细菌的不致病株或治疗株或细菌治疗颗粒(BTP)将小干扰RNA(siRNA)递送至真核细胞的组合物和方法。所述细菌或BTP递送编码siRNA的DNA或siRNA本身，以通过侵入真核宿主细胞内而发挥RNA干扰(RNAi)的作用。通常，为了在靶细胞内触发RNA干扰，需要将siRNA引入所述细胞。所述siRNA被直接引入或者通过转染而引入靶细胞中或者可以在靶细胞内由具有RNA聚合酶III兼容性启动子(例如U6、H1)的特异质粒转录为发夹结构的dsRNA(shRNA)(P.J.Paddison，A.A.Caudiy，G.J.Hannon，PNAS 99，1443(2002)，T.R.Brummelkamp，R.Bernards，R.Agami，Science 296，550(2002))。
本发明的干扰RNA调节真核细胞中的基因表达，其沉默或敲减靶标细胞内的目标基因(例如降低基因活性)。所述干扰RNA将细胞所属的多酶复合体RISC(RNA诱导的沉默复合物)靶向至待沉默基因的mRNA。RISC和mRNA的相互作用引起mRNA的降解或封存(sequestration)。这导致目标基因的有效的转录后沉默。该方法被称为细菌介导的基因沉默(BMGS)。
在通过递送表达siRNA的DNA质粒进行BMGS的情况下，释放真核转录质粒后，在靶细胞内产生shRNA或siRNA，并且触发mRNA降解的高特异过程，该过程引起靶基因的沉默。此外，可以使用将siRNA或shRNA的表达限定在出于特定代谢状态的特定靶细胞或组织的一个或多个细胞特异性真核启动子。在该方法的一个实施方式中，所述细胞特异性启动子为白蛋白，所述靶细胞或组织为肝脏。在该方法的另一个实施方式中，所述细胞特异性启动子为角蛋白，所述靶细胞或组织为皮肤。
本发明的无毒细菌和BTP具有侵袭性质(或者经修饰而具有侵袭性质)并且可以通过多种机制进入哺乳动物宿主细胞。与通过专门的吞噬细胞摄取细菌或BTP(该摄取通常致使细菌或BTP在专门的溶酶体中遭到破坏)相比，侵袭细菌或BTP菌株具有侵入非吞噬性宿主细胞的能力。天然存在的此类细菌或BTP的实例为细胞内病原体，例如耶尔森氏菌(Yersinia)、立克次氏体(Rickettsia)、军团菌(Legionella)、布鲁氏菌(Brucella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、螺杆菌(Helicobacter)、考克斯菌(Coxiella)、衣原体(Chlamydia)、奈瑟氏菌(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌(Burkolderia)、包特氏菌(Bordetella)、布鲁氏菌(Borrelia)、李斯特菌(Listeria)、志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、卟啉菌(Porphyromonas)、螺旋体(Treponema)和弧菌(Vibrio)，但该性质还可以转移至其它细菌或BTP中，例如大肠埃希氏菌(E.coli)、乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)或双歧杆菌(Bifidobacteriae)(P.Courvalin，S.Goussard，C.Grillot-Courvalin，C.R.Acad.Sci.Paris 318，1207(1995))。在本发明的另一个实施方式中，用于将干扰RNA递送至宿主细胞的细菌或BTP包括福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(D.R.Sizemore，A.A.Branstrom，J.C.Sadoff，Science 270，299(1995))，侵袭性大肠埃希氏菌(P.Courvalin，S.Goussard，C.Grillot-Courvalin，C.R.Acad.Sci.Paris 318，1207(1995)，C.Grillot-Courvalin，S.Goussard，F.Huetz，D.M.Ojcius，P.Courvalin，Nat Biotechnol 16，862(1998))，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)(A.Al-Mariri A，A.Tibor，P.Lestrate，P.Mertens，X.De Bolle，J.J.Letesson Infect Immun 70，1915(2002))和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(M.Hense，E.Domann，S.Krusch，P.Wachholz，K.E.Dittmar，M.Rohde，J.Wehland，T.Chakraborty，S.Weiss，Cell Microbiol 3，599(2001)，S.Pilgrim，J.Stritzker，C.Schoen，A.Kolb-
Figure BPA00001372421100071
G.Geginat，M.J.Loessner，I.Gentschev，W.Goebel，Gene Therapy10，2036(2003))。任何侵入性细菌或BTP都可用于将DNA转移至真核细胞中(S.Weiss，T.Chakraborty，Curr Opinion Biotechnol 12，467(2001))。
利用天然的侵袭性病原体鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)进行BMGS。在该实施方式的一个方面，鼠伤寒沙门氏菌菌株包括SL 7207和VNP20009(S.K.Hoiseth，B.A.D.Stocker，Nature 291，238(1981)；Pawelek JM，Low KB，Bermudes D.Cancer Res.57(20)：4537-44(Oct.15 1997))。在本发明的另一个实施方式中，利用减毒的大肠埃希氏菌进行BMGS。在该实施方式的另一个方面，对CEQ201菌株进行工程改造以通过侵袭性质粒而使其具有细胞侵袭性质。在本发明的一个方面，该质粒为TRIP(Transkingdom RNA干扰质粒)质粒或pNJSZ。
针对携带由真核转录质粒的侵入性营养缺陷性细菌或者BTP还使用了双重“特洛伊木马”技术。该质粒反过来由靶细胞转录，以形成触发RNAi的细胞内过程的一个或多个发夹RNA结构。本发明的该方法诱导多个基因的显著的基因沉默。在该实施方式的某些方面，所述基因包括体外的转基因(GFP)、突变的致癌基因(k-Ras)和癌相关基因(β-连环蛋白)。
本发明BMGS的另一方面被称为Transkingdom RNAi(tkRNAi)。在本发明的该方面，与靶细胞对比，siRNA由侵袭性细菌直接产生，或者在细菌产生后聚集在BTP中。通过标准的转化技术将由原核启动子(例如T7)控制的转录质粒插入至载体细菌中。在所述细菌中产生siRNA，并在由营养缺陷或定时添加抗生素触发的细菌裂解后释放到哺乳动物靶细胞中。
大多数细菌都含有大量RNA降解酶RNAse，其可以降解siRNA从而引起tkRNAi活性的降低。在特定细菌的RNAse表现出此siRNA降解活性的情况下，对编码目标RNAse的基因(例如编码RNAse III的rnc基因)进行靶向删除，以使每tkRNAi细菌产生较高水平的siRNA，从而使更多的siRNA被递送至靶细胞中，以及靶细胞中目标基因的更有效的基因沉默。
与用于发现基因功能的遗传工程化敲减模型相比，包括BMGS和tkRNAi在内的本发明的RNAi方法用于产生瞬时“敲减”的遗传动物模型。所述方法还用作研究和药物开发用体外转染工具。
这些方法使用具有理想性质(侵袭性、减毒、易操作性)的细菌以进行BMGS和tkRNAi。如本文较详细描述的，利用质粒(例如TRIP)和载体使细菌或BTP具有侵袭性以及一个或数个shRNA的真核或原核转录。
1.细菌和/或细菌治疗颗粒(BTP)
本发明提供了至少一种侵袭性细菌或者至少一种细菌治疗颗粒(BTP)，其包含一个或多个siRNA或编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子。
根据本发明，能够通过例如跨膜进入细胞的细胞质，将分子例如RNA分子或编码RNA的DNA分子递送至靶细胞的细胞质的任何微生物均可用于向此细胞递送RNA。在优选的实施方式中，所述微生物为原核生物。在更优选的实施方式中，所述原核生物是细菌或BTP。除细菌外，可用于向细胞递送RNA的微生物也包含在本发明的范围内。例如，所述微生物可以是真菌，例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，原生动物，例如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)和疟原虫(plasmodia)。
在优选实施方式中，所述微生物为细菌或BTP。优选的侵袭性细菌或BTP能够通过例如进入真核细胞的细胞质，向靶细胞递送至少一种分子，例如RNA或编码RNA的DNA分子。优选地，所述RNA是siNRA或shRNA，并且所述编码RNA的DNA分子编码siRNA或shRNA。
BTP为用于治疗或预防目的的细菌的片段。BTP可以包括本领域已知为迷你细胞(minicell)的颗粒。迷你细胞是由在极点(pole)附近具有缺陷的细胞分裂产生的小细胞，其缺乏类核，因此不能生长和形成菌落(Alder et al.，(1967)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.57，321-326；综述参见Sullivan and Maddock，(2000)Curr.Biol.10：R249-R252；Margolin，(2001)Curr.Biol.11，R395-R398；Howard and Kruse，(2005)J.Cell Biol.168，533-536)。迷你细胞的形成是突变的结果，该突变导致细胞分裂用隔膜形成位点的选择缺陷。此类突变包括minC、minD的无效等位基因(Davie et al，(1984)J.Bacteriol.158，1202-1203；de Boer et al.，1988)J.Bacteriol.170，2106-2112)和ftsZ的某些等位基因(Bi andLutkenhaus，(1992)J.Bacteriol.174，5414-5423)。据报道，FtsZ或MinC-MinD蛋白的过表达同样引起迷你细胞的形成(Ward and Lutkenhaus，1985；de Boeret al.，1988)。虽然迷你细胞不含类核体，但其能够进行转录和翻译(Roozenet al.，(1971)J.Bacteriol.107，21-33；Shepherd et al.，(2001)J.Bacteriol.183，2527-34)。
BTP与细菌的区别在于其缺乏细菌基因组，因此降低了细菌在患者体内增殖的风险。这对免疫功能低下的患者尤其有益。此外，BTP的不能增殖性可使其用于敏感组织例如脑，和通常认为传统siRNA难以接近的其他身体区域。例如，细菌的腹膜内递送可涉及粘连和腹膜炎的风险，这些风险可通过使用BTP消除。然而，与本发明的细菌相同，BTP包含细菌细胞壁、一些细菌胞质内容物(bacterial plasma content)和亚细胞颗粒、一种或多种治疗性组分(例如一种或多种siRNA)、一种或多种侵袭因子、一种或多种吞噬体降解因子和一种或多种靶向特定组织的因子。BTP由已产生siRNA并在细菌内积聚siRNA的细菌产生，然后在细胞分裂过程中分离细菌片段(BTP)。在本发明的一个实施方式中，通过发酵细菌获得BTP(在所述发酵过程中大量形成BTP)，然后利用体积差过滤从活细菌分离BTP(所述分离将截留细菌而允许BTP通过和收集)。在本发明的另一个实施方式中，通过离心从细菌分离BTP。在本发明的另一个实施方式中，通过激活死亡信号裂解活细菌细胞。分离后，可以将BTP冷冻并进行配制以备用。
当涉及微生物例如细菌或BTP时，本文使用的术语“侵袭”是指能够向靶细胞递送至少一种分子例如RNA或编码RNA的DNA分子的细菌。侵袭性微生物可以是能够穿过细胞膜，由此进入所述细胞的细胞质并向所述靶细胞递送其至少一些内容物(例如RNA或编码RNA的DNA)的微生物。向靶细胞递送至少一种分子的过程优选不明显改变所述侵袭器官。
侵袭性微生物包括天然能够通过例如穿过细胞膜(例如真核细胞膜)并进入细胞质而向靶细胞递送至少一种分子的微生物，以及天然不具有侵袭性，但已经过修饰(例如遗传修饰)从而具有侵袭性的微生物。在另一个优选的实施方式中，可以通过将所述细菌或BTP连接至“侵袭因子”(也称为“进入因子”或“胞质靶向因子”)进行修饰从而使所述天然不具有侵袭性的微生物具有侵袭性。本文使用的“侵袭因子”是当由非侵袭性细菌或BTP表达时使所述细菌或BTP具有侵袭性的因子，例如蛋白或蛋白组。本文使用的“侵袭因子”由“胞质靶向基因”编码。
在本发明的一个实施方式中，所述微生物是选自以下组的天然具有侵袭性的细菌或BTP，所述组包括但不限于耶尔森氏菌、立克次氏体、军团菌、布鲁氏菌、分枝杆菌、螺旋菌、考克斯菌、衣原体、奈瑟氏菌、伯克霍尔德氏菌、包特氏菌、布鲁氏菌、李斯特菌、志贺氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、卟啉菌、螺旋体、弧菌、大肠埃希氏菌和双歧杆菌。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的耶尔森氏菌，所述组包括但不限于侵袭素和YadA(小肠结肠炎耶尔森氏菌质粒粘附因子)。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达侵袭因子RickA(肌动蛋白聚合蛋白)的立克次氏体。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达侵袭因子RaIF(鸟嘌呤交换因子)的军团菌。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的奈瑟氏菌，所述组包括但不限于NadA(奈瑟氏菌粘附/侵袭因子)、OpaA、OpaC和Opa52(不透明性相关蛋白)。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的李斯特菌，所述组包括但不限于InlA(内化蛋白因子)、InlB(内化蛋白因子)、Hpt(己糖磷酸转运蛋白)和ActA(肌动蛋白聚合蛋白)。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的志贺氏菌，所述组包括但不限于志贺氏菌分泌因子IpaA(侵袭质粒抗原)、IpaB、IpaC、IpgD、IpaB-IpaC复合体、VirA和IcsA。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的沙门氏菌，所述组包括但不限于沙门氏菌分泌/交换因子SipA、SipC、SpiC、SigD、SopB、SopE、SopE2和SptP。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的葡萄球菌，所述组包括但不限于纤连蛋白结合蛋白FnBPA和FnBPB。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达选自以下组的侵袭因子的链球菌，所述组包括但不限于纤连蛋白结合对比ACP、Fba、F2、Sfb1、Sfb2、SOF和PFBP。任选地，所述天然具有侵袭性的细菌或BTP是表达侵袭因子FimB(整合素结合蛋白fibriae)的牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)。
在本发明的另一个实施方式中，所述微生物是天然不具有侵袭性但已经过修饰(例如遗传修饰)而具有侵袭性的细菌或BTP。任选地，所述天然不具有侵袭性的细菌或BTP已通过表达选自以下组的侵袭因子对其进行遗传修饰而具有侵袭性，所述组包括但不限于侵袭素、YadA、RickA、RaIF、NadA、OpaA、OpaC、Opa52、InlA、InlB、Hpt、ActA、IpaA、IpaB、IpaC、IpgD、IpaB-IpaC复合体、VirA、IcsA、SipA、SipC、SpiC、SigD、SopB、SopE、SopE2、SptP、FnBPA、FnBPB、ACP、Fba、F2、Sfb1、Sfb2、SOF、PFBP和FimB。
在本发明的另一个实施方式中，所述微生物是可具有天然侵袭性但已经经过修饰(例如遗传修饰)而表达一个或多个额外的侵袭因子的细菌或BTP。任选地，所述侵因子选自包括但不限于以下的组：侵袭素、YadA、RickA、RaIF、NadA、OpaA、OpaC、Opa52、InlA、InlB、Hpt、ActA、IpaA、IpaB、IpaC、IpgD、IpaB-IpaC复合体、VirA、IcsA、SipA、SipC、SpiC、SigD、SopB、SopE、SopE2、SptP、FnBPA、FnBPB、ACP、Fba、F2、Sfb1、Sfb2、SOF、PFBP和FimB。
天然具有侵袭性的微生物例如细菌或BTP可以具有特定的趋向性，即优选的靶细胞。或者，也可以对微生物(例如细菌或BTP)进行修饰(例如遗传修饰)而模仿第二微生物的趋向性。任选地，所述细菌或BTP是链球菌并且所述优选的靶细胞选自包括但不限于以下的组：咽上皮细胞、舌的口腔上皮细胞和粘膜上皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是卟啉菌并且所述优选的靶细胞选自包括但不限于口腔上皮细胞的组。任选地，所述细菌或BTP是葡萄球菌并且所述优选的靶细胞是粘膜上皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是奈瑟氏菌并且所述优选的靶细胞选自包括但不限于尿道上皮细胞和宫颈上皮细胞的组。任选地，所述细菌或BTP是大肠埃希氏菌并且所述优选的靶细胞选自包括但不限于以下的组：肠上皮细胞、尿道上皮细胞和上尿路的细胞。任选地，所述细菌或BTP是包特氏菌并且所述优选的靶细胞是呼吸道上皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是弧菌并且所述优选的靶细胞是肠上皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是螺旋体并且所述优选的靶细胞是粘膜上皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是支原体并且所述优选的靶细胞是呼吸道上皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是螺杆菌并且所述优选的靶细胞是胃内皮细胞。任选地，所述细菌或BTP是衣原体并且所述优选的靶细胞选自包括但不限于结膜细胞和尿道上皮细胞的组。
在本发明的另一个实施方式中，所述微生物是经过修饰(例如遗传修饰)以具有特定趋向性的细菌或BTP。任选地，所述优选的靶细胞选自包括但不限于由以下组成的组：咽上皮细胞、舌的口腔上皮细胞、粘膜上皮细胞、口腔上皮细胞、尿道上皮细胞、宫颈上皮细胞、肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、上尿路的细胞、胃上皮细胞和结膜细胞。任选地，所述优选的靶细胞是发育异常的或癌性上皮细胞。任选地，所述优选的靶细胞是激活的或静息的免疫细胞。
可以根据本领域已知的方法测定至少一个分子至靶细胞的递送。例如，可以利用杂交或PCR方法，或者利用可包括抗体使用在内的免疫学方法，通过由此沉默的RNA或蛋白的表达减少而测定所述分子的存在。
测定微生物是否具有足以用于本发明应用的侵袭性可以包括测定相对于与宿主细胞接触的微生物的数量，是否有足够的siRNA被递送至宿主细胞。如果相对于所用微生物的量，siRNA的量较少，则可能期望进一步修饰所述微生物以提高其侵袭潜能。
可以通过多种方法测定进入细胞的细菌或BTP。细胞内的细菌或BTP耐受氨基糖苷抗生素处理，而细胞外细菌被快速杀死。可以通过用抗生素庆大霉素处理细胞单层以使细胞外细菌或BTP失活，然后在用温和去污剂释放存活的细胞内生物前除去所述抗生素，并测定在标准细菌培养基上的存活数，而实现细菌或BTP摄取的定量估算。此外，可以通过例如细胞层的薄片透射电子显微镜或者通过免疫荧光技术直接观察进入细胞的细菌或BTP(Falkowet al.(1992)Annual Rev.Cell Biol.8：333)。因此，可以使用各种技术测定特定细菌或BTP是否能够侵袭特定类型的细胞，或确定细菌或BTP修饰(修饰此细菌的趋向性以模仿第二细菌的趋向性)之后的细菌侵袭。
根据本发明的方法，优选可以用于递送RNA的细菌或BTP为不致病的。然而也可以使用致病细菌或BTP，前提是其致病性已经减弱，由此使所述细菌对所施用的受试者无害。本文使用的术语“减毒的细菌或BTP”是指已经过修饰以显著降低或消除了其对受试者的有害性的细菌或BTP。可以通过以下所列的多种方法对致病细菌或BTP进行减毒。
无论其具体的作用机制如何，向真核细胞递送RNA的所述细菌或BTP可以根据细菌或BTP的类型而进入细胞的各种区室。例如，所述细菌或BTP可以在小泡(例如吞噬细胞小泡)中。一旦进入细胞内，所述细菌或BTP可以被破坏或裂解，并且其内容物被递送至真核细胞中。还可以对细菌或BTP进行工程加工以表达吞噬体降解蛋白从而使RNA从吞噬体漏出。在本发明的一个实施方式中，所述细菌或BTP表达(天然表达或者通过诸如遗传修饰的修饰而表达)促进所述吞噬体的形成孔、破裂或降解的蛋白。任选地，所述蛋白是胆固醇依赖性溶细胞素。任选地，所述蛋白选自由以下组成的组：李斯特菌溶素(listeriolysin)、伊万诺夫溶素(ivanolysin)、链球菌溶素(streptolysin)、神经磷脂酶、产气荚膜梭菌溶素(perfringolysin)、肉毒溶菌素(botulinolysin)、杀白细胞素(leukocidin)、炭疽毒素、磷脂酶、IpaB(侵袭质粒抗原)、IpaH、IcsB(细胞内传播)、DOT/Icm(细胞器转运缺陷/细胞内繁殖缺陷)、DOTU(DOT/Icm复合体的稳定因子)、IcmF和PmrA(多药耐药外排泵)。
在一些实施方式中，所述细菌可以在真核细胞中保持存活不同的时间长度，并且可以持续产生RNA。然后，所述RNA或编码RNA的DNA可以通过例如泄漏而从细菌释放至细胞中。在本发明的某些实施方式中，所述细菌还可以在真核细胞中复制。在优选的实施方式中，细菌复制不杀死宿主细胞。本发明不限于通过具体机制递送RNA或编码RNA的DNA，且旨在包括可以通过细菌递送RNA或编码RNA的DNA的方法和组合物，而与其递送机理无关。
在一个实施方式中，用于本发明应用的细菌或BTP是不致病的或者无毒的。在本实施方式的另一个方面，所述细菌或BTP是治疗性的。在该实施方式的另一方面，所述细菌或BTP是选自但不限于以下的减毒株或其衍生物：耶尔森氏菌、立克次氏体、军团菌、布鲁氏菌、分枝杆菌、螺旋菌、嗜血菌(Haemophilus)、考克斯菌、衣原体、奈瑟氏菌、伯克霍尔德氏菌、包特氏菌、布鲁氏菌、李斯特菌、志贺氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、卟啉菌、螺旋体、弧菌、大肠埃希氏菌和双歧杆菌。任选地，所述耶尔森氏菌是假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)种的减毒株。任选地，所述耶尔森氏菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌种的减毒株。任选地，所述立克次氏体菌株是Rickettsia coronii种的减毒株。任选地，所述军团菌菌株是嗜肺性军团菌(Legionella pneumophilia)种的减毒株。任选地，所述分支杆菌菌株是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)种的减毒株。任选地，所述分支杆菌菌株是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG种的减毒株。任选地，所述螺杆菌菌株是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)种的减毒株。任选地，所述考克斯菌菌株是贝氏考克斯菌(Coxiella burnetti)的减毒株。任选地，所述嗜血菌菌株是流感嗜血菌(Haemophilus influenza)种的减毒株。任选地，所述衣原体菌株是砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)种的减毒株。任选地，所述衣原体菌株是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)种的减毒株。任选地，所述奈瑟氏菌菌株是淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)种的减毒株。任选地，所述奈瑟氏菌菌株是脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)种的减毒株。任选地，所述伯克霍尔德氏菌菌株是洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkolderia cepacia)种的减毒株。任选地，所述包特氏菌菌株是百日咳包特氏菌(Bordetella pertussis)种的减毒株。任选地，所述布鲁氏菌菌株是Borrelia hermisii种的减毒株。任选地，所述李斯特菌菌株是单核细胞增生李斯特菌种的减毒株。任选地，所述李斯特菌菌株是伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)种的减毒株。任选地，所述沙门氏菌菌株是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)种的减毒株。任选地，所述沙门氏菌菌株是鼠伤寒沙门氏菌种的减毒株。任选地，所述鼠伤寒沙门氏菌菌株是SL 7207或VNP20009。任选地，所述葡萄球菌菌株是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)种的减毒株。任选地，所述链球菌菌株是化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)种的减毒株。任选地，所述链球菌菌株是变形链球菌(Streptococcus mutans)种的减毒株。任选地，所述链球菌菌株是唾液链球菌(Streptococcus salivarius)种的减毒株。任选地，所述链球菌菌株是肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)种的减毒株。任选地，所述卟啉菌菌株是牙龈卟啉菌种的减毒株。任选地，所述假单胞菌菌株是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)种的减毒株。任选地，所述螺旋体菌株是梅毒螺旋体(Treponemapallidum)种的减毒株。任选地，所述弧菌菌株是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)种的减毒株。任选地，所述大肠埃希氏菌菌株为MM294。
以下列出的是已在文献中描述具有天然侵袭性的细菌的实例(第1.1部分)、文献中描述为天然不具有侵袭性的细菌(第1.2部分)以及天然的不致病的或者减毒的细菌。虽然已经描述一些细菌不具有侵袭性(第1.2部分)，但这些细菌可能仍然具有足以用于本发明的侵袭性。不论通常描述的具有天然侵袭性的细菌或不具有侵袭性的细菌，任何细菌菌株都可以经修饰而调节尤其是提高其侵袭特性(例如在第1.3部分的描述)。
1.1天然具有侵袭性的细菌
在本发明中使用的具体天然侵袭性细菌对本发明并不重要。此天然存在的具有侵袭性的细菌包括，但不限于志贺氏菌、沙门氏菌、李斯特菌、立克次氏体和肠侵袭性大肠埃希氏菌。
所采用的具体志贺氏菌菌株对本发明并不重要。可在本发明中使用的志贺氏菌菌株的实例包括福氏志贺氏菌2a(ATCC No.29903)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)(ATCC No.29930)和痢疾志贺氏菌(Shigella disenteriae)(ATCC No.13313)。本发明优选使用减毒的志贺氏菌株，例如福氏志贺氏菌2a 2457T aroA virG突变体CVD 1203(Noriega et al.见上文)、福氏志贺氏菌M90T icsA突变体(Goldberg et al.Infect.Immun.，62：5664-5668(1994))、福氏志贺氏菌Y SFL114 aroD突变体(Karnell et al.Vacc.，10：167-174(1992))和福氏志贺氏菌aroA aroD突变体(Verma et al.Vacc.，9：6-9(1991))。或者，也可以通过引入单个减毒突变或者引入所述单个减毒突变与一个或多个其他减毒突变的组合而构建新的减毒志贺氏菌株。
志贺氏菌细菌作为递送载体的至少一个优势是其对结肠粘膜表面的淋巴组织的趋向性。此外，认为志贺氏菌复制的主要位点在常见于粘膜淋巴组织的M细胞基部侧面的树突细胞和巨噬细胞内(McGhee，J.R.et al.(1994)Reproduction，Fertility，& Development 6：369；Pascual，D.W.et al.(1994)Immunomethods 5：56的综述)。因此，志贺氏菌载体可提供靶向RNA干扰或递送治疗分子至这些专门的抗原呈递细胞的方式。志贺氏菌载体的另一个优势在于减毒的志贺氏菌株在体外和体内递送核酸报告基因(Sizemore，D.R.etal.(1995)Science 270：299；Courvalin，P.et al.(1995)Comptes Rendus de lAcademie des Sciences Serie III-Sciences de la Vie-Life Sciences 318：1207；Powell，R.J.et al.(1996)In：Molecular approaches to the control of infectiousdiseases.F.Brown，E.Norrby，D.Burton and J.Mekalanos，eds.Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York.183；Anderson，R.J.et al.(1997)Abstractsfor the 97th General Meeting of the American Society for Microbiology：E.)。在实用方面，志贺氏菌严格受限的宿主特异性能够防止志贺氏菌载体通过中间宿主向食物链内扩散。此外，已经开发出了在啮齿动物、灵长类和志愿者体内高度减毒的减毒株(Anderson et al.(1997)见上文；Li，A.et al.(1992)Vaccine 10：395；Li，A.et al.(1993)Vaccine 11：180；Karnell，A.et al.(1995)Vaccine 13：88；Sansonetti，P.J.and J.Arondel(1989)Vaccine 7：443；Fontaine，A.et al.(1990)Research in Microbiology 141：907；Sansonetti，P.J.et al.(1991)Vaccine 9：416；Noriega，F.R.et al.(1994)Infection & Immunity 62：5168；Noriega，F.R.et al.(1996)Infection & Immunity 64：3055；Noriega，F.R.et al.(1996)Infection & Immunity 64：23；Noriega，F.R.et al.(1996)Infection &Immunity 64：3055；Kotloff，K.L.et al.(1996)Infection & Immunity 64：4542)。最后一项知识允许开发在人中使用的良好耐受的志贺氏菌载体。
已经通过非特异性诱变，利用如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍试剂的化学方法，或者利用重组DNA技术；经典遗传技术，例如Tn10诱变、P22-介导的转导、λ噬菌体介导的交换(crossover)和接合转移；或者利用重组DNA技术的定点诱变，将减毒突变引入至细菌病原体中。由于通过重组DNA技术构建的菌株更为确定，因此优选重组DNA技术。此类减毒突变的实例包括，但不限于：
(i)营养缺陷型突变，例如aro(Hoiseth et al.Nature，291：238-239(1981))，gua(McFarland et al.Microbiol.Path.，3：129-141(1987))，nad(Park et al.J.Bact.，170：3725-3730(1988)，thy(Nnalue et al.Infect.Immun.，55：955-962(1987))和asd(Curtiss，见上文)突变；
(ii)使整体调节功能失活的突变，例如cya(Curtiss et al.Infect.Immun.，55：3035-3043(1987))，crp(Curtiss et al(1987)，见上文)，phoP/phoQ(Groisman et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：7077-7081(1989)；and Miller etal.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：5054-5058(1989))，phopc(Miller et al.J.Bact.，172：2485-2490(1990))或ompR(Dorman et al.Infect.Immun.，57：2136-2140(1989))突变；
(iii)改变胁迫应答的突变，例如recA(Buchmeier et al.Mol.Micro.，7：933-936(1993))，htrA(Johnson et al.Mol.Micro.，5：401-407(1991))，htpR(Neidhardt et al.Biochem.Biophys.Res.Com.，100：894-900(1981))，hsp(Neidhardt et al.Ann.Rev.Genet.，18：295-329(1984))和groEL(Buchmeier et al.Sci.，248：730-732(1990))突变；
(iv)特定毒力因子的突变，例如IsyA(Libby et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：489-493(1994))，pag或prg(Miller et al(1990)，见上文；and Miller etal(1989)，见上文)，iscA或virG(d′Hauteville et al.Mol.Micro.，6：833-841(1992))，plcA(Mengaud et al.Mol.Microbiol.，5：367-72(1991)；Camilli et al.J.Exp.Med，173：751-754(1991))和act(Brundage et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11890-11894(1993))突变；
(v)影响DNA拓扑学的突变，例如topA(Galan et al.Infect.Immun.，58：1879-1885(1990))；
(vi)打断或改变细胞周期的突变，例如min(de Boer et al.Cell，56：641-649(1989))；
(vii)引入编码自杀系统的基因，例如sacB(Recorbet et al.App.Environ.Micro.，59：1361-1366(1993)；Quandt et al.Gene，127：15-21(1993))，nuc(Ahrenholtz et al.App.Environ.Micro.，60：3746-3751(1994))，hok，gef，kil或phlA(Molin et al.Ann.Rev.Microbiol.，47：139-166(1993))；
(viii)改变脂多糖和/或脂质A的生物发生的突变，例如rFb(Raetz inEsherishia coli and Salmonella typhimurium，Neidhardt et al.，Ed.，ASM Press，Washington D.C.pp 1035-1063(1996))，galE(Hone et al.J.Infect.Dis.，156：164-167(1987))和htrB(Raetz，见上文)、msbB(Reatz，见上文)；
(ix)引入噬菌体裂解系统，例如P22编码的溶素原(Rennell et al.Virol，143：280-289(1985))，λ胞壁质糖基转移酶(Bienkowska-Szewczyk et al.Mol.Gen.Genet.，184：111-114(1981))或S-基因(Reader et al.Virol，43：623-628(1971))；和
所述减毒突变可以为组成型表达或者受诱导型启动子的控制，例如温度敏感性热休克蛋白家族的启动子(Neidhardt et al.见上文)，或者厌氧诱导的nirB启动子(Harborne et al.Mol.Micro.，6：2805-2813(1992))或者阻遏型启动子，例如uapA(Gorfinkiel et al.J.Biol.Chem.，268：23376-23381(1993))或gcv(Stauffer et al.J.Bact.，176：6159-6164(1994))。
所采用的具体李斯特菌菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的李斯特菌菌株的实例包括单核细胞增生李斯特菌(ATCC No.15313)。在本发明中优选使用减毒的李斯特菌菌株，例如单核细胞增生李斯特菌actA突变体(Brundage et al.见上文)或单核细胞增生李斯特菌plcA(Camilli et al.J.Exp.Med.，173：751-754(1991))。或者，可以如以上对志贺氏菌的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒李斯特菌菌株。
所采用的具体沙门氏菌菌株对本发明并不重要。可以在本发明中使用的沙门氏菌菌株的实例包括伤寒沙门氏菌(ATCC No.7251)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)(ATCC No.13311)。在本发明中优选使用减毒的沙门氏菌菌株，其包括S.typhi-aroC-aroD(Hone et al.Vacc.9：810(1991)和鼠伤寒沙门氏菌-aroA突变体(Mastroeni et al.Micro.Pathol.13：477(1992))。或者，可以如以上对志贺氏菌菌种描述，通过引入一个或多个减毒突变而构建新的减毒沙门氏菌菌株。
所采用的具体立克次氏体菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的立克次氏体菌株的实例包括立氏立克次氏体(Rickettsia Rickettsiae)(ATCCNos.VR149和VR891)、Ricketsia prowaseckii(ATCC No.VR233)、恙虫病立克次氏体(Rickettsia tsutsugamuchi)(ATCC Nos.VR312、VR150和VR609)、莫氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)(ATCC No.VR144)、西伯利亚立克次氏体(Rickettsia sibirica)(ATCC No.VR151)和五日热立克次氏体(Rochalimaeaquitana)(ATCC No.VR358)。在本发明中优选使用减毒的立克次氏体菌株，并且可以如以上对志贺氏菌菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体肠侵袭性埃希氏菌菌株对本发明并不重要。在本发明中可以使用的肠侵袭性埃希氏菌菌株的实例包括大肠埃希氏菌4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和6-81(Sansonetti et al.Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur)，132A：351-355(1982))。在本发明中优选使用减毒的肠侵袭性埃希氏菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
此外，由于除细菌外的某些微生物还能够与用于细胞摄取的整合素分子(其为某些侵袭因子的受体)相互作用，这些微生物也可以用于向靶细胞中引入RNA。例如，与整合素分子相互作用的诸如口足病病毒、艾柯病毒和腺病毒的病毒，以及诸如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)和硕大利什曼原虫(Leishmania major)的真核病原体。
1.2侵袭性较小的细菌
本发明中可以使用的，已经在文献中描述为不具有侵袭性或者至少比上文第1.1部分列出的细菌的侵袭性小的细菌的实例包括，但不限于耶尔森氏菌、埃希氏菌(Escherichia spp.)、克雷伯菌(Klebsiella spp.)、包特氏菌、奈瑟氏菌、气单胞菌(Aeromonas spp.)、弗朗西斯菌(Franciesella spp.)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter spp.)、衣原体、嗜血杆菌(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌、分枝杆菌、军团菌、红球菌(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、螺杆菌、弧菌、杆菌(Bacillus spp.)和丹毒丝菌(Erysipelothrix spp)。可能必须对这些细菌进行修饰以提高其侵袭潜能。
所采用的具体耶尔森氏菌株对本发明并不重要。可以在本发明中使用的耶尔森氏菌株的实例包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(ATCC No.9610)或鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)(ATCC No.19428)。在本发明中优选使用减毒的耶尔森氏菌株，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌Ye03-R2(al-Hendy et al.Infect.Immun.，60：870-875(1992))或小肠结肠炎耶尔森氏菌aroA(O′Gaora etal.Micro.Path.，9：105-116(1990))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒耶尔森氏菌株。
所采用的具体埃希氏菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的埃希氏菌株的实例包括大肠埃希氏菌Nissle 1917、MM294、H10407(Elinghorst etal.Infect.Immun.，60：2409-2417(1992))和大肠埃希氏菌EFC4、CFT325和CPZ005(Donnenberg et al.J.Infect.Dis.，169：831-838(1994))。在本发明中优选使用减毒的埃希氏菌株，例如减毒的火鸡病原体大肠埃希氏菌02 carAB突变体(Kwaga et al.Infect.Immun.，62：3766-3772(1994))或CEQ201。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒埃希氏菌株。
所采用的具体克雷伯菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的克雷伯菌株的实例包括肺炎克雷伯菌(ATCC No.13884)。在本发明中优选使用减毒的克雷伯菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体包特氏菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的包特氏菌菌株的实例包括支气管炎包特氏菌(ATCC No.19395)。在本发明中优选使用减毒的包特氏菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体奈瑟氏菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的奈瑟氏菌菌株的实例包括脑膜炎奈瑟氏菌(ATCC No.13077)和淋病奈瑟氏菌(ATCC No.19424)。本发明优选使用减毒的奈瑟氏菌菌株，例如淋病奈瑟氏菌MS11 aro突变体(Chamberlain et al.Micro.Path.，15：51-63(1993))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒奈瑟氏菌菌株。
所采用的具体气单胞菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的气单胞菌株的实例包括嗜矿泉气单胞菌(A.eucrenophila)(ATCC No.23309)。或者，可以如以上对志贺氏菌种描述，通过引入(i)至(vii)组中一个或多个减毒突变而构建新的减毒气单胞菌株。
所采用的具体弗朗西斯菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的弗朗西斯菌株的实例包括土拉热弗朗西斯菌(F.tularensis)(ATCC No.15482)。在本发明中优选使用减毒的弗朗西斯菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体棒状杆菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的棒状杆菌菌株的实例包括假结核棒状杆菌菌(C.pseudotuberculosis)(ATCC No.19410)。在本发明中优选使用减毒的棒状杆菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体柠檬酸杆菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的柠檬酸杆菌菌株的实例包括弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)(ATCC No.8090)。在本发明中优选使用减毒的柠檬酸杆菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体衣原体菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的衣原体菌株的实例包括肺炎衣原体(ATCC No.VR1310)。在本发明中优选使用减毒的衣原体菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体嗜血杆菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的嗜血杆菌菌株的实例包括H.sornnus(ATCC No.43625)。在本发明中优选使用减毒的嗜血杆菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体布鲁氏菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的布鲁氏菌菌株的实例包括牛布鲁氏菌(B.abortus)(ATCC No.23448)。在本发明中优选使用减毒的布鲁氏菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体分支杆菌菌株对本发明并不重要。可以在本发明中使用的分支杆菌菌株的实例包括胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(ATCC No.13950)和结核性分枝杆菌(M.tuberculosis)(ATCC No.27294)。在本发明中优选使用减毒的分支杆菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体军团菌菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的军团菌菌株的实例包括嗜肺军团菌(L.pneumophila)(ATCC No.33156)。在本发明中优选使用减毒的军团菌菌株，例如嗜肺军团菌mip突变体(Ott，FEMS Micro.Rev.，14：161-176(1994))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒军团菌菌株。
所采用的具体红球菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的红球菌菌株的实例包括马红球菌(R.equi)(ATCC No.6939)。在本发明中优选使用减毒的红球菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体假单胞菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的假单胞菌菌株的实例包括铜绿假单胞菌(ATCC No.23267)。在本发明中优选使用减毒的假单胞菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体螺杆菌菌株对本发明并不重要。本发明中可以使用的螺杆菌菌株的实例包括雪貂螺杆菌(H.mustelae)(ATCC No.43772)。在本发明中优选使用减毒的螺杆菌菌株，并且可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建所述菌株。
所采用的具体沙门氏菌菌株对本发明并不重要。可以在本发明中使用的沙门氏菌菌株的实例包括伤寒沙门氏菌(ATCC No.7251)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.13311)。本发明优选使用减毒的沙门氏菌菌株，并且所述菌株包括鼠伤寒沙门氏菌aroC aroD(Hone et al.Vacc.，9：810-816(1991))和鼠伤寒沙门氏菌aroA突变体(Mastroeni et al.Micro.Pathol，13：477-491(1992)))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒沙门氏菌菌株。
所采用的具体弧菌菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的弧菌菌株的实例包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(ATCC No.14035)和辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis)(ATCC No.35912)。本发明优选使用减毒的弧菌菌株，所述菌株包括霍乱弧菌RSI毒性突变体(Taylor et al.J.Infect.Dis.，170：1518-1523(1994))和霍乱弧菌ctxA、ace、zot、cep突变体(Waldor et al.J.Infect.Dis.，170：278-283(1994))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒的弧菌菌株。
所采用的具体杆菌菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的杆菌菌株的实例包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC No.6051)。本发明优选使用减毒的杆菌菌株，并且所述菌株包括炭疽杆菌(B.anthracis)突变体pX01(Welkos et al.Micro.Pathol，14：381-388(1993))和减毒的BCG菌株(Stover et al.Nat.，351：456-460(1991))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒杆菌菌株。
所采用的具体丹毒丝菌菌株对本发明并不重要。本发明可以使用的丹毒丝菌菌株的实例包括猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(ATCC No.19414)和扁桃体丹毒丝菌(Erysipelothrix tonsillarum)(ATCC No.43339)。本发明优选使用减毒的丹毒丝菌菌株，并且所述菌株包括猪丹毒丝菌Kg-1a和Kg-2(Watarai et al.J.Vet.Med.Sci.，55：595-600(1993))和猪丹毒丝菌ORVAC突变体(Markowska-Daniel et al.Int.J.Med.Microb.Virol.Parisit.Infect.Dis.，277：547-553(1992))。或者，可以如以上对志贺氏菌种的描述，通过引入(i)至(vii)组中的一个或多个减毒突变而构建新的减毒丹毒丝菌菌株。
1.3.提高细菌菌株的侵袭性质的方法
无论是传统意义上的侵袭性生物还是非侵袭性生物，这些生物都可以例如通过模仿志贺氏菌、李斯特菌、立克次氏体或肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭性质而对其进行工程加工以提高其侵袭性质。例如，可以向微生物中引入能够使所述微生物进入细胞(例如所述非侵袭性细菌的天然宿主的细胞)的细胞质中的一个或多个基因。
在本文称为“细胞质靶向基因”的此类基因的实例包括编码能够使志贺氏菌侵袭的蛋白的基因，或者肠侵袭性埃希氏菌的类似侵袭基因或者李斯特菌的李斯特菌溶素O，因此，已知此类技术使多种侵袭性细菌能够侵袭并进入动物细胞的细胞质(Formal et al.Infect.Immun.，46：465(1984)；Bielecke etal.Nature，345：175-176(1990)；Small et al.In：Microbiology-1986，pages121-124；Levine et al.Eds.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1986)；Zychlinsky et al.Molec.Micro.，11：619-627(1994)；Gentschev etal.(1995)Infection & Immunity 63：4202；Isberg，R.R.and S.Falkow(1985)Nature 317：262；和Isberg，R.R. et al.(1987)Cell 50：769)。用于将以上细胞质靶向基因转入细菌菌株的方法是本领域熟知的。可以引入细菌以提高其侵袭性质的另一个优选基因编码来自假结核耶尔森氏菌的侵袭素蛋白(Leong et al.EMBO J.，9：1979(1990))。可以将侵袭素和李斯特菌溶素组合引入，由此进一步提高所述细菌相对于单独引入这些基因时的侵袭性质。以上基因的描述是出于示例目的，然而，来自一个或多个来源的参与将来自微生物的分子(尤其是RNA或编码RNA的DNA分子)递送至细胞(例如动物细胞)的细胞质的任意基因或基因组合都可以满足本发明，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，此基因并不限于细菌基因，并且包括病毒基因，例如促进内渗裂解(endosmolysis)的流感病毒血凝素HA-2(Plank et al.J.Biol.Chem.，269：12918-12924(1994))。
可以通过例如从携带期望的细胞质靶向基因的侵袭细菌分离的DNA进行PCR扩增，从而获得上述细胞质靶向基因。可以根据本领域可得的，例如从以上列出的文献和/或GenBank(可从因特网上公开获得，www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的核苷酸序列设计PCR用引物。可以设计PCR引物以扩增细胞质靶向基因、细胞质靶向操纵子、细胞质靶向基因簇或者细胞质靶向基因的调节子。所采用的PCR策略将取决于靶标侵袭细菌中的一个或多个细胞质靶向基因的遗传构造。所述PCR引物经设计包含与靶DNA序列的开始和末端DNA序列同源的序列。然后，可以将所述细胞质靶向基因引入至靶细菌株，例如通过使用Hfr转移或者质粒迁移(Miller，A Short Coursein Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1992)；Bothwell et al.见上文；and Ausubel et al.见上文)，噬菌体介导的转导(de Boer，见上文；Miller，见上文；and Ausubel et al.见上文)，化学转化(Bothwell et al.见上文；Ausubel et al.见上文)，电穿孔(Bothwel et al.见上文；Ausubel et al.见上文；and Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)和物理转化技术(Johnston et al.见上文；and Bothwell，见上文)。可以将所述细胞质靶向基因引入至溶原性噬菌体中(de Boer et al.Cell，56：641-649(1989))、质粒载体中(Curtiss et al.见上文)或者剪接至靶菌株的染色体中(Hone et al.见上文)。
除了遗传加工细菌和BTP以提高其侵袭性质外，如上文所述，还可以通过将侵袭因子连接至细菌而对其进行修饰。因此，在一个实施方式中，通过用侵袭因子例如蛋白侵袭素、侵袭素衍生物或者其足以进行侵袭性的片段共价或非共价地包被细菌而使所述细菌具有更高的侵袭性。事实上，已经证明用从假结核耶尔森氏菌纯化的侵袭素，或者侵袭素的羧基末端192个氨基酸包被的非侵袭性细菌细胞能够进入哺乳动物细胞(Leong et al.(1990)EMBO J.9：1979)。此外，用侵袭素的羧基末端区域包被的乳胶珠被哺乳动物细胞有效内化；与此类似，用抗体固定化侵袭素包被的金黄色葡萄球菌菌株也被哺乳动物细胞有效内化(Isberg and Tran van Nhieu(1994)Ann.Rev.Genet.27：395中综述)。或者，还可以用抗体、其变体或其片段包被细菌，其中所述抗体、其变体或其片段特异性地结合细菌进入因子识别的表面分子。例如，已经证明，如果用靶向整合素分子(例如α5β1，已知为与细菌侵袭素蛋白相互作用的表面分子)的单克隆抗体包被细菌，则所述细菌被内化。可以根据本领域已知的方法制备此抗体。根据上文所述的方法，可以通过例如用抗体包被细菌，使所述细菌接触具有所述抗体识别的表面受体的真核细胞，并监测细胞内细菌的存在，来测定所述抗体在介导细菌侵袭性中的功效。使侵袭因子与细菌表面相连的方法是本领域已知的，并且包括交联。
3.质粒和载体
本发明还提供了包含编码一个或多个siRNA的至少一个DNA分子和至少一个启动子的至少一个载体或质粒，其中所表达的siRNA干扰目标基因的至少一个mRNA。在一个优选的实施方式中，本发明提供了包含编码一个或多个siRNA的至少一个DNA分子和与RNA聚合酶III兼容的至少一个启动子或至少一个原核启动子的至少一个原核载体，其中所表达的siRNA干扰目标基因的至少一个mRNA。
本发明的TRIP(transkingdom RNA干扰质粒)载体和质粒包含多克隆位点、启动子序列和终止子序列。所述TRIP载体和质粒还包含编码侵袭因子的一个或多个序列以允许非侵袭性细菌或BTP进入哺乳动物细胞(例如编码允许细菌或BTP进入β1-整合素阳性的哺乳动物细胞的侵袭物的Inv基因座)(Young et al.，J.Cell Biol.116，197-207(1992))和允许遗传物质逃离进入小泡的一个或多个序列(例如编码李斯特菌溶素O的Hly A基因)(Mathew et al.，Gene Ther.10，1105-1115(2003)and Grillot-Courvalin et al.，Nat.Biotechnol.16，862-866(1998))。在PCT公开WO 06/066048中进一步描述了TRIP(包含载体/质粒示意图)。在优选的实施方式中，所述TRIP载体和质粒中将引入在适当启动子序列和终止子序列控制之下编码短发夹RNA的发夹RNA表达盒。
在这些构建体的设计中，利用算法以顾及siRNA开发中的一些已知难点，即：(1)排除不合格性质(SNP、干扰素基序)；(2)如果与ref seq(19/21，与其它任何基因相隔＞17)具有同源性，则排除所述序列，和(3)如果具有显著的miRNA种型匹配，则排除所述序列。
如本文所述，在真核靶细胞中转录，或者在细菌或BTP中转录编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子。
在DNA在真核细胞中转录的实施方式中，所述一个或多个siRNA在真核细胞中被转录为shRNA。所述真核细胞可以是体内的、体外的或离体的。在本实施方式的一方面，编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子包含真核启动子。任选地，所述真核启动子是RNA聚合酶III启动子。任选地，所述RNA聚合酶III启动子是U6启动子或H1启动子。
在DNA在细菌或BTP中转录的实施方式中，所述一个或多个DNA分子包含原核启动子。任选地，所述原核启动子是大肠埃希氏菌启动子。优选地，所述大肠埃希氏菌启动子可以为T7启动子、lacUV5启动子、经修饰的lacUV5启动子、RNA聚合酶启动子、gapA启动子、pA1启动子、lac调节的启动子、araC+ParaBAD启动子、T5启动子、Ptac启动子(Estrem et al，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，9761-9766；Meng et al.，2001，Nucleic Acids Res.29，4166-417；De Boer et al.，1983，Proc.NatL Acad.Sci.USA 80，21-25)或者recA启动子。
优选地，启动子序列列于表1中。
表1
Figure BPA00001372421100271
在所述DNA在细菌或BTP中转录的实施方式中，所述大肠埃希氏菌启动子与终止子相连。优选地，所述大肠埃希氏菌终止子可以是T7终止子、lacUV5终止子、不依赖Rho的终止子、Rho-依赖性终止子或者RNA聚合酶终止子。
优选地，将终止子序列列于表2。
表2
Figure BPA00001372421100282
在其它实施方式中，本发明的载体和质粒进一步包含一个或多个增强子序列、选择标记或裂解调节系统序列。
在本发明的一方面，所述一个或多个DNA分子包含原核增强子。任选地，所述原核增强子为T7增强子。任选地，所述T7增强子具有序列GAGACAGG(SEQ ID NO：22)。在该实施方式的另一个方面，所述一个或多个DNA分子包含原核终止子。
在本发明的另一方面，所述一个或多个DNA分子与一个或多个选择标记相连。在该实施方式的一个方面，所述选择标记是含有一个或多个突变的琥珀抑制因子或含有一个或多个突变的二氨基庚二酸(DAP)。任选地，所述诱饵基因选自，但不限于dapA和dapE。
优选地，将选择标记的序列列于表3。
表3
Figure BPA00001372421100291
Figure BPA00001372421100301
Figure BPA00001372421100311
任选地，所述琥珀抑制因子与启动子或终止子相连。任选地，所述启动子为脂蛋白启动子。优选地，启动子序列列于表4中。
表4
Figure BPA00001372421100312
任选地，所述终止子是rrnC终止子。优选地，终止子序列列于表5中。
表5
  琥珀抑制因子的终止子序列   序列 SEQ ID NO：
  rrnC终止子   GATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTAC 30
  rrnC终止子   GATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTTT 31
细菌和BTP递送比病毒递送更有吸引力，原因是细菌和BTP更易于进行产生针对特定应用特异剪裁的载体株的遗传操控。在本发明的一个实施方式中，本发明的方法用于产生以组织特异性方式引起RNAi的细菌和BTP。
通过活化机制从细胞内细菌或BTP释放编码siRNA的质粒或一个或多个siNRA。一个机制涉及鼠伤寒沙门氏菌中的III型输出系统，这是跨越细菌或BTP细胞膜的专门的多蛋白复合体，其功能包括向细胞外分泌毒力因子以允许向靶细胞传导信号，但也可以将其用于通过细菌裂解以及细菌或BTP内容物向细胞质中的释放向靶细胞中递送抗原(Rüssmann H.Int J MedMicrobiol，293：107-12(2003))。通过多种机制触发细胞内细菌或BTP的裂解，所述机制包括加入细胞内活性抗生素(四环素)，天然地通过细菌代谢减毒(营养缺陷型)，或者通过包含细菌调节子、启动子和对环境(例如pH、镁浓度、磷酸盐浓度、三价铁离子浓度、渗透摩尔浓度、无氧条件、营养缺乏和靶细胞或宿主吞噬体的基本胁迫)敏感的传感蛋白的裂解调节系统或者细菌自杀系统。当所述细菌或BTP裂解调节系统检测到一个或多个以上环境条件时，通过一个或多个机制触发细菌或BTP裂解，所述机制包括但不限于由所述细菌或BTP天然表达或通过修饰表达的抗微生物蛋白、噬菌体细胞溶解素和自细胞溶解素，或者通过由所述细菌或BTP天然表达或通过修饰(例如遗传修饰)表达孔形成蛋白，其破坏含有细菌或BTP的吞噬体并释放编码siRNA的质粒或者一个或多个siRNA。
裂解调节系统的调节子可选自包括但不限于OmpR、ArcA、PhoP、PhoB、Fur、RstA、EvgA和RpoS的组。优选地，裂解调节子的序列列于表6中。
表6
Figure BPA00001372421100321
Figure BPA00001372421100331
裂解调节系统的启动子可以选自包括但不限于ompF、ompC、fadB、phoPQ、mgtA、mgrB、psiB、phnD、Ptrp、sodA、sodB、sltA、sltB、asr、csgD、emrKY、yhiUV、acrAB、mdfA和tolC的组。优选地，裂解调节系统的启动子序列列于表7中。
表7
Figure BPA00001372421100332
Figure BPA00001372421100341
裂解调节系统的传感蛋白可以选自包括但不限于EnvZ、ArcB、PhoQ、PhoR、RstB和EvgS的组。优选地，裂解调节系统传感蛋白的序列列于表8。
表8
Figure BPA00001372421100342
Figure BPA00001372421100351
Figure BPA00001372421100361
所述裂解调节系统可以包含上述一个或多个以上调节子、启动子和传感蛋白的任意组合。
在该实施方式的一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的OmpR、作为启动子的ompF和作为传感蛋白的EnvZ，并且所述刺激是降低的渗透摩尔浓度。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的OmpR、作为启动子的ompC和作为传感蛋白的EnvZ，并所述刺激是降低的渗透摩尔浓度。
在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的ArcA、作为启动子的fad和作为传感蛋白的Arc B，并且所述刺激是无氧条件。
在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的PhoP、作为启动子的phoPQ和作为传感蛋白的PhoQ，所述刺激是降低的镁浓度。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的PhoP、作为启动子的mgtA和作为传感蛋白的PhoQ，所述刺激是降低的镁浓度。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的PhoP、作为启动子的mgrB和作为传感蛋白的PhoQ，所述刺激是降低的镁浓度。
在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的PhoB、作为启动子的psiB和作为传感蛋白的PhoR，所述刺激是降低的磷酸盐浓度。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的PhoB、作为启动子的phnD和作为传感蛋白的PhoR，所述刺激是降低的磷酸盐浓度。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的RstA、作为启动子的asr和作为传感蛋白的RstB。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的RstA、作为启动子的csgD和作为传感蛋白的RstB。
在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的EvgA、作为启动子的emrKY和作为传感蛋白的EvgS。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的EvgA、作为启动子的yhiUV和作为传感蛋白的EvgS。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的EvgA、作为启动子的acrAB和作为传感蛋白的EvgS。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的EvgA、作为启动子的mdfA和作为传感蛋白的EvgS。在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的EvgA、作为启动子的tolC和作为传感蛋白的EvgS。
在该实施方式的另一个实例中，所述裂解调节系统包含作为调节子的Fur以及选自包含sodA、sodB、sltA或sltB的组的启动子。
所述抗微生物蛋白可选自包括但不限于α-防卫素和β-防卫素、protegrins、cathelicidin(如indolicidin和bactenecin)、颗粒溶素、溶菌酶、乳铁蛋白、天青杀素(azurocidin)、弹性蛋白酶、细菌通透性诱导肽(BPI)、肾上腺髓质素、brevinin、富组蛋白(histatin)和铁调素的组。其它抗微生物蛋白公开于以下文献中，其均通过引用全文并入本文：Devine，D.A.et al.，Current PharmaceuticalDesign，8，703-714(2002)；Jack R.W.，et al.，Microbiological Reviews，59(2)，171-200(June 1995)。
任选地，所述抗微生物蛋白是α-防卫素、β-防卫素或protegrin。优选地，抗微生物蛋白的序列列于表9中。
表9
Figure BPA00001372421100371
Figure BPA00001372421100381
Figure BPA00001372421100391
Figure BPA00001372421100401
所述噬菌体细胞溶解素可选自包括但不限于穿孔素和细胞内溶素或细胞溶解素(例如溶菌酶、酰胺酶和转糖基酶)的组。其它细胞溶解素公开于以下文献中，其均通过引用全文并入本文：Kloos D.-U.，et al.，Journal ofBacteriology，176(23)，7352-7361(December 1994)；Jain V.，et al.，Infection andImmunity，68(2)，986-989(February 2000)；Srividhya K.V.，et al.，J.Biosci.，32，979-990(2007)；Young R.V.，Microbiological Reviews，56(3)，430-481(September 1992)。
所述自细胞溶解素可以选自包括但不限于肽聚糖水解酶、酰胺酶(例如N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶)、转糖基酶、肽链内切酶和氨基葡糖苷酶的组。其它自细胞溶解素公开于以下文献中，其均通过引用全文并入本文：Heidrich C.，et al.，Molecular Microbiology，41(1)，167-178(2001)；Kitano K.，etal.，Journal of Bacteriology，167(3)，759-765(September 1986)；Lommatzsch J.，et al.，Journal of Bacteriology，179(17)，5465-5470(September 1997)；Oshida T.，et al.，PNAS，92，285-289(January 1995)；Lenz L.L.，et al.，PNAS，100(21)，12432-12437(October 14，2003)；Ramadurai L.，et al.，Journal of Bacteriology，179(11)，3625-3631(June 1997)；Kraft A.R.，et al.，Journal of Bacteriology，180(12)，3441-3447(July 1998)；Dijkstra A.J.，et al.，FEBS Letters，366，115-118(1995)；Huard C.，et al.，Microbiology，149，695-705(2003)。
在本发明的一方面，可以通过细菌或BTP菌株特异性调节而进一步增强所述裂解调节系统发挥的控制作用。在该实施方式的一个方面，所述菌株特异性调节是由营养基因的删除引起的减毒作用。所述营养基因可以选自包括但不限于dapA、aroA和guaBA的组。在该实施方式的一个实例中，dapA减毒引起赖氨酸和肽聚糖的生物合成的缺陷。在该特定实施方式中，包括但不限于lysC的基因的转录可以被诸如转录诱导、抗终止和核糖开关(riboswitch)的机制所激活。在该实施方式的另一个实例中，aroA减毒引起芳族氨基酸的缺陷和诸如TrpR和TyrR的调节子对包括但不限于aroF、aroG和aroH的一个或多个基因的抑制。在该实施方式的另一个实例中，guaBA减毒引起由PurR抑制的一个或多个基因的抑制。
除了裂解调节系统和菌株特异性调节外，所述细菌或BTP可进一步包含包括但不限于Tet-on表达系统的诱导型系统以有利于细菌或BTP在临床医生所期望的时间裂解。在施用激活Tet-on启动子的四环素后，细菌或BTP表达触发细菌或BTP裂解的蛋白。在该实施方式的一个实例中，在Tet-on表达系统下表达的蛋白选自包括但不限于防卫素和protegrins的组。
本发明还提供了与菌株特异性减毒(例如营养减毒)结合的裂解调节系统。如PCT公开号WO2008/156702在图30所示，与存在过量营养以及应答饥饿的正调节子或负调节子的实验室培养不同，全局调节子可以感觉到细胞外环境并调节转录和体内特定营养(例如氨基酸)的饥饿。在PCT公开号WO2008/156702，图31所示的示意图中具有三个盒，其中任一个盒均可被置于细菌染色体上或者质粒上。
如所描述的，本发明提供了包含裂解调节系统的质粒以及对细菌裂解提供两个水平的控制的Tet-on表达系统，所述裂解调节系统包含作为调节子的OmpR、作为启动子的ompF或ompC和作为抗微生物蛋白的protegrin或β-防卫素。该实施方式示例于PCT公开号WO2008/156702的图32。
在本发明的另一个方面，所述DNA插入物包含一个或多个以下构建体，如表10所示，每一个构建体均包含HPV靶序列、发夹序列和便于引入到TRIP质粒的发夹RNA表达盒中的BamH1和Sal1限制性位点。
表10
Figure BPA00001372421100421
4.细胞和基因靶标
本发明还提供了使用本发明提供的多种细菌、BTP和载体的方法。例如，本发明提供了将一个或多个siRNA递送至哺乳动物细胞的方法。所述方法包括向哺乳动物细胞中引入至少一种侵袭性细菌或者至少一种细菌治疗颗粒(BTP)，其包含一个或多个siRNA或编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子。
本发明还提供了调节哺乳动物细胞中基因表达的方法。所述方法包括向哺乳动物细胞中引入至少一种侵袭性细菌或者至少一种细菌治疗颗粒(BTP)，其包含一个或多个siRNA或编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子，其中所表达的siRNA干扰目标基因的至少一个mRNA并由此调节基因表达。
本发明提供了用于将RNA递送至任何类型的靶细胞的方法。本文使用的术语“靶细胞”指细菌可以侵袭的细胞，即具有细菌识别所必需的表面受体的细胞。
优选的靶细胞是真核细胞。更优选的靶细胞是动物细胞。“动物细胞”定义为源自或存在于分类学位置在动物界内的多细胞生物的有核且不含叶绿体的细胞。所述细胞可以存在于完整动物、初级细胞培养物、外植体培养物或转化细胞系中。所述细胞的具体组织来源对本发明并不重要。
在本发明中使用的受体动物细胞对本发明并不重要，并且包括存在于或源自动物界内的所有生物(例如哺乳动物纲、鱼纲、鸟类、爬行动物纲的那些动物)的细胞。
优选的动物细胞是哺乳动物细胞，例如人、牛、绵羊、猪、猫、犬、山羊、马和灵长类的细胞。最优选的哺乳动物细胞是人细胞。所述细胞可以是体内的、体外的或离体的。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞是宫颈上皮细胞、直肠上皮细胞或咽上皮细胞，巨噬细胞，胃肠上皮细胞，皮肤细胞，黑素细胞，角化细胞，毛囊，结肠癌细胞，卵巢癌细胞，膀胱癌细胞，咽癌细胞，直肠癌细胞，前列腺癌细胞，乳腺癌细胞，肺癌细胞，肾癌细胞，胰腺癌细胞，肝细胞，肝细胞癌(HCC)细胞，神经细胞或诸如淋巴瘤细胞或白细胞的造血细胞。在该实施方式的一个方面，所述结肠癌细胞是SW480细胞。在该实施方式的另一个方面，所述胰腺癌细胞是CAPAN-1细胞。
在优选的实施方式中，所述靶细胞在粘膜表面内。某些肠内病原体，例如大肠埃希氏菌、志贺氏菌、李斯特菌和沙门氏菌天然适应于本申请，原因是这些生物具有结合并侵袭宿主粘膜表面的能力(Kreig et al.见上文)。因此，在本发明中，此类细菌可以递送RNA分子或编码RNA的DNA至宿主粘膜区室内的细胞中。
虽然某些类型的细菌可能具有某种趋向性，即优选靶细胞，可以通过选择对期望细胞类型具有趋向性的细菌，或者对细菌进行修饰而使其能够侵袭期望的细胞类型，而实现RNA或编码RNA的DNA分子至特定类型的细胞的递送。因此，如上文讨论的，例如可以对细菌进行遗传加工以模仿粘膜组织趋向性和侵袭性质，由此使所述细菌能够侵袭粘膜组织并将RNA或编码RNA的DNA递送至那些位点的细胞中。
还可以使细菌靶向其它类型的细胞。例如，可以通过修饰细菌以使其在其表面表达与人和灵长类的红细胞特异结合的间日疟原虫(Plasmodium vivax)网织红细胞结合蛋白-1和-2中任一者或两者，从而使所述细菌靶向人和灵长类的红细胞(Galinski et al.Cell，69：1213-1226(1992))。在另一个实施方式中，对细菌进行修饰以使其在其表面具有非唾液血清类粘蛋白(肝细胞上的无唾液酸糖蛋白受体的配体)(Wu et al.J.Biol.Chem.，263：14621-14624(1988))。在另一个实施方式中，用胰岛素-聚L-赖氨酸包被细菌，其中已经证明所述胰岛素-聚L-赖氨酸目的使具有胰岛素受体的细胞摄取质粒(Rosenkranz et al.Expt.Cell Res.，199：323-329(1992))。还包含在本发明范围内的是，经修饰以在其表面具有使其产生针对肝细胞的趋向性的单核细胞增生李斯特菌p60的细菌(Hess et al.Infect.Immun.，63：2047-2053(1995))，或者具有通过结合至肝素、硫酸肝素和胶原而引起与哺乳动物细胞外基质特异性结合的克氏锥虫的60kD表面蛋白的细菌(Ortega-Barria et al.Cell，67：411-421(1991))。
在另一个实施方式中，可以对细胞进行修饰以成为用于递送RNA的细菌的靶细胞。因此，可以对细胞进行修饰以表达供细菌识别以进入细胞的表面抗原，即侵袭因子的受体。可以通过向细胞中引入编码侵袭因子受体的核酸，从而使所述表面抗原在期望的条件下表达，而对所述细胞进行修饰。或者，可以用侵袭因子受体包被所述细胞。侵袭因子受体包括属于整合素受体超家族的蛋白。由多种细菌和其它微生物识别的整合素受体类型的列表可见于，例如Isberg and Tran Van Nhieu(1994)Ann.Rev.Genet.27：395。整合素亚基的核苷酸序列可见于，例如公众可从因特网上获得的GenBank。
如以上所阐述的，其它靶细胞包括鱼、鸟类和爬行动物细胞。对鱼、鸟类和爬行动物细胞天然具有侵袭性的细菌的实例列于下文。
天然能够进入鱼细胞的细胞质的细菌的实例包括，但不限于杀鲑气单胞菌(Aeromonas salminocida)(ATCC No.33658)和Aeromonas schuberii(ATCCNo.43700)。在本发明中优选使用减毒细菌，并且所述细菌包括杀鲑气单胞菌vapA(Gustafson et al.J.Mol.Biol.，237：452-463(1994))或杀鲑气单胞菌芳族依赖性突变体(Vaughan et al.Infect.Immun.，61：2172-2181(1993))。
天然能够进入鸟类细胞的细胞质的细菌的实例包括，但不限于鸡沙门氏菌(Salmonella galinarum)(ATCC No.9184)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteriditis)(ATCC No.4931)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.6994)。本发明优选减毒的细菌，并且所述细菌包括减毒的沙门氏菌菌株，例如鸡沙门氏菌cya crp突变体(Curtiss et al.(1987)见上文)或肠炎沙门氏菌aroA芳族依赖性突变体CVL30(Cooper et al.Infect.Immun.，62：4739-4746(1994))。
天然能够进入爬行动物细胞的细胞质的细菌的实例包括，但不限于鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.6994)。本发明优选减毒的细菌，并且所述减毒细菌包括减毒的菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌芳族依赖性突变体(Hormaeche et al.见上文)。
本发明还提供了RNA至其它真核细胞的递送，所述真核细胞为例如植物细胞，前提是存在能够侵袭(天然能够侵袭或者经过修饰后而具有侵袭性)此细胞的微生物。可以侵袭植物细胞的微生物的实例包括Agrobacteriumtumerfacium，其使用通过特异受体而与植物细胞结合的纤毛样结构，然后通过类似于细菌接合的过程将其至少一些内容物递送至所述植物细胞。
以下列出的是根据本发明方法可以向其中递送RNA的细胞系的实例。
人细胞系的实例包括，但不限于ATCC Nos.CCL 62、CCL 159、HTB151、HTB 22、CCL 2、CRL 1634、CRL 8155、HTB 61和HTB104。
牛细胞系的实例包括ATCC Nos.CRL 6021、CRL 1733、CRL 6033、CRL 6023、CCL 44和CRL 1390。
绵羊细胞系的实例包括ATCC Nos.CRL 6540、CRL 6538、CRL 6548和CRL 6546。
猪细胞系的实例包括ATCC Nos.CL 184、CRL 6492和CRL 1746。
猫细胞系的实例包括CRL 6077、CRL 6113、CRL 6140、CRL 6164、CCL 94、CCL 150、CRL 6075和CRL 6123。
水牛细胞系的实例包括CCL 40和CRL 6072。
犬细胞系的实例包括ATCC Nos.CRL 6213、CCL 34、CRL 6202、CRL6225、CRL 6215、CRL 6203和CRL 6575。
山羊衍生细胞系的实例包括ATCC No.CCL 73和ATCC No.CRL 6270。
马衍生细胞系的实例包括ATCC Nos.CCL 57和CRL 6583。
鹿细胞系的实例包括ATCC Nos.CRL 6193-6196。
灵长类衍生细胞系的实例包括来自黑猩猩的细胞系，例如ATCC Nos.CRL 6312、CRL 6304和CRL 1868；猴细胞系，例如ATCC Nos.CRL 1576、CCL 26和CCL 161；猩猩细胞系ATCC No.CRL 1850；和大猩猩细胞系ATCCNo.CRL 1854。
本发明还提供了调节一个或多个基因表达的方法。优选地，调节一个或多个基因表达表示降低或减少所述基因的表达和/或降低或减少所述基因的活性及其相应的基因产物。
在一个实施方式中，所表达的siRNA指导细胞的多酶复合体RISC(RNA诱导的沉默复合体)与待调节的mRNA相互作用。所述复合体使mRNA降解或者封存，从而引起基因表达的降低或抑制。
在一些实施方式中，所述基因为动物基因。优选的动物基因是哺乳动物基因，例如人、牛、绵羊、猪、猫、犬、山羊、马和灵长类基因。最优选的哺乳动物基因是人细胞。
待调节的基因可以是病毒基因、抗炎症基因、肥胖基因或自身免疫性疾病或病变的基因。在一些实施方式中，可由单个质粒或载体调节多于一个基因。
在优选的实施方式中，所述基因可以为，但不限于ras、β-连环蛋白、一个或多个HPV癌基因、APC、eotaxin-1(CCL11)、HER-2、MCP-1(CCL2)、MDR-1、MRP-2、FATP4、SGLUT-1、GLUT-2、GLUT-5、apobec-1、MTP、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-12、IL-13、IL-13 Ra-1、IL-18、IL-21R、IL-32α、IL-23的p19亚单位、LY6C、p38/JNK MAP激酶、p65/NF-κB、CCL20(MIP-3α)、Claudin-2、壳多糖酶3样1酶、apoA-IV、I型MHC和II型MHC。在该实施方式的一个方面，所述ras为k-Ras。在该实施方式的另一个方面，所述HPV癌基因是E6或E7。
优选的β-连环蛋白靶向基因序列列于表11。表11中的序列是跨物种的靶向序列，原因是其能够沉默人、小鼠、大鼠、犬和猴的β-连环蛋白基因(CTNNB1)。
表11
β-连环蛋白靶向基因序列 SEQ ID NO：
  AGCCAATGGCTTGGAATGAGA   55
  ATCAGCTGGCCTGGTTTGATA   56
  CTGTGAACTTGCTCAGGACAA   57
  AGCAATCAGCTGGCCTGGTTT   58
  CCTCTGTGAACTTGCTCAGGA   59
  TTCCGAATGTCTGAGGACAAG   60
  CCAATGGCTTGGAATGAGACT   61
  GGTGCTGACTATCCAGTTGAT   62
  CAATCAGCTGGCCTGGTTTGA   63
  CACCCTGGTGCTGACTATCCA   64
  CACCACCCTGGTGCTGACTAT   65
  TGCTTTATTCTCCCATTGAAA   66
  CTGGTGCTGACTATCCAGTTG   67
  TCTGTGCTCTTCGTCATCTGA   68
  TGCCATCTGTGCTCTTCGTCA   69
  TGGTGCTGACTATCCAGTTGA   70
  CCTGGTGCTGACTATCCAGTT   71
  ACCCTGGTGCTGACTATCCAG   72
  GAGCCTGCCATCTGTGCTCTT   73
  CTGGTTTGATACTGACCTGTA   74
  TGGTTTGATACTGACCTGTAA   75
  TCGAGGAGTAACAATACAAAT   76
  ACCATGCAGAATACAAATGAT   77
  AGGAGTAACAATACAAATGGA   78
  GTCGAGGAGTAACAATACAAA   79
  TTGTTGTAACCTGCTGTGATA   80
  GAGTAATGGTGTAGAACACTA   81
  AGTAATGGTGTAGAACACTAA   82
  CACACTAACCAAGCTGAGTTT   83
  TTTGGTCGAGGAGTAACAATA   84
  TACCATTCCATTGTTTGTGCA   85
  TAGGGTAAATCAGTAAGAGGT   86
  CTAACCAAGCTGAGTTTCCTA   87
  TGGTCGAGGAGTAACAATACA   88
  CTGGCCTGGTTTGATACTGAC   89
  TAACCTCACTTGCAATAATTA   90
  ATCCCACTGGCCTCTGATAAA   91
  GACCACAAGCAGAGTGCTGAA   92
  CACAAGCAGAGTGCTGAAGGT   93
  CTAACCTCACTTGCAATAATT   94
  AGCTGATATTGATGGACAG   95
优选的HPV目标基因序列列于表12。表12的序列是靶向序列，原因是其能够沉默HPV E6癌基因。
表12
  HPV靶向基因序列  SEQ ID NO：
  CGGTGCCAGAAACCGTTGAATCC   96
  CACTGCAAGACATAGAAATAACC   97
  AGGTGCCTGCGGTGCCAGAAACC   98
  GCGGTGCCAGAAACCGTTGAATC   99
  TCACTGCAAGACATAGAAATAAC   100
  CCCATGCTGCATGCCATAAATGT   101
  ATGCTGCATGCCATAAATGTATA   102
  GTGGTGTATAGAGACAGTATACC   103
  GCGCGCTTTGAGGATCCAACACG   104
  CTGCGGTGCCAGAAACCGTTGAA   105
  CCCCATGCTGCATGCCATAAATG   106
  ACCCCATGCTGCATGCCATAAAT   107
  AACACTGGGTTATACAATTTATT   108
  ACGACGCAGAGAAACACAAGTAT   109
  AAGGTGCCTGCGGTGCCAGAAAC   110
  GGTGCCTGCGGTGCCAGAAACCG   111
  CATGCTGCATGCCATAAATGTAT   112
  GACGCAGAGAAACACAAGTATAA   113
  TTCACTGCAAGACATAGAAATAA   114
  GGTGCCAGAAACCGTTGAATCCA   115
  TGGCGCGCTTTGAGGATCCAACA   116
  TGTGGTGTATAGAGACAGTATAC   117
  GTGCCTGCGGTGCCAGAAACCGT   118
  CTGCATGCCATAAATGTATAGAT   119
  GACTCCAACGACGCAGAGAAACA   120
  CTGGGCACTATAGAGGCCAGTGC   121
  TGCTGCATGCCATAAATGTATAG   122
  GTGCCAGAAACCGTTGAATCCAG   123
  TTACAGAGGTATTTGAATTTGCA   124
  GAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGC   125
其它优选的HPV目标基因序列列于表13。表13的序列是靶向序列，原因是其能够沉默HPV E7癌基因。
表13
  HPV靶向基因序列  SEQ ID NO：
  ATTCCGGTTGACCTTCTATGTCA   126
  GATGGAGTTAATCATCAACATTT   127
  AAGCCAGAATTGAGCTAGTAGTA   128
  CATGGACCTAAGGCAACATTGCA   129
  AACCACAACGTCACACAATGTTG   130
  ATGGACCTAAGGCAACATTGCAA   131
  TAAGCGACTCAGAGGAAGAAAAC   132
  GAAGCCAGAATTGAGCTAGTAGT   133
  GAGCCGAACCACAACGTCACACA   134
  ACGTCACACAATGTTGTGTATGT   135
  GAACCACAACGTCACACAATGTT   136
  AGGCAACATTGCAAGACATTGTA   137
  AAGACATTGTATTGCATTTAGAG   138
  TAAGGCAACATTGCAAGACATTG   139
  CCAGCCCGACGAGCCGAACCACA   140
  AAGCTCAGCAGACGACCTTCGAG   141
  GCCCGACGAGCCGAACCACAACG   142
  TTCCGGTTGACCTTCTATGTCAC   143
  TGCATGGACCTAAGGCAACATTG   144
  TTCCAGCAGCTGTTTCTGAACAC   145
  AACACCCTGTCCTTTGTGTGTCC   146
  CTTCTATGTCACGAGCAATTAAG   147
  ACGAGCCGAACCACAACGTCACA   148
  TTGAGCTAGTAGTAGAAAGCTCA   149
  CAGCAGACGACCTTCGAGCATTC   150
  AGCCAGAATTGAGCTAGTAGTAG   151
  GTCACACAATGTTGTGTATGTGT   152
  CCGACGAGCCGAACCACAACGTC   153
  AATTCCGGTTGACCTTCTATGTC   154
  ATTCCAGCAGCTGTTTCTGAACA   155
其它优选的HPV靶向基因序列列于表14。表14的序列是HPV E6和E6共有的靶向序列。
表14
  HPV靶向基因序列 SEQ ID NO：
  TAGGTATTTGAATTTGCAT 156
  GAGGTATTTGAATTTGCAT 157
优选的MDR-1靶向基因序列列于表15。表15的序列能够沉默人的MDR-1基因。
表15
  MDR-1靶向基因序列 SEQ ID NO：
  ATGTTGTCTGGACAAGCACT 158
优选的k-Ras靶向基因序列列于表16。表16的序列能够沉默人的k-Ras基因。
表16
 k-Ras靶向基因序列  SEQ ID NO：
 GTTGGAGCTGTTGGCGTAG  159
优选IL-6R靶向基因序列列于表17。表17的序列能够沉默人的IL-6R基因。
表17
  IL-6R靶向基因序列 SEQ ID NO：
  CTCCTGGAACTCATCTTTCTA   160
  GCTCTCCTGCTTCCGGAAGAG   161
  CTCCACGACTCTGGAAACTAT   162
  CAGAAGTTCTCCTGCCAGTTA   163
  CCGGAAGACAATGCCACTGTT   164
  CTGAACGGTCAAAGACATTCA   165
  CACAACATGGATGGTCAAGGA   166
  ATGCAGGCACTTACTACTAAT   167
  ATCGGGCTGAACGGTCAAAGA   168
  AGCTCTCCTGCTTCCGGAAGA   169
  CAGCTCTCCTGCTTCCGGAAG   170
  CAGGCACTTACTACTAATAAA   171
  CACTTGCTGGTGGATGTTCCC   172
  AACGGTCAAAGACATTCACAA   173
  TGCACAAGCTGCACCCTCAGG   174
其它可参考的IL-6R靶向基因序列列于表18。表18的序列能够沉默小鼠的IL-6R基因。
表18
  IL-6R靶向基因序列 SEQ ID NO：
  ATCCTGGAGGGTGACAAAGTA   175
  TGGGTCTGACAATACCGTAAA   176
  AACGAAGCGTTTCACAGCTTA   177
  CCGCTGTTTCCTATAACAGAA   178
  ACGAAGCGTTTCACAGCTTAA   179
  CTGCTGTGAAAGGGAAATTTA   180
  AACCTTGTGGTATCAGCCATA   181
  CACAGTGTGGTGCTTAGATTA   182
  CAGCTTCGATACCGACCTGTA   183
  CAGTGTGGTGCTTAGATTAAA   184
  CCCGGCAGGAATCCTCTGGAA   185
  CCCGCTGTTTCCTATAACAGA   186
  AACCACGAGGATCAGTACGAA   187
  ACCTGCCGTCTTACTGAACTA   188
  ACCACGAGGATCAGTACGAAA   189
  ACAGCTTGTGATGACTGAATA   190
  AGGATCAGTACGAAAGTTCTA   191
  AACCCGCTGTTTCCTATAACA   192
  CAGTACGAAAGTTCTACAGAA   193
  TACGCGAGTGACAATTTCTCA   194
  ACGAAAGTTCTACAGAAGCAA   195
  CAGGCACTTACTACTAATAAA   196
  CACTTGCTGGTGGATGTTCCC   197
  AACGGTCAAAGACATTCACAA   198
  TGCACAAGCTGCACCCTCAGG   199
优选的IL-7靶向基因序列列于表19。表19的序列能够沉默人的IL-7基因。
表19
  IL-7靶向基因序列  SEQ ID NO：
  TAAGAGAGTCATAAACCTTAA   200
  AACAAGGTCCAAGATACCTAA   201
  AAGATTGAACCTGCAGACCAA   202
  AAGAGATTTCAAGAGATTTAA   203
  AAGCGCAAAGTAGAAACTGAA   204
  TAGCATCATCTGATTGTGATA   205
  TAAGATAATAATATATGTTTA   206
  ATGGTCAGCATCGATCAATTA   207
  TTGCCTGAATAATGAATTTAA   208
  ATCTGTGATGCTAATAAGGAA   209
  AACAAACTATTTCTTATATAT   210
  AACATTTATCAATCAGTATAA   211
  ATCAATCAGTATAATTCTGTA   212
  AAGGTATCAGTTGCAATAATA   213
其它优选的IL-7靶向基因序列列于表20。表20的序列能够沉默小鼠的IL-7基因。
表20
  IL-7靶向基因序列  SEQ ID NO：
  CGGATCCTACGGAAGTTATGG   214
  GACCATGTTCCATGTTTCTTT   215
  AACCTAAATGACCTTTATTAA   216
  CAGGAGACTAGGACCCTATAA   217
  TAGGGTCTTATTCGTATCTAA   218
  ATGAGCCAATATGCTTAATTA   219
  GCCAATATGCTTAATTAGAAA   220
  CAGCATCGATGAATTGGACAA   221
  TTGCCTGAATAATGAATTTAA   222
  CTGATAGTAATTGCCCGAATA   223
  AAGGGTTTGCTTGTACTGAAT   224
  AACATGTATGTGATGATACAA   225
  TTGCAACATGTAATAATTTAA   226
  AAGAGACTACTGAGAGAAATA   227
  AAGAATCTACTGGTTCATATA   228
  TGCCGTCAGCATATACATATA   229
  AGGGCTCACGGTGATGGATAA   230
其它优选的IL-7靶向基因序列列于表21。表21的序列是跨物种序列，原因是其能够沉默人和小鼠的IL-7基因。
表21
  IL-7靶向基因序列 SEQ ID NO：
  CGCCTCCCGCAGACCATGTTC   231
  TCCGTGCTGCTCGCAAGTTGA   232
  GCCTCCCGCAGACCATGTTCC   233
  CCTCCCGCAGACCATGTTCCA   234
  CTCCCGCAGACCATGTTCCAT   235
  TCCCGCAGACCATGTTCCATG   236
  CCCGCAGACCATGTTCCATGT   237
  CCGCAGACCATGTTCCATGTT   238
  CGCAGACCATGTTCCATGTTT   239
  GCAGACCATGTTCCATGTTTC   240
  CAGACCATGTTCCATGTTTCT   241
  AGACCATGTTCCATGTTTCTT   242
优选的IL-13Ra-1靶向基因序列列于表22。表22的序列能够沉默人的IL-13Ra-1基因。
表22
  IL-13Ra-1靶向基因序列  SEQ ID NO：
  AACCTGATCCTCCACATATTA   243
  CCTGATCCTCCACATATTAAA   244
  AGAAATGTTTGGAGACCAGAA   245
  CAAATAATGGTCAAGGATAAT   246
  TTCCTGATCCTGGCAAGATTT   247
  TAAAGAAATGTTTGGAGACCA   248
  ATGTTTGGAGACCAGAATGAT   249
  CTCCAATTCCTGATCCTGGCA   250
其它优选的IL-13Ra-1靶向基因序列列于表23。表23的序列能够沉默小鼠的IL-13Ra-1基因。
表23
  IL-13Ra-1靶向基因序列  SEQ ID NO：
  CAAGAAGACTCTAATGATGTA   251
  CACAGTCAGAGTAAGAGTCAA   252
  ACCCAGGGTATCATAGTTCTA   253
  CTGCTTTGAAATTTCCAGAAA   254
  ATCATAGTTCTAAGAATGAAA   255
  AAGGCTTAAGATCATTATATT   256
  AACTACTTATAAGAAAGTAAA   257
  CACAGAACATCTAGCAAACAA   258
  CTCGTTCTTGTTCAATCCTAA   259
  AACTTGTAGGTTCACATATTA   260
  AACCATTTCTGCAAATTTAAA   261
  CTCAGTGTAGTGCCAATGAAA   262
  CAGGCCTTAGGGACTCATAAA   263
  AAGTATGACATCTATGAGAAA   264
  GTGGAGGTCAATAATACTCAA   265
  CAGAGTATAGGTAAGGAGCAA   266
优选的IL-18靶向基因序列列于表24。表24的序列能够沉默人的IL-18基因。
表24
 IL-18靶向基因序列  SEQ ID NO：
 TTGAATGACCAAGTTCTCTTC  267
其它优选的IL-18靶向基因序列列于表25。表25的序列能够沉默小鼠的IL-18基因。
表25
  IL-18靶向基因序列  SEQ ID NO：
  CTCTCTGTGAAGGATAGTAAA   268
  CCGCAGTAATACGGAATATAA   269
  CAAGGAAATGATGTTTATTGA   270
  CAGACTGATAATATACATGTA   271
  TTGGCCGACTTCACTGTACAA   272
  CCAGACCAGACTGATAATATA   273
  AAGATGGAGTTTGAATCTTCA   274
  ACGCTTTACTTTATACCTGAA   275
  TACAACCGCAGTAATACGGAA   276
  CTGCATGATTTATAGAGTAAA   277
  CCCGAGGCTGCATGATTTATA   278
  CACGCTTTACTTTATACCTGA   279
  CGCCTGTATTTCCATAACAGA   280
  CGCAGTAATACGGAATATAAA   281
  TACATGTACAAAGACAGTGAA   282
  CAGGCCTGACATCTTCTGCAA   283
  TTCGAGGATATGACTGATATT   284
  CTGTATTTCCATAACAGAATA   285
  GAGGATATGACTGATATTGAT   286
  CAAGTTCTCTTCGTTGACAAA   287
  CACTAACTTACATCAAAGTTA   288
  ACCGCAGTAATACGGAATATA   289
  CTCTCACTAACTTACATCAAA   290
优选的CCL20靶向基因序列列于表26。表26的序列能够沉默人的CCL20基因。
表26
  CCL20靶向基因序列  SEQ ID NO：
  ATCATCTTTCACACAAAGAAA   291
  AACAGACTTGGGTGAAATATA   292
  ATGGAATTGGACATAGCCCAA   293
  GAGGGTTTAGTGCTTATCTAA   294
  CTCACTGGACTTGTCCAATTA   295
  ATCATAGTTTGCTTTGTTTAA   296
  TTGTTTAAGCATCACATTAAA   297
  AAGCATCACATTAAAGTTAAA   298
  CCCAAAGAACTGGGTACTCAA   299
  CACATTAAAGTTAAACTGTAT   300
  CAGATCTGTTCTTTGAGCTAA   301
  TTGGTTTAGTGCAAAGTATAA   302
  CAGACCGTATTCTTCATCCTA   303
  AACATTAATAAGACAAATATT   304
  GACCGTATTCTTCATCCTAAA   305
其它可参考的CCL20靶向基因序列列于表27。表27的序列能够沉默小鼠的CCL20基因。
表27
  CCL20靶向基因序列  SEQ ID NO：
  AAGCTTGTGACATTAATGCTA   306
  CAATAAGCTATTGTAAAGATA   307
  ATCATCTTTCACACGAAGAAA   308
  AGCTATTGTAAAGATATTTAA   309
  CAGCCTAAGAGTCAAGAAGAT   310
  CCCAGTGGACTTGTCAATGGA   311
  ATGAAGTTGATTCATATTGCA   312
  AAGTTGATTCATATTGCATCA   313
  TCACATTAGAGTTAAGTTGTA   314
  CACATTAGAGTTAAGTTGTAT   315
  TATGTTATTTATAGATCTGAA   316
  ATGTTTAGCTATTTAATGTTA   317
  TTAGTGGAAGGATTAATATTA   318
  ACCCAGCACTGAGTACATCAA   319
  TATGTTTAAGGGAATAGTTTA   320
其它优选的CCL20靶向基因序列列于表28。表28中的序列是跨物种的靶向序列，原因是其能够沉默人和小鼠的CCL20基因。
表28
  CCL20靶向基因序列  SEQ ID NO：
  ATGAAGTTGATTCATATTGCA   321
  TGAAGTTGATTCATATTGCAT   322
  GAAGTTGATTCATATTGCATC   323
  AAGTTGATTCATATTGCATCA   324
  AGTTGATTCATATTGCATCAT   325
  GTTGATTCATATTGCATCATA   326
  TTGATTCATATTGCATCATAG   327
  TGATTCATATTGCATCATAGT   328
  TCAATGCTATCATCTTTCACA   329
  CAATGCTATCATCTTTCACAC   330
  TAATGAAGTTGATTCATATTG   331
  AATGAAGTTGATTCATATTGC   332
优选的CCL20靶向基因序列列于表29。表29的序列能够沉默人的CCL20基因。
表29
  Claudin-2靶向基因序列  SEQ ID NO：
  AGCATGAAATTTGAGATTGGA   333
  TACAGAGCCTCTGAAAGACCA   334
  CACTACAGAGCCTCTGAAAGA   335
  CTGACAGCATGAAATTTGAGA   336
  ATCTCTGTGGTGGGCATGAGA   337
  CATGAAATTTGAGATTGGAGA   338
  TCTGGCTGAGGTTGGCTCTTA   339
  GTGGGCTACATCCTAGGCCTT   340
其它优选的CCL20靶向基因序列列于表30。表30的序列能够沉默小鼠的CCL20基因。
表30
  Claudin-2靶向基因序列 SEQ ID NO：
  CAGCTTCCTGCTAAACCACAA   341
  CAAGAGTGAGTTCAACTCATA   342
  CTGGTTCCTGACAGCATGAAA   343
  TGGCTGGGACTATATATATAA   344
  GAGGGCAATTGCTATATCTTA   345
  CAGCAGCCAAACGACAAGCAA   346
  CAAGGGTTTCCTTAAGGACAA   347
  CAGATACTTGTAAGGAGGAAA   348
  AAGAAATGGATTAGTCAGTAA   349
  AAGGAAAGCACAAGAAGCCAA   350
  CTGGCTGAGGTTGGCTCTTAA   351
  AACCTGGGATCTAAAGAAACA   352
  AAGGGCTTGGGTATCAAAGAA   353
  CAGGCTCCGAAGATACTTCTA   354
  CCCAATATATAAATTGCCTAA   355
  CTGACCCAGCTTCCTGCTAAA   356
优选的壳多糖酶-3靶向基因序列列于表31。表31的序列能够沉默人的壳多糖酶-3基因。
表31
  壳多糖酶-3靶向基因序列 SEQ ID NO：
  ACCCACATCATCTACAGCTTT   357
  CATCATCTACAGCTTTGCCAA   358
  CAGCTGGTCCCAGTACCGGGA   359
  CACCAAGGAGGCAGGGACCCT   360
  CCGGTTCACCAAGGAGGCAGG   361
  AGCTGGTCCCAGTACCGGGAA   362
  CAGGCCGGTTCACCAAGGAGG   363
  GGCCGGTTCACCAAGGAGGCA   364
其它优选的壳多糖酶-3靶向基因序列列于表32。表32的序列能够沉默小鼠的壳多糖酶-3基因。
表32
  壳多糖酶-3靶向基因序列 SEQ ID NO：
  TAGGTTTGACAGATACAGCAA   365
  AACCCTGTTAAGGAATGCAAA   366
  ATCAAGTAGGCAAATATCTTA   367
  CGCAGCTTTGTCAGCAGGAAA   368
  TTGGATCAAGTAGGCAAATAT   369
  TTGAGGGACCATACTAATTAT   370
  GAGGACAAGGAGAGTGTCAAA   371
  TGCGTACAAGCTGGTCTGCTA   372
  CAGGAGTTTAATCTCTTGCAA   373
  ATCAAGGAACTGAATGCGGAA   374
  CACCCTGATCAAGGAACTGAA   375
  CACTTGGATCAAGTAGGCAAA   376
  CAGGATTGAGGGACCATACTA   377
  AACTATGACAAGCTGAATAAA   378
  ATGCAAATTCTCAGACTCTAA   379
  ATCCTTCCCTTAGGAACTTAA   380
5.疾病和病变的治疗
本发明还提供了治疗或预防哺乳动物疾病或病变的方法。所述方法包括通过向哺乳动物的细胞引入包含一个或多个siRNA或编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子的至少一个侵袭性细菌或至少一个细菌治疗颗粒(BTP)来调节该细胞中已知引起疾病或病变的至少一个基因的表达，其中所表达的siRNA干扰已知引起目标疾病或病变的基因的mRNA。
包括BMGS和tkRNAi的本发明RNAi方法用于治疗基因表达调节对其是有益的任何疾病或病变。所述方法通过沉默或敲减(降低)参与一个或多个疾病和病变的基因而发挥作用。
需要调节的以治疗或预防目标疾病或病变的基因可以为，但不限于ras、β-连环蛋白、一个或多个HPV癌基因、APC、eotaxin-1(CCL11)、HER-2、MCP-1(CCL2)、MDR-1、MRP-2、FATP4、SGLUT-1、GLUT-2、GLUT-5、apobec-1、MTP、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-12、IL-13、IL-13 Ra-1、IL-18、IL-21R、IL-32α、IL-23的p19亚基、LY6C、p38/JNK MAP激酶、p65/NF-κB、CCL20(MIP-3α)、Claudin-2、壳多糖酶3样1酶、apoA-IV、I型MHC和II型MHC。在该实施方式的一个方面，所述ras为k-Ras。在该实施方式的另一个方面，所述HPV癌基因是E6或E7。
本发明提供了治疗或预防与基因的过表达有关的疾病或病变的方法，其中所述基因包括，但不限于ras、β-连环蛋白、一个或多个HPV癌基因、APC、eotaxin-1(CCL11)、HER-2、MCP-1(CCL2)、MDR-1、MRP-2、FATP4、SGLUT-1、GLUT-2、GLUT-5、apobec-1、MTP、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-12、IL-13、IL-13 Ra-1、IL-18、IL-21R、IL-32α、IL-23的p19亚单位、LY6C、p38/JNK MAP激酶、p65/NF-κB、CCL20(MIP-3α)、Claudin-2、壳多糖酶3样1酶、apoA-IV、I型MHC和II型MHC。优选地，所述基因是β-连环蛋白，并且所述待治疗的疾病或病变与β-连环蛋白的过表达相关。本文使用的术语“过表达”是指当与正常或野生型表达相比时，提高的表达(DNA、RNA或蛋白)。优选地，所述待治疗的疾病或病变选自由以下组成的组：结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、Gardner综合征、肝细胞癌(HCC)、基细胞癌、毛母质瘤、成髓细胞瘤和卵巢癌。
优选地，本发明提供了通过向细胞引入细菌或BTP而调节已知与疾病或病变的发作、传播或拖延有关的一个或数个基因的表达，来治疗或预防哺乳动物的癌症或细胞增殖病变、病毒病、炎症性疾病或病变、代谢疾病或病变、自身免疫性疾病或病变、或者皮肤或头发相关的疾病、病变或美容事件的方法。所述细菌或BTP含有一个或多个siRNA或编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子，其中所表达的siRNA干扰已知引起、传播或拖延目标疾病或病变的基因的mRNA。
在一些优选的实施方式中，所述病毒疾病可以是，但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头状瘤病毒(HPV)感染或上皮细胞发育异常或由HPV感染引起的癌症或HPV诱导的转化，包括宫颈癌、直肠癌和咽癌。
在一些优选的实施方式中，所述炎症性疾病或病变可以是，但不限于炎症性肠病、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、过敏性反应、类风湿性关节炎或呼吸道疾病。
在一些优选的实施方式中，所述自身免疫性疾病或病变可以是，但不限于腹腔病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或脑脊髓炎。
在一些优选的实施方式中，所述疾病、病变或美容事件可以是，但不限于牛皮癣、湿疹、白化病、秃头或头发灰白。
所述哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括但不限于人、牛、绵羊、猪、猫、犬、山羊、马或灵长类。优选地，所述哺乳动物是人。
本文使用的术语“治疗”是指向受不利病况、病变或疾病折磨的临床上具有症状的个体施用试剂或制剂(例如包含siRNA或编码siRNA的DNA的细菌和/或BTP)，从而使症状的严重度和/或频率降低，消除症状和/或其潜在病因，和/或促进伤害的改善或补救。
术语“预防”是指向易患特定不利病况、病变或疾病的没有临床症状的个体施用试剂或组合物，并由此预防症状和/或其潜在病因的出现。
6.药物组合物和施用模式
在本发明的优选实施方式中，通过静脉内、肌内、皮内、腹膜内、经口、鼻内、眼内、直肠内、阴道内、骨内、口服、浸渍和尿道接种将包含RNA分子和/或编码此RNA分子的DNA的侵袭性细菌或BTP引入至动物中。
向受试者施用的本发明侵袭性细菌或BTP的量可根据受试者的物种以及所治疗的疾病或病况而变化。通常，所采用的剂量为每位受试者约103-1011活生物，优选约105-109活生物。
本发明的侵袭性细菌或BTP通常与药学上可接受的载体和/或稀释剂一起施用。所采用的具体的药学上可接受的载体和/或稀释剂对本发明并不重要。稀释剂的实例包括磷酸盐缓冲液，缓冲胃内胃酸的缓冲剂，例如含有蔗糖的柠檬酸盐缓冲剂(pH 7.0)、单独的碳酸氢钠缓冲液(pH 7.0)(Levine et al.J.Clin.Invest.，79：888-902(1987)；and Black et al J.Infect.Dis.，155：1260-1265(1987))或者含有抗坏血酸、乳糖和任选的天冬氨酸的碳酸氢盐缓冲剂(pH 7.0)(Levine et al.Lancet，II：467-470(1988))。载体的实例包括蛋白，例如在脱脂乳中发现的蛋白，糖，例如蔗糖，或聚乙烯吡咯烷酮。通常，这些载体的使用浓度为约0.1-30％(w/v)，但优选1-10％(w/v)的范围。
下文列出的是可用于特定递送途径的其它药学上可接受的载体或稀释剂。可以使用任意此载体或稀释剂以施用本发明的细菌，前提是所述细菌或BTP仍能够侵袭靶细胞。可以进行侵袭性的体外或体内测试，以确定适当的稀释剂和载体。本发明的组合物经配制可用于多种施用类型，包括全身施用和外用或局部施用。还可以包括冻干形式，前提是所述细菌在与靶细胞接触后或者施用给受试者后具有侵袭性。相关技术和制剂通常可见于Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，Pa。对于全身施用，优选注射，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。对于注射，可以将本发明的组合物(例如细菌或BTP)配制成液态溶液，优选配制在生理兼容的缓冲液(例如Hank溶液或Ringer溶液)中。
对于经口施用，所述药物组合物可以采用例如，通过常规方式与药学上可接受的赋形剂例如结合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)，或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)制备成片剂或胶囊的形式。可以通过本领域熟知的方法对所述片剂进行包衣。用于经口施用的液体制剂可以采用，例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者其可以以干产品的方式提供，以便在使用前用水或其它合适的媒介物配制。可以通过常规方式使用药学上可接受的添加剂制备此液体制剂，所述添加剂为，例如助悬剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水媒介(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。所述制剂还可以包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可以对口服给药的制剂进行适当配制，以产生活性化合物的控释。对于经口腔给药，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，本发明使用的药物组合物通常可以以气溶胶喷雾包装的形式，使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，由加压包或喷雾器递送。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀以确定剂量单位，由此进行定量递送。可以配制包含所述组分(例如细菌)和诸如乳糖或淀粉的适当粉末基料的粉末混合物，以用在吸入器或吸药器中的明胶胶囊和药筒。
所述药物组合物可以经配制以通过注射进行肠胃外施用，例如通过推注(bolus)注射或连续输注。注射用制剂可以包装成单位剂量的形式，例如在加入防腐剂的安瓿或多剂量容器中的形式。所述组合物可以采用例如油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以包含诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配方剂。或者，所述活性成分可以为粉末形式，以便在使用前用诸如不含热原的无菌水的合适媒介物配制。
所述药物组合物还可以配制成直肠、阴道内或尿道内组合物，例如包含诸如可可油或其它甘油酯的常规栓剂基料的栓剂或滞留性灌肠剂。
全身给药还可以通过透粘膜或透皮的方式。对于透粘膜或透皮给药，在所述制剂中使用适合待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域通常已知的，并且包括例如用于经粘膜给药的胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，可以使用去污剂以有利于渗透。透粘膜给药可以通过鼻喷雾或使用栓剂。如本领域普遍已知的，对于局部给药，可以将本发明的细菌配制成软膏、药膏、凝胶或乳霜，前提是所述细菌在与靶细胞接触后仍然具有侵袭性。
如果需要，所述组合物可以包装成可包含含有所述活性成分的一个或多个单位剂量形式的包装或分配装置和/或试剂盒的形式。所述包装可以包含，例如金属或塑料薄片，例如吸塑装(blister pack)。所述包装或分散装置可以随附使用说明书。
含有待引入的RNA或编码RNA的DNA的侵袭性细菌或BTP可以用于感染在体外培养的动物细胞，例如由受试者获得的细胞。然后可以通过静脉内、肌内、皮内或者颅内，或者通过可以使细胞进入宿主组织的任何接种途径，将这些体外感染的细胞引入至动物体内，例如最初获得细胞的受试者。当向单个细胞递送RNA时，所施用的活生物的剂量的感染复数将为每个细胞约0.1-106细菌，优选每个细胞约102-104细菌。
在本发明的另一个实施方式中，细菌还可以向细胞(例如动物细胞)递送编码蛋白的RNA分子，随后可以从所述细胞收获或纯化蛋白。例如，可以在组织培养细胞中产生蛋白。
虽然已经结合详细说明书对本发明进行了描述，然而以上说明书旨在例示而非限定本发明，本发明由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优势和改变也在以下权利要求书的范围之内。
以下通过实施例进一步例示本发明，然而该实施例不以任何方式限定本发明。本申请全文引用的所有参考文献的内容，包括文献引用、授权专利、公开的专利申请都通过引用清楚地并入本文。除非另有指明，否则本发明的实施可采用本领域内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。此类技术均在文献中有完整描述。参见，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.bySambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No：4,683,195；NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu etal.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。
以下非限制性实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，而不用于限制本发明。
实施例
实施例1：β-连环蛋白和k-Ras的敲减
以往的研究已证实了本文所公开的siRNA敲除技术的有效性。例如，PCT公开号WO 06/066048描述了利用细菌递送的β-连环蛋白和k-ras的体外和体内敲减，其通过引入全文并入本文。
实施例2：具有多shRNA表达盒的TRIP
本文所述的以及在PCT公开号WO 06/066048中详细描述的TRIP均可进行修饰以产生可以同时靶向多个基因或者同时靶向一个基因内的多个序列的质粒。例如，具有产生shRNA的多个发夹表达盒的TRIP可以靶向给定基因内的不同序列或者通过同步细菌处理而靶向多个基因。
所述TRIP质粒可以引入多个(达10个)克隆位点，以表达不同的shRNA构建体(如PCT公开号WO2008/156702中图1所示)。此质粒的目的是可以通过单个治疗细菌沉默多个基因，可通过多表达盒-TRIP(mec-TRIP)以合成同时针对多个靶的短发夹RNA而实现该目的。
这些不同的发夹可以通过使用相同的高水平启动子(例如T7启动子或不同的高水平细菌启动子)而以高水平竞争表达，或者可以通过使用具有不同活性水平的启动子而以不同的水平表达，这将依赖于该质粒的目的用途以及期望的靶基因的相对沉默水平。
通过同时沉默(靶向)本文所述的多个靶(例如多个癌基因，例如结肠癌情况下的k-ras和β-连环蛋白，或者乳腺癌中的HER-2和MDR-1或其它组合)，该mec-TRIP可用于治疗本文所述的复杂疾病(例如炎性疾病或癌症)。
实施例3：操作子-抑制子滴定系统
已经对所述TRIP系统(细菌和质粒)进行修饰以包括来自CobraBiomanufacturing(Keele，UK)的ORT(操纵子抑制子滴定)系统。该修饰有助于在没有选择性抗生素存在下将质粒维持在合适的菌株内。因此，已经对所述细菌载体株进行了修饰，以使ORT系统发挥功能(删除DAP基因并置换成ORT控制的DAP基因表达系统)。所述质粒已经进行了修饰从而除去抗生素选择序列，以支持ORT系统。还向所述细菌基因组中引入了其他变化，包括例如(a)删除aroA基因(在一些CEQ菌株中)以使所述细菌对营养缺陷更敏感，尤其是在细胞内区室内，此处其由于缺乏营养而死亡；(b)向染色体插入T7RNA聚合酶基因，和/或(c)将T7启动子控制下的shRNA表达盒整合至染色体。
PCT公开号WO2008/156702在图2显示了细菌菌株的研发实例。进一步开发的菌株包括，但不限于CEQ922(没有aroA删除的CEQ919)、CEQ923(没有aroA删除的CEQ920)、CEQ924(没有aroA删除的CEQ921)。
实施例4：肠道基因递送
对鼠伤寒沙门氏菌进行了研究，以确定其是否能够用作向肠道内的上皮细胞递送RNAi的载体。利用108 SL 7207单剂量口服处理小鼠，并在给药后不同的时间点处死小鼠。然后利用沙门氏菌特异性抗体对SL7207进行染色。处理2小时后，可以观察到许多SL7207侵入肠上皮层(染成红色的沙门氏菌)，这表明口服SL7207可以是向肠和结肠粘膜递送有效荷载(payload)的有用工具。在随后的实验中，用具有GFP表达质粒(pEGFPC1，Invitrogen)的SL7207处理小鼠。在单次处理后24小时，清楚地发现小比例(约1％)的细胞表达GFP。
PCT公开号WO2008/156702在图3显示了鼠伤寒沙门氏菌的有效侵袭以及向肠粘膜的质粒递送。在口服给药后6小时，利用红色荧光抗体对SL7207染色。在上皮细胞以及固有层的下部细胞(上左/右)中观察到完整的SL7207和SL7207的片段。SL7207将表达DNA成功地递送至肠粘膜中：在用携带GFP真核表达质粒(pEGFP-C1)的SL7207处理后，肠粘膜细胞表达GFP(下左)。对于荧光显微镜，使用红色荧光抗体对SL7207染色，用Hoechst37111对细胞核复染色。
为了检测SL7207是否能够向肠道递送靶向靶基因的RNAi，利用具有靶向GFP的shRNA表达质粒(SL-siGFP)或者具有靶向k-RAS的shRNA表达质粒(SL-siRAS)的鼠伤寒沙门氏菌处理GFP转基因小鼠(每组4只)。通过经口灌饲，每周三次给予108c.f.u.，共2周。随后，在利用特定抗体(LivingColors
Figure BPA00001372421100641
Invitrogen)对GFP表达进行免疫组化染色后，利用荧光显微镜观察结肠组织(数据未显示)，并且进行染色分析。与用SL-siRAS处理的动物相比，经SL-siGFP处理的动物中整体GFP表达水平显著降低，且表达GFP的小囊数也显著降低(33.9％比50％，p＜0.05)，这表明该方法可用于向结肠上皮细胞递送治疗性RNAi。
PCT公开号WO2008/156702在图4显示了细菌介导的RNA干扰降低了肠胃上皮细胞中靶基因的表达。与用SL-siRAS处理的动物相比(左下)，在用携带靶向GFP的表达质粒的SL7207(SL-siGFP，右下)处理后，结肠组织显示较低水平的GFP表达，且GFP染色阳性的结肠小囊较少。用GFP特异性抗体对载玻片染色。
实施例5：CEQ503细菌菌株的构建
CEQ 503(菌株CEQ201(pNJSZ))的衍生和描述
CEQ503由减毒的大肠埃希氏菌株(CEQ201)和专门工程化的TRIP质粒(pNJSZ)的组合构成。所述质粒使其带有诱导tkRNAi所需的能力(在该情况下：侵袭性、从进入小泡逃逸、表达短发夹RNA)。CEQ503(pNJSZ)的菌株描述：
1.基因型：大肠埃希氏菌CEQ201[glnV44(AS)，LAM-，rfbC1，endA1，spoT1，thi-1，hsdR17，(rk -mk +)，creC510ΔdapA，ΔrecA]。
2.CEQ201的衍生
         MM294(Meselson and Yuan，Nature 217，1110，1968；来自CGSC)
            ↓用质粒pKD46转化
         MM294(pKD46)
            ↓利用通过pKD4的PCR产生的ΔdapA::kan盒转化
         MM294ΔdapA::kan(pKD46)
            ↓利用通过pKD3的PCR产生的ΔrecA::cat盒转化
         MM294ΔdapA::kanΔrecA::cat(pKD46)
            ↓通过在43℃培养细胞而保留(cured)质粒pKD46
         MM294ΔdapA::kanΔrecA::cat
            ↓用质粒pCP201转化
         MM294ΔdapA::kanΔrecA::cat(pCP20)
            |保留质粒pCP20和通过在43℃诱导FLP重组酶的处理
            ↓而从染色体删除kan基因
         MM294ΔdapAΔrecA(CEQ201)
3.质粒：pNJSZ，在PCT公开号WO2008/156702的图5中图示，其是赋予本发明的细菌菌株(CEQ503)卡霉素抗性的10.4kb的质粒。该质粒包含两个基因hly和inv，并且H3发夹序列为：
ggatccAGGAGTAACAATACAAATGGATTCAAGAGATCCATTTGTATTGTTACTCCTTTgtcgac(SEQ ID NO：383)，其包含BamHI和SalI限制性位点。为了证明该质粒的存在，进行PCR以证明dapA的染色体删除，并且进行小量制备和/或PCR以确认所述质粒上的inv、hly和341-H3。
4.营养条件：Althea Media Broth或LB，Miller(Luria-Bertani)broth(Amresco；cat.no.：J106-2KG)和50μg/ml DL-Δ；ε-二氨基庚二酸(DAP)(SIGMA；cat.no.：D1377-10G)。
5.培养条件：37℃。
实施例6：BTP的产生
已经通过工程建立了用于递送tkRNAi的包含诸如TRIP的合适的质粒的BTP或迷你细胞。这些细胞可表达侵袭素或Opa以能够进入哺乳动物细胞中，李斯特菌溶素可使吞噬体在迷你细胞降解/裂解后裂解。此外，已经开发了利用自杀构建体杀死完整细胞以帮助纯化迷你细胞的制造迷你细胞的方法。此类自杀质粒在文献中已经有描述(Kloos et al.，(1994)J.Bacteriol.176，7352-61；Jain and Mekalanos，(2000)Infect.Immun.68，986-989)。总之，将编码形成孔和溶菌酶的λS和R基因置于细菌染色体上诱导型启动子的调节之下。当进行诱导时，由于迷你细胞缺乏染色体，其将裂解完整的细胞而非迷你细胞。可以使用许多不同类型的调节子，例如lacI、araC、λcI857和rhaS-rhaR，用于诱导型自杀基因构建体的开发。类似地，可以将包括大肠埃希氏菌自裂解基因和抗菌小肽在内的多个不同类型的自杀基因用在类似的方案中。通过诱导丝状化(filamentation)的处理或突变而增强纯化(参见，例如Ward andLutkenhaus，(1985)Cell 42，941-949；Bi and Lutkenhaus，1992)。最初的纯化包括低速离心以分离完整的细胞并将迷你细胞保留在上清中。随后可以是密度梯度纯化或过滤(例如，Shull et al.，(1971)J.Bacteriol.106，626-633)。
在本方法中可以使用任何细胞死亡触发基因(还被称为自杀基因，包括但不限于编码抗菌蛋白、噬菌体细胞溶解素或自细胞溶解素的基因)，用于从包含BTP和细菌的混合物中获得BTP。自杀基因可以通过包括但不限于细胞裂解或者通过破坏、降解或毒化细胞组分(例如染色体DNA或丝组分)的机制，杀死活细菌。任何诱导型启动子都可以与该系统联用。在本发明的一个实施方式中，所述自杀基因被整合至染色体内，由此限制使其仅在完整细菌中存在，而BTP或迷你细胞由于没有染色体DNA而将不引入这些基因。
如PCT公开号WO2008/156702的图6所示，自杀基因的诱导将裂解完整的细菌细胞。将λS和R基因(自杀基因)置于PlacUV5(诱导型启动子)控制之下。遗漏的基础活性被PgapA(强启动子)上的lacIq基因编码的“超抑制子(super-repressor)”抑制。该盒被置于minCD基因座。
实施例7：人乳头状瘤病毒(HPV)癌基因的siRNA抑制
细胞培养：Hela细胞培养在补充抗生素100U/ml青霉素G、10μg/ml链霉素(Sigma)且含有10％FBS的Minimum Essential Medium(MEM，ATCCNo.30-2003)中。
细菌培养：将质粒转化至BL21(DE3)菌株(Invitrogen)中。细菌培养在37℃，含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。利用OD600测定计算细菌细胞密度(CFU/ml)。对于细胞感染，将过夜培养物接种至新鲜的培养基中培养另外2-3小时，直至在600nm[OD600]的光学密度达0.6。
侵袭试验：对于细菌侵袭，以200,000细胞/孔将Hela细胞铺至6孔平皿中，并在2ml完全培养基中培养过夜。将所述细菌细胞在具有氨苄青霉素的LB培养基中培养至中指数期(在600nm的光学密度[OD600]为0.6)，然后以3,400rpm在4℃离心10分钟。将细菌沉淀重悬在不含血清或抗生素的MEM中并以1∶1000、1∶500、1∶250、1∶125或1∶62.5的MOI将所述细菌加入细胞中，并使其在37℃、5％CO2条件下侵袭Hela细胞2小时。利用含10％FBS和青霉素-链霉素(每毫升100IU青霉素和100μg链霉素)的MEM洗涤细胞4次。将细胞在37℃、5％CO2的条件在新鲜的完全培养基中进一步培养48小时，然后利用柱上DNAse消化或通过TRIZOL提取方法通过Qiagen RNeasy系统分离总的RNA。
siRNA转染：在转染前一天，将细胞铺在不含抗生素的完全生长培养基中从而使细胞在转染时达到30-50％的汇合度。在175μl Opti-MEM中，由20μM母液稀释为各种浓度siRNA。将4μl Oligofectamine分别混入15μlOpti-MEM。轻柔混合并在室温下温育5-10分钟。将稀释的siRNA与稀释的oligofectamine混合并在室温下温育15-20分钟。在形成复合物时，从细胞除去生长培养基并向含细胞的各个孔中加入800μl不含血清的培养基。向细胞中加入200μl siRNA/oligofectamine复合物并在37℃温育4小时。加入含有3倍正常浓度血清的1ml生长培养基而不用除去转染混合物。测定在48小时的基因沉默。
RT-PCR：使用以下引物和用于检测HPV18E6E7转录本的探针组，通过TaqMan RT-PCR master Mix试剂盒(Applied Biosystems)进行定量实时逆转录PCR(RT-PCR)。
正向引物：5′-CTGATCTGTGCACGGAACTGA-3′(148-168)(SEQ ID NO：384)
反向引物：5′-TGTCTAAGTTTTTCTGCTGGATTCA-3′(439-463)(SEQ ID NO：385)
探针：5′-TTGGAACTTACAGAGGTGCCTGCGC-3′(219-233和416-425)(SEQID NO：386)
利用报告子荧光染料FAM在5′末端标记探针，利用荧光染料淬灭子TAMRA在3′末端标记探针。利用GAPDH检测人GAPDH转录本，以用于标准化。
HPV shRNA序列：
H1(有效序列)
5’-ggATCCTAGGTATTTGAATTTGCATTTCAAGAGAATGCAAATTCAAATACCTTTTgTCgAC(SEQ ID NO：387)
5’-GTCGACAAAAGGTATTTGAATTTGCATTCTCTTGAAATGCAAATTCAAATACCTAGGATCC(SEQ ID NO：388)
H2(无效序列)
5’-ggATCCTCAGAAAAACTTAGACACCTTCAAGAGAGGTGTCTAAGTTTTTCTGTTTgTCgAC(SEQ ID NO：389)
5’-GTCGACAAACAGAAAAACTTAGACACCTCTCTTGAAGGTGTCTAAGTTTTTCTGAGGATCC(SEQ ID NO：390)
蛋白印迹：利用1X细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology，Cat No.9803)裂解Hela细胞。对于电泳，向12％的SDS-PAGE凝胶的各个孔中加入含50μg总蛋白的2X上样缓冲液。转移后，封闭印迹并用一抗结合2小时，然后用结合有HRP的二抗温育，之后通过ECL检测。除HPV18E7抗体以1/250稀释外，所有一抗都以1/1000稀释使用。
抗人pRb抗体：BD Pharmingen(Cat No.554136)，二抗：HRP-抗小鼠
HPV18E7：Santa Cruz(Cat No.sc-1590)，二抗：驴抗山羊IgG-HRP Cat no.sc 2020
p53：Santa Cruz(Cat No.sc-126)，二抗：HRP-抗小鼠
p21：Santa Cruz(Cat No.sc-397)，二抗：HRP-抗兔
c-Myc：Cell Signaling Technology(Cat No.9402)，二抗：HRP-抗兔
集落形成试验：在细菌侵袭2小时后收集Hela细胞。利用完全MEM培养基将对照处理的细胞或者HPV shRNA处理的细胞洗涤3次，用PBS洗涤1次。然后用胰酶消化细胞并计数。将每种处理的500个细胞加入至含2ml完全生长培养基的6孔板的单个孔中。使细胞生长10天，然后利用GEIMSA染色将集落固定。
MTT试验：在细菌侵袭2小时后收集Hela细胞。利用完全MEM培养基将对照处理的细胞或者HPV shRNA处理的细胞洗涤3次，用PBS洗涤1次。然后用胰酶消化细胞并计数。将每种处理的5000个细胞加入至含100μl完全生长培养基的96孔板的单个孔中，一式三份。使该细胞在37℃温育48-72小时，然后向各个孔中加入10μl 0.5mg/ml MTT。使该平板在37℃进一步温育3小时，从孔中吸除培养基并温育后，向各个孔中加入100μl MTT增溶溶液[含10％Triton X-100的酸性异丙醇(0.1N HCl)]以终止反应。在平板读数仪上读取在570nm的吸收值。
在该实施例中，观察到了短发夹RNA针对HPV 18 E6和E7癌基因的抑制作用。通过利用产生短发夹RNA的细菌菌株感染人宫颈癌细胞(Hela)，递送短发夹RNA。所述shRNA表达盒包含靶序列的19个核苷酸(nt)，然后是环状序列(TTCAAGAGA)(SEQ ID NO：391)和19nt的反向互补序列。对于所述19nt，使用在Cancer Gene Therapy(2006)13，1023-1032中公开的两个shRNA序列测定siRNA递送和基因沉默的功效，并使用6孔模式的oligofectamine试剂。简而言之，以约40％汇合的细胞密度将Hela细胞铺在不含抗生素的培养基中。次日，以50、100、200nM的多种浓度向6孔板中加入siRNA。以100nM的单个浓度加入对照siRNA。
如PCT公开号WO2008/156702在图7中所显示的，与对照siRNA相比，oligofectamine转染法引起Hela细胞中E6 mRNA的减少。siRNA(H1)显示E6 mRNA降低达约40％。所述敲减应答不是剂量依赖性的。
接着，将siRNA(H1)的发夹克隆至TRIP载体中。为了测定是否能够通过transkingdom系统实现基因沉默，在侵袭试验中测定人宫颈癌细胞(Hela)中的shRNA。简而言之，将Hela细胞以2x105细胞/孔铺在6孔板中，使其生长过夜，并于次日以不同的MOI与经过工程加工以产生发夹RNA的细菌(大肠埃希氏菌)温育2小时。利用含10％FBS和Pen Strep的培养基洗涤细菌4次，并使哺乳动物细胞在完全培养基中进一步温育额外48小时。从细菌分离RNA或蛋白。
PCT公开号WO2008/156702在图8和9中证明siRNA下调了Hela细胞中HPV E6的表达。将细胞铺在6孔板中，并使其生长至40％的汇合度(约40,000个细胞)。通过混合4μl oligofectamine和siRNA(在185μl培养基中的终浓度为50、100、200nM)，在无血清的Opti-MEM培养基中制备Oligofectamine/siRNA转染复合物。收集转染后48小时的细胞并通过实时RT-PCR分析靶标和GAPDH mRNA的水平。根据GAPDH信号对数据进行标准化。使用200nM单浓度的两种不同的阴性对照siRNA。
PCT公布WO2008/156702在图10的A-C部分显示了Hela细胞侵袭试验后实时PCR的结果。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过实时RT-PCR分析靶标和GAPDH两者的mRNA水平。根据GAPDH信号对数据进行标准化。然后针对未处理的对照细胞对这些数据进一步标准化。
PCT公开号WO2008/156702在图11显示了下调HPV E6和E7基因对肿瘤抑制通路和其它下调靶标的影响。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过蛋白印迹进行分析。如图所示，将50μg蛋白上样至各个泳道，并通过凝胶电泳分离，转移至膜上并利用特异于HPV 18 E7、p53、肌动蛋白、p110Rb、p21和c-myc的抗体检测。
PCT公开号WO2008/156702在图12和图13分别显示了集落形成和MTT试验。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后2小时，洗涤细胞、用胰酶处理并计数，并将对于每种MOI等量的细胞加入至6孔板的孔中(对于CFA：向6孔板的各个孔中进入500个细胞，对于MTT，向96孔板的各个孔中进入5000个细胞)。对于集落形成，培养细胞10天并用吉姆萨(Geimsa)染色，在铺板后72小时进行MTT分析。
PCT公开号WO2008/156702在图14和图15显示了Hela细胞侵袭试验后实时PCR的结果。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过实时RT-PCR分析靶标和GAPDH两者的mRNA水平。根据GAPDH信号对数据进行标准化。然后针对未处理的对照细胞对这些数据进一步标准化。
PCT公开号WO2008/156702在图16显示了下调HPV E6和E7基因对肿瘤抑制通路和其它下调靶标的影响。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过蛋白印迹进行分析。如图所示，将50μg蛋白上样至各个泳道，并通过凝胶电泳分离，转移至膜上并利用特异于HPV 18 E7、p53、肌动蛋白、p110Rb的抗体检测。
PCT公开号WO2008/156702在图17显示了利用含阴性sHRNA对照和HPV sHRNA的BL21(DE3)冷冻试样进行Hela细胞侵袭试验后，实时PCR的结果。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过实时RT-PCR分析靶标和GAPDH两者的mRNA水平。根据GAPDH信号对数据进行标准化。然后针对未处理的对照细胞对这些数据进一步标准化。
PCT公开号WO2008/156702在图18显示了含阴性sHRNA对照和HPVsHRNA的BL21(DE3)冷冻试样的铺板功效。使冷冻细菌解冻并以3.38X108细胞/孔的终浓度重悬。利用该浓度进行侵袭试验，以2ml 3.38X108细胞作为1000MOI。对一些对照细菌或HPV细菌储液进行连续稀释(1∶100)并铺在LB铺板上，以在48小时评价细菌处理的细胞的数量和存活率。通过使用ΔΔCt相对定量法的定量实时PCR或者通过蛋白印迹分析，对基因沉默进行分析。针对内在对照GAPDH对HPVE6 mRNA水平进行标准化。根据来自未处理细胞的RNA对最终数据进一步进行标准化。对于蛋白分析，在细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology)中制备细胞裂解物，并利用来自BioRad的BCA试剂盒测定蛋白浓度。对于电泳，针对肌动蛋白上样对照对蛋白表达进行标准化。
实施例8：通过利用HPV 18 E7抗体的蛋白印迹评价HPV E6基因的敲减
利用表达shRNA的BL21(DE3)(以下的HPVH1构建体)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过蛋白印迹进行分析。将HPV E6特异性敲减与阴性shRNA对照进行比较。简而言之，如所示，将50μg蛋白上样至各个泳道并通过凝胶电泳分离，转移至膜上并利用特异于HPV 18 E7和肌动蛋白的抗体检测。
HPVH1
5’-GATCC TAGGTATTTGAATTTGCAT TTCAAGAGA ATGCAAATTCAAATACCTTTT G-3’(SEQ ID NO：392)
3’-G ATCCATAAACTTAAACGTA AAGTTCTCT TACGTTTAAGTTTATGGAAAA CAGCT-5’(SEQ ID NO：393)
PCT公开号WO2008/156702在图19显示了通过利用HPV 18 E7抗体的蛋白印迹评价的HPV E6基因敲减。利用表达shRNA的BL21(DE3)以不同的感染复数(MOI)温育Hela细胞2小时。转染后48小时，收集细胞并通过蛋白印迹进行分析。将HPV E6特异性敲减与阴性sHRNA对照进行比较。简而言之，如图所示，将50μg蛋白上样至各个泳道并通过凝胶电泳分离，转移至膜上并利用特异于HPV 18 E7和肌动蛋白的抗体检测。
实施例9：CMT93细胞中的CCL20表达抑制
将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mls DMEM(10％FCS，pen/strep)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移8ml至50ml无菌试管中，并加入32mLDMEM 10％。将细胞充分混合，并向48孔板的各个孔中加入250uL，在37℃温育过夜，从而在次日清晨产生约70％汇合度的贴壁细胞。次日，通过以下方法产生siRNA转染复合物。
从Qiagen订购序列(预退火的siRNA双链)。将各个孔重悬在250ul siRNA缓冲液(Qiagen)中以产生20uM的储液浓度。然后将平板置于95℃的水浴中5分钟，然后使之缓慢冷却以使双链重悬并使聚集体分开。然后将重悬的双链用在标准方法中描述的转染试验中。该配置是48孔板的各个孔含250uL培养基；以三个生物重复进行各个筛选，因此，所述溶液制备在4个孔中：3个用于转染和1个附加孔。
将0.3uL适当的siRNA(来自20uM储备溶液)稀释在47uL不含血清/抗生素的培养基中，并混合。向该溶液中加入3uL HiPerfect转染试剂(Qiagen)，随后简单涡旋并在室温温育20分钟。将包含复合物的50uL混合物加入至含有CMT93细胞的48孔板的每3个孔中。在37℃转染24小时，此时除去培养基，并替换成400uL包含100ng/mL LPS的400uLs DMEM/10％FCS。刺激后，洗涤细胞并分离RNA以根据Qiagen Quantitech方法(参见厂商的说明书)进行qRT-PCR(50个循环)。
PCT公开号WO2008/156702在图20显示了利用各种siRNA序列对CMT93细胞中CCL20表达的敲减。所测试的siRNA序列列于表33。
表33
Figure BPA00001372421100731
实施例10：CMT93细胞中的Claudin-2表达抑制
将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mls DMEM(10％FCS，pen/strep)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移8ml至50ml无菌试管中，并加入32mLDMEM 10％。将细胞充分混合好，向48孔板的各个孔中加入250uL，在37℃温育过夜，从而在次日清晨产生约70％汇合度的贴壁细胞。次日，通过以下方法产生siRNA转染复合物。
从Qiagen订购序列(预退火的siRNA双链)。将各个孔重悬在250ul siRNA缓冲液(Qiagen)中以产生20uM的储液浓度。然后将平板置于95℃的水浴中5分钟，然后使之缓慢冷却以使双链重悬并使聚集体分开。然后将重悬的双链用在标准方法中描述的转染试验中。该配置是48孔板的各个孔含250uL培养基；以三个生物重复进行各个筛选，因此，所述溶液制备在4个孔中：3个用于转染和1个附加孔。
将0.3uL适当的siRNA(来自20uM储备溶液)稀释在47uL不含血清/抗生素的培养基中，并混合。向该溶液中加入3uL HiPerfect转染试剂(Qiagen)，随后简单涡旋并在室温温育20分钟。将包含复合物的50uL混合物加入至含有CMT93细胞的48孔板的每3个孔中。在37℃转染24或48小时，此时洗涤细胞并分离RNA以根据Qiagen Quantitech方法(参见厂商的说明书)进行qRT-PCR(50个循环)。
PCT公开号WO2008/156702在图21显示了转染后24小时，各种siRNA序列对CMT93细胞中Claudin-2表达的敲减。所检测的siRNA序列列于表34中。
表34
Figure BPA00001372421100741
实施例11：CMT93细胞中的IL6-Ra表达抑制
将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mls DMEM(10％FCS，pen/strep)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移8ml至50ml无菌试管中，并加入32mLDMEM 10％。将细胞充分混合，并向48孔板的各个孔中加入250uL，在37℃温育过夜，从而在次日清晨产生约70％汇合度的贴壁细胞。次日，通过以下方法产生siRNA转染复合物。
从Qiagen订购序列(预退火的siRNA双链)。将各个孔重悬在250ul siRNA缓冲液(Qiagen)中以产生20uM的储液浓度。然后将平板置于95℃的水浴中5分钟，然后使之缓慢冷却以使双链重悬并使聚集体分开。然后将重悬的双链用在标准方法中描述的转染试验中。该配置是48孔板的各个孔含250uL培养基；以三个生物重复进行各个筛选，因此，所述溶液制备在4个孔中：3个用于转染和1个附加孔。
将0.3uL适当的siRNA(来自20uM储备溶液)稀释在47uL不含血清/抗生素的培养基中，并混合。向该溶液中加入3uL HiPerfect转染试剂(Qiagen)，随后简单涡旋并在室温温育20分钟。将包含复合物的50uL混合物加入至含有CMT93细胞的48孔板的每3个孔中。在37℃转染24、48或72小时，此时洗涤细胞并分离RNA以根据Qiagen Quantitech方法(参见厂商的说明书)进行qRT-PCR(40个循环)。
PCT公开号WO2008/156702在图22显示了在转染后24小时，各种siRNA序列对CMT93细胞中IL6-RA表达的敲减。所测试的siRNA序列列于表35。
表35
Figure BPA00001372421100751
实施例12：CMT93细胞中的IL13-Ra1表达抑制
将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mls DMEM(10％FCS，pen/strep)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移8ml至50ml无菌试管中，并加入32mLDMEM 10％。将细胞充分混合，并向48孔板的各个孔中加入250uL，在37℃温育过夜，从而在次日清晨产生约70％汇合度的贴壁细胞。次日，通过以下方法产生siRNA转染复合物。
从Qiagen订购序列(预退火的siRNA双链)。将各个孔重悬在250ul siRNA缓冲液(Qiagen)中以产生20uM的储液浓度。然后将平板置于95℃的水浴中5分钟，然后使之缓慢冷却以使双链重悬并使聚集体分开。然后使重悬的双链用在标准方法中描述的转染试验中。该配置是48孔板的各个孔含250uL培养基；以三个生物重复进行各个筛选，因此，所述溶液制备在4个孔中：3个用于转染和1个附加孔。
将0.3uL适当的siRNA(来自20uM储备溶液)稀释在47uL不含血清/抗生素的培养基中，并混合。向该溶液中加入3uL HiPerfect转染试剂(Qiagen)，随后简单涡旋并在室温温育20分钟。将包含复合物的50uL混合物加入至含有CMT93细胞的48孔板的每3个孔中。在37℃转染24或72小时，此时洗涤细胞并分离RNA以根据Qiagen Quantitech方法(参见厂商的说明书)进行qRT-PCR(40个循环)。
PCT公开号WO2008/156702在图23显示了在转染后24小时，各种siRNA序列对CMT93细胞中IL13-RA1表达的敲减。检测的siRNA序列列于表36。
表36
Figure BPA00001372421100761
实施例13：CMT93细胞中的IL18表达抑制
将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mls DMEM(10％FCS，pen/strep)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移8ml至50ml无菌试管中，并加入32mLDMEM 10％。将细胞充分混合，并向48孔板的各个孔中加入250uL，在37℃温育过夜，从而在次日清晨产生约70％汇合度的贴壁细胞。次日，通过以下方法产生siRNA转染复合物。
从Qiagen订购序列(预退火的siRNA双链)。将各个孔重悬在250ul siRNA缓冲液(Qiagen)中以产生20uM的储液浓度。然后将平板置于95℃的水浴中5分钟，然后使之缓慢冷却以使双链重悬并使聚集体分开。然后使重悬的双链用在标准方法中描述的转染试验中。该配置是48孔板的各个孔含250uL培养基；以三个生物重复进行各个筛选，因此，所述溶液制备在4个孔中：3个用于转染和1个附加孔。
将0.3uL适当的siRNA(来自20uM储备溶液)稀释在47uL不含血清/抗生素的培养基中，并混合。向该溶液中加入3uL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Qiagen)，随后简单涡旋并在室温温育20分钟。将包含复合物的50uL混合物加入至含有CMT93细胞的48孔板的每3个孔中。在37℃转染24或72小时，此时洗涤细胞并分离RNA以根据Qiagen Quantitech方法(参见厂商的说明书)进行qRT-PCR(40个循环)。
PCT公开号WO2008/156702在图24显示了在转染后24小时，各种siRNA序列对CMT93细胞中IL18表达的敲减。检测的siRNA序列列于表37。
表37
Figure BPA00001372421100771
实施例14：CMT93细胞中的IL-7表达抑制
将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mls DMEM(10％FCS，pen/strep)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移8ml至50ml无菌试管中，并加入32mLDMEM 10％。将细胞充分混合，并向48孔板的各个孔中加入250uL，在37℃温育过夜，从而在次日清晨产生约70％汇合度的贴壁细胞。次日，通过以下方法产生siRNA转染复合物。
从Qiagen订购序列(预退火的siRNA双链)。将各个孔重悬在250ul siRNA缓冲液(Qiagen)中以产生20uM的储液浓度。然后将平板置于95℃的水浴中5分钟，然后使之缓慢冷却以使双链重悬并使聚集体分开。然后使重悬的双链用在标准方法中描述的转染试验中。该配置是48孔板的各个孔含250uL培养基；以三个生物重复进行各个筛选，由此所述溶液制备在4个孔中：3个用于转染和1个附加孔。
将0.3uL适当的siRNA(来自20uM储备溶液)稀释在47uL不含血清/抗生素的培养基中，并混合。向该溶液中加入3uL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Qiagen)，随后简单涡旋并在室温温育20分钟。将包含复合物的50uL混合物加入至含有CMT93细胞的48孔板的每3个孔中。在37℃转染24小时，此时洗涤细胞并分离RNA以根据Qiagen Quantitech方法(参见厂商的说明书)进行qRT-PCR(40个循环)。
PCT公开号WO2008/156702在图25显示了利用在转染后24小时，各种siRNA序列对CMT93细胞中IL-7表达的敲减。检测的siRNA序列列于表38。
表38
Figure BPA00001372421100781
Figure BPA00001372421100791
实施例15：CMT93细胞中的壳多糖酶3样1酶(CH13L1)表达抑制
在1.7ml微离心管中，将2.4μl 20μM双链RNA溶液(Qiagen)稀释在含有1μl Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)的394μl Opti-MEM无血清培养基(Invitrogen)中，混合，并在室温下温育10分钟以能够形成转染复合物。将100μl该混合物加入至24孔组织培养平皿的每3个孔中，在其上平铺体积为500μl的CMT-93细胞，从而形成每孔600μl的终体积和20nM的RNA终浓度。转染24小时后，向各个孔中加入0.1μg/ml脂多糖(LPS)(Sigma)，再温育细胞24小时以刺激CHI3L1的产生，之后在PBS中洗涤细胞并收集以用于RNA提取。按照以下准备用于转染的CMT-93细胞。将CMT93细胞的一个汇合T-175培养瓶在10ml中胰酶消化，直至细胞脱落。通过加入30mlsDMEM(10％FCS)使胰酶失活，并通过吹吸使细胞完全混合。从该溶液中转移10ml至50ml无菌试管中，并加入40mL DMEM 10％FBS。将细胞充分混合，并向24孔板的每孔加入500μL。该细胞浓度在24小时培养后产生约70％的汇合度。
WO2008/156702中的图26显示了利用在24小时转染后，各种siRNA序列对CMT93细胞中CH13L1表达的敲减。检测的siRNA序列列于表39。
表39
Figure BPA00001372421100792
Figure BPA00001372421100801
实施例16：CEQ200的构建
CEQ200具有以下基因型：glnV44(AS)，LAM-，rfbC1，endA1，spoT1，thi-1，hsdR17，(rk -mk +)，creC510ΔdapA。MM294具有以下基因型：glnV44(AS)，LAM-，rfbC1，endA1，spoT1，thi-1，hsdR17，(rk -mk +)，creC510。质粒购自于CGSC(参见Datsenko et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640-6645)。
CEQ200的衍生
               MM294(来自CGSC)
                  ↓利用质粒pKD46转化
               MM294(pKD46)
                  ↓利用通过pKD4的PCR产生的ΔdapA::kan盒转化
               MM294ΔdapA::kan(pKD46)
                  ↓通过在43℃培养细胞保留质粒pKD46
               MM294ΔdapA::kan
                  ↓用质粒pCP20转化
               MM294ΔdapA::kan(pCP20)
                  ↓保留质粒pCP20并且通过在43℃诱导FLP重组酶处理
                    而删除kan基因
               CEQ200
实施例17：CEQ201的构建
CEQ201具有以下基因型：CEQ200[glnV44(AS)，LAM-，rfbC1，endA1，spoT1，thi-1，hsdR17，(rk -mk +)，creC510ΔdapAΔrecA。MM294具有以下基因型：glnV44(AS)，LAM-，rfbC1，endA1，spoT1，thi-1，hsdR17，(rk -mk +)，creC510。质粒购自于CGSC(参见Datsenko et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97，6640-6645)。
CEQ200的衍生
             MM294(来自CGSC)
                ↓利用质粒pKD46转化
             MM294(pKD46)
                ↓利用通过pKD4的PCR产生的ΔdapA::kan盒转化
             MM294ΔdapA::kan(pKD46)
                ↓利用通过pKD3的PCR产生的ΔrecA::cat盒转化
             MM294ΔdapA::kanΔrecA::cat(pKD46)
                ↓通过在43℃培养细胞保留质粒pKD46
             MM294ΔdapA::kanΔrecA::cat
                ↓用质粒CP20转化
             MM294ΔdapA::kanΔrecA::cat(pCP20)
                ↓保留质粒pCP20并且通过在43℃诱导FLP重组酶处理
                  而删除kan和cat基因
             CEQ201
实施例18：通过从MM294删除minC和/或minD基因构建BTPs(CEQ210)
      MM294(来自CGSC)
            ↓用质粒pKD46转化
      MM294(pKD46)
            ↓用通过pKD4的PCR产生的ΔdapA::kan盒转化
      MM294ΔminCD::kan(pKD46)
            ↓通过在43℃培养细胞而保留质粒pKD46
      MM294ΔminCD::kan
            ↓用质粒pCP20转化
      MM294ΔminCD::kan(pCP20)
              恢复质粒pCP20并且通过在43℃诱导FLP重组酶处理
            ↓而删除kan基因
           CEQ210
实施例19：pMBV40、pMBV43和pMBV44质粒的图解
在tkRNA系统中将pMBV40、pMBV43和pMBV44质粒用作最终或中间质粒，并可根据以下构建：利用限制性酶PvuII消化pUC19。将产生的～2.4kb片段与通过使5个寡核苷酸彼此退火产生的～200bp DNA片段连接。所述寡核苷酸具有以下名称和序列：
OHTOP1：GACTTCATATACCCAAGCTTGGAAAATTTTTTTTAAAAAAGTCTTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGGATCCAGGAGTAACAATACAAATGGA(SEQ ID NO：556)
OHTOP2：TTCAAGAGATCCATTTGTATTGTTACTCCTTTTTTTTTTTGTCGACGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTTTACTCGAGCGGATTACTACATAC(SEQ ID NO：557)
OHBOT1：GTATGTAGTAATCCGCTCGAGTAAAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATCGTCGACAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：558)
OHBOT2：AGGAGTAACAATACAAATGGATCTCTTGAATCCATTTGTATTGTTACTCCTGGATCCATT(SEQ ID NO：559)
OHBOT3：ATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTCAAGACTTTTTTAAAAAAAATTTTCCAAGCTTGGGTATATGAAGTC(SEQ ID NO：560)
                                 ↓
      将连接混合物转化至大肠埃希氏菌中并选择氨苄青霉素抗性的转
      化子。将来自转化子的具有预期的插入物DNA序列和限制图的质
                        粒DNA命名为pMBV38。
                                 ↓
      利用NdeI消化pMBV38并与质粒pKSII-inv-hly的BamHI-SalI消
                化产生的～6kb片段进行使平末端连接
所预测的序列示于表40。
表40
Figure BPA00001372421100831
Figure BPA00001372421100841
                                   ↓
  将连接混合物转化至大肠埃希氏菌中并选择氨苄青霉素抗性的转化子。将来自
        转化子的具有inv和hly基因插入的质粒DNA命名为pMBV40。
                                   ↓
  利用BspHI消化pMBV40并使所得7.4kb DNA片段与利用质粒pKD4(购自
  CGSC(参见Datsenko et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640-6645)作为
              模板产生的含有kan基因片段的PCR片段连接
                                   ↓
  将连接混合物转化至大肠埃希氏菌中并选择卡那霉素抗性的转化子。筛查其限
  制性酶图谱。其具有不同两个不同方向的kan基因。将具有顺时针方向和逆时
      针方向的kan基因开放阅读框的质粒分别命名为pMBV43和pMBV44
如PCT公布号WO2008/156702的图27所示，pMBV40(amp选择性，具有H3发夹)或pMBV43和pMBV44(kan选择性，具有H3发夹)质粒分别具有以下各序列。
表41
Figure BPA00001372421100861
表42含有所预测的pMBV43质粒的8427个碱基对。所示序列含有以下区域：hly orf(682-2271bp)；inv orf(2994-5954bp)(6212-6282bp)(6483-6534bp)；shRNA启动子(6303-6361bp)；正义链(6362-6383bp)；环(6384-6390bp)；反义链(6391-6412bp)；终止子I(6413-6422bp)；终止子II(6423-6460bp)；复制起点(6720-7307bp)和kan orf(7498-8292bp)。
表42
Figure BPA00001372421100872
Figure BPA00001372421100881
Figure BPA00001372421100891
表43包含经验证的pMBV43质粒的8443个碱基对序列。所示序列含有以下区域：hly orf(682-2271bp)；inv orf(2992-5952bp)；shRNA启动子(6317-6375bp)；正义链(6376-6397bp)；环(6398-6404bp)；反义链(6405-6426bp)；终止子I(6427-6437bp)；终止子II(6438-6475bp)；复制起点(6735-7322bp)；和kan orf(7513-8307bp)。
表43
Figure BPA00001372421100892
表44
Figure BPA00001372421100912
Figure BPA00001372421100931
实施例23：pNJSZc质粒的构建
pNJSZ是具有诱导tkRNAi所需的能力的10.4kb的质粒。该质粒包含能够使细菌侵袭哺乳动物细胞并逃离进入小泡的两个基因，inv和hly。短发夹RNA的表达在起始Trip质粒和pNJSZ之间是不同的。在pNJSZ中，shRNA的表达在组成型细菌启动子的控制之下，其允许持续表达。这不同于起始的Trip质粒(其具有控制shRNA表达的IPTG诱导型启动子)。此外，pNJSZ和起始的Trip质粒含有不同的抗生素抗性基因。pNJSZ具有卡那霉素抗性基因，而起始的Trip质粒具有氨苄青霉素抗性基因。通过从pNJSZ除去不是维持该质粒所需的或不是诱导tkRNAi的能力所需的pNJSZ的任何区域而构建pNJSZc。
步骤1如PCT公开号WO2008/156702的图28所示。通过利用SpeI(9784)和XmaI(9772)两者酶解pNJSZ而除去在9778位的其他BamH1，利用T4 DNA聚合酶填充这两个位点，然后使所述质粒自连接，从而产生pNJSZΔBamH1。
步骤2如PCT公开号WO2008/156702的图29所示。通过利用BglI(208)和PmeI(982)酶解pNJSZΔBamH1而除去在972位的其他SalI位点和f1复制起点两者，利用T4 DNA聚合酶填充这两个位点，然后使所述质粒自连接，从而产生pNJSZc。
pNJSZc DNA序列如表45所示。
表45
Figure BPA00001372421100941
Figure BPA00001372421100951
Figure BPA00001372421100961
Figure BPA00001372421100971
Figure BPA00001372421100981
实施例24：CEQ200中编码RNAse III的rnc的删除(CEQ221Δrnc)
多数细菌都包含大量的可以降解siRNA从而引起tkRNAi活性降低的RNA降解酶RNase。在特定细菌的RNase可显示此siRNA降解的情况下，进行编码目标Rnase的基因(例如编码RNase III的rnc基因)的靶向删除以使每个tkRNAi细菌产生较高水平的siRNA，从而导致更多的siRNA被递送至靶细胞以及目标基因在靶细胞内的更有效的基因沉默。
Δrnc的构建
             CEQ200
                用质粒pKD461转化
              ↓进行Ampr选择
          CEQ200(pKD46)
                用使用引物rncFP和rncRP以及pKD31制得的Δrnc::cat PCR产物转化
              ↓并进行Cmr选择
          CEQ200Δrnc::cat(pKD46)
              ↓通过使细胞在43℃培养而保留pKD46
          CEQ200Δrnc::cat
              ↓通过质粒pCP201转化细胞
          CEQ200Δrnc::cat(pCP20)
              ↓保留pCP20并通过在43℃的处理诱导FLP重组酶而删除cat基因
          CEQ200Δrnc
          该菌株命名为CEQ221
1来自Datsenko and Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640-6645。这些质粒购自CGSC。
所示的凝胶分析证明了CEQ221的结构并证实了Δrnc基因型。凝胶分析证明了Proteus 23S rRNA在Δrnc株中的表达以及缺少加工23S dsDNA的能力。从携带pPM2的CEQ200和CEQ221提取总细胞RNA并在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳。由pPM2转录的23S rRNA在螺旋25中具有插入序列，其在熟化过程中被RNase III加工，形成23S rRNA片段：23S’和23S”。RNase III缺陷型菌株CEQ221不能加工此螺旋，因此显示Proteus 23S rRNA是完整的。这是Δrnc株CEQ221已经丧失RNAse III活性的证据。
Δrnc株CEQ221证明了提高的shRNA产量和更高数量的shRNA向靶细胞中的提高的递送。当用相同质粒pNJSZc-H3进行转化时，与用相同质粒转化的wt-rnc细菌(CEQ200)相比，Δrnc细菌(CEQ221)包含明显更多的shRNA。在体外侵袭测试实验中，Δrnc细菌向细胞中递送更高数量的shRNA。
与用相同量CEQ200(H3)处理的细胞相比，用CEQ221(H3-Δrnc)处理的细胞含有更高水平的shRNA。用携带针对基因靶标(β-连环蛋白H3)的tkRNAi质粒的大肠埃希氏菌-Δrnc或者用携带针对β-连环蛋白的相同tkRNAi质粒(H3)的大肠埃希氏菌处理SW480细胞。在所示时间点收集细胞并分析细胞提取物，以计算通过载体细菌(carrier bacteria)存放在细胞内的shRNA的量。与其野生型rnc对应物(蓝柱)相比，Δrnc菌株(CEQ221-红柱)能够向靶细胞存放显著更高量的shRNA。
图1显示了提高的基因沉默能力(最大作用)和效率(IC50)。与用CEQ200(wt rnc)处理相比，用CEQ221(Δrnc)处理获得显著更高水平的基因抑制。如图1所示，用更高量的携带质粒pNJSZc-H3(或对照质粒pNJSZc-HPVb)的细菌处理Cos-7细胞，在48小时后分析β-连环蛋白靶基因的表达。显示了相对于已经用相同细菌量的对照细菌(含有质粒pNJSZc-HPVb并产生针对HPV的shRNA)处理的细胞的β-连环蛋白基因表达(mRNA)水平。结果表明所观察到的β-连环蛋白基因表达水平具有剂量依赖性降低(“敲减”)。-Δrnc菌株(CEQ221)的效力显著高于wt-rnc菌株(CEQ200)的效力，其最高基因沉默水平分别为76％和57％。这些结果表明，CEQ221的功效比CEQ200高约10倍：与CEQ200的IC50为107cfu/ml相比，CEQ221的IC50为106cfu/ml。
实施例25：设计RNAse III底物以作为用于tkRNAi的功能shRNA的前体
在前述实施例中证明，限制递送细菌中的RNase活性有益于保护shRNA避免不利的加工和降解。在可选的实施方式中，设计出可改良且更准确和高效的Dicer加工的发夹RNA是有益的，这对有效RNA干扰至关重要。Dicer是具有特异于dsRNA的活性的RNase酶，由此RNase III切割产物包含5’磷酸酯和3’羟基末端以及3’末端的2-nt的悬端。Dicer产物的进一步特征是约21nt的离散式大小。因此，本实施例提供了发夹RNA分子，其在细菌(tkRNAi)载体中产生RNaseIII的加工底物，从而在宿主靶细胞中形成Dicer加工底物。
RNaseIII酶可以分成三种类型。发现于细菌、噬菌体和真菌的I型酶包含单个RnaseIII结构域和dsRNA结合结构域(dsRBD)。II型和III型酶分别通过Drosha和Dicer表征。Dicer是最复杂的Rnase III酶，通常包含DExD/H-盒解螺旋酶结构域、功能未知的小结构域(DUF283)、PAZ(Piwi ArgonauteZwille)结构域、两个串联的RNase III结构域(RNase IIIa和IIIb)和dsRBD。来自低等真核生物的一些Dicer或Dicer-样蛋白具有较简单的域结构；例如来自肠贾第虫(Giardia intestinalis)的Dicer蛋白仅包含PAZ和两个RNase III结构域。之前对大肠埃希氏菌Rnase III和人Dicer的突变和酶学研究获得了用于Rnase III切割的“单加工中心模型”。该模型集中于形成催化二聚体的两个Rnase III结构域：用于I型酶的分子间均二聚体和用于Dicer和Drosha在RNase IIIa和IIIb之间的分子内假二聚体。这种二聚作用产生了用于dsRNA切割的单加工中心，其中每个RNase III结构域切割dsRNA的一条链。两个切割位点之间的距离控制产生特征性2-nt 3′悬端。对于Dicer，末端结合PAZ结构域和Rnase III结构域之间的距离决定切割产物的长度(Du，Lee，Tjhen etal in PNAS 105(7)2008)。
细菌包含切割dsRNA的I型Rnase III酶。有证据表明，该I型Rnase III识别决定在何处切割dsRNA的特定基序。该酶进以留下2nt 3’悬端的方式进行所述切割(参见Pertzev and Nicholson Nucleic Acid Research vol.34(13)2006and reviewed by Nicholson in FEMS Micro Reviews 23 1999)。此外，已经描述了排斥Rnase III的结合和切割的序列：即所谓抗决定簇(anti-determinant)。
在以下实施例中，在释放至哺乳动物细胞质之前使用tkRNAi细菌内的发夹RNA的I型RNAseIII加工tkRNAi细菌内的发夹RNA。将所定义的细菌RNAse III所需的所定义的近盒序列和远盒序列置于假四环结构“之后”以下”，任选地，该假四环结构作为该设计的变体可以经构建而具有或没有环，和假四环“之前”以上”的“间隔子“，”，以将发夹序列延长～21个核苷酸。近/远盒基序将包含仅远盒基序可包含仅～10nt，由此剩余的与沉默序列相邻的剩余11nt延伸段应由所有抗决定簇碱基配对组成。细菌RNAse III可将识别远盒序列和近盒序列并在近盒处或近盒以下之后的2nt切割dsRNA(图2)，留下较长(即更稳定)的发夹结构。此外，近盒基序/远盒基序“以上之前”的抗决定簇碱基配对的存在保护发夹免受进一步的加工/降解，并维持适当的发夹结构发夹长度，从而当Dicer在靶细菌细胞内加工发夹时，将可产生21nt的沉默siRNA。
图2显示了具有功能注解的RNase III底物发夹RNA结构的示意图。
图3显示了细菌的I型RNase III对发夹前体的切割作用的示意图。所述切割是正向靶向发生在假四环结构的约10nt末梢，从而形成理想的Dicer-底物前体。该步骤在向靶细胞递送之前在细菌中发生。I型Rnase III的切割将形成在3′末端包含2个核苷酸的悬端的约100个核苷酸的发夹，其引导下一个的酶促加工步骤(参见图4)。
图4显示熟化第二步的功能注解(第一Dicer切割步骤)。该步骤在向靶细胞的细胞质内释放RNA发夹分子后发生。I型RNAse III加工留下的发夹RNA结构3’末端的2个核苷酸的悬端有助于引导并触发Dicer在21个核苷酸的上游切割RNA结构(切割位点表示为箭头所示的“第一Dicer切割位点”)。
图5显示第二Dicer切割步骤和熟化为活性siRNA。该第二Dicer切割发生在宿主细胞的细胞质中并除去发夹环结构，从而留下用于荷载至RISC复合体内的功能siRNA。第一Dicer切割在RNA的3’末端留下的2-nt悬端也有助于引导Dicer。
使用细菌I型RNase III切割发夹RNA的时程试验产生了由150nt RNA至100nt RNA的降低。利用MEGAshortscript试剂盒(Ambion)由质粒模板合成包含发夹序列的单链RNA。然后使RNA与纯化的细菌RNaseIII接触指定的时间段，在10％的TBE-Urea凝胶上电泳，并通过溴化乙锭染色可视化。在切割4分钟后，出现约100nt RNA物质。
实施例26：CEQ505的构建
药物候选物CEQ505通过删除dapA基因和rnc基因而由MM294衍生的大肠埃希氏菌菌株组成。该大肠埃希氏菌株的内部命名为用质粒pNJSZc-H3转化的CEQ221，所述质粒为表达质粒，其通过inv基因编码侵袭素的表达、通过hly基因编码李斯特菌溶素O的表达，并且通过包括发夹序列H3的shRNA表达盒编码靶向β-连环蛋白mRNA的短发夹RNA。
FACS分析表明，CEQ 200Δrnc pNJSZc H3进入哺乳动物细胞需要耶尔森氏菌侵袭素的表面表达。耶尔森氏菌和CEQ 200Δrnc pNJSZc H3均具有侵袭素的表面表达。
CEQ200Δrnc pNJSZc H3需要LLO活性以使shRNA逃脱哺乳动物细胞内涵体。通过溶血素试验测定LLO活性，其证明CEQ505具有溶血素活性而不含质粒的CEQ 221没有溶血素活性。
需要shRNA H3以沉默哺乳动物细胞中的β-连环蛋白。通过PK测定H3发夹相对表达，其证明CEQ505表达H3 shRNA，而未转化的菌株CEQ221不表达H3 shRNA。
图6显示利用CEQ 505的基因沉默。A部分证明CEQ 505能够以剂量依赖方式在Cos-7细胞中沉默哺乳动物β-连环蛋白达90％。B部分证明CEQ221pNJSZc lamin(靶向核纤层蛋白基因的等同株)能够以剂量依赖方式在SW480细胞中沉默哺乳动物核纤层蛋白达65％。
实施例26：修饰pMBV40、43和44以产生没有5′或3′尾的发夹
原始的TRIP质粒在T7 RNA聚合酶启动子、增强子和终止子的控制下表达shRNA。在这种模式中，转录开始于T7 RNA聚合酶启动子序列内。因此，T7增强子、BamHI位点、SalI位点和大部分终止子都被转录。然而shRNA发夹长度为约55nt，预测所产生的转录本的长度为约115个碱基。增强子和用于克隆的限制性位点形成了5’尾，而T7 RNA聚合酶终止子形成了3’尾。
因此，设计了用在pMBV40、43和44中的新启动子-终止子构建体(参见实施例19)，以形成没有5’或3’尾的发夹。用于克隆发夹的BamHI位点包含在启动子元件内(紧随-10共有序列之后)(Lisser and Margalit，1993，NucleicAcids Res.，21，1507-1516)。通过包含UP元件而强化所述启动子(Estrem et al，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，9761-9766；Meng et al.，2001，NucleicAcids Res.29，4166-4178)。为了有效终止，将一系列T段加入至发夹之后，用于克隆发夹的SalI位点之前(终止子I)。不依赖Rho的终止子包含富含A的序列，之后为4-18bp的茎环，随后为一系列T段(例如Lesnik et al.，2001，Nucleic Acids Res.29，3583-3594)。由于没有富含A的序列，shRNA茎环长度为19-21bp，并且由于所述基因异乎寻常的小，难以预测该终止子的功效。因此，还包含来自鞭毛蛋白基因的另一个rho依赖性终止子(终止子II)。由于有两个终止子，预测有两种转录本。转录本I和II分别由终止子I和终止子II终止。
实施例27：在tkRNAi中使用的阿拉伯糖诱导型侵袭素基因的克隆
在tkRNAi中，通过给所述载体细菌配备使该细菌通过与宿主细胞表面受体相互作用而进入宿主靶细胞的侵袭性蛋白而实现治疗性shRNA的细胞内递送。由耶尔森氏菌的inv基因编码的侵袭素蛋白是侵袭性蛋白的一个实例，其与所谓β-1-整合素的宿主细胞蛋白相互作用后触发细菌进入宿主细胞的摄取作用。然而，高水平的侵袭素蛋白表达会对细菌载体菌株产生毒性。因此，为了提高tkRNAi介导的基因沉默的功效和潜能，构建了能够通过向细菌培养基中加入阿拉伯糖而诱导表达侵袭素的细菌菌株。
所构建的质粒具有：包含编码AraC蛋白(阿拉伯糖操纵子-抑制子-激活子)的araC基因的阿拉伯糖诱导型侵袭素盒；受代谢物抑制蛋白(CRP)和AraC蛋白调节的ParaBAD(阿拉伯糖启动子)；和受ParaBAD启动子控制克隆的inv基因。
侵袭素的表达状态不同：(1)在具有葡萄糖和没有阿拉伯糖的情况下，启动子被代谢物抑制和AraC介导的抑制所抑制；(2)由于没有代谢物抑制且没有AraC介导的诱导，在没有任何糖(没有葡萄糖和没有阿拉伯糖)的情况下发生未诱导的状态；和(3)由于具有AraC介导的诱导但没有代谢物抑制，在没有葡萄糖但具有阿拉伯糖的情况下发生诱导状态。
根据以下方法测定了侵袭素的以上状态。在葡萄糖存在下培养所述细胞过夜，然后稀释并在具有葡萄糖(受抑制)或没有任何糖(两个培养物)的情况下培养4小时。利用阿拉伯糖(10mM)诱导在没有阿拉伯糖存在下培养一个培养物2小时。通过离心收集细胞，并通过FACS测定侵袭素的表达。将不含任何质粒的大肠埃希氏菌用作阴性对照，将在26℃培养的耶尔森氏菌用作阳性对照。
在存在阿拉伯糖的情况下，通过FACS测定发现了高水平表达的侵袭素，与在阳性对照(耶尔森氏菌)中观察到的侵袭素表达水平相当。在利用阿拉伯糖诱导侵袭素的两个小时过程中，根据OD测定细菌生长似乎停止。在2小时内存活率也降低了100倍，这与本发明人最初的设想一致。然后，本发明人优化了实验条件以产生良好的侵袭素表达和良好的存活率。本发明人发现，虽然生长率具有可测定的降低，但0.3-1mM的阿拉伯糖没有引起存活率可检测的降低。根据FACS，还表明在这些条件下诱导的侵袭素与10mM阿拉伯糖的诱导没有差别。所述结果证明，细菌生长(通过OD测定)是侵袭素的阿拉伯糖诱导的函数。
实施例28：用于tkRNAi的可选的shRNA结构
Transkingdom RNA干扰(tkRNAi)使用载体细菌以合成并递送存放于靶细胞的细胞质的短发夹RNA(shRNA)。为实现此目的，使细菌配备有表达质粒或染色体整合物以使其表达至少三种新性质：表面表达的侵袭素标记物(例如由inv基因编码的耶尔森氏菌侵袭素蛋白)、内涵体释放功能(例如由hly基因编码的李斯特菌溶素O蛋白-LLO)，和治疗性有效荷载，即在递送至宿主细胞细胞质后触发RNA干扰的shRNA。试验已经证明，大量发夹RNA的表达给细菌造成负担，并导致较缓慢的生长和/或细菌对质粒或发夹的修饰。具有较高结构能量的shRNA设计使细菌转录机器更难以分离两条链，然而此shRNA比具有降低结构能量的shRNA更难以克隆。在该实施例中，本发明人公开了表达具有较低能量系数的可选发夹RNA的方法，以更容易地在细菌内保持shRNA表达质粒同时保持通过RNA干扰诱导基因沉默的能力。
图7所示的设计优于现有shRNA结构之处主要在于显著较低的结构能量，以便于克隆tkRNAi质粒，更稳定地在细菌内维持所示质粒以及便于该质粒的测序。引入正义链3’末端的摆动(wobble)[3’(S)摆动]被耐受且不改变构建体的沉默能力，而5’(S)摆动的引入可能降低沉默能力。可通过没有传统双链结构的shRNA触发RNAi。此外，半重叠结构可诱导基因沉默，只要反义链(AS)为全长(19nt)且在5’末端被正义链覆盖。
实施例29：TRIP和pNJSZc中inv表达的去抑制
假结核耶尔森氏菌表面表达的侵袭素蛋白通过与β-1整合素家族成员结合而介导进入人细胞。为此原因，本发明人向pTRIP和pNJSZc质粒中克隆了包括其天然启动子的侵袭素基因(inv)，以介导大肠埃希氏菌向人肠上皮细胞中的内化。当H-NS(组蛋白样蛋白)与YmoA共同结合至inv启动子区时，假结核耶尔森氏菌中侵袭素的表达受到抑制。这两中蛋白形成将inv的表达降至基础水平的抑制复合物。当受温度调节的RovA(毒力A的调节子)结合在inv的相同启动子区内时(替换H-NS/YmoA)，发生inv表达的上调。大肠埃希氏菌中存在H-NS和YmoA的同源物。然而，RovA不存在于大肠埃希氏菌中，其导致侵袭素的恒定的基础水平表达。据报道，除去inv启动子区的调节结合区引起inv的恒定上调。在该实施例中，本发明人描述了从inv启动子除去如克隆在pTRIP和pNJSZc中的调节结合区以允许inv的恒定上调的方法。
经设计，表46中所示的引物删除了位于假结核耶尔森氏菌inv启动子区，被认为与大肠埃希氏菌中inv的抑制有关的153个核苷酸。所述引物与pTRIP(模板)和QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis kit(Stratagen)组合使用，以删除表46中所示的克隆在包含H3或核纤层蛋白发夹的TRIP中的inv启动子区内的调节结合区。
表46
Figure BPA00001372421101051
所产生的inv抑制基因经过测序验证并被克隆至NJSZc的NruI和ScaI位点之间。
通过FACS测定侵袭素表达，其中将CEQ221/pTRIP和CEQ221/pNJSZc在37℃培养过夜，用PBS洗涤并用抗-inv单克隆抗体3A2检测。阳性对照为在26℃培养以获得侵袭素的最佳表达的假结核耶尔森氏菌。
FACS分析表明，除去inv调节区导致了用pTRIP(去抑制突变体称为pGB60)和pNJSZc(去抑制突变体称为pGB69)转化的大肠埃希氏菌中侵袭素表达的提高。通过标准的庆大霉素保护测试，测定了最初的质粒和去抑制的质粒在Vero细胞中诱导大肠埃希氏菌内化的能力。数据表明，inv的去抑制引起Vero细胞内大肠埃希氏菌内化的提高。
实施例30：Opa52介导的大肠埃希氏菌向T84人肠上皮细胞的侵袭
对Opa52进行工程改造以用于顶级(apical)、宽范围地靶向肠上皮细胞以递送tkRNAi。Opa52将与CEACAM 1、3、5和6结合，其中CEACAM1、-5和-6由上皮细胞表达。这使得可以将tkRNAi递送至健康且极化的上皮细胞中。以下实施例描述了用于使大肠埃希氏菌侵袭至高度极化的T84人肠上皮细胞的Opa52细菌表达载体的构建和应用。
opa52基因序列获自GenBank(登录号#Z18929)并对其进行修饰以包含起始密码、信号序列和终止密码。所述信号序列与一些其它Opa蛋白的天然分泌信号相同，且针对在大肠埃希氏菌中的表达而进行了密码子优化。然后将该基因置于包含第二lacO位点的经修饰的lacUV5启动子的控制下，以获得增强的转录抑制。所述λt0终止子序列包含在opa52终止密码的下游。该完整的DNA片段由Blue Heron Biotechnology(Bothell，WA)合成，克隆至pUC19上并得到验证。为了促进Opa52在低拷贝ColE1-兼容质粒上的表达，本发明人将来自Blue Heron的完整合成盒亚克隆至被称为pJS15的pACYC177修饰物中。这是一个与ColE1质粒兼容的小(2kb)且低拷贝(每个细胞10-12个拷贝)的卡那霉素抗性载体。所产生的命名为pJS34的opa52构建体的长度为1040个碱基对，并且示于表47中。所述序列包括：KpnI(1-6)、SpeI(101-106)、NdeI(922-927)、NotI(1023-1030)和PmeI(1033-1040)的限制性位点；lacO位点(用于LacI结合)(7-25和70-88)；RBS(95-100)；ptac-35(32-37)和-10(56-62)；引导序列(109-177)和λt0终止子序列(928-1022)。
表47
Figure BPA00001372421101071
表48显示了所翻译的具有所加入的23个氨基酸的引导肽的270个氨基酸的序列。引导肽是氨基酸1-23。
表48
Figure BPA00001372421101072
从高度极化的T84细胞释放的细菌的铺板和培养证明了表达opa的大肠埃希氏菌株显著高于表达侵袭素的大肠埃希氏菌株细胞的侵袭能力。图8显示了重复试验的数据。
为了能够通过tkRNAi靶向健康(非发育异常)的上皮细胞，本发明人开发了两个可选的侵袭策略，这两个策略均基于来自靶向上皮细胞表面受体的肠侵袭性病原体的单个蛋白。
第一个是由奈瑟氏菌种表达的Opa家族蛋白的一员，并且根据所使用的Opa变体，差异地靶向在上皮细胞的顶面(apical aspect)上表达的癌胚抗原粘附分子(CEACAM)家族的成员。初级结合由纤毛介导，然后是通过存在于细菌外膜内的不透光蛋白(Opa)的更亲密的相互作用。Opa蛋白识别存在于上皮细胞的特定受体。某些Opa蛋白结合细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)多配体聚糖-1和-4，而其它Opa蛋白与癌胚抗原(CEA)或CD66家族(最近被重新命名为CEACAM家族)的成员结合。CEACAM可见于上皮细胞和嗜中性粒细胞(在天然感染过程中被奈瑟氏菌株靶向的两个细胞类型)上。Opa蛋白和CEACAM家族成员之间的相互作用是高度特异的，即每个Opa变体都显示出仅针对于CEACAM受体家族的某些成员的特定趋向性。
这些靶向蛋白的第二个源自单核细胞增生性李斯特菌，被命名为内化蛋白A或InlA，并靶向粘着连接的E-cadherin蛋白成分。与InlB结合的InlA能够使单核细胞增生性李斯特菌侵袭易感宿主中的多种非吞噬细胞。InlA通过靶向E-cadherin(粘着结合复合体中的主要分子)的N-末端结构域而促进单核细胞增生性李斯特菌进入肠上皮细胞。最近的研究表明，天然的InlA利用肠上皮细胞熟化和从绒毛顶端脱落过程中的临时窗口以进入宿主。换而言之，肠上皮细胞由位于绒毛小囊基底自我更新的干细胞样细胞产生，并随其从小囊移向绒毛顶端的移动而逐步成熟。在肠上皮细胞到达绒毛顶端后，其在常规的周转过程中或者通过损伤诱导的凋亡而脱落。在任一种情况下，都出现粘着结合蛋白(即E-cadherin)的瞬时暴露，从而允许InlA结合并使李斯特菌进入细胞。此外，在诸如IBD的病理条件下，不仅病变位点，未涉及区域周围的上皮屏障的完整性也受到影响。在这种情况下，受影响的屏障会暴露出粘着结合(例如E-cadherin)，并因此使表达InlA的递送菌株能够进入炎性病灶和周围上皮内的细胞。这有益于在炎症的活性发作过程中，递送菌株优选侵入并沉默发炎/受影响屏障位点的目标靶标，同时不接触正常上皮细胞区。因此，依赖于InlA的任何tkRNAi递送平台都可用作治疗剂以用于在活性炎症期间的治疗。
结果已经证明了携带表达Opa的质粒的大肠埃希氏菌细胞的侵袭能力显著高于携带表达侵袭素的质粒的大肠埃希氏菌。
实施例31：用于治疗由β-连环蛋白的上调介导的病变的CEQ508
药物候选物CEQ508由包含pMBV43-H3质粒的大肠埃希氏菌菌株CEQ221组成。菌株CEQ221是借助于购自CGSC的具有5-菌株-基因破坏组(5-strain gene-disruption set，Datsenko and Wanner，2000(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640))，使用λ噬菌体Red重组系统，通过dapA和rnc基因的相继删除而由大肠埃希氏菌菌株MM294得来。本实施例中的质粒pMBV43编码shRNA发夹以通过包含发夹序列“H3”(之前公开)、假结核耶尔森氏菌侵袭素(由inv基因编码)和单核细胞增生李斯特菌李斯特菌溶素O(LLO)(由hly基因编码)的shRNA表达盒靶向β-连环蛋白mRNA。pMBV43质粒源自pUC19，并具有以下改变：
1.发夹盒具有与UP元件相连的经修饰的PlacUV5启动子和两个终止子的组。
2.从另一个现有质粒pKSII-inv-hly克隆包含inv和hly基因的片段。
3.利用卡那霉素(kan)替换作为抗生素抗性标记物的amp。
在本实施例pMBV43质粒中使用的经修饰的启动子PlacUV5具有至少三个不同于在之前使用的pNJSZ质粒中使用的PlacUV5启动子的重要区别。
1.-35共有元件(阴影为从TTTACA突变为TTGACA)；
2.将UP元件加入至-35元件的上游；
3.从PlacUV5删除lacO(lac操纵子操纵基因)的元件并替换成BamHI位点。
表49
Figure BPA00001372421101091
PlacUV5启动子的长度为87个碱基对并且如表49所示。PlacUV5启动子的-35和-10共有序列分别为7-12和31-37碱基对。所示的lacO(lac操纵子操纵基因)为43-64碱基对。
经修饰的PlacUV5启动子的长度为65个碱基对并且如表49所示。PlacUV5启动子的-35和-10共有序列分别为30-35和54-60碱基对。所示的UP元件为7-26碱基对。
pMBV43质粒的其他不同之处是其具有两组终止子：
1.终止子1：为当其紧随shRNA发夹后时功能为终止子的一系列T段。
2.终止子2：与大肠埃希氏菌rrnC终止子相同，并具有以下序列：GATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT(SEQ ID NO：574)。
此外，pNJSZ质粒产生包含约131-135个碱基的总长度，且由约8个碱基的5′悬端、51个碱基对的shRNA和由约72-76个碱基组成的3’悬端组成的shRNA。相比之下，pMBV43质粒不产生5’悬端，而产生由2-5个碱基组成的显著较小的3’悬端，并产生51个碱基对的shRNA，即shRNA的总长度为53-70个碱基。为了很好地发挥功能，3’悬端需要至少2个碱基。因此，shRNA的总长度为53-70个核苷酸长度，优选53-65个核苷酸长度，更优选53-58个核苷酸长度，且最优选53-55个核苷酸长度。
FACS分析显示CEQ 221 pMBV43-H3进入哺乳动物细胞需要耶尔森氏菌侵袭素的表面表达。耶尔森氏菌和CEQ 221 pMBV43-H3(CEQ508)都具有侵袭素的表面表达。没有pMBV43质粒的CEQ221显示没有侵袭素表达。阴性对照：没有抗体的耶尔森氏菌。
CEQ508需要李斯特菌溶素(LLO)活性以使治疗性荷载(shRNA)在侵袭后逃脱哺乳动物细胞内涵体。通过以上描述的溶血试验测定LLO活性。CEQ508显示明显的溶血活性而没有质粒的CEQ 221或PBS则不显示溶血活性。
相对H3发夹RNA表达的定量实时PCR证明，CEQ508所含的H3 shRNA比其前体CEQ505高约20倍。如之前所公开的，CEQ505由源自MM294的大肠埃希氏菌构成，其中通过删除dapA基因和rnc基因产生命名为CEQ221的大肠埃希氏菌株，随后用质粒pNJSZc-H3转化，在质粒pNJSZc-H中，通过inv基因编码侵袭素的表达，通过hly基因编码李斯特菌溶素O的表达并且通过包含发夹序列H3的shRNA表达盒编码靶向β-连环蛋白mRNA的短发夹RNA。相比之下，如之前所公开的，CEQ508由含有pMBV43-H3质粒的大肠埃希氏菌株CEQ221构成，其编码假结核耶尔森氏菌侵袭素(由inv基因编码)、单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶素O(LLO)(由hly基因编码)和shRNA发夹序列H3。
图9显示利用CEQ508在人细胞(SW480)中沉默基因。A部分显示CEQ508能够在SW480细胞中以剂量依赖方式将哺乳动物β-连环蛋白mRNA沉默多达90％。利用CEQ221-pMBV43-lamin和CEQ221-pMBV43-luciferase处理对照。B部分显示CEQ 508能够在SW480细胞中以剂量依赖方式将哺乳动物β-连环蛋白沉默多达72％。利用CEQ221-pMBV43-luciferase处理对照。在DLD-1中细胞进行的类似实验表明，CEQ508能够将β-连环蛋白mRNA沉默大于50％。额外的试验证明利用CEQ508-H3沉默了HeLa细胞中的β-连环蛋白。将HeLa细胞培养在37℃的标准DMEM(10％FBS，1％Pen-Strep)中，当细胞汇合度为80％时向培养物中加入CEQ508-H3。利用相同遗传背景但表达靶向人核纤层蛋白(hlam)而非β-连环蛋白的发夹RNA的大肠埃希氏菌株处理对照。利用范围为1∶6.5至1∶51的多个感染复数(MOI)处理细胞2小时，然后洗涤四次。然后加入包含抗生素四环素和氧氟沙星的新鲜培养基，并在侵袭后48小时收集细胞。利用TRIZOL(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取RNA，并利用定量实时PCR进行基因表达分析。在用CEQ508-H3处理的HeLa细胞中观察到了β-连环蛋白的剂量依赖性沉默，但在用对照菌株处理的细胞中没有观察到。在最高MOI时，β-连环蛋白表达被降低至基础值的45％。
图10显示了在用CEQ508单次处理后在蛋白水平上(通过蛋白印迹)观察到SW480细胞中基因表达的降低，而没有在任何对照菌株中观察到。将SW480细胞培养在37℃的标准DMEM(10％FBS，1％Pen-Strep)中。当细胞汇合度为70％时加入CEQ508。用相同遗传背景但表达以下任一个：(a)靶向荧光素酶(luc)的发夹RNA，(b)具有侵袭性质侵袭素和李斯特菌溶素但不表达发夹RNA的细菌，或(c)不携带pMBV43质粒的空大肠埃希氏菌CEQ221(不具有侵袭性)的大肠埃希氏细菌菌株处理对照。利用范围为1∶50至1∶150的多个感染复数(MOI)处理细胞2小时，然后洗涤四次。加入包含抗生素四环素和氧氟沙星的新鲜培养基，并在侵袭后48小时收集细胞，然后利用标准方法提取全蛋白。在用CEQ508处理的SW480细胞中观察到了β-连环蛋白的剂量依赖性沉默，但在用对照菌株处理的细胞中没有观察到。在最高MOI时，β-连环蛋白表达被降低至几乎不能检测的水平。
此外，还进行了时程试验并且证明，在用CEQ508单次处理后SW480细胞中β-连环蛋白的表达在施用后至少1天、优选至少2天、更优选至少3天且最优选至少4天具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％且最优选至少80％的长期沉默。将SW480细胞培养37℃的标准DMEM(10％FBS，1％Pen-Strep)中使。当细胞汇合度为70％时加入CEQ508。利用具有相同遗传背景(大肠埃希氏菌株CEQ221)但不携带pMBV43质粒(即不携带用于侵袭的基因并因此不具有侵袭性)的细菌菌株处理对照。利用MOI为1∶200处理细胞2小时，然后洗涤四次。加入含有抗生素四环素和氧氟沙星的新鲜培养基，培养细胞且在达到90％的汇合度时进行传代。在侵袭后的指定时间点收集来自平行管的细胞。利用TRIZOL提取RNA，并利用定量实时PCR进行基因表达分析。所述结果显示，在用CEQ508单次处理后具有大幅(＞80％)的基因沉默，其在β-连环蛋白水平缓慢恢复至正常前保持至少4天。在10天附近的明显“过调量(overshoot)”被解释为由细胞系的传代引起的人为现象。
用两个不同剂量(低剂量107/ml和高剂量108/ml)的CEQ508(CEQ221/pMBV43H3)的处理没有导致人细胞(SW480)中核纤层蛋白的基因表达的显著变化(利用定量实时PCR测定)，这证明对其它基因没有有害影响。利用108/ml不含质粒的CEQ221细菌(无质粒，高)、分别为107/ml和108/ml的CEQ221-pMBV43-luciferase(pMBV43luc，高和低)和分别为108/ml和107/ml的不表达短发夹RNA的CEQ221-pMBV43(无发夹pMBV43，高/低)分别进行对照处理。这些数据证明，CEQ508处理不会引起其它基因的问题。
制作时程谱图以评价在野生型小鼠和荷载息肉的APCmin小鼠中单次口服饲喂CEQ508后0-12小时是否存在炎性细胞因子。利用单次剂量的CEQ508处理动物(野生型和APCmin小鼠，每个时间点每组3-7只)，在指定时间点采集血清。用400μg LPS静脉注射用作阳性对照的动物。分析了炎症细胞因子TNFα、IL6、IL12、IFNγ、MCP-1和IL-10，以作为对口服施用CEQ508的炎症反应的指示物。总之，在用CEQ508口服处理后所检测的炎症细胞因子均没有显示增加，这证明在用CEQ508处理后在野生型或荷载息肉的APCmin小鼠均没有全身炎症细胞因子反应。
表50证明，在口服饲喂CEQ508或CEQ501后胃肠粘膜中shRNA的药物代谢动力学。
表50
Figure BPA00001372421101121
Figure BPA00001372421101131
利用一次或重复CEQ508或CEQ501处理对小鼠给药，并分析胃肠粘膜组织以量化在处理后的多个时间点存积于GI粘膜中的shRNA的量。在用CEQ501或CEQ508给药的小鼠的肠粘膜中可检测到H3 RNA，而PBS/甘油处理的小鼠缺乏H3 shRNA。此外，与用CEQ501相比，在用CEQ508处理后的粘膜中检测到的H3 RNA的量显著较高，这与Δrnc突变赋予H3 shRNA具有更高产量且更好的稳定性相一致。但在末次给药(每日多次的给药方案)后24小时进行试验时，CEQ501和CEQ508在肠粘膜中均显示相当水平的H3 shRNA，这提示两个递送平台都实现了所递送发夹的相等稳态水平。
表51显示用于评价口服处理后小鼠中的活CEQ508细菌的药物代谢动力学的实验分组
表51
利用CEQ508通过口服强饲处理小鼠1、3或7次。每个剂量包含5x109cfu CEQ508。在末次给药后24小时分析组织。在无菌条件下取出组织并测定活的治疗性CEQ508细菌的存在。阳性对照动物用CEQ508的静脉注射处理。
表52显示了证明在这些单次或多次(一天一次，达7天)口服处理后，没有从所检测的任何器官回收到存活的CEQ508的药物代谢动力学。
表52
这些结果证明，CEQ508在小鼠中不能逃脱胃肠道(除了两只动物在灌饲损伤后显示假阳性细菌外)。在野生型小鼠(具有完整内脏屏障的正常健康小鼠)以及由于发育异常而使上皮屏障完整性受损的APCmin小鼠中均观察到这种现象。然而，在给药后5小时采集的粪便样品中回收到CEQ508，这证明存活细菌在贯穿肠长度内的运动。与预期相符，至给药后24小时从粪便样回收的存活CEQ508的数量迅速降低。在通过尾静脉的给予单次静脉注射的小鼠中回收到存活的CEQ508。在这些动物中，在注射后2小时检测的血液和器官中回收到CEQ508。存活细菌的量随后降低，但在(iv)给药后达96小时仍可在肝脏中回收到。
从接受单次口服剂量CEQ508(5.0x109cfu，灌饲，总体积为0.2ml)后的动物收集粪便样品。在前6个小时每小时收集粪便样品，然后每两小时收集直到24小时，然后是为每12小时收集直到108小时。为了能够收集计划总数为24只动物的粪便样品，将小鼠分为两组，每组12只并以12小时为轮转接受单次口服剂量CEQ508。将粪便样品重悬在1ml无菌PBS中，用无菌PBS稀释到10mL，然后将50μL该悬液铺在非选择性LB/DAP平板上，其中预期在非选择性LB/DAP平板上来自粪便样品的所有细菌都生长，并且预期在包含LB/Kan/DAP的选择性平板上仅有来自粪便样品的治疗性CEQ508细菌生长。然后对细菌集落进行计数。根据粪便样品中CEQ508的汇合度，将小鼠细分为以下组：0CFUs、＜100CFUs、＜1000CFUs、＞1000CFUs。最终，如表53所示，计算具有某种特定量细菌的小鼠的百分数。
表53
Figure BPA00001372421101151
表53显示，在用CEQ508单次口服处理后，在前2个小时小鼠开始排出存活细菌。粪便样品中CEQ508的量在5小时时达到峰值(即所有小鼠都排出＞1000CFU的存活CEQ508)，在给药后达8小时都保持升高并随后逐渐降低。在给药后24小时，多数经处理的小鼠仅排出少量CEQ508(即33％＜1000CFU和63％＜100CFUs)。在经处理小鼠总数中，仅有三分之一(33.3％)在处理后36小时仍继续在粪便样品中排出存活CEQ508(＜100CFUs)，然而在处理后48、60、72、84、96或108小时没有动物排出存活CEQ508。总而言之，这些数据证明CEQ508不仅通过胃肠道，还被快速消除并且不能在内脏中居留并增殖。在给药后5小时粪便样品中的CEQ508达到峰值，在给药后达8小时保持升高并且随后逐渐降低，而在给药后48、60、72、84、96或108小时没有动物排出存活CEQ508。
实施例32：用于治疗由β-连环蛋白上调介导的病变的CEQ509
药物候选物CEQ509由细菌治疗颗粒(BTP)组成，其中所述BTP是源自包含pNJSZc质粒的大肠埃希氏菌菌株CEQ210的迷你细胞。菌株CEQ210是借助于购自CGSC的具有5-菌株-基因破坏组(Datsenko and Wanner，2000(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640))，使用λ噬菌体Red重组系统通过删除minC基因而由大肠埃希氏菌菌株MM294得来。pNJSZc质粒编码shRNA发夹，由inv基因编码的假结核耶尔森氏菌侵袭素和由hly基因编码的单核细胞增生李斯特菌李斯特菌溶素O(LLO)。通过低速离心纯化BTP，根据其形成集落的能力而产生＞99.9％的纯度。
已经进行了多个实验以评价CEQ509的tkRNAi活性，所述试验包括对于由pNJSZc质粒的hly基因编码的LLO蛋白的试验。证明了当使用等量(等生物量)的BTP时，CEQ509 BTP与CEQ501相同的LLO活性。
CEQ509需要单核细胞增生李斯特菌李斯特菌溶素O(LLO)活性以逃脱吞噬体并将所述发夹释放至细胞质中。通过在pH 5.5的溶血测定LLO活性。目测观察到溶血并通过测定540nm的吸收度定量。对于吸收度的测定，利用经PBS处理的样品作为分光光度计的空白对照。CEQ509-H3和CEQ509-HPV是含有针对β-连环蛋白和HPV E6蛋白(用作对照)的H3 shRNA的BTP。
FACS分析证明了侵袭素存在于CEQ509 BTP的表面。
CEQ509 BTP进入哺乳动物细胞需要CEQ509表面表达假结核耶尔森氏菌侵袭素。
定量实时PCR(qPCR)分析证明，CEQ509 BTP不含任何H3 shRNA并且仅产生背景信号。
最后，在如图11所示的tkRNAi试验中测定了BTP。图11显示了利用CEQ509的β-连环蛋白沉默。以所示感染复数(MOI)由CEQ509-H3或CEQ509-HPV BTP感染COS-7细胞。在48小时后收集细胞的RNA并对β-连环蛋白mRNA进行基于qPCR的定量。绘制CEQ509-H3感染的细胞与以以相应MOI的CEQ509-HPV感染的细胞的相对定量(RQ)比值曲线。该数据和其它数据显示CEQ509沉默了30-50％的β-连环蛋白。所述试验证明，侵袭素表达的水平足以诱导tkRNAi介导的基因沉默。

Claims (35)

1.包含原核载体的侵袭性大肠埃希氏细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因，其中所述siRNA干扰β-连环蛋白的mRNA，并且与野生型大肠埃希氏细菌相比，所述侵袭性大肠埃希氏细菌的RNase III活性降低。
2.原核载体，其包含编码一个或多个siRNA的一个或多个DNA分子、经修饰的PlacUV5启动子、至少一个Inv基因座和至少一个HlyA基因，其中所述siRNA干扰β-连环蛋白的mRNA。
3.向哺乳动物细胞递送一个或多个siRNA的方法，所述方法包括向所述哺乳动物细胞中引入权利要求1所述的至少一种侵袭性大肠埃希氏细菌。
4.调节哺乳动物细胞中的基因表达的方法，所述方法包括向所述哺乳动物细胞中引入权利要求1所述的至少一种侵袭性大肠埃希氏细菌。
5.治疗或预防有需要的哺乳动物的与β-连环蛋白过表达相关的疾病或病变的方法，所述方法包括调节所述哺乳动物中β-连环蛋白的表达，其包括向所述哺乳动物的细胞中引入权利要求1所述的至少一种侵袭性大肠埃希氏细菌。
6.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述细菌中删除了编码RNase III的rnc基因。
7.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，与野生型大肠埃希氏细菌相比，所述RNase III活性降低至少90％。
8.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，与野生型大肠埃希氏细菌相比，所述RNase III活性降低至少95％。
9.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，与野生型大肠埃希氏细菌相比，所述RNase III活性降低至少99％。
10.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述一个或多个DNA分子在所述侵袭性细菌中被转录成一个或多个shRNA。
11.如权利要求10所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述一个或多个shRNA包含3’悬端或平末端。
12.如权利要求11所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述3’悬端为2-5个碱基对。
13.如权利要求11所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述3’悬端不超过2个碱基对。
14.如权利要求10所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述一个或多个shRNA被加工成一个或多个siRNA。
15.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述原核载体进一步包含至少一个终止子序列。
16.如权利要求15所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述至少一种终止子序列包含至少5个连续的胸苷碱基对。
17.如权利要求15所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述细菌进一步包含第二终止子序列。
18.如权利要求17所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述第二终止子序列为rrnC终止子序列。
19.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述原核启动子进一步包含至少一个UP元件。
20.如权利要求1所述的侵袭性大肠埃希氏细菌，其中，所述侵袭性细菌为减毒的、不致病的或无毒的细菌。
21.组合物，其包含权利要求1所述的侵袭性细菌和药学上可接受的载体。
22.如权利要求5所述的方法，其中，用约103-1011侵袭性细菌感染所述哺乳动物细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中，用约105-109侵袭性细菌感染所述哺乳动物细胞。
24.如权利要求5所述的方法，其中，以约0.1-106范围的感染复数感染所述哺乳动物细胞。
25.如权利要求25所述的方法，其中，以约102-104范围的感染复数感染所述哺乳动物细胞。
26.如权利要求5所述的方法，其中，与野生型β-连环蛋白表达相比，或者与向所述细胞引入所述侵袭性细菌之前的β-连环蛋白表达相比，所述β-连环蛋白表达降低。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述β-连环蛋白表达降低是指β-连环蛋白mRNA的表达降低。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述β-连环蛋白表达降低是指β-连环蛋白的表达降低。
29.如权利要求26所述的方法，其中，与野生型β-连环蛋白表达相比，或者与向所述细胞引入所述侵袭性细菌之前的β-连环蛋白表达相比，所述β-连环蛋白表达降低至少50％。
30.如权利要求26所述的方法，其中，与野生型β-连环蛋白表达相比，或者与向所述细胞引入所述侵袭性细菌之前的β-连环蛋白表达相比，所述β-连环蛋白表达降低至少75％。
31.如权利要求26所述的方法，其中，与野生型β-连环蛋白表达相比，或者与向所述细胞引入所述侵袭性细菌之前的β-连环蛋白表达相比，所述β-连环蛋白表达降低至少90％。
32.如权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物的与β-连环蛋白过表达相关的疾病或病变选自由以下组成的组：结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、Gardner综合征、肝细胞癌(HCC)、基细胞癌、毛母质瘤、成髓细胞瘤和卵巢癌。
33.如权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组：结肠上皮细胞、直肠上皮细胞、小肠上皮细胞、肝细胞、皮肤上皮细胞、毛细胞、神经细胞和卵巢细胞。
34.如权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物选自由以下组成的组：人、牛、绵羊、猪、猫、水牛、犬、山羊、马、驴、鹿和灵长类。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述哺乳动物为人。
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