CN111133107A - 用于治疗性核酸递送的跨界平台 - Google Patents
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Abstract
一种用于将治疗性核酸递送至上皮组织的跨界平台，其中将核酸设计为具有增强的稳定性。所述平台对先前的递送平台进行了许多改进，包括表达TAR RNA结合蛋白(TRBP)的双链RNA结合结构域(dsRBD)，在细菌递送运载体中敲除RNase R活性，以及表达甲基转移酶基因HEN1，用于与治疗性核酸递送运载体同时包装。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2017年4月3日提交的美国临时申请第62/480,875号的权益。
技术领域
本发明涉及疾病的治疗和预防。更具体地，本发明涉及一种具有改善的侵袭特性的用于将治疗性核酸递送至上皮组织的跨界平台，其中所述跨界平台已经被工程化以产生具有增强的稳定性的核酸。
背景技术
核酸(NA)的治疗应用对于广泛的临床目标具有强大的潜力。然而，NA向特异性细胞和组织的递送及其瞬时靶向作用仍然是利用其能力和临床应用的主要障碍。
核糖核酸(RNA)干扰(RNAi)是一种特异性抑制基因表达的技术。它是通过通常长度约为21-27个核苷酸的小双链小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)进行的。
siRNA和shRNA的有效性可能受到许多因素的限制。首先，siRNA和shRNA容易被核糖核酸酶(RNase)降解，从而降低了它们的功效。其次，它们无法穿透细胞膜，因此其生物利用度非常低。由于siRNA不能独立穿过细胞膜，因此经常使用递送运载体，例如病毒载体和合成载体。这些病毒和合成的siRNA运载体对临床功效造成了严重的局限和问题，例如细胞死亡、RNAi/微小RNA饱和和肝毒性以及肿瘤发生。合成运载体通常具有低的递送效率并且需要大剂量才能实现临床功效，这可能是成本过高的并且常常是有毒的。此外，基于siRNA的应用历来与瞬时RNAi效应相关，这意味着临床靶向所需的沉默效应是短暂的。尽管已经进行了shRNA/siRNA的化学修饰以及许多基于纳米技术的递送方法的应用，但对少数靶组织的有限递送效率以及RNAi的短暂效应仍然是主要障碍。用于将RNAi介导剂和其他核酸(包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、小干扰RNA/短发夹RNA(siRNA/shRNA)、微小RNA(miRNA)、antagomiR(miRNA拮抗剂)、适体、信使RNA(mRNA)、剪接转换寡核苷酸、缺损干扰颗粒和反义寡核苷酸)细胞内靶向递送至特定组织的递送平台对于利用基于核酸的技术在翻译医学中所具有的治疗潜力至关重要。本发明提供了如以下公开中提出的这种递送平台。
发明内容
跨界NA递送运载体通过采用本文教导的几个独特特征而大大进步。本发明提供了一种改进的跨界递送系统，其具有许多显著和实质的特征和/或对比现有递送平台的进步。第一个进步是表达双链RNA结合蛋白(dsRBP)(例如反式激活应答(transactive response)(TAR)RBP(TRBP))的双链RNA结合结构域(dsRBD)，用于同时包装在跨界递送运载体内。这项创新背后的理由是，诸如TRBP的dsRBP以高亲和力结合dsRNA，并提供针对RNA降解的保护，提供miRNA前体的稳定作用，并用作siRNA和miRNA介导的基因沉默的重要组成部分。第二个进步是在细菌递送运载体中敲除RNase R活性。这种修饰背后的理由是，在细菌细胞指数生长后，当shRNA的产生最大化时，停止细菌生长并将培养物在37℃以下孵育将会抑制双链(ds)RNA衰变，从而增强编码的治疗性shRNA的稳定性。第三个进步是表达甲基转移酶基因，例如HEN1，用于同时包装在递送运载体内。这种修饰背后的理由是，甲基转移酶(例如HEN1)提供的3'末端核苷酸的甲基化可防止siRNA的3'-5'降解和3'尿苷化，从而最终提高了增强RNAi的siRNA的稳定性。其他改善和进步描述如下。这些提出的改善各自代表了一种增强shRNA稳定性和siRNA治疗寿命的独特方法。
与当前最先进的平台和其他基于NA的递送应用相比，本文所教导的技术具有许多优势，包括：(1)靶向递送至粘膜上皮组织，具有有效的细胞内递送和内体逃逸；(2)稳定递送用于催化和持久性RNAi沉默的shRNA有效载荷；(3)消除了昂贵的合成siRNA制造；(4)针对口服、鼻内、眼、阴道、直肠和呼吸道给药的适应性临床施用；(5)将具有确定安全记录的天然产生的运载体用于临床目的(对脆弱的粘膜组织无刺激性)；(6)在紧急暴发(即大流行性流感)期间迅速扩大疾病准备水平；(7)对传染性、免疫性和过敏性疾病的可行治疗应用；(8)可与现有的疫苗接种、抗生素、抗病毒等方案联合使用；(9)消除了对穿透增强剂的需求，所述穿透增强剂会增加毒素和病原体侵袭的风险；(10)NA是由原核RNA聚合酶产生的，并以不依赖序列的方式递送，这使其成为通用的平台，可单独或组合递送任何基于NA的治疗剂(即siRNA/shRNA、miRNA、miRNA拮抗剂、适体、mRNA、剪接-转换寡核苷酸、缺损干扰颗粒、反义寡核苷酸)。
这种新颖的方法为NA递送提供了新的视角，并解决了与当前NA递送方法相关的许多缺点。一般而言，本文所教导的改善通过以下方面增强了跨界递送运载体在多种用途(包括治疗应用)中的功能：(a)例如通过表达HEN1和TRBP并提供RNase R基因敲除来提高产生和递送的NA的稳定性，(b)例如通过在染色体而不是质粒上实现某些基因(例如inv、hlyA、HEN1、TRBP和/或HA-1基因)的基因表达来提高跨界递送运载体的稳定性，从而提高了递送运载体的稳定性并使制造更简单，(c)改善了递送运载体的侵袭特性(例如通过包括HA-1并且通过从染色体而不是从质粒表达HA-1和inv两者，尽管本文也考虑从质粒表达这些基因)，(d)消除了对抗生素选择的需要，抗生素选择对于制造/调节或治疗应用而言不是理想的。所有这些修饰协同作用以改善用于治疗应用的跨界NA递送系统的功能。
在第一方面，本发明提供了一种在适当时包含原核或真核载体的非致病性细菌或酵母。载体包括编码一个或多个治疗性核酸(例如短双链RNA)的DNA分子和控制短双链RNA的转录的启动子，其中短双链RNA干扰一个或多个靶RNA分子，并且其中细菌被工程化以表达一个或多个dsRNA结合蛋白(dsRBP)。已知许多dsRBP以高亲和力结合dsRNA，以防止降解，结合和稳定miRNA前体，并在siRNA和miRNA指导的基因沉默中起重要作用。提出了dsRBP的表达将通过限制可用治疗性核酸的降解，增加miRNA前体的浓度并因此增加其成熟产物的浓度，并提供参与靶向基因沉默的必要成分，来增强可用治疗性核酸的稳定性并增加其浓度。在一个有利的实施方案中，dsRBP是TAR RNA结合蛋白(TRBP)。此外，该平台还具有编码/递送包括siRNA/shRNA、miRNA模拟物和抑制剂的多种其他NA分子的能力。其他可能的dsRNA结合蛋白包括核因子90(NF90)、ZNF346、SID-1和Ku70(及其组合)。
在第二方面，本发明提供了一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或酵母，其中所述载体包括编码一个或多个NA分子(包括例如短双链RNA(例如siRNA/shRNA))的DNA分子和控制短双链RNA的转录的启动子，其中短双链RNA干扰一个或多个靶RNA分子，并且其中细菌被工程化成缺乏RNase活性。在一个有利的实施方案中，细菌缺乏功能性rnr基因。除RNase R敲除外，其他可靶向敲除的RNase蛋白包括RNase E、RNase I、RNase H、RNase J及其组合。
在第三方面，本发明提供了一种包含原核载体的非致病性细菌，其中所述载体包括编码一个或多个NA分子(包括例如短双链RNA(例如siRNA/shRNA))的DNA分子和控制短双链RNA的转录的启动子，其中短双链RNA干扰一个或多个靶RNA分子，并且其中细菌被工程化以将siRNA的3’末端核苷酸甲基化。更具体地说，细菌系统表达甲基转移酶基因，其包括HEN1或另一种具有2'-O-甲基转移酶活性的甲基转移酶基因，从而甲基转移酶促进siRNA的3'末端核苷酸的甲基化。3'末端核苷酸的甲基化可防止RNA降解的主要来源，包括3'-5'降解和3'尿苷化，最终有助于增强稳定性和/或增加可用于参与RNAi途径的治疗性NA的浓度。
在第四方面，本发明提供了一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或酵母，其中所述载体包括编码一个或多个NA分子(包括例如短双链RNA(例如siRNA/shRNA))的DNA分子和控制短双链RNA的转录的启动子，其中短双链RNA干扰一个或多个靶NA分子，并且其中细菌被工程化以表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)和HEN1基因。在一个有利的实施例中，第四方面的大肠杆菌细菌被工程化成缺乏RNase活性。在一个尤其有利的实施方案中，细菌缺乏功能性rnr基因。
在第五方面，本发明提供了一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或非致病性酵母，所述载体包含编码一个或多个核酸的DNA分子和控制治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述非致病性细菌或酵母被工程化以展现减少的核酸降解表型。
在广义上，所述一个或多个核酸与一个或多个分子或化合物相互作用。这可能是为了上调或下调靶细胞或生物体中的作用，例如治疗生物体的疾病状况或研究生物体中基因或基因产物的作用。在一个有利的实施方案中，所述一个或多个核酸是治疗性核酸。治疗性核酸可干扰一个或多个靶标，例如病原体核酸序列。取决于治疗性核酸的性质和特性，治疗性NA(TNA)可能会干扰多种类型的靶分子(RNA、DNA、其他寡核苷酸等)。TNA可以与一个或多个宿主因子或病原体因子相互作用(例如干扰、靶向、修饰、改变)，其中宿主因子可以是寡核苷酸、蛋白质、基因等。举例来说，TNA可以与癌症基因或癌症基因的产物相互作用，以调节癌症或研究癌症或癌症疗法。在另一个有利的实施方案中，减少的核酸降解表型增加了预期治疗效果或活性的稳定性、幅度和/或持续时间。预期非致病性酵母将采用适当的真核质粒/附加体和启动子序列。
在第六方面，本发明提供了一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或非致病性酵母，所述载体包含编码一个或多个核酸的DNA分子和控制治疗性核酸的转录的原核或真核启动子，其中所述非致病性细菌或酵母被工程化成具有inv、hlyA、HEN1、TRBP和/或HA-1基因的染色体整合。inv、hlyA、HEN1、TRBP和/或HA-1基因的染色体整合为增强这些基因的表达提供了一种途径(与从质粒表达相比，如果从细菌的基因组表达，则表达更加稳定并且更高)，并提高了递送系统的稳定性。相对于细菌必须维持质粒并从质粒表达基因的系统，这种途径提供使细菌更易于从基因组表达的系统。换句话说，如果它是从细菌的基因组而不是质粒中表达的话，它会更稳定并且表达更多。预期非致病性酵母将采用适当的真核质粒/附加体和启动子序列。
附图说明
为了更全面地理解本发明，应参考以下结合附图进行的详细描述，其中：
图1是治疗性NA产生质粒的两种版本的图示。(A)质粒版本A除含有治疗性NA稳定性增强剂外，还含有靶向和递送所需的所有基因，并且非常大且不稳定，超过12,100bp。(B)质粒版本B仅含有治疗性NA序列和无HisD抗生素的选择标记，因为所有其他必需基因已转移至递送运载体染色体上，以提高效率和稳定性，并保留约4,700bp的小质粒大小。
图2是描绘RNase R活性消除的图。消除递送运载体中的RNase R功能意味着在低孵育温下不会诱导这种热休克蛋白。由于NA在较低的温度下具有更大的稳定性，因此例如在不存在RNase R的情况下在17℃下孵育会产生更高浓度的治疗性NA以用于递送至疾病部位。
图3是在呼吸道上皮细胞中的跨界核酸递送运载体的作用机理的图示，其中具有本文所教导的增强。
图4是描绘增强型递送运载体(如左图所示)的图，所述增强型递送运载体表达分别结合β1整合素和唾液酸受体的细胞表面蛋白侵袭素和HA-1，以特异性递送至与疾病相关的部位。与仅表达侵袭素蛋白的当前技术水平(如右图所示)相比，这提供了更大的侵袭特性。增强型递送运载体还能够与结合相同宿主细胞表面受体的病原体竞争，从而减少病原体摄取。
图5是描绘了例如TRBP的dsRBP的递送运载体表达的图，TRBP结合dsRNA并通过切酶(Dicer)的加工使dsRNA稳定以产生siRNA，随后将siRNA加载到RISC复合物中以用于引导链识别和与靶序列的相互作用。TRBP未结合的shRNA(和其他dsRNA核酸)易受RNase降解。TRBP的更高可用性和丰度与更高的shRNA稳定性和更高浓度的引导链siRNA序列相关。
图6是图和相关的直方图。(上图)增强型递送运载体表达3'甲基转移酶(例如HEN1)，其使siRNA的正向链和反向链的3'末端核苷酸甲基化，从而提供针对RNase的保护，而RNase通常会从3'末端核苷酸开始引起降解。3'甲基还可以防止尿苷化，已知尿苷化会导致RNA降解。(下图)通过表达HEN1的增强型递送运载体产生和递送后，该图显示了与未甲基化siRNA(siRNA)相比，随着时间流逝，每ng cDNA预期的甲基化siRNA(me-siRNA)的拷贝。
具体实施方式
本发明通过提供通用的递送平台来推进治疗性核酸的递送，所述通用的递送平台可以被定制为靶向特定组织，以用于多种不同的真核生物中的广泛治疗应用。治疗性核酸最初显示出用于治疗疾病的巨大潜力，但是由于这些核酸向靶组织和细胞的递送中的缺点，这种潜力尚未完全实现。可以对沉默效应的幅度和持续时间以及对使用递送平台靶向多种相关组织进行重大改进，以用于广泛临床应用的未来发展。在更集中的意义上，可以进行改进以增强递送运载体和由递送运载体产生的核酸的稳定性，提高运载体的侵袭性，提高安全性以及改进在制造工艺和监管考虑方面的性质。
外来体、脂质体和其他脂质囊泡已被用作NA递送平台，以携带RNA有效载荷以递送至远处组织。诸如脂质体的递送运载体具有包括囊泡内容物泄漏、批次间差异、生产成本高以及靶向能力受限的缺点。这种跨界递送系统是基于使用非致病性细菌介导的RNAi递送运载体，所述RNAi递送运载体使用天然受体介导的内吞作用在作用组织部位进行特异性细胞内递送，从而导致shRNA在内体中积累和将shRNA有效载荷有效释放入靶细胞的细胞质中以进行RNAi沉默。这些跨界运载体是大肠杆菌细胞，其已被工程化以可特异性靶向粘膜上皮组织，并以序列独立的方式递送以组成型方式产生的shRNA的有效载荷。
使用工程化的RNAi递送平台进行的跨界RNA干扰已被用于显著降低AIV感染的严重程度并抑制禽上皮细胞中AIV的脱落，所述工程化的RNAi递送平台采用含有shRNA表达质粒的非致病性细菌。(Linke,Lyndsey M.等人“使用新颖的RNAi抗病毒载体技术抑制禽流感病毒脱落：禽细胞模型中的概念论证(Inhibiting Avian Influenza Virus SheddingUsing a Novel RNAi Antiviral Vector Technology:Proof of Concept in an AvianCell Model.)”AMB Express 6(2016):16.PMC.Web.2018年3月27日)在Linke等人的US2016/0177296A1中教导了用于递送shRNA的跨界RNA系统，该专利的内容通过引用整体并入本文。跨界核酸递送系统使用被工程化以从质粒转录shRNA的非致病性细菌，例如大肠杆菌。通过在shRNA表达质粒上包含其他基因，从而使细菌进入靶细胞以及在其进入靶细胞后随后释放非致病性细菌的内含物，使得跨界核酸干扰与临床应用相关。具体而言，已开发出编码以下两种因子或基因的系统，从而允许将shRNA递送至粘膜上皮细胞：侵袭素基因(Inv)和李斯特菌溶血素O基因(hylA)。Inv基因对于在大肠杆菌表面上表达侵袭素蛋白是必需的(Xiang等人2006)，该侵袭素蛋白与存在于粘膜上皮细胞上的β(1)整合素受体相互作用，从而导致受体介导的内吞作用(Conte等人1994；Isberg和Barnes 2001；Isberg和Leong 1990)。hlyA基因编码一种成孔毒素，即李斯特菌溶血素O(LLO)，其促进内体膜的破裂以及shRNA随后释放到细胞质中(Grillot-Courvalin等人1998；Mathew等人2003；Nguyen和Fruehauf 2009；Radford等人2002；Xiang等人2006)。在以上研究中使用的跨界核酸递送运载体是二氨基庚二酸(Dap)营养缺陷型突变体，并且对卡那霉素具有抗性。
这些运载体表达李斯特菌溶血素O(LLO)，这是一种成孔毒素，可使大肠杆菌逃逸宿主内体，从而释放到细胞质中。内体中营养物质的缺乏促进了细菌的裂解和LLO毒素的释放，这破坏了内体膜。释放的shRNA然后被加工成siRNA，并掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。
这些细菌可以调节shRNA的递送。一旦进入宿主内体，它们将不再存活并且不再产生shRNA，从而消除了使RISC机制超载并给宿主带来不良副作用的可能性。
可以在原核RNA聚合酶(例如T7聚合酶)的控制下用shRNA(或其他治疗性核酸)表达盒转化跨界递送运载体，这可以在针对关注的任何临床目标基因的原核RNA聚合酶的控制下组成性地产生shRNA(或其他治疗性核酸)。包含原核RNA聚合酶意味着该细菌是期望产物(例如治疗性核酸)而不是靶细胞的表达源。在病毒靶向的情况下，该平台技术可以编码若干shRNA以靶向多个病毒RNA靶标。另外，代替表达盒中产生shRNA的序列或除了表达盒中产生shRNA的序列之外，可以包含其他治疗性核酸，并且该系统可以靶向其他病原体或疾病相关分子。这种混合方法将限制通过突变的病毒逃逸的风险。此外，该平台还具有编码包括miRNA模拟物和抑制剂的多种其他NA分子的能力。换句话说，除了siRNA/shRNA之外，提议的系统还具有递送其他核酸的能力，并且是对当前技术水平的重大改进，当前技术水平不适用于递送分子，诸如微小RNA模拟物或微小RNA抑制剂的编码和递送。
跨界递送平台使用二氨基庚二酸(Dap)营养缺陷型的非致病性细菌。包括大肠杆菌的某些细菌需要Dap作为其细胞壁的组成部分，并且营养缺陷体不能在补充Dap的培养基外部增殖或存活。作为非致病性和非定殖性细菌，这些运载体不会对宿主造成任何已知风险，并具有确定的安全记录。此外，作为非结合载体，不存在整合入宿主基因组和肿瘤发生的风险。在以前的工作(数据未发表)中，我们证明了这些细菌运载体与测试物种(即鸡)中任何观察到的临床疾病、毒性或组织发病机制不相关。因此，细菌对宿主细胞或目标物种是“非致病性的”，并且不会引起疾病。
我们提议以独特的修饰来改进当前的跨界递送运载体，其重点是提高所递送的核酸(NA)的稳定性，提高双链干扰RNA对细胞分解机制的抵抗力，改善侵袭性和/或改善与递送系统相关的制造工艺、安全性和法规问题。增加dsRNA稳定性的理由是，稳定shRNA(以及可以使用此递送平台产生和递送的其他NA分子)的有效载荷将增加shRNA的可用性并加工更多的siRNA。改善侵袭特性的理由是，跨界递送运载体将有更大的机会附着在更广泛的宿主细胞上，从而增加了被摄取和细胞内转运的跨界递送运载体的数量。这些改进将为最佳治疗应用提供更强大和更持久的RNAi效应。单独采用或以任何组合采用的这些改进促进该技术在治疗和临床应用中的翻译潜力。
可以通过本文教导的多种方法来改善所递送的NA的侵袭性和稳定性。改善递送运载体的第一种方法是包含将增加dsRNA的稳定性的dsRNA结合蛋白(dsRBP)。改善递送运载体的第二种方法是消除参与RNA降解的关键细菌酶的活性。改善递送运载体的第三种方法是包含将引起dsRNA稳定甲基化的基因/蛋白质。在一个实施方案中，将编码HEN1基因的TARRNA结合蛋白(TRBP)和C末端甲基化酶结构域，并且在大肠杆菌细菌递送载体中的RNase R活性将被敲除。这些制剂改进将用于将核酸(包括shRNA)递送到多种粘膜上皮组织，包括上/下呼吸道、口腔、胃肠道(GI)、阴道、直肠和眼上皮。施用这些改进的跨界NA递送运载体的方法包括鼻腔内给药至鼻腔以进行局部作用，气雾化以实现上下呼吸道靶向，口腔吸收以经颊递送，咽下以实现GI吸收，施加于脆弱的生殖器粘膜上皮，和表面施用以用于眼部递送。这些改进的递送运载体可用于预防和/或治疗多种物种(人、禽、猪、牛、犬、马、猫)的多种疾病(传染性、过敏性、癌性和免疫性)。
我们提议通过工程化表达流感病毒血凝素(HA-1)蛋白的递送运载体来增强递送运载体对表达唾液酸受体的上皮细胞的靶向。预期HA-1可以在递送运载体中单独表达或与侵袭素蛋白结合表达。HA-1在递送运载体中的表达因而不仅将为细菌细胞摄取和细胞内进入宿主细胞提供适当的手段，而且将通过阻止接近靶细胞上的受体位点而机械地防止竞争性病原体(例如使用唾液酸受体进行附着/进入的流感病毒和其他病原体)的摄取和感染。在靶向肠道、眼和呼吸道黏膜上皮细胞的病毒和细菌感染的情况下，包含HA-1蛋白以用于运载体递送将为靶向这些组织以实现局部递送提供更大的亲和力，并在治疗和预防上最大程度地抵御入侵的病原体。
实施例1-工程化大肠杆菌以表达dsRBP
在第一方面，可以如下改善递送运载体：将dsRNA结合蛋白结构域克隆到治疗性核酸产生质粒中以在原核RNA聚合酶的控制下表达，或者在大肠杆菌上通过染色体表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)，因此包含dsRBP将增加非致病性细菌所产生的dsRNA的稳定性。
dsRBP家族包含一个或多个在真核生物、原核生物和病毒编码产物中发现的65-68个氨基酸的进化保守dsRNA结合结构域(dsRBD)(Ryter等人1998)。这些dsRBD在1992年首次被认为是引起蛋白质与RNA双链体之间许多相互作用的原因(Johnston等人1992；McCormack等人1992)。dsRBP家族包括TAR RNA结合蛋白(TRBP)，它以非序列特异性方式与dsRNA排他性地相互作用(Ryter等人；Manche等人)。TRBP含有三个高度保守的dsRBD，但是第一个和第二个具有结合和防止dsRNA降解的高亲和力(Yamishita等人；Daviet等人；Tian等人)。TRBP可以参与RNAi(Gatignol等人，Gredell等人，Lee和Ambros,Tian等人；Daniels等人；Parker等人)。这两个TRBP结合结构域可用于体外和体内结合并防止shRNA/siRNA降解，在siRNA和microRNA(miRNA)所诱导的基因沉默中发挥作用，并且通过结合miRNA发夹前体并稳定其成熟途径而在细胞中发挥生理作用(Chendrimada等人；Koh等人；Gregory等人；Dar等人；Yamashita等人；Koh等人)。因此，可以优先使用仅两个结构域，或者可以将所有三个结构域都包含在跨界载体中。总之，TRBP的功能类似于dsRNA门控因子(gatekeeper)。在跨界载体中同时编码该dsRNA结合蛋白代表了一种用于改善跨界NA递送运载体的强大方法。可被考虑代替TRBP或除TRBP之外用于表达的其他dsRBP包括核因子90(NF90)、ZNF346、SiD-1和Ku70(及其组合)。
实施例2-RNase R敲除
在第二方面，可以通过消除或减少负责RNA降解的酶的活性来改善递送运载体的性质。在诸如大肠杆菌的细菌中，结构化的RNA双链体降解仅由RNase R进行，RNase R是一种水解性3'至5'外切核糖核酸酶(Matos 2009；Khemici和Carpousis；Cheng和Deutscher2005；Vincent和Deutscher 2009；Awano等人2007,Awano 2010；Chen等人1998；Hossain2015；Hossain 2016)。与shRNA/siRNA分子的情况一样，RNase R能够通过特异性结合3'单链突出端来降解这些dsRNA(Cheng和Deutscher,Vincent和Deutscher 2006)。实际上，RNase R是唯一能够通过广泛的二级RNA结构进行咀嚼的3'至5'外切核糖核酸酶(Vincent和Deutscher 2009)。RNase R是由rnr基因编码的一种冷休克蛋白，其活性可以通过改变细菌细胞的生长条件来调节(Chen等人1998；Cheng和Deutscher；Cairrao和Arraiano 2006；Cairrao等人2003)。当大肠杆菌的指数生长温度从37℃转变为15℃时，RNase R的冷休克反应受到刺激(Awano等人2007)。这意味着，RNase R活性增加，导致更大的dsRNA降解。研究表明，RNase R解旋酶活性对于有效的针对dsRNA的核酸酶活性起着必要的催化作用，尤其是在更低的孵育温度下，当同时存在更高浓度的更稳定的dsRNA底物时(Hossain等人2015，Hossain等人2016，Awano等人2007；Awano等人2010)。缺乏rnr基因的大肠杆菌突变体能够在标准的37℃生长温度下有效复制，但无法消化dsRNA(Chen等人1998；Khemici和Carpousis；Cheng和Deutscher；Vincent和Deutscher 2009；Vincent和Deutscher 2006；Awano等人2007；Hossain等人2015；Hossain等人2016(两者)；Awano等人2010)。shRNA和siRNA分子的稳定性在较低的温度下得到了提高，因此降低培养温度有利于维持高的NA浓度，但前提是可以避免RNase R活性的冷休克诱导。因此，在大肠杆菌细菌递送运载体中敲除RNase R活性可以导致NA的递送增强。在具有RNase R敲除的改进型大肠杆菌细菌递送运载体中，在细菌细胞指数生长后，当shRNA的产生最大化时，停止细菌生长并将培养物在37℃以下孵育将会抑制dsRNA降解，从而增强编码的治疗性shRNA的稳定性。因此，预期跨界系统可以包含缺乏rnr基因的非致病性细菌(例如大肠杆菌)，其已被特殊的shRNA(或其他治疗性核酸)产生质粒转化。进一步预期这些rnr缺陷型大肠杆菌可以在降低的温度(即低于37℃)下繁殖，例如33℃或更低、30℃或更低、27℃或更低、25℃或更低、22℃或更低、20℃或更低、17℃或更低，优选25℃或更低，最优选17℃或更低。在此类降低的温度下繁殖将允许产生期望的shRNA，同时限制其降解。进一步预期，在rnr缺陷型跨界核酸递送系统中使用的shRNA产生质粒可以包括编码dsRBD的基因，例如TRBP。通过重新组合缺失，可以实现一种敲除方法，因此大肠杆菌不再产生RNase R蛋白，本质上产生了大肠杆菌突变。消除rnr基因功能的其他方法包括Cre-lox、FLP-FRT、选择反选择和CRISPR/Cas介导的基因编辑。预期敲除不仅仅针对rnr基因，因为也可以敲除其他基因以消除大肠杆菌中的RNase活性。通常，消除大肠杆菌中的RNase催化活性(包括消除RNase R)可以增强功效。敲除的其他靶标可包括但不限于RNase E、RNase I、RNase H、RNase J及其组合。
实施例3-siRNA的3'末端核苷酸的甲基化
在第三方面，可通过例如在治疗性NA产生质粒上包含将引起shRNA的稳定甲基化的基因来改进递送运载体的性质。如上所述，dsRNA的降解主要是由核酸外切酶引起的(Czauderna等人2003)。siRNA的3'末端核苷酸的甲基化可提供针对核酸外切酶的稳定作用，因为它可防止siRNA的3'-5'降解和3'尿苷化(Ji和Chen 2012；Lifang等人2010；Kurth和Mochizuki 2009；Chan等人2009)。当仅在有义链的末端或在siRNA发夹的情况下在3'末端修饰siRNA分子时，RNAi活性得到保持(Czauderna等人2003)。所有植物siRNA的功能都需要3’末端甲基化，并且在某些哺乳动物和细菌siRNA中也可以观察到。HEN1基因编码甲基转移酶Hen1，这是一种催化甲基依赖于S-腺苷甲硫氨酸转移至3'-末端核苷酸的2'-羟基的甲基化酶(Jain和Shuman 2010；Baranauske等人2015)。几种细菌物种的Hen1结构域已被证明在功能上等同于它们的真核同源物(Chan等人2009)。使用甲基化分析，Chan等人(2009年)表明，人类和细菌(热纤梭菌(Clostridium thermocellum))重组Hen1蛋白在小的单链RNA(21-30nt)上表现出酶促等效的甲基化活性。但是，热纤梭菌Hen1的C末端甲基化酶结构域显示出相比其全长对应物和人类Hen1提高的酶活性，表明该结构域能够独立发挥功能。因此，在跨界递送运载体中包装HEN1基因(或在一个有利的实施方案中包装HEN1基因的C末端甲基化酶结构域)将为siRNA提供针对核酸外切酶的稳定作用。换句话说，HEN1将主动甲基化并增强编码的shRNA的稳定性，从而提供最适合体内治疗应用的shRNA。
实施例4-被工程化以表达流感血凝素-1(HA-1)蛋白的非致病性细菌
在第四方面，可以通过工程化细菌以通过基因组(染色体)或质粒表达而表达流感血凝素-1(HA-1)蛋白来改善递送运载体向粘膜组织，特别是向呼吸道粘膜组织的局部和靶向递送。HA-1是一种在流感病毒表面上发现的糖蛋白，并且通过受体介导的内吞作用促进病毒附着和进入靶细胞(White等人1997)。HA-1代表球状头部，其含有对唾液酸具有高亲和力的受体位点，所述受体位点存在于靶细胞(包括呼吸道粘膜上皮细胞)的表面上(Russell等人2008)。在一个优选的实施方案中，HA-1在大肠杆菌表面上表达，并与粘膜上皮细胞上的唾液酸表面受体相互作用以用于细菌摄取。HA-1蛋白可以衍生自任何A型或B型流感病毒亚型。全长HA-1基因使用标准克隆方法被克隆到shRNA生成质粒(或被构建用于生成治疗性核酸的其他质粒)中，或使用例如Gibson组装法和市售Gibson Assembly Cloning试剂盒、翻转酶/翻转酶识别靶标(FLP/FRT)定点重组技术(Pósfai等人1994,Bertram等人2009)、选择-反选择策略或CRISPR/Cas操纵(Jiang等人2013,Jiang等人2015,Pyne等人2015,Reisch等人2015,Zhao等人2016)被整合到大肠杆菌染色体中。
在大肠杆菌细胞表面上添加HA-1蛋白是相比仅Inv的单独表达的一种改进。在一个实施方案中，HA-1将被独立表达，或在单独的实施方案中与Inv组合表达，以提供单独的Inv则不能提供的独特的方面。如果病毒和细菌病原体利用唾液酸受体在细胞内进入靶细胞，例如感染呼吸道组织的流感病毒，则大肠杆菌细胞通过HA-1蛋白的结合将物理阻断感染病原体(即流感病毒)与靶细胞上唾液酸受体之间的必需结合相互作用。因此，这不仅将为细菌细胞摄取和细胞内进入宿主细胞提供适当的手段，而且将机械地防止竞争性病原体(即流感病毒)的摄取和感染。在靶向呼吸道黏膜上皮细胞的病毒和细菌感染的情况下，包含HA-1蛋白以用于运载体递送将为靶向这些组织以实现局部递送提供更大的亲和力，并在治疗和预防上最大程度地抵御入侵的病原体。已知包括冠状病毒、诺如病毒、轮状病毒、腮腺炎病毒、副流感、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的其他病原体(Mastrovich等人2013年；Varki 2008年)会产生与宿主细胞上的唾液酸结合的蛋白质，以促进进入或感染。还预期那些蛋白质或来自那些病原体蛋白质的结合蛋白质结构域可以用作流感HA-1蛋白(或来自HA-1的唾液酸残基结合结构域)的替代物。
实施例5-从非致病性细菌中去除抗生素抗性基因
在第五方面，通过去除抗生素抗性基因(包括但不限于卡那霉素抗性(潜在地包括在质粒上作为选择标记))改善了递送系统的制造工艺、安全性和监管考虑。抗生素抗性基因是作为大多数细菌表达载体上的选择标记而被包括(Peubez等人2010)。抗生素抗性是人类和动物健康的主要问题，并且对生物制剂的监管要求也变得越来越严格，以反映这一点(Mignon 2015)。消除在制造工艺中包括抗生素的需要可以降低成本，并消除细菌递送系统可能在意料之外的宿主中产生抗生素抗性的担忧。在一个有利的实施方案中，该递送运载体使用无抗生素系统，例如以下实施例6中描述的氨基酸营养缺陷和互补系统，以特异性地选择含期望质粒的细菌。
实施例6-非致病性营养缺陷型突变体的产生
通过包含代谢或营养选择标记(包括但不限于氨基酸营养缺陷和互补)改善了递送系统的功能性和稳定性，从而改善了递送系统的制造工艺、安全性和监管考虑。
在第六方面，通过包含代谢或营养选择标记来改善递送系统的功能性和稳定性，所述代谢或营养选择标记包括但不限于氨基酸营养缺陷和互补(例如靶向必需氨基酸，包括但不限于组氨酸)。氨基酸合成途径中的一个或多个关键基因可以靶向在大肠杆菌染色体上，以产生无法产生所需的氨基酸的营养缺陷型突变体。补充质粒上敲除的一个或多个基因将仅允许含有该质粒的大肠杆菌的存活，从而允许在缺乏氨基酸的培养基中进行有效且可靠的选择(Peubez等人2010；Mignon等人2105；Fiedler等人2017)。类似的原理适用于对细菌存活至关重要的其他营养物或营养加工途径。该方法促进了无抗生素的制造，这进一步支持了以上实施例5中所述的改进。例如，在大肠杆菌中，组氨酸是通过十步途径合成的，其中hisD基因产物双功能酶组蛋白醇脱氢酶催化最后的两个氧化步骤(Ramage等人2012；Matte等人2003)，并且hisB产物双功能酶组蛋白醇磷酸酶催化第七个和第九个步骤(Winkler&Ramos-Montanez 2009；Chiariotti等人1986)。组氨酸合成和因此基本培养基上的大肠杆菌生长需要hisA、hisB、hisC、hisD、hisE、hisG、hisH和hisI基因产物(Joyce等人2006)，但是，计算模型和已发表的实验表明，HisD或hisB基因敲除产生的菌株的生长完全取决于组氨酸的存在与否，并且与培养基中存在的其他氨基酸或代谢产物无关(Bertels等人2012；Tepper&Shlomi 2011)。
在一个有利的实施方案中，大肠杆菌被工程化成组氨酸营养缺陷型，其中细菌缺乏功能性HisD基因(产物：组蛋白醇脱氢酶)，并且shRNA产生质粒(或其他经构建以产生治疗性NA的质粒)被工程化以表达hisD基因，从而补充了组氨酸生物合成途径并允许细菌在缺乏组氨酸的培养基中复制。在另一个实施方案中，大肠杆菌被工程化为缺乏功能性hisA、hisB、hisC、hisE、hisG或hisH基因，而原核载体被工程化为表达缺失的his基因。在参与组氨酸合成的基因的情况下，该基因可以在细菌hisp1启动子或另一原核启动子的控制下在质粒上表达(Alifano等人1996)。
实施例7-通过跨界递送运载体表达多种治疗性核酸
在第七方面，通过使单个或多个治疗性NA在单个质粒上表达而提高了递送系统的功能性和稳定性。可能有许多不同的配置，包括1)在单个表达盒中在单个启动子的控制下串联表达的NA，2)在独立表达盒中的NA，其各自处在其自身的启动子和终止子的控制下，但由于使用相同的启动子序列，存在竞争性表达，以及3)独立表达盒中的NA，其各自处在不同启动子的控制下进行差异表达。正如许多已发表的研究所证明的，质粒构型的具体细节(包括间隔区的长度和序列、启动子序列和强度、治疗性NA类型(例如shRNA)和大小，以及所表达的治疗性NA的数量)均会影响NA表达水平、siRNA折叠/加工、沉默特异性和RNAi活性。尽管已经针对HIV模型完成了许多工作，但是可以使用良好的方法来指导质粒设计和用每种方法适当地进行优化(Liu等人2007；Mcintyre等人2011；Spanavello等人2016；Choi等人2015；Wang等人2013)。多个NA在单个质粒上的表达实现了几个重要的改进：分类为某些调节机构的单一‘活性’成分，而不是大肠杆菌细菌内的每个NA表达质粒被认为是分开的；简化制造方法，只需培养含有所有相关的NA靶标的大肠杆菌的单个储备液；并扩大了靶向能力，以降低病原体突变的风险，并允许通过单一疗法治疗多种疾病。
质粒上多个特异性核酸序列的串联表达提供了一种系统，即使表达具有不同靶标的多个核酸，该系统也易于制造且制造成本较低(例如，可以作为单一培养物来制造)。通过减少可变性并使制造过程更可预测，从而提高了系统的稳定性。这也促进了简化的监管途径(美国和国际)，因为它是单一的活性药物/治疗药物，而不是多种药物，从而降低了成本和资源需求。
实施例8-Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP的染色体表达
在第八方面，Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP表达的稳定性、Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP的表达(总体丰度)以及递送运载体的制造工艺通过将这些基因各自的表达整合到大肠杆菌染色体(或其他非致病性细菌或酵母)上来改进。这产生了稳定表达Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP基因的细菌菌株。在构建菌株时，可以定位沿着细菌染色体的区域，其中表达盒将整合到工程化细菌中。这些基因(Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP)的任何组合的全长序列或其缩短部分可使用例如Gibson组装法和市售Gibson Assembly Cloning试剂盒、翻转酶/翻转酶识别靶标(FLP/FRT)定点重组技术(Pósfai等人1994,Bertram等人2009)、选择-反选择策略或CRISPR/Cas操纵(Jiang AEM,Jiang NBT 2013,Pyne AEM,Reisch等人2015,Zhao等人2016)被整合到大肠杆菌染色体中。由于多种原因，基因组表达是相对于质粒表达的一种改进方法。质粒运输和维持使大肠杆菌细胞处于选择性劣势。依赖质粒表达需要大肠杆菌细胞可以在特定的环境条件下生长，以保持质粒在细菌内部的存在。这使制造变得复杂，并可能导致更大的细菌压力。在制造过程中，大规模发酵中的可变条件会影响大肠杆菌细胞中质粒DNA的复制，从而显著影响基因表达的效率(稳定性和丰度)。在这个实施方案中，这些功能基因的基因组整合消除了细菌维持质粒复制的需要，尤其是在生长条件可变的情况下。此外，如果将这些基因从质粒中消除并整合到大肠杆菌染色体中以进行表达，则大肠杆菌细胞将更快地生长(G Wegrzyn和A Wegrzyn 2002)。在该实施方案中，与质粒表达相比，来自大肠杆菌染色体的Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP的基因组表达也将导致这些基因的丰度更高。依赖质粒表达意味着质粒必须经常复制以产生足够数量的拷贝，以便在母细胞分裂后分配给两个子细胞。与稳定和一致的基因组衍生表达相比，这导致了子代细胞中质粒衍生基因的较低表达(较低丰度)。总体而言，将Inv、LLO、HA-1、HEN1和/或TRBP整合到大肠杆菌染色体中提高了这些基因的稳定性并增加了这些基因的表达，特别是对于大规模制造工艺而言。
在本发明的上述方法的一个实施方案中，细菌是非致病性或非毒性的。在该实施方案的另一方面，细菌是治疗性的。在该实施方案的另一方面，细菌是侵袭性的或已被工程化成具有侵袭性并进入宿主细胞。此类细菌的实例包括李斯特氏菌(Listeria)、耶尔森氏菌(Yersinia)、立克次氏体(Rickettsia)、志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella)、军团菌(Legionella)、衣原体(Chlamydia)、布鲁氏菌(Brucella)、奈瑟菌(Neisseria)、伯克氏菌(Burkolderia)、博德特氏菌(Bordetella)、疏螺旋体(Borrelia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、幽螺杆菌属(Helicobacter)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、弧菌(Vibrio)、密螺旋体属(Treponema)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacteriae)。在该实施方案的另一方面，递送运载体是真菌细胞，例如酵母属(Saccharomyces)和假丝酵母属(Candida)酵母。
在本发明的一个有利实施方案中，通过静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、经口、鼻内、眼内、直肠内、阴道内、骨内、口服、浸入、表面、尿道内和雾化接种途径将含有NA分子的侵袭性递送运载体引入宿主。
在一个有利的实施方案中，本发明涉及一种用于RNAi介导剂和其他核酸的靶向细胞内递送的跨界平台。此类RNAi剂和NA的实例包括但不限于脱氧核糖核酸酶(DNA)、RNA、siRNA/shRNA、miRNA、miRNA拮抗剂、适体、mRNA、剪接转换寡核苷酸、缺损干扰颗粒和反义寡核苷酸。
通过粘膜的病原体进入途径：
病原体最有可能侵袭人体的表面(包括胸膜、腹膜和皮肤)受到粘膜免疫系统的保护(Janeway等人2001)。粘膜表面是人体内部免受外部环境中的病原体和过敏原侵害的第一道防线。上皮细胞形成紧密连接，以在所有粘膜表面中形成动态层(Parham 2014；Presland&Jurevic 2002)。覆盖粘膜表面的潮湿的粘液层含有上皮细胞和白细胞所分泌的‘防御性化合物’的混合物，它们形成物理屏障，但也可能直接作用于某些微生物(Linden等人2008)。呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道和其他器官(例如眼睛)代表含有粘膜上皮表面的主要系统(Parham2014)。令人印象深刻地，仅胃肠道(GI)的表面积就超过了400平方米(Guandalini等人2008)。当病原体或过敏原成功突破粘膜防御时，通常会对身体的那个部位产生疾病反应(Janeway等人2001)。
提出的跨界NA递送系统可以靶向的示例性病毒：
许多疾病影响含有粘膜上皮的多种组织类型。1型和2型单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)在粘膜上皮细胞中复制，包括嘴、眼和生殖器的粘膜上皮细胞(Chentoufi&BenMohamed 2012；Karasneh&Shukla 2011；NIAID)。在美国，约有65％的人对HSV-1呈血清反应阳性，而全球患病率据认为要高得多，约90％的人感染了HSV-1和/或HSV-2(Wald&Corey 2007)。在发达国家，HSV-1是角膜盲和病毒性脑炎的主要原因(Chentoufi&BenMohamed 2012)。HSV-2在产道中的围产期传播约占新生儿疱疹病例的85％(Chentoufi&BenMohamed2012)。流感是一种全球重要且具有高度传染性的病毒，会感染呼吸组织，包括眼、鼻、肺和喉的粘膜。尽管可以接种疫苗，但每年仍有数百万人患季节性流感，并且新出现和大流行的病毒株仍然是一种威胁(NIAID)。人乳头瘤病毒(HPV)可以感染口腔、咽喉和上呼吸道的粘膜上皮细胞(Nguyen等人2014；Rautava&Syrjanen 2011)。HPV还会感染肛门生殖器上皮粘膜，并且是全球最常见的性传播疾病之一，仅在美国，每年估计就有1-550万新病例出现(Burd2003；NIAID)。
影响呼吸系统的粘膜上皮细胞的其他重要疾病包括麻风病、结核病和高度传染性疾病，例如百日咳、呼吸道合胞病毒、MERS和SARS。肺气肿、哮喘、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化和支气管炎是其他肺部疾病。在胃肠道粘膜中，已知例如霍乱的广泛传播的疾病每年引起300万到500万例新病例(NIAID)。例如淋病、衣原体感染(Becker 1996年)和梅毒的性传播疾病也是泌尿生殖道粘膜上皮细胞(包括阴道和直肠组织)的重大健康问题(NIAID)。预期本文所教导的跨界NA递送系统可通过递送靶向shRNA而用于治疗这些疾病。
许多不同的疾病特异性地影响不同组织类型的粘膜上皮，并且解决这些部位中的病原体复制为治疗性治疗提供了选择。该递送平台具有将治疗性NA递送至广泛的粘膜上皮组织的潜力。因此，除了改善跨界NA递送运载体的特性外，我们还证明了将这些运载体递送到易患疾病的几种临床相关粘膜上皮组织的可行性。这些组织包括上/下呼吸道、口腔、胃肠道、阴道、直肠和眼上皮。
本文教导的平台利用有效/适当的给药应用以靶向非常特定且临床相关的粘膜上皮组织来促进NA的递送，并且代表了基于NA的人类医学领域的重大进步。可以将递送运载体施用于鼻腔以进行局部作用，气雾化以用于上下呼吸道疾病，口腔吸收以用于颊递送，咽下以实现GI吸收，施加于脆弱的生殖器粘膜上皮，和经施用以用于表面眼部递送。这项技术为粘膜上皮组织提供了一种安全有效的NA递送运载体，其具有增强的稳定性、治疗功效和总体上改善的功能特性。这种跨界NA递送平台是NA治疗领域的重大进步，并且在解决影响多种临床相关组织的多种疾病的同时，具有巨大的治疗应用。
术语表
关于本发明的化合物，术语“施用”及其变体(例如，“施用”化合物)是指将所述化合物引入需要治疗的受试者的系统中。当将本发明的化合物与一种或多种其他活性剂(例如AIV疫苗等)组合提供时，“施用”及其变体各自均应理解为包括化合物和其他药剂的同时和顺序引入。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的在组织、系统、动物或人中的生物或医学反应的活性化合物或药剂的量。关于病毒感染，有效量包括足以预防感染疾病或减轻疾病严重程度的量，如临床疾病、临床症状、病毒滴度或从受试者脱落的病毒所证明的，或如预防或减少动物之间传播的能力所证明的。在一些实施方案中，有效量是足以延迟临床疾病和/或症状发作或预防疾病的量。在一些实施方案中，有效量是足以降低病毒滴度和/或减少病毒脱落的量。有效量可以一个或多个剂量施用。
如本文所用，“治疗”是指获得有益或期望的临床结果。有益或期望的临床结果包括但不限于以下任何一项或多项：减轻一种或多种症状，降低病毒感染的程度，稳定(即不加重)病毒感染状态，防止或延迟病毒感染的传播(例如脱落)，预防、延迟或减慢病毒感染的进展，和/或保持体重/体重增加。本发明的方法涵盖了这些治疗方面中的任何一个或多个。
“药学上可接受的”组分是适合与人和/或动物一起使用而没有与合理的益处/风险比相当的过度的不利副作用(例如毒性、刺激性和过敏性反应)的组分。
“安全和有效量”是指当以本发明的方式使用时，足以产生期望的治疗反应而没有与合理的益处/风险比相当的过度的不利副作用(例如毒性、刺激性或过敏性反应)的组分数量。。
如在整个申请中所使用的，术语“一(a)”和“一(an)”的含义是所引用的组分或步骤中的“至少一个”、“至少第一”、“一个或多个”或“多个”，除非上下文另有明确规定。举例来说，术语“一细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
术语“和/或”在本文中无论在何处使用都包括“和”、“或”以及“通过所述术语连接的要素的所有或任何其他组合”的含义。
如本文所使用的，术语“包括”旨在表示产品、组合物和方法包括所引用的组分或步骤，但不排除其他。当用于定义产品、组合物和方法时，“基本上由……组成”应表示排除具有任何重要意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物将不排除痕量污染物和药学上可接受的载体。“由……组成”应表示还排除其他组分或步骤的痕量元素。
如本文所用，术语“侵袭性”在涉及微生物例如细菌或细菌治疗性颗粒(BTP)时是指能够将至少一个分子例如RNA或编码RNA的DNA分子递送到靶细胞。侵袭性微生物可以是能够穿过细胞膜，从而进入所述细胞的细胞质，并且将其至少一部分内容物(例如RNA或编码RNA的DNA)递送至靶细胞中的微生物。将至少一个分子递送至靶细胞中的过程优选不显著改变侵袭装置。
如本文所用，术语“跨界”是指递送系统使用细菌(或另一种侵袭性微生物)产生核酸并在靶组织内在细胞内(即，跨界：原核到真核，或跨门：无脊椎动物到脊椎动物)递送核酸，从而无需宿主基因组整合即可进行加工。
侵袭性微生物包括天然能够将至少一个分子递送至靶细胞(例如通过穿过细胞膜(例如真核细胞膜)并进入细胞质)的微生物，以及天然不具有侵袭性并且已被修饰(例如基因修饰)成具有侵袭性的微生物。在另一个优选的实施方案中，通过将细菌或BTP与“侵袭因子”(也称为“进入因子”或“细胞质靶向因子”)连接，可以将天然不具有侵袭性的微生物修饰成具有侵袭性。如本文所用，“侵袭因子”是当由非侵袭性细菌或BTP表达时使该细菌或BTP具有侵袭性的因子，例如蛋白质或一组蛋白质。如本文所用，“侵袭因子”由“细胞质靶向基因”编码。侵袭性微生物已在本领域中进行了一般描述，例如，美国专利公开号US20100189691A1和US20100092438A1以及Xiang,S等人,Nature Biotechnology 24,697-702(2006)。出于所有目的，其中每一个均通过引用整体并入。
在一个优选的实施方案中，如本申请的实施例中所教导的，侵袭性微生物是大肠杆菌。但是，预期其他微生物可以潜在地适于充当用于递送NA的跨界递送运载体。这些非毒性和侵袭性细菌和BTP会表现出侵袭性，或者会被修饰以表现出侵袭性，并可能通过各种机制进入宿主细胞。与专业吞噬细胞对细菌或BTP的摄取(这通常会导致特殊溶酶体中细菌或BTP的破坏)相反，侵袭性细菌或BTP菌株具有侵袭非吞噬宿主细胞的能力。这种细胞内细菌的天然存在的实例是耶尔森氏菌、立克次氏体、军团菌、布鲁氏菌、分枝杆菌、幽螺杆菌属、柯克斯氏体属、衣原体、奈瑟菌、伯克氏菌、博德特氏菌、疏螺旋体、李斯特氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、卟啉单胞菌属、密螺旋体属和弧菌，但是这种特性也可以通过侵袭相关基因的转移而转移到其他细菌或BTP中，例如大肠杆菌，乳杆菌，乳球菌或双歧杆菌，包括益生菌(P.Courvalin,S.Goussard,C.Grillot-Courvalin,C.R.Acad.Sci.Paris318,1207(1995))。在评估其他细菌物种作为用作跨界NA递送运载体的候选者时要考虑或解决的因素包括候选者的致病性或缺乏致病性，候选细菌对靶细胞的嗜性，或者为了将NA递送到靶细胞内部而可以对细菌进行工程化的程度，以及候选细菌可能通过触发宿主的先天免疫力而提供的任何协同价值。
核酸定义为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或任何紧密相关的化合物。它们可以是编码的或非编码的、合成地或天然地衍生的单链或双链区段，通常由许多(2个或更多)核苷酸连接的分子组成。实例包括但不限于小干扰RNA/短发夹RNA(siRNA/shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂、RNA或DNA适体、信使RNA(mRNA)、剪接转换寡核苷酸、反义寡核苷酸、抗原寡核苷酸、脱氧核酶、RNA诱饵、核酶、肽核酸、寡聚物和缺损干扰颗粒。
治疗性核酸是用于治疗疾病、研究疾病或用于实现期望的遗传修饰或用于基因转移目的的本文所述的NA或紧密相关的化合物。它们在参与疾病的特定基因或其他分子的功能的特异性抑制或中断或改变被认为在治疗上是需要的情况下使用。
如本文所用，如果(1)药物组合物体内(通过摄入、吸入、注射等)、表面(在皮肤上以便吸收到体内)或以其他方式施用于受试者，和(2)药物组合物防止受试者染上疾病并防止受试者经历通常与该疾病相关的症状/临床病痛，则在暴露于疾病之前或之后该疾病得到预防，或者，如果受试者染上疾病并经历或未经历不同严重程度的通常与该疾病相关的症状/临床病痛中的某些或全部，则受试者从该疾病恢复到正常的健康状态。
还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。“试剂盒”意思是包含至少一种试剂(例如本发明的pH缓冲液)的任何制品(例如包装或容器)。试剂盒可以作为用于实施本发明的方法的单元被促销、分销或销售。另外，试剂盒还可以含有描述试剂盒和其使用方法的包装插页。任何或所有的试剂盒试剂都可以在将其与外部环境隔绝的容器中，例如在密封容器或小袋中提供。
在一个有利的实施方案中，试剂盒容器可进一步包括药学上可接受的载体。试剂盒可进一步包括无菌稀释剂，其优选地储存在单独的另外的容器中。在另一个实施方案中，试剂盒还包括包装插页，该包装插页包括指导将pH缓冲液和抗病原体试剂的组合治疗作为在受试者中治疗和/或预防疾病的方法使用的印刷说明书。试剂盒还可包括另外的容器，这些容器包括另外的抗病原体试剂(例如金刚烷胺、金刚乙胺和奥司他韦)、增强此类试剂的效果的试剂或改善治疗功效或耐受性的其他化合物。试剂盒还可以包括至少一种用于执行本领域技术(即核酸提取)范围内的特定常规技术的试剂。
除非另有说明，否则本发明的实施可以采用本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。此类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标记物检测杂交。合适的技术的具体说明可参考本文以上的实施例。但是，当然也可以使用其他等效的常规程序。此类常规技术和描述可见于标准实验室手册中，例如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷),Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cells:A Laboratory Manual,PCRPrimer:A Laboratory Manual,and Molecular Cloning:A Laboratory Manual(都来自Cold Spring Harbor Laboratory Press),Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman,N.Y.,Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRLPress,London,Nelson and Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.和Berg等人(2002)Biochemistry,第5版,W.H.FreemanPub.,New York,N.Y.，其全部通过引用整体并入本文以用于所有目的。
本申请中引用的所有参考文献均以与本文不矛盾的程度通过引用全文并入本文。
可以看出，有效地获得了上述优点以及从前述描述中显而易见的优点，并且由于可以在不脱离本发明范围的情况下对上述构造进行某些改变，因此意图将前述描述中包含的或附图中示出的所有内容解释为说明性的，而不是限制性的。
还应理解，以下权利要求书旨在覆盖本文所述的本发明的所有一般和特定特征，并且就语言而言，可以认为本发明的范围的所有陈述都介于它们之间。现在已经描述了本发明。
Claims (53)
1.一种包含原核载体的非致病性细菌，所述载体包含编码一个或多个治疗性核酸的DNA分子和控制所述治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述细菌被工程化以表现出减少的治疗性核酸降解表型，以增加所述治疗性核酸的预期效果或活性的稳定性、幅度或持续时间。
2.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述治疗性核酸是选自以下的核酸：小干扰RNA/短发夹RNA(siRNA/shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂、RNA或DNA适体、信使RNA(mRNA)、剪接转换寡核苷酸、反义寡核苷酸、抗原寡核苷酸、脱氧核酶、RNA诱饵、核酶、肽核酸、寡聚物和缺损干扰颗粒。
3.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)或一个或多个dsRBP的结合结构域或片段。
4.根据权利要求3所述的非致病性细菌，其中在产生治疗性核酸的质粒上编码所述dsRBP或dsRBP的一个或多个结合结构域或片段。
5.根据权利要求3所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达选自以下的蛋白质的dsRBP结合结构域：TAR RNA结合蛋白(TRBP)、核因子90(NF90)、ZNF346、SID-1和Ku70及其组合。
6.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表现出降低的RNase活性。
7.根据权利要求6所述的非致病性细菌，其中所述细菌是缺乏功能性rnr基因的工程化细菌。
8.根据权利要求6所述的非致病性细菌，其中在所述细菌中缺失或下调了编码选自由RNase E、RNase I、RNase H和RNase J组成的组的蛋白质的基因。
9.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达使治疗性核酸的3'末端核苷酸甲基化的产物。
10.根据权利要求9所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达HEN1蛋白或其活性甲基转移酶片段或结构域。
11.根据权利要求9所述的非致病性细菌，其中所述HEN1蛋白或其活性甲基转移酶片段或结构域是热纤梭菌(C.thermocellum)HEN1的C末端甲基化酶结构域。
12.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述细菌是选自由以下组成的细菌组的工程化细菌：李斯特氏菌属(Listeria)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、立克次氏体属(Rickettsia)、志贺氏菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、军团菌属(Legionella)、衣原体(Chlamydia)、布鲁氏菌属(Brucella)、奈瑟菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkolderia)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、弧菌属(Vibrio)、密螺旋体属(Treponema)、乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacteriae)。
13.一种包含原核载体的非致病性细菌，所述载体包含编码一个或多个治疗性核酸的DNA分子和控制所述治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述治疗性核酸干扰一个或多个靶分子并且其中所述细菌被工程化以表达结合靶细胞上的唾液酸残基的蛋白质。
14.根据权利要求13所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达流感血凝素-1(HA-1)蛋白或其片段或结合结构域。
15.根据权利要求13所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达Inv蛋白或其片段或结合结构域。
16.一种包含原核载体的非致病性细菌，所述载体包含编码一个或多个治疗性核酸的DNA分子和控制所述治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述治疗性核酸干扰一个或多个靶分子并且其中所述DNA分子缺乏抗生素抗性基因。
17.一种包含原核载体的非致病性细菌，所述载体包含编码一个或多个治疗性核酸的DNA分子和控制所述治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述治疗性核酸干扰一个或多个靶分子并且其中所述非致病性细菌已被工程化成营养缺陷型突变体。
18.根据权利要求17所述的非致病性细菌，其中所述非致病性细菌和DNA分子缺乏抗生素抗性基因。
19.根据权利要求17所述的非致病性细菌，其中所述细菌已经被工程化成在一个或多个氨基酸的合成方面是染色体缺陷型的。
20.根据权利要求19所述的非致病性细菌，其中所述细菌已经被工程化成在组氨酸合成方面是缺陷型的。
21.根据权利要求19所述的非致病性细菌，其中所述DNA分子编码一个或多个氨基酸，从而通过在缺乏所述一个或多个氨基酸的培养基中的生长来促进携带所述DNA分子的群体的选择，并且所述DNA分子上存在用于缺少的氨基酸的基因使携带所述DNA分子的细菌能够生长。
22.根据权利要求19所述的非致病性细菌，其中所述细菌是hisD或hisB敲除型。
23.一种用于在受试者中治疗疾病的试剂盒，其在组合物中包含权利要求1的非致病性细菌，其中所述组合物以适合于选自以下的途径施用的形式提供：鼻内给药至鼻腔，气雾化用于上下呼吸道靶向，口腔中吸收用于经颊递送，咽下用于GI吸收，施加于脆弱的生殖器粘膜上皮，和表面施用以用于眼部递送。
24.一种包含原核载体的非致病性细菌，所述载体包含编码一个或多个治疗性核酸的DNA分子和控制所述治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述细菌被工程化以表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)。
25.根据权利要求24所述的非致病性细菌，其中所述治疗性核酸是选自以下的核酸：小干扰RNA/短发夹RNA(siRNA/shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂、RNA或DNA适体、信使RNA(mRNA)、剪接转换寡核苷酸、反义寡核苷酸、抗原寡核苷酸、脱氧核酶、RNA诱饵、核酶、肽核酸、寡聚物和缺损干扰颗粒。
26.根据权利要求24所述的非致病性大肠杆菌细菌，其中所述dsRBP是TAR RNA结合蛋白(TRBP)。
27.根据权利要求24所述的非致病性细菌，其中所述细菌被进一步工程化以表达至少一个基因以促进所述细菌进入受试者的靶组织。
28.一种包含原核载体的非致病性大肠杆菌细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的DNA分子和控制所述siRNA的转录的启动子，其中所述siRNA干扰一个或多个靶RNA分子并且其中所述细菌被工程化以表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)。
29.根据权利要求28所述的非致病性大肠杆菌细菌，其中所述细菌被进一步工程化以表达至少一个inv基因和至少流感病毒血凝素(HA-1)蛋白。
30.根据权利要求28所述的非致病性大肠杆菌细菌，其中所述dsRBP是TAR RNA结合蛋白(TRBP)。
31.一种包含原核载体的非致病性大肠杆菌细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的DNA分子和控制所述siRNA的转录的启动子，其中所述siRNA干扰一个或多个靶RNA分子并且其中所述细菌被工程化以表现出降低的RNase活性。
32.根据权利要求31所述的非致病性大肠杆菌细菌，其中所述细菌缺乏功能性rnr基因。
33.一种生产跨界递送运载体的方法，其包括以下步骤：使非致病性RNase R缺陷型运载体在选自由以下组成的组的温度下生长：33℃或更低、30℃或更低、27℃或更低、25℃或更低、22℃或更低、20℃或更低和17℃或更低。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细菌是选自由以下组成的细菌组的工程化细菌：李斯特氏菌属、耶尔森氏菌属、立克次氏体属、志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、军团菌属、衣原体属、布鲁氏菌属、奈瑟菌属、伯克氏菌属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、柯克斯氏体属、分枝杆菌属、螺杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属、弧菌属、密螺旋体属、乳杆菌属和双歧杆菌属。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述细菌是非致病性大肠杆菌。
36.一种包含原核载体的非致病性大肠杆菌细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的DNA分子和控制所述siRNA的转录的启动子，其中所述siRNA干扰一个或多个靶RNA分子并且其中所述细菌被工程化以使siRNA的3’末端核苷酸甲基化。
37.一种包含原核载体的非致病性大肠杆菌细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的DNA分子和控制所述siRNA的转录的启动子，其中所述siRNA干扰一个或多个靶RNA分子并且其中所述细菌被工程化以表达HEN1基因，从而HEN1促进siRNA的3’末端核苷酸的甲基化。
38.一种包含原核载体的非致病性大肠杆菌细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的DNA分子和控制所述siRNA的转录的启动子，其中所述siRNA干扰一个或多个靶RNA分子并且其中所述细菌被工程化以表达HEN1基因的C末端甲基化酶结构域，从而HEN1的C末端甲基化酶结构域促进siRNA的3’末端核苷酸的甲基化。
39.一种包含原核载体的非致病性大肠杆菌细菌，所述载体包含编码一个或多个siRNA的DNA分子和控制所述siRNA的转录的启动子，其中所述siRNA干扰一个或多个靶RNA分子并且其中所述细菌被工程化以表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)和HEN1基因。
40.根据权利要求39所述的非致病性大肠杆菌细菌，其中所述非致病性大肠杆菌细菌缺乏功能性rnr基因。
41.根据权利要求40所述的非致病性大肠杆菌细菌，其中所述细菌被进一步工程化以表达至少一个inv基因和至少流感病毒血凝素(HA-1)蛋白。
42.一种包含原核载体的非致病性细菌，所述载体包含编码一个或多个治疗性核酸的DNA分子和控制所述治疗性核酸的转录的原核启动子，其中所述治疗性核酸干扰一个或多个靶分子并且其中所述细菌被工程化以表达流感病毒血凝素(HA-1)蛋白。
43.根据权利要求42所述的非致病性细菌，其中所述细菌被进一步工程化以表达至少一个inv基因。
44.根据权利要求43所述的非致病性细菌，其中所述治疗性核酸干扰一个或多个靶流感病毒RNA分子。
45.一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或酵母，所述载体包含编码一个或多个核酸的DNA分子和控制所述核酸的转录的启动子，其中所述细菌或酵母被工程化以从染色体中表达流感病毒血凝素(HA-1)蛋白。
46.一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或酵母，所述载体包含编码一个或多个核酸的DNA分子和控制所述核酸的转录的启动子，其中所述细菌或酵母被工程化以从染色体中表达hlyA、inv、HA-1、TRBP、HEN1。
47.根据权利要求46所述的非致病性细菌或酵母，其中所述核酸是治疗性核酸。
48.一种包含原核或真核载体的非致病性细菌或酵母，所述载体包含编码一个或多个核酸的DNA分子和控制所述核酸的转录的启动子，其中所述细菌或酵母被工程化以从染色体中表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)或dsRBP结合结构域。
49.根据权利要求48所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达选自以下的蛋白质的dsRBP结合结构域：TAR RNA结合蛋白(TRBP)、核因子90(NF90)、ZNF346、SID-1和Ku70及其组合。
50.一种包含质粒的非致病性细菌或酵母，所述质粒包含编码一个或多个核酸的DNA分子和控制所述核酸的转录的启动子，其中所述治疗性核酸与一个或多个靶分子相互作用并且其中所述非致病性细菌或酵母已被工程化成用于DNA分子选择或维持的营养缺陷型突变体。
51.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述治疗性核酸是选自以下的核酸：小干扰RNA/短发夹RNA(siRNA/shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂、RNA或DNA适体、信使RNA(mRNA)、剪接转换寡核苷酸、反义寡核苷酸、抗原寡核苷酸、脱氧核酶、RNA诱饵、核酶、肽核酸、寡聚物和缺损干扰颗粒。
52.根据权利要求13所述的非致病性细菌，其中结合靶细胞上的唾液酸残基的所述蛋白质是来自冠状病毒(coronaviruses)、诺如病毒(norovirus)、轮状病毒(rotavirus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、副流感(parainfluenza)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的唾液酸结合蛋白或结合结构域。
53.根据权利要求1所述的非致病性细菌，其中所述细菌被工程化以表达dsRNA结合蛋白(dsRBP)或dsRBP的一个或多个结合结构域或片段，所述细菌被工程化以表现出降低的RNase活性，并且所述细菌被工程化以表达使所述治疗性核酸的3'末端核苷酸甲基化的产物。
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