CN112410275A - 流感的大肠杆菌介导的siRNA沉默 - Google Patents

Abstract

本发明描述了利用非致病性细菌向细胞递送一种或多种小干扰RNA(siRNA)来预防或治疗流感病毒的产物和相关方法。所述siRNA显示出防止疾病的临床症状发作或降低严重性，包括降低病毒滴度或病毒脱落。

Description

流感的大肠杆菌介导的siRNA沉默

本申请是申请日为2015年1月23日的PCT国际专利申请PCT/US2015/012704进入中国国家阶段的中国专利申请号201580011665.5、发明名称为“鸡禽流感的大肠杆菌介导的siRNA沉默”的分案申请。

相关申请的交互参考

本申请要求2014年1月23日提交的美国临时申请No.61/930,821和2014年4月29日提交的美国临时申请No.61/986,033的权益。

技术领域

本发明涉及治疗或预防家禽中的禽流感的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及干扰鸡和其他家禽中的禽流感病毒复制的siRNA组合物。

背景技术

禽流感病毒(AIV)是在许多禽物种中感染特定组织、包括呼吸、消化和/或神经系统组织的病毒性疾病。虽然在野生禽类中很少致死，但AIV是高度传染性的并且当传播到家禽时经常是致死性的(Swayne和Halvorson 2008，Capua和Marangon 2006，Horimoto和Kawaoka 2001)。高致病性禽流感(HPAI)病毒迅速感染家禽并且经常是致死性的，病死率接近100％(Horimoto和Kawaoka 2001)。低致病性禽流感(LPAI)病毒通常引起可能不被发现的轻度疾病；然而，LPAI的经济影响在于造成生产损失。LPAI和HPAI爆发的风险对家禽业是重大威胁。

目前对家禽中AIV的预防性方法是受限的。正如由病毒在疫苗接种过的禽类中复制的能力所证明的，现有的疫苗不能提供完全免疫(Capua等2004)。疫苗依靠健全的免疫系统并且由于病毒抗原的进化而可能变得无效(Arzt等2010，Escorcia等2008，Zhou等2008，Bennink等2004，Ge等2004)。以前的研究结果显示，来自家禽的AIV实地分离株在它们的遗传信息中表现出不断的漂移，并且归因于疫苗株的抗原性差异可能有助于所述病毒在实地的持留(Escorcia等2008，Lee等2004)。有趣的是，一些为了控制HPAI爆发而创制的疫苗是新的HPAI爆发的前兆。疫苗保护可能要花超过一周来获得(Kim等2009)；因此，在爆发期间疫苗接种几乎提供不了保护。疫苗接种通过肌内注射最有效，但肌内注射对于大规模疫苗给药是不实际的。最后，储存和操作不当经常导致疫苗失效。还日益担心当前的禽H5N1病毒正变得耐受金刚烷胺、金刚烷乙胺和奥司他韦(Cheung等2006，Le等2005，de Jong等2005)。报告已经将使用这些常见药的治疗与耐药病毒的脱落联系起来。例如，在保护禽类养殖场的紧急尝试中，据报告中国在2005H5N1爆发期间施用了金刚烷胺。这种错用导致了在中国和东南亚传播的耐药株(Cheung等2006)。缺少可靠的预防药和这种疾病的地方性质突出了开发在家禽中更有效的控制措施作为控制AIV传播和减少爆发对家禽操作的影响的手段的急迫性。特别有价值的是考虑能够保护家禽对抗AIV的任何亚型或病毒株的新预防性策略。

在缺乏有效控制时，家禽中AIV爆发可以是毁灭性的并且可能的经济损失估计值是巨大的。当AIV流行袭击具有更高密度的禽类养殖场的地区时，尤其如此。尽管有严格的生物安全措施和销毁工作，这些地区仍然成为爆发的高风险地点并且经常面临相当大的控制AIV传播的挑战。一旦通过呼吸分泌物和粪便传播，AIV的潜伏期可能持续长达10天并且大多数感染的家禽脱落病毒7到10天，使得病毒在禽群中长时间传播(Easterday等1997)。这种潜在的长脱落期增加了对家禽的传播风险，尤其是在更大的群体内(Easterday等1997)。开发强有力的抗流感技术是有效管理和控制这种疾病在家禽中蔓延以使经济损失和传播到其他易感物种(包括人类)的风险最小化的关键步骤。

当前的禽类疫苗接种策略是受限的，因为它们不提供完全免疫、依靠健全的免疫系统、对病毒抗原性进化易感、在大规模商业家禽操作中要求对每只禽进行单独处理、储存期有限、和要花几个星期才能获得疫苗接种后抗体保护。因为这些挑战，在美国，AIV疫苗接种很少用于家禽的预防性应用。如果采取紧急疫苗接种程序，如果在爆发期间施用的话，它将几乎不提供保护。此外，越来越多的关于出现耐药性AIV变体的证据提出了使用药物疗法例如金刚烷胺、金刚烷乙胺和奥司他韦的风险。这些限制表明，真正的需要是开发不仅能够防御病毒的不同亚型和耐药株，而且在如果爆发发生并且在短时期内疫苗接种不可行或不生效时提供瞬时保护的预防策略。

发明内容

本发明提供了利用非致病性细菌向禽类细胞递送一种或多种小干扰性RNA(siRNA)以预防或治疗禽流感病毒(AIV)的产物和相关方法。所述siRNA与AIV NP或PA序列的mRNA互补。在鸡的攻击研究中，所述siRNA显示出防止疾病的临床症状发作或降低严重性，包括降低病毒滴度或病毒脱落。

在第一方面，本发明提供了包含原核载体的非致病性大肠杆菌(E.coli)。所述载体是编码一种或多种siRNA和控制所述siRNA转录的启动子的DNA分子。由所述载体编码的siRNA干扰一种或多种禽流感病毒RNA分子，从而抑制所述AIV的复制。另外，所述细菌被工程改造成表达至少一种inv基因和至少一种hlyA基因。所述inv基因产物帮助所述细菌进入靶细胞中。

在所述第一方面的有利实施方式中，所述siRNA干扰NP、PA、PB1或PB2 mRNA。在其他有利的实施方式中，所述siRNA与多个亚型共有的禽流感病毒mRNA序列互补。理想地，所述siRNA将靶向在大多数亚型中保守的序列。以这种方式，所述siRNA将有效对抗尽可能多的亚型。然而，共有序列可能是更受限的并且它们可以随时间改变。因此，siRNA可以被设计成有效对抗多个亚型，纵然不是全部亚型的话，并且可以使用有各种不同siRNA的“混合物”方式来覆盖广阔的AIV谱。

在第一方面的其他实施方式中，所述siRNA可以从包含选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列的DNA序列产生。类似地，如果在质粒具有选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQID No.15和SEQ ID No.17的序列的情况下，所述siRNA可以从编码转录本的质粒产生。

用于控制所述siRNA转录的启动子可以是T7启动子、T3启动子或SP6启动子。所述siRNA可以靶向保守序列，其中被靶向的保守序列是多个禽流感亚型共有的。并且所述原核载体是编码inv基因和hlyA基因的质粒，从而促进所述细菌进入细胞中并在进入后从内涵体递送来自所述细菌的siRNA。

在第二方面，本发明提供了治疗家禽中的禽流感或降低禽流感蔓延风险的方法。所述方法包括向家禽施用根据第一方面所述的包含非致病性大肠杆菌的组合物的步骤。在有利的实施方式中，所述组合物作为适合于吸入的气雾剂经鼻内或喷雾施用。在其他有利的实施方式中，可以施用多个大肠杆菌菌群。在施用多个菌群的情况下，每个大肠杆菌菌群可以被工程改造成表达干扰一种或多种禽流感病毒RNA分子的不同的siRNA分子。通过这样的策略，可以在单次预防性施用中靶向多个AIV mRNA。

在第三方面，本发明提供了药物组合物，其具有递送两种不同siRNA的两种不同的非致病性大肠杆菌。换句话说，第一种非致病性大肠杆菌具有编码一种siRNA的原核载体，其中编码的第一种siRNA干扰一种或多种禽流感病毒RNA分子，并且第二种非致病性大肠杆菌具有编码不同siRNA的原核载体，其中编码的第二种siRNA干扰不同的禽流感病毒RNA分子或相同禽流感病毒RNA分子的不同部分。所述组合物在可药用载体中提供。在有利的实施方式中，编码的第一种siRNA序列可以包括SEQ ID No.3并且编码的第二种siRNA序列可以包括SEQ ID No.4。所述第一种细菌和第二种细菌可以被工程改造成表达至少一种inv基因和至少一种hlyA基因。

在第四方面，本发明提供了通过向家禽施用根据第三方面所述的组合物来治疗家禽中的禽流感或降低禽流感蔓延风险的方法。

在第五方面，本发明提供了通过向鸡施用包含具有原核载体的侵袭性大肠杆菌的组合物的步骤来治疗鸡中的禽流感或降低禽流感蔓延风险的方法。然而，所述载体，虽然包含DNA分子，却不编码与任何已知的鸡基因或禽流感病毒RNA分子互补的siRNA。换句话说，所述细菌可以表达siRNA，或者它可以不表达siRNA，但如果它表达siRNA的话，该siRNA不与任何已知的鸡基因或禽流感病毒RNA分子互补。所述细菌被工程改造成表达至少一种inv基因和至少一种hlyA基因。

在第六方面，本发明提供了具有编码一种或多种siRNA的一种或多种DNA分子、控制所述siRNA转录的启动子、至少一种inv基因和至少一种hlyA基因的原核载体。编码的siRNA干扰禽流感病毒的mRNA。在有利的实施方式中，根据第六方面所述的载体可以产生干扰NP、PA、PB1或PB2 mRNA的siRNA。另外，所述siRNA可以包含选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。

在第七方面，本发明提供了通过向家禽施用包含第六方面所述的原核载体的组合物来治疗家禽中的禽流感或降低禽流感蔓延风险的方法。在有利的实施方式中，所述组合物可以是利用编码其他siRNA的其他原核载体的混合物，其中所述siRNA干扰禽流感病毒的其他mRNA转录本。

附图说明

为了更完全了解本发明，应该结合附图参考以下详细说明，在所述附图中：

图1是一系列四个图(图1A-1D)，显示了通过按日、MOI和病毒示出的中位滴度降低而测量的siRNA保护。*表明利用Wilcoxon秩和检验，与相应的未处理样品有统计学显著性差异(p<0.05)。

图2是显示在正常生长培养基(WM)、感染培养基(IM)中培养的或用A/火鸡/科罗拉多/235497/2003(H8N4)(感染的)感染的LMH细胞中β-肌动蛋白(ACTB-282bp)和β1-整合素(ITGB1-308bp)的mRNA表达的图像。泳道：1)在WM中的ITGB1；2)在IM中的ITGB1；3)感染的ITGB1；4)在WM中的ACTB；5)在IM中的ACTB；6)感染的ACTB；和7)阴性PCR对照。

图3是一组六个图像，显示了带有RFP标签的抗AIV_乱序(scramble)载体。向鸡LMH细胞给予两种剂量的RFP-载体(高＝7.8e5CFU/mL和低＝1.95e5 CFU/mL)。在侵袭后2和24小时评价载体摄取。*注意，白色箭头指向红色荧光区域，所述红色荧光区域在灰度图上是不清楚的。

图4是一系列四个图(图4A-4D)，显示了通过按日、MOI和病毒示出的中位滴度降低而测量的抗AIV载体保护。星号(*)指示利用Wilcoxon秩和检验，与相应的未处理样品有统计学显著性差异(p<0.05)。

图5是一系列六个图像，显示了带有RFP标签的抗AIV_乱序载体。将鸡用RFP载体鼻内处理并在处理后15和27小时评价摄取。*注意，白色箭头指向红色荧光区域，所述红色荧光区域在灰度图上是不清楚的。

图6是一系列三个图(图6A-6C)，显示了在研究期内，每日A/鸡/德克萨斯/473-2/10(H6N2)病毒滴度和脱落病毒的鸡的比例。(A)逐日绘制的代表所有鸡(脱落和不脱落)的中位病毒滴度(Log EID50 eq/mL)。在第4日上面的线是PC；在第4日中间的线是乱序载体；并且在第4日下面的线是混合物。(B)代表鸡脱落并且逐日绘制的中位病毒滴度。每日从左至右：混合物；乱序载体；PC。(C)在每组总共n＝10只鸡中，逐日示出的脱落H6N2病毒的鸡的比例(％)；但是，第10日在PC组中由于一只鸡死亡，因此代表的是n＝9的观察结果。逐日示出的中位滴度(B)表示在那日脱落H6N2病毒的鸡的比例(C)。每日从左至右：混合物；乱序载体；PC。

具体实施方式

开发强有力的抗流感技术是有效管理和控制AIV在家禽中蔓延以使经济损失和传播到其他易感物种(包括人类)的风险最小化的关键步骤。当前的禽类疫苗接种策略是受限的，因为它们不提供完全免疫、依靠健全的免疫系统、对病毒抗原性进化易感、在大规模商业家禽操作中要求对每只禽进行单独处理、储存期有限、和要花几个星期才能获得疫苗接种后抗体保护。因为这些挑战，在美国，AIV疫苗接种很少用于家禽的预防性应用。如果采取紧急疫苗接种程序，如果在爆发期间施用的话，它将几乎不提供保护。此外，越来越多的关于出现耐药性AIV变体的证据提出了使用药物疗法例如金刚烷胺、金刚烷乙胺和奥司他韦的风险。这些限制表明，真正的需要是开发不仅能够防御病毒的不同亚型和耐药株，而且在如果爆发发生并且在短时期内疫苗接种不可行或不生效时提供瞬时保护的预防策略。

为了开发替代性抗病毒药，已经探索了利用siRNA的RNA干扰(RNAi)，以利用siRNA控制人类和家畜物种中的疾病(Lyall等2011，Long等2010，Chen等2009)。RNAi介导剂的递送已阻碍了它的临床应用(Li和Shen 2009)。因为siRNA不能独立地跨过细胞膜，因此，它们需要递送媒介例如基因工程改造的病毒和合成载体(Aigner 2009，Li等2006，Ge等2004)。这些病毒和合成siRNA媒介对临床功效造成了严重的局限性和顾虑(Ge等2004)。病毒载体能引发造成细胞死亡的强免疫应答(Davidson和McCray 2011，Ge等2004)。控制具有病毒载体的RNAi剂的剂量是困难的并且可以导致RNAi/microRNA系统的饱和，引起肝毒性(Beer等2010，Hacein-Bey-Abina等2008，Grimm等2006)。病毒载体可以整合到宿主基因组中并引起肿瘤发生(Davidson和McCray 2011，Beer等2010，Hacein-Bey-Abina等2008，Ge等2004)。实际上，近期的研究警告了来自短发夹RNA(shRNA)病毒载体的脱靶效应，其在转基因动物中导致细胞死亡和器官问题(Grimm等2006)。最后，合成的RNA媒介具有低递送效率并且需要较高的剂量，这不仅成本过高，而且经常是有毒性的(Ge等2004)。因此，迫切需要致力于获得基于RNAi的抗病毒药、特别是对抗家禽中的AIV的基于RNAi的抗病毒药的更好的递送机制。会特异性靶向AIV感染和复制的主要位点——肺和呼吸组织的安全有效的siRNA递送媒介是特别有希望的途径。这种类型的系统会改善更有效的抗流感预防药的递送特异性，同时由于全身给药而使siRNA损失最小化并降低siRNA相关毒性。

因此，开发了transkingdom RNAi(tkRNAi)递送平台来提供对鸡上皮细胞中AIV的抑制。TkRNAi使用非致病性细菌来产生和递送沉默性RNA到粘膜上皮组织，并且证明了是通过施用于鸡的上气道来预防流感的有希望的递送方法。这些细菌在遗传上被工程改造成产生mRNA靶特异性的shRNA，侵袭粘膜上皮细胞，并将它们的shRNA有效载量释放到寄主细胞的细胞质中。据认为，一旦释放到细胞质中，这些shRNA就被加工成siRNA并随后沉默互补的mRNA靶，从而触发RNAi(Buttaro和Fruehauf 2010，Xiang等2006)。这里使用的tkRNAi系统包含已经被特殊的shRNA生成质粒(pMBV43)转化的大肠杆菌。这些pMBV43质粒和载体大肠杆菌的特征在于几种组分。它们包括在T7 RNA聚合酶启动子控制下的shRNA表达盒、和终止子，用于在流感易感性呼吸道上皮细胞的细胞质中成功释放和产生siRNA。引入来自假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵袭基因(inv)为在大肠杆菌表面上表达侵袭素蛋白质做准备。侵袭素与粘膜上皮细胞的表面上存在的β1整合素受体相互作用，导致载体细菌摄入到靶上皮细胞的内涵体中。一旦大肠杆菌被摄取到所述宿主细胞中，它们需要逃脱宿主液泡以释放到细胞溶质中。所述细菌被编码成从hlyA基因表达李斯特溶解素O(Listerolysin O)(LLO)，这是来自单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的成孔毒素(Xiang等2006，Mathew等2003，Radford等2002，Grillot-Courvalin等1998)。由于宿主溶酶体的低pH环境和缺少营养素，所述细菌在内涵体内部溶解，随后释放这种细菌毒素，其导致内涵体膜破裂(Nguyen和Fruehauf 2009)。于是，在细胞质中，所释放的shRNA被Dicer加工成siRNA，合并到RNA-诱导的沉默复合体(RISC)中，并触发RNAi途径来沉默被靶向敲除的基因。利用tkRNAi，我们开发了能够生成并递送靶向NP和PA AIV基因的siRNA的新RNAi抗病毒药。这种新方法被应用于禽类组织模型，以演示利用抗AIV载体抑制禽流感复制和脱落的概念的体外证据，所述模型的建立也在本文中公开。

对家禽进行疫苗接种以对抗AIV的经济奖励很低并且经常归因于疫苗的几个限制。这些限制和缺少奖励对有效控制家禽中AIV爆发造成了明显的障碍。开发新的抗流感技术是对于有效管理和控制这种疾病在家禽中蔓延、使财务损失最小化、和降低传播给其他动物(包括人类)的风险的关键步骤。应用RNAi方法来开发对抗AIV的替代抗病毒药是有希望的选择。然而，RNAi介导剂的递送仍然是限制其临床应用的障碍。Transkingdom RNAi(tkRNAi)利用非致病性细菌来产生siRNA并将siRNA递送到靶组织，并且可能是获得RNAi方法的临床应用的关键。构建TkRNAi载体(抗AIV载体)以产生靶向病毒基因NP和PA的siRNA，并在已建立的禽类组织模型中评价这些载体的保护性功效。

首先在用带有红色荧光蛋白标签的载体处理的鸡LMH细胞中验证载体摄取和侵袭。接着，将细胞用抗AIV载体处理并用两种不同的LPAI亚型H8N4和H6N2感染。以日为控制变量的多变量线性回归分析揭示了用所述抗AIV载体处理的样品和那些未处理的样品之间校正平均脱落滴度的显著差异(p<0.05)。靶向NP和PA这两个基因的载体混合物在鸡LMH细胞上清液中提供了高达10,960-倍的脱落滴度降低(p<0.05)。该工作演示了在已建立的禽类组织模型中利用这些新型抗AIV载体抑制AIV的概念的体外证据。该工作代表了在禽类模型中利用所述tkRNAi系统和抑制流感复制的第一个这样的实例。

因为NP和PA蛋白二者在AIV转录和复制中发挥关键的作用，所以它们代表了通过siRNA抑制病毒复制的主要靶标。设计经过抗原性漂移和抗原性转变仍能有效的siRNA需要靶向基因内部在不同的AIV亚型和病毒株之间保守的区域。由于它们在病毒转录和复制中的作用以及作为保持最佳病毒适应度的方式，NP和PA各自含有在大多数A型流感病毒中发现的一段保守核苷酸。这些短序列在病毒复制中发挥的特定作用还有待于确定。然而，在鸡、人、犬、马和猪流感基因组中都发现了这些短保守序列。与NP和PA基因不同，HA和NA区段不含用于siRNA设计的21个保守核苷酸段。在成功转录和复制中对这些保守区域的依赖性致使所述NP和PA基因中的这些短序列成为siRNA设计的主要靶标。

几乎所有调查siRNA应用的研究都在哺乳动物细胞中评估，而缺少利用禽类模型的研究。基于几个原因，使用哺乳动物细胞是明显的限制。首先，因为大部分RNAi设计工具是利用哺乳动物系统开发的，这些工具可能设计出当被引入禽类细胞培养物时不太有效的siRNA，导致RNAi效率较低。其次，AIV是禽类物种的疾病。因此，使用相关的禽类组织模型来确定RNAi是否是防止家禽中AIV复制的有效方法，是必要的。以前的RNAi转染和病毒感染研究通常选择的病毒是从人类和其他哺乳动物分离的实验室改造的病毒。如果我们试图确定RNAi是否是防止家禽中AIV复制的有效方法，则利用通常从家禽分离的天然存在的禽流感病毒进行这些研究是至关重要的。

AIV被公认为国立过敏和传染性疾病研究所(National Institute of Allergyand Infectious Diseases)生物防御C类优先病原体、经济上重要的家禽疾病、和重大公众健康威胁，因为来源于动物的病毒有引起下一步人类流行的潜力(Carver和Krushinskie2006，Webster 1997)。AIV侵害许多食用禽类，包括鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和珍珠鸡。在文献中，有LPAI和HPAI在家禽中重大全球爆发的数不清的描述。这些爆发引人关注，不仅因为在家禽中观察到的毒力程度导致严重的经济后果，而且是由于传播给哺乳动物物种的能力。高度致病性的H5N1禽类病毒株目前在许多国家流行。家禽中HPAI爆发已经导致数百万动物的剔除和数十亿美元的净损失。自从2003年以来，H5N1病毒株已经引起了648个人类病例，其中384例是致死的(2013：WHO在人类动物交界处的流感(Influenza at the human animalinterface))。令人震惊的是，现在已经报告了大约150例的LPAI(H7N9)病毒的人类感染，其中约33％已经导致死亡(疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)2014)。

AIV传播给人类的主要风险因数是直接接触和处理家禽(Vong等2009，Areechokchai等2006，Dinh等2006，Wang等2006，Bridges等2002，Mounts等1999)，因此大部分人类病例是当人类和家畜之间的密切接近导致传播时发生的。因为流行病毒的数量在家禽中增加，因此传播给人类的风险和重配成更容易在人类中传播的形式的潜力也增加(Gatherer 2010)。因此，对于降低对人类的风险来说，家禽中的AIV预防必须是主要关注点。在几乎没有或没有免疫力的人群中出现新型可传播AIV，将引起没有疫苗可用的全球大流行。这些病毒株特别令人担忧，因为它们耐受最成本有效的抗病毒药物，金刚烷胺和金刚烷乙胺(He等2008，Lee等2008，Pinto和Lamb 1995，Belshe等1988)。

正如具有在位的早期检测规程和警报系统作为控制和管理家禽中AIV的手段是至关重要的，还必须有可利用的有效预防性措施为潜在性爆发作准备。家禽疫苗接种可以有助于控制HPAI病毒并降低经济损失和动物传染病传播，然而疫苗接种不是家禽养殖场的常见做法，因为它不被认为是可行的选项。此外，如果在紧急情况下采取疫苗接种，它很可能是在爆发已经被确定后发生的。疫苗保护需要花两到三周来获得(Kim等2009)，并且经常需要重复给药来引起完全的保护(Poetri等2011)。因此，在爆发期间疫苗接种可能对控制传播链几乎没有作用，尤其在家禽数量密集的地区。开发用于家禽的强有力的抗流感技术是有效管理和控制这种疾病在全世界蔓延的关键步骤。

之前描述的工作研究了利用RNAi递送平台tkRNAi在鸡上皮细胞中抑制AIV。这种tkRNAi系统利用工程改造的大肠杆菌来产生对抗NP和PA病毒基因的短发夹RNA并成功地将所述shRNA递送到细胞内。在给药二十四小时内，这些载体在体外导致AIV复制显著减少。这些进程证明了这些新型抗AIV载体在我们的禽类组织模型中的瞬时抗病毒潜力。在继续追求我们的长期目标、即将这种抗流感技术开发成为能促进更有效和强大的家禽AIV控制方法的开发的预防药中，本研究的目的是评价这些抗病毒载体在实验性攻击的鸡中的鼻内施用和保护性功效。

基于临床保护(降低的发病率和死亡率)和通过检测攻击后的病毒脱落来评价疫苗功效。家禽中AIV疫苗接种的另一个目标是刺激免疫应答并防止个体动物被感染。这种预防药没有被工程改造成在个体动物中预防感染。这种新技术的作用模式是抑制病毒复制，从而在感染之后减少感染性病毒的脱落。理论上，如果鸡脱落的病毒量降低，则病毒载量降低并且动物更可能被临床保护。因此，为了提供这些抗AIV载体的初始功效，评价了这些载体在实验性攻击的鸡中降低发病率、死亡率和病毒脱落的预防能力。如果这种预防药能抑制禽类个体中禽类脱落的比例和脱落滴度，则在禽类群体中能更好地控制传播风险。因此，除了监测脱落性禽类的比例和脱落滴度之外，还利用在接受所述抗AIV载体的AIV攻击的禽类之中圈养的岗哨(sentinel)禽类测试传播潜力(参见下面的实施例3)。

用所述抗AIV载体处理的家禽不会产生抗AIV的抗体。这通常是与疫苗接种实践相关的局限性，因为疫苗刺激抗病毒的抗体产生。这造成与交换壁垒(trade barrier)相关的问题，使得难以判别抗体反应性是由于疫苗接种还是天然AIV感染。如果有有效的常规疫苗可用，它经常是不能使用的。国家不能冒失去无AIV疾病状态的风险，当由于疫苗接种产生的阳性血清学试验干扰疾病监控时，情况经常是这样。与接种疫苗的家禽不同，用所述抗AIV载体处理的那些家禽不会对AIV抗体测试阳性，并且不会需要利用区分感染与疫苗接种的试验(Differentiate Infected from vaccinated Assay)(DIVA)进一步测试。以这种方式，将避免与疫苗接种动物的反应性有关的教皇壁垒和额外的AIV筛选试验。

家禽业不会采用没有证明它的使用是AIV爆发的成本有效的对策的商业疫苗或任何其他预防药。这在低密度家禽地区尤其关键，在这种地区下爆发的风险被认为是可忽略的。影响疫苗接种成本的因素包括疫苗的保存期限或持久性、给药方法、能产生它的容易性和可及性。通常，利益必须高于疫苗接种或治疗的成本方能被视为有利的投资。

与其他RNAi治疗方法有关的局限性之一是与沉默性RNA的商业制造有关的成本。所提议的技术的显而易见的优点是细菌自身产生shRNA以供分裂成随后的siRNA序列的能力。这种特性消除了昂贵的siRNA制造和高生产成本(Xiang等2009，Keates等2008，Xiang等2006，Gardlik等2005)。在疫苗被认为必要的地区中，国家每年会储备数百万剂疫苗用于突然事件的准备。很多次当发现这些疫苗距离现场病毒很远时，它们就变得过期了。产生大量细菌是简单和快速的。因此，与疫苗可能花数月来配制和甚至更长时间来获得足够的量不同，这些载体可以容易地从少量原料产生巨大的量。如果储存得当，这些细菌性载体可以具有无限的储存期限。这是超越当前疫苗的又一个主要优点。

疫苗接种和其他RNAi方法具有共同的与给药和靶向递送相关的障碍。大多数AIV疫苗必须皮下给药，使得它们给药繁琐和效率低。这些抗AIV载体允许靶向呼吸递送并特异性侵袭到表达β1-整合素的粘膜上皮细胞中。与其他组织和器官不同，包括肺在内的呼吸组织是难以置信地易接近的，使得这种抗AIV技术理想地用于预防呼吸疾病，如流感。鸡具有位于眼睛中部的腺，称为哈氏腺(Harderian gland)，该腺被认为对于在上呼吸道中产生局部免疫应答是关键的(Wight等1971)。基于这个理由，滴眼液疫苗接种被认为通过哈氏腺刺激了粘膜免疫反应，如果将这些载体施用于眼中的话，也能这么说。所述抗AIV载体可以被容易地修改成鼻内、口服、通过滴眼液施用、或作为适合于吸入或眼睛递送的喷雾气雾剂施用。

这些载体将提供成本有效的持久的产物，所述产物可容易地用于在商业家禽操作上进行大规模应用。递送的多用性和它可以容易地修改成供大规模应用赋予了这种技术超过当前疫苗的优点并等同于提供有效率的递送和肺组织定位的系统。这些品质使得这种技术在爆发疫情期间在减少病毒脱落和病毒在家禽群体之间传播上尤其有利。

功效是理想的AIV疫苗或替代的家禽预防药的本质特性。术语“有效的”是用于确定疫苗或替代性预防药在标准化实验性攻击研究中的保护性，所述保护性根据预防死亡率、发病率、脱落和AIV在家禽中传播来度量。疫苗对HPAI的功效的行业标准是降低的发病率和死亡率。在LPAI实验性攻击的SPF鸡中观察到非常小的发病率和死亡率，使得难以确定疫苗对LPAI分离株的功效。确定疫苗对抗LPAI分离株的功效如何，常规是定量鸡的口咽部滴度。因为目前家禽可用的疫苗不提供杀菌性免疫，所以有效控制工具应该是将病毒脱落降低到最大可能的程度(Sylte和Suarez 2012)。这些初始的试验性研究的结果表明，抗AIV载体处理将病毒复制和脱落滴度降至被认为临床相关的水平。然而，需要进行其他研究来进一步证明这种技术的保护性质。

家禽中的AIV疫苗接种比用于对抗大多数其他由病毒引起的疾病的疫苗接种更困难。这是由于大的抗原变异需要事先知道流行亚型，从而降低了疫苗功效。低疫苗功效和高成本与利益比通常抵销了任何提议的疫苗接种策略。当在家禽中检出AIV时，一般使用‘扑灭’或剔除策略来努力根除疾病。假定在将来的攻击研究和随机化现场试验中证明了功效、效能和环境安全性，我设想这种预防技术可能是抢先剔除高风险地区中的家禽的解决方案。然而，即使当选择疫苗接种作为爆发期间的应急工具时，它还经常结合其他控制方法，尤其是如果难以迅速剔除的话。以前的经验已经指出，为了成功控制并最终根除AIV，疫苗接种程序必须是更广泛的控制策略的一部分(Capua和Marangon 2006)。这包括严格的生物安全措施、监控、剔除、和可能实施这种预防技术的应用。

与功效相关的另一个问题是获得保护性免疫所必需的时间间隔。需要最少7到10日来刺激疫苗接种之后的初始免疫应答，并再需要2周来产生保护性抗体水平。这意味着即使作决定的过程是快步的并且有适当的疫苗供立即应用，但如果是在家禽中爆发活跃期间应用的话，疫苗接种未必有效。这种抗AIV载体技术会超过所述疫苗的关键益处在于它提供瞬时保护的能力。在爆发疫情期间，这种特性是难以置信地有利的。

实施例1–设计siRNA和在禽类组织模型中利用病毒特异性siRNA抑制禽流感

禽流感病毒(AIV)是对全世界家禽最重大的经济威胁。AIV疫苗有限，这突出了对考虑能保护家禽对抗爆发的新预防策略的需要。已开发了适当的禽类组织转染和AIV感染模型。这种禽类模型被用于证明靶向病毒复制所需要的两个关键AIV基因NP和PA的小干扰RNA(“siRNA”)的抗病毒潜力。将鸡LMH细胞用靶向NP和PA mRNA的siRNA转染并用两种不同的LPAI亚型H8N4和H6N2感染细胞。以日为控制变量的多变量线性回归分析揭示了用siRNA处理的样品和那些未处理的样品之间校正平均脱落滴度的显著差异(p<0.05)。各siRNA和待测siRNA混合物导致在鸡LMH细胞上清液中脱落滴度降低高达100倍(p<0.05)。该工作演示了在已建立的禽类组织模型中利用病毒特异性siRNA抑制禽流感复制的概念的体外证据。

材料和方法

细胞培养–选择鸡肝细胞癌上皮细胞(LMH细胞，ATCC CRL-2117)作为所述模型的禽类细胞系。这些细胞是可商购的，专门计划用于转染研究的，并且作为上皮肝细胞，它们代表了A型流感感染的适当禽类组织(Swayne和Pantin-Jackwood 2006，Shinya等1995)。将LMH细胞在37℃和7％CO₂存在下生长在Waymouth's MB 752/1培养基(Life Technologies)中，所述培养基含有10％胎牛血清(FBS，Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)、100单位/ml青霉素和1mg/ml链霉素(Life Technologies)。用于增殖所述LMH细胞的所有培养容器预先涂布有0.1％明胶(Millipore)。在LMH细胞中进行的全部转染和感染试验之后，Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞被用于测定病毒滴度和定量感染性病毒粒子。将MDCK细胞在37℃和7％CO₂存在下生长在最低必需培养基中，所述培养基具有Earle's平衡盐(MEM/EBSS)、2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(FBS)、0.5％丙酮酸钠(100mM溶液，Life Technologies)、0.5％MEM非必需氨基酸(NEAA，100x溶液，Life Technologies)、100单位/ml青霉素和1mg/ml链霉素(Life Technologies)。

病毒–下列LPAI禽流感病毒株在LMH细胞中增殖：A/鸡/德克萨斯/473-2/10(H6N2)，A/鸡/德克萨斯/55116-2/11(H4N8)，和从2005年科罗拉多的火鸡爆发中分离的LPAI亚型H8N4(亚型是以前通过血细胞凝集抑制和神经氨酸苷酶抑制实验确定的)。病毒滴度通过在MDCK细胞中的50％组织培养感染剂量(TCID50)试验来测量。H6N2和H8N4 LPAI病毒株被选择用于本研究，因为它们在48个感染后小时数(hpi)时在LMH细胞中复制到高滴度并具有强细胞病变效应(CPE)，并且适合于使用MDCK细胞的TCID₅₀试验。将这两种病毒在LMH细胞中增殖并收集感染性病毒上清液，离心去除细胞碎片，并在-80℃储存。通过TCID₅₀度量工作储液滴度，并确定最佳感染复数(MOI)。

siRNA–合成RNA寡核苷酸，脱盐，并在运输之前双链体化(Dharmacon，ThermoScientific)。NP(NP-siRNA)和PA(PA-siRNA)的正义和反义RNA序列以前已发表(Ge等2003)。各siRNA的mRNA靶序列如下：NP：5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGA G-3’(SEQ ID NO.1)和PA：5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG A-3’(SEQ ID NO.2)。使用BLAST证实每种siRNA正义链序列与同H6N2和H8N4有关的NP和PA病毒基因序列100％互补。另外，筛选与鸡序列高度同源的所有siRNA反义种子区序列以减少脱靶沉默的可能性。

转染效率–测试了几种转染试剂的与siRNA无关的CPE视觉征象。这些转染试剂包括

2000(Life Technologies)、

RNAiMax(LifeTechnologies)、

6(Promega Corporation)和XtremeGene(Roche Diagnostics)。在LMH细胞中利用BLOCK-iT^TM Alexa

红色荧光dsRNA对照(Life Technologies)测定转染效率。利用LSM 510 Zeiss共聚焦荧光显微镜在40X下在八个随机视野中计数Alexa

-阳性细胞。使用荧光显微术来选择最终转染试剂，确定siRNA和转染试剂的最佳浓度范围，和最佳siRNA温育期。在温育24h后测定转染效率(α＝0.05)。

将siRNA转染到鸡细胞中–在转染前一日将LMH细胞接种在24-孔板中，以让细胞单层达到80％汇合。利用

2000，根据制造商的说明书，将细胞用NP-siRNA、PA-siRNA和NP/PA二者(siRNA混合物)(各32nM或以混合物形式总共64nM)转染。简单地说，将

2000在Opti-MEM培养基(Life Technologies)中以1:50稀释。随后将各试验siRNA和假siRNA(与任何已知鸡基因没有互补性的乱序的阴性siRNA)在所述

2000–Opti-MEM混合物中稀释并使其在室温下温育15分钟。所述LMH细胞通过去除完全生长培养基并只用Opti-Mem培养基洗涤每个孔来准备用于转染。用687μl/孔转染培养基(Opti-MEM，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺)替换洗涤液并添加63μl的siRNA-

2000复合体。所有对照或处理细胞在一式三个孔中转染。

病毒感染–在转染后24小时，所述LMH细胞通过去除所述转染培养基并用含有0.25μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)、3％牛血清白蛋白(BSA，Gemini Bio-Products)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素的接种培养基(IM)洗涤每个孔而准备用于感染。去除洗涤液并向每个适当的孔添加总共250μl的IM，所述IM含有MOI为0.01或0.001的H8N4或H6N2病毒。将板在摇摆平台上在37℃和7％CO₂存在下温育1小时，然后去除所述病毒并用750μl/孔的新鲜IM替换。收获48hpi细胞培养上清液，离心去除细胞碎片，并在-80℃下冷冻。每个实验包括以一式三个孔测试的阳性对照(只感染LPAI)、阴性对照(未处理的LMH细胞)和假转染对照(假siRNA和LPAI感染)。

感染性病毒滴度评价–LMH细胞培养上清液通过利用CPE作为病毒存在的指标对MDCK细胞滴定来定量，并且将滴度表示为50％组织培养物感染剂量/ml(TCID50/ml)。简单地说，将MDCK细胞接种到96孔板中。对于每个培养上清液，在含有1μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)的MEM/EBSS、2mM L-谷氨酰胺、3％BSA、0.5％丙酮酸钠、0.5％MEM-NEAA、100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素中进行从1:10到1:108的十倍连续稀释。当细胞单层80-90％汇合时，去除生长培养基并将所述细胞用100μl/孔病毒悬液进行一式三份的接种。在48hpi时，将细胞与结晶紫染色剂(含有0.1％结晶紫和2.5％PBS缓冲的福尔马林的磷酸盐缓冲盐水(PBS))一起温育并将有CPE的孔记分为病毒生长阳性。TCID50/mL通过Reed和Muench数学技术来计算(Reed和Muench 1938)。

统计分析–所有实验在不同日重复最少三次。利用0.05的统计显著性水平，进行Wilcoxon秩和检验以比较在同一日进行的siRNA转染样品和阳性对照(PC)样品之间的中位病毒滴度。为了确定siRNA转染样品和PC样品之间的校正平均LogTCID₅₀/mL值是否有统计差异(p<0.05)，利用以日为控制变量的多变量线性回归来分析数据。利用计算软件Stata 10(Statcorp LP)进行统计分析。

结果

有效siRNA的设计–不同的禽流感病毒株之间范围广泛的遗传变异对非特异性疫苗接种之后的病毒逃避负有很大责任。同样地，这种遗传变异性使得难以设计能对许多AIV保持有效的siRNA。mRNA靶位点和siRNA反义种子区之间少到一个核苷酸的差异都可能完全消除任何RNAi抗病毒活性。因此，重要的是设计靶向在许多不同的病毒株(包括HPAI病毒)中观察到的高度保守序列的siRNA。利用BLAST来检索A型流感病毒中的序列同源性以及NP和PA siRNA序列与鸡序列之间的脱靶匹配。这种筛选揭示了这两种siRNA与任何已知鸡序列都不具有高度同源性，特别是在siRNA种子区和宿主mRNA之间。所述NP和PA siRNA序列二者以100％同源性与H8N4和H6N2 NP和PA序列对齐。利用这两种19个nt的siRNA序列的核苷酸收集(nr/nt)数据库，所述BLAST检索显示出在超过10,000种A型流感病毒(包括从猪、野鸟、家禽、马、犬和人类分离的那些病毒)中100％的查询覆盖。这些查询匹配包括最近在2013年从国内和国际爆发分离的致病性H5、H9和H7亚型。

siRNA在鸡细胞中的抗病毒活性–优化所述转染程序，以利用

2000和浓度在32nM和64nM之间的siRNA在LMH细胞中达到高达81％的转染率。这种转染程序和siRNA浓度范围允许在不引起CPE的情况下实现足够的转染。在用MOI 0.01和0.001的H6N2或H8N4病毒感染之前，将NP和PA-siRNA转染到LMH细胞中并收集培养上清液用于TCID₅₀分析。在假对照和PC之间病毒滴度没有显著差异(数据未示出)表明siRNA转染不影响病毒产生。

正如所料，每种siRNA转染的抗病毒活性按日、用于感染的病毒和MOI变化(图1)。然而，在H6N2和H8N4二者感染的NP、PA或混合物-siRNA样品中观察到显著的抗病毒活性。在每个实验日，与相应的PC样品相比，至少一种siRNA转染在这两种病毒中和在这两种MOI下显著降低中位病毒滴度。在至少一个实验日，除了MOI 0.001的H8N4之外，所述混合物-siRNA在这两种病毒中和在这两种MOI下显著降低中位病毒滴度。尽管没有显著差异可能与样本量小有关，但与其适当的未处理PC相比，70％、50％和100％的所有NP-siRNA、PA-siRNA和混合物-siRNA转染分别导致中位病毒滴度降低。

为了跨所有实验日比较siRNA转染样品与未处理的PC样品，利用以日为控制变量的多变量线性回归(MLR)分析。MLR结果揭示了在siRNA转染样品和未处理的PC样品之间校正平均病毒滴度的显著差异(表1)。在来自H8N4 MOI 0.01和H6N2 MOI 0.001感染细胞的NP-siRNA和混合物-siRNA样品二者中观察到显著差异。计算siRNA转染样品和未处理样品之间感染性病毒的log₁₀降低。除了来自H8N4 MOI 0.001和H6N2 MOI 0.01样品的PA-siRNA转染之外，所有siRNA转染都导致至少0.3的log₁₀降低(降低2.1倍)。最值得注意的是在混合物-siRNA转染后的H8N4/MOI 0.01滴度、NP-siRNA转染后的H8N4/MOI 0.001滴度以及混合物-和NP-siRNA转染后的H6N2/MOI 0.001滴度，分别导致1.3(20-倍)、1.0(10-倍)和1.7(50-倍)、2.0log₁₀降低(100-倍)。

表1-通过脱落滴度的log降低和降低倍数度量的在鸡上皮细胞中的SiRNA保护

本实施例演示了在禽类组织模型中利用病毒特异性siRNA抑制禽流感的概念的体外证据。用靶向NP和PA mRNA的siRNA转染鸡LMH细胞显著降低了用两种不同的AIV亚型H8N4和H6N2感染之后的感染性滴度。这两种病毒不是实验室改造的LPAI病毒。二者都从过去在美国发生的家禽爆发中分离。因而，它们是测试这种siRNA抗病毒方法的适当且理想的病毒。

即使在siRNA转染样品和未处理的PC样品之间没有观察到显著差异时，在所有siRNA样品中，除了两个PA-siRNA转染组之外，仍观察到感染性病毒滴度的log₁₀降低。最强效的感染性病毒滴度抑制发生在LMH细胞用NP-siRNA或混合物-siRNA转染后，导致log₁₀降低在0.5-2.0的范围内(降低3.2-100倍)。

本工作为确定能够引发充分的siRNA保护以在家禽的AIV爆发期间防止病毒脱落和后续疾病传播的措施提供了基础。另外，流感病毒突变迅速，经常致使疫苗无效。设计靶向这些保守mRNA位点的RNAi构建物允许获得更有效率的RNAi沉默，而且，利用这些siRNA混合物靶向多个保守位点可以进一步防止因突变引起的RNAi逃脱。

RNAi是可以帮助研究人员实现尚不可能的目标并提供新的抗流感发展策略的机会的工具。本研究在开发适当的体外禽类模型来证实这种RNAi抗流感方法上是成功的。本工作表明，靶向病毒NP和PA基因的以混合物形式的siRNA介导的敲除抑制了AIV体外复制。然而，尽管有所述潜力，但这些siRNA必须在这种禽类模型中抑制感染性病毒脱落，这些RNAi介导剂需要被认为临床可应用的更好的递送机制。出于几个原因，与使用合成转染媒介例如

2000有关的递送效率是有限的。第一，低递送效率需要更高的剂量，这不仅成本过高，而且经常有毒性(Ge等2004)。第二，这些转染试剂只实现全身递送，而不是靶向递送。这再次需要更高的剂量来充分转染特定的组织。开发允许鼻内递送的RNAi抗病毒技术是预防AIV的唯一希望。因此，后续的工作集中在设计这种基于RNAi的抗病毒药、特别是用于预防家禽中AIV的基于RNAi的抗病毒药的更好的递送机制上。这项工作在下面实施例2中示出。

实施例2–在鸡细胞模型中利用独特的RNAi递送技术抑制禽流感复制

对家禽进行疫苗接种以对抗AIV的经济奖励很低并且经常归因于疫苗的几个限制。这些限制和缺少奖励对有效控制家禽中AIV爆发造成了明显的障碍。开发新的抗流感技术是对于有效管理和控制这种疾病在家禽中蔓延、使财务损失最小化、和降低传播给其他动物(包括人类)的风险的关键步骤。应用RNAi方法来开发对抗AIV的替代抗病毒药是一种可能性。然而，RNAi介导剂的递送仍然是限制其临床应用的障碍。Transkingdom RNAi(tkRNAi)利用非致病性细菌来产生siRNA并将siRNA递送到靶组织，并且可能是获得RNAi方法的临床应用的关键。构建tkRNAi载体(抗AIV载体)以产生靶向病毒基因NP或PA的siRNA，并在已建立的禽类组织模型中评价这些载体的保护性功效。还运用载体的组合(“混合物”)来研究靶向多个AIV mRNA的附加效应。首先在用带有红色荧光蛋白标签的载体处理的鸡LMH细胞中验证载体摄取和侵袭。接着，将细胞用抗AIV载体处理并用两种不同的LPAI亚型H8N4和H6N2感染。以日为控制变量的多变量线性回归分析揭示了用所述抗AIV载体处理的样品和那些未处理的样品之间校正平均脱落滴度的显著差异(p<0.05)。靶向NP和PA这两个基因的载体混合物在鸡LMH细胞上清液中提供了高达10,960倍的脱落滴度降低(p<0.05)。该工作演示了在已建立的禽类组织模型中利用这些新型抗AIV载体抑制AIV的概念的体外证据。该工作代表了在禽类模型中利用所述tkRNAi系统和抑制流感复制的第一个这样的实例。

材料和方法

细胞培养–基于前面在实施例1中的工作，鸡肝细胞癌上皮(LMH)细胞和Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞分别用于所有的侵袭和感染以及病毒滴度试验。将细胞保持在如前面所述并略加修改的适当的生长培养基中。为了使所述抗AIV载体在侵袭步骤期间的宿主补体灭活最小化，将LMH细胞一直在含有热灭活的FBS(Life Technologies)的培养基中生长。这是为了避免因响应于细菌的存在而可能引起的补体旁路途径的激活，导致细菌载体在细胞内摄取之前失活。

病毒–选择下列LPAI禽流感病毒株用于所有的侵袭和感染研究：A/鸡/德克萨斯/473-2/10(H6N2)和从2005年科罗拉多的火鸡爆发中分离的LPAI亚型H8N4。每种LPAI的病毒滴度通过TCID₅₀试验来测量。这两种病毒在48个感染后小时数(hpi)时在有CPE的LMH细胞中复制到高滴度。如前面所述，产生储液并选择最佳MOI。

鸡细胞中β-1整合素的验证–因为禽类组织是tkRNAi的新靶标，在正常条件下(未感染)和AIV感染后的LMH细胞表面上β(1)整合素受体的存在对于验证是重要的。从未感染的(正常生长条件)LMH细胞培养物以及从用H8N4病毒感染后6和24小时的培养物提取总RNA(E.Z.N.A.

总RNA试剂盒I，Omega Bio-Tek)。利用寡聚(dT)引物(Promega)从0.75μg的总RNA合成第一链cDNA，并利用4mM dNTP和AffinityScript多温度逆转录酶试剂盒(Stratagene)根据制造商的推荐完成所述cDNA合成。管家基因β-肌动蛋白用作LMH细胞中β(1)整合素表达的内部控制。β-肌动蛋白和β(1)整合素的引物以前已发表(Caprile等2009)，利用的是GenBank鸡序列。常规PCR扩增利用25μl反应来完成，其含有：2.5μl cDNA，0.8mM dNTP，1.6mM MgCl₂，2.5μl 10X Amplitaq Gold缓冲液

II，0.8U Taq DNA聚合酶(Applied Biosystems)，以及0.4μM正向和反向引物。各反应用30μl Chill

蜡(Bio-Rad)覆盖以防止蒸发并放入MJ Research 60个位置的热循环仪(Bio-Rad)中。将PCR反应混合物在95温育10分钟以及35个下述的循环：95℃30秒，57℃60秒，和72℃20秒。PCR产物通过利用

DNA系统(Lonza Group Ltd)的琼脂糖凝胶电泳来分析。扩增的产物通过紫外光透照来可视化，并且将100碱基对(bp)分子量阶梯状标志物(Lonza Group Ltd)在所述凝胶上一体运行以帮助计算扩增的DNA片段的大小。β-肌动蛋白和β(1)整合素的预期条带大小分别是282和308bp。

tkRNAi shRNA载体的构建和产生–以前已经描述了ShRNA表达载体pmbv43(Buttaro and Fruehauf 2010)。Pmbv43包含由T7启动子驱动的表达盒以及含有BamHI和SalI限制酶序列的克隆位点。在收到来自Cambridge Biolabs(Cambridge，MA)的亲本_pmbv43质粒后，将所述质粒在50μl反应中37℃下消化2小时，所述反应含有：2μg pmbv43，2.0μl BamHI(New England Biolabs(NEB))，2.0μl SalI(NEB)，5.0μl缓冲液3(NEB)，0.5μl100X牛血清白蛋白(NEB)，和24.2μl分子水。消化的亲本_pmbv43随后用小牛肠碱性磷酸酶(NEB)处理并用苯酚/氯仿和乙醇沉淀。由此产生的8.4kb线性亲本_pmbv43质粒从凝胶电泳之后的1％琼脂糖凝胶中进行凝胶提取并利用透析分离。

靶向NP序列的RNAi是5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGA G-3’(SEQ ID.NO.1)，并且靶向PA序列的RNAi是5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG A-3’(SEQ ID NO.2)。NP的互补/反义序列是5’-CTC CGA AGA AAT AAG ATC C–3’(SEQ ID NO.3)，并且PA的互补/反义序列是5’–TCA GGC ACT CCT CAA TTG C–3’(SEQ ID NO.4)。编码NP和PA特异性shRNA的DNA模板是：BamHI位点-正义序列-发夹环(5’-TTC AAG AGA-3’)-反义序列-TTTTTTTTTT-SalI位点。换句话说，编码NP特异性shRNA的DNA模板是没有poly-T尾的5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGAGTT CAA GAG ACT CCG AAG AAA TAA GAT CC–3’(SEQ ID NO.5)和有poly-T尾的5’-GGATCT TAT TTC TTC GGA GTT CAA GAG ACT CCG AAG AAA TAA GAT CCT TTT TTT TTT–3’(SEQ ID NO.6)。并且编码PA特异性shRNA的DNA模板是没有poly-T尾的5’-GCA ATT GAGGAG TGC CTG ATT CAA GAG ATC AGG CAC TCC TCA ATT GC-3’(SEQ ID NO.7)和有poly-T尾的5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG ATT CAA GAG ATC AGG CAC TCC TCA ATT GCT TTTTTT TTT-3’(SEQ ID NO.8)。

整合的DNA技术合成了PA DNA寡核苷酸序列的上链和下链。将各PA寡核苷酸重悬浮到300μM并将120μM的每条链在20μl反应中一起退火。退火后，将双链体磷酸化并在10μl反应中在4℃下经24小时连接成线性pmbv43，所述反应含有：1μl T4 DNA连接酶缓冲液(NEB)，1μl退火和磷酸化的PA寡核苷酸，2μl pmbv43，1μl T4 DNA连接酶(NEB)，和5μl分子水。将由此产生的连接混合物转化到DH5α^TM感受态细胞(Life Technologies)中，并将由此产生的转化细胞铺在含有10μg/ml卡那霉素(Kan)的Luria肉汤(LB)板上并在37℃温育过夜。由此产生的菌落通过利用PA_shRNA特异性引物的PCR根据以下热方案扩增209bp产物来筛选：944分钟，30个下述的循环：94℃30秒、45℃30秒、72℃30秒，以及最后在72℃延伸10分钟。利用

HiPure Plasmid Maxiprep试剂盒(Life Technologies)纯化单个PCR阳性PA_pmbv43质粒克隆并对其进行测序以验证正确的PA_shRNA插入。利用标准的克隆和质粒纯化方法，所述NP_pmbv43质粒被商业合成，利用DH10-β细胞产生，并由商业股份有限公司DNA 2.0纯化。在收到NP_pmbv43后，将质粒重悬浮在分子水中，终浓度为100ng/μl。将NP_pmbv43、PA_pmbv43和亲本_pmbv43转化到CEQ221感受态细胞中(NP_pmbv43/CEQ，PA_pmbv43/CEQ，和亲本_pmbv43/CEQ载体)并在含有25μg/ml Kan和50μg/ml 2,3-二氨基丙酸的脑心浸液(Brain Heart Infusion)琼脂(BHI/Kan/Dap)上铺板。将板在37℃温育过夜，并且由此产生的菌落通过利用NP、PA和亲本_shRNA特异性引物组的PCR进行筛选。对代表NP_pmbv43/CEQ、PA_pmbv43/CEQ和亲本_pmbv43/CEQ的单个PCR阳性克隆进行测序。在序列验证之后，随后将各克隆在BHI/Kan/Dap肉汤中增殖。在对数中期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)和静止期(OD₆₀₀＝1.0)产生储液，并在20％甘油中冻回-80℃。将来自代表OD₆₀₀＝1.0的各载体储液的单个冷冻等分试样解冻以用于板计数。简单地说，解冻各1ml的等分试样，以5,000x g离心5分钟，并在1ml含有100μg/ml Dap的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBS/Dap)中重悬浮。将由此产生的载体在PBS/Dap中以1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:60,000、1:90,000、1:135,000、1:270,000稀释。将来自代表1:60,000-1:270,000的各理论稀释度的总共50μl在BHI/Kan/Dap琼脂上以一式两份铺板并在37℃温育过夜。将各稀释度下的菌落计数平均并用于计算每ml的总体菌落形成单位(CFU/ml)。这些计数值代表了NP_pmbv43/CEQ(anti-AIV_NP)、PA_pmbv43/CEQ(anti-AIV_PA)和亲本_pmbv43/CEQ(抗-AIV_乱序)载体储液的适当可行的CFU/ml浓度。这种系统允许在所有将来的体外侵袭试验中直接解冻和使用等分试样。

除了所述NP和PA构建物之外，还创造了下列PB1和PB2序列的构建物：PB1(5’–GATCTG TTC CAC CAT TGA A–3’)(SEQ ID NO.11)和PB2(5’–CGG GAC TCT AGC ATA CTT A–3’)(SEQ ID NO.12)。PB1的互补/反义序列是5’-TTC AAT GGT GGA ACA GAT C–3’(SEQ IDNO.13)，并且PA的互补/反义序列是5’–TCA GGC ACT CCT CAA TTG C–3’(SEQ ID NO.14)。编码PB1和PB2特异性shRNA的DNA模板是：BamHI位点-正义序列-发夹环(5’-TTC AAG AGA-3’)-反义序列-TTTTTTTTTT-SalI位点。换句话说，编码PB1特异性shRNA的DNA模板是没有poly-T尾的5’–GAT CTG TTC CAC CAT TGA ATT CAA GAG ATT CAA TGG TGG AAC AGA TC–3’(SEQ ID NO.15)和有poly-T尾的5’-GAT CTG TTC CAC CAT TGA ATT CAA GAG ATT CAATGG TGG AAC AGA TCT TTT TTT TTT–3’(SEQ ID NO.16)。并且编码PB2特异性shRNA的DNA模板是没有poly-T尾的5’–CGG GAC TCT AGC ATA CTT ATT CAA GAG ATA AGT ATG CTAGAG TCC CG-3’(SEQ ID NO.17)和有poly-T尾的5’-CGG GAC TCT AGC ATA CTT ATT CAAGAG ATA AGT ATG CTA GAG TCC CGT TTT TTT TTT-3’(SEQ ID NO.18)。还设想了，所述正义和反义序列在构建物内的次序可以是颠倒的，使得所述次序是BamHI位点-反义序列-发夹环(5’-TTC AAG AGA-3’)-正义序列-TTTTTTTTTT-SalI位点，但是优选首先放置所述正义序列。另外，设想了可以使用长度在3到23个核苷酸之间变化的其他发夹环序列，包括具有3、4、5、6、7、9、或23个核苷酸的发夹环。因此，所述正义和反义序列可以被具有3、4、5、6、7、9、或23个核苷酸长度的一段发夹环核苷酸(以及3到23个核苷酸之间的任何数量的核苷酸)隔开。还设想了所述shRNA/siRNA的长度可以变化，取决于靶mRNA序列的组成，所生成的siRNA的长度变异可高达约30个核苷酸。最后，设想了可以构建载体以产生超过一种siRNA，从而靶向超过一种AIV mRNA，或利用单个载体靶向在给定AIV mRNAm内的多个序列。然而，从单个质粒产生多种siRNA可导致所述siRNA的不同等的转录。

tkRNAi载体的细胞内摄取–为了验证细菌摄取和细胞内侵袭到LMH细胞中，使抗AIV_乱序载体带有红色荧光蛋白(RFP)标签。简单地说，利用标准转化方法，将抗AIV_乱序载体与RFP原核表达载体pE2-Crimson(Clontech)共转化。选择这种RFP是因为它是具有快速成熟、高度光稳定性、降低的细胞毒性的远红荧光蛋白，并且从lac启动子表达以允许RFP表达的IPTG活化(Bevis和Glick 2002)。在所述抗AIV_乱序_RFP载体(RFP载体)生长后，如前面所述产生储液并计数。将LMH细胞在侵袭前一天接种在8-孔腔室载玻片中以使细胞单层达到60％汇合。在载体侵袭当日，解冻RFP载体的1ml等分试样，以5,000x g离心5分钟，并重悬浮于PBS/Dap中。然后将所述RFP载体放在冰上并在含有2mM L-谷氨酰胺和50μg/mlDap的Waymouth's MB 752/1培养基中以1:4连续稀释，以5e7 CFU/ml开始并在7.8e5 CFU/ml时结束。为了制备用于侵袭的LMH细胞并从所述生长培养基中去除抗生素，吸出培养基并且将每个孔用含有2mM L-谷氨酰胺和50μg/ml Dap的新鲜Waymouth's MB 752/1培养基(侵袭培养基)洗涤两次。吸出冲洗培养基并向适当的孔添加1ml各稀释度的RFP载体并使其在37℃和7％CO₂存在下温育2小时。对于每个腔室载玻片试验，包括一个未处理孔(Waymouth's MB 752/1完全培养基)、一个假侵袭对照孔(只有侵袭培养基)和一个非RFP侵袭对照孔(3.1e6 CFU/ml的抗AIV_乱序载体)。在温育2小时后，吸出侵袭培养基并且将孔用Waymouth's MB752/1完全培养基洗涤两次，然后替换新鲜的Waymouth's MB 752/1完全培养基并让细胞继续再温育2-24小时。为了固定细胞，吸出生长培养基并且将孔用无钙/镁的PBS冲洗两次。从所述载玻片去除所述腔室并向每个孔格添加10μl有DAPI的

Gold抗褪色试剂(Life Technolgies)并将所述载玻片安装上盖玻片。将由此产生的载玻片在没有紫外光下在室温下温育24小时，然后利用Eclipse Ti倒置荧光显微镜(NikonInstruments Inc.)在40X放大倍数下捕获图像。使用DAPI和CY5滤光块，分别利用461和670发射来将所述DAPI和RFP荧光团可视化。

最佳tkRNAi载体浓度–为了确定不伴随引起CPE的可允许的最佳载体浓度，将LMH细胞在侵袭前一天接种在24-孔板中以使细胞单层达到80％汇合。如前面所述制备抗AIV_乱序载体，并将其在侵袭培养基中稀释到5e7、1.25e7、3.1e6和7.8e5 CFU/ml。如上所述准备LMH细胞用于侵袭。吸出冲洗培养基并向适当的孔以一式三份添加1ml各稀释度的抗AIV_乱序载体，并使其在37℃和7％CO₂存在下温育2小时。每个板包括未处理孔(Waymouth's MB752/1完全培养基)和假侵袭孔(只有侵袭培养基)。在温育2小时后，吸出侵袭培养基并且将孔用Waymouth's MB 752/1完全培养基洗涤两次，然后替换新鲜的Waymouth's MB 752/1完全培养基并让细胞继续再温育24-48小时。在侵袭后多个时间点，观察孔的CPE视觉征象，与未处理的对照孔比较。选择不引起CPE的可允许的最大抗AIV_乱序载体浓度用于在LMH细胞中的所有后续抗AIV_NP和抗AIV_PA侵袭试验。

使用tkRNAi shRNA载体的鸡细胞侵袭–在侵袭前一天将LMH细胞接种在24-孔板中，以让细胞单层达到80％汇合。在载体侵袭当日，解冻抗AIV_NP、抗AIV_PA和抗AIV_乱序载体的1ml等分试样，以5,000x g离心5分钟，并重悬浮于PBS/Dap中。然后将各载体放在冰上并适当稀释用于侵袭试验。如前面所述准备LMH细胞用于侵袭。孔以一式三份进行测试并包括抗AIV_NP、抗AIV_PA、抗AIV_乱序、和抗AIV_NP+抗AIV_PA载体的混合物(抗AIV_混合物)。因此，“混合物”是携带抗AIV_NP载体的大肠杆菌和携带抗AIV_PA载体的大肠杆菌的1:1混合物。还以一式三份包括对照孔(假侵袭和未处理的)。在温育2小时后，洗涤LMH细胞(如前面所述的)和替换新鲜的Waymouth's MB 752/1完全培养基。

病毒感染–在侵袭后24小时，通过去除所述生长培养基并用含有0.25μg/ml TPCK的IM洗涤每个孔来准备LMH细胞用于感染，如前面所描述的。去除洗涤液并向每个适当的孔添加总共250μl的IM，所述IM含有MOI为0.01或0.001的H8N4或H6N2病毒。将板在摇摆平台上在37℃和7％CO₂存在下温育1小时，然后去除所述病毒并用750μl/孔的新鲜IM替换。在48hpi收获细胞培养上清液，离心，并在-80℃下冷冻。每个实验包括阳性对照(AIV感染)、阴性对照(未处理的)和假侵袭对照(假侵袭+AIV感染)，各自以一式三个孔测试。

感染性病毒滴度评价–利用TCID₅₀/ml计算，通过按前面所描述的对MDCK细胞进行终点滴定来定量LMH细胞培养上清液。简单地说，将收获的上清液解冻，稀释十倍，并将100μl/孔的病毒悬液以一式三份覆盖到接种有MDCK的96孔板中。在48hpi时，将细胞用结晶紫染色并将有CPE的孔记分为病毒生长阳性。TCID₅₀/mL通过Reed和Muench数学技术来计算(Reed和Muench 1938)。

统计分析–所有实验在不同日重复最少三次。利用0.05的统计显著性水平，进行Wilcoxon秩和检验以比较在同一天进行的载体处理样品和未处理的阳性对照(PC)样品之间的中位病毒滴度。为了确定载体处理样品和PC样品之间的校正平均LogTCID₅₀/mL值是否有统计差异(p<0.05)，利用以日为控制变量的多变量线性回归来分析数据。利用统计计算软件Stata 10(Statcorp LP)进行统计分析。

结果

验证tkRNAi载体在鸡细胞中的细胞内摄取–当细菌的表面蛋白侵袭素与宿主受体β(1)整合素相互作用时，通过受体介导的胞吞行使上皮细胞对所述tkRNAi载体的摄取。因此重要的是验证在正常生长条件期间和在用AIV感染期间，鸡LMH细胞中β(1)整合素的存在和稳定表达。在RNA提取和cDNA合成之后，观察β(1)整合素在使用正常生长条件生长的LMH细胞中以及在用H8N4病毒(MOI 0.01)感染的细胞中在感染后6和24小时的表达(图2)。这些结果表明，所述tkRNAi载体应恰当地附着于LMH细胞，即使当所述细胞在感染后显示出CPE和病变的迹象时。使所述抗AIV_乱序载体带有RFP标签验证了在侵袭后2和24小时LMH细胞内部的细胞内表达(图3)。不引起CPE的可允许的最大RFP载体浓度是7.8e5 CFU/ml。因此，所有后续的实验都采用该载体浓度。总之，这些结果表明所述tkRNAi递送平台适合于鸡上皮细胞。

TkRNAi shRNA载体在鸡细胞中的抗病毒活性–前面显示了所述NP和PA siRNA序列以100％同源性与所述H8N4和H6N2 NP和PA序列对其并且没有与任何已知鸡序列的任何脱靶匹配。在用H6N2或H8N4病毒感染之前，将LMH细胞首先用载体处理并在感染之后收集培养上清液用于TCID₅₀分析。

正如所料，各载体的抗病毒活性按日而且按用于感染的病毒和MOI变化(图4)。然而，在H6N2和H8N4二者感染的抗AIV_NP、抗AIV_PA和抗AIV_混合物样品中，观察到显著的抗病毒活性。在至少一个实验性试验日，与相应的PC样品相比，在MOI 0.01的这两种病毒下，抗AIV_NP、抗AIV_PA和抗AIV_混合物显著降低中位病毒滴度。所述载体似乎在病毒MOI0.001下具有略微不显著的抗病毒效应。尽管没有显著差异可能与样本量小有关，但与其适当的未处理PC相比，100％、89％和100％的所有NP、PA和抗AIV_混合物载体处理都分别导致中位病毒滴度降低。应该注意，所述抗AIV_乱序载体也导致中位病毒滴度降低，其中有一些与PC样品存在显著差异(图4)。

以日为控制变量，利用多变量线性回归(MLR)分析，跨所有实验日比较载体处理的LMH细胞与未处理的PC细胞。表2中示出了载体处理的样品和未处理的PC样品之间校正平均病毒滴度的显著差异。MLR分析指出了在用H6N2和H8N4二者以MOI 0.01感染后，所有载体处理(除了抗AIV_乱序载体以外)和它们相应的PC样品之间的显著差异。除了用H8N4MOI0.001感染之外，在所有实验组中，所述混合物载体与适当的PC滴度相比导致显著降低的病毒滴度(p<0.05)。计算载体处理样品和未处理样品之间感染性病毒的log10降低。所有载体处理样品产生至少0.8log10降低(降低6-倍)。最显著的是来自NP(3.8log降低或降低6,918-倍)、PA(2.5log降低或降低331-倍)和抗AIV_混合物载体处理(4log降低或降低10,965倍)后MOI 0.01的H8N4感染以及抗AIV_PA载体处理后MOI 0.001的H8N4感染(3.0log降低或降低1,000-倍)。有趣的是，除了用H6N2以MOI 0.001感染之外，所述乱序载体在所有实验组中也显示出抗病毒活性(表2)。

表2–通过脱落滴度的log降低和降低倍数度量的在鸡LMH细胞中的抗AIV载体保护

本实施例的目标和它的教导的应用是在用所述抗AIV载体处理LMH细胞后，提供不一定防止感染、但减少脱落到培养上清液中的感染性病毒的量的手段。用这些抗病毒载体体外处理显著降低了用在家禽中分离的两种不同AIV亚型H8N4和H6N2感染后的感染性滴度。在除了一个样品组(H8N4/MOI 0.001)之外的全部样品组中，所述混合物载体显著降低病毒滴度。然而，即使当没有观察到载体处理的样品和未处理的PC样品之间的显著差异时，从所有载体处理的样品组都观察到感染性滴度的显著log10降低。感染性病毒脱落的最强效抑制发生在LMH细胞用抗AIV_混合物处理并用H8N4或H6N2感染后，导致在1.7-4.0范围内的显著log10降低(降低50-10,965倍)。

如上所述，用乱序载体处理也在除H6N2/MOI 0.001感染样品组以外的全部样品组中降低感染性滴度。对这种观察结果有可能的解释。先天免疫应答是宿主早期防御机制的一部分。Toll样受体(TLR)通过识别并结合作为宿主细胞感染的标志物的细菌组分而在先天应答中发挥关键作用。这些细菌组分，也称为病原体相关分子模式(PAMP)，包括充当免疫增强剂的内毒素样脂多糖(Bessler等1990)。这些抗AIV载体由非致病性大肠杆菌递送，因此这些鸡上皮细胞将可能通过TLR-4识别来察觉到这些细菌内毒素的细胞外存在，是不意外的(Schoen等2004)。这种结合事件将导致炎性转录因子——核因子kappaβ的表达，并最终导致作为所述先天应答的一部分的下游促炎性细胞因子和趋化因子的释放。在这种情况下，这些细菌组分的作用可能非常像疫苗佐剂，从而在AIV感染之前刺激所述先天应答并在本质上设置对抗病毒感染的额外保护水平。

本实施例演示了概念的体外证据并显示这些新型抗AIV载体在禽类组织模型中的抗病毒潜力。然而，该数据是否表明靶向NP和PA的抗AIV载体混合物可以显著降低鸡中的AIV脱落？这种方法能转变成限制AIV在家禽中爆发和传播的抗病毒技术吗？再有，这能代表在其他物种中控制流感的变革性方法吗？本工作代表了回答这些疑问的第一步。本研究的目标是将所公开的预防药开发成家禽的传统AIV疫苗的新补充。因而，来自本工作的发现已经被转化为目的在于如下面紧接的实施例3中所述的在实验性攻击的鸡中评估这些抗病毒载体的功效的工作。长期目标是开发创新的抗流感预防药，其将促进更有效和强大的家禽AIV控制方法的开发。

实施例3–用抗AIV载体预防性处理鸡群

在面对AIV爆发时，几个因素对于有效控制病毒在家禽之间和家禽之中蔓延是关键的。它们包括应用控制方法或疫苗的速度、预防工作有多迅速地起到保护作用、和防御AIV的任何亚型或病毒株的能力。开发强有力的家禽抗流感技术是有效管理和控制这种疾病在全世界蔓延的关键步骤。以前的工作证明了使用靶向所述病毒NP和PA基因的新型抗AIV载体来体外降低病毒脱落滴度的价值，但还有待于使用实验性攻击的鸡进行体内测试。首先使用带有荧光红色蛋白标签以便可视化的载体评估载体摄取到鸡呼吸组织中。一旦在鸡中证明了载体摄取并且没有载体相关的致病性，就用混合物载体(n＝10)、乱序载体(n＝10)或安慰剂(n＝10)处理商业鸡组。24小时后，将所有鸡用H6N2病毒攻击。用抗AIV混合物载体预防性处理的鸡与未处理的鸡相比，脱落显著更少的病毒(p<0.05)。同样地，与未处理的鸡相比，在抗AIV混合物处理的鸡中脱落病毒的鸡的比例显著减少(p<0.05)。所述抗AIV混合物还防止AIV传播到岗哨鸡。本工作演示了利用这种新型RNAi抗病毒技术保护鸡对抗AIV复制、病毒脱落和传播的概念的体内证据。

材料和方法

动物–四周龄商业来亨鸡是由科罗拉多(Colorado)的商业养殖场惠赠的并安置在生物安全2级设施中。到达后，通过盲法选择放在盒子中的颜色编码的腿带，将禽随机分派到处理组。到达当天，从臂静脉收集血液并取得口咽(OP)拭子以利用血清学测试和实时RT-PCR验证无AIV状态。依照实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)，将禽组安置在包含分开的12平方英尺隔间的房间中。保持负压气流以防止隔间之间的交叉污染，因此在整个研究过程期间，房间中间过道的空气是正压的。允许鸡组在每个隔间内自由走动并且随意接近饲料和水。将室温保持在70°F并控制每天照明以允许足够时间进行日间活动和休息。各实验的动物护理在科罗拉多州立大学(ColoradoState University)的IACUC委员会批准下进行。为了给鸡适应它们新环境的时间，在到达以后至少4天才开始所有的实验研究。

病毒–LPAI A/鸡/德克萨斯/473-2/10(H6N2)由在IA，Aimes的美国国立兽医服务实验室(United States National Veterinary Services Laboratory)(NVSL)惠赠。选择H6N2病毒是由于它从2010年德克萨斯州(Texas)发生的爆发期间收集的鸡呼吸拭子分离出来的历史。将所述病毒在10-日胚龄的无特定病原体(SPF)的鸡蛋的尿囊腔中在37℃下增殖和滴定2天。简单地说，在病毒生长后，收获羊膜尿囊液(AAF)并合并以代表单一病毒储液。为了滴定所述病毒，将所述储液的等分试样在含有1X抗生素混合物(2000U/ml青霉素G，4mg/ml链霉素，16μg/ml庆大霉素，100U/ml制霉菌素，650μg/ml卡那霉素)的脑心浸液肉汤(BHI)中从1:10至1:10¹⁰十倍稀释，并在各稀释度用0.1ml接种3SPF蛋。收获AAF，并根据Reed和Muench数学公式计算50％蛋感染性滴度(EID₅₀/ml)。

载体施用–产生载体储液并以适当的CFU/ml浓度(如前面所述)冻回，因此额外的生长和计数不是必要的。这本质上允许将载体等分试样直接用作适合于直接施用于禽类的处理剂量。简单地说，将适当体积的载体储液解冻，以5,000x g离心5分钟，并重悬浮在含有50μg/ml 2,3-二氨基丙酸(Dap)的PBS中。所述混合物载体表示相等浓度(CFU/ml)和相等体积(基于总剂量体积)的NP(NP_pmbv43/CEQ)和PA(PA_pmbv43/CEQ)载体。将所述载体在冰上运输到安置所述鸡的设施。载体通过鼻内途径来施用(0.3-0.5ml/禽)。在给药期间温柔地约束每只鸡并在每个鼻孔中施用等体积。将所述禽再约束一分钟以防止打喷嚏并让所述载体沉降到鼻组织中以便有效侵袭。

病毒攻击–为了在实验环境中模仿AIV的天然感染途径，在5周(±4天)龄时用10⁶EID₅₀/0.1ml H6N2病毒溶液对鸡进行接种。在接种之前，将病毒在无菌PBS中稀释到预定剂量并冷藏直到准备攻击。在攻击期间，每个动物被温柔地约束，同时受过训练的人员将50μl病毒接种到每个鼻孔中。在攻击后，将每只禽再约束一分钟以防止打喷嚏并让所述病毒沉降到鼻组织中以便有效感染。每天评估鸡的临床病症。

数据和样品收集–在载体和/或病毒接种后，利用临床病症(0-4)评分系统每天检查鸡：1＝因对饲料缺乏兴趣、行动缓慢、对外界环境反应低下的轻度嗜睡迹象；2＝轻度呼吸道疾病(张口呼吸，吸鼻(snicking)，打喷嚏)，伴有轻度嗜睡；3＝中度呼吸道疾病(吸鼻，打喷嚏，轻咳，呼吸粗重)，伴有中度嗜睡；和4＝重度呼吸道疾病(咳嗽，打喷嚏，呼吸困难)，伴有缺少进食以及行动或对外界环境的反应有限。在用H6N2病毒攻击后，在2、3、4、5、6、7、和10个感染后天数(dpi)时从感染的禽收集OP拭子。将拭子立即在含有1ml脑心浸液(BHI)肉汤储存培养基并放在冰上的falcon管中浸泡和漂洗。收集所述拭子的人员在组之间更换手套和靴子以避免潜在的交叉污染。将样品储存在-70℃，直到后来的逆转录酶定量实时PCR(RT-qPCR)。在适当的时间，将禽通过CO₂安乐死并在尸检时收集组织以评估RFP载体摄取、载体相关的致病或病毒感染。

通过RT-qPCR检测病毒脱落–对在整个感染期间收集的所有OP拭子样品进行处理以用于RT-qPCR，从而测定H6N2病毒滴度。简单地说，利用Trizol LS(Life Technologies，Grand Island，NY)和MagMAX 96 AI/ND病毒RNA分离试剂盒(Life Technologies)与KingFisher磁粒子处理器(Thermo Scientific，Waltham，MA)，从50μl的OP拭子样品提取总RNA。利用ABI 7500平台(Applied Biosystems)并用先前描述的对禽流感基体基因中的保守序列而言特异性的引物和探针(Spackman等2002)并按照NVSL规程AVSOP1521.01进行RT-qPCR。引物和探针序列如下：正向引物(5′-AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TCG-3′)，反向引物(5′-TGC AAA AAC ATC TTC AAG TCT CTG-3′)，和5′报告染料(5’-6-羧基荧光素[FAM])(5′-FAM-TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA-TAMRA-3′)3’报告染料(6-羧基四甲基罗丹明[TAMRA])标记的探针。RT步骤条件是在50℃下30min和在94℃下15min，接着是45个在94℃下0s和在60℃下20s的循环。利用H6N2储液病毒的从1:10至1:10¹⁰的10倍稀释液系列，以一式三份产生用于病毒定量的标准曲线，由此可以计算每个RNA样品的EID₅₀当量/ml(EID₅₀eq/ml)样品培养基。测得检测限是10¹EID₅₀/ml(1log₁₀EID₅₀/ml)/反应。

血清学–在到达安置设施后，从所有的禽收集的血清通过琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验进行测试并显示出对任何A型流感病毒抗原呈抗体阴性。将感染的鸡在感染后第10日取血并再次利用AGID试验测试血清。

统计分析–描述性统计包括带95％置信区间(CI)的中位病毒滴度、滴度峰值和范围、脱落病毒的鸡的比例、和脱落滴度的降低倍数。脱落病毒的鸡的比例的差异利用费舍尔精确检验(Fisher's exact test)来分析(p<0.05)。处理和未处理的鸡之间中位病毒滴度差异利用Wilcoxon秩和检验来分析(p<0.05)。利用以日为控制变量的多变量线性回归(MLR)确定来自从载体处理和未处理的PC鸡收集的OP样品的校正中位Log EID₅₀ eq/ml值是否有统计差异(p<0.05)。利用对数回归分析确定处理的鸡与未处理的PC鸡相比在单日以及跨所有天数的脱落比值比(OR)(p<0.05)。利用统计计算软件Stata 10(Statcorp LP)进行统计分析。

实验设计–本工作包括三个初始的试验性研究，每个都需要禽的比较性检查，以便验证抗AIV载体摄取到鸡呼吸组织中、确定正确的抗AIV载体剂量、和验证H6N2病毒适合于攻击鸡。来自这些试验性的探索性实验的发现结果是计划所描述的体内工作的第四部分——最后的概念证据(POC)研究的重要组成部分。由于样本量有限并且缺乏检验力，来自所述初始的试验性研究的发现结果不用于推广到鸡群。

试验性研究1：将两组各两只鸡安置在分开的隔间中并在500μl的单剂量中施用1.6e8 CFU的所述RFP载体(亲本_pmbv43/CEQ_RFP，如前面所述)。每组的两只鸡在RFP载体处理后15和27小时通过吸入CO₂安乐死。在尸检时收集呼吸组织，包括鼻窦、气管、咽和肺，并类似地收集每只动物的腺胃。在三个小时之内，这些组织准备用于荧光显微术，随后的RFP表达观察结果表明载体附着和细胞内摄取。简单地说，将所述组织低温冷冻并利用低温恒温器切片。利用具有DAPI的

Gold抗褪色试剂将组织切片安装在玻璃盖玻片上并用盖玻片覆盖。在室温下温育24小时后，将载玻片保持在4℃，直至使用Eclipse Ti倒置荧光显微镜利用461和670发射来捕获图像。这种试验性研究的目标是验证这些大肠杆菌是特异性靶向鸡呼吸组织并向鸡呼吸组织递送抗AIV载体的适当的媒介。统计计算和检验力证明(power justification)不适用于确定实现与试验性研究1有关的目标所必需的鸡数量。这些是定性观察，目的不在于检测所述两个组之间测量到的效果的差异，而是对确定这些载体是否是鸡呼吸组织的最佳递送媒介感兴趣。每组两只鸡的样本量足以为所提议的分析提供多个组织样品。

试验性研究2：将两组各五只鸡安置在分开的隔间中并施用以下两种剂量之一的所述乱序载体(亲本_pmbv43/CEQ，如前面所述)：1.36e7或3.6e8 CFU/500μl剂量。试验性研究2需要一组五只鸡来充当未处理的对照组。这些鸡被施用500μl的PBS/Dap并充当基线以与临床病症得分和组织学比较。每天监测鸡的临床病症，载体处理的鸡在第3天(n＝2)、第7天(n＝2)和第14天(n＝1)安乐死。未处理的对照禽在第3天(n＝1)、第7天(n＝2)和第14天(n＝2)安乐死。在尸检期间，评估鸡的指示细菌感染的致病和/或炎症的大体征象，并收集鼻窦、气管、咽、肺和腺胃组织。将组织在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，切片，并用苏木精和伊红染色。该试验性研究的目标是验证这些载体在所施用的两种剂量下是耐受良好的，与未处理的组织相比，在处理后第3、7和14日没有伴随引起上皮损伤的大体或微观征象。统计计算和检验力证明不适用于确定实现与试验性研究2有关的目标所必需的鸡数量。这些是定性观察，目的在于基于最低平均临床病症和上皮损伤的最小可观察的大体或微观征象，确定最高可耐受的载体剂量。每组五只鸡的样本量足以计算各组的平均临床病症得分。为了为最后的POC实验确定最佳抗AIV载体剂量，试验性研究2是必需的。

试验性研究3：将一组十只鸡用LPAI H6N2病毒攻击。每天评价鸡的临床病症并收集OP拭子以利用RT-qPCR检测病毒脱落。在10dpi时，将鸡安乐死。试验性研究3的目的是通过临床病症得分和/或用RT-qPCR检测来验证鸡在H6N2攻击之后对感染的易感性。

概念证据(POC)：将安置在三个分开的隔间中的三组各十只鸡以300μl剂量施用3.6e8 CFU的载体或安慰剂。这些组包括组1＝抗AIV混合物载体，组2＝乱序载体，和组3＝阳性对照(PBS/Dap溶液)。所有的禽在处理后20小时(±2小时)通过鼻内(IN)途径用H6N2病毒攻击。每天评价鸡的临床病症并收集OP拭子。在10dpi时，将鸡安乐死并尸检以获得疾病征象和收集鼻窦、气管、咽、肺、肝和脾。将组织切片的一半在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，而将剩下一半的新鲜组织储存在-80℃。这项工作需要三组动物(每组n＝10)来统计确定用所述抗AIV载体处理的鸡和未处理的阳性对照鸡之间病毒脱落的差异。计算估算的样本量，以利用前面指出的统计分析(Wilcoxon秩和检验，费舍尔精确检验，多变量线性回归，和对数回归)，在95％的显著性水平下达到至少80％的检验力。最关键的测量结果是EID₅₀/ml，因为这个值代表病毒滴度，其指示病毒脱落。因此，检验力计算是基于预计的EID₅₀/ml测量结果。据估算，未处理的鸡中平均病毒滴度是5.5 log EID₅₀/ml，标准偏差(SD)±0.5 log EID₅₀/ml(Swayne和Beck，2005)。对于本工作而言，病毒滴度降低至少5-倍(0.7 log EID₅₀/ml差)被认为是统计学显著性的。因此，处理的鸡的估算的平均病毒滴度是4.8 log EID₅₀/ml，SD±0.5 log EID₅₀/ml。计算的效应量是1.4((最大平均值-最小平均值)/SD＝(5.5-4.8)/0.5)。利用Stata码fpower，输出表指示需要9至10之间的样本量来达到在α＝0.05下检验力为0.8。样本量为10足以证明与未处理的PC鸡或乱序载体处理的鸡相比，与用表达病毒特异性shRNA的混合物载体处理的鸡相关的病毒脱落降低≥5-倍。

岗哨鸡：将另外两只4-周龄商业鸡加到运输的三十只动物中用于最后的POC研究。代替将这些额外的动物安乐死，它们被安置在H6N2攻击的十只鸡之中，这十只鸡已另外接受抗AIV混合物载体。这些岗哨鸡与这些感染动物直接接触并共享相同的食物和水。使用这两只岗哨鸡的目的是监测可能的传播。

结果

RFP载体定位在鸡呼吸组织中–在试验性研究1中，在鸡用所述RFP载体处理后15和27小时，动物被安乐死并收集组织。将这些组织准备用于荧光显微术并捕获处理和未处理的组织的图像。这种RFP由原核表达载体pE2-Crimson(Clontech)产生。这种荧光蛋白是很明亮的、光稳定的、并且由于它在宿主细胞的细胞溶质中的可溶性而没有细胞毒性(Strack等2011)。选择它还因为它的远红激发和发射性质，允许在这种红色荧光信号和由于自发荧光产生的可能的背景之间进行区分。图5中显示，表达RFP的细菌看起来在这两个时间点定位到鼻窦组织、气管和肺的上皮。这与从PBS/Dap处理的鸡收集的那些组织中缺乏可见的红色表达形成对比。

最佳载体剂量和相关的致病性–在试验性研究2中，鸡被施用乱序载体的两种剂量之一并观察14天。在处理后1-14天之间，所有组中的禽都没有显示出任何痛苦或临床病症的征象。在这两种载体剂量下，鸡组在处理后第3(n＝2)、7(n＝2)和14日(n＝1)被安乐死，并且在尸检时，所有组织与来自用安慰剂(PBS/Dap)处理的禽的组织相比看起来正常。在腺胃组织中没有观察到明显的致病。组织学评估表明，当与PBS/Dap处理的组织相比时，载体处理与呼吸组织致病不相关。组织学确实表明在一些处理和未处理的组织中存在少量潜在疾病，其可能在开始研究之前就已经存在于这些商业鸡中了。因此，难以确定疾病是否与所述载体、处理体积(500μl)有关，或者是否所述动物来自以前患病的群体。

为此，决定使用只给予较高载体剂量(3.6e8 CFU/500μl剂量)的禽来重复这项工作，将所述禽与用500μl PBS/Dap处理的禽、未处理的禽相比、和从商业性经营中新到的禽相比较。包括最后一组禽是为了确定在未处理的禽中发现的疾病是在到达之前就存在还是在到达安置设施后发展的疾病。简单地说，向四个组的每组随机分派两只禽。除了新到的禽在到达时被安乐死和尸检之外，将其余三个组中的禽用载体、PBS/Dap处理或什么也不处理并观察14天。在第14日，所有禽被安乐死并尸检。在尸检时，任何组中的禽均未显示出任何疾病或反常的征象，并且病理学者是盲法分析组织学载玻片的以去除任何潜在的偏倚。组织学揭示，任何禽的肺、气管和肺泡中的病理或巨噬细胞浸润都非常少，特别是在气道和间质组织中，所述病理或巨噬细胞浸润会指示对载体或剂量体积的不良反应。在一些所述组织中注意到有轻度的血管周围炎症，但在所有组中的出现是轻微和随机的。此外，鉴于这些禽是商业的而不是SPF，这种出现并不异常。

对H6N2攻击的易感性–在试验性研究3中，将十只鸡用H6N2病毒攻击。收集OP拭子并记录临床病症。虽然没有预料到死亡，但发现一只鸡在7dpi时死亡。在8dpi时，9只剩余的鸡中有6只在AGID测试后是AIV血清阳性的，将鸡在10dpi时安乐死。本试验性研究的目的是验证在实验性攻击后H6N2感染和脱落。因此，在3、4和5dpi时收集的OP拭子是利用RT-qPCR测试的第一组和唯一一组样品。结果揭示了在3、4和5dpi时分别在7/10、10/10和8/10只鸡中的脱落。该数据足以证实鸡对H6N2攻击的易感性，并且对其余样品没有进行进一步的RT-qPCR测试。

在实验性攻击的鸡中的载体抗病毒活性–在最后的POC研究中，将禽组用所述混合物载体、乱序载体、或给定的安慰剂(PBS/Dap)预防性处理，然后用H6N2病毒感染。收集OP拭子并每天记录临床病症。在8dpi时，PC组中的一只鸡死亡。这是所有组中唯一的死亡。其余的鸡在10dpi时被安乐死。在安乐死之前收集的血液揭示，混合物、乱序载体和PC鸡中分别有4/10、6/10和6/9是AIV血清阳性的。H6N2攻击产生亚临床病症，因为没有鸡出现任何明显的疾病征象。因此，没有使用所述临床病症评分系统并且不分析得分。

表3中显示了通过与PC鸡相比从载体处理的鸡收集的总拭子中中位病毒滴度和阳性OP拭子的比例的累计降低来测量的载体保护。该原始数据表代表了在整个研究中的差异，没有对日进行校正。显示出在所述混合物处理的鸡(1.5，95％CI＝0，3.0)和PC鸡(4.1，95％CI＝2.8，4.8)之间中位滴度的显著差异(Wilcoxon秩和，p<0.0001)。同样地，在乱序载体处理的鸡(3.2，95％CI＝0，3.9)和PC鸡之间的中位滴度也有显著差异(p＝0.003)。从所述混合物组收集的阳性OP拭子的比例36/70(51％)，与PC组的58/70(83％)相比有显著差异(费舍尔精确检验，p<0.0001)。在乱序载体处理的禽(42/70，60％)和PC禽之间也观察到这种显著差异(p＝0.002)。虽然在这两种测量中混合物组和乱序载体组之间累计中位滴度或阳性拭子的比例没有显著差异，但所述混合物组中抗病毒效应更显著。表3指示了载体保护，但没有揭示在感染期间哪日存在这些显著性差异。

表4示出了每天的载体保护。对于每个处理组，显示了感染后每一日的滴度峰值和范围、中位滴度、和脱落比例。对中位滴度的差异进行Wilcoxon秩和检验指示了混合物处理的鸡和PC鸡之间在感染后第3和4日的显著差异。在所述乱序载体处理的鸡和PC鸡之间在任何一天都没有观察到中位滴度的显著差异。在3dpi时，混合物组(5/10)与PC组(10/10)相比，禽脱落比例有显著差异(p＝0.016)。然而，脱落比例的差异在乱序载体处理组和PC组之间在任何一天都不显著。

图6显示了每日时间间隔下的中位H6N2病毒滴度和脱落病毒的鸡的比例。观察代表每组中所有鸡(包括没有脱落的那些)的按日绘制的中位滴度曲线，在混合物鸡与在乱序载体和PC组中的那些鸡之间脱落的病毒载量有不同的趋势(图6A)。在感染后第2和7日之间，所述乱序载体和PC组二者的中位滴度显得上升，而混合物组中中位滴度下降并持续降低直至感染后第5日。所述混合物组中的滴度在6和7dpi时短暂上升，但脱落的病毒载量仍比从乱序载体和PC鸡脱落的病毒载量低得多。当将代表每组中脱落的那些鸡的中位滴度按日绘图时，观察到的趋势较不明显(图6B)。此处，每个中位滴度代表来自图6C的每天的鸡脱落的比例。除了感染后第3和10日之外，每日脱落的病毒的中位载量在混合物禽中比PC的脱落禽低。虽然观察到的病毒滴度在所述混合物和PC组之间在这两日具有这种明显转换，但重要的是要认识到，在第3和10日，PC组(10/10和5/9)与混合物组(5/10和4/10)相比，仍有更多数量的禽在脱落(图6C)。

正如所预期和观察到的，来自各组禽的中位脱落滴度按日变化。在原始中位滴度之间观察到显著差异(表3)，然而为了确定跨感染后所有天数的显著差异，有必要在分析中以日为控制变量。通过中位滴度降低测量的载体保护利用以日为控制变量的MLR来分析(表5)。不论是感染后哪天，与所述混合物(p<0.0001)鸡相比和与所述乱序载体(p＝0.002)鸡相比，PC鸡中的中位滴度都具有显著差异。在做出这点的大部分分析和比较中，与所述乱序载体处理相比，所述混合物处理保护往往更优越。然而，利用MLR并以日为控制变量，这种差异是无显著性的(p＝0.251)。

利用简单和多元对数回归分析来评估通过阳性对照鸡与载体处理的鸡相比脱落H6N2病毒的比值而测量的载体保护(表6)。对每个单日和以日为控制变量后(跨所有天数)计算OR、95％CI、和显著性水平(p<0.05)。除了3dpi之外，PC鸡中单日的脱落比值与所述混合物或乱序载体处理的鸡相比没有显著性。在感染后第3日，因为10/10(100％)PC鸡在脱落病毒，所以不能计算脱落比值。当以日为控制变量时，在PC鸡之中脱落H6N2的比值与混合物处理的鸡相比大4.83(95％CI＝2.17，10.72)(p<0.0001)。与所述乱序载体处理的鸡相比，所述PC鸡中跨所有天数脱落的可检测到的病毒的比值稍低(3.48；95％CI＝1.57，7.86)，但仍然显著(p＝0.003)。虽然不显著，但在所述乱序载体组中跨所有天数的脱落病毒的比值比所述混合物组中脱落的比值大1.42(p＝0.303)。

表7中显示了通过复制和脱落滴度的log降低和降低倍数而测量的载体保护。载体处理的鸡和PC鸡之间中位滴度(log EID₅₀ eq/mL)的差异以log降低计算。利用几何中位值，计算病毒滴度的降低倍数。跨所有天数(利用未校正的中位滴度)和为每个单日计算这两种降低测量结果。跨所有天数，所述混合物处理与PC鸡相比在病毒滴度上具有2.6中位log降低(降低398-倍)。在感染后的每个单日，所述混合物处理导致可测量的中位log降低。最显著的是在感染后第3、4、5、6和7日，其中与所述PC鸡相比，病毒脱落在2.5和3.8中位log降低(降低288至6309-倍)之间。病毒脱落的log降低在乱序载体处理的鸡中不明显得多。然而，总体仍然产生0.9中位log降低(降低7.9-倍)，并且在每个单日产生至少0.3中位log降低(降低1.8-倍)。所述乱序载体处理最显著的是在感染后第10日(1.4中位log降低)，其代表在混合物组中观察到的最小的有效降低，也在感染后第10日。

岗哨鸡–将没有接受过处理的鸡(n＝2)与混合物处理的禽从载体施用时到H6N2攻击后10日安置在一起。从这两只禽中，只在引入后第7日检出一个OP阳性拭子(1.5logEID50 eq/mL)。在感染后第2日和第10日之间从这些岗哨禽收集的所有其他拭子都是阴性的。总的来说，从这些接触禽收集的OP拭子中13/14(92.8％)是阴性的。

本研究利用所述tkRNAi递送平台首次显示了有效递送和细菌介导的向禽类鼻窦、气管和肺组织的侵袭。在两个时间点，即处理后15和27小时评估RFP载体摄取。在递送和侵袭到鸡呼吸组织后，这些载体能有多长时间向这些非吞噬性上皮细胞接受体主动供应shRNA仍是未知的。为了证明初始功效，决定评估和验证瞬时载体摄取来模拟24小时内的病毒防护。图5中捕获的图像表明，在这两个时间点RFP载体定位到所述呼吸组织使得足以作出以下结论：载体递送和理论上shRNA的卸载将先于病毒攻击。

与安慰剂(PBS/Dap)和未处理的禽相比，鼻内施用所述乱序载体在处理后14日内不伴有任何观察到的致病。没有任何观察到的临床病症以及有利的组织病理学结果提示这些载体在所施用的剂量下耐受良好。作为后续行动，可以进行其他的研究。试验性研究2没有测试如果在数日中连续施用载体剂量，是否会存在组织特异性致病。在该工作中也没有评价定量测量载体处理响应的可选方式，包括蛋禽的产蛋减少和肉鸡不增重。在未来的工作中，这种预防技术可以包括超过14日和多次剂量后的评价。然而，这些载体是Dap营养缺陷型的，一旦施用后，不能在补充培养基之外生存或增殖。怀疑由于在处理后2周时没有任何大体或微观的组织损伤，在超过14日时会引起慢性炎性响应。这些初始的试验性结果是有希望的，并且表明了这种tkRNAi系统适合于禽类呼吸组织递送并且不触发禽类宿主在14日内不能克服的炎性响应。

试验性研究3验证了H6N2病毒在所述攻击剂量下在5周龄商业蛋鸡中是感染性的。该剂量(10⁶EID₅₀/0.1mL)常用于鸡中的LPAI疫苗功效试验和其他实验性攻击研究(Claes等2013，Pantin-Jackwood等2012，Abbas等2011)。试验性研究1、2和3一起验证了24小时内的载体摄取，鉴定了适当的载体剂量和最佳的LPAI攻击病毒。这些参数被结合到最后的POC研究中。

将三组各十只鸡预防性施用所述混合物、乱序载体或安慰剂载体并在处理后20小时(±2)用H6N2攻击。表3中提供的原始数据表明当将所述混合物或乱序载体处理的禽与所述PC禽比较时，跨感染后所有天数的脱落滴度和收集的阳性拭子的比例有显著差异。当以日为控制变量进行MLR分析时，进一步支持了这些结果。有趣的是按日展开这些结果，以鉴定这些差异在处理组之间哪里出现和暗示为什么出现。在H6N2攻击之后，看起来在2dpi时的鸡脱落比例比较相似；意味着成功的实验性感染在所有组中比较相等。还有，在第2日脱落的禽中，混合物禽中的脱落滴度与所述乱序和PC禽相比降低。另外，个体禽脱落(未提供)指出，一只混合物处理的禽在2dpi时脱落，但在随后的天数中停止以可检测的水平脱落。这在直观上是有道理的，因为所述载体的作用模式旨在防止复制而不是感染。

在第3日，虽然乱序载体(7/10)和PC(10/10)组中的脱落比例看起来突增，但所述混合物组显著下降到5/10并且在第3、4和5日间形成平台。作为对这种观察结果的支持，混合物处理的鸡和PC鸡之间在感染后第3和4日脱落滴度显著不同。同样地，观察脱落趋势(图6A)，在感染后3至5日，所述混合物组中中位滴度下降，但在所述乱序载体和PC组二者中，连续增加直到感染后第7日。这些观察结果可以解释所述NP和PA shRNA的抗病毒活性，在感染期期间干扰有效的病毒复制。还有别的方式能解释这些观察结果。在所述混合物处理组中，与感染后第3-5日相比，在感染后第2日有更多的鸡脱落病毒。这可能表明，如果在攻击之前>24小时施用以允许更多的时间用于shRNA卸载和加工的话，载体保护将更有效。

按日的脱落滴度和比例支持所提议的载体保护模型。在病毒进入和感染之后，所述载体干扰病毒复制，抑制要继续感染相邻细胞和组织的感染性毒粒的增殖。这减少了呼吸组织内的感染性病毒载量，从而减少了每只鸡中的病毒脱落。因为AIV主要通过鸡的直接接触传播，这防止了该组中易感禽的后续感染。总之，这些发现暗示了混合物载体处理破坏了有效的病毒复制和脱落。

脱落持续时间直接影响感染期或从首次检出病毒时到不再检出病毒时的时间。它提供了评估载体保护的另一种方式。然而，可以争论：脱落持续时间与脱落滴度相比在传播中发挥的作用较小。动物可能在较长的持续时间内脱落，但脱落滴度太低而不支持成功的传播。另外，尽管脱落期较长，但禽密度可能不支持传播。为此，脱落持续时间通常不用作评价疫苗功效的度量。本研究在10dpi时终止，虽然在各组的鸡当中脱落继续。因此，如果所述研究持续超过10日，有可能精确测量所述载体对脱落持续时间的影响。所述混合物载体降低口咽部病毒脱落滴度，但看起来不限制脱落持续时间。也许这表明了所述载体在感染周期的早期恰当提供瞬时保护，而且还可以表明需要施用后续的载体剂量，很像加强疫苗。这还可以保护易感禽免受被感染禽的影响，从而阻断传播链。

除了评估脱落持续时间以及脱落滴度和脱落比例的差异之外，所述PC鸡与载体处理的鸡相比脱落病毒的比值提供了测量载体保护的另一种方式。在跨感染后的所有天数进行控制下，与所述混合物处理的鸡相比，所述PC鸡脱落H6N2病毒的可能性高4.83倍(p<0.0001)。与所述乱序载体处理的鸡相比，PC鸡也更可能脱落病毒。虽然这些比值比提供了对载体保护的更大支持，但它们不是业内评价疫苗功效的标准化方法。

呼吸道中病毒复制的定量降低是用于评价限制病毒传播和控制疾病的预防能力的关键度量(Swayne和Kapczynski 2008)。为了被认为是临床相关的，AIV疫苗必须表现出，与未接种疫苗的禽相比，在接种疫苗的禽中来自呼吸道的病毒复制和脱落滴度至少降低10²EID₅₀(2log或100-倍)(Suarez等2006)，和/或所述差异应该是统计显著性的(Swayne等1997)。虽然所述乱序载体没有表现出这种最低要求的降低，但它的确表现出跨所有天数的脱落滴度的统计显著性差异(表5)。除感染后第2和10日之外，来自所述混合物载体的脱落滴度与所述PC禽相比，表现出最低2.5log降低(288-倍)和最高3.8log降低(6,309-倍)。跨所有天数，所述抗AIV混合物组与所述PC组相比，脱落的感染性病毒少398-倍。这些测量结果全部是统计显著性的。基于这两种可测量的标准，所述混合物载体处理在所述参数内是良好的，被认为提供了临床相关的AIV防护。

利用几种其它测量来评估疫苗保护。在用10²至10⁵EID₅₀的更高剂量攻击后，与未接种疫苗的禽相比，测试接种疫苗的禽的可量化的耐受性(Swayne和Kapczynski 2008)。另外，由蛋禽中产蛋减少定义的临床病症能够可定量地测量保护。产蛋直至18-20周龄时方开始。为了模拟产业通常应用疫苗方案的龄期，本研究中使用的禽是4-6周龄。因此不可能测量产蛋。将来利用这种载体系统的研究将使用这两种评估来定量地测量载体保护。防止死亡是疫苗保护的另一种直接度量。LPAI根据定义是低致病性的并且经常与死亡不相关。然而，这种H6N2病毒充分适应鸡，在试验性研究3中所述PC鸡和攻击的鸡中造成了10％死亡。相反，所述混合物和乱序载体二者看起来防止死亡，因为接受任一种载体的禽均未在H6N2感染之后死亡。

最后，防止接触传播是证明疫苗的保护性功效和限制现场传播的倾向的直接方法。因此，临床相关的脱落降低可以通过显示出减少蔓延到接触禽来证明，这是国立兽医生物管理机构经常要求的做法。这在实验环境中是难以评估的，因为在传播中起作用的因素不是标准化的。这些因素包括禽密度、通风、湿度、温度、攻击病毒和剂量、给药途径、攻击时的龄期、病毒-宿主适应、和室内卫生。鼻内50％禽感染剂量(BID₅₀)已被建议作为在实验室环境中攻击的鸡中可定量地评估AIV启动感染和支持传播的潜力的方式(Tumpey等，2004)。在本研究中，可以说，所述禽是用启动感染和支持传播的适当的BID50攻击的，因为大于50％的PC鸡脱落病毒。与所述混合物处理的禽安置在一起的两只没有经过处理的岗哨鸡充当监测在密度为1.0平方英尺/禽的密度下这个组内病毒蔓延的方式。除了在引入后第7日的一个阳性拭子之外，在两只岗哨鸡中没有检测到禽-禽传播。从这一个拭子检测到的滴度刚刚超过RT-qPCR试验的检测限。有可能这个阳性样品确实是由H6N2传播引起的。然而，也可能这个偶发的阳性拭子是来自收集期间的手套或提取程序期间的病毒RNA的交叉污染的结果。

在一个基于实验室的传播研究中，研究人员用LPAI A/Ck/HN/1/98(H9N2)实验性攻击3周龄的SPF鸡(n＝10)(Guan等2013)。当以0.5平方英尺/禽的密度安置时，在2dpi时2.1 log 10 EID₅₀ eq/mL的平均OP病毒滴度足以传播到没有接受过处理的鸡(n＝2)。第二个研究用含有10⁶EID₅₀的A/鸡/CA/1255/02(H6N2)病毒的0.1mL鼻内攻击46周龄SPF来亨鸡(n＝10)并在3dpi时加入两只岗哨禽以监测接触传播(Pantin-Jackwood等2012)。在被攻击的鸡中，在2和4dpi时的平均OP滴度±SD(log 10 EID₅₀ eq/mL)分别是4.8±0.5和5.3±0.5。在引入后4日，这两个岗哨禽都是阳性(3.7和3.1 log 10 EID₅₀ eq/mL滴度)。虽然本研究中没有给出禽密度，但在感染后第2和4日，攻击的禽中的脱落滴度类似于在当前PC鸡中检测到的那些滴度。如果将岗哨禽也与所述PC鸡安置在一起的话，将更好地说明通过降低传播潜力来测量的载体保护。令人遗憾的是，这是不可能的，因为商业农场只提供了两只额外的禽。除了使用适当的BID₅₀之外，这些前面的研究还表明，如果将岗哨禽安置在PC鸡之中的话，脱落滴度将足够支持传播。不管怎样，看起来所述混合物载体成功地抑制了传播到这些接触禽。为了做出关于这些抗AIV载体打断传播链的能力的任何有效推论，需要标准化的实验室接触传播模型来更准确地复制现场或农场环境。

家禽呼吸道的粘膜表面是已知的AIV进入通路(Zarzaur和Kudsk 2001)。因为AIV侵袭所述粘膜表面，将这些载体靶向递送到鸡的粘膜呼吸道是靶向病毒复制的附加益处。以这种方式，这些载体可以在防御的第一线为宿主提供强保护。然而，关于免疫激活的顾虑是要重要考虑的，因为激活呼吸组织中的免疫应答是有有利弊的。与存在于家禽胃肠道中的天然微生物菌群不同，呼吸组织不可能发展出对细菌组分的免疫耐受性。适中的免疫应答可能是有益的，尤其是对抗流感感染。这可能有助于解释与乱序载体处理相关的抗病毒活性。

然而，重要的是避免刺激强粘膜免疫应答。这可能干扰这种鼻内应用载体的功效，尤其是如果需要多个剂量来更好地防御AIV的话。在结束所述POC工作后，得悉这些4周龄小母鸡已经在7日龄时接种了

大肠杆菌改良型活疫苗(Zoetis，Florham Park，新泽西)。这种新批准的疫苗已被研究以确定它对抗禽类致病性大肠杆菌(APEC)的广谱保护机制。当通过喷雾或饮用水施用时，看起来所述疫苗刺激APEC特异性免疫球蛋白A在粘膜组织中产生以及CD8记忆细胞的增殖，这二者指示一类MHC的激活，引起细胞应答而不是体液应答(Filho等2013)。激活细胞免疫应答将帮助预防将来组织被APEC侵袭，特别是在呼吸道中，因为这是APEC感染的主要途径(Sadeyen等2014)。疫苗接种可能已经在4周龄时导致粘膜炎症。也许

大肠杆菌疫苗接种解释了在试验性研究2(第一轮)中观察到的潜在疾病并导致了在对照和载体处理的两种禽的呼吸组织中观察到的炎症和淋巴细胞聚集。

除了对

大肠杆菌疫苗诱导的粘膜炎症的顾虑以外，对这种大肠杆菌疫苗的明显的警告是它是否通过引发细胞介导的应答来阻止载体侵袭呼吸上皮从而影响载体功效。虽然这种顾虑是正当的，但它可以用几种方式解决。所述抗AIV载体系统中使用的细菌是非移动性大肠杆菌菌株CEQ221。这些细菌是K-12衍生物，表型粗糙，并且虽然它们的脂多糖具有完整的核心结构，但它们缺乏O抗原(Liu和Reeves 1994)。这意味着这些载体在LPS O-抗原生物合成中是有缺陷的并且可能缺乏有效的LPS表达，导致在它们的外膜上LPS的水平较低。因此CEQ221不可能诱导强大的免疫应答。CEQ221是非致病的侵袭性细胞内细菌并且已经被遗传工程改造成靶向粘膜上皮细胞。这些侵袭性大肠杆菌需要粘膜上皮细胞表面上的(β)1整合素表达。进入依赖于这种侵袭素-(β)1整合素受体相互作用，这种相互作用使得细菌通过受体介导的胞吞被摄取(Xiang等2006，Isberg和Barnes 2001，Conte等1994，Isberg and Leong 1990)。要不是所述遗传工程改造的细菌表达所述侵袭素蛋白，这些CEQ221细菌原本应是细胞外的并被专职抗原递呈细胞(APC)识别。上皮细胞通常不被表征为专职APC。因为这种特异性粘膜上皮靶向系统，树突状细胞和其他APC不大可能与这些载体相互作用或对这些载体作出应答。CEQ221是Dap营养缺陷体并在侵袭到宿主细胞中后经历快速裂解。即使CEQ221对APC和其他免疫细胞是侵袭性的，但细菌在吞噬体中裂解后LLO的表达将破坏所述细胞的吞噬体和溶酶体之间的融合。这种破坏将阻断I类MHC呈递并通过CD8记忆细胞增殖来防止细胞介导的免疫应答的激活(Grillot-Courvalin等1998)。因此，这些CEQ221载体不是非常适合于发展细胞介导的免疫应答或甚至体液免疫应答。这些特性、或缺乏这些特性可以解释这种载体在这些商业鸡中逃避由

大肠杆菌疫苗产生的细胞应答的能力。

如果在该研究中使用的动物是SPF禽，则载体保护可能已被更直接地测量到。然而，为了最好地模拟这种载体系统在现场的功效，可以对使用这些商业禽作出争议。最终，难以解读在这项初步的试验性工作中，这种

大肠杆菌疫苗对所述抗AIV载体可能产生的影响。然而，如果所述大肠杆菌疫苗具有任何有害效应的话，这将提示这项工作的结果低估了载体在鸡中对AIV的防御。

虽然结果提示所述混合物载体提供更大的保护，但单独的乱序载体具有抗病毒能力并不异常。这些细菌载体在特性上是LPS粗糙型的，然而即使很低水平的LPS仍能充当免疫增强剂(Bessler等1990)。LPS通常被宿主组织识别并刺激先天免疫应答。LPS识别可以引起刺激I型IFN产生的下游信号转导途径。鉴于过去的一些与CEQ508大肠杆菌相关的研究，CEQ221菌株的衍生物充当抗AIV载体递送工具这种情形是可能的。在以前的工作中(Steinbach等2010)，与LPS注射相比，口服CEQ508不引起小鼠中循环促炎性细胞因子的显著增加。然而，这些细菌载体确实刺激了很低水平的这些细胞因子，包括TNF-α、IL-6、MCP-1和IL-12。这些是参与先天免疫应答的所有关键细胞因子，先天免疫应答是对抗病毒感染、特别是流感的公知的细胞防御机制(Garcia-Sastre和Biron 2006)。当这些细菌载体通过鼻内途径施用于鸡时，这些载体触发先天应答是很可能的，导致对抗H6N2以及复制和脱落的附加防护。在这种先天激活期间产生的促炎性细胞因子将增加任何未感染的宿主细胞抵抗被新产生的病毒新感染的能力。

正如已经介绍和讨论的，有几种方式用于测量和描述来自该POC工作的载体保护。不论是看按日计和跨所有天数二者的脱落比例、脱落滴度还是比值比的差异，都出现相似的模式。与阳性对照相比，用所述抗AIV混合物载体预防性处理的鸡在用H6N2实验性攻击之后受到保护。虽然在任何单日的分析无显著性，但总体(跨所有天数)的显著性保护与乱序载体处理有关联。虽然，来自所述乱序载体的保护不太明显，提示所述混合物载体具有更大的抗病毒潜力。这种附加的保护可能是由于NP和PA shRNA的双重抗病毒作用。

平均后，在感染后第3-7日之间，48％的混合物载体处理的鸡没有脱落。与此相反，PC组中只有10％的鸡没有脱落。脱落滴度降低的分析结果显示所述混合物载体提供临床相关的保护。

如之前所述，这项工作的长期目标是将这种抗流感技术开发成为能促进更有效和强大的家禽AIV控制方法的开发的预防药。成功开发这种技术将不仅降低爆发对行业和发展中国家的经济负担，它还将直接降低传播给人类的风险并为科学和医学界开发用于人类的类似的抗流感预防药提供概念证据。与开发任何新技术一样，需要额外的研究并且不应被低估。这项工作证明了这些抗AIV载体在鸡中对抗禽流感的保护性功效并提供了继续评价这种技术的强论据。

权利要求项的术语表

术语“施用”及其变化形式(例如“施用”化合物)在指代本发明的化合物时是指将所述化合物引入需要治疗的对象的身体中。当本发明的化合物与一种或多种其他活性剂(例如AIV疫苗等)相组合提供时，“施用”以及它的变化形式各自被理解为包括同时和相继引入所述化合物和其他活性剂。

用在本文中时，术语“组合物”意图涵盖包含指定量的指定成分的产物，以及由指定量的指定成分的组合直接或间接产生的任何产物。

术语“治疗有效量”用在本文中时是指在组织、全身、动物或人类中引起研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的生物或医学应答的活性化合物或药剂的量。在指代AIV感染时，有效量包括足以防止感染疾病或足以减轻疾病严重性的量，如通过对象的临床症状、病毒滴度或病毒脱落所证实的，或通过防止或减少动物之间传播的能力所证实的。在一些实施方式中，有效量是足以延迟症状发作或预防所述疾病的量。在一些实施方式中，有效量是足以降低病毒滴度和/或减少病毒脱落的量。有效量可以在一剂或多剂中施用。

术语“治疗AIV”或“AIV的治疗”是指施用于具有感染AIV的风险的动物，特别是家禽，并且是指通过抑制AIV的复制来缓解所述疾病的效应，而且还指的是导致临床症状、病毒滴度和/或病毒脱落减少的效应。

用在本文中时，“治疗”是指获得有益的或期望的临床结果。有益的或期望的临床结果包括但不限于下列的任何一种或多种：缓解一种或多种症状，减轻AIV的程度，稳定的AIV状态(即不恶化)，阻止或延迟AIV的蔓延(例如脱落)，阻止、延迟或减慢AIV进展，和/或保持重量/重量增加或产蛋，从而保持动物生产力。本发明的方法设想了这些治疗方面的任何一种或多种。

“需要治疗的对象”是具有感染AIV的风险的动物。

“可药用的”组分是适合用于人类和/或动物并且与合理的利益/风险比相称没有过度的不良副作用(例如毒性，刺激和变态反应)的组分。

“安全有效量”是指当以本发明的方式使用时足以产生期望的治疗反应并且与合理的利益/风险比相称没有过度的不良副作用(例如毒性、刺激或变态反应)的组分量。

用在整个申请中时，不带具体数量的指称以它们是指“至少一个”、“至少第一”、“一个或多个”或“多个”所指称的组分或步骤的意义使用，除非上下文明确地另有指定。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

术语“和/或”无论用在本文中何处都包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其他组合”。

用在本文中时，术语“包含”意图是指所述产物、组合物和方法包括所提及的组分或步骤，但不排除其他组分或步骤。“基本由...组成”当用于定义产物、组合物和方法时，应该是指排除任何有实质意义的其他组分或步骤。因此，基本由所列举的组分组成的组合物不排除痕量的染污物和可药用的载体。“由...组成”应该是指排除痕量元素以外的其他组分或步骤。

用在本文中时，术语“侵袭性的”当涉及微生物例如细菌或细菌治疗粒子(BTP)时，是指能够向靶细胞递送至少一种分子例如RNA或编码RNA的DNA分子的微生物。侵袭性的微生物可以是能够穿越细胞膜从而进入所述细胞的细胞质并将至少一部分它的内容物例如RNA或编码RNA的DNA递送到所述靶细胞中的微生物。将所述至少一种分子递送到靶细胞中的过程优选不显著改变侵袭器官。

侵袭性微生物包括：天然能够向靶细胞递送至少一种分子的微生物，例如通过穿越细胞膜例如真核细胞膜并进入细胞质；以及不是天然侵袭性的并且已被修饰、例如遗传修饰成侵袭性的微生物。在另一种优选实施方式中，通过将细菌或BTP与也称为“进入因子”或“细胞质靶向因子”的“侵袭因子”连接，可以将不是天然侵袭性的微生物修饰变成侵袭性的。用在本文中时，“侵袭因子”是指当被非侵袭性细菌或BTP表达时致使所述细菌或BTP变成侵袭性的因子，例如，蛋白质或一组蛋白质。用在本文中时，“侵袭因子”是由“细胞质靶向基因”编码的。在本领域中已全面描述了侵袭性的微生物，例如，美国专利公布No.US20100189691 A1和US20100092438 A1以及Xiang，S.等，Nature Biotechnology 24，697-702(2006)。它们各自通过引用以其全文并入用于所有目的。

在优选实施方式中，所述侵袭性微生物是大肠杆菌，如本申请的实施例中所教导的。然而，设想了其他的微生物也有可能被修改成充当递送抗AIV siRNA的tkRNAi载体。这些无毒力并且侵袭性的细菌和BTP将表现出侵袭性质，或者将被修饰成表现出侵袭性质，并且可以通过各种机制进入哺乳动物宿主细胞。与由专职吞噬细胞摄取细菌或BTP常规导致所述细菌或BTP在专门的溶酶体内破坏相反，侵袭性的细菌或BTP株具有侵袭非吞噬性宿主细胞的能力。这类细胞内细菌的天然存在的实例是耶尔森氏菌(Yersinia)、立克次氏体(Rickettsia)、军团杆菌(Legionella)、布鲁氏菌(Brucella)、分支杆菌(Mycobacterium)、螺杆菌(Helicobacter)、考克斯氏体(Coxiella)、衣原体(Chlamydia)、奈瑟氏菌(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌(Burkolderia)、博德特氏菌(Bordetella)、包柔氏螺旋体(Borrelia)、李斯特菌(Listeria)、志贺菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、卟啉单胞菌(Porphyromonas)、密螺旋体(Treponema)和弧菌(Vibrio)，但这种性质也可以转移给其他细菌或BTP，例如大肠杆菌、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)或双歧杆菌(Bifidobacteriae)，包括通过转移侵袭相关基因的益生菌(P.Courvalin，S.Goussard，C.Grillot-Courvalin，C.R.Acad.Sci.Paris 318，1207(1995))。当评价其他细菌物种作为用作tkRNAi载体的候选物时要考虑或解决的因素包括候选物的致病性或缺乏致病性，候选细菌对靶细胞的趋向性，或者细菌可以被工程改造成向靶细胞内部递送siRNA的程度，以及候选细菌可能通过触发宿主的先天免疫而提供的任何协同价值。

禽流感病毒是对动物和人类健康造成重大威胁的疾病，并且是使得大流行性流感出现的遗传多样性的来源。用在本文中时，禽流感是通过在家禽中引起流感症状和可能的死亡而不利地影响至少一部分家禽的流感。流感可以被一些家禽携带而不产生流感症状或没有不利地影响所述家禽的健康这一事实不会改变只要所述流感不利地影响至少一部分家禽的健康，则所述流感就是禽流感并且是疾病这一事实。用在本文中时，感染禽流感病毒并且没有表现出症状和/或起到病毒载体的作用的家禽仍然被称为已经感染所述禽流感疾病。当所述病毒在家禽身体内时，所述家禽感染禽流感病毒。

用在本文中时，如果(1)将药物组合物通过内部(通过吞食、吸入、注射等)、局部(在皮肤上吸收到体内)或以其它方式施用于动物，并且(2)所述药物组合物防止家禽感染所述疾病并经历通常与所述疾病有关的症状，或者，如果家禽感染所述疾病并经历或不经历不同程度的严重性的一些或全部通常与所述疾病有关的症状，所述家禽从所述疾病恢复到正常健康状态，则在家禽暴露于疾病之前或之后防止了所述疾病。以类似的方式，如果家禽的病毒脱落降低(例如脱落滴度降低)，不管所述家禽是否在禽流感病毒感染中存活，则禽流感蔓延风险降低。如上文所讨论的，本发明的主要目标之一是遏止或减少禽流感的蔓延，这种减少可以通过减少从感染的家禽传播到其他动物或人类来解决。

用在本文中时，如果将药物组合物在家禽已经感染疾病后施用于所述家禽，则是治疗疾病。如上所述，感染疾病的家禽可以或可以不表现出与所述疾病有关的症状。

在家禽中由禽流感产生的症状范围为从轻度患病到高度传染性和迅速致死的“高度致病的”疾病形式，后者可以产生严重的流行病。高度致病性禽流感的特征在于突然发作、严重和迅速死亡，并且死亡率可以接近100％。

还提供了实践本发明方法的试剂盒。“试剂盒”意图是指包含本发明的至少一种试剂、例如pH缓冲剂的任何制品(例如，包装或容器)。所述试剂盒可以作为执行本发明方法的单位来推销、分配或销售。另外，所述试剂盒可以含有描述所述试剂盒及其使用方法的包装插页。任何或所有的试剂盒试剂都可以被提供在保护它们抵御外界环境的容器内，例如在密封容器或小袋内。

除非另有陈述，本发明的实践可以使用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组体技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和说明，它们在本领域技术人员的范围之内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、和利用标签检测杂交。适用技术的具体说明可以通过参考上文的实例来获得。然而，当然也可以使用其他等效的常规程序。这样的常规技术和说明可以在标准实验室手册中找到，例如《基因组分析：实验室手册系列》(Genome Analysis：A Laboratory Manual Series)(I-IV卷)，《抗体使用：实验室手册》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，《细胞：实验室手册》(Cells：ALaboratory Manual)，《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A Laboratory Manual)，和《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(全部来自Cold SpringHarbor Laboratory Press)，Stryer，L.(1995)《生物化学》(Biochemistry)(第四版)Freeman，N.Y.，Gait，“寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach)”1984，IRL Press，London，Nelson和Cox(2000)，Lehninger，《生物化学原理》(Principles of Biochemistry)第三版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.，和Berg等(2002)《生物化学》(Biochemistry)第五版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.，它们全部以其全文通过引用并在本文中用于所有目的。

在有利的实施方式中，所述试剂盒容器还可以包括可药用的载体。所述试剂盒还可以包括无菌稀释剂，其优选储存在分开的其他容器中。在另一种实施方式中，所述试剂盒还包含包装插页，其包含印刷的说明书，指导使用pH缓冲剂和所述抗AIV剂的联合治疗作为治疗对象中的禽流感的方法。所述试剂盒也可以包含其他容器，其包含其他抗流感药剂(例如金刚烷胺、金刚烷乙胺和奥塞米韦)、增强这种药剂的效应的试剂、或改善所述治疗的功效或耐受性的其他化合物。

本申请中引用的所有参考文献在与此没有不一致的程度上，通过引用以它们的全文结合到本文中。

可以看出，有效获得了上文阐述的优点，和从前面的描述变得显而易见的那些优点，并且因为在不背离本发明范围的情况下可以在上述构建物中做出某些变化，所以在前面的描述中包含的或在附图中显示的所有主题都应该意欲被解释为说明性而不是限制性的。

还要理解，权利要求意欲覆盖在本文中描述的本发明的所有上位和下位特征，以及作为语言问题可以被认为落在其间的本发明范围的所有陈述。现在本发明已经被描述。

序列表

<110> 科罗拉多州立大学研究基金会

<120> 流感的大肠杆菌介导的siRNA沉默

<130> SCT164047-80

<140> 14/604,252

<141> 2015-01-23

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 1

ggatcttatt tcttcggag 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 2

gcaattgagg agtgcctga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 3

ctccgaagaa ataagatcc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 4

tcaggcactc ctcaattgc 19

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA序列的流感病毒NP。

<400> 5

ggatcttatt tcttcggagt tcaagagact ccgaagaaat aagatcc 47

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA和多聚T尾序列的流感病毒NP。

<400> 6

ggatcttatt tcttcggagt tcaagagact ccgaagaaat aagatccttt ttttttt 57

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA序列的流感PA。

<400> 7

gcaattgagg agtgcctgat tcaagagatc aggcactcct caattgc 47

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA和多聚T尾序列的流感病毒 PA。

<400> 8

gcaattgagg agtgcctgat tcaagagatc aggcactcct caattgcttt ttttttt 57

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 发夹环序列。

<400> 9

ttcaagagat 10

<210> 10

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多聚T尾序列

<400> 10

tttttttttt 10

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 11

gatctgttcc accattgaa 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 12

cgggactcta gcatactta 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 13

ttcaatggtg gaacagatc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 14

tcaggcactc ctcaattgc 19

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA序列的流感病毒 PB1.

<400> 15

gatctgttcc accattgaat tcaagagatt caatggtgga acagatc 47

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA和多聚T尾序列的流感病毒PB1。

<400> 16

gatctgttcc accattgaat tcaagagatt caatggtgga acagatcttt ttttttt 57

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA序列的流感病毒 PB2。

<400> 17

cgggactcta gcatacttat tcaagagata agtatgctag agtcccg 47

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有shRNA和多聚T尾序列的流感PB2。

<400> 18

cgggactcta gcatacttat tcaagagata agtatgctag agtcccgttt ttttttt 57

Claims (21)

1.包含质粒的非致病性大肠杆菌(E.coli)，所述质粒编码一种或多种siRNA和控制所述siRNA转录的原核启动子，其中所述siRNA干扰一种或多种流感病毒RNA分子并且其中所述细菌被工程改造成表达侵袭因子。

2.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述侵袭因子是inv基因或hlyA基因。

3.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述siRNA干扰NP mRNA、PA mRNA、PB1 mRNA或PB2 mRNA。

4.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述siRNA与多个流感亚型共有的流感病毒mRNA序列互补。

5.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述siRNA包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。

6.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述质粒编码包含选自由以下组成的组的序列的转录本：SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.15和SEQ ID No.17。

7.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述原核启动子选自由以下组成的组：T7启动子、T3启动子或SP6启动子。

8.根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌，其中所述siRNA靶向保守序列，其中所述保守序列是多个流感亚型共有的。

9.包含根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌的组合物在制备通过包括以下步骤的方法治疗受试者中的流感或降低流感蔓延风险的药物中的应用：向所述受试者施用包含根据权利要求1所述的非致病性大肠杆菌的组合物。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述组合物作为适合于吸入的气雾剂经鼻内或喷雾施用。

11.根据权利要求9所述的应用，其中所述方法包括施用多个大肠杆菌菌群的步骤，其中每个大肠杆菌菌群被工程改造成表达干扰一种或多种流感病毒RNA分子的不同的siRNA分子。

12.药物组合物，其包含：含有质粒的第一种非致病性大肠杆菌，所述质粒编码原核启动子和第一种siRNA，其中所述第一种非致病性大肠杆菌被工程改造成表达侵袭因子并且编码的第一种siRNA干扰一种或多种流感病毒RNA分子并且所述启动子控制所述第一种siRNA的转录；含有质粒的第二种非致病性大肠杆菌，所述质粒编码原核启动子和第二种siRNA，其中所述第二种非致病性大肠杆菌被工程改造成表达侵袭因子并且编码的第二种siRNA干扰不同的感病毒RNA分子并且所述启动子控制所述第二种siRNA的转录，所述第一种细菌和第二种细菌在可药用载体中。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中第一种非致病性大肠杆菌或所述第二种非致病性大肠杆菌的所述侵袭因子是inv基因或hlyA基因。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中编码的第一种siRNA序列包含SEQ IDNo.3并且编码的第二种siRNA序列包含SEQ ID No.4。

15.根据权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗流感或降低流感蔓延风险的药物中的应用。

16.质粒，其编码一种或多种siRNA、控制所述siRNA转录的原核启动子、侵袭因子，其中所述siRNA干扰流感病毒的mRNA。

17.根据权利要求16所述的质粒，其中所述侵袭因子是inv基因和hlyA基因。

18.根据权利要求16所述的质粒，其中所述siRNA干扰NP mRNA、PA mRNA、PB1 mRNA或PB2 mRNA。

19.根据权利要求16所述的质粒，其中所述siRNA包含选自由以下组成的组的序列：SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14。

20.包含根据权利要求16所述的质粒的组合物在制备用于治疗流感或降低流感蔓延风险的药物中的应用。

21.根据权利要求20所述的应用，其中所述组合物包含编码其它siRNA的其他原核载体，其中所述siRNA干扰禽流感病毒的其他mRNA转录本。

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