JP2004525602A - 組織特異的および病原菌特異的毒性剤、リボザイム、DNAzymeおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの使用方法 - Google Patents
組織特異的および病原菌特異的毒性剤、リボザイム、DNAzymeおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004525602A JP2004525602A JP2001577507A JP2001577507A JP2004525602A JP 2004525602 A JP2004525602 A JP 2004525602A JP 2001577507 A JP2001577507 A JP 2001577507A JP 2001577507 A JP2001577507 A JP 2001577507A JP 2004525602 A JP2004525602 A JP 2004525602A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- toxic
- ribozyme
- nucleic acid
- target
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
Abstract
本発明は、病原菌に致死作用を示す毒性剤の発見、同定および特徴付けと、感染症を治療および/または根絶するために、病原菌または病原菌感染細胞にこのような毒性剤を標的化するための方法とに関する。特に、本発明は、細菌生活環が異なる段階の細菌を標的とし、細菌または細菌感染細胞に単独または併用して送達される毒性剤に関する。本発明は、異常な細胞に致死作用を示す毒性剤と、異常を治療および/または根絶するために異常な細胞にこのような毒性剤を標的化するするための方法とに関する。本発明は、病原特異的または組織特異的であるプロモーターエレメントと、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原菌特異的または組織特異的発現を実施するためのこのようなプロモーターエレメントの用途とに関する。詳細には、本発明は、毒性遺伝子産物、アンチセンスRNAもしくはリボザイムまたはそれらの組み合わせのうちの1つ以上の送達に関する。本発明は、病原菌または病原菌が感染した細胞の細胞死を生ずるために、複数の病原菌標的を同時に標的化することができる新規方法を提供する。さらに、本発明は、薬剤耐性菌および病原性細菌の根絶に重要な関係がある。本発明は、異常な細胞を死滅させるために、複数の標的を同時に標的化することができる新規の系を提供する。本発明は、薬剤耐性菌(抗生物質耐性菌など)および薬剤耐性異常細胞(薬剤耐性癌細胞など)の根絶に重要な関係がある。
Description
【0001】
1. 序文
本発明は、病原菌に致死作用を示す毒性剤の発見、同定および特徴付けと、感染症を治療および/または根絶するために、病原菌または病原菌感染細胞にこのような毒性剤を標的とし、送達するための方法とに関する。特に、本発明は、細菌生活周期が異なる段階の細菌を標的とし、細菌または細菌感染細胞に単独または併用して送達される毒性剤に関する。特に、本発明は、ヒトおよび動物の細菌感染症を治療するためのファージ送達媒体法に関する。本発明はまた、異常な細胞に致死作用を示す毒性剤と、疾患を治療および/または根絶するために異常な細胞にこのような毒性剤を標的とするするための方法とに関する。本発明は、病原特異的または組織特異的であるプロモーターエレメントに関する。本発明はまた、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原特異的または組織特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントに関する。詳細には、本発明は、毒性遺伝子産物、アンチセンスRNAもしくはリボザイムまたはそれらの組み合わせの1つ以上の送達に関する。本発明は、病原菌または病原菌が感染した細胞を死滅させるまたは適応性を低下するために、複数の標的を同時に標的とすることができる新規方法を提供する。本発明は、薬剤耐性病原菌(抗生物質耐性菌など)および薬剤耐性異常細胞(薬剤耐性癌細胞など)の根絶に重要な関係がある。本発明はまた、パピローマウイルスおよびB型肝炎ウイルスを含むウイルス感染症を治療するための薬学的組成物に有用なDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムに関する。
【0002】
2. 背景技術
2.1. 抗菌剤
感染性疾患は毎年数百万人を罹患させ、死亡させている。米国だけでも毎年数十万人が、ペニシリンおよびバンコマイシンのような薬剤で治療できない耐性細菌株に感染している(Hiramatsuら、1997、Morbidity and Mortality Weekly Report 46:624−26)。抗菌耐性に関連する感染症は、特に若年者、高齢者および免疫寛容者における肺炎などの病院において(院内)獲得されるもの、腸チフス熱、細菌性髄膜炎および結核を含む。世界では、約15億人が種々の種類の結核菌を保菌しており、国によっては、40パーセントが抗生物質抵抗性であることが証明されている(Boyceら、1997、「院内感染の疫学および予防、ヒト疾患におけるブドウ球菌(Epidemiology and prevention of nosocomial infections. In The Staphylococcus in Human Disease.)」Crassly and Archer E’s, Churchill Livingston Inc.、New York、NY参照)。一部の先進国では、院内感染症全体の60%が抗生物質抵抗性の細菌によって生ずると推定される。例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は火傷治療室における院内感染および発生に関連する最も一般的なグラム陰性菌である。この生物による感染症は高い死亡率(60%)に関連しており、構造的に関連のない多数の抗生物質に対するこの属のメンバーの高い固有耐性に寄与している。グラム陽性菌も感染性疾患に大きな影響を与えている。例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、米国における約260,000例の院内感染の原因となっており、それによって年間60,000〜80,000人の死亡を生ずるグラム陽性菌である(Boyceら、上記参照)。
【0003】
1つまたは数種の感染菌を標的とするために数多くの抗菌治療が設計されているが、多くの治療は感染症の根絶の成功程度は様々である。この10年間にごく少数の新規抗生物質が市場に登場したが、これらの薬物治療に耐性を示す致死的な細菌の数は増加した。例えば、バンコマイシンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染症(MRSA)の治療に利用可能な唯一の効果的な抗菌剤の1つである。しかし、バンコマイシン耐性分離株黄色ブドウ球菌が今や出現している(Hiramatsuら、1997、Morbidity and Mortality Weekly Report 46:624−26)。また、これらの治療が特定の感染菌を標的できないことにより、治療が過剰または不適当に使用されており、薬剤耐性菌を発生させている。多数の感染菌における薬剤耐性の発生により効果は低下しており、既に確立している抗菌治療を使用するリスクが増加している。
【0004】
従って、細菌に対して致死剤として作用することができ、感染している宿主に毒性を生ずることなく、病原菌に送達することができる新規分子および分子の新規組み合わせの必要性が当技術上存在している。さらに、特定の種の病原菌を標的とするが、宿主の有用な細菌叢に有害な影響を与えない新規方法の必要性が当技術上存在している。本発明は、細菌などの病原菌に対する毒性剤として使用することができるこのような新規産物、治療薬および送達方法を提供する。
【0005】
2.2 アンチセンス
アンチセンス技術は、細胞RNAをコードされているタンパク質に翻訳させないために、細胞RNAに相補的である(または細胞RNAのアンチセンスである)RNA分子の使用を試みるものである。この方法では、特定のタンパク質の発現は下方制御を標的とされる。しかし、アンチセンス技術を取り巻く分野には大多数の困難が存在する。通常、標的細胞への外因性アンチセンス分子の送達は達成が困難または不可能である。さらに、アンチセンス分子は、常にタンパク質の発現を低下させるわけではない。例えば、遺伝子組換えマウスにおけるアンチセンスRNAの発現は標的RNA分子の減少をいつも生じるわけではなく、標的RNA分子の減少が生じたとき、予想されるようにタンパク質の減少がそれに平行して生じるわけではないことが示されている。タンパク質レベルが低下した場合でも、生物的影響が検出されなかったことがあった(Whitton, J. Lindsay、「ウイルス感染のアンチセンス治療(Antisense Treatment of Viral Infection)」Adv. in Virus Res. Vol. 44、1994)。従って、アンチセンス分子を、病原菌などの標的細胞に効率的に送達することができる送達系の必要性が当技術上存在する。
【0006】
2.3 リボザイム
リボザイムは、RNAを配列特異的に切断する触媒RNA分子である。リボザイムを抗菌剤として使用する際の主な技術的な点は、リボザイムが微生物内で標的RNAを切断することができるように、リボザイムが標的微生物に導入され、標的微生物によって発現されなければならないことである。第2の重要な点は、微生物では転写と翻訳が密接に関連しているので、細菌のRNA標的の結合および切断が防がれていることである。また、細菌のRNAは、真核細胞のRNAより半減期が短いことが多く、細菌のRNAを標的とする時間を短くしている。本明細書に記載する発明はこれらの点に対処しており、リボザイムと毒性剤との組み合わせを使用した細菌感染症の新規治療法を証明している。
【0007】
3. 発明の概要
本発明は、細菌または細菌感染細胞または他の病原菌に毒性剤を特異的に標的とする毒性剤と方法とを提供する。本発明の毒性剤は、1つ以上の標的に向けられ、従って、細菌を根絶するために単独または併用して使用することができる。本発明は、病原菌または異常細胞を根絶するために毒性遺伝子産物またはリボザイムと毒性遺伝子産物との組み合わせを送達することに関する。詳細には、本発明は、このような細菌または病原菌を根絶するために、毒性タンパク質、アンチセンスRNA、マルチリボザイムまたはこれをコードする核酸またはそれらの組み合わせを1つ以上、感染性細菌または病原菌を含有する細胞、組織または対象に送達することを提供する。
【0008】
本発明は、さらに、疾患、ウイルス感染症、寄生虫感染症および微生物感染症を治療するために、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを使用することを含む。本発明は、さらに、組織の細胞増殖を阻止することによって、特定組織の増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、組織特異的プロモーター配列に機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、プロモーターは異常組織に特異的であり、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、細胞増殖が阻止され、増殖性疾患が治療される方法に関する。
【0009】
本発明は、さらに、病原菌の複製を阻止することによって、病原菌感染症または疾患を有する対象を治療する方法であって、病原菌特異的プロモーターに機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、病原菌は複製が阻止されるか、または死滅させられるか、または適応性を低下させられ、感染症または疾患が治療される方法に関する。本発明の特定の態様において、本発明の毒性剤は、重症の火傷、嚢胞性繊維症、癌または他の免疫寛容状態に関連する微生物感染症を治療するのに有用である。本発明は、薬学的製剤中に本発明の毒性剤および/またはリボザイムを含む。
【0010】
本発明は、さらに、研究およびスクリーニング目的のために、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを使用することを含む。本発明の一態様において、リボザイムおよび/または毒性剤は、選択されたウイルスもしくは微生物病原菌または選択された細胞を効果的に阻止するために、標的とされるウイルス、微生物、原核細胞または真核細胞遺伝子産物をスクリーニングするために使用することができる。
【0011】
さらに別の態様において、本発明は、毒性剤および/またはリボザイムをコードする新規ベクターに関する。本発明の新規ベクターは、組織特異的、病原菌特異的、プロモーター特異的、抗菌特異的、抗ウイルス特異的、抗癌特異的、抗腫瘍特異的または標的特異的を含むが、これらに限定されない、多種多様の毒性剤および/またはリボザイムを操作するために使用することができる。
【0012】
一態様において、本発明は、病原菌の生存または生活周期(複製、パッケージング等)に必須の遺伝子産物を特異的に標的とする毒性剤に関する。一態様において、本発明は、対応する嗜癖系(addiction system)解毒剤が存在しない場合に発現するように改変されている天然型殺菌嗜癖系毒素に関する。別の態様において、本発明は、対応する嗜癖系解毒剤より高いレベルで発現するように改変されている天然型嗜癖系毒素に関する。一例において、嗜癖系毒素(例えば、doc、chpBK、kicBまたはgef)を毒性剤として使用し、その解毒剤から離しておく。特定の態様において、本発明は、バクテリオファージ送達系によって殺菌タンパク質などの毒性剤(またはこのような毒性剤をコードする核酸)の送達を提供する。他の特定の態様において、本発明は、宿主の細菌感染症を治療するために、バクテリオファージ送達系と併用して使用することができる毒性剤をコードする新規伝達プラスミド(transfer plasmid)を提供する。
【0013】
本発明はまた、複製または生存に必須のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を特異的に標的とするDicF1またはDicF1様アンチセンス分子などの必須ヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスRNAに関する。さらに、本発明は、細菌中で発現されると、致死剤として作用する、安定性が増加した改変されたアッセイ構造に関する。本発明はまた、必須のアンチセンス分子を標的とするように設計された毒性のセンス分子に関する。
【0014】
本発明は、(病原菌感染症または癌などの)疾患を治療するために、組織特異的または病原菌特異的にRNAを標的とするためのマルチリボザイムとそれらの用途とに関する。本発明は、1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有するマルチリボザイムを提供する。トランス作用性リボザイムは標的特異的に作用するので、(細菌などの)病原菌または(異常細胞などの)選択された細胞に毒性剤として作用することができる。本発明によると、マルチリボザイムは、a)5’側および3’側の自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイム、b)5’側または3’側の自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイム、またはc)5’側および3’側の両方または一方の自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムが隣接した複数のトランス作用性リボザイムを含んでもよい。本発明のマルチリボザイムはまた、異常な細胞または組織に1つ以上の毒性剤を送達するために使用することができる。本発明に有用なリボザイムは、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている米国特許第5,824,519号、PCT出願国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第97/17433号、国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第99/67400号に記載されているものを含む。本発明によると、マルチ−トランス作用性リボザイムを同一RNAの同一部位、同一RNAまたは異なるRNAの異なる部位に標的とすることができる。本発明によると、複数の毒性剤を、(細胞RNAまたはタンパク質などの)同一標的の同一部位、同一標的または異なる標的の異なる部位に標的とすることができる。例えば、ある態様において、(毒性タンパク質をコードするアンチセンス核酸または核酸などの)毒性剤を、トランス作用性リボザイムの代わりに、またはトランス作用性リボザイムに加えてマルチリボザイム内に操作することができる。この態様では、毒性剤には5’側および/または3’側自己触媒的切断リボザイムが隣接している。
【0015】
本発明は、さらに、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸および発現カセットを提供する。これらの核酸は、選択された部位において本発明の毒性剤および/またはリボザイムを発現するために使用することができる。
【0016】
分子遺伝子レベルでは、本発明の毒性剤、リボザイムまたはマルチリボザイムのコード配列は、以下の遺伝子エレメントの1つ以上の制御下に置かれることができる:標的とされる微生物の天然型で、強い、中程度または弱い構成的発現プロモーターまたは調節プロモーター、または望ましいレベルのリボザイムおよび/または毒性剤発現を与える、強い、中程度または弱いコンセンサス配列を含有する人工的に考案された構成的発現プロモーターまたは調節プロモーター。本発明は、病原菌特異的であるプロモーターエレメントに関する。本発明は、本発明の毒性剤の病原菌特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントに関する。本発明はまた、組織特異的であるプロモーターエレメントに関する。本発明は、本発明の毒性剤の組織特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントに関する。
【0017】
一態様において、核酸は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む。本発明によると、本発明の毒性剤は同一標的または異なる標的に作用することができる。
【0018】
本発明は、任意の既知の分類学上の科、属または種の任意の細胞、ウイルス、細菌、真菌または他の単細胞もしくは多細胞生物を標的とする毒性剤および/またはトランス作用性リボザイムに関する。本発明の別の態様は、細菌、真菌、酵母、異常細胞などの異常に致死的または毒性である毒性剤に関する。
【0019】
本明細書に記載されている抗菌リボザイム治療の標的は、侵入している微生物または正常な細菌叢の微生物のRNAである。本明細書に記載されている抗菌毒性剤治療の標的は侵入している微生物または正常な細菌叢の微生物のRNA、タンパク質、遺伝子および他の分子を含む。本発明は、1つまたは一連の候補微生物の必須遺伝子、ハウスキーピング遺伝子または病原性遺伝子に対して一連のリボザイムおよび/または毒性剤を送達することを提供する。必須タンパク質および病原性決定因子の不活性化は、侵入している微生物を不活性化し、それらの増殖を遅くするが、同時に宿主の必須課程には大きな影響を与えない。
【0020】
本発明はまた、非生物系または生物系によって、細胞または病原菌に本発明の毒性剤を送達することに関する。特定の態様において、本発明の毒性剤は、病原菌に感染することができる改変されたバクテリオファージによって、細菌細胞に送達される。さらに別の態様において、バクテリオファージは、特定の種または属の細菌に感染する能力について選択され、宿主からこのような細菌種を根絶させるために毒性剤を送達するのに使用される。好ましい態様において、送達媒体に固有の核酸を送達するには不十分な量しか遺伝情報を含有しないように、送達媒体または送達媒体に固有の核酸を改変する。従って、改変された送達媒体(例えば、ビリオンまたはバクテリオファージ)は、標的細胞または病原菌に、本発明のリボザイムおよび/または毒性剤を送達する分子媒体として働くことができるが、送達媒体に固有の複製可能な核酸を送達しない。または、非生物送達系(例えば、リポソーム)を使用して、リボザイムおよび/または毒性剤の適切な発現に必要で、十分な遺伝子エレメントを保有する核酸をパッケージングすることができる。一態様において、病原菌に毒性剤を送達することは、関心のある病原菌を標的とするバクテリオファージまたは他の送達媒体を使用することによる。一態様において、組換えバクテリオファージは、毒性剤または毒性剤をコードする核酸を病原菌に送達する。
【0021】
本発明は、標的微生物に毒性剤および/またはリボザイムを含む核酸を送達することができる、不活性化し、改変したウイルス(ビリオン)、バクテリオファージまたは非生物送達媒体によって、標的微生物に特異的な基礎的および必須の細胞過程に対するリボザイムおよび/または毒性剤を1つ以上送達するための方法および組成物を開発することによって得られたものの組成物を提供する。微生物は、任意のウイルス、非ウイルス、細菌または真菌、酵母、寄生虫、原生動物などの下等真核生物、またはヒト、動物、魚類、植物または他の植物体の病原菌であると考えられる他の真核生物であってもよい。従って、本発明は、ヒトおよび獣医医学に重要な関係がある。
【0022】
ある好ましい態様において、本発明の毒性剤を抗菌治療剤として使用する。毒性剤は、単独で使用しても、または1つ以上の他の毒性剤と併用して使用してもよい。従って、侵入している微生物への毒性剤の送達はその微生物を死滅させるか、または適応性を低下させる。毒性剤は、1つ以上のリボザイムと併用して使用してもよい。さらに、リボザイムと毒性剤との組み合わせを抗菌治療剤として使用することができる。
【0023】
本発明の毒性剤方法は、(1)最新の(sophisticated)微生物が持っているまたは形成する可能性のある、新生(de novo)または組み込み型(built−in)薬剤耐性の回避、(2)それらに送達されるリボザイムまたは毒性剤を中和する細胞能力の低さ、(3)同時に攻撃することができる、微生物中で利用可能な広域RNA標的および非−RNA標的の使用、(4)異なる科の生物または異なる種の生物に容易に適合させることができる本発明の送達媒体に特定設計の柔軟性、(5)改変された送達基剤の集成的構成および製造の容易さ、(6)局所、注射、吸入または摂取等などの、本発明の薬学的製剤の種々の投与方法の利用性、(7)薬学的製剤を凍結乾燥し、それによって抗菌治療剤に安定性を与えることができること、(8)治療用製剤の免疫原性の低さおよび(9)本発明のリボザイムおよび/または毒性剤の評価を可能にする動物試験系の利用性を含むが、これらに限定されない抗菌治療の進歩を提供する。従って、病原菌に必須または重要な遺伝子産物を送達する独自の送達方法および攻撃的な機序が、感染した宿主内の病原菌を適時的に破壊することができる。従って、本発明は、薬物耐性病原菌の根絶に重要な関係がある。
【0024】
本発明はまた、形質転換またはプラスミドコピー数制御に関連する少なくとも1つのウイルスタンパク質をコードするmRNAに生理的条件下において特異的にハイブリダイズする、またはウイルスのポリアデニル化シグナルにハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。本発明のさらに別の態様は、mRNAがE6/E7mRNAである、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。本発明のよりさらに別の態様は、mRNAがパピローマウイルスRNAまたはB型肝炎ウイルスRNAである、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。本発明は、生理的条件下において、パピローマウイルスE6/E7mRNAまたはパピローマウイルスポリアデニル化シグナルに特異的にハイブリダイズする1つ以上のアンチセンス核酸の精製調製物であって、アンチセンス核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはDNAzymeである精製調製物を提供する。
【0025】
本発明のさらに別の態様は、関連HPVまたはHBV株の配列番号:AA〜BDからなる群より選択される配列または相同配列に生理的条件下において特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、好ましくは、本出願の開示内容に同定されている標的部位と、少なくとも約70%または75%または80%または85%または86%または87%または88%または89%または90%または91%または92%または93%または94%または95%または96%または97%または98%または99%一致する。
【0026】
本発明のさらに別の態様は、上記の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物であって、核酸分子がDNAzymeまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムの単独または併用したものである精製調製物に関する。
【0027】
本発明のさらに別の態様は、上記の核酸分子のいずれかの精製調製物であって、核酸分子が、当業者に周知の任意の手段によってヌクレアーゼ分解に抵抗性にしてある精製調製物に関する。
【0028】
好ましい態様において、本発明の核酸分子は、3’末端に3’−3’逆位Tを挿入することによってヌクレアーゼ分解に抵抗性にするように、それらの3’末端が改変されている。3’末端の改変は、3’末端に3’−3’逆位チミジン、アデニン、グアニンまたはシトシン(それぞれ、逆位T、逆位A、逆位G、逆位C)を挿入してもよい。
【0029】
本発明のさらに別の態様は、上記の核酸分子のいずれかと薬学的に許容されうる担体とを含有する薬学的組成物に関する。よりさらに別の態様において、薬学的組成物のいずれかは、美容剤および/または局所適用剤として製剤化されていてもよい。局所製剤は、軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはローションの形態であってもよい。薬学的組成物のいずれかは、核酸分子がリポソーム製剤または脂質製剤に製剤化されるように、製剤化されていてもよい。さらに別の態様において、リポソームは、肝臓において組織特異的に取り込まれることができる。よりさらに別の態様において、リポソームは、アシアロフェチュイン(asialofetutuin)または1つ以上の糖を使用して修飾される。
【0030】
よりさらに別の態様は、本発明の核酸分子が、パピローマウイルスまたはB型肝炎ウイルスが感染した細胞において細胞毒性または細胞増殖抑制作用を生ずるのに十分な量が製剤化されている薬学的組成物に関する。細胞はまた、パピローマウイルスによって形質転換されていても、またはB型肝炎ウイルスによって形質転換されていてもよい。
【0031】
本発明のさらに別の態様は、パピローマウイルス性状態またはB型肝炎ウイルス性状態を治療する方法であって、上記の薬学的組成物のいずれかを対象に投与する段階を含む方法に関する。さらに別の態様において、パピローマウイルス性状態は、疣(例えば、手、足、喉頭の疣および/または子宮頚部の偏平な疣)、子宮頚癌、喉頭乳糖腫、せんけいコンジローム、疣状表皮異形成、子宮頚部上皮細胞間異形成またはパピローマウイルスに関係する任意の他の感染症からなる群より選択される。本発明の方法は、扁平上皮、皮膚上皮および粘膜上皮などの上皮細胞またはパピローマウイルスが感染したもしくはパピローマウイルスが感染した可能性のある任意の他の細胞治療を含む。
【0032】
本発明のさらに別の態様は、局所適用を含む、上記の薬学的組成物のいずれかを投与する方法に関する。投与は頚部または表皮に対して行ってもよい。さらに別の態様において、投与は、扁平上皮、皮膚上皮および粘膜上皮などの上皮細胞に対して行われる。
【0033】
本発明はまた、パピローマウイルス性状態を治療する方法であって、本明細書に記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムの1つ以上を、パピローマウイルスが感染した細胞に局所適用によって対象に投与する段階を含む方法に関する。パピローマウイルス性状態を治療する方法には、頚部適用または皮膚もしくは表皮適用が含まれる。
【0034】
本発明のよりさらに別の態様において、パピローマウイルスを治療する方法は、ヒトパピローマウイルス(HPV)によって誘導される状態の治療を含む。
【0035】
さらに別の態様において、本発明のアンチセンス核酸の薬学的組成物は美容適用であってもよい。
【0036】
薬学的組成物は、疣ウイルスが感染した細胞またはウイルスに細胞毒性または細胞増殖抑制作用を生じるのに十分な量の本発明の核酸が存在するように、製剤化することができる。特定の態様において、疣ウイルスはパピローマウイルスである。よりさらに別の態様において、細胞はパピローマウイルスによって形質転換されている。
【0037】
好ましい態様において、本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムの薬学的組成物は、局所適用用に製剤化される。このような製剤は軟膏、膏薬、ゲル、クリーム、ローションまたは坐剤を含む。
【0038】
本発明のよりさらに別の態様において、本発明の核酸の薬学的組成物はリポソーム製剤または脂質製剤に製剤化することができる。
【0039】
薬学的組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムからなる群より選択される本発明の1つ以上の核酸を含有してもよく、核酸は、HPV E6/E7mRNAまたはHPV ポリアデニル化シグナルに生理的条件下において特異的にハイブリダイズするか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはDNAzymeは3’末端に3’−3’逆位チミジンを有し、および/または薬学的組成物は軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはローションなどの局所適用用に製剤化される。
【0040】
別の好ましい態様において、B型肝炎ウイルス(HBV)RNAに生理的条件下において特異的にハイブリダイズする本発明の1つ以上の核酸の精製調製物であって、該1つ以上の核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムである精製調製物が提供される。
【0041】
5. 発明の詳細な説明
本発明は、細菌、寄生虫もしくはウイルス感染症または細胞増殖および癌に関連する疾患および疾病を治療するための毒性剤および/またはリボザイムと、組織特異的、標的特異的または病原菌特異的なそれらの用途とを提供する。本発明のリボザイムおよび/または毒性剤は、宿主の特定の細胞または組織に含有される1つ以上の特定のRNAを標的とするように操作することができる。本発明のリボザイムは、特定の病原菌、ウイルスまたは微生物によってコードされる1つ以上の特定のRNAを標的とするように操作することもできる。本発明の毒性剤は、特定の病原菌、ウイルスまたは微生物の1つ以上のRNA、タンパク質または分子を標的とするように操作することもできる。
【0042】
本発明はまた、選択された病原菌に致死的または毒性である毒性剤を提供する。本発明の一態様において、本発明の毒性剤は、病原菌または選択された細胞(例えば、異常細胞)を致死させるか、または病原菌または選択された細胞を適用性を低下させる毒性タンパク質を含む。一態様において、本発明のこのような毒性タンパク質は、病原菌または選択された細胞において過剰発現されるとき、致死的である。他の態様において、毒性タンパク質は、病原菌または選択された細胞内で発現されるとき毒性である外因性タンパク質である。本発明の毒性タンパク質は、毒性を増強するようにさらに操作することができる。例えば、突然変異、欠損、挿入等を既知の配列に導入するための多数の方法が当技術上知られている。従って、最適な毒性タンパク質が提供される。本発明はまた、毒性タンパク質を産生中の細胞中で産生または製造されるように、毒性タンパク質の毒性が抑制される方法を提供する。毒性の抑制は、当技術上周知の任意の方法によって実施することができ、例えば、毒性タンパク質は、適当な条件下において発現のスイッチをオン/オフすることができる誘導プロモーターから発現させることができる。毒性タンパク質は、同じ細胞において解毒剤タンパク質を過剰発現することによって、細胞を致死させることなく、細胞中で発現することができる。他の方法は当業者に明らかであり、本発明の範囲内である。
【0043】
本発明は、毒性剤と、細菌または細菌感染細胞または他の病原菌に毒性剤を特異的に標的とする方法とを提供する。本発明の毒性剤は、1つ以上の標的に向けられるので、細菌を根絶するために単独または併用して使用することができる。詳細には、本発明は、感染性細菌または病原菌を根絶するために、毒性タンパク質、アンチセンスRNA、マルチリボザイムまたはこれをコードする核酸またはそれらの組み合わせの1つ以上を、このような細菌または病原菌を含有する細胞、組織または対象に送達することを提供する。
【0044】
本発明はさらに、治療薬および薬学的組成物としての、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの用途を含む。本発明の特定の態様において、本発明の毒性剤は、重症の火傷、嚢胞性繊維症、癌または他の免疫寛容状態に関連する微生物感染症を治療するのに有用である。
【0045】
本発明はさらに、研究およびスクリーニング目的のための、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの使用を含む。本発明の一態様において、リボザイムおよび/または毒性剤は、選択されたウイルスもしくは微生物または選択された細胞を効果的に抑制するために、標的とされたウイルス、微生物、原核生物または真核生物の遺伝子産物または分子をスクリーニングするために使用することができる。
【0046】
5.1. 病原菌特異的および組織特異的毒性剤
本発明は、毒性剤として作用し、または毒性剤をコードし、従って抗菌剤として有用である特定の核酸を提供する。種々の毒性剤が本発明の範囲内である。明らかにするために、本発明の毒性剤は、本明細書の以下にいくつかのサブタイプで記載されている。本発明の毒性剤は、アンチセンス核酸、毒性遺伝子産物、センス核酸を含むが、これらに限定されない。
【0047】
5.1.1. 毒性遺伝子産物
本発明は、細菌、寄生虫、真菌またはウイルス感染症または細胞増殖および癌、または異常な細胞に関連する疾患および疾病を治療するための毒性剤としての毒性遺伝子産物または毒性タンパク質の用途に関する。本発明の毒性遺伝子産物は、病原菌または(異常細胞などの)選択された細胞に毒性である(DNA、RNAまたはタンパク質など)任意の遺伝子産物である。このような毒性遺伝子産物は、標的病原菌または選択された細胞において天然であっても(内因性)、または非天然(外因性)であってもよい。本発明の毒性剤は、染色体でコードされても、プラスミドでコードされていても、病原菌でコードされていても、合成であってもまたは任意の他の核酸もしくはヌクレオチド配列でコードされていてもよい。本発明は、病原菌または選択された細胞において発現され、病原菌または選択された細胞を死滅または適応性を低下させる内因性毒性遺伝子産物である毒性剤を提供する。本発明はまた、病原菌または選択された細胞に導入されるかまたはそれらにおいて発現され、病原菌または選択された細胞を死滅または適応性を低下させる外因性毒性遺伝子産物である毒性剤を提供する。適応性が低下した病原菌または選択された細胞は、弱毒化されたもの、または(医薬品、毒素、製剤、突然変異原、溶媒等などの)化学的処理に感受性の高いもの、または(温度などの)物理的ストレスに感受性の高いもの、または(照射またはUVによるなどの)遺伝的改変に感受性の高いもの、または(利用可能な栄養素などの)環境変化に感受性の高いものである。
【0048】
いくつかの態様において、本発明は、細菌または選択された細胞において発現されるとき、毒性剤としてのプラスミド嗜癖系タンパク質の用途を提供する。例えば、ある種のバクテリオファージにおいて、溶原性(潜伏)経路は、プラスミドの携帯のバクテリオファージDNAのシングルコピーだけを保持する細菌細胞によって発現される。娘細菌細胞が共にプラスミドのコピーを受け取っていることを確信するために、「プラスミド嗜癖系」または「分離後系(post−segregation system)」がその細胞によって使用されており、プラスミドのコピーを受け取っている細菌細胞だけが生存していることを保証している。
【0049】
本発明の一態様において、分離後系またはプラスミド嗜癖系毒素は、毒素を過剰発現することによって、(細菌などの)病原菌に対する毒性剤として使用される。このような毒素の過剰発現は毒素と解毒剤を分離し、過剰発現された毒性剤を含有する細胞において毒性、好ましくは致死を生じる。
【0050】
例えば、一態様において、本発明は、(複製、パッケージングなどの)病原菌の生存または生活周期に必須の遺伝子産物を特異に標的とする毒性剤を提供する。一態様において、本発明は、嗜癖系解毒剤が存在しない場合に発現されるように改変されている天然型嗜癖系毒素を提供する。別の態様において、本発明は、嗜癖系解毒剤より高レベルに発現されるように改変されている天然型嗜癖系毒素を提供する。一例において、嗜癖系毒素(例えば、doc、chpBK、kicBまたはgef)は、毒性剤として使用され、解毒剤から離れている。本発明の別の態様において、(chpBK、kicBまたはgefなどの)染色体によりコードされる毒性遺伝子産物は、毒性遺伝子産物を過剰発現することによって病原菌に対する毒性剤として使用される。
【0051】
ある態様において、毒性剤は、大腸菌(E. coli)の志賀毒素様毒素、ビブリオ コレラ(Vibrio cholerae)のコレラ毒素および緑膿菌(P. aeruginosa)の細胞毒を含むが、これらに限定されない。例えば、ファージK139はビブリオ コレラ(V. cholerae)に、コレラ毒素の酵素活性を増強する遺伝子産物を与える。このような毒素は本発明の範囲内であり、本発明の方法および組成物に関連して毒性剤として使用することができる。本発明のある態様において、殺菌性毒性剤は、黄色ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェーカリス(Enterococcus faecalis)または緑膿菌を含むが、これらに限定されない細菌から誘導される。
【0052】
別の態様において、毒素の解毒剤は、本発明のトランス作用性リボザイムまたは毒性剤の標的である。従って、解毒剤がトランス作用性リボザイムまたは毒性剤によって不活性化されると、毒素は解毒剤によって中和または不活性化されず、従って、病原菌に毒性、好ましくは致死を生じる。
【0053】
さらに別の態様において、解毒剤自体がアンチセンスRNAである場合には、センスRNAを毒性剤として合成し、アンチセンス解毒剤を不活性化するために送達することができる。従って、解毒剤がセンスRNAによって不活性化されると、解毒剤は毒素を不活性化するために利用できず、従って毒性、好ましくは致死を生ずる。
【0054】
本発明に関連して使用することができる嗜癖系毒素の一例はdocである(death on curing; Lehnherr H.ら、1993、J. Mol. Biol. 233: 414−28)。docによってコードされるタンパク質はグラム陰性菌およびグラム陽性菌(例えば、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびエンテロコッカス・フェーカリス)に致死的または毒性である。docは、Phd(prevention of host death)が解毒剤である細菌の細胞毒素として作用する。従って、本発明は、病原菌を適応性を低下し、好ましくは病原菌を根絶するために、病原性細菌に送達することができる、docを発現するプラスミドを提供する。docの特定の利点は、docが真核細胞にほとんどまたは全く毒性を示さないことであり、真核細胞宿主に安全に投与することができる。
【0055】
本発明に関連して使用することができる嗜癖系毒素または染色体によってコードされる毒素または他の毒素の具体的な例は、ccdB、kid、perK、parE、doc、higB、chpAK、chpBK、kicB、hoc、srnB’、flmA、pmdA、relF、gef、kilA、kilB、kilC、kilE、traL、traE、sigB、hok、pemK、リソスタフィン(lysostaphin)およびkikAを含むが、これらに限定されない。本発明の方法に使用することができる解毒剤の例は、ccdA、kis、pemI、parD、phd、higA、chpAI、chpBI、kicA、soc、srnC、flmB、pndB、sof、korA、korB、korC、korD、korEおよびkorFを含むが、これらに限定されない。従って、本明細書の本発明は、本発明の毒性剤として、(docなどの)嗜癖系毒素または他の毒素タンパク質を使用する方法を提供する。本発明はまた、毒素の解毒剤を抑制または不活性化する方法を提供する。本発明はさらに、製造目的のために、毒素および対応するその解毒剤の同時発現を提供する。
【0056】
ある特定の態様において、本発明は、毒性剤chpBK、kicBおよびgefを提供する。kicBまたはgefのタンパク質の各々は大腸菌には致死的であるが、緑膿菌には致死的ではない。従って、本発明は、大腸菌の細菌感染症を根絶または治療する際のkicBまたはgefの使用を提供する。一態様において、kicBまたはgefをコードする核酸を、kicBまたはgef毒性剤(またはその両方)をコードする伝達プラスミドを含有する本発明のP1バクテリオファージによって大腸菌に送達する。
【0057】
本発明の別の特定の態様において、chpBKタンパク質は本発明の毒性剤であり、大腸菌に致死的で、緑膿菌に毒性または致死的である。従って、本発明は、大腸菌または緑膿菌の感染症を根絶または治療する際のchpBKの使用を提供する。一態様において、chpBK核酸を、chpBK毒性剤コードする伝達プラスミドを含有する、本発明のP1バクテリオファージによって大腸菌または緑膿菌に送達する。chpBK機能に拮抗する解毒剤タンパク質をChpBlと呼ぶ。従って、本発明は、製造目的のために、解毒剤ChpBlおよびchpBKの同時発現を提供する。
【0058】
本発明のいくつかの態様において、doc、chpBK、kicBまたはgefなどの毒性剤は誘導プロモーターの制御下に置かれ、解毒剤から離れている。一態様において、プロモーターは、P1溶菌プロモーターP53である。好ましい態様において、プロモーターはLEASHIプロモーターである。好ましい態様において、緑膿菌感染症を治療するためには、本発明は、緑膿菌特異的プロモーターanr、arcまたはproCを提供する。
【0059】
本発明の他の特定の態様において、コンセンサスリボソーム結合部位(
ここで、Xは任意のヌクレオチドである)を、毒性剤をコードする核酸のすぐ上流に挿入することができ、毒性剤の発現が増加する。本発明は、毒性剤またはリボザイムの発現を調節するための、プロモーターとリボザイム進入部位とを組み合わせての使用を提供する。
【0060】
感染症を根絶または治療するために2つ以上の毒性剤を使用することができることも本発明の範囲内である。例えば、バクテリオファージによる送達のために、2つ以上の毒性剤を1つの伝達プラスミドに操作することが考慮されている。このようなバクテリオファージは、細菌を標的とするための複数の毒性剤をコードする核酸を送達する働きをすると思われる。または、各伝達プラスミドが異なる毒性剤をコードする2つ以上の伝達プラスミドが1つのバクテリオファージに保有されてもよい。この態様では、2つ以上の伝達プラスミドを使用する場合には、このようなプラスミドは、2つ以上のプラスミドが組換えによらず発生される(non−recombinigenic)ように設計される。組換えによらず発生される(non−recombinigenic)配列を操作するこのような方法は当技術上周知である。また、この態様において、操作された2つ以上のプラスミドは、好ましくは、異なる複製起点を有する。このように、バクテリオファージは、複数の毒性剤をコードする核酸を送達する働きをする。さらに第3の態様において、バクテリオファージは、複数の伝達プラスミド上に複数の毒性剤を保有するように設計することができる。2つ以上の毒性剤が1つのバクテリオファージにコードされる場合には、このような毒性剤をコードする核酸は同一プロモーターまたは異なるプロモーターに機能的に結合することができる(例えば、本明細書の5.4および5.4.1の項を参照)。
【0061】
5.1.2. アンチセンス
本発明は、毒性剤として作用するので、抗菌剤として有用である特定の核酸を提供する。本発明は、病原菌または選択された細胞のRNAを標的とするアンチセンスRNA分子を提供する。本発明の標的RNAは病原菌特異的RNA、組織特異的細胞RNAまたは疾患特異的RNAであってもよい。本発明はまた、改変されて増強されたアンチセンス核酸を提供し、病原菌特異的RNA、組織特異的細胞RNAまたは疾患特異的RNAを標的とする。
【0062】
本発明の毒性アンチセンス分子の提案されている標的は、病原菌の生存に重大な役割を果たす、または病原菌の生活周期に必須である遺伝子のRNAである。本発明はまた、病原菌の必須遺伝子産物の発現を調節する天然型アンチセンス分子の改変を含む。例えば、上記のように、本発明のアンチセンスの提案されている1つの標的は、その遺伝子産物が大腸菌の細胞分裂の開始に重大な役割を果たしているftsZ遺伝子である。
【0063】
別の態様において、本発明の毒性剤は、標的RNAの阻止を増強するように設計されたアンチセンス分子を含む。本発明のアンチセンス分子を含む毒性剤は、このような毒性アンチセンス分子の配列が、病原菌または選択された細胞の必須RNAなどの標的配列と高い相補性を有するように設計されているという点において、標的RNAとより特異的に結合するように操作される。このような毒性アンチセンス分子は、従って、標的にさらに特異的であり、従って、効率が高い。本発明は、より安定な分子を作製するために、ヘアピン構造で改変されたアンチセンス毒性剤およびリボザイムを提供する。本発明のアンチセンス毒性剤は、当技術上周知の任意の方法によって、標的病原菌または細胞内で高レベルに発現させることもできる。例えば、アンチセンス毒性剤は、強い調節プロモーターを使用して、多コピー発現プラスミドからイントランス(in trans)で発現させることができる。アンチセンス毒性剤はまた、同じプロモーターを使用する病原菌または細胞においてアンチセンス分子だけが発現されるように、組織特異的または病原菌特異的プロモーターに機能的に結合することができる。
【0064】
詳細には、本発明は、複製または生存に必須なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を特異的に標的とするDicF1またはDicF1様アンチセンス分子などの、必須ヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスRNAを提供する。さらに、本発明は、細菌中で発現されるとき、致死剤として作用するために安定性が増加した改変されたアンチセンス構造を提供する。本発明はまた、必須アンチセンス分子を標的とするように設計された毒性のセンス分子を提供する。
【0065】
本発明の別の態様において、毒性剤は、病原菌または細胞の生存に必要なアンチセンスRNAを標的とするセンスRNA分子を含む。例えば、(嗜癖系毒素などの)毒性タンパク質の解毒剤は、毒素の発現を調節するアンチセンス分子の形態であってもよい。このようなアンチセンス解毒剤により、病原菌または細胞は、このような毒素の存在下においても生存することができる。本発明は、センスRNA分子の形態の毒性剤によるアンチセンス解毒剤の抑制を提供する。
【0066】
ある態様において、致死を生ずるために、2つ以上の毒性分子の組み合わせを(大腸菌、緑膿菌等などの)病原菌に送達することができる。この態様において、毒性アンチセンスは同じ標的または異なる標的に向けることができる。病原菌または細胞の異なる標的を標的とする場合には、このような標的は、病原菌の同じ生物経路または異なる生物経路に関与することができる。
【0067】
特定の態様において、アンチセンス配列はDicFに基づいている(Bouche F.ら、1989、Mol Microbiol. 3: 991−4)。このような改変されたDicF配列はDicF1(配列番号:8)と呼ばれる。天然型DicFは、大腸菌(Escherichia coli)内で発現されるとき、細胞分裂の阻止を生ずるシストロン間領域の一部である。この阻止は、DicFmRNAのタンパク質への翻訳を必要とせず、代わりに、DicFRNAは、アンチセンス分子として阻止作用を発揮する。
【0068】
DicFの提案されている標的は、その遺伝子産物が、大腸菌の細胞分裂の阻止に重大な役割を果たすftsZ遺伝子である。ftsZ遺伝子の温度感受性突然変異は、それが、大腸菌の生存に必須であることを示している。機序を限定するわけではないが、DicFRNAは、ftsZmRNAの5’側非翻訳領域に特異的に結合し、それによってftsZタンパク質の発現を阻止すると考えられる。ftsZタンパク質を欠損する細胞は、分裂することができず、最終的に死滅する。DicF相同物は、種々の他の細菌において同定されているが、それらが同様の機能を発揮するかどうかは不明である。
【0069】
本発明は、本発明の抗菌剤または毒性剤として使用され、DicF1またはDicF1様RNAと呼ばれる、改変されたDicF核酸を提供する。DicF1RNAは、内因性DicF1RNAより優れたアンチセンス分子である。それは、ftsZ5’側非翻訳mRNAとの相補性を増加することによって改変されている。従って、標的にさらに特異的であるので、効率が高い。さらに安定な分子を作製するために、オートヘアピン構造がさらに増強された。本発明はまた、病原菌の生活周期または生存に必須の遺伝子産物の発現を調節する際に、DicFと同様の機能を有するヌクレオチド配列などの他の天然型アンチセンス分子の改変を提供する。このような核酸分子はDicF1様分子と呼ばれる。内因性とDicF1は異なり、本発明のDicF1またはDicF1様核酸分子は、マルチ−コピー発現プラスミドからイントランス(in trans)で発現される。さらに、DicF1またはDicF1様核酸分子は、このような発現の強度、時期または分布を制御するために使用することができる種々のプロモーターに機能的に結合することができる。DicF1またはDicF1様核酸分子はまた、リボザイムカセットからイントランス(in trans)で発現される。これらの特徴を組み合わせることにより、(大腸菌)などの病原菌に対する効果的な抗菌剤であるDicF1またはDicF1様核酸分子が得られる。他の態様において、本発明のアンチセンスの配列を改変することにより、種々の他の細菌を標的とすることができる。他の態様において、本発明のアンチセンスの配列を改変することにより、病原菌特異的に標的とすることができる。本発明はまた、相補的RNA標的を有する細菌、細菌感染細胞または他の病原菌の毒性剤として使用することができるDicF1様核酸分子を提供する。
【0070】
5.1.3. アンチセンスオリゴヌクレオチド
標的配列の少なくとも一部と生理的条件下においてハイブリダイゼーションまたはアニーリングするアンチセンスオリゴヌクレオチドも、本発明の組成物および方法に使用するために提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的には、鎖長が短く(例えば、隣接ヌクレオチドまたはそれらの類似物の任意の数は約6〜約50)、当技術上周知の任意の方法によって細胞に送達される(例えば、以下のセクション5.9に記載の例示的な投与方法を参照)。このようなオリゴヌクレオチドは、2’−デオキシ−D−リボースを含有するポリデオキシヌクレオチド、D−リボースを含有するポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、または非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー(例えば、ペプチド核酸またはRNA、以下参照および市販の任意の他の合成配列特異的核酸様ポリマー)またはポリマーが構造中にヌクレオチドを含有し、それによってDNAおよびRNAに見られるような塩基対または塩基スタッキングが可能になる非標準的結合を含むが、これらに限定されない。それらは、2本鎖および1本鎖DNA、ならびに2本鎖および1本鎖RNAおよびDNA:RNAハイブリッド、ならびに全ての既知の種類の改変、例えば、ラベル、「キャップ」、メチル化、1つ以上の天然ヌクレオチドの1つ以上の類似物との置換を含んでいてもよい。追加の既知の改変は、例えば、種々の非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホロトリエステル、ホスホールアミデート、カルバメート等)、荷電結合または含硫黄結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)、側基部分(例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジン等を含むタンパク質上などの)および糖類(例えば、単糖類等)、挿入剤(例えば、アクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等)、アルキル化剤および修飾された結合(例えば、αアノマー核酸等)などの内部ヌクレオチド(internucleotide)改変を含む。
【0071】
ペプチド核酸(PNA)は、本発明の組成物および方法に使用することができる、当技術上周知の核酸誘導体または類似物のまさに一例である。PNAはニールセン(Nielsen)らによって1991年に最初に記載され(1991、Science 254、1497−1500)、負に荷電した糖−リン酸塩骨格の代わりに中性のペプチド様骨格を有する核酸模倣物と記載されている。しかし、DNAおよびRNAに見られるものと同じ窒素塩基(すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン)がPNAに使用されており、PNAはDNAおよびRNAとワトソン−クリック塩基対を形成する。PNAは、DNAポリメラーゼ、核酸結合タンパク質またはプロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む他の酵素の基質と一般に認識されていないが、いくつかの例外が存在する(例えば、Lutzら、1997、J. Am. Chem. Soc. 119、3177−3178参照)。PNAの化学構造は、アミド結合によって結合されたN−(2−アミノエチル)−グリシンの反復単位からなる。窒素塩基は、メチレンカルボニル結合によってこの中性の骨格に結合する。天然の核酸骨格とは異なり、デオキシリボース、リボースまたはホスフェート基は存在しない。結果として、標的核酸とのPNA結合は、従来の核酸の場合より強力であり、結合は実際には塩濃度に無関係である。定量的には、これは、PNAを含有する2本鎖の高い熱安定性によって反映される。
【0072】
PNAは、核酸およびペプチドの合成に使用されるものと同様の化学を使用して、当技術上周知の方法によって合成することができる。このような合成に使用されるPNAモノマーは、ヌクレオシドとアミノ酸のハイブリッドである。PNAオリゴマーの中性の骨格によりいくつかの独自の特性がある。天然の核酸と比較した特性には、(a)高い親和性、(b)早いハイブリダイゼーションおよび(c)塩濃度とは比較的無関係のハイブリダイゼーションがある。一般に、1つ以上のミスマッチを有する天然の核酸と2本鎖を形成した所定のPNAは融点が大きく変化する(すなわち、ΔTm)。PNA産物、提供および技術的支援は、Applied Biosystemsの一部門であるPerSeptive Biosystems, Inc.(www.pbio.com)を利用することができる。例えば、PNAはキットを使用して合成することも、または特注のPNA合成を注文することもできる。PNAオリゴマーは、Fmocまたはt−Boc系モノマーと標準的なペプチド化学プロトコールとを使用して手動で合成することもできる。標準的なペプチド精製条件を使用して、合成後にPNAを精製することができる。
【0073】
種々の広範なPNAの総説が報告されており、その各々は参照として本明細書に組み入れられている(例えば、Nielsenら、1992、「アンチセンス研究および応用(Antisense Research and Applications)」、CrookeおよびLebleu編、CRC Press、363−372頁; Nielsenら、1993、Anti−Cancer Drug Design 8、53−63; Buchardtら、1993、TIB TECH 11、384−386; Nielsenら、1994、Bioconjugate Chem. 5、3−7; Nielsenら、1996、「アンチセンス治療(Antisense Therapeutics)」Vol. 4、Trainor編、SECOM Science Publishers B.V., Lieden、76−84頁; Nielsen、1995、Ann. Rev. Biohys. Biomol. Struct. 24、167−183; HyrupおよびNielsen、1996、Bioorg. Med. Chem. 4、5−23; Mesmaekerら、1995、Curr. Opin. Struct. Biol. 5、343−355; DeuholmおよびNielsen、1997、New J. Chem. 21、19−31; KundsenおよびNielsen、1997、Anti−Cancer Drug 8、113−118; Nielsen、1997、Chem. Eur. J. 3、505−508; Corey、1997、TIB TECH 15、224−229; NielsenおよびOrum、1995、「分子生物学:現行の革新および将来の動向(Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends)」、Part 2、Horizon Scientific Press、73−89頁; NielsenおよびHaaima、1997、Chem Soc. Rev.、73−78;Orumら、1997、「核酸増幅技術:疾患診断への応用(Nucleic Acid Amplification Technologies: Application to Disease Diagnostics)」、Leeら編、Bio Techniques Books Div.、Eaton Publishing、29−48頁を参照)。
【0074】
5.1.4. DNAzyme
DNAzymeは、その全てが参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、ウスマニ(Usman)らに付与された米国特許第6,159,714号、Sunらに付与された国際公開公報第00/09673号およびJoyceらに付与された米国特許第5,807,718号を含む、種々の文献に記載されている。この用語が本出願において使用されるとき、DNAzyme(触媒DNA酵素またはデオキシリボザイムとしても当技術上周知である)は、ヌクレオチド塩基配列特異的に別個の標的RNA分子を切断する(好ましくは、反復的に切断する)ことができる酵素活性を有するキメラDNA分子またはRNA不含DNA分子である。
【0075】
DNAzymeは、最初に、標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、RNA基質に近接している、DNAzymeのDNA結合部分を介してこの部分に生じる。次いで、DNAzymeの触媒配列が標的RNAを切断する。従って、DNAzymeは最初に相補的な塩基対を介して標的RNAを認識して、次いで結合し、適切な部位に一旦結合したら、酵素的に作用して、標的RNAを切断する。このような標的RNAの戦略的な切断は、コードされているタンパク質を合成しようとする能力を破壊する。DNAzymeがそのRNA標的に結合して切断したら、DNAzymeはそのRNAから放出され、遊離して、別の標的と結合する。従って、1つのDNAzyme分子は新たな標的と反復的に結合し、切断することができる。
【0076】
一般に、DNAzymeは、基質結合領域において特定の遺伝子標的配列と相補性を有し、RNA標的配列を特異的に切断することができるDNA分子である。すなわち、DNAzyme分子はRNAを分子内切断することができ、それによって標的RNA分子を不活性化することができる。所定のDNAzymeの相補的な配列は、標的RNAにDNAzymeが十分にハイブリダイズして切断を生じさせる働きをする。100パーセントの相補性が好ましいが、50〜75%程度の相補性も本発明に有用である。特に、ミスマッチは、切断領域に隣接していない標的認識部位内に残ることがある。
【0077】
DNAzymeの触媒中心は、RNA基質に対する酵素活性を有する数多くの可能な配列のいずれかから選択することができる。一態様において、触媒中心の配列は、
(配列番号:)である。他の触媒中心の配列は、例えば、Joyceらに付与された米国特許第5,807,718号に開示されている。
【0078】
5.1.5. アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeおよびそれらの3’末端および/または5’末端が改変された類似物
3’末端および/または5’末端が改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、ロッシャー(Rosch)らに付与された米国特許第5,750,669号に記載されている。これらのオリゴヌクレオチドの特徴的な構造の改変は、3’末端のヌクレオチド内結合が改変されており、すなわち、生物的な3’−5’結合の代わりに3’−3’結合が存在するということである。この小さな構造の改変でも、ヌクレアーゼ分解からこのような化合物を安定させるのには十分である。チミジン、シトシン、グアノシンまたはアデニンなどの逆位塩基を使用することができるが、他の塩基も可能である。このわずかな構造の改変によって、未改変のオリゴヌクレオチドとほぼ同じハイブリダイゼーション挙動を生じる。この改変により、これらの化合物は一般に遺伝子発現の阻害剤として利用可能になる。本発明のDNAzymeはまた、3’末端に上記に開示されている改変を有することもある。
【0079】
5.1.6. 核酸の相同性
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルの相同性または同一性は、配列の類似性検索のために適合されているプログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxによって使用されるアルゴリズムを使用したBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析を含む、当業者に周知の任意の方法によって判定することができる(Karlinら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2264−2268およびAltshul、1993、J. Mol. Evol. 36、290−330、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている)。BLASTプログラムに使用される方法は、最初に質問配列とデータベース配列との類似したセグメントを考慮し、次いで同定されている全ての整合の統計的有意さを評価し、最後に予め選択しておいた有意さの閾値を満足する整合だけをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題に関する考察は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Altschulら、1994、Nature Genetics 6、119−129を参照。本出願の目的のためには、ヒストグラム(histogram)、記述(description)、アライメント(alignment)、予想(expect)(すなわち、データベース配列との整合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ値(cutoff)、行列(matrix)およびフィルター(filter)の検索パラメーターをデフォルト設定に使用することができる。blastp、blastx、blastn、tblastnおよびtblastxによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Henikoffら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、10915−10919)。blastnでは、スコアリングマトリックスは、N(すなわち、ミスマッチ残基のペナルティスコア)に対するM(すなわち、整合している残基対のリワードスコア)の比で設定され、MおよびNのデフォルトスコアは、それぞれ、5および−4である。4つのblastnパラメーターは以下のように調整された:Q=10(ギャップ形成ペナルティ)、R=10(ギャップ伸長ペナルティ)、wink=1(質問配列の全てのwink番目の位置においてワードヒット(word hit)を形成する)およびgaps=16(ギャップを入れた整列が形成されるウィンドウ幅を設定する)。相当するBlastpパラメーターの設定は、Q=9、R=2、wink=1およびgaps=32であった。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間のベストフィット(Bestfit)比較は、DNAパラメーターGAP=50(ギャップ形成ペナルティ)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティ)を使用し、タンパク質比較の相当する設定はGAP=8およびLEN=2である。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、本出願の開示の標的部位と少なくとも約70%一致する配列である。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、さらに好ましくは、本出願の開示内容に同定されている標的部位と、少なくとも75%または80%または85%または86%または87%または88%または89%または90%または91%または92%または93%または94%または95%または96%または97%または98%または99%一致する。例えば、配列番号:AHおよび配列番号:AMとして同定された標的配列は、関連のHPV株の相同配列である(それぞれ、HPV16およびHPV11)。結果として、関連HPVまたはHBV株の標的部位はそれらの相同性に基づいて同定可能である。相同部位は、関連ウイルスのタンパク質配列を整列させ、ついで相同または対応する標的部位を見つけるために、基礎となる核酸配列を整列させることによっても同定することができる。
【0080】
5.1.7. リボザイム
本発明は、本発明の毒性剤以外に、トランス作用性リボザイムを使用することができる方法を提供する。さらに、マルチリボザイムを、毒性剤またはトランス作用性リボザイムの1つ以上の発現系として使用することができる。本発明のこれらのリボザイムは、例えば、組織特異的疾患を破壊するため、または細菌、ウイルスもしくは寄生虫感染症を治療するために使用することができる。本発明のリボザイムは1つ以上のマルチリボザイムを含んでいてもよい。
【0081】
本発明によると、マルチリボザイムは1つ以上のリボザイムまたは1つ以上のリボザイムカセットを含んでいてもよい。各カセットは触媒中心(例えば、1つ以上のトランス作用性リボザイムを含有するか、または1つ以上の毒性剤を含有する)と1つ以上の隣接領域からなる。触媒中心は、病原菌特異的標的を特異的に抑制することによって、病原菌を標的とすることができる。触媒中心は、(疾患特異的標的などの)組織特異的標的を特異的に抑制することによって、(異常細胞などの)細胞を標的とすることができる。さらに、以下の項に記載するように、本発明のマルチリボザイムは、細胞もしくは組織特異的または病原菌特異的に、細胞へ毒性剤を送達し、(アンチセンスRNA、毒性遺伝子産物を含む)本発明の毒性剤を発現する手段を提供する。一態様において、リボザイムカセットは、5’側自己触媒的切断リボザイム配列、トランス作用性リボザイムを含むコア触媒リボザイム、および3’側自己触媒的切断リボザイムから構成されていてもよい。別の態様において、マルチリボザイムは、増強された5’側および3’側自己触媒的切断リボザイム配列を含むカセットを含む。別の態様において、マルチリボザイムは1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有する。このようなトランス作用性リボザイムは同一RNAの同一部位、同一RNAの異なる部位または異なるRNAに向けられていてもよい。従って、本発明のトランス作用性リボザイムは病原菌特異的RNAまたは組織特異的RNAを標的とすることができる。
【0082】
本発明はまた、マルチリボザイムと、細菌感染症などの疾患を治療するための、組織特異的または病原菌特異的にRNAを標的とするそれらの用途とを提供する。本発明は、1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有するマルチリボザイムを提供する。トランス作用性リボザイムは標的特異的に作用するので、ある態様では、毒性剤の用途を増強するために、(細菌などの)病原菌または(異常細胞などの)選択された細胞に作用することができる。本発明によると、マルチリボザイムは、a)5’側および3’側自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイム、b)5’側または3’側自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイムまたは毒性剤、あるいはc)5’側および3’側自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムの一方もしくは両方が隣接したマルチ−トランス作用性リボザイムおよび/またはマルチ毒性剤を含んでもよい。例えば、特定の態様において、本発明は、第1のトランス作用性リボザイムがHBV標的を切断し、第2のトランス作用性リボザイムがHCV標的を切断する、2つのトランス作用性リボザイムを有するマルチリボザイムを提供する。この態様では、例えば、肝臓特異的プロモーターとの機能的な結合によって、このようなマルチリボザイムの発現を肝臓に標的とすることが望ましいことがある。従って、本発明のマルチリボザイムは、細菌または細菌感染細胞または組織に1つ以上の毒性剤を送達することができる。本発明によると、マルチ−トランス作用性リボザイムは同一RNAの同一部位、同一RNAの異なる部位または異なるRNAを標的とすることができる。本発明によると、マルチ毒性剤は、(細胞RNAまたはタンパク質などの)同一標的の同一部位、同一標的の異なる部位または異なる標的を標的とすることができる。
【0083】
本発明のリボザイムは、標的としたRNAのRNAを不活性化するのに十分な触媒能力を有する。抗菌的な見地からは、mRNAのホスホジエステル結合を切断することによって、分子が遺伝子発現を触媒作用により不活性化するので、ハンマーヘッド型リボザイムが本質的に好ましい。さらに、ハンマーヘッド型リボザイムは分子内またはトランスデューサ(トランス)作用性状態で機能するように再操作されている(Haseloffら、1988、Nature 334(6183): 585−91; Uhlenbeck, O.C.、1987、Nature 328(6131):59)。リボザイムの触媒活性は十分な濃度の2価陽イオン、Mg2+と基質を必要とする。基質は、切断部位が認識エレメントNUX(ここで、Nは任意のヌクレオチドであり、Uはウラシルに相当し、XはG以外の任意のヌクレオチドである)を含有する限り、任意の配列を有していてもよい(Koizumiら、1989、Nucleic Acids Resonant. 17(17): 7059−71)。リボザイムはインビボにおいて機能することが広範に証明されている(Christoffersenら、1995、J. Med. Chem.38(12): 2023−37; Inokuchiら、1994、J. Biol. Chem. 269(15): 11361−6)。本発明は、リボザイムカセットからなるマルチリボザイムを構築することによって、最初に設計されたハンマーヘッド型リボザイム(Tairaら、1991、NAR 19(9): 5125−5130)を改善している。リボザイムカセットは、標的としたRNAを不活性化するリボザイムに隣接している1つ以上のシス作用性ハンマーヘッドリボザイムと、1つ以上の隣接配列とを含有する。転写の結果、標的とされたリボザイムは、非特異的相互作用を減少することによってその特異性の改善だけでなく、その触媒活性も改善した60〜70塩基の転写物として放出される。本発明は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第5,824,519号、PCT公開公報国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第97/17433号、国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第99/67400号に記載されているリボザイムの改変および用途を含む。
【0084】
5.2. 毒性剤またはリボザイムをコードする核酸
本発明はまた、本発明のリボザイムおよび/または毒性剤をコードする核酸および発現カセットを提供する。これらの核酸は、選択された部位において本発明のリボザイムまたは毒性剤を発現するために使用することができる。部位は、組織特異的な癌または疾患を治療する場合には組織特異的であってもよく、または感染症(例えば、肝炎、ヘルペス、マラリア、結核、細菌感染症等)を治療するためには、感染菌の増殖を抑制するリボザイムまたは毒性剤の場合には病原菌特異的であってもよい。本発明は、標的特異的である毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を提供する。本発明はまた、組織特異的または病原菌特異的プロモーターに機能的に結合する毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を提供する。
【0085】
マルチリボザイムをコードする配列を構築するためにはいくつかの選択肢がある:1)同一病原菌の異なる標的に向かうリボザイム、2)同一リボザイムの複数のコピー、3)複数の標的に向かう複数のリボザイムおよび4)同一標的の異なる部位に向かう複数のリボザイム。毒性剤をコードする配列を構築するためにもいくつかの選択肢がある:1)同一病原菌の異なる標的に向かう毒性剤、2)同一毒性剤の複数のコピー、3)複数の標的に向かう複数の毒性剤および同一標的に向かう複数の毒性剤。さらに、毒性剤およびリボザイムを種々の方法で組み合わせることができ、例えば、マルチリボザイムと毒性剤をコードする核酸とを1つのプロモーターの制御下において1つの構築物に操作することができる。プロモーターは、本明細書に記載されている特性のレベルを選択することができる。
【0086】
本発明の核酸は、本発明の1つ以上の毒性剤をコードする。従って、本発明の毒性タンパク質をコードする核酸は、嗜癖系毒素を含むが、これらに限定されない。本発明は、改変されて増強された嗜癖系毒素を提供し、特定の標的病原菌にさらに毒性またはさらに特異的であるように操作されている。本発明は、病原菌の生存に重大な役割を果たす、または病原菌の生活周期に必須である遺伝子のRNAを標的とするアンチセンス分子をコードする核酸を提供する。本発明にはまた、病原菌の必須遺伝子産物の発現を調節する天然型アンチセンス分子の改変を含む核酸が含まれる。
【0087】
本発明の核酸は、本発明のアンチセンス分子をコードするものに関する。本発明は、改変されて増強されたアンチセンスを提供し、増強された安定性、標的RNAとの増強された相補性または標的RNAもしくは標的病原菌に対する増強された特異性を有する。本発明はまた、病原菌の生活周期または生存に必須の遺伝子産物の発現を調節する際にDicFと同様の機能を有するヌクレオチド配列などの、改変された天然型アンチセンス分子をコードする核酸を提供する。
【0088】
本発明の核酸は、必須アンチセンス分子を標的とすることができるセンスRNA分子をコードする核酸に関する。
【0089】
ccdB、kid、perK、parE、doc、higB、chpAK、chpBK、kicB、hoc、srnB’、flmA、pmdA、relF、gef、kilA、kilB、kilC、kilE、traL、traE、sigB、hok、pemK、リソスタフィンおよびkikAからなる群より選択される毒性剤をコードする核酸が提供される。毒性剤DicF1またはDicF1様をコードする核酸が提供される。
【0090】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、a)標的RNAを切断する触媒配列(「触媒中心」としても知られる)およびb)シス作用性自己触媒的切断リボザイムを含む隣接領域を含む2つの分離可能な機能的領域を含有する触媒マルチリボザイムをコードする。上記のように、触媒中心は1つ以上のトランス作用性リボザイムおよび/または1つ以上の毒性剤からなる。本発明は、2つ以上のトランス作用性リボザイムを含有する内部標的リボザイムをコードする核酸を提供し、別個のトランス作用性リボザイムの各々は同一または異なる標的RNA分子を標的とすることができる。核酸の相補性によって、結合部位はリボザイム中心に向かい、標的RNA分子の特異的部位を切断する。隣接する配列の鎖長は、特異性だけでなく、個々のリボザイム分子の切断効率にも関係を持つ。本発明の触媒リボザイムでは、隣接する配列は標的RNAに特異性が高いが、切断が生じると、標的RNAから容易に分離することができる。これにより、リボザイムはサイクリング(cycling)し、有効であることが必要なリボザイムの量を低下する。16〜21 Kalの範囲の結合/分離値が有効であると予想される。本発明は、2つ以上の毒性剤をコードする核酸を提供し、毒性剤の各々は同一または異なる標的分子を標的とすることができる。
【0091】
本発明はさらに、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸および発現カセットを提供する。これらの核酸は、選択された部位において本発明の毒性剤および/またはリボザイムを発現するために使用することができる。一態様において、核酸は、毒性剤に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、本発明の核酸および発現カセットは、1つ以上の標的RNA特異的トランス作用性リボザイムおよび1つ以上の毒性剤を含む触媒リボザイムをコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、毒性剤をコードする配列由来の病原菌特異的プロモーターを含む。別の態様において、本発明の核酸および発現カセットは、5’側自己触媒的切断リボザイム配列、1つ以上の標的RNA特異的トランス作用性リボザイムおよび/または病原菌特異的毒性剤を含む触媒リボザイム、ならびに3’側自己触媒的切断リボザイム配列、をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む。本発明によると、発現カセットは、同一または異なる標的に作用するトランス作用性リボザイムを含有する2つ以上のマルチリボザイムを発現するように操作することができる。発現カセットはまた、切断活性が遅い、または増強されている5’側および3’側自己触媒的切断リボザイムを含有する2つ以上のマルチリボザイムを発現するように操作することができる。
【0092】
本発明の発現カセットまたは本発明の毒性剤をコードする核酸は、当技術上周知のいかなる好適な(バクテリオファージ伝達プラスミド、細菌プラスミドまたは真核細胞発現プラスミドなどの)プラスミドに配置することができる。本発明はまた、本発明により使用するための新規かつ改変されたプラスミドを提供する。
【0093】
分子遺伝学的レベルでは、本発明の毒性剤、リボザイムまたはマルチリボザイムのコード配列は、以下の遺伝子エレメントの1つ以上の制御下におくことができる:標的とされる微生物の天然型で、強い、中程度もしくは弱い構成的発現プロモーターもしくは調節プロモーター、または望ましいレベルのリボザイムおよび/もしくは毒性剤発現を与える、強い、中程度もしくは弱いコンセンサス配列を含有する人工的に考案された構成的発現プロモーターもしくは調節プロモーター。本発明は、病原菌特異的であるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、本発明の毒性剤の病原菌特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、組織特異的であるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、本発明の毒性剤の組織特異的な発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。従って、本発明は、病原菌特異的であるプロモーターエレメントをコードする核酸を提供する。本発明は、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原菌特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、組織特異的であるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの組織特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。
【0094】
一態様において、核酸は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、少なくとも1つの自己触媒的リボザイムおよび1つ以上のトランス作用性リボザイムをコードする配列に機能的に結合した組織特異的または病原菌特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、少なくとも1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的または病原菌特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、少なくとも1つの自己触媒的リボザイムおよび1つ以上のトランス作用性リボザイムおよび1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む。本発明によると、本発明のトランス作用性リボザイムおよび/または毒性剤は同一または異なる標的に作用することができる。
【0095】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする新規ベクターまたはプラスミドを提供する。本発明の新規ベクターは、組織特異的、病原菌特異的、プロモーター特異的、抗菌特異的、抗ウイルス特異的、抗癌特異的、抗腫瘍特異的または標的特異的を含むが、これらに限定されない多種多様の毒性剤および/またはリボザイムを操作するために使用することができる。本発明はまた、細胞または病原菌のベクターまたはプラスミドの複製の特異性を調節するベクターまたはプラスミドの複製起点に関する。本発明はまた、毒性剤および/またはリボザイムの用量を調節するための、選択された細胞または病原菌中のベクターまたはプラスミドのコピー数に関する。
【0096】
特定の態様において、本発明は、毒性タンパク質をコードする新規プラスミドを提供する。別の特定の態様において、本発明は、突然変異体バクテリオファージpac部位または突然変異体バクテリオファージpacABC配列をコードする新規プラスミドを提供する。
【0097】
5.2.1. 真核細胞および原核細胞発現ベクター
本発明は、本発明の毒性剤および/またはマルチリボザイムを発現させるために使用することができる、発現系、真核細胞および原核細胞発現ベクターを含む。本発明の毒性剤をコードする核酸を含有するDNA発現ベクターおよびウイルスベクターは、当技術上周知の技法を使用した組換えDNA技術によって作製することができる。従って、毒性剤および/またはマルチリボザイム配列をコードする核酸を発現させることによって、本発明の発現ベクターおよびウイルスベクターを作製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を使用して、遺伝子産物をコードする配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えDNA技法、合成技法およびインビトロ遺伝子組換えを含む。例えば、サムブルック(Sambrook)ら、1989, 上記およびオウスベル(Ausubel)ら、1989、上記に記載されている技法を参照。または、毒性剤および/またはリボザイム配列をコードすることができる核酸は、例えば、合成装置を使用して化学的に合成することができる。例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」、1984、Gait, M.J.編、IRL Press、Oxfordに記載されている技法を参照。
【0098】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムを発現するために使用することができる。このような宿主発現系は、本発明の毒性剤またはリボザイムをコードする配列をインビボおよびインビトロにおいて細胞、組織または病原菌に導入することができる媒体であるが、配列をコードする適当なヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされたとき、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを発現することができる細胞でもある。これらは、選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物;選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia));選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;選択された毒性剤および/もしくはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させた、もしくは選択された毒性剤および/もしくはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;あるいは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)を含むが、これらに限定されない。
【0099】
5.3. 毒性剤の送達および発現
本発明はまた、本発明の毒性剤またはリボザイムを送達するための新規媒体を提供する。本発明は、コード配列を発現させる調節エレメントが機能的に結合した上記のコード配列のいずれかを含有するDNA発現ベクターおよびウイルスベクターと、宿主細胞または病原菌においてコード配列またはRNAを発現させる調節エレメントが機能的に結合した上記のコード配列のいずれかを含有する遺伝子操作された宿主細胞とを含む。本発明の主要な点は、標的とした微生物または病原菌に毒性剤および/またはリボザイムを送達するために使用する方法である。一方は性質が生物的で、他方は非生物的である、2つの別個のクラスの送達系を製造することができる。
【0100】
従って、本発明はまた、非生物的または生物的な系によって、細胞または病原菌に本発明の毒性剤を送達することを提供する。本発明は、不活性化され、変更され、または改変されたウイルス(ビリオン)またはバクテリオファージ送達媒体によって、標的微生物に特異的な基礎的および必須の細胞過程にリボザイムおよび/または毒性剤を1つ以上送達するための方法および組成物を開発することによって得られたものの組成物を提供する。本発明はまた、標的微生物に、毒性剤および/またはリボザイムを含む核酸を送達することができる非生物送達媒体を提供する。
【0101】
5.3.1. 生物送達媒体
本発明の生物送達媒体は、一般的な形質導入粒子がウイルス送達媒体由来のDNAを欠損しているということ、またはウイルス送達媒体由来のDNAを導入する能力が低いということを利用している。本発明の好ましい態様において、ウイルス送達媒体はバクテリオファージまたは改変されたバクテリオファージである。一態様において、このようなウイルスまたはバクテリオファージ粒子だけが宿主起源の配列を含有する。他の態様において、このような粒子は、送達される毒性剤またはリボザイムをコードする操作されたプラスミド/ベクターを含有する。他の態様において、このような粒子は、送達される毒性剤またはリボザイムをコードする操作されたプラスミド/ベクターを含有し、送達媒体由来のDNAを移入する送達媒体の能力を不活性化する突然変異を含有する。結果として、本発明は、毒性剤および/またはリボザイムの望ましいレベルの発現を保証する必要な遺伝子エレメントを含有する核酸の周囲に、ウイルスの頭部タンパク質(抗菌治療のためのパッケージング構成要素)の生物集成物を使用する。本発明の重要な特徴は、ウイルス送達を用いる毒性剤またはリボザイムとプラスミドの特徴の独自の組み合わせを使用したビリオンの集成の組み合わせである。
【0102】
好ましい一態様において、本発明は、本発明の毒性剤を送達するバクテリオファージを提供する。本発明のバクテリオファージは、1つ以上の毒性遺伝子産物、タンパク質、アンチセンスRNA、センスRNAまたはそれらの組み合わせなどの、本発明の1つ以上の毒性剤を送達するように構築することができる。本発明の別の態様において、宿主細胞は、病原菌特異的毒性剤またはリボザイムを発言するように構築することができる。本発明のよりさらに別の態様において、宿主細胞は、本発明に使用するプロモーターのリプレッサーを発現するように構築することができる。
【0103】
他の態様において、宿主細胞は、毒性剤の解毒剤を過剰発現するように操作して宿主細胞を毒性から保護することができ、産生株または製造株として使用できる。
【0104】
本発明はまた、バクテリオファージ、ウイルスベクター等などの毒性剤および/またはリボザイムを発現させるために使用することができる発現系を含む。例えば、種々のバクテリオファージ系を使用して、本発明の選択されたリボザイムおよび/または毒性剤を発現させることができる。例えば、このようなバクテリオファージ系は、毒性剤および/またはリボザイムをコードする配列をインビボおよびインビトロにおいて標的細菌に導入することができる媒体である。いくつかの態様において、選択された特定のバクテリオファージは、バクテリオファージによって標的とされ、感染させられる細菌の種類を決定する。
【0105】
一態様において、病原菌への毒性剤の送達は、関心のある病原菌を標的とするバクテリオファージまたは他の送達媒体を使用することによる。一態様において、バクテリオファージ(または送達媒体)は、病原菌に、毒性剤または毒性剤をコードする核酸を送達する。特定の態様において、本発明の毒性剤は、病原菌に感染することができる改変されたバクテリオファージによって、細菌細胞に送達される。さらに別の態様において、バクテリオファージは、特定の種または属の細菌に感染する能力について選択され、このような細菌の種または属を宿主から根絶させるための毒性剤を送達するために使用される。好ましい態様において、送達媒体に固有の核酸を送達するには不十分な量しか遺伝情報を含有しないように、送達媒体または送達媒体に固有の核酸を改変する。従って、改変された送達基剤(例えば、ビリオンまたはバクテリオファージ)は、標的細胞または病原菌に、本発明のリボザイムおよび/または毒性剤を送達する分子媒体として働くことができるが、送達媒体に固有の複製可能な核酸を送達しない。または、非生物送達系(例えば、リポソーム)を使用して、リボザイムおよび/または毒性剤の適切な発現に必要で、十分な遺伝子エレメントを保有する核酸をパッケージングすることができる。
【0106】
本発明の毒性剤および/またはリボザイムは、種々の病原菌による感染症を治療するために使用することができる。これらは、細菌などの微生物、寄生虫および真菌を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の態様において、(改変されたバクテリオファージなどの)ウイルス送達媒体によって送達される、本発明の毒性剤は、重症の火傷、嚢胞性繊維症、癌または他の免疫寛容状態に関連する微生物感染症を治療するために使用することができる。
【0107】
5.3.1.1. ウイルスベクターによる送達および発現
本発明によると、多種多様のウイルスおよびウイルスベクターを使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードするヌクレオチド配列を送達することができ、その例をいくつか以下に記載する。これに関しては、種々のウイルスは、特定の病原菌を標的とするために、選択された毒性剤および/またはリボザイムを発現するように遺伝子操作することができる。
【0108】
本発明はまた、非生物的または生物的系によって、細胞または病原菌に、本発明の毒性剤を送達することに関する。特定の態様において、例えば、本明細書に記載されているように、本発明の毒性剤は、病原菌に感染することが可能なバクテリオファージによって細菌細胞に送達される。さらに別の態様において、バクテリオファージは、特定の種の細菌に感染する能力について選択され、宿主からこのような細菌種を根絶するための毒性剤を送達するために使用される。
【0109】
本発明は、本発明の病原菌に特異的に感染する任意のバクテリオファージならびに本発明の病原菌に感染させるために特異的に標的されうる任意のウイルスであってもよいビリオンの用途を提供する。例えば、バクテリオファージは、以下の属の細菌細胞に特異的な、バシラス(Bacillus)、カンピロバクター(Campylobacter)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、エンテロバクター(Enterobacter)、腸球菌(Enterococcus)、エシェリキア(Escherichia)、クレブシェラ(Klebsiella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、シュードモナス(Pseudomonas)、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ビブリオ(Vibrio)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、 エルシニア(Yersinia)等(例えば、「細菌とバクテリオファージのアメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ(the Amerian Type Culture Collection Catalogue of Bacteria and Bacteriophages)」、最新版、Rockville、MD参照)ならびに本発明の細菌に特異的に感染することが現在知られているまたは後に同定される任意の他のバクテリオファージを含んでもよいが、これらに限定されない。本発明はまた、真菌病原菌に特異的に感染するビリオンの用途を提供する。
【0110】
この送達系は、ウイルス粒子にパッケージングされた毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を保有するDNAプラスミドからなる。特異性は、毒性剤および/またはリボザイムのプロモーター駆動性転写およびウイルス媒体の宿主特異性によって与えられる。特性はまた、ベクター複製を制御する複製起点によって与えられる。
【0111】
本発明のビリオンでは、非ウイルスDNAは1つ以上の毒性剤および/または1つ以上のリボザイムをコードすることができる。ビリオンでは、非ウイルスDNAは、1つ以上の毒性剤またはリボザイムをコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的または組織特異的プロモーターを含むことができる。
【0112】
ビリオンによって送達される核酸は、1つ以上の毒性剤および/または1つ以上のリボザイムまたはそれらの組み合わせをコードすることができる。ビリオンは、リボザイムまたは毒性剤、特に本明細書に記載されているものをコードする任意の核酸を含むことができる。
【0113】
バクテリオファージP1
本発明は、毒性剤またはリボザイムを標的細胞に送達するための任意のビリオンの用途を提供する。例えば、大腸菌の一般的なバクテリオファージP1は、数多くの理由により、本発明の好ましい送達媒体である。第一に重要なことは、P1は広域属間および種間範囲を有する(Yarmolinskyら、1988、Mol. Gen. Genet. 113−273−284)。大腸菌のP1受容体は、細菌外膜のリポ多糖類(LPS)コアのリセルグ環の末端グルコースである(「普遍形質導入(Generalized Transduction)」、2421−2441頁、F. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、Vol.2、ASM Press、Washington、DC.)。ヤルモリンスキー(Yarmolinsky)およびステルンバーグ(Sternberg)は、この特定のファージは、大腸菌以外に、多数(>25)の異なるグラム陰性菌に核酸を注入する能力を有することを報告している(Yarmolinskyら、1988、Mol. Gen. Genet. 113: 273−284)。
第2に、P1は、相当量の遺伝情報、大腸菌のDNAの2%(100,000 bp)以上を収容することができる(「普遍形質導入(Generalized Transduction)」、2421−2441頁、F. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、Vol.2、ASM Press、Washington、DC.)。結果として、リボザイムまたは毒性剤の遺伝子量は、毒性剤および/またはリボザイムの倍増によって増加させることができ、毒性剤および/またはリボザイムの殺菌活性を増加することができる。従って、バクテリオファージP1は、送達媒体または分子シリンジとして使用される。1)非病原性固有微生物叢への望ましくない産物(例えば、P1バクテリオファージ由来のDNA)の播種、2)顕著に狭い宿主範囲、3)宿主の細網内皮系による遺伝材料の早急な除去および4)免疫寛容患者では偏共生細菌への溶解感染が制御不能になる可能性があるという問題、をリスクとして有することがある溶解ファージ治療よりもP1には利点がある。これらの態様のうちある態様では、P1送達系は、標的病原微生物に毒性剤を送達するための好ましい送達媒体である。P1送達媒体の別の利点は、宿主に内因性ファージDNAを移入できないようにファージが操作されている場合には、望ましくない産物のファージ媒介性移入が低下または回避されることである。この態様では、ファージ粒子は、標的細菌細胞に伝達プラスミドDNAを注入する。コードされる毒性剤の発現により、微生物の抗生物質への耐性に無関係に、微生物細胞が死滅する。
【0114】
また、インビトロパッケージングを使用する方法も可能である。インビトロパッケージングは、毒性剤またはリボザイム構築物の遺伝情報にPAC部位を添加することにより実施することができる。P1パッケージングは、P1 PAC遺伝子の1つのなかで開始する(Steinberg, N.、1987、J. Mol. Bil. 194(3): 469−79)。活性なPAC部位は、P1 EcoR1断片20の161塩基対のセグメント内に含有されることが報告されている(Steinberg, N.、1987、J. Mol. Bio. 194(3): 469−79)。従ってファージ頭部は、不活性化用のリボザイムおよび/または毒性剤を病原菌に送達する分子シリンジとして働く。
【0115】
本発明の特定の好ましい態様において、毒性剤は伝達プラスミドにコーティングされ、P1バクテリオファージ送達系と関連して使用される。このような伝達プラスミドは、好ましくは、1)複製起点、2)選択マーカー、3)P1 PAC部位を有するPac ABC遺伝子、4)P1溶菌レプリコンおよび5)本発明の1つ以上の毒性剤をコードする核酸(例えば、アンチセンス分子、リボザイムまたは毒性タンパク質等)を含有する。伝達プラスミドは細菌産生細胞において作製することができる(例えば、P1溶菌ファージ)。本発明の好ましい態様において、バクテリオファージP1プラスミド(例えば、P1ファージ前駆体)は、ファージ頭部にパッケージングされないように操作される。この態様では、伝達プラスミドだけがビリオンにパッケージングされる。このようなP1プラスミドパッケージングの阻止は、P1プラスミドがビリオンまたはファージ頭部にパッケージングされないようにする突然変異または欠損をP1プラスミドに導入することによって、実施される。パッケージングを阻止するP1プラスミドの突然変異または欠損は、P1プラスミドPAC部位の1つ以上の突然変異および/または欠損を含むが、これらに限定されない。バクテリオファージP1プラスミドのパッケージングを阻止するP1プラスミドの任意の突然変異および/または欠損は本発明の範囲内である。このような突然変異または欠損は、当技術上周知の標準的な技法によって導入される。いくつかの態様において、P1溶菌ファージは温度感受性リプレッサー突然変異を有する(例えば、C1. 100)。好ましくは、P1溶菌ファージの導入により、パッケージングされた伝達プラスミドだけを含有するP1ファージ頭部が作製される。次いで、パッケージングされた伝達プラスミド核酸を含有するバクテリオファージを使用して、病原菌などの標的細胞に感染することができる。バクテリオファージは、細菌に核酸を注入することによって、病原菌に感染する。従って、バクテリオファージ核酸にコーティングされた毒性剤が細菌に送達される。細菌内で、伝達プラスミド核酸は再び環状化(recircularize)し、毒性剤が細菌内で発現され、毒性および死滅を生じる。欠損および/または突然変異により、本発明の毒性剤またはリボザイムをコードする核酸のパッケージングが可能になるが、1つ以上のウイルス遺伝子またはプラスミドをコードする核酸のパッケージングを抑制するように、同様の突然変異および/または欠損を本発明の他のウイルス送達系に使用することができる。このような方法により、安全性が増加したウイルス送達系が構築される(例えば、本発明の治療に関連して使用する場合)。
【0116】
特定の態様において、本発明は、病原菌標的に感染するP1ビリオンに伝達プラスミドをパッケージング/送達することができるバクテリオファージを提供する。別の特定の態様において、バクテリオファージP1(PAC部位)ノックアウトは伝達プラスミドDNAをパッケージング/送達することができるが、P1 DNAを組み込むことができないので、非病原性の固有微生物叢への望ましくない産物の水平導入を抑制することができる。本発明の別の特定の態様において、ファージ送達系は、抗菌剤をコードする遺伝子を保有する伝達プラスミド、プラスミド複製起点、P1溶菌複製起点および最小PAC部位(図12、配列番号:7に示す最小P1 pac部位などの)を含む。この態様では、プラスミドは、自身のDNAをパッケージングすることができないバクテリオファージP1溶菌ファージ内に維持される。欠損溶菌ファージは、伝達プラスミド上でP1複製起点を活性化するのに必要な全ての複製因子および成熟ビリオンを形成するのに必要な全ての構造的構成要素を提供する。溶菌ファージはまた、C1.100温度感受性リプレッサー突然変異を保有する。C1は、増殖期ファージを生ずる機能の抑制を担う。温度変化によって溶菌ファージを誘導すると、DNAが増幅され、伝達プラスミドがP1ファージ頭部にパッケージングされ、産生株が溶菌される。ビリオンを回収し、伝達プラスミドを病原菌に送達するために使用する。ファージ頭部は伝達プラスミドDNAの複数のコピーを含有し、バクテリオファージの天然の受容体媒介性機序によって病原菌に標的される。送達の結果、プラスミドDNAが再び環状化(recircularize)し、毒性剤が環境、毒性調節的または種特異的プロモーターの制御下において発現すると、細胞死が迅速に生じる。
【0117】
特定の態様において、本発明は、宿主の細菌感染症を治療するために、バクテリオファージ送達系と併用して使用することができる毒性剤をコードする新規伝達プラスミドを提供する。
【0118】
バクテリオファージλ
大腸菌に対して向かうリボザイムおよび/または毒性剤を保有するDNAをパッケージングするバクテリオファージビリオンを使用した系の他の例は、バクテリオファージλである。同様の方法を使用して、他の微生物に対して向かうリボザイムおよび/または毒性剤を送達することができるビリオンを作製する。バクテリオファージλ外被由来のビリオンなどの、DNAをパッケージングするために使用されるビリオンは種特異的であってもよく、または上記のように、バクテリオファージP1由来のビリオンなど、広域宿主範囲を保有していてもよい。種特異的プロモーターは、種特異的で標的とされているRNA配列に対して向けられるリボザイムを転写させるために使用されるので、広域宿主範囲のウイルスは、種特異性を損失せずに、抗菌剤の産生を促進する。例えば、λバクテリオファージは、リボザイムおよび/または毒性剤、プラスミド複製起点、プラスミド維持のための選択マーカー、最小λ複製起点およびDNAをλビリオンにパッケージングするのに必要な、cos部位を保有するプラスミドを使用する。このプラスミドは、組み込み/切断および組換え機能が欠損しているλ溶菌ファージに維持される。欠損溶菌ファージは、プラスミド上でλ複製起点を活性化するのに必要な全ての複製因子および成熟ビリオンを形成するのに必要な全ての構造的構成要素を提供するが、溶菌ファージは、複製して、自身のDNAをビリオンにパッケージングすることができない。溶菌ファージは温度感受性リプレッサー突然変異(cI857など)を保有していてもよい。
【0119】
他のウイルスベクター
レトロウイルスベクターも、インビボおよびエクスビボの両方において遺伝子を宿主細胞に送達するために通常使用される。レトロウイルスベクターは、細胞に入るとき、検出可能な害を生じない極めて効率的な遺伝子送達媒体である。レトロウイルスの核酸は宿主染色体DNAに組み込むことができるので、長期間持続され、子孫に安定して伝播され、このようなベクターは、慢性疾患もしくは遺伝的疾患に関与する細胞遺伝子産物を標的とする、または慢性感染症もしくは持続感染症に関与するウイルス遺伝子もしくは微生物遺伝子または寄生虫遺伝子を標的とするために使用される毒性剤および/またはリボザイムを送達するのに有用であると思われる。適当なレトロウイルスベクターの例は、非分裂細胞に感染し、形質導入するという利点を有するレンチウイルスである。このような態様では、レトロウイルスの機能的補助遺伝子全てが欠損しているプロモーターに機能的に結合したパッケージングRNAベクターゲノムをコードするレンチウイルスベクターを使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードするDNAを移入する。このようなベクターの例は、その各々が参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、国際公開公報第98/17815号、国際公開公報第98/17816号および国際公開公報第98/17817号に記載されている。
【0120】
よりさらに別の態様において、アデノウイルスベクターなどの、非分裂細胞に感染して、形質導入する非組み込みウイルスベクターを使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを送達することができる。アデノウイルスベクターを使用すると、宿主細胞ゲノムの永久的な変更、または 挿入突然変異の促進に関連したリスクが回避されるので、アデノウイルスベクターは、いくつかの利点を有する。アデノウイルスは、開発された中で最良の非組み込み型ウイルスベクターの1つで、75 kb以下の発現カセットを導入するために使用することができる。組換えアデノウイルスは非常に高い力価で作製することができ、感染性が高く、多種多様の非複製細胞および複製細胞に遺伝子を効率的に導入し、インビボにおける哺乳類の遺伝子導入に理想的である。
【0121】
アデノウイルス系ベクターは比較的安全で、望ましい毒性剤および/またはリボザイムをコードするように操作することができると同時に、通常のウイルスの生活周期において複製する能力に関しては不活性化することができる。アデノウイルスは気道上皮に天然の親和性を有する。従って、アデノウイルス系ベクターは、呼吸器遺伝子治療適用に特に好ましい。特定の態様において、アデノウイルス系遺伝子治療ベクターはアデノウイルスの2つのセロタイプのゲノムを含み、ウイルス複製の早期段階に関与する、ElaおよびElbのゲノムは、関心のあるヌクレオチド配列が欠損および置換されている。さらに別の態様において、アデノウイルス系遺伝子治療ベクターは、アデノウイルス早期領域(E4)の必須オープンリーディングフレーム(ORF3またはORF6)だけを含有し、他のE4オープンリーディングフレームは全て欠損しているか、またはE3領域の欠損をさらに含むこともある(例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第5,670,488号参照)。別の態様において、使用されるアデノウイルス系治療ベクターは、有害なウイルス遺伝子を含有せず、約36 kbの外来遺伝材料の理論的容量を有する、シュード−アデノウイルス(pseudo−adenovirus(PAV))であってもよい。
【0122】
別の態様において、アデノ関連ウイルス(AVV)系を使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを送達することができる。AAVは広域宿主範囲を有し、ヘルパーウイルスを必要としないAAVベクターが現在設計されている。このようなベクターの例は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、国際公開公報第97/17458号に記載されている。
【0123】
大きい断片のDNAが容易にゲノムにクローニングされ、組換え弱毒化ワクシニア変種が記載されいてるので(Meyerら、1991、J. Gen. Virol. 72: 1031−1038)、ワクシニアウイルスベクターを本発明により使用することができる。インフルエンザを含むオルソミクソウイルス(Orthomyxovirus);呼吸器発疹ウイルスおよびセンダイウイルス(Sendai virus)を含むパラミクソウイルス(Paramyxovirus);ならびにラブドウイルス(Rhabdovirus)は、弱毒化表現型を生ずる突然変異を発現するように操作することができる(1996年11月26日に付与された、米国出願番号第5,578,473号参照)。これらのウイルスゲノムはまた、本発明の選択された毒性剤および/またはリボザイムなどの外来ヌクレオチド配列を発現するように操作することができる(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、1992年11月24日に付与された米国出願番号第5,166,057号参照)。インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルス、シンドビスウイルスおよびポリオウイルスにおいて証明されているように(Paleseら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11354−11358)、弱毒化表現型を生ずる突然変異を導入するように、負鎖および正鎖RNAウイルスゲノムを操作するために逆遺伝子技法を適用することができる。これらの技法はまた、本発明により使用される組換えウイルスベクターを作製するための、外来DNA、すなわち、選択された毒性剤および/またはリボザイムを導入するために使用することができる。また、毒性剤および/またはリボザイムを発現するために、弱毒化されたアデノウイルスおよびレトロウイルスを操作することができる。従って、本発明のリボザイム送達媒体を設計するために、多種多様のウイルスを操作することができる。
【0124】
毒性剤および/またはリボザイムを組織特異的に発現するために、本発明のウイルスベクターを操作することができる。例えば、癌胎児性抗原(LEA)のプロモーターは乳癌、肺癌および結腸直腸癌に平行して発現されるが、健康な組織ではほとんど発現されない。肝癌を標的とするためには、α−フェトプロテイン(AFP)プロモーターの活性は悪性細胞に限定されている。増殖中の細胞は、増殖中の内皮細胞を優先的に標的にできることが示されているflt−1プロモーターで標的とすることができる。参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Millerら、1997、Human Gene Therapy 8: 803−815を参照。
【0125】
5.3.2. 非生物送達媒体
1つ以上の毒性剤および/またはリボザイムの非生物送達は、毒性剤および/またはリボザイムをリポソームにコーティングする遺伝子を保有するパッケージングプラスミドDNAを含む種々の方法によって、または毒性剤および/またはリボザイムをコードする遺伝子を保有するプラスミドDNAと脂質またはリポソームとを複合体として、DNA−脂質またはDNA−リポソーム複合体を形成することによって実施される。リポソームは、インビトロにおいて細胞をトランスフェクトするために通常使用される陽イオンおよび中性脂質を含む。陽イオン脂質はプラスミドDNAと複合体を形成して、リポソームを形成する。
【0126】
a)5’側自己触媒的切断リボザイム配列、b)標的RNA特異的結合部位を含む触媒リボザイム、およびc)3’側自己触媒的切断リボザイム配列、を含むトランス作用性リボザイムをコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む核酸が含まれているリポソームを提供する。
【0127】
1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターをコードする核酸を含むリポソームが提供される。
【0128】
核酸が、2つ以上のトランス作用性リボザイムおよび/または2つ以上の毒性剤をコードする、本発明のリポソームを提供する。リポソームは、任意のリボザイムをコードする核酸または任意の毒性剤をコードする核酸、特に本明細書に記載されているものを含んでいてもよい。このような核酸は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターに機能的に結合することができる。
【0129】
本発明のリポソーム送達系は、a)5’側自己触媒的切断リボザイム配列、b)標的RNA特異的結合部位を含む触媒リボザイム、およびc)3’側自己触媒的切断リボザイム配列、を含むマルチリボザイムをコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む核酸を送達するために使用することができる。
【0130】
本発明のリポソーム送達系は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む核酸を送達するために、使用することができる。本発明のリポソーム送達系は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む核酸を送達するために、使用することができる。
【0131】
陽イオンおよび中性リポソームは本発明によって考慮されている。陽イオンリポソームは、これらの成分を混合し、それらを荷電により結合させることによって、負に荷電した生物活性分子(例えば、DNA)と複合体を形成することができる。陽イオンリポソームは、生物活性分子が核酸である場合には、核酸の負荷電のために特に有用である。陽イオンリポソームの例には、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクテース(lipofectace)およびDOTAP(Hawley−Nelsonら、1992、Focus 15(3): 73−83; Felgnerら、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413; Stewartら、1992、Human Gene Therapy 3: 267−275)が挙げられる。物質を入れた陽イオンリポソームを形成する手法は当技術上標準的で(Nicolauら、1987、Methods Enzymol. 149: 157)、本発明の複合体を入れるために、当業者によって容易に使用することができる。
【0132】
本発明のよりさらに別の態様において、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする遺伝子を保有するプラスミドDNAは、全身送達および遺伝子発現を増加するために改善された方法を使用してリポソームと複合体を形成する(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Templetonら、1997、Nature Biotechnology 15: 647−652)。本発明によると、陽イオン脂質の改善された製剤は、インビボにおける長い半減期と特定の組織をインビボにおいて標的とする手法を用いて、宿主細胞へのDNA送達効率を大幅に増加する。例えば、これらに限定されないが、肝臓等への送達が実質的に増大される、肝臓特異的タンパク質などの外側の脂質二重膜にペプチドおよびタンパク質を操作することができる。
【0133】
本発明の一態様において、全身送達ならびにインビボおよびエクスビボにおける遺伝子送達は、市販の陽イオン脂質、例えば、ジメチルジジオクタデクルアンモニウムブロミド(dimethyldioctadeclammonium bromide)(SSAB)、生物分解性脂質1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)を使用して最適化される。これらのリポソームは中性脂質、例えば、全身送達のために通常使用される2つの中性脂質であるL−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)またはコレステロール(Chol)と混合することができる。DNA:リポソーム比は、当業者によって使用される方法を使用して最適化することができる(例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Templetonら、1997、Nature Biotechnology 15: 647−152)。
【0134】
本発明のさらに別の態様において、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を保有するプラスミドDNAは、複数の正荷電を保有し、インビボおよびエクスビボにおいて遺伝子導入を実施するために使用される分子である、ポリ陽イオンにより送達することができる。ポリエチレンイミン(polyethilenimine)などのポリ陽イオンは、インビボおよびエクスビボにおいて遺伝子導入を成功させるために使用することができる(例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Bolettaら、1996、J. Am. Soc. Nephrol. 7: 1728)。
【0135】
リポソームは、局所適用用軟膏に組み入れられても、膿瘍に注射することができる溶液などの他の形態で送達されても、または全身送達されても、またはエアゾールによって送達されてもよい。
【0136】
以下の理由により、リボザイムまたは毒性剤で実施するのではなく、リボザイムまたは毒性剤をコードするプラスミドDNAが使用される。プラスミドDNAにより標的細胞は毒性剤またはリボザイムを産生することができ、従ってリポソームによりリボザイムRNAまたは毒性剤を送達することによって期待されるより、細胞への送達量が大量になる。DNAはまた、標的配列特異性に基づいた作用の特異性を提供する。リポソームは、宿主の細胞を含む、投与領域の任意の細胞にDNAを送達する。毒性剤またはリボザイムの転写を駆動するプロモーターは標的とされた微生物に特異的であるので、他の細胞種では不活性である。従って、毒性剤またはリボザイムをコードするDNAのリポソーム送達は増殖および特性を提供する。本発明は、病原菌特異的または組織特異的であるプロモーターエレメントに関する。このようなプロモーターエレメントは、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原菌特異的または組織特異的発現を達成するために使用される。本発明はまた、複製の特異性または細胞もしくは病原菌におけるベクターもしくはプラスミドのコピー数を調節する複製起点の使用に関する。
【0137】
5.3.2.1. マルチリボザイムを使用した送達および発現
本発明の別の態様において、毒性剤の発現は、組織特異的、病原菌特異的および/または標的特異的リボザイムまたはリボザイムカセットによって駆動される。本発明は、触媒作用において標的RNA特異的であり、発現において組織特異的または病原菌特異的である独自の特徴を有するリボザイムを提供する。リボザイムは、組織特異的疾患を治療する場合には組織特異的であってもよく、または大腸菌などの病原菌を治療する場合には、病原菌特異的であってもよい。マルチリボザイムは1つ以上の標的特異的リボザイム(例えば、トランス作用性触媒リボザイム)ならびに組織特異的または病原菌特異的発現を制御するエレメントを有することができる。
【0138】
一態様において、本発明の核酸は、a)5’側自己触媒的切断リボザイム配列、b)標的RNA特異的結合部位を含む触媒リボザイムおよびc)3’側自己触媒的切断リボザイム配列、をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。
【0139】
リボザイム産生構築物における組織特異的プロモーターにより、選択されたプロモーターからRNAに活発に転写する組織においてリボザイムが組織特異的に発現される。従って、このプロモーターを使用する組織の標的RNAだけがこのリボザイムによって切断される。
【0140】
さらに、本発明によると、マルチリボザイムは1つ以上のリボザイムカセットからなってもよい。各カセットは触媒中心および1つ以上の隣接配列からなっていてもよい。一態様において、リボザイムカセットは、5’側自己触媒的切断リボザイム配列、トランス作用性リボザイムを含むコア触媒リボザイムおよび3’側自己触媒的切断リボザイムからなっていてもよい。よりさらに別の態様において、触媒中心は1つ以上の毒性剤をコードする配列を含有する。一態様において、マルチリボザイムは、増強された5’側および3’側自己触媒的切断リボザイム配列を含むカセットを含む。別の態様において、マルチリボザイムは1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有する。好ましい態様において、本発明のマルチリボザイムは、トリプルリボザイムカセットを含むが、これらに限定されない。別の態様において、マルチリボザイムは、互いに結合した1つ以上のトリプルリボザイムカセットを含むが、これらに限定されない。さらに別の態様において、マルチリボザイムは1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有するリボザイムカセットを含む。別の態様において、マルチリボザイムは、1つ以上の内部トランス作用性リボザイムまたはそれらの任意の組み合わせを含有する一連の1つ以上のリボザイムカセットを含む。さらに別の態様において、マルチリボザイムまたは毒性剤は、組織特異的または病原菌特異的に発現される。本発明の好ましい態様において、病原菌特異的発現を病原菌特異的プロモーターに結合する。
【0141】
5.4. プロモーターの選択
プロモーターの選択は、当技術上利用可能な技法を使用して実施される。本明細書において使用される、調節エレメントは、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターならびに発現を駆動および調節する当業者に周知の他のエレメントを含むが、これらに限定されない。詳細には、本発明は、転写制御が高く、発現レベルが高い誘導プロモーターを提供する。プロモーターは、標的とされる微生物の天然型で、強い、中程度または弱い構成的発現プロモーターまたは調節プロモーターであってもよく、または望ましいレベルの毒性剤および/またはリボザイム発現を送達する、強い、中程度または弱いコンセンサス配列を含有する人工的に考案された構成的発現プロモーターまたは調節プロモーターであってもよい。
【0142】
問題の標的(例えば、特定の病原菌、属)に特異的なプロモーターは、プロモーターのないリポーター遺伝子を活性化する能力について、ゲノム配列をスクリーニングすることによって選択することができる。プロモーターのないリポーター遺伝子は、プラスミドpMC1871を用いて使用するために開発された方法に基づいている(Casadabanら、1983、Meth. Enzymol. 100: 293)。非ウイルス病原菌では、微生物代役(understudy)において安定に複製および維持することができるプラスミドは、リポーター遺伝子のコード領域を保有するように、標準的な分子生物技法によって改変される(Sambrookら、最新版)。リポーター遺伝子は、β−ラクタマーゼをコードするする大腸菌のlacZ遺伝子を含むが、これらに限定されない数多くの標準的なリポーター遺伝子のいずれかであってもよい。総ゲノムDNAが病原菌細胞から単離され、制限エンドヌクレアーゼで切断して、平均数百塩基対の断片を生ずる。次いで、これらの断片を、リポーター遺伝子コード領域の5’末端の独自の制限エンドヌクレアーゼ切断部位にライゲーションして、プラスミドのライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーを標準的な技法によって病原菌に形質転換し、得られた形質転換体をリポーター遺伝子の発現についてスクリーニングする。lacZの場合には、発色ガラクトシダーゼ基質X−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−D−ガラクトシド)を含有する培地で形質転換体を培養することができる。プロモーターを保有する挿入物を有するプラスミドを含有する形質転換体はβ−ガラクトシダーゼを発現し、X−Gal平板培地で青色になる。青色の強度は発現レベルに関係があり、強度の異なるプロモーターを、青色の強度に基づいて選択することができる。
【0143】
上記スクリーニング手法は調節プロモーターを同定するために改良することができる。例えば、炭素源の利用性によって調節されるプロモーターは、異なる炭素源を含有する培地でスクリーニングすることができる。他の改良も可能であり、一部には、問題の生物に依存している。種特異性を試験するためには、同定されたプロモーターを、異なる生物において複製および維持することができるプロモーターのないリポータープラスミドに導入する。種特異的または病原菌特異的プロモーターは、実際には、いかなる他の種においてもリポーターを活性化しない。プロモーターのないリポータープラスミドに挿入された合成オリゴヌクレオチドを含む人工的プロモーターを同定し、試験するために、明らかな改良を用いてもよい。
【0144】
一態様において、本発明の核酸は5’側自己触媒的切断リボザイム配列、1つ以上の触媒標的特異的トランス作用性リボザイムまたは1つ以上の毒性剤および3’側自己触媒的切断リボザイム配列、をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。
【0145】
リボザイム産生構築物の組織特異的プロモーターは、選択されたプロモーターからRNAを活発に転写する組織においてリボザイムが組織特異的に発現される。従って、プロモーターを使用する組織の標的RNAだけがリボザイムによって切断される。リボザイム産生構築物における病原菌特異的プロモーター結合部位は、選択されたプロモーターからRNAを活発に転写する病原菌または微生物においてリボザイムが病原菌特異的に発現される。従って、プロモーターを使用する病原菌の標的RNAだけがリボザイムによって切断される。
【0146】
組織特異的プロモーターは本発明の核酸構築物において使用することができる。これらのプロモーターの例は、プロバシンプロモーター、プロモーター前立腺上皮前立腺特異的抗原に特異的(前立腺)、ケラチン、k7(表皮皮脂腺)、アルブミン(肝臓)、脂肪酸結合タンパク質(回腸)、乳漿酸性タンパク質(乳房)、ラクトアルブミン、平滑筋アクチン(平滑筋)等の配列を含む。特定の態様において、GenBank(商標)アクセッション番号U04199の338〜668位のヌクレオチド、続く配列
、続くアクセッション番号J04738の1762〜1846位のヌクレオチド、続くヌクレオチド配列
、続くアクセッション番号J04738の1864〜2063位のヌクレオチドからなる、マウスアルブミンプロモーター/エンハンサーが使用される。一態様において、マウスプロモーター/エンハンサーは肝細胞(例えば、ヒト肝細胞、肝細胞培養物等)において活性であり、肝臓組織における組織特異的発現に有用である。同定されていない組織特異的プロモーターを、選択された組織に本発明のリボザイムの発現を標的とするために使用することができることも明らかである。標的特異的プロモーターが同定されたら、使用することができる配列分析などの通常の方法によって結合配列を決定することができる。プロモーターは、欠損分析、突然変異性、フットプリント法、ゲルシフトおよびトランスフェクション分析によって規定される(Sambrookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1988)。病原菌特異的プロモーターを本発明の核酸構築物に使用することができる。
【0147】
5.4.1 細菌特異的プロモーター/発現
本発明は、転写および増大された発現の厳重な調節を可能にする細菌プロモーターを提供する。一態様において、LEASHIと呼ばれる新規プロモーターが3つのエレメントから構築されている(図1参照)。RIPと名づけられた第1のエレメントは、転写開始位置に対して−10(TATAAT)と−35(TTGACA)の2つのコンセンサスの組み合わせである。第2のエレメントは、−10と−35コンセンサス部位の間に配置された(lacオペレーター配列と名づけられた)lacIリプレッサー結合配列に基づいている。これは、lacオペレーターが−10コンセンサスエレメントの下流に見られる従来のlacおよびtacプロモーターと異なる。−10と−35部位の間にlacオペレーターを配置すると、プロモーターへのRNAポリメラーゼの結合をより効果的に遮断し、それによってプロモーターからの転写制御を増強する。従って、オペレーター配列に結合し、転写速度を決定する、存在するlacIリプレッサータンパク質のレベルは2つの方法で制御される;1)内因的に発現されるlacIタンパク質による方法、および2)lacI遺伝子を発現するプラスミドによる方法。通常の条件下では、lacIリプレッサータンパク質はlacオペレーター配列に結合し、RNAポリメラーゼ結合を遮断することによって転写を抑制する。イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドはリプレッサータンパク質に結合し、その後滴定するが、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドを付加することにより、プロモーターが「スイッチ オン」される。次いで、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合して、転写を進行させることができる。
【0148】
LEASHIプロモーターの第3のエレメントはUPエレメントと名づけられる。UPエレメントは、−35エレメントのすぐ上流に配置される高アデニン/チミン配列である。UPエレメントが付加されると、このプロモーターからの発現がさらに増加する。従って、本発明は、本発明の毒性剤を発現するLEASHIプロモーターの用途を提供する。
【0149】
本発明の特定の態様において、毒性剤またはリボザイムをコードする核酸に機能的に結合するプロモーターはLEASHIプロモーターである。
【0150】
特定の態様において、本発明のリボザイムはLEASHIプロモーターに機能的に結合する。本発明の別の特定の態様において、本発明の毒性剤はLEASHIプロモーターに機能的に結合する。
【0151】
特定の態様において、本発明は、LEASHIプロモーターなどの調節プロモーターの制御下においてリボザイムカセットからのDicF1の発現を含む。
【0152】
本発明の別の態様において、LEASHIプロモーターのlacIオペレーター配列は、−35コンセンサス部位の5’側に配置される。本発明の別の態様において、LEASHIプロモーターのlacIオペレーター配列は−10コンセンサス部位の3’側に配置される。本発明の他の態様において、1つ以上の追加のlacオペレーター配列をLEASHIプロモーターに加えて、−35コンセンサス部位の5’側および/または−10コンセンサス部位の3’側に配置する。
【0153】
他の特定の態様において、本発明は、anr、arcまたはproCプロモーターの用途を提供する。共に大腸菌において転写がオフで、緑膿菌においてオンである。これらのプロモーターは、病原菌(シュードモナス)において毒性剤の制御された発現を可能にするが、毒性剤治療薬の毒性作用からはパッケージング株(大腸菌)が保護されるという利点を提供する。このようなプロモーターはまた、患者への遺伝子治療薬の細菌特異的標的を可能にする。特定の態様において、anrプロモーターは、(doc、gef、chpBKまたはkicB等などの)毒性剤をコードする配列に機能的に結合し、例えば、シュードモナスを根絶するために使用することができる。
【0154】
他の特定の態様において、本発明はTSST−1プロモーターの用途を提供する。TSST−1は、環境的に調節されたブドウ球菌特異的プロモーターである。TSST−1は、docまたは他の毒性剤を発現するのに有用である。黄色ブドウ球菌株に伝達プラスミドを送達することができるブドウ球菌特異的ファージは、ブドウ球菌病原菌を特異的に標的とするのに使用される。
【0155】
他の典型的な細菌誘導プロモーターは、転写を厳重に制御できないことが知られており、大きいレベルのバックグラウンド発現が特徴的に観察される。本発明のプロモーターの大きな利点は、誘導プロモーターに一般に観察される高いレベルのバックグラウンドを軽減することである。関心のあるプロモーターが高コピー数プラスミド上にある場合に、高いバックグラウンドレベルの転写を生ずる制限因子は、プロモーターに結合するために利用可能なリプレッサー分子がないことによる。本発明は、lacI発現プラスミドを使用することによって、第2に、通常の条件下において転写を効果的に遮断する−35と−10コンセンサスエレメントの間にlacオペレーターを配置することによって、この問題を克服している。さらに、−35領域のすぐ上流にUPエレメントが配置されると、コアプロモーターからの転写が増強される。
【0156】
本発明はまたrrnBプロモーターに関する。本発明の一態様において、プロモーターは、1つ以上のlacIオペレーター部位がプロモーターに加えられるように改良されたrrnBプロモーターである。このような改変されたrrnBプロモーターの一例を図1Bに示す。本発明の別の態様において、rrnBプロモーターのlacIオペレーター配列は−10コンセンサス部位の3’側に配置される。本発明の他の態様において、1つ以上の追加のlacIオペレーター配列がrrnBプロモーターに加えられ、−35コンセンサス部位の5’側および/または−10コンセンサス部位の3’側に配置される。
【0157】
5.5. 宿主細胞
本発明は、インビトロスクリーニングアッセイ放およびエクスビボ遺伝子治療のための、初代細胞、動物、昆虫、真菌、細菌および酵母細胞における毒性剤および/またはリボザイムの発現を含む。本発明はまた、インビトロスクリーニングアッセイ放およびエクスビボ遺伝子治療のための、細胞系統における毒性剤および/またはリボザイムの発現を含む。本発明によると、少数を挙げると、皮膚、骨髄、肝臓、膵臓、腎臓、副腎および神経組織から単離された細胞を含むが、これらに限定されない種々の一次または二次細胞または細胞株を使用することができる。本発明により使用することができる他の細胞種は、免疫細胞(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞等など)、マクロファージ/単球、脂肪細胞、周細胞、線維芽細胞、神経細胞、細網細胞等である。さらに別の態様において、CWSV、NR、チャン肝細胞などの肝細胞系統またはCHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、373、HUVEC、CaSkiおよびW138細胞系統などの他の細胞系統を含むが、これらに限定されない二次細胞系統を本発明により操作された応答細胞および組織として使用することができる。本発明の毒性剤またはリボザイムは、毒性剤またはリボザイムの影響に感受性でない任意の細胞系統(例えば、特定の毒性剤またはリボザイムに抵抗性の細胞、または中和剤または解毒剤を同時発現する細胞)においても発現することができる。
【0158】
組換えタンパク質の長期高収率の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、選択された毒性剤および/またはリボザイムを安定に発現する細胞系統を操作することができる。毒性剤が安定に発現されるとき、発現は誘導プロモーターによって制御されても、または毒性剤の産生中に細胞が生存できるように、毒性剤に対する解毒剤を同時発現するように操作されてもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞を適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)および選択マーカーによって制御されたDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作された細胞を栄養強化培地で1〜2日間増殖させることができ、次いで選択培地に移される。組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択に対して抵抗性を示し、細胞を増殖させて細胞増殖巣を形成し、細胞系統にクローニングし、増殖することができる。本発明の方法は、有利なことに、細胞系統を操作するために使用することができる。本発明の方法は、有利なことに、選択された遺伝子産物を発現する細胞系統を操作するために使用することができる。このような細胞系統は、選択された遺伝子産物の内因的活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であると思われる。
【0159】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977、Cell 11: 223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybaska & Szybalski、1962、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lpwryら、1980、Cell 22:817)遺伝子を含むが、これらに限定されない数多くの選択系を、それぞれtk−、hgprt−またはaprt−細胞において使用することができる。また、抗代謝抵抗性を、以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる:メトトレキセート抵抗性を与えるdhfr(Wiglerら、1980、Natl, Acad. Sci. USA 77: 3567; O’Hareら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527)、ミコフェノール酸抵抗性を与えるgpt(Mulligan & Berg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072)、アミノグリコシドG−418抵抗性を与えるneo(Colberre−Garapinら、1981、J. Mol. Biol. 150: 1)およびヒグロマイシン抵抗性を与えるhygro(Santerreら、1984、Gene 30: 147)。
【0160】
5.6. 標的
本発明は、任意の既知の分類である科、属または種由来の任意の細胞、ウイルス、細菌、真菌または他の単細胞もしくは多細胞生物を標的とする毒性剤またはトランス作用性リボザイムを提供する。本発明の別の態様は、細菌、真菌、酵母などの病原菌、異常細胞に致死的または毒性である毒性剤を提供する。このような毒性剤は、本発明の方法によって病原菌に送達することができる。微生物は、任意のウイルス、非ウイルス、微生物または真菌、酵母、寄生虫、原生動物などの下等真核細胞またはヒト、動物、魚、植物もしくは他の生命形態の病原菌であると考えられることができる他の真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載されている抗菌リボザイム治療薬の標的は、侵入性または通常の微生物叢の微生物のRNAである。他の態様において、本明細書に記載されている抗菌毒性剤治療薬の標的は、侵入性および通常の微生物叢の微生物のRNA、タンパク質、遺伝子および他の分子を含む。従って、本発明は、ヒトおよび獣医医学に重要な関係がある。
【0161】
本発明の毒性剤は、寄生虫の成長、細菌、ウイルスの生活周期等に必要な必須の遺伝子、遺伝産物または過程を標的とするように操作することができ、発現は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターで駆動させることができる。本発明の毒性剤またはトランス作用性触媒リボザイムは、多種多様の細胞RNA、腫瘍または癌関連RNA、細菌RNA、寄生虫RNA等を標的とするように操作することができる。例えば、リボザイム標的部位を本明細書において表11、13および13に示す。毒性剤またはトランス作用性リボザイムは、寄生虫の成長、細菌、ウイルスの生活周期等に必要な非細胞性RNAを標的とすることができ、発現は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターで駆動させることができる。
【0162】
本発明の方法に使用されるビリオン構築物は、毒性剤またはリボザイム、特に病原菌または異常細胞の必須遺伝子を標的とするために本明細書において記載されているものをコードする任意の核酸を含んでもよい。ビリオンは、バクテリオファージまたは特定の細胞種、微生物または動物を標的とする能力について選択される他のウイルスであってもよい。バクテリオファージはλ、P1、Phi−11または他のファージであってもよい。P1がビリオンである場合には、伝達プラスミドは、PAC部位およびPAC ACB遺伝子をさらに含んでもよい。この構築物は、P1を使用する場合に好ましい。または、ビリオンは広域標的を有するので、選択することができる。
【0163】
本出願において特に示される重要な例は以下のようである:
A) doc、gef、chpBK、kicBまたはDicF1などの毒性剤を発現させるための、LEASHIプロモーターと(大腸菌などの)細菌標的との使用、
B) SofセンスRNAを含む毒性剤を発現させるための、LEASHIプロモーターと大腸菌などの)細菌標的との使用、
C) doc、gef、chpBK、kicBまたはDicF1などの毒性剤を発現させるための、anr、arcまたはproCプロモーターと(緑膿菌などの)シュードモナス標的との使用、
D) doc、gef、chpBK、kicB、DicF1、pemK、hok、relF、sigBまたはリソスタフィンなどの毒性剤を発現させるための、TSST−1、hlaまたはSrcBプロモーターと(黄色ブドウ球菌などの)ブドウ球菌標的との使用、
E) アルブミンプロモーターと、(同一リボザイム標的部位を使用して、ウイルスRNAプレゲノム、Sタンパク質およびポリメラーゼ/およびxタンパク質転写物を切断するために選択される)B型肝炎ウイルス標的との使用、
F) アルブミンとプロモーターと、(B型肝炎およびC型肝炎ウイルスのトランス作用性リボザイム標的部位を使用した)B型肝炎およびC型肝炎ウイルス標的との使用、
G) マラリアの細胞接着および抗原性変種に必要な熱帯マラリア原虫(P. falciparum)由来のEMP−1タンパク質ファミリーの高度に保存された領域を標的とするリボザイムを使用した、赤血球において活性な一般的なプロモーターの使用、および
H) ケラチン7プロモーターと、E6タンパク質の翻訳開始部位近傍の特定の部位、子宮頚部癌に密接に関係するE6およびE7タンパク質の発現に重要であることが知られている部位、ならびにE6タンパク質の高度に保存されている領域の3’側に近い部位を標的とするトランス作用性リボザイムとの使用。
【0164】
本発明の毒性剤またはトランス作用性リボザイムによって標的とすることができる病原性細菌の例は、以下の属の種、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、クラミジア(Chlamydia)、ヘリコバクター(Helicobacter)、エルシニア(Yersinia)、ボルデテラ(Bordatella)、シュードモナス(Pseudomonas)、ナイセリア(Neisseria)、ビブロ(Vibro)、ヘモフィルス(Haemophilus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、トレポネーマ(Treponema)、コクシエラ(Coxiella)、エシェリキア(Escherichia)、ブルセラ(Brucella)、ストレプトバシラス(Streptobacillus)、フソスパイロキータ(Fusospirocheta)、スピリルム(Spirillum)、ウレアプラズマ(Ureaplasma)、スパイロキーt(Spirochaeta)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、アクチノマイセス(Actinomyces)、ボレリア(Borrelia)、バクテロイデス(Bacteroides)、トリコモラス(Trichomoras)、ブランハメラ(Branhamella)、パストレラ(Pasteurella)、クロストリジウム(Clostridium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、リステリア(Listeria)、バシラス(Bacillus)、エリジペロスリックス(Erysipelothrix)、ロドコックス(Rhodococcus)、エシェリキア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、シュードモナス(Pseudomonas)、エンテロバクター(Enterobacter)、セラチア(Serratia)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、レジオネラ(Legionella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、プロテウス(Proteus)、カンピロバクター(Campylobacter)、腸球菌(Enterococcus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、モルガネラ(Morganella)、モラクセラ(Moraxella)、シトロバクター(Citribacter)、リケッチア(Rikettsia)、ロシャリメア(Rochlimae)ならびに緑膿菌(P. aeruginosa)、大腸菌(E. coli)、P.セパシア(P. cepacia)、S.エピデルミス(S. epidermis)、E.フェーカリス(E. faecalis)、S.ニューモニア(S. pneumonias)、S.キシローサス(S. xylosus)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、髄膜炎菌(N. meningitidis)、S.ピオゲネス(S. pyogenes)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)およびP.ミラビリス(P. mirabilis)などの細菌種を含むが、これらに限定されない。
【0165】
本発明の病原菌は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans);ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis);アジェロミセス・デルマチチジス(Aiellomyces dermatitidis);ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum);コクスディオイデス・イミチス(Coccidioides immitis);C.アルビカンス(C. albicans)、C.トロピカリス(C. tropicalis)、C.パラプシロシス(C. parapsilosis)、C.ギリエルモンディ(C. guilliermondii)およびC.クルセイ(C. krusei)を含むカンジダ(Candida)種;A.フミガーツス(A. fumigatus)、A.フラーブス(A. flavus)およびA.ニガー(A. niger)を含むアスペルギルス(Aspergillus)種;リゾープス(Rhizopus)種;リゾムコール(Rhizomucor)種;クンニングアメラ(Cunninghamella)種;A.サクセネア(A. saksenaea)、A.ムコール(A. mucor)およびA.アブシジア(A. absidia)を含むアポフィソミセス(Apophysomyces)種;スポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix shenckii);パラコクシディオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis);シュードアレシェリア・ボイジ(Pseudallescheria boydii);トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata);トリコフィトン(Trichophyton)種;ミクロスポルム(Microsporum)種ならびにデルマトフィルス(Dermatophyres)種、同様に病原菌であると現在知られているまたは後に同定される、いかなるの他の酵母または真菌も含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【0166】
さらに、本発明の病原菌は、例えば、バベシア(Babesia)、トキソプラズマ(Toxoplasma)、プラズモディウム(Plasmodium)、アイメリア(Eimeria)、イソスポラ(Isospora)、アトキソプラズマ(Atoxoplasma)、シストイソスポラ(Cystoisospora)、ハモンディア(Hammondia)、ベスノイチア(Besnoitia)、肉胞子虫属(Sarcocystis)、フレンケリア(Frenkelia)、ヘモプロテウス(Haemoproteus)、ロイコシトゾーン(Leucocytozoon)、タイレリア(Theileria)、ペルキンスス(Perkinsus)およびグレガリナ種(Gregarina spp.)などのアピコンプレクサ門(Apicomplexa phylum)のメンバー;ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii);例えば、ノセマ(Nosema)、エンテロシトゾーン(Enterocytozoon)、エンセファリトゾーン(Encephalitozoon)、セプタタ(Septata)、メラゼキア(Mrazekia)、アムブリオスポラ(Amblyospora)、アメソン(Ameson)、グルゲア(Glugea)、プリストフォーラ(Pleistophora)およびミクロスポリジウム種(Microsporidium spp.)などのミクロスポラ門(Microspora phylum)のメンバー;ならびに例えば、ハプロスポリジウム種(Haplosporidium spp.)などのアセトスポラ門(Ascetospora phylum)のメンバー、同様に熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malaria)を含む種;トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii);メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana)、熱帯リーシュマニア(L. tropica)、大形リーシュマニア(L. major)、エチオピアリーシュマニア(L. aethiopica)、ドノバンリーシュマニア(L. donovani)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、トリパノソーマ・ブルーセイ(T. brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ビルハルツ住血吸虫(S. haemoatobium)、日本住血吸虫(S. japonium);旋毛虫(Trichinella spiralis);バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti);マレー糸状虫(Brugia malayi);赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);蟯虫(Enterobius vermiculoarus); カギサナダ(Taeniasolium)、カギナシサナダ(T. sanginata)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginatis)、腸トリコモナス(T.hominis)、口腔トリコモナス(T.tenax)、ランブルべん毛虫(Giardia lamblia); クリプトスポリジウム・パルヴム(Cryptosporidium parvum);ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carnii)、バベシア・ボービス(Babesia bovis)、B.ディバージエンス(B. divergens)、B.ミクロチ(B. microti)、イソスポラ・ベリ(Isospora belli)、L.ホミニス(L. hominis);2核アメーバ(Dientamoeba fragilis);回旋糸状虫(Onchocerca volvulus);回虫(Ascaris lumbricoides);アメリカ鉤虫(Necator americanis);十二指腸虫(Ancylostoma duodenale);糞線虫(Strongyloides stercoralis);フィリピン毛頭虫(Canpillaria philippinensis);広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis);小形条虫(Hymenolepiasis nana);ミゾサナダ(Diphyllobothrium latum);単包包虫(Echinococcus granulosus)、多包条虫(E. multicularis);ウェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、P.カリエンシス(P. caliensis);肝吸虫(Clonorchis sinensis);ネコ肝吸虫(Opisthorchis felineas)、G.ビベリニ(G. Viverini)、肝蛭(Fasciola hepatica)、ヒゼンダニ(Sarcoptes scabiei)、ヒトジラミ(Pediculus humanus);恥毛ジラミ(phthirius pubis);およびヒトヒフバエ(Dermatobia hominis)ならびに病原性であることが現在知られているまたは後に同定される、いかなる他の寄生虫を含むが、これらに限定されない寄生虫であってもよい。
【0167】
ウイルス病原菌の例は、レトロウイルス(ヒト免疫不全ウイルス)、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、帯状疱疹ウイルス)、オルソミクソウイルス(インフルエンザ)、パラミクソウイルス(はしかウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸系発疹ウイルス)、ピコナウイルス(コクサッキーウイルス、ライノウイルス)、肝炎ウイルス(C型肝炎)、ブンヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、アレナウイルス(ラッサ熱ウイルス)、フラビウイルス(デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、チクングニヤウイルス)、アデノウイルス、ビルナウイルス、フレボウイルス(phlebovirus)、カリチウイルス、ヘパドナウイルス、オルビウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、ラブドウイルス、パルボウイルス、αウイルス、ペスチウイルス、ルビウイルス、フィルウイルス(filivirus)、 コロナウイルスならびにピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科およびポックスウイルス科のいかなるウイルスを含むが、これらに限定されない。
【0168】
5.7. 標的の選択
本発明の治療薬を開発する際の重要な要素は適当な標的の選択である。
【0169】
毒性剤の標的
本発明の毒性剤は、病原菌もしくは選択された細胞の増殖を阻止する能力または病原菌もしくは選択された細胞を致死させる能力、または病原菌もしくは選択された細胞の適応性を低下する能力に基づいて選択される。本発明の毒性剤の選択を例示する働きをする毒性のいくつかの特定の例を本明細書に記載する。
【0170】
例えば、毒性剤は、(docなどの)嗜癖系毒素であってもよい。Docは、phdと呼ばれるタンパク質に翻訳過程により結合する毒素をコードする。Phdはdocの解毒剤であり、docの毒性作用を中和する作用をする。2つのタンパク質、phdおよびdocは、P1プラスミド上でオペロンを形成し、phdはdocの上流に位置する。さらに、phd遺伝子はリボソーム進入部位を含有し、効率的に翻訳される。しかし、未処理のdoc遺伝子は、認識可能なリボソーム進入部位を欠損しており、十分に翻訳されない。従って、対応する解毒剤、phdを欠損する細胞または病原菌において発現される場合に毒性を生じる可能性があるので、docが選択された。この態様では、docはphdから分離しているように操作されている。例えば、、docはphdとは別のプラスミド内に操作される。docの翻訳レベルを増加するために、docをコードする核酸の上流にリボソーム進入部位が構築されるように、docを含有するプラスミドも操作されている。このプラスミドは、伝達プラスミドと呼ばれる本発明の毒性剤および/またはリボソームを含有している。本発明の特定の一態様において、伝達プラスミドは毒性剤docをコードする。
【0171】
次いで、パッケージング株(例えば、大腸菌)を使用して、バクテリオファージの頭部にdocを含有する伝達プラスミドをパッケージングする。パッケージング株細胞はP1プラスミドならびに未結合のdocおよびリボソーム進入部位を有する伝達プラスミドを含有する。パッケージングはまた、適宜、docの毒性からパッケージング細胞を保護する作用をすることができる追加のphdタンパク質をコードする第3のプラスミドを含んでいてもよい(例えば、伝達プラスミドのプロモーターがパッケージング細胞内に漏洩して、docが産生される場合)。
【0172】
従って、パッケージング株は、(docなどの)毒性剤を含有する伝達プラスミドをファージ頭部またはビリオンにパッケージングする作用をする。パッケージング株のファージ溶解産物は感染性バクテリオファージビリオンを含有する。
【0173】
次いで、ファージ溶解産物を使用して選択された病原菌(例えば、大腸菌、緑膿菌等)に感染させる。さらに、ファージ溶解産物を使用して、薬学的調製物などの本発明の治療薬を調製するこができる。ファージは、本明細書に記載されている方法または当技術上周知の任意の方法によって、細菌または病原菌または病原菌感染症宿主に送達される。例えば、ファージ溶解産物は凍結乾燥され、細菌感染症、真菌感染症等の治療を必要としている宿主に送達することができる。
【0174】
ビリオンがバクテリオファージである、上記の標的方法が提供される。バクテリオファージはλ、P1または他のファージであってもよい。伝達プラスミドがPAC部位およびPAC ABC遺伝子をさらに含む標的方法も提供される。パッケージング欠損であるように操作されるバクテリオファージP1も提供される。
【0175】
アンチセンスの標的
本発明の毒性剤は、毒性剤の解毒剤を標的とするように選択されるアンチセンス、または病原菌もしくは選択された細胞の生存に重要な必須RNAを標的とするように選択されるアンチセンスであってもよい。本発明の毒性アンチセンス分子の提案されている標的は、病原菌の生存に重大な役割を果たす任意の遺伝子のRNAであっても、または病原菌の生活周期に必須の任意の遺伝子のRNAであってもよい。本発明はまた、病原菌の必須遺伝産物の発現を調節する天然型アンチセンス分子の改変を含む。例えば、以下に記載するように、本発明のアンチセンスの提案されている標的は、その遺伝産物が大腸菌の細胞分裂の開始に重要な役割を果たすftsZ遺伝子である。例えば、毒性剤は、標的RNAに相同であるように改変され、増強されるように構築されているアンチセンス分子であってもよい。従って、DicFの場合と同様に、アンチセンス配列は、標的RNAとの相補性を増加したDicF1アンチセンス毒性剤を操作するように改変され、増強されている。さらに、、本発明の方法によって発現され、送達されて、毒性アンチセンスRNAレベルが増加した標的細胞を提供するという点において、DicF1またはDicF1様アンチセンス分子は増強された特性を有する。
【0176】
第三に、毒性剤は、必須アンチセンス分子を標的とするように選択することができる。従って、毒性剤は、必須アンチセンスRNAと相補的であるように設計されるセンス分子であってもよい。必須アンチセンス分子の例はSofである。Sofは、gefと呼ばれる染色体によってコードされる毒素のアンチセンス解毒剤である(Poulsen,L.ら、1991、Mol. Microbiology 5: 1639−48)。Sofは、通常は、細菌においてgefのレベルを調節する作用をする。本発明者らは、Sofに相補的であるセンス分子を設計した。Sofのセンス分子は、Sofがgefを調節する能力を阻害する作用をするので、内因性gefレベルを毒性にすることによって、病原菌に毒性をもたらす。
【0177】
リボザイムの標的
効果的な抗菌治療であるリボザイムは、侵入微生物を完全に不活性にし、脱出を防ぐために、例えば、いくつかの主要なタンパク質、tRNA、rRNAまたは細胞の生存もしくは適応に必須の任意の他のRNA分子のようなRNAを標的とすることが好ましい。
【0178】
ヒトRNAの複雑性はヒトDNAの約100倍低いので、特異性は12〜15程度の塩基対で得られる。RNA−RNA2本鎖の安定性は、GC含量、温度、pH、イオン濃度および構造によって得られる。隣接ルールは、2本鎖の安定性に有用な推定を与える(Castanottoら、「治療薬としてのアンチセンス触媒RNA(Antisense Catalytic RNAs as Therapeutic Agents)」、Advances in Pharmacol. 25: 289−317、1994)。
【0179】
本発明の触媒リボザイムは、標的RNA特異的配列が結合する部位の中間付近において標的RNAを切断する触媒配列も含む。ハンマーヘッド型のリボザイムでは、触媒配列は、一般に、高度に保存されている。保存されている触媒中心の残基は、進化により保存されているステムループ構造によって結合された5’GUGANGA3’および5’GAAA3’である。
【0180】
標的RNAの最もよく保存され、おそらく最も効率的に切断される配列は5’GUC3’である。しかし、NUX(ここで、X=A、UまたはCである)も効率的に切断されうる。このような切断部位はほとんどのRNAにおいて独自であるので、本質的に全てのRNAを標的にすることができる(Whitton, J. Lindsay、「ウイルス感染のアンチセンス治療(Antisense Treatment of Viral Infection)」、Adv. in Virus Res.Vol.44,1994)。
【0181】
標的RNAの適当な部位の選択に関しては、標的部位の二次構造がインビトロにおいて切断になんらかの影響を有することが知られている(Whitton、1994上記)。RNA標的の利用可能な部位を選択するために、数多くの手法が利用可能である。好ましい手法では、ライブラリースクリーニングを使用して、標的RNAの適当な部位を選択することができる。次いで、当業者に周知の技法を使用して選択された部位の利用性を確認することができる。従って、選択された標的分子の配列は、プログラムRNAFOLD(PCGENEグループ製のプログラムまたはインターネットを利用)を使用して、可能な二次構造について通常スクリーニングすることができる。標的の利用性の合理的な予測を立てることができる。コンピュータ支援RNAフォールディング(Castanottoら、1994)およびRNAの3次元モデリングのコンピュタ解析(Majorら、science 253: 1255−1260、1991、およびCastanotteら、1994)は、切断部位選択誘導に確かに有効である。
【0182】
少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが、病原菌のccdA、kis、pemI、parD、phd、higA、chpAI、chpBI、kicA、soc、sos、srnC、flmB、pndB、sof、korA、korB、korC、korD、korEまたはkorF転写物を標的とする核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが病原菌のrpoA転写物を標的とする核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが病原菌のsecA転写物を標的とする核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが、病原菌のdnaG転写物に向けられる核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが病原菌のftsZ転写物に向けられる核酸が提供される。マルチリボザイムをコードする核酸は上記のトランス作用性リボザイムの全てまたは一部をコードすることができる。リボザイムは全て1つのプロモーターの制御下にあってもよい。
【0183】
例えば、生存に必須であるが、活性に無関係のいくつかの細菌遺伝子が選択されており、原核細胞標的に対する抗菌剤の好ましい構成のために適当なmRNA標的の選択がどのように実施されるかを強調するために本明細書に記載されている。交差属RNA標的を使用して、プロモーターの特異性によって改変された広域的な適用を有する抗菌剤を設計することができる。また、原核細胞標的に対する抗菌剤の好ましい構成のために適当な毒性剤の選択がどのように実施されるかを強調するためにいくつかの毒性剤が本明細書に記載されている。
【0184】
本発明の一態様において、第1のリボザイムは必須転写因子を標的とし、第2のリボザイムは必須の一般的な分泌成分を標的とし、第3のリボザイムはDNA生合成に必要なプライモソームの必須成分を標的とし、第4のリボザイムは細胞分裂に必要な酵素を標的とする。結果として、リボザイムは、細菌の増殖に必要な基本的な過程を特異的に標的とすることによって増殖を阻止するという点において冗長である。従って、これは、抗菌治療薬に対する耐性の形成を最小にすることができる。
【0185】
例えば、1つの標的は、必須タンパク質、rpoAまたはRNAコアポリメラーゼのαサブユニットである。rpoAは、活性なRNAポリメラーゼ酵素複合体の集成を容易にすると考えられているので、RNAポリメラーゼホロ酵素の他の成分ではなくrpoAが選択される。rpoA転写物が不活性化されると、ホロ酵素RNAポリメラーゼの細胞内濃度が低下し、新たな宿主に侵入すると、細胞をそれに必要な変化に対応できなくする。rpoAのヌクレオチド配列は、大多数の微生物(>20)について周知であり、GenBank(商標)から容易に入手可能である。
【0186】
リボザイム標的の第2の例は、細菌のsecA遺伝子のmRNAであってもよい。この遺伝子の産物は、細菌における一般的な分泌経路の必須で、律速成分である(Bassfordら、1994、Nucleic Acids Reserach Apr. 11、22(7):1326; Nucleic Acid Reserach. 22(3)293−300)。SecAは、これまで検討された全ての原核細胞で見つけられている。また、その生合成は翻訳過程により上流の遺伝子Xに結合され(Schmidtら、1991、J. Bacteriol. 173(20): 6605−11)、リボザイムの都合のよい標的となる。SecAの合成の阻害または低下も、細胞の生存度の低下を示すのに十分である(Schmidtら、1987、J. Bateriol. 171(2): 643−9)。さらに、病原菌が感染過程に必要な変化に応答するとき、SecAなどの主要タンパク質の利用性の変化は病原菌に不利益になり、宿主は病原菌を妨害することができる。最後に、SecAの分泌−応答発現の制御は翻訳レベルであり(Christoffersenら、1995、J. Med. Chem. 38(12): 2023−37)、多シストロンメッセージ内の調節配列は、上流の遺伝子Xの末端部およびsecAの開始部を含む領域に局在化している。結果として、リボザイムの触媒切断による転写物の不活性化は、侵入微生物の生存に深刻な結果を与える。
【0187】
第3のリボザイムは、DnaGなどのDNA生合成に必須の因子を標的とすることができる。1または2秒ごとに、細胞プライマーゼdnaG(Boucheら、1975、J. Biol. Chem. 250: 5995−6001)とdnaB(Marians, K. J. 1996、「複製フォーク伝播(Replication Fork Propagation)」、749−763頁、F. C. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、vol.1. American society for Microbiology、Washington、DC)との相互作用の結果として、岡崎フラグメントの大腸菌プライミングの各複製点について少なくとも1,000回反復される。複製中1〜2秒ごとに必要なタンパク質について予測されるように、DnaGの損傷またはその濃度の変化が生じると途中で停止した表現型が生ずる(Marians, K. J.、1996、「複製フォーク伝播(Replication Fork Propagation)」、749−763頁、F. C. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、vol.1. American society for Microbiology、Washington、DC); Weschlerら、1971、Mol. Gen. Genet. 113: 273−284)。従って、排除されない場合には、ラギング鎖の一般的なプライミングが低下するという点において、リボザイムによるDnaGメッセージの不活性化は深刻な細胞結果をもたらすはずである。DnaGは、複製を開始する責任を担うマルチ−タンパク質複合体である、プライモソームの一成分である。プライモソームの成分のいずれかは、個別にまたは任意の組み合わせで、プライモソーム不活性化の標的として働くことができるので、細胞を死滅させる。プライモソームの他の成分は、DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriBおよびPriCである。従って、プライモソームは、トランス作用性リボザイムによる不活性化の数多くの他の標的(DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriBおよびPriC)となるのに十分に複雑である。
【0188】
第4の標的はftsZであってもよい。これらの遺伝子も、分離の開始の責任を担うという点において細胞分裂に必要である必須タンパク質、ftsZをコードする。ftsZRNAの切断により細胞分裂が阻害され、生存が低下するので、ftsZが選択される。(DicF1などの)ftsZを標的とする任意の毒性剤またはリボザイムを使用して、ftsZ遺伝産物を必要とする細胞の分裂を阻害することができる。また、例えば、リボザイムによるftsZメッセージの切断の結果、このようなリボザイムはftsZメッセージの追加のコピーを攻撃して、細胞分裂を阻害することができる。選択された他の標的と同様に、ftsZのヌクレオチド配列は通常GenBank(商標)から利用可能である。
【0189】
病原菌の任意の他の必須タンパク質は、本発明において標的とされるメッセージを有することができ、どのタンパク質が必須であるかの決定は当技術上標準的なプロトコールにより通常決定しうることが明らかである。実際、 国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(National Center for Biotechnology Information)のアントレ(Entrez)データベースの公共セクションには、52,000個を超えるウイルス、41,000個を超える細菌および12,300個を超える真菌の配列が寄託されている。これらのいずれも、本発明の触媒トランス作用性リボザイムを設計するために使用することができる。
【0190】
必須タンパク質のmRNAを標的とする以外に、リボザイムは、細胞内の他のRNA種を標的とすることができる。詳細には、細菌、真菌または他の下等真核生物の適当な標的は、スモールサブユニットRNA(SSU)またはラージサブユニットRNA(LSU)などのリボソームRNAおよびタンパク質の合成に必要なtRNA分子を含む。病原性ブドウ球菌に関しては、翻訳されない比較的少量のRNA III部分は切断に利用可能であるはずである。標的とされるRNAが正規のリボザイム切断ドメインを含有する限り、リボザイム治療薬は相補的RNAにハイブリダイズし、切断して、微生物細胞の適応性に影響を与える。さらに、3000個を超えるrRNA種が配列決定され、整列されている。この情報はリボソームデータベースプロジェクト(Ribosomal Database Project)から入手可能で、このような標的に対するリボザイムの迅速な設計および適合を容易にするはずである。例えば、細菌の16S rRNA分子は、細胞あたり4000コピーを上回る16S rRNAが存在するという点において特に好ましい。結果として、数の低下は、16S rRNA分子が翻訳開始過程に関与するタンパク質合成過程を遅くする。従って、mRNAおよびrRNAに対して向かう毒性剤またはリボザイムは、侵入微生物の適応性に影響を与える。
【0191】
5.8. 毒性および/またはリボザイム産生細胞の保護
毒性剤またはリボザイムをコードする核酸は、毒性剤またはリボザイムを保有するビリオンを産生することを必要とされている細胞に毒性となることができる。P1のような広域宿主範囲ビリオンを使用する場合、ビリオンを作製するために使用する生物は標的生物と異なっていてもよい。このように、毒性剤またはリボザイムは、種特異的プロモーターエレメントのために産生株中では効率的には発現されず、リボザイムは、リボザイムを標的とする種特異性配列により、攻撃する任意の標的RNA分子を持たないので、産生株は毒性剤またはリボザイムの毒性作用に抵抗性である。標的微生物の株内で発現され、集成される必要のある種特異的ウイルスを使用する場合には、この毒性は大きな問題となる。λにパッケージングされた抗大腸菌リボザイムまたは毒性剤遺伝子からなるビリオンの集成は、毒性を阻止するために使用される方法を例示している。例えば、大腸菌のRNA種に対して向かうリボザイムは、コンセンサスプロモーターエレメントを含有する人工的プロモーターから発現される。このプロモーターにより、標的細胞の感染直後に、リボザイムが高レベルに転写される。大腸菌の産生株の望ましくない死滅を防止するために、死滅の標的となる野生型株には利用されない機序によって産生株において転写を抑制する。異種転写因子のDNA結合部位を構成する配列を、リボザイムプロモーターの必須活性化エレメントの間に配置する。産生株における異種転写因子の発現は、プロモーターエレメントの活性化およびRNAポリメラーゼの結合の防止の閉鎖(occlusion)を生じる。一例として、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)転写因子Ste12pの遺伝子を大腸菌において発現させることができ、リボザイムプロモーター内に配置されているフェロモン応答エレメントである結合部位に結合することができる。Ste12pは野生型には見られない。従って、リボザイムプロモーターは、標的細胞にプラスミドを送達した後にRNAポリメラーゼに接近することができる。
【0192】
リボザイムの毒性から産生株を保護することができる別の方法は、標的とされるRNA分子のリボザイム耐性種を使用する。標的RNA分子がタンパク質をコードする場合に、この方法を使用することができる。翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列は変化がないが、mRNA配列はリボザイムの基質として働かないように、mRNA分子内のリボザイム標的部位を部位特異的突然変異によって突然変異させる。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムでは、切断が生じるためには、標的mRNA内にNUX配列を必要とする。この配列をほかの何かに変更することによって、リボザイムはmRNAを切断しない。標的RNAのこの種類のリボザイム抵抗性種はプラスミドから発現され、産生細胞の染色体に組み込まれるので、この株をリボザイムの毒性抵抗性にする。
【0193】
産生細胞を毒性剤の毒性から保護することができる別の方法は、中和剤または解毒剤の同時発現を使用する。解毒剤または中和剤のこのような同時発現は、コードされる毒性剤の毒性作用からパッケージング細胞を保護する。毒性を発現するために使用されるプロモーターが漏洩して、産生細胞内で毒性剤を発現する場合には、この方法は特に有用である。例えば、パッケージング株(例えば、細菌細胞)を使用して、毒性剤を含有するウイルスベクターをバクテリオファージ頭部内にパッケージングすることができる。パッケージング細胞の生存または産生細胞によって作製されるベクターまたはファージの量の最適化は、産生細胞における解毒剤または中和剤の同時発現を必要とする。中和剤は、毒性剤の毒性作用を中和する任意の分子(タンパク質、アンチセンス、センスまたは他の分子(薬剤、化合物等の)ような)任意の分子である。具体的な実施例における例として、パッケージング株細胞は、バクテリオファージP1プラスミドならびに毒性剤docおよびリボザイム進入部位を含む伝達プラスミドを含有する。伝達プラスミドがパッケージング株に毒性であると判定される場合には、phdタンパク質などのdocの解毒剤をコードする第3のプラスミドを導入することができる。解毒剤を有する追加のプラスミドは、docの毒性からパッケージング株を保護する作用をする。
【0194】
本発明の改善箇所は、無傷のバクテリオファージに典型的な溶菌感染サイクルとは異なり、ファージ外被が核酸を標的微生物に注入すると、毒性剤またはリボザイムの発現が微生物を破壊するという点において、非反復送達シス作用性が利点を有するということである。結果として、ファージ外被の増幅は問題とはならず、非反復的なファージ送達系が免疫応答を形成して、その後送達系が使用できなくなる可能性は低い。さらに、患者が耐性病原菌に暴露され、本発明の治療薬が有効で、進入微生物を中和する場合には、微生物抗原は治療薬の作用の結果として遊離し、液性免疫および細胞性免疫を誘発して、その後の攻撃に対する防御となる。
【0195】
5.9. 治療薬および薬学的調製物/製剤および投与方法
本発明はさらに、疾患、ウイルス感染症、寄生虫感染症および微生物感染症を治療するための本発明の毒性剤および/またはリボザイムの用途をさらに含む。
本発明はさらに、組織における細胞増殖を阻害することによって特定組織の増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、組織特異的プロモーター配列に機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、プロモーターは異常組織に特異的であり、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、細胞増殖を阻止し、増殖性疾患を治療する方法を含む。
【0196】
本発明はさらに、病原菌の複製を阻止することによって、病原菌感染症または疾患を有する対象を治療する方法であって、病原菌特異的プロモーターに機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、病原菌は複製が阻止されるかまたは死滅させられるかまたは適応性を低下され、感染症または疾患が治療される方法を提供する。本発明は、薬学的製剤の形態の本発明の毒性剤および/またはリボザイムを含む。
【0197】
本発明のいくつかの態様において、本発明の毒性剤またはリボザイムは、抗菌治療薬として特に好適である。例えば、標的RNA転写物との核酸ハイブリダイゼーションの結果、リボザイム−RNA複合体は、標的RNAを切断するヌクレアーゼとして作用する触媒形態をとる。従って、切断により、侵入微生物は必須細胞過程を奪われ、死滅するかまたは適応性が低下される。また、本発明の毒性剤は抗菌治療薬として使用することもできる。毒性剤は単独で使用しても、または1つ以上の他の毒性剤と併用して使用してもよい。従って、毒性剤の侵入微生物への送達は死滅させるかまたは適応性を低下する。毒性剤は1つ以上のリボザイムと併用して使用してもよい。さらに、リボザイムと毒製剤との組み合わせを抗菌治療薬として使用することができる。
【0198】
本発明は、1つまたは1系列の候補微生物の必須遺伝子、ハウスキーピング遺伝子または毒性遺伝子に向かう1つ以上のリボザイムおよび/または毒性剤の使用を提供する。必須タンパク質および毒性決定因子の不活性化は、侵入微生物を不活性にするかまたは増殖を遅くすると同時に、宿主の必須課程は有意に影響されない。
【0199】
a)プロモーターと、毒性剤またはリボザイムをコードする配列とを含むリポソームを作製する段階、およびb)リポソームを対象に送達する段階を含み、標的特異的プロモーターが、標的細胞において毒性剤またはリボザイムを転写させる、毒性剤またはリボザイムを対象の標的(例えば、病原菌)に送達する方法が提供される。標的は、病原菌、例えば、細菌、真菌、酵母、寄生虫、ウイルスまたは非ウイルス病原菌であってもよい。
【0200】
a)本発明の非ウイルスDNAを含むビリオンを作製する段階、b)それをリポソームと組み合わせる段階、およびb)ビリオンを含有するリポソームを対象に送達する段階を含み、リポソームが真核細胞に進入し、ビリオンを放出し、これがDNAを病原菌に送達して、病原菌特異的プロモーターが病原菌細胞において毒性剤またはリボザイムを転写させる、毒性剤またはリボザイムを対象の病原菌に標的送達する方法が提供される。
【0201】
標的特異的プロモーターを含むDNAと毒性剤またはリボザイムをコードする配列とを含むリポソームを対象に投与する段階を含み、DNAによってコードされる毒性剤またはリボザイムが発現され、感染菌が死滅されるか弱体化される方法が提供される。この方法に使用されるリポソームは、任意のリボザイムコード核酸または任意の毒性剤コード核酸であってもよく、特に病原菌の遺伝子を標的とする本明細書に記載されているものであってもよい。感染症は細菌、真菌、酵母、寄生虫、ウイルスまたは非ウイルスであってもよい。
【0202】
リポソーム(edleyら、1987)またはウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム(Nicolauら、1983)にDNAが捕獲されている製剤を用いて、およびポリリジン−糖タンパク質担体複合体に結合したDNAを用いて、直接インビボ遺伝子移入を実施することができる。また、「遺伝子銃(gene guns)」を、細胞への遺伝子送達に使用している(オーストラリア特許第9068389号)。最後に、細胞にDNAを移入するために、 間隙に注射するための液体担体溶液の形態で裸のDNA(nakedDNA)またはリポソームが結合したDNAを製剤化することができる(国際公開公報第90/11092号)。アシアロフェチュイン標識リポソームは、アシアログリコプロテイン受容体を介して肝細胞を選択的に標的化することが知られている(その各々は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Wuら、1998、Hepatology 27/3: 772−8; Haraら、1996、Biochem. Biophys. Acta 1278/1:51−8; Haraら、1995、Gene Therapy 2/10: 784−8; Haraら、1995、Gene 159/2: 167−74)。アシアログリコプロテイン受容体媒介性エンドサイトーシスは、関心のある核酸を付加したアシアロフェチュイン標識リポソームを使用した遺伝子導入またはトランスフェクションを実施する手段として使用されている。使用糖またはアシアログリカンなどの、リポソームの他の改良も周知である。
【0203】
従って、本発明の一態様において、本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを送達するための非ウイルスベクターとして、アシアロフェチュイン標識リポソームを使用する。それによって、動物の肝臓への本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのインビボまたはインビトロにおける送達が達成される。
【0204】
標的細胞が生体から取り出され、本発明の、設計された核酸を保有するベクターがトランスフェクトまたは感染され、生体に移植されるエクスビボ遺伝子治療も提供される。細胞にインビトロにおいてDNAを移入するために現在使用される技法は、リン酸カルシウム−DNA沈降法、DEAE−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性DNA移入、例えば、Lipofectamine(登録商標)などの液体媒介性トランスフェクションまたは組換えウイルスベクターによる形質導入(一般に、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Ausubelら、2001、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.)を含む。これらのトランスフェクションプロトコールは、上皮細胞(米国特許第4,868,166号、Morganら、1987)、内皮細胞(国際公開公報第89/05345号)、肝細胞(Ledleyら、1987; Wilsonら、1990)、繊維芽細胞(Rosenbergら、1988; 米国特許第4,963,489号)、リンパ球(米国特許第5,399,346号、Blaeseら、1995)および造血幹細胞(Limら、1989; 米国特許第5,399,346号)を含む種々の異なる細胞種にDNAを移入するために使用されている。
【0205】
ウイルスベクターは最も効率的な遺伝子治療送達系であることが多く、数多くの組換え複製欠損ウイルスベクターがエクスビボおよびインビボにおいて細胞に形質導入(すなわち、感染)することが当技術上知られている。このようなベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルスおよびヘルペスウイルスベクターを含む。
【0206】
非経口投与は、使用する場合には、注射(静脈内、皮内、皮下および筋肉内)によって一般に特徴づけられる。注射剤は、液体または懸濁液、注射時に溶液または懸濁液に調製するのに好適な固形形態または乳剤などの従来の形態で調製することができる。さらに最近考案された非経口投与方法は、一定レベルの用量が維持される徐放性または持続性放出系の使用に関係する。例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第3,610,795号参照。本発明のある種の好ましい態様において、投与は非経口である。
【0207】
本発明は予防的投与に関する。例えば、多数の入院患者または免疫寛容宿主は、病原菌感染を特に受けやすい。さらに、多数の病原菌の院内株は、ペニシリンなどの従来の抗生物質に耐性がある。本発明の治療薬は、病原菌感染症を予防する、または耐性病原菌株によって生じる感染症を治療するのに特に有用である。
【0208】
滅菌溶液または懸濁液の形態で物質を非経口投与するのに好適な担体は、エチルオレエートまたはイソプロピルミリステートなどの添加剤を含有してもよい滅菌生理食塩液を含んでもよく、例えば、静脈内ならびに皮下組織または粘膜内組織に注射することができる。
【0209】
局所投与は、クリーム、ゲル、坐剤、エアゾール、スプレー等によってもよい。エクスビボ(体外)送達は、他の内容において典型的に使用されるようであってもよい。好ましい治療用途において、本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはリボザイムは、手の疣、足の疣、喉頭の疣、せんけいコンジローム、疣状表皮異形成、子宮頚部の偏平な疣、子宮頚癌またはパピローマウイルスに関係する任意の他の感染症を1つ以上有する対象に投与される。本発明による治療薬を局所的または病巣内に適用することが一般に好ましい。経皮または筋肉内投与などの他の形態の投与も有用である場合がある。軟膏、膏薬、ゲル、クリーム、ローション、スプレー、吸入剤または坐剤に加えることは、現在では、有用性が高いと考えられている。本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはリボザイムは予防にも使用することができる。例えば、コンドームのコーティングとして、または単独もしくはコンドーム、女性用避妊具等と併用して使用する殺精子製剤中に薬物を提供することによってこれを実施することができる。本発明の好ましい態様において、投与は局所治療としてである。本発明の一態様において、火傷または開放創に関連する感染症の治療には、局所投与が好ましい場合がある。
【0210】
経口投与も提供される。経口投与の好適な担体は、矯味剤、潤滑剤、懸濁剤または保護剤として作用することもできる1つ以上の物質を含む。好適な固形担体はリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、カルボキシポリメチレンまたはシクロデキストランを含む。好適な液体担体は水、発熱物質を含まない生理食塩液、薬学的に許容されうるオイルまたはこれらのいずれかの混合物であってもよい。液体はまた、緩衝液、保存剤、矯味剤、粘性または浸透圧調節剤、安定剤または懸濁剤などの他の好適な薬学的に許容されうる添加剤を含有してもよい。好適な液体担体の例は、pH調節ゲルとしてのカルボキシポリメチレンを含む、種々の添加剤を含むまたは含まない水を含む。
【0211】
本発明の治療薬は、抗生物質作用を生ずる、または標的病原菌の活性を阻止または低下するのに十分な量を対象に投与することができる。最適な用量は、年齢、体格、体重、状態等ならびに誘導される特定の調節作用に基づいて、患者個人により異なる。当業者は用量は担当医によって最適に決定されることを知っており、用量設定方法は、例えば、「レミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Science)」(Martin, E. W.編、Remington’s Pharmaceutical Science、最新版、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania)に記載されている。治療は、特定の感染症に関連する徴候、症状および臨床パラメーターをモニターすることによって示されるように、間欠的であっても、無限に継続してもよい。感染症に関連するパラメーターは多数の病原菌について周知であり、治療経過中定期的に評価される。
【0212】
好ましい一態様において、本発明は、ウイルス感染症を治療するために使用することができる本発明の核酸を1つ以上含有する組成物を提供する。個々の患者の必要量は異なるが、組成物中の各成分の有効量の最適範囲の設定は当業者の認識範囲内である。典型的な用量は0.001〜100 mg/kg体重を含む。好ましい用量は0.1〜10mg/kg体重を含む。最も好ましい用量は0.1〜1mg/kg体重を含む。好ましい局所適用は、パピローマを覆うのに十分な量であるか、または膣鏡検査によって同定される子宮頚管病変全体を覆うのに十分な量である。局所適用されるDNAzymeまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適用あたり1μg〜250μgの範囲、好ましくは50μg〜100μgの範囲であるように含まれる。例えば、典型的なHPV局所適用は50μl中50μgである。本発明のHBV剤では、総用量が500μg〜1000μgの範囲であるように含まれる。最適な用量範囲の設定は、毒性研究の考え方を含み、当業者の認識範囲内である。
【0213】
本発明の組成物は、薬理学的に活性な薬剤以外に、作用部位への送達に使用することができる製剤への作用化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む薬学的に許容されうる担体を含有してもよい。
【0214】
非経口投与に好適な製剤は、例えば、水溶性の塩のような水溶性の形態の作用剤の水溶液を含む。また、適当な油性注射用懸濁液としての作用化合物の懸濁液が投与される場合もある。好適な親油性溶媒または媒体は脂肪油、例えば、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドを含む。水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加する物質を含有してもよい。必要に応じて、懸濁液は安定剤を含有してもよい。リポソームは、細胞に送達するための薬剤を封入するためにも使用される。
【0215】
上記のように、本発明による全身投与のための薬学的組成物は、経腸、非経口または局所投与用に製剤化することができる。実際、作用成分の全身投与を実施するために、3種類の製剤全てを同時に使用する場合もある。
【0216】
好適な経口投与製剤は、硬または軟ゼラチンカプセル、ピル、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤およびそれらの徐放性形態を含む。
【0217】
6. 実施例:プロモーターの構築および特徴づけ
既に確立されている細菌誘導プロモーターは、転写を厳重に制御できないことで有名であり、有意なレベルのバックグラウンド発現が特徴的に観察される。
【0218】
Leashiプロモーター
本発明は、転写および増大された発現の厳重な調節を可能にする細菌プロモーターを提供する。LEASHIと呼ばれる新規プロモーターは3つのエレメントから構築されている(図1A参照)。RIPと呼ばれる第1のエレメントは、転写開始位置に対して−10(TATAAT)および−35(TTGACA)に位置する2つのコンセンサス部位の組み合わせであった。第2のエレメントはlacIリプレッサー結合配列(lacオペレーター配列と呼ばれる)に基づいており、−10〜−35コンセンサス部位に位置した。−10〜−35の間に配置されるlacオペレーターは、RNAポリメラーゼのプロモーターへの結合を効果的に遮断したので、プロモーターによる転写制御を増強した。プロモーターは、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドを添加することにより「スイッチ オン」されるように設計され、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドはリプレッサータンパク質に結合し、その後リプレッサータンパク質を滴定する。次いで、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合することができ、転写が進行することができる。
【0219】
LEASHIプロモーターの第3のエレメントはUPエレメントであった。UPエレメントはアデニン/チミンに富む配列で、−35エレメントのすぐ上流に配置された。UPエレメントの追加はこのプロモーターによる発現をさらに増加した。
LEASHIプロモーター配列:(配列番号:1)
【0220】
本発明のLEASHIプロモーターの重要な利点は、それは、誘導プロモーターに通常観察される高いレベルのバックグラウンドを軽減することである。関心のあるプロモーターが高コピー数プラスミド上にある場合に、転写の高いバックグラウンドレベルを生ずる制限因子は、プロモーターに結合するのに利用可能なリプレッサー分子がないことによる。本発明は、lacI発現プラスミドを使用し、第2に、−35と−10のコンセンサスエレメントの間に、通常の条件下では転写をより効果的に遮断するlacオペレーターを配置することによって、この問題を克服している。さらに、−35領域のすぐ上流に配置されたUPエレメントがプロモーターによる転写を増大した。
【0221】
LEASHIプロモーター(図1B)は、多種多様の細菌に対する広域スペクトルプロモーター活性を有するlacI調節プロモーターとして設計された。IPTG誘導性LEASHIは大腸菌において機能し、厳重に調節されている。それは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方において活性である。
【0222】
本明細書に記載されるように、本発明のリボザイムはLEASHIプロモーターに機能的に結合している。本発明の別の特定の態様において、本発明の毒性剤はLEASHIプロモーターに機能的に結合している。
【0223】
改変型rrnBプロモーター
改変型rrnBと呼ばれる新規プロモーターが構築された(図1C参照)。改変型rrnBプロモーターの配列:(配列番号:2)
【0224】
Anr、Arc、およびProcプロモーター
Anr(図1D)、proC(図1E)およびArc(図1F)プロモーターは種特異的である。anrおよびproCは共に大腸菌において転写がオフで、緑膿菌においてオンである。これらのプロモーターは、病原菌(シュードモナス)において毒性剤の制御された発現を可能にすると同時に、パッケージング株(大腸菌)を治療薬の毒性作用から保護することができるという利点を提供する。このようなプロモーターは、送達媒体の製造を容易にするのに特に有用である。このようなプロモーターは、患者の遺伝子治療の細菌特異的標的化も可能にする。
緑膿菌「特異的」プロモーター(5’側から3’側)
ANRプロモーター(配列番号:3)
Proプロモーター(配列番号:4)
ARCプロモーター(配列番号:5)
【0225】
緑膿菌において主に発現されたAnr、ArcおよびproCプロモーターが単離され、この病原菌において毒性剤を特異的に発現することが示されている(表1および2ならびに図2参照)。詳細には、表1に示すように、プロモーターは、複数の転写ターミネーターが隣接したカセットのβ−ラクタマーゼリポーター遺伝子の上流にクローニングされた。構築物を大腸菌または緑膿菌に形質転換し、異なる量のカルベニシリンを含有する寒天上で培養した。3回の反復評価では同じ結果が得られた。
【0226】
【表1】β−ラクタマーゼをリポーター遺伝子として使用したプロモーターの評価
【0227】
表2に示すように、chpBK遺伝子を、緑膿菌プロモーターproCおよびanrの制御下において両方向にクローニングした。等量のDNA(500ng)を大腸菌および緑膿菌に形質転換して、寒天上で培養した。模擬の形質転換も「DNAなし」で実施した。+はコロニーが100より多いことを示し、−は検出可能なコロニーがないことを示す。括弧はプロモーターに対するchpBK遺伝子の方向を示す。実験は少なくとも2回反復し、同じ結果を得た。重要なことに、chpBK発現を調節するためにproCおよびanrを使用したプラスミドは大腸菌において細胞死を誘発せず、これは転写活性化機能の欠損を示している。
【0228】
【表2】緑膿菌において主に発現されるプロモーターの評価
【0229】
種特異的プロモーターの開発は、固有の偏共生細菌を本発明の毒性剤から保護すると同時に、病原性緑膿菌を標的とするすることが望ましい本発明の局面において特に重要である。
【0230】
TSST−1プロモーター
環境的に調節されたブドウ球菌特異的プロモーターTSST−1が得られ、このプロモーターを使用する伝達プラスミドを使用してdocまたは他の毒性剤を発現する。黄色ブドウ球菌株に伝達プラスミドを送達することができるブドウ球菌特異的ファージを使用して、ブドウ球菌病原菌を特異的に標的とする。
TSSTI−プロモーター(配列番号:6)(GanBank(商標)アクセッション番号U93688、また、Lindsay, J. A.ら、1998、「毒素ショックトキシンに対する遺伝子を黄色ブドウ球菌における移動性病原性島のファミリーが保有している(The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus」、Mol. Microbiol. 29(2)、527−543も参照):
【0231】
7. 実施例:細菌の増殖に及ぼす毒性剤の影響
本発明の方法を証明するために、本発明者らは、病原菌に対するいくつかの毒性剤を発現し、標的とした。毒性剤は、病原菌もしくは異常細胞の増殖を阻止する能力または病原菌もしくは異常細胞に致死を生じる能力に基づいて選択した。本明細書の以下の実施例は、いくつかの天然型ファージ、プラスミドおよび染色体によってコードされたタンパク質の毒性剤を例示しており、抗菌治療剤としての有効性を証明している。
【0232】
詳細には、SecA、16S RNA、dicF、 sof、dicFアンチセンス、16Sアンチセンス、毒素/解毒剤対の毒性タンパク質doc/Phd、gef/Sof、chpBK/ChpB1またはkicB/KicAを含むが、これらに限定されない、いくつかの天然型ファージ、プラスミドおよび染色体によりコードされる毒性タンパク質を同定し、抗菌治療剤として有効であることを証明した。
【0233】
毒性剤が、嗜癖系毒素の毒性遺伝子産物、染色体によってコードされる毒素の毒性遺伝子産物またはアンチセンス分子であることを例示するために、doc、gef、chpBK、kicBまたはDicF1をコードする核酸を、P1バクテリオファージ送達系に使用する伝達プラスミドに操作した。プラスミドの構築は当技術上周知の標準的な方法によって実施した。
【0234】
図3に示すように、毒性剤をクローニングするための発現ベクターを操作した。詳細には、lacI調節プロモーターの制御下において毒性タンパク質chpBK、kicB、docおよびgefをコードする遺伝子を、複製起点ColE1(300〜500コピー/細胞)、pMB1(15〜20コピー/細胞)またはp15A(10〜12コピー/細胞)および選択マーカーCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)を含有する大腸菌ベクターにクローニングした。しかし、当技術上周知の任意の選択マーカーを使用してもよい(例えば、bla、アンピシリン抵抗性)。lacI発現プラスミド由来のlacIリプレッサータンパク質を過剰発現する大腸菌株に毒性剤をクローニングした。lacI調節プロモーターの制御下において毒性タンパク質chpBK、kicB、docおよびgefをコードする遺伝子をPCRによって入手し、大腸菌シャトルベクターにクローニングした。lacI発現プラスミド由来のlacIリプレッサータンパク質を過剰発現する大腸菌株に致死剤をクローニングした。
【0235】
docまたはgefの翻訳レベルを増加するために、リボソーム進入部位が、毒性剤をコードする核酸の上流に構築されているように、毒性剤docまたはgefを含有するプラスミドを構築した。毒性剤を保有するプラスミドは伝達プラスミドと呼ばれる。伝達プラスミドは、1)複製起点、2)選択マーカー、3)P1 PAC部位およびPAC ABC遺伝子4)P1溶菌レプリコン、5)毒性剤(例えば、doc、gefまたはDicF1)をコードする核酸を含有するように構築された。
【0236】
詳細には、伝達プラスミドは、pBluescript(ColE1起源)およびpBBR 122(広域宿主範囲起源)親ベクターに基づいて構築した。毒性剤docまたはgefをコードする核酸を広域宿主範囲伝達プラスミドにクローニングした。dicFをコードする核酸をCo1E1伝達プラスミドにクローニングした。各ベクターの構造は入手可能である。docおよびgefはともにlacI調節プロモーターの制御下においた。伝達プラスミドは、ファージの溶菌サイクル中にローリングサークル複製を受けるように設計された。
【0237】
毒性剤をコードする核酸をバクテリオファージ頭部に含有する伝達プラスミドをパッケージングするために、パッケージング株(例えば、細菌細胞)を使用した。3つの毒性剤の各々のパッケージング株は、P1バクテリオファージのファージ前駆体および毒性剤をコードする核酸を含有する伝達プラスミドを含有した。いくつかの場合において、パッケージング株は、適宜、毒性剤の毒性からパッケージング株を保護する作用をする追加の解毒剤タンパク質をコードするか、または伝達プラスミドのプロモーターのスイッチをオフするための追加のリプレッサータンパク質をコードする第3のプラスミドも含有した。
【0238】
従って、毒性剤(例えば、doc、gefまたはDicF1)を含有する伝達プラスミドをファージ頭部またはビリオンにパッケージングするためにパッケージング株(P1溶菌ファージ)を使用した。パッケージング株のファージ溶解物は感染性バクテリオファージビリオンを含有し、以下の方法で細菌標的に感染させるために使用した。
【0239】
毒性剤(docまたはgefまたはDicF1)を有する伝達プラスミドを保有するP1溶菌ファージ(P1 cm C1.100)を、30℃において、LB、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2、12.5μg/mlクロラムフェニコール中で、A450が0.8に達するまで増殖させ、A450が0.8に達したら、培養物を42℃の水浴に移し、1時間活発に通気した。クロロホルムを添加し、37℃においてさらに20分間インキュベーションを継続した。ファージストックは4,000 gにおいて20分間遠心分離して透明にした。DNase(1μg/ml)およびRNase(10μg/ml)を添加し、37℃において30分間インキュベーション後、ファージを4,000 gにおいて20分間遠心分離した。NaClを1 Mおよびポリエチレングリコール6000を10%(w/v)添加することによって、ファージ粒子をファージストックから沈殿させた。氷上で2時間インキュベーションした後、11,000 gにおいて15分間遠心分離することによってファージをペレットにした。ペレットを50 mMのTris Cl pH 7.5、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2、0.01%ゼラチンに慎重に溶解した。クロロホルムで抽出してポリエチレングリコールを除去した。
【0240】
選択された病原菌(例えば、大腸菌)に感染させるためにファージ溶解物を使用した。標的細胞(105 CFU/ml、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2で処理済)は、上記のファージ溶解物の各々を用いて、種々のM.O.I(0.1、1、10、100)で感染させた。30℃において30分間インキュベーションした後、コロニー形成単位の総数についてプレートを計数することによって、細胞死を評価した。
【0241】
両方の種類の伝達プラスミド(Co1E1および広域宿主範囲系)が、インビトロにおいてP1送達系によって種々の大腸菌株に移入された。広域宿主範囲伝達プラスミドをインビトロにおいて緑膿菌に送達するためにもP1系を使用した。Co1E1伝達プラスミドはインビボにおける大腸菌への移入が成功し、広域宿主範囲伝達プラスミドはインビボにおいて緑膿菌および大腸菌に送達された。
【0242】
結果は、毒性剤を含有する感染性ビリオンを含むファージ溶解物による細菌細胞の感染は、感染した細菌細胞を死滅させることができることを示した。さらに、高M.O.I.により多量の細胞死を生じたので、細菌細胞の死滅は用量依存的であることがわかった。従って、本発明の方法および組成物は、病原菌感染症を治療する抗菌剤として有用である。
【0243】
毒性剤の致死試験は、doc、gef、chpBKおよびkicBは全て大腸菌に対して殺菌性であることを明らかにした(図4参照)。詳細には、毒性タンパク質の発現が抑制される条件下においてコロニーを液体培地で増殖させた。IPTGで1時間誘発することによってタンパク質を発現させた後、IPTGを欠損する寒天上で培養物を終夜培養した。コロニーが見られないのは、タンパク質が致死的であることを示している(結果の表4も参照)。構築物を大腸菌に形質転換し、1 mM IPTGが存在する場合または存在しない場合において寒天上で培養した。等量のDNA(500 ng)を緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)にも形質転換した。模擬の形質転換も「DNAなし」で実施した。+はコロニーが100より多いことを示し、−は検出可能なコロニーがないことを示す。実験は少なくとも2回反復し、同じ結果を得た。全ての薬剤は大腸菌に致死的であったが、docだけは4種全てにおいて毒性であった。
【0244】
【表4】広域宿主範囲プラスミドを使用した大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)における毒性タンパク質の評価
【0245】
図5に示すように、doc発現プラスミドを保有する大腸菌の増殖は、docの発現がITPGによって誘発される場合には、阻止されることが証明された。詳細には、細胞を32℃においてLB中で終夜増殖させ、新鮮なLB培地で1:100希釈し、32℃において180分インキュベーションした。次いで、培養物を均等に分けて、2 mM IPTGが存在しない場合(○)または存在する場合(○)において32℃においてインキュベーションすると、致死的な薬剤docが発現された。増殖は、1 mlの試料のOD600における分光学的測定によって算出した。
【0246】
細菌の増殖を遅くするだけの従来の抗生物質とは異なり、細胞死の99%は、細胞をIPTGで20分間誘導した場合に達成されることをdocの致死試験は示している。細胞が、doc発現プラスミドを維持する非選択的なプレッシャー(no selective pressure)条件下に置かれている場合には、有意な低下(92%の細胞死)が証明された。従って、細菌の迅速な死滅は、耐性株を生ずる選択的プレッシャーの可能性を低下しており、これは多剤耐性菌を根絶する際に重要である。
【0247】
DOCに対する低い耐性
docに対する耐性頻度を検討するために、耐性突然変異体を単離した。根本的理由は自然突然変異を選択することであったので、突然変異原は使用しなかった。致死量以下の濃度の40 docに長期暴露した後、耐性大腸菌クローンを単離した。これらのクローンから単離したDNAは、doc感受性細胞への形質転換によって試験したが、IPTGの存在が細胞死滅を誘発しなかった。これは、耐性はdoc発現プラスミドにおける突然変異または組換え事象によることを示しており、doc標的の染色体の突然変異は非常に低い頻度でしか生じないことを示唆している。
【0248】
緑膿菌に対する毒性
docおよびchpBKは緑膿菌に毒性であることが証明された。特に注目すべきことは、docはグラム陰性菌(大腸菌および緑膿菌)およびグラム陽性菌(黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis))の両方に広域スペクトル活性を有したことである(上記表4参照)。表4からわかるように、毒性剤docは試験した全ての細菌種を死滅させた。doc、gef、chpBKおよびkicBは全て大腸菌を死滅させることができた。chpBKは大腸菌および緑膿菌を死滅させた。
【0249】
バクテリオファージ毒性剤送達系の開発
伝達プラスミド(図6Aおよび6B参照)をパッケージングして、大腸菌および緑膿菌に送達するためにバクテリオファージP1系を使用するための毒性剤送達系を実施した。図6Aは、パッケージングに必須のシグナル(P1 P53プロモーターの制御下におけるpac部位および溶菌レプリコン)、検出のための選択マーカー(bla、アンピシリン)およびCo1E1複製起点を大腸菌内に含有する伝達プラスミドを図示する。図6Bは、C1リプレッサー制御P53プロモーターアンチセンスおよび遺伝子kilAおよびrepLを含む溶菌レプリコンを図示する。kilAはフレーム欠損が52%である。P53アンチセンスはP1レプリコンの安定性に関係している。本発明の方法は、病原性グラム陰性菌に送達するためのP1ビリオンに効率的にパッケージングすることができる2つの伝達プラスミドによって本明細書において例示されている。重要なことには、送達系は重感染排除の抑圧下にはない(図7)。P1送達系による伝達プラスミドの大腸菌への送達効率を証明するために、以下のアッセイ法を実施した。伝達プラスミドを保有する大腸菌P1 Cm clts 100溶菌ファージは、熱誘導によって誘導して、ファージ粒子を作製した。ファージ溶解物はDNaseおよびRNaseで作製して、沈殿した粒子を50 mMのTris. Cl pH 7.5、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2、0.11%ゼラチン、大腸菌C600に再懸濁させ、大腸菌P1 C600標的細胞(105 CFU/ml;10 mM MgSO4、5 mM CaCl2で処理済)にファージ溶解物の各々を感染させた。30℃において30分間インキュベーションした後、感染物を選択培地で培養し、抗生物質耐性コロニーを計数した。値は抗生物質耐性コロニー数±標準誤差、n=6を示す。
【0250】
さらに、ファージに基づく送達系は、P1およびλなどの定住ファージまたは適合性プラスミドによってブロックされない。自然の生態系(湖沼の水、土砂、土壌および汚水)における緑膿菌株の40%が、ファージゲノムに相同なDNA配列を含有することを環境試料の分析が示唆しているので、これは重要である。バクテリオファージに基づく系は、感染症のマウス腹膜炎モデルにおいて大腸菌および緑膿菌に対する抗生物質マーカーを発現する伝達プラスミドを送達することによって、インビボにおいて遺伝情報を導入するのに有用である。プラスミド導入は、腹腔内腔から回収した細菌から単離したプラスミドDNAの制限分析および配列決定によって確認した。インビボにおける導入の証明も得られた。
【0251】
伝達プラスミドをパッケージングすることができるが、P1 DNAを組み込むことができないバクテリオファージP1ノックアウトの開発
未改変のファージを送達媒体として使用する理由は、溶原化変換のリスクの可能性があるからである。伝達プラスミドを標的細菌に送達することができるが、自身のDNAを標的細菌に送達できないバクテリオファージ送達ベクターを開発するために、改変されたP1ファージを開発した。
【0252】
図8に示すように、P1ファージ前駆体DNAを改変して、pac部位ノックアウトを作製した。破壊カセットは、P1ファージ前駆体と相同な配列が隣接した栄養マーカーまたは抗生物質マーカーを含有する。鎖状断片は、ホスホロチオエート基を導入することによってエキソヌクレアーゼの結合から保護した。インビトロにおいて改変した配列とP1ファージ前駆体との間のダブルクロスオーバー事象によりpac部位が欠損し、選択マーカーが獲得される。このノックアウトの機能は、自身のDNAを標的細菌にパッケージングまたは導入するP1バクテリオファージの能力を阻止する働きをする。
【0253】
図9に示すように、改変されたP1は、ゲノムに結合するクロラムフェニコールマーカーを導入することができず、pac突然変異体から作製されるファージ粒子はファージDNAを欠損していることを示唆している。図9の上のパネルは、pac部位に破壊カセットを組み込むことによるP1ファージ前駆体の物理的マップと予測されるP1ノックアウトとを示す。矢印は、P1 pac部位のS. cerevisiae TRP1遺伝子との置換を証明するために使用されるPCRプライマーの位置を示す。ゲルは、P1特異的プライマーを使用したPCRの産物(1、3、5および6)ならびに野生型P1ファージ前駆体またはP1ノックアウトを検出するための破壊カセット特異的プライマー(2および4)を示す。プライマー1および3は、破壊カセットのP1配列内に結合しないので、プライマー1+2および3+4だけによるPCRは、pac部位のS. cerevisiae TRP1遺伝子との置換を生ずる特定の組み込み事象を検出する。
【0254】
pac部位がpacABCオペロン内に存在している結果として、改変されたファージは、pacase酵素とトランス相補性である必要があった。pacABC相補プラスミドの構成を示す(図10および表5)。
【0255】
【表5】pacABC相補プラスミドの構成
【0256】
P1 pacABCは、早期プロモーターPr94から発現した。タンパク質、C1リプレッサーおよびBof修飾因子をコードした2つのファージを使用して、Pr94プロモーターからの発現を調節した。Bof単独はDNAに結合しないが、C1と一体として、リプレッサー−オペレーター相互作用の効率を増加した。c1リプレッサーはclts 100突然変異を有するので、温度感受性であった。これにより、pacABC遺伝子へのファージの 溶菌サイクル中の同調発現が可能になった。
【0257】
相補プラスミドにより、P1 pac突然変異体は伝達プラスミドをパッケージングするが、自身のウイルスDNAをパッケージングしない。pacase酵素との相補性により、P1 pac突然変異は伝達プラスミドをパッケージングするが、pac突然変異体から作製されるファージ粒子の一部はP1ウイルスDNAを含有した。クロラムフェニコール耐性形質導入体の分析は、大多数が2回目の増殖を生じることができいことを示し、それらは欠陥溶原菌であることを示唆している。pac突然変異体は、相補プラスミドとの組換えによってpac部位を獲得し、それによって突然変異体は自身のウイルスDNAをパッケージングし、送達することができると思われた。
【0258】
サザンブロット分析は、相補プラスミドのpacABC遺伝子がScTRP1破壊コピーで置換されていることを証明した(図11)。詳細には、伝達プラスミドおよびpac ABC相補プラスミドを保有するP1突然変異溶原ファージを32℃において増殖し、6時間ごとに新鮮な培地で1:100希釈した。1日、2日、3日、4日および5日目にDANを抽出し、Hind IIIで消化し、高ストリンジェンシー条件下においてScTRP1 EcoR1−BamH1断片で探索した。
【0259】
伝達プラスミドと改変されたP1ファージゲノムとの間の組換え事象によって、機能的(pacABC pac酵素の再構成を防止するために、図12に示すように、サイレント突然変異を相補プラスミドに導入した。相補プラスミドpac部位サイレント突然変異により、組換えが生じた場合でも、欠陥pac部位が生じ、欠陥pac部位はP1pacノックアウトに確実に導入された(図12)。162 bpのpac部位は、pac切断およびP1パッケージングを促進するのに十分である。HEX4およびHEX3ドメインを有するヘキサヌクレオチドエレメントの位置は□で示す。IHF結合部位、コンセンサス配列
を示す。pac切断の調節は5’側GATC部位のアデニンのメチル化に関係する。pac部位に導入されるサイレント突然変異は下側の活字ケースの文字で示される。
【0260】
P1ビリオンによる治療薬のインビボ送達
表6に掲載した5匹の動物モデル全てを本明細書において例示する。LD50は、大腸菌および緑膿菌の腹膜炎モデルにおいて確立されており、必要な菌量は多い(107〜108細菌細胞/動物)。さらに、マウスにおけるシュードモナス感染症の嚢胞性繊維症モデルは、この疾患に特徴的な日和見肺感染症を治療するための、本発明の毒性剤および方法の効率を証明するために使用される。
【0261】
【表6】原核細胞による遺伝子治療の動物モデル
【0262】
腹膜炎モデル
本発明の伝達プラスミドは、マウス腹膜炎モデルにおいてインビボで大腸菌およびシュードモナスにP1送達系を用いて送達した。移入は、腹腔内腔から回収した細菌からプラスミドを単離し、回収したプラスミドの制限分析によって確認した。結果は、本発明の送達媒体は、感染患者に毒性を生ずることなく、細菌標的に本発明の毒性剤を送達することができることを証明している。
【0263】
インビボにおけるファージに対する免疫応答およびファージ除去動態も検討した。結果は、マウスあたり2×109の溶原ファージ形成単位(lfu)のP1ファージを1回注射すると、8〜14日後に抗ファージ抗体が形成されたことを示している。2群のマウス4匹に、2×109lfuの長期循環型(long−circulating)P1ファージを腹腔内(IP)注射した。抹消血は、注射後1時間、4時間、8時間および24時間経過時にテールクリップによって採取し、大腸菌C600標的細胞で滴定した。以前にファージを投与した群は、この実験の18日前に、等量の同じファージ調製物を腹腔内投与した。プレ免疫群は事前処置を行わなかった。これにより、インビボにおいてファージが迅速に除去された(図13)。しかし、ヒトでの治療を考慮すると、多数の感染患者(特にシュードモナス感染患者)は免疫寛容状態であり、強力な免疫応答を形成することができない。従って、本発明の治療および組成物は、このようなヒト対象に特に有用である。
【0264】
また、P1の長期循環型変種は、マウスによる継代によって選択され、注射後24および30時間経過時には循環液中に残存するファージは200倍多い(図14)。6匹のマウスの群に5×108 lfuのファージまたは5×108 lfuの長期循環型P1ファージを腹腔内注射した。注射後1、6、24および30時間経過時にテールクリップによって抹消血を採取し、大腸菌C600標的細胞で滴定した。各時間経過時において血液1 mlあたり残存する生きているファージの数を図14に示す。循環液中に持続する改善の倍数は表の最後の欄に示す(lfu長期間循環型P1ファージ/lfu元のP1ファージ)。従って、長期間循環型P1は本発明の範囲内である。高い濃度のファージが感染患者の循環液中に望ましい場合には、このような変種は特に好ましい。例えば、対象が血中の病原菌または細菌感染症を有する場合にはそれが望ましい。
【0265】
孵化(embryonated)鶏卵モデル
P1送達媒体によって送達される毒性剤の効率を証明するために、感染の孵化鶏卵モデルを報告されているプロトコールから改良した。外見的には、Hartl, A.ら(1997、「孵化鶏卵における緑膿菌感染(Pseudomonas aeruginosa infection in embryonated hen’s eggs)」、Arzneim.−Forsch. 47(II): 1061−1064)のモデルを、卵をインキュベーションし、卵殻に穴をあけて、投与を実施するように改良した。簡単に説明すると、卵は、広い方の極を上にした垂直位置でインキュベーションし、4日ごとに90度の弧で自動的に回転させた。殻は、接着剤で殻を補強し、はさみで丸い局をテープと殻を切断することによって広い方の局から開けた(開口部径約1cm)。下層の卵殻膜を滅菌水で湿らせ、滅菌したピンセットで1 cm2の卵殻膜をはがし、透明な漿尿膜(CAM)を露出させる。水分が損失しないように接着テープで卵殻を密閉して、インキュベーションを18〜24時間継続した。その時点においてキャンドリング(明るい光源の前に卵を置くことによって胚を観察すること)によって生存度を評価した。自然な動きが観察されれば生存の証拠である。細菌懸濁液をCAMにピペットで適用することによって、生きている卵に接種した。治療薬をCAMにピペットで適用するか、またはシリンジで卵殻の他の位置から注射した。卵殻の開口部をテープで密封して、インキュベーションを継続し、上記のキャンドリングによって生存度を評点した。細菌およびファージは、卵殻に作製した開口部から卵に導入し、次いで密封し、孵卵(gestation)を継続した。
【0266】
インビボ系として種々の利点を有する孵化鶏卵モデルは上記のように確立した。詳細には、卵モデルは非常に低いLD50しか必要とせず(緑膿菌では<10 cfu/卵および毒性株の大腸菌では>50 cfu/卵)、卵モデルはまた迅速で、自己充足しており、未成熟免疫系を提供する。大腸菌および緑膿菌(PA01)のヒト臨床単離株は、非常に低い細菌量でも(100〜1000細胞)このモデルに致死的な感染症を常にもたらし、治療薬を証明することができる。これらのテストは、docなどの毒性剤のインビボにおける効果を示す。
【0267】
本発明の送達媒体が伝達プラスミドをインビボにおいて送達する能力を証明するために、カナマイシン耐性遺伝子を保有する伝達プラスミドを大腸菌および緑膿菌にインビボにおいてマウスおよび孵化鶏卵に送達した。結果は、P1系による毒性剤の送達がインビボにおいて成功していることを示した。
【0268】
緑膿菌鶏卵モデル
ニワトリ胚へのインビボにおけるプラスミド移入:孵化鶏卵を使用して、インビボにおいて伝達プラスミドpBHRをP1ファージによって細菌細胞に送達した。詳細には、孵化鶏卵6個の群に、孵卵10日目の漿尿膜を介して細菌およびファージを接種した。P1溶原ファージは、doc遺伝子をコードする伝達プラスミド、pDocを保有する。このファージ調製物は、p1 DNAまたはpDocを含有する粒子の混合物であった。ファージ溶解産物は、pDoc含有粒子に対するP1含有ファージ粒子の比が約99:1であった。
【0269】
結果は、ヒト臨床緑膿菌PA01を接種した直後にP1またはP1−pDoc溶解産物を加えたとき、卵の生存率が増加したことを証明した(図15)。
【0270】
大腸菌鶏卵モデル:
P1 DNAによる形質導入に不応である大腸菌のヒト臨床単離株は孵化鶏卵において致死的な感染症を生ずることが見出されている。この単離株はEC−4と命名され、2つの理由により重要である。第一には、この株は安定なP1溶原ファージを形成できず、doc保有ファージ調製物によるEC−4細胞の死滅は、毒性剤docの致死的な活性を証明した。
【0271】
詳細には、P1−pDoc溶解産物は、P1−pBHRファージ単独より効率的にEC−4大腸菌をインビトロにおいて死滅させた(図16参照)。詳細には、図16に示す感染多重度(MOI)で、毒性剤doc(P1−pDoc)を含有するファージまたは対照の伝達プラスミドpBHR(P1−pBHR)でEC−4細胞(500 cfu)を処理し、非選択培地で培養し、緩衝液単独で処理した生細胞の割合として計数した。結果は、毒性剤docは、大腸菌EC−4の適応を低下させ、病原菌の死滅を増加することができた。また、大腸菌の死滅はインビトロにおいてP1の50〜700のMOIで確認され、docは、5〜7のMOI、すなわち、総P1粒子の1%で大腸菌を死滅することができた(図16)。
【0272】
第2に、地元の病院の臨床単離株のランダム試料にこの株が存在することは、溶菌性ファージに抵抗性であるが、毒性剤ファージ送達系に感受性である病原菌株ヒト集団中にが存在することを証明した。詳細には、以下の表7に示すように、大腸菌の3つの臨床単離株を、P1 DNAで形質導入される能力(クロラムフェニコール耐性の獲得で示される)および伝達プラスミドDNAで形質される能力(カナマイシン耐性の獲得で示される)について、大腸菌の実験株C600を比較した。3つの臨床単離株は全て伝達プラスミドで形質導入されたが、2つだけがP1で溶原性になった。これらの結果は、ファージ抵抗性機序はP1 ウイルスDNAの形質導入を抑制しており、伝達プラスミドのEC−4細胞への送達を抑制できなかったことを示している。
【0273】
【表7】臨床単離株−P1形質導入の感受性
【0274】
さらに、2×103のEC−4細胞による感染は、P1の700〜800MOIで、細菌を接種した直後に投与したP1−pDoc溶解産物治療により卵内で治癒された(ビリオンを含有するdocは総ファージ粒子の1%である)(図17)。詳細には、7つの孵化鶏卵群に、孵卵10日目に、漿尿膜を介して細菌およびファージを接種した。p1−pDocファージは、pDocを有するP1溶原ファージ、doc遺伝子をコードする伝達プラスミドまたは対照の伝達プラスミドpBHRから作製した。このファージ調製物は、P1 DNAまたはpDocを含有するビリオンの混合物である。ファージ溶解産物は、pDocを含有する粒子に対するP1を含有するファージ粒子の比が約99:1であった。これらの結果は、病原菌感染症が、P1送達媒体を介するdocなどの、本発明の治療薬によって根絶されることを示している。
【0275】
哺乳類動物モデル
3匹のマウスおよびラットモデルを使用して、本発明の毒性剤の効果を証明した。各モデルは、免疫寛容で、次いで細菌を投与される動物を使用する。モデルは、細菌投与経路および免疫障害を生じる手段が異なる。
【0276】
2つのモデルにおいて、免疫障害は火傷モデルに形成する。詳細には、ヒトまたは他の動物の全体表面積の10〜20%の火傷により、10〜14日継続し、免疫系のほぼ全ての支流に関係する、ある期間の免疫障害を生じる。緑膿菌による実験的感染症のために文献において十分に記載されている2つの火傷モデル(例えば、J.P. Waymackら、1988、「複数の敗血性動物モデルにおける免疫調節物質としてのシクロホスファミドの評価(An evaluation of cyclophosphamide as an immunomodulator in multiple septic animal models)」、J. Burns and Clinical Rehabilitation 9(3): 271−274を参照、また、Stieritz, D. D.およびHolder, I. A.、1975、「緑膿菌による感染の病原性の実験的研究:火傷マウスモデルの記述(Experimental Studies of the pathogenesis of infections due to Pseudomonas aeruginosa: Description of a burned mouse model)」、J. Infect. Dis. 131(6): 688−691も参照 )を使用して、この種類の創傷に生じる種類の感染症に対する毒性剤治療薬の有効性を証明した。
【0277】
第3のモデルは、胃腸管の内因性微生物叢が体腔に侵入して、敗血症を生じる、免疫寛容状態(白血球減少症)を生ずる生物修飾因子シクロホスファミドを使用する。この種類の敗血症は免疫不全患者において記載されている(Furuyaら、1993、「多様な源からの緑膿菌分離株によって生じるマウス内在性敗血症における死亡率(Mortality rates amongst mice endogenous septicemia caused by Pseudomonas aeruginosa isolates from various sources)」、J. Medical Microbiology 39: 141146; Woodsら、1997、「好中球減少マウスにおける病原性と臨床および環境的単離株からの緑膿菌ビルレンス因子との相関(Correlation of Pseudomonas aeruginosa virulence factors from clinical and environmental isolates with pathogenicity in the neutropenic mouse)」、Can. J. Microbiol. 43: 541−551参照)。
【0278】
モデル1:成体マウス、背面火傷、創傷表面への細菌投与
第1の使用モデルは、Strieritz, D. D. およびHolderm I. A. のものである(1975、J. Infect. Dis. 13(6): 688−691);また、Neely, A. N. and Holder, I. A.、1996、「敗血性宿主における抗菌誘導性内毒素の放出の研究に関連する臨床局面でのマウスモデル(A murine model with aspects of clinical relevance for the study of antibiotic−induced endotoxin release in septic hosts)」、J. Endotoxin Research 3: 229−235.も参照)。若い成体雌マウス、22〜25g、ICR株(または、Balb/c、CD1、C3HEB/FeJ、C3H/HeJ、C57BL/6、DBA/2、A/J、CBA、C3H/HeNの場合もある)をペントバルビトール(pentobarbitol)で麻酔し、背面を剃毛した。1×1.5インチの開口部を有する耐熱性プラスチックカードを剃毛した背中に配置し、0.5mlのエタノールを露出した皮膚にピペットで適用し、10秒間焼いた。炎を消し、腹腔内注射(IP)により、1〜2mlの生理食塩液を補液としてマウスに投与した。この手法は、22〜25gのマウスの体表面積の12〜15%を覆う、非致死的で中間層熱傷を生ずる(NeelyおよびHolder、1996、上記)。火傷の1時間後、マウスに鎮痛性を与えた後(ブプレノルフィン2mg/kg,IM)、少量の細菌(100 cfuの緑膿菌)を0.1 mlの生理食塩液に加えたものを創傷に皮下注射した。毒性剤治療薬または偽薬を、病原菌投与1時間後または直前に、同じ部位に同時に投与(生理食塩液に加えたもの0.1 ml)するか、またはIP注射した(生理食塩液に加えたもの0.5ml以下)。動物は敗血症について観察し、12時間を越えない間隔で疼痛の治療を行った(ブプレノルフィン 2mg/kg、IM)。通常の食餌および水は随時与えた。死亡は、約48時間以内に未処理の火傷群において予期される。12〜24時間間隔で、尾静脈採血により血液試料(10〜25 ul)を採取して細菌負荷をモニターした。死亡時または安楽死時に血液および器官を採取し、細菌負荷をモニターし、緑膿菌敗血症による死亡または処理動物における感染症の除去を確認する。
【0279】
モデル2:成体マウス、背面火傷、IPまたは創傷表面への細菌投与
第2のモデルは、Waymackら、(J.P. Waymack, G.D. Warden, J. W. Alexander, P. M.およびS. Gorne.、1988、「複数の敗血性動物モデルにおける免疫調節物質としてのシクロホスファミドの評価(An evaluation of cyclophosphamide as an immunomodulator in multiple septic animal models)」、J. Burns and Clinical Rehabilitation 9(3): 271−274)。若い雄Lewisラット(100〜125g)をペントバルビトール(pentobarbitol)(〜40mg/kg)を腹腔内注射して麻酔し、背面を剃毛した。剃毛した領域(総体表面積の20%)を露出している耐熱性鋳型に動物を押し付けた。この鋳型を10秒間95℃の水浴に漬けた。水浴を除去後、体液維持療法のために(循環血液量の約1/2が推奨される)、動物に5〜10 mlのリンガー乳酸(Ringer’s Lactate)液を投与し、鎮痛作用のためにブプレノルフィン(0.1〜0.5mg/kg、12時間ごと)を投与した。この傷害は全層皮膚火傷で、さらに傷害がない場合には死亡率は0であると報告されている。50%致死量の細菌投与(1×108 cfuの緑膿菌を0.5mlの生理食塩液に加えたもの)を火傷から4日目に腹腔内注射によって、または火傷から1日目に細菌懸濁液を塗布することによって実施した。腹腔内感染経路は24時間以内に(すなわち、火傷から5日目)敗血症を生じ、火傷から12日目までには全動物が死亡することが報告されている。従って、腹腔内注射の証明は火傷から12日目に終了することができる。火傷部位へのシュードモナスの塗布は、接種後7〜8日で敗血症を生じることが報告されており(火傷から8〜9日目)、生存率は20日目までは安定である。この方法を実施した動物は火傷から21日目に安楽死させる。通常の食餌および水は随時与えた。一部の動物は、火傷領域への局所投与または腹腔内注射によって投与する本発明の治療薬(毒性剤をコードする伝達プラスミドを含むP1ファージ)で治療する。血液試料(50〜100 ul)をペントバルビトール(pentobarbitol)麻酔したラットの眼窩後方採血によって12〜24時間間隔で採血して、細菌負荷をモニターすることができる。死亡時または安楽死時に血液および器官を採取して、細菌負荷をモニターし、緑膿菌敗血症による死亡を確認する。
【0280】
モデル3:成体マウス、抗生物質およびシクロホスファミドの注射、経口細菌投与
これは、Furuyaらの内因性敗血症のモデルである(Furuya, N.、Hirakata, Y.、Tomono, K.、Matsumono, T.、Tateda, K.、Kaku, M.およびYamaguchi, K.、1993、「多様な源からの緑膿菌分離株によって生じるマウス内在性敗血症における死亡率(Mortality rates amongst mice with endogenous septicemia caused by Pseudomonas aeruginoza isolates from various sources)」、J. Medical Microbiology 39: 141−146)。体重20〜25gのマウスを滅菌環境で飼育し(例えば、隔離箱)、滅菌した食餌および水を与えた。アンピシリンナトリウム(200mg/kg)を1日目および2日目に腹腔内注射して、通常の腸内細菌叢を妨害し、緑膿菌によるコロニー形成を助ける。シクロホスファミドを6日目および9日目に腹腔内注射した(250mg/kg)。この投与量は、感染症が存在しない場合に致死させることなく白血球減少症を誘発する。2〜4日目に飲料水中に混入させて細菌をマウスに投与する。本発明の治療薬による治療(毒性剤をコードする伝達プラスミドを含むP1ファージ)を9日目に開始し、腹腔内注射により投与する。細菌投与前および感染期間中種々の間隔で糞ペレットを回収し、緑膿菌の有無をモニターする。敗血症の発症は、シクロホスファミドの2回目の投与の24〜48日後であると予期され(11日目)、約80%の死亡率が14日目までに予期される。尾静脈採血によって採取される血液試料も、4日目以降12〜24時間間隔で採血することができる。または、最終のシクロホスファミド注射後その日に腹腔内注射によって細菌を導入することによってアンピシリンの注射を行わなくてもよい(Woods, D.E.、Lam, J. S.、Paranchych, D.P.、Speert, D.P.、Campbell, M.およびGodfrey, A. J.、1997、「好中球減少マウスにおける病原性と臨床および環境的単離株からの緑膿菌ビルレンス因子との相関(Correlation of Pseudomonas aerginosa virulence factors from clinical and environmental isolates with pathogenicity in the neutropenic mouse)」、Can. J. Microbiol. 43: 541−551)。
【0281】
【表8】マウスモデルに使用した、以下の様式での治療用製剤
総動物数:112匹のマウス/モデル×2モデル=224匹のマウス
【0282】
【表9】用量依存の証明は以下のように実施される
総動物数:36匹のマウス/モデル/薬剤×8薬剤×2モデル=576匹のマウス
【0283】
【表10】以下の様式での治療用製剤をラットモデルに使用する
総動物数:36匹のマウス/薬剤×8薬剤=278匹のマウス
【0284】
動物による証明の結果は、本発明の毒性剤を含むファージ治療薬は、対象の細菌感染症を治療するのに好適である。ウシ、ブタ、コヒツジ、モルモット、ウサギ等を含むが、これらに限定されない、当技術上周知の他の動物モデルも本発明の範囲内である。本発明の好ましい局面において、本発明の治療薬を必要とする対象は、火傷傷害を有する哺乳類である。
【0285】
嚢胞性繊維症のマウスモデルにおける日和見感染症の治療
本発明の毒性剤は、嚢胞性繊維症に関連する感染症などの細菌感染症の治療に有用である。本発明の利用性(unility)の証明として、ヒト嚢胞性繊維症(CF)患者に見られる種類の感染症に類似している、シュードモナス呼吸器感染症のマウスモデルを使用する。このモデルは、cftr遺伝子のDF508突然変異(C57BL/6DF508マウス)およびそれらの野生型(C57BL/6マウス)またはcftr突然変異のないBALB/c成体マウス(6〜8週齢)を使用する。DF508突然変異は、ヒトCF患者に見られる最も一般的な突然変異の1つであり、C57BL/6DF508マウスはこの疾患を有する患者に似た症状を多数有する。離乳後、cftr突然変異によるこれらのマウスに共通する致命的腸閉塞を予防するために、DF508 cftr同型接合突然変異体はペプタミン(Peptamin)液状飼料(Clintec Nutrition Co.、Deerfield、MI)およびゴリテリ(golytely)を含有する水で飼育管理しなければならない(Zaidai, T. S.ら、1999 「緑膿菌の角膜上皮細胞摂取を正常に介する嚢胞性線維症の膜コンダクタンスは実験マウス角膜炎の病原性において鍵となる要素である(Cystic fibrosis transmembrane conductance regular−mediated corneal epithelial cell ingestion of Pseudomonas aerginosa is a key component in the pathogenesis of experimental murine keratitis)」、Infection and Immunity 67(3): 1481−1492参照)。C57BL/6DF508マウスが入手できない場合には、BALB/cマウスを使用することもできる。
【0286】
実験手法は以下のとおりである(例えば、Pier, G. B.ら、1996、「肺感染に対する嚢胞性線維症患者の過感受性における突然変異体CFTRの役割(Role of mutant CFTR in hypersusceptibity of cystic fibrosis patients to lung infections)」、Science 271: 64−7参照)。成体マウスを、塩酸ケタミン(65 mg/kg)およびキシラジン(13mg/kg)の調製直後の混合物を腹腔内注射することによって麻酔する。次いで、マウスを立位で保定し、10 ulの細菌懸濁液を各鼻孔に入れる(総量20 ul)。マウスの意識を回復させ、72時間まで生存を観察するか、または種々の組織、特に肺における細菌負荷を求めるために、感染後24時間までの種々の経過時間においてCO2過剰投与によって屠殺する。麻酔は感染手法の必要な部分である。無麻酔のマウスは、効率的に接種物を吸引することができず、感染しない。本発明の1つ以上の毒性剤を含む治療用ファージは、例えば、鼻腔内、静脈内または腹腔内投与する。本発明の治療薬を投与されたマウスは、未処理の対照マウスより長く生存する。従って、本発明の毒性剤は、感染症を改善または根絶する目的のために、病原菌(例えば、細菌)感染症を有する対象に送達することができる。
【0287】
8. 実施例:毒性剤としてのSOFセンスの構築および特徴づけ
毒性剤がリボザイムカセットを使用して送達されて発現されることを証明するために、本発明者らは、Sofと呼ばれる必須分子に対して向かう毒性剤を操作し、細菌細胞を死滅させるために、細菌細胞にリボザイムカセット内の毒性剤を送達する。
【0288】
本明細書で上述のように、毒性剤は、病原菌または選択された細胞の必須分子を標的とするように設計されている分子であってもよい。細菌の必須アンチセンス分子の一例はSofである。Sofは、gefと呼ばれる染色体によりコードされる毒素のアンチセンス解毒剤である。Sofは、通常、病原菌のgefレベルを調節する作用をし、従ってgefの存在下において細胞は生存することができる。本発明の発明者らは、Sofに相補的なセンス分子を設計した。Sofに対するセンス分子は、Sofがgefを調節する能力を阻止する作用をすると、内因性gefレベルを細菌にとって毒性にすることによって、病原菌内に毒性をもたらした。
【0289】
詳細には、Sofセンスをトリプルリボザイムカセット内に構築した(5’側および3’側シス作用性リボザイム)。Sofセンス毒性剤を含有するリボザイムカセットをLEASHIプロモーターに結合した。リボザイムカセットをコードする核酸を使用して大腸菌を形質転換した。細菌細胞をLB Amp+IPTGで培養した。プレートは37℃において終夜インキュベーションした。次いで、形質転換体の存在、コロニーのサイズ、増殖速度および形態的な差についてプレートを計測した。
【0290】
これらの検討の結果は、リボザイムカセットからのSofセンス分子の発現により標的細菌に毒性作用を生ずることを示した。
【0291】
9. 実施例:リボザイムおよびリボザイムカセット
本発明の方法に特に有用なリボザイムカセットは、以下を含むが、これらに限定されない:
【0292】
pClip(図19に記載する遺伝子エレメント)は、示すカセットがpBluescriptのNotI部位にあるpBluescriptの改変体である。毒性剤またはトランス作用性リボザイムをBgl II部位(TGCTCT)に構築する。真核細胞に送達されるとき、pClipからの内部リボザイムまたは毒性剤の遊離により、核に約20%および細胞質に80%の毒性剤またはリボザイムが分布される。pClipはまた原核細胞を標的とするために使用される。
【0293】
本発明の方法に関連して有用な第2のリボザイムカセット/ベクターはpChopである。pChopは、内部トランス作用性リボザイムまたは毒性をより効率的および効果的に遊離させるために、pClipから改変されている。pChopリボザイムカセットを図20に示す。真核細胞に送達されたとき、pChopから内部触媒中心リボザイムが遊離すると、核に局在化する。
【0294】
本発明の方法に関連して有用な第3のリボザイムカセットはpSnipである。pSnipマルチリボザイムは、pChopの5’側にpClipカセットを操作することによって構築される。また、pSnipマルチリボザイムは、各カセットにトランス作用性リボザイムまたは毒性剤を有する触媒中心配列を含有する。トランス作用性リボザイムまたは毒性剤の各ペアは短いスペーサーによって結合され、ペアの3’側に位置するヘアピンループによって安定化される。図21は、pSnipカセットの略図である。
【0295】
トランス作用性リボザイムまたはアンチセンス毒性は、アニーリングされたとき、2つのシス作用性リボザイム間の領域に含有される制限エンドヌクレアーゼにより消化することによって作製されるものと同一の1本鎖末端を形成するように消化される逆相補重複オリゴデオキシヌクレオチドとして合成される。この特定の実施例において、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、Bgl IIによって認識されるものである。本質的に全てのRNAを標的とすることができ、特異性は、標的とされるRNA分子の選択された切断部位に隣接する配列に逆方向または相補性であるリボザイムの配列を選択することによって与えられる。次いで、毒性剤またはトランス作用性リボザイムをダブルリボザイムカセット内のクローニング領域(ポリリンカー)内にクローニングして、標的とする毒性剤またはリボザイムを作製する。大腸菌 secA、(EcosecA、AE000119 U00096)、 geneX(EcosecA、AE000119 U00096)ftsZ(AE000119;U00096)、dnaG(AE000388 U00096)、rpoA(AE000407 U00096)およびtRNA−asp(X14007)、ストレプトマイセス・リビデンス(Streptomyces lividins) secA(Z50195)、エンテロコッカス・フェーカリス ftsZ(U94707)シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)dnaG(U85774)、ストレプトマイセス・ケリコロール(Streptomyces coelicolor) rpoA(X92107)、スタヒロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)tRNA−Asp(X66089S42075)、ブドウ球菌(Staphylococcus)RNAIIIを含むが、これらに限定されない原核細胞の配列を標的とするトランス作用性リボザイムが構成されている。
【0296】
真核細胞の配列を用いる設計を使用して、a)反復B2転写物(B2);b)RNAポリメラーゼI(po1I);c)B型肝炎ウイルス(HBV);d)ソニックヘッジホッグ(SH)e)ヒトパピローマウイルスE6/E7タンパク質(HPV);f)RNAポリメラーゼII(polII)、g)インスリン様増殖因子1(IGF1);h) 網膜芽細胞腫タンパク質(RB);i)およびj)多触媒性プロテイナーゼαサブユニットC3およびC9(それぞれ、C3およびC9);k)テロメラーゼ(tel);l)形質転換増殖因子β(TGFβ)、m)カタラーゼ(CAT);n) ペルオキシソーム増殖結合受容体(PpaTα);ならびにo)チトクロームP450 1E1(p4501E1);KiSS−1、NudC、アンドロゲン受容体およびSF−1転写因子も評価した。標的RNA(遺伝子座の名称およびアクセッション番号)ならびに選択された標的部位を示す(表11)。
【0297】
【表11】標的とされたRNAおよび標的部位の要約
【0298】
【表12】ライブラリー選択によるHPV E6/E7標的RNAの同定される部位
【0299】
【表13】ライブラリー選択により同定されるHBV RNA上の部位
ヌクレオチドトリプレットおよび部位
* X75664、X75657、X75665、X75663およびX75658を含むが、これらに限定されない。
# X75664、X75657、X75656およびX75665を含むが、これらに限定されない。
【0300】
HBV、Pol IおよびPTEN mRNAの特定の標的部位に向かうリボザイムを構築し、表XおよびYに掲載する。表Xに関しては、接頭語「Rz−」の次の数は関連するmRNAの切断部位を示す。表Yは、標的部位に結合するリボザイムのRNA配列に相当する隣接配列を同定している。これらの隣接配列は触媒中心の5’側および3’側に見られ、配列
(配列番号)を有する。本発明のトリプルリボザイムのシスエレメントは開示されている関連のベクターに見られる。好ましい態様において、2つのリボザイム(同一または異なる)を、両者の間に短い(3〜15 nt)リンカーを入れて組み合わせることができる。
【0301】
1回の代謝回転条件を使用して、sRzおよびmRzの触媒活性を求めた。少量の[32P]で標識した標的RNAを5 mM MgCl2、20 mM Tris−HCl( pH 7.4)において37℃において40または200 nM Rzと共に30分間インキュベーションし、切断産物を変性性PAGEで分離した(HBV標的Rzsのインビトロ切断結果は図23および24参照)。sRzのうち3つは、30分間の切断反応中、「高い」活性を示し、40 nM Rzを使用したとき標的RNAの39〜44%を切断し、200 nM Rzを使用したとき標的RNAの48〜71%を切断した。sRzの1つおよびmRzの1つは、「中程度」活性を示し、それらは40 nM Rzにおいて標的RNAの8〜10%または200 nMにおいて10〜15%を切断する。別のmRzは不活性であった。追加の実験において、Rz濃度を1.6 nMに低下しても、活性が高い3つのsRzの切断産物がPAGEにより見られた(データは示していない)。全体として、sRzの92%が効率的な活性レベルを示し、54%は活性が高く、38%は活性が中程度であった。一方、mRzはどれも活性が高くなく、50%は中程度または低い活性を示し、50%は不活性であった(表X)。
【0302】
【表X】Rzの相対的な触媒活性の要約
【0303】
動態分析では、40 nM Rzおよび1〜100 nMの標的RNAを種々の期間インキュベーションして、1回および多数回の代謝回転条件下の動態データを得た。HBV標的sRzの結果(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図10)は、26 nMのKmおよび1×106(M−1分−1)のKcat/Kmを示した。他のsRzの同様の分析は0.6×106(M−1分−1)のKcat/Km値を示した。比較すると、これらの標的および他の標的に対するmRzで得られたKcat/Km値は(Benedictら、1998、Carcinogenesis 19: 1223−1230、Renら、1999、Gene Ther. Mol. Biol. 3:257−269、およびCroneら、1999、Hepatology 29: 1114−1123)は、典型的には、1オーダー程度低い。
【0304】
細胞においてsRzの有効性を試験するために、HBV DNA(それらはウイルスに直接感染できない)をトランスフェクションさせた後、HBV複製および分泌を支持することができるHepG2細胞(ヒト肝芽腫細胞系統)を使用した。HepG2細胞に、CLIP TripleリボザイムカセットのHBV DNA構築物およびHBV標的sRzを同時トランスフェクトした(Benedictら、1998、Carcinogenesis 19: 1223−1230、Renら、1999、Gene Ther. Mol. Biol. 3: 257−269、およびCroneら、1999、Hepatology 29: 1114−1123)。CLIPカセットは、HBVを標的とする内部トランス作用性Rzに隣接する2つのシス作用性Rzをコードする。2つのシス作用性Rzは、一次転写物から自身を放出して、最小非特異的隣接配列を有するトランス作用性内部ハンマーヘッドRzを遊離する機能を有し、この過程は重大な利点となる。
【0305】
HBV構築物およびTrz構築物をHepG2細胞に同時トランスフェクトし、HBV複製に対するsRzを影響について培養物を分析した。sRz777またはsRz885を含有するCLIP構築物をトランスフェクションした後4日および5日経過時に、HBV分泌の劇的な阻止が観察され(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルC)、同時に、HbsAg分泌の阻止(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルD)およびHBV RNA標的転写物の顕著な低下(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、それぞれパネルAおよびB)も観察された。sRz777およびsRz885の標的部位は、3つの主要なHBV転写物全てが標的とされる位置に配置される。比較のために、5’側隣接配列にヌクレオチド置換を含有するmRz408 CLIP構築物も使用した。このRzは、「中程度の活性」を示し、sRz408の速度の約20%の速度でHBV標的を切断し(示していない)、その活性はmRz247に相当する。mRz408CLIP構築物は、HBV複製を遮断する際に有効ではなかった(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルA−D)。また、mFold選択部位へのCLIP構築物標的は、この系ではHBVに対する活性がないことを示した(データは示していない)。
【0306】
777および885 CLIP構築物を用いた2つの追加の反復実験も、HBVの分泌の顕著な低下を示したが(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルE)、HbsAg分泌およびHBV RNA転写物の低下はばらつきが大きかった。関連の実験において、別のHBVリボザイム、pCHOPベクターのシスエレメントから遊離されるとき、配列
(配列番号:)を有するHBV Rz881は、リポソームに複合体形成して(Templetonら、1997)、腹腔内注射するとき、マウス肝臓細胞からのHBV分泌およびマウス肝臓細胞におけるHBV複製を低下することが示されている。
【0307】
要約すると、HBVを標的とする選択されたRzも、HBV複製の細胞培養モデルにおいて有効であることが示されている。
【0308】
【表Y】リボザイム隣接配列
【0309】
材料と方法
インビトロにおける切断試験
ガイド−RNAライブラリーの作成について記載されているT7(HBVおよびPolI)またはSp6(PTEN)ポリメラーゼを使用して、個別の部位を標的とするRzを2本鎖DNAオリゴヌクレオチドから転写した。Rzの標準的なスクリーニングでは、インキュベーションは少量の[32P]標識標的RNA、40 nM Rz RNAを含有し、37℃において、20 mM Tris−HCl(pH 7.4)、5 mM MgCl2中で30分間(または2時間)実施した。インキュベーション後、試料を尿素ポリアクリルアミドゲルで分離し、次いでゲルを乾燥し、Phosphor−Imagerを使用して放射能を分析した。
【0310】
動的分析では、少量の[32P]標識標的RNAを未標識標的RNA(最終濃度1、10または100 nM 標的RNAを得る)およびRz−RNA(最終濃度40 nM)と混合して、インキュベーション時間を変更(20秒、40秒、1分、3分、10分、30分および2時間)した以外は上記のインビトロライブラリー選択と同じ条件を使用して、インキュベーションを実施した。次いで、尿素ポリアクリルアミドゲルで試料を分離し、次いで乾燥し、Phosphor−Imagerを使用して分析した。
【0311】
細胞培養物中の HBV 複製に対する Rz の影響
細胞培養物中のsRzの有効性を試験するために、10%熱不活性化ウシ胎児血清を補給した最小必須培地において30℃、5%CO2の加湿恒温槽においてHepG2細胞を維持した。これらの細胞に、pBB4.5HBV1.3(1.3×単位長さのHBV DNAプラスミド構築物;Delaney & Isom、1998、Hepatology 28: 1134−2246参照)およびpLSCLIP、pLSCCLIPmRz408、pLSCLIPsRz777またはpLSCLIPsRz885(pLSCLIPは、Stratagene製のLacSwitchベクターのCLIPカセットを示す)を同時トランスフェクトした。pLSCLIPsRz777およびpLSCLIPsRz885は、逆相補オリゴヌクレオチド(それぞれ、CLAW437/CLAW438およびCLAW397/CLAW398)をアニーリングし、pLSCLIPのBgl II部位にそれらを挿入することによって構築した。pLSCLIPmRz408は、オリゴヌクレオチドCLAW435/CLAW436と同じ方法で構築した。しかし、これらのオリゴヌクレオチドは、不注意なことに、5’側隣接領域がミスマッチを含有するように合成され、その後のインビトロにおける試験は、このRzは、sRz408の触媒活性の約20%を有することを示し、これはmRz247の活性に相当するので、この実験には「中程度」の比較として含まれた。
【0312】
FuGENE6トランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim)を使用して、HepG2細胞をトランスフェクトした。合計5μgのDNA(0.5μgのpBB4.5HBV1.3および2.7μgのPLSCLIP構築物)、24μlのエンハンサーおよび30μlのEffectenceトランスフェクション試薬。血清を含有する培地においてDNA/試薬混合物中で細胞を6時間培養した。
【0313】
ノーザンブロット分析では、トランスフェクション後4日目および5日目に総RNAをトランスフェクトしたHepG2細胞から単離し(Chomczynski & Sacchi、1987、Anal Biochem 162: 156−159)、上記のように、10μgの総RNAを使用してノーザンブロット分析を実施した(Davisら、1986、「真核細胞からのRNAの調製および分析(Preparation and analysis of RNA from eukaryotic cells):分子生物学における基礎方法(Basic Methods in Molecular Biology)」、New York: Elsevier Science Publishing Co., Inc.、129−156)。ランダムプライミング(Boehringer−Mannheim Ramdom Prime DNA Labeling kits)によって作製した[32P]放射性標識HBVプローブを使用してハイブリダイゼーションを実施した。同時にHBVおよびGAPDH転写物についてブロットを探索した。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー条件下においてブロットを洗浄し、オートラジオグラフィーに暴露した。
【0314】
分泌された細胞外HBV DNAの分析は、トランスフェクション後4日目および5日目に培地を回収し、6,000×gにおいて5分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。記載されているように、3本組の試料をプールし、HBV粒子を沈殿させ、分析した(Weiら、1996 J. Virol. 70: 6455−6458)。ウイルスのペレットをPBSに懸濁させ、プロティナーゼ(Proteinase)Kで消化し、次いでフェノール/クロロホルムで抽出した。0.1容量の3 M 酢酸ナトリウムと1容量のイソプロパノールでDNAを沈殿させた。10μgのtRNAを沈殿の担体として添加した。ペレットをTEに懸濁し、0.5mg/mlのRNaseで1時間消化した。次いで、DNAを電気泳動およびサザンブロット法、その後のオートラジオグラフィーで分析した。
【0315】
選択されたHBV表面抗原(HbsAg)を分析するために、Sorin診断キットを使用して、ラジオイムノアッセイで検出を実施した。トランスフェクトした細胞の培地を回収して、6,000×gで遠心分離して、細胞残渣を除去した。総計数を分析のために比較した。
【0316】
10. 実施例:好ましい標的配列およびいくつかの好ましいDNAzyme
本出願の開示内容において同定されるヒトパピローマウイルス(HPV)およびB型肝炎ウイルス(HBV)標的部位は、これらの部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムのハイブリダイゼーションの部位として有用である。好ましい標的は、HPV E6/E7 mRNAまたは肝炎ウイルスのコア、プレコアもしくはポリメラーゼコード配列である。
【0317】
HPV16−Dz57と名づけられる、HPV16に特異的なDNAzymeの好ましい態様は以下のようである:
触媒中心に下線をつけ、隣接5’側および3’側配列は、生理的条件下において、配列番号:AAとして同定される標的配列にハイブリダイズする。
【0318】
一般に、本発明のDNAzymeは、触媒中心の配列に5’側および3’側隣接配列を加えることによって作製した。5’側および3’側隣接配列は、関心のある標的配列に相補的であるように設計される。例えば、表14に同定されている標的配列(配列番号:AA〜BD)は、開示されている標的部位の各々に特異的なDNAzymeを設計するために使用することができる。表14は、標的mRNAのセンス方向に相当するDNA配列を示す。表15のDNAzymeは、表14の逆相補性である隣接配列を有する。各標的配列(配列番号:AA〜BD)の下線は、DNAzymeによって標的部位に相当するRNAが切断される切断部位である。本発明のDNAzymeは、特定の標的配列中の関心のある下線をつけた切断部位に隣接するがこれを含まない核酸を同定し、切断部位に隣接する標的配列に結合する相補的核酸配列を設計することによって設計される。相補的配列は、当技術上周知の技法を使用して化学的に合成し、DNAzymeの触媒中心の5’および3’末端に結合することができる。DNAzymeの触媒中心の5’および3’末端に結合する相補的核酸配列は、5’側および3’側隣接配列が生理的条件下において関心のある標的部位に特異的にハイブリダイズするので、関心のある標的部位に特異性を提供する。DNAzymeの触媒中心に結合する5’側および3’側隣接配列は、6〜15ヌクレオチド長であってもよく、さらに好ましくは、それらは7〜10ヌクレオチド長であってもよく、さらにより好ましくは、それらは8〜9ヌクレオチド長であってもよい。本発明の特定の態様において、表15に記載のするDNAzyme(配列番号:BE〜BQ)は、それぞれ、配列番号:AA〜AMとして開示されているHPV標的配列に特異的であるように設計される。当業者に明らかであるように、本出願の標的配列に特異的であるDNAzymeの設計は、上記に詳細に記載されている方法を使用して実施することができる。本明細書の具体的な例示は本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【0319】
【表14】標的配列
【0320】
【表15】HPV標的に特異的なDNAzyme。各配列の下線をつけた太字の部分は、DNAzymeの触媒中心であり、5’側および3’側隣接配列は標的配列にハイブリダイズする。
【0321】
11. 実施例:遺伝子組換えマウスのHBV部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
以下の表16〜21のデータに示すように、DNAzyme
またはその触媒的に不活性な相対物(すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
)は、ヒトHBVを発現する遺伝子組換えマウスにおいて、すなわち、インビボにおいてHBV複製および分泌を低下する際に効果的であった。
【0322】
【表16】HBV 遺伝子組換えマウスにおける血清 HBV ゲノム等価物に対する DNAzyme(Dz879) または触媒的に不活性な相対物 (m879) の影響
50 ugのDz879またはm879を、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で、1週間あたり2回、2週間投与し、最後の治療の48時間後に屠殺した。明らかなように、Dz879およびm879は共に、2週間の処置後インビボにおいてHBV分泌の低下に効果的であった。しかし、おそらくアシアロフェチュインに対する免疫応答のため、この影響は5週間後には低下した。
【0323】
【表17】HBV 遺伝子組換えマウスの肝臓における HBV コア( Core ) Ag に対する Dz879 および m879 の影響
Dz879およびm879は、記載されているように、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で投与した。肝組織を採取し、固定し、処理し、中心静脈周囲においてHBVコア抗原について免疫組織化学的分析を実施した。明らかなように、2週間後、HBVコア抗原の染色は劇的に低下した。また、染色の強度も大幅に低下し、細胞質染色数によって示されるものよりさらに顕著な影響を示している。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:2回/1週間、(火曜日、金曜日)×2または5週間
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:2または5週間
a 染色された細胞質数/中心静脈内腔の総細胞数 平均5本の血管を計数した。
b 各処理群の動物数
c 最初の処理後の日数
* 未処理と比較して、P<0.05
*** 未処理と比較して、P<0.001。
【0324】
【表18】HBV 遺伝子組換えマウスにおける HBV RNA 転写物に対する Dz879 および m879 の影響
Dz879およびm879は、記載されているように投与し、肝組織をRNAについて抽出した。RNAは、ノーザンブロット分析およびその次に実施したデンシトメトリーによって分析した。結果は、HBV RNA転写物レベルの顕著な低下を示した(細胞培養物の結果の場合と同様に、全ての転写物)。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:2回/1週間、(火曜日、金曜日)2週間
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:2または5週間
a ノーザンブロット分析±標準偏差を使用して、HBV RNAの平均シグナルをGAPDHハウスキーピング遺伝子のシグナルで割ったもの
b 各処理群の動物数
* 未処理と比較して、P<0.05
注:5週間処理群のRNA試料は強度が低く、測定困難であった。
【0325】
【表19】遺伝子組換えマウスの HBV 肝臓 DNA に対する Dz879 および m879 の影響
Dz879およびm879は、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で投与した。肝組織をDNAについて抽出し、HBVゲノムDNAをクロスオーバーPCRで定量した。Dz879およびm879の投与により、HBV肝DNAは劇的に低下した。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:2回/1週間、(火曜日、金曜日)×2または5週間
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:2または5週間
a 各処理群の動物数
b 最初の処理後の日数
c 別の実験の対照(ISA−2、対照)
d 不良調製試料、不良結果
* 未処理と比較して、P<0.05
【0326】
【表20】遺伝子組換えマウスにおける HBV 肝 DNA に対する Dz879 または対照 DNAzyme の影響
これは、肝HBV DNAに対するDNAzymeの顕著な影響を示す反復実験を示す。さらに別の実験は、DNAzymeの触媒中心またはオリゴヌクレオチドから一リン酸ヌクレオチドへの迅速な分解が偽薬群において観察される影響の一因であるかどうかを判定するために実施されている。遺伝子発現分析は、例えば、デオキシシチジンキナーゼの発現の増加を示すと同時に、サイトカインがそれらの影響の原因でないことを示している。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:以下参照
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:3週間
a 各処理群の動物数。
【0327】
【表21】遺伝子組換えマウスにおける HBV コア抗原染色に対する Dz879 または対照 DNAzyme の影響
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:以下参照
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:3週間
a 各処理群の動物数。
b 最初の処理後の日数
* P<0.05、群17と比較
【0328】
12. 実施例:ワタオウサギにおけるパピローマ増殖を阻止するためのマルチリボザイムの用途
DNAzymeを、モデルのワタオウサギ系においても試験した。ワタオウサギの一部の皮膚を軽く剃毛し、 ショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)の懸濁液を適用した。10日目以降、DNAzymeの生理食塩液を、30μg/日で、4週間局所適用し、次いで60μg/日をさらに2週間局所適用した。以下のDNAzymeを個別に、および混合物として試験した:群L1(配列番号:WW)、群L2(配列番号:XX)、群L3(配列番号:YY)。DNAzymeの標的部位は、以前に同定されたHPV部位との相同性によって選択した。触媒機能が欠損しているDNAzyme(群mL2、配列番号:ZZ)も試験した。次いで、パピローマを測定し、平均容積を算出した。図25に示すように、個々のDNAzymeおよび触媒機能が欠損したDNAzymeは、パピローマ増殖阻止に効果的ではなかった。しかし、3つのDNAzyme全ての混合物(L1/L2/L3)は、パピローマ増殖の低下に効果が高かった。
(配列番号:WW)は、ヌクレオチド614に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)のLS1DNAzymeである。
(配列番号:XX)は、ヌクレオチド935に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)のLS2DNAzymeである。
(配列番号:YY)は、ヌクレオチド1006に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)のDNAzyme、LS3である。
(配列番号:ZZ)は、ショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)の触媒機能欠損DNAzyme、mLS2である。
【0329】
13. 実施例:送達およびインビボにおける試験
生物送達
本発明の毒性剤および/またはリボザイムは、本明細書に記載され、本明細書の上記に例示されているように、多種多様のウイルスベクターおよびバクテリオファージによって送達することができる。
【0330】
本発明の一態様において、毒性剤は伝達プラスミドにコードされ、P1バクテリオファージ送達系と関連して使用される。このような伝達プラスミドは、好ましくは、1)複製起点、2)選択マーカー、3)P1 PAC部位およびPAC ABC遺伝子、4)P1溶菌レプリコン、5)本発明の1つ以上の毒性剤をコードする核酸を含有する。好ましい態様において、バクテリオファージP1ファージ前駆体(P1プラスミド)は、P1プラスミドからPAC部位を欠損することによって、ウイルスDNAがビリオンにパッケージングされるように操作される。
【0331】
別の態様において、毒性剤および/またはリボザイムは、毒性剤および/またはリボザイム、プラスミド複製起点、プラスミド維持のための選択マーカー、最小λ複製起点およびDNAをλビリオンにパッケージングするのに必要なcos部位をコードするプラスミドを介して送達することができる。このプラスミドは、組み込み/切断および組換え機能が欠損しているλ溶原ファージに維持される。欠陥溶原ファージは、プラスミドのλ複製起点を活性化するのに必要な複製因子の全ておよび成熟ビリオンを形成するのに必要な構造的成分の全てを提供するが、溶原ファージは複製することができず、自身のDNAをビリオンにパッケージングできない。溶原ファージはまた、cI857温度感受性リプレッサー突然変異も保有する。42℃に温度を変化させることによる、または5J/m2の紫外線照射に暴露するなどの他の手段による溶原ファージの誘導はプラスミドを誘発し、複製し、λビリオンにパッケージングする。次いで、ビリオンを回収し、大腸菌タンパク質を含有しないように精製し、大腸菌に毒性剤および/またはリボザイム遺伝子を送達するために使用することができる。緑膿菌に毒性剤および/またはリボザイムを送達するために、同様の方法を緑膿菌に実施する。
【0332】
非生物送達
毒性剤および/またはリボザイムの非生物送達は、標的組織または病原菌内で発現されるように操作されている構築物を用いて実施される。簡単に説明すると、プロモーターおよび毒性剤および/またはリボザイムを含有する遺伝子エレメントを1:10の比で陽イオンリポソーム(リポフェクタミン−−Gibco BRL)と複合体とし、0.2 mlの総容量の核酸−リポソーム混合物の単回注射または多数回注射によって試験動物に導入される。
【0333】
急性細菌感染症の予防的投与および予防
本発明の毒性剤および/またはリボザイムが、インビトロにおいて(細菌培養物に直接または感染組織培養物細胞アッセイ系において)生物活性を有する証明により、毒性剤および/またはリボザイムの有効性が、例えば、上記のインビボモデル系において示されている。本発明の毒性剤および/またはリボザイムの効果をインビボにおいて証明するために、本明細書に記載されているものなどの実験動物モデル系を使用する。毒性剤および/またはリボザイムの効果をインビボにおいて最初に証明するために、マウスに、毒性および/またはリボザイム構築物に感受性であることが以前に示されている病原微生物を感染させ、投与した毒性剤および/またはリボザイムのインビボにおける効果を求める。最初の一連のインビボ試験において、毒性剤および/またはリボザイムがインビボに投与される前に微生物に直接加えられる場合には、マウスモデル系における急性感染症を予防する際の毒性剤および/またはリボザイムの有効性が求まる。
【0334】
次の一連の試験は、感染後に投与した毒性剤および/またはリボザイムが、急性細菌感染症を予防する際に効果的であることを証明する。感染マウスの臨床状態以外に、剖検時に採取された組織を組織学的に検査し、組織試料中に複製中の微生物が存在するかどうかを標準的な方法によって判定する。動物は種々の経路(全身および/または粘膜)によって感染させることができ、全身、粘膜または局所的な経路によって、感染後、経時的に毒性剤および/またはリボザイムが送達される。毒性および/またはリボザイムの非生物送達ならびに生物送達が使用される。管理された実験モデル系における毒性剤および/またはリボザイムの陽性の影響を証明するには、調製物の効果の注目すべき証拠を提供し、標準的な臨床試験条件下において調製物が評価を保証するかどうかを判定する。
【0335】
本発明は、本明細書に記載されている具体的な態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているもの以外の、本発明の種々の改良が、上記の説明および添付の図面から当業者に明らかである。このような改良は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。
【0336】
本出願全般にわたって、種々の文献が参照されている。これらの文献の全体の内容における開示内容は、本発明が属する分野をより詳細に説明するために、本出願に参照として組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【図1A】lacI調節広域スペクトルプロモーターの構成要素を示す略図である。
【図1B】LEASHIプロモーター(配列番号:1)の配列を示す。
【図1C】改変されたrrnBプロモーター(配列番号:2)の配列を示す。
【図1D】Anrプロモーター(配列番号:3)の配列を示す。
【図1E】Procプロモーター(配列番号:4)の配列を示す。
【図1F】Arcプロモーター(配列番号:5)の配列を示す。
【図1G】TSST−1プロモーター(配列番号:6)の配列を示す。
【図2】β−ラクタマーゼリポータープラスミドの略図である。
【図3Aから3B】毒性剤をクローニングする発現ベクターを示す。
【図4】毒性剤の致死性についてのアッセイ法を示す。
【図5】doc発現プラスミドを保有する大腸菌の増殖を示す。
【図6Aから6B】輸送プラスミドの構造を示す。
【図7】P1バクテリオファージ媒体による大腸菌への輸送プラスミドの送達効率を示す。
【図8】P1 pac部位ノックアウトを作製する図式である。
【図9】PCRスクリーニングによるP1 pac部位ノックアウトの同定および確認を示す。
【図10】pacABC相補プラスミドの略図である。
【図11】P1 pac 突然変異体とpacABC相補プラスミド間の組換えを示す。
【図12】最小P1 pac部位(配列番号:7)の配列を示す。
【図13】マウスで複製しているファージの免疫原性を示す。
【図14】インビボにおける元のファージと長期循環型P1ファージの持続性の比較を示す。
【図15】孵化鶏卵における緑膿菌(P. aeruginosa)(PA01)感染症の治療を示す。
【図16】大腸菌EC−4細菌細胞のインビトロにおける死滅を示す。
【図17】孵化鶏卵における大腸菌EC−4感染症の治療を示す。
【図18】DciF1分子(配列番号:8)の配列を示す。
【図19】pClipリボザイムカセットの略図およびヌクレオチド配列である。
【図20】pChopリボザイムカセットの略図およびヌクレオチド配列配列である。
【図21】pSnipリボザイムカセットの略図を示す。pSnipはpClipトリプルリボザイムカセットの配列、2つが結合したトランス作用性リボザイムを含有する触媒中心標的リボザイムおよびpClopトリプルリボザイムカセットの配列を含む。
【図22A】リボザイム成熟化および作用における事象の分子配列に使用されるリボザイムをコードするDNAの略図である。
【図22B】一次RNA転写物を示す。自己触媒的切断が転写の終結により生じる。
【図22C】トランス作用性リボザイムの放出を示す。2つのシス作用性リボザイムの切断の直接的な結果として、mRNA標的に対して逆方向で相補的な配列を含有する内部リボザイムが放出される。
【図22D】リボザイムの配列特異的ハイブリダイゼーションを示す。内部リボザイムまたはトランス作用性リボザイムは、短いヌクレオチドの「スペーサー」によって結合された2つのトランス作用性リボザイムを含有する。2つのトランス作用性リボザイムは各々、同一または異なる部位の標的メッセージに逆方向で、相補的な配列を含有する。リボザイムは、標的化された転写物の全てまたは実質的に全てに局在化し、ハイブリダイズするのに十分な濃度が合成される。
【図22E】トランス触媒切断を示す。内部トランス作用性リボザイムリボザイムが標的化されたmRNA転写物にハイブリダイズすると、内部リボザイムは触媒トポロジーを実施し、標的化されたメッセージを切断する。切断の結果、トランス作用性リボザイムが放出され、その活性および機能がリサイクルされる。
【図23】HBV標的化Rzのインビトロにおける切断分析を示す。試験した6Rzの位置は、参照として本明細書に組み入れられている、2000年12月7に出願された優先権仮出願番号第60/251,810号の図7に示す。個々のRzが構築され、インビトロにおいて転写され、[32P]−標識HBV標的RNA(917nt)と混合した。インキュベーションは、37℃において、20 mM Tris−HCl(ph 7.4)、5 mM MgCl2中で30分間実施した。切断後、産物を変性PAGEによって分離し、得られたものをPhosphor−Imagerを使用して定量した。切断産物の大きさは、右に示し、Rzの濃度(40 mMまたは200mM)は上に示した。
【図24】HBV標的Rzの切断分析を示す。RzおよびHBV標的RNAを種々の比(40:1、40:10または40:100、上に示す)で混合し、種々の期間の間(各比について20秒、40秒、1分、3分、10分、30分または2時間、それぞれ、左から右方向に示す)。インキュベーション後、変性PAGEによって産物を分析し、Phosphor−Imagerを使用して定量した。
【図25】ワタオウサギにおけるパピローマ増殖に対するDNAzymeの局所適用の影響を示す。ショープ乳頭腫ウイルス(Shope Papilloma Virus)mRNA部位を標的化するDNAzymeを単独で(群L1、群L2、群L3)、または併用して(群L1/L2L3)適用した。結果は、併用療法がパピローマ容積の低下に有効であることを示した。触媒的に不活性なDNAzyme(群mL2)は、パピローマ容積の低下に無効であった。
1. 序文
本発明は、病原菌に致死作用を示す毒性剤の発見、同定および特徴付けと、感染症を治療および/または根絶するために、病原菌または病原菌感染細胞にこのような毒性剤を標的とし、送達するための方法とに関する。特に、本発明は、細菌生活周期が異なる段階の細菌を標的とし、細菌または細菌感染細胞に単独または併用して送達される毒性剤に関する。特に、本発明は、ヒトおよび動物の細菌感染症を治療するためのファージ送達媒体法に関する。本発明はまた、異常な細胞に致死作用を示す毒性剤と、疾患を治療および/または根絶するために異常な細胞にこのような毒性剤を標的とするするための方法とに関する。本発明は、病原特異的または組織特異的であるプロモーターエレメントに関する。本発明はまた、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原特異的または組織特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントに関する。詳細には、本発明は、毒性遺伝子産物、アンチセンスRNAもしくはリボザイムまたはそれらの組み合わせの1つ以上の送達に関する。本発明は、病原菌または病原菌が感染した細胞を死滅させるまたは適応性を低下するために、複数の標的を同時に標的とすることができる新規方法を提供する。本発明は、薬剤耐性病原菌(抗生物質耐性菌など)および薬剤耐性異常細胞(薬剤耐性癌細胞など)の根絶に重要な関係がある。本発明はまた、パピローマウイルスおよびB型肝炎ウイルスを含むウイルス感染症を治療するための薬学的組成物に有用なDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムに関する。
【0002】
2. 背景技術
2.1. 抗菌剤
感染性疾患は毎年数百万人を罹患させ、死亡させている。米国だけでも毎年数十万人が、ペニシリンおよびバンコマイシンのような薬剤で治療できない耐性細菌株に感染している(Hiramatsuら、1997、Morbidity and Mortality Weekly Report 46:624−26)。抗菌耐性に関連する感染症は、特に若年者、高齢者および免疫寛容者における肺炎などの病院において(院内)獲得されるもの、腸チフス熱、細菌性髄膜炎および結核を含む。世界では、約15億人が種々の種類の結核菌を保菌しており、国によっては、40パーセントが抗生物質抵抗性であることが証明されている(Boyceら、1997、「院内感染の疫学および予防、ヒト疾患におけるブドウ球菌(Epidemiology and prevention of nosocomial infections. In The Staphylococcus in Human Disease.)」Crassly and Archer E’s, Churchill Livingston Inc.、New York、NY参照)。一部の先進国では、院内感染症全体の60%が抗生物質抵抗性の細菌によって生ずると推定される。例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は火傷治療室における院内感染および発生に関連する最も一般的なグラム陰性菌である。この生物による感染症は高い死亡率(60%)に関連しており、構造的に関連のない多数の抗生物質に対するこの属のメンバーの高い固有耐性に寄与している。グラム陽性菌も感染性疾患に大きな影響を与えている。例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、米国における約260,000例の院内感染の原因となっており、それによって年間60,000〜80,000人の死亡を生ずるグラム陽性菌である(Boyceら、上記参照)。
【0003】
1つまたは数種の感染菌を標的とするために数多くの抗菌治療が設計されているが、多くの治療は感染症の根絶の成功程度は様々である。この10年間にごく少数の新規抗生物質が市場に登場したが、これらの薬物治療に耐性を示す致死的な細菌の数は増加した。例えば、バンコマイシンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染症(MRSA)の治療に利用可能な唯一の効果的な抗菌剤の1つである。しかし、バンコマイシン耐性分離株黄色ブドウ球菌が今や出現している(Hiramatsuら、1997、Morbidity and Mortality Weekly Report 46:624−26)。また、これらの治療が特定の感染菌を標的できないことにより、治療が過剰または不適当に使用されており、薬剤耐性菌を発生させている。多数の感染菌における薬剤耐性の発生により効果は低下しており、既に確立している抗菌治療を使用するリスクが増加している。
【0004】
従って、細菌に対して致死剤として作用することができ、感染している宿主に毒性を生ずることなく、病原菌に送達することができる新規分子および分子の新規組み合わせの必要性が当技術上存在している。さらに、特定の種の病原菌を標的とするが、宿主の有用な細菌叢に有害な影響を与えない新規方法の必要性が当技術上存在している。本発明は、細菌などの病原菌に対する毒性剤として使用することができるこのような新規産物、治療薬および送達方法を提供する。
【0005】
2.2 アンチセンス
アンチセンス技術は、細胞RNAをコードされているタンパク質に翻訳させないために、細胞RNAに相補的である(または細胞RNAのアンチセンスである)RNA分子の使用を試みるものである。この方法では、特定のタンパク質の発現は下方制御を標的とされる。しかし、アンチセンス技術を取り巻く分野には大多数の困難が存在する。通常、標的細胞への外因性アンチセンス分子の送達は達成が困難または不可能である。さらに、アンチセンス分子は、常にタンパク質の発現を低下させるわけではない。例えば、遺伝子組換えマウスにおけるアンチセンスRNAの発現は標的RNA分子の減少をいつも生じるわけではなく、標的RNA分子の減少が生じたとき、予想されるようにタンパク質の減少がそれに平行して生じるわけではないことが示されている。タンパク質レベルが低下した場合でも、生物的影響が検出されなかったことがあった(Whitton, J. Lindsay、「ウイルス感染のアンチセンス治療(Antisense Treatment of Viral Infection)」Adv. in Virus Res. Vol. 44、1994)。従って、アンチセンス分子を、病原菌などの標的細胞に効率的に送達することができる送達系の必要性が当技術上存在する。
【0006】
2.3 リボザイム
リボザイムは、RNAを配列特異的に切断する触媒RNA分子である。リボザイムを抗菌剤として使用する際の主な技術的な点は、リボザイムが微生物内で標的RNAを切断することができるように、リボザイムが標的微生物に導入され、標的微生物によって発現されなければならないことである。第2の重要な点は、微生物では転写と翻訳が密接に関連しているので、細菌のRNA標的の結合および切断が防がれていることである。また、細菌のRNAは、真核細胞のRNAより半減期が短いことが多く、細菌のRNAを標的とする時間を短くしている。本明細書に記載する発明はこれらの点に対処しており、リボザイムと毒性剤との組み合わせを使用した細菌感染症の新規治療法を証明している。
【0007】
3. 発明の概要
本発明は、細菌または細菌感染細胞または他の病原菌に毒性剤を特異的に標的とする毒性剤と方法とを提供する。本発明の毒性剤は、1つ以上の標的に向けられ、従って、細菌を根絶するために単独または併用して使用することができる。本発明は、病原菌または異常細胞を根絶するために毒性遺伝子産物またはリボザイムと毒性遺伝子産物との組み合わせを送達することに関する。詳細には、本発明は、このような細菌または病原菌を根絶するために、毒性タンパク質、アンチセンスRNA、マルチリボザイムまたはこれをコードする核酸またはそれらの組み合わせを1つ以上、感染性細菌または病原菌を含有する細胞、組織または対象に送達することを提供する。
【0008】
本発明は、さらに、疾患、ウイルス感染症、寄生虫感染症および微生物感染症を治療するために、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを使用することを含む。本発明は、さらに、組織の細胞増殖を阻止することによって、特定組織の増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、組織特異的プロモーター配列に機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、プロモーターは異常組織に特異的であり、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、細胞増殖が阻止され、増殖性疾患が治療される方法に関する。
【0009】
本発明は、さらに、病原菌の複製を阻止することによって、病原菌感染症または疾患を有する対象を治療する方法であって、病原菌特異的プロモーターに機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、病原菌は複製が阻止されるか、または死滅させられるか、または適応性を低下させられ、感染症または疾患が治療される方法に関する。本発明の特定の態様において、本発明の毒性剤は、重症の火傷、嚢胞性繊維症、癌または他の免疫寛容状態に関連する微生物感染症を治療するのに有用である。本発明は、薬学的製剤中に本発明の毒性剤および/またはリボザイムを含む。
【0010】
本発明は、さらに、研究およびスクリーニング目的のために、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを使用することを含む。本発明の一態様において、リボザイムおよび/または毒性剤は、選択されたウイルスもしくは微生物病原菌または選択された細胞を効果的に阻止するために、標的とされるウイルス、微生物、原核細胞または真核細胞遺伝子産物をスクリーニングするために使用することができる。
【0011】
さらに別の態様において、本発明は、毒性剤および/またはリボザイムをコードする新規ベクターに関する。本発明の新規ベクターは、組織特異的、病原菌特異的、プロモーター特異的、抗菌特異的、抗ウイルス特異的、抗癌特異的、抗腫瘍特異的または標的特異的を含むが、これらに限定されない、多種多様の毒性剤および/またはリボザイムを操作するために使用することができる。
【0012】
一態様において、本発明は、病原菌の生存または生活周期(複製、パッケージング等)に必須の遺伝子産物を特異的に標的とする毒性剤に関する。一態様において、本発明は、対応する嗜癖系(addiction system)解毒剤が存在しない場合に発現するように改変されている天然型殺菌嗜癖系毒素に関する。別の態様において、本発明は、対応する嗜癖系解毒剤より高いレベルで発現するように改変されている天然型嗜癖系毒素に関する。一例において、嗜癖系毒素(例えば、doc、chpBK、kicBまたはgef)を毒性剤として使用し、その解毒剤から離しておく。特定の態様において、本発明は、バクテリオファージ送達系によって殺菌タンパク質などの毒性剤(またはこのような毒性剤をコードする核酸)の送達を提供する。他の特定の態様において、本発明は、宿主の細菌感染症を治療するために、バクテリオファージ送達系と併用して使用することができる毒性剤をコードする新規伝達プラスミド(transfer plasmid)を提供する。
【0013】
本発明はまた、複製または生存に必須のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を特異的に標的とするDicF1またはDicF1様アンチセンス分子などの必須ヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスRNAに関する。さらに、本発明は、細菌中で発現されると、致死剤として作用する、安定性が増加した改変されたアッセイ構造に関する。本発明はまた、必須のアンチセンス分子を標的とするように設計された毒性のセンス分子に関する。
【0014】
本発明は、(病原菌感染症または癌などの)疾患を治療するために、組織特異的または病原菌特異的にRNAを標的とするためのマルチリボザイムとそれらの用途とに関する。本発明は、1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有するマルチリボザイムを提供する。トランス作用性リボザイムは標的特異的に作用するので、(細菌などの)病原菌または(異常細胞などの)選択された細胞に毒性剤として作用することができる。本発明によると、マルチリボザイムは、a)5’側および3’側の自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイム、b)5’側または3’側の自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイム、またはc)5’側および3’側の両方または一方の自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムが隣接した複数のトランス作用性リボザイムを含んでもよい。本発明のマルチリボザイムはまた、異常な細胞または組織に1つ以上の毒性剤を送達するために使用することができる。本発明に有用なリボザイムは、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている米国特許第5,824,519号、PCT出願国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第97/17433号、国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第99/67400号に記載されているものを含む。本発明によると、マルチ−トランス作用性リボザイムを同一RNAの同一部位、同一RNAまたは異なるRNAの異なる部位に標的とすることができる。本発明によると、複数の毒性剤を、(細胞RNAまたはタンパク質などの)同一標的の同一部位、同一標的または異なる標的の異なる部位に標的とすることができる。例えば、ある態様において、(毒性タンパク質をコードするアンチセンス核酸または核酸などの)毒性剤を、トランス作用性リボザイムの代わりに、またはトランス作用性リボザイムに加えてマルチリボザイム内に操作することができる。この態様では、毒性剤には5’側および/または3’側自己触媒的切断リボザイムが隣接している。
【0015】
本発明は、さらに、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸および発現カセットを提供する。これらの核酸は、選択された部位において本発明の毒性剤および/またはリボザイムを発現するために使用することができる。
【0016】
分子遺伝子レベルでは、本発明の毒性剤、リボザイムまたはマルチリボザイムのコード配列は、以下の遺伝子エレメントの1つ以上の制御下に置かれることができる:標的とされる微生物の天然型で、強い、中程度または弱い構成的発現プロモーターまたは調節プロモーター、または望ましいレベルのリボザイムおよび/または毒性剤発現を与える、強い、中程度または弱いコンセンサス配列を含有する人工的に考案された構成的発現プロモーターまたは調節プロモーター。本発明は、病原菌特異的であるプロモーターエレメントに関する。本発明は、本発明の毒性剤の病原菌特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントに関する。本発明はまた、組織特異的であるプロモーターエレメントに関する。本発明は、本発明の毒性剤の組織特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントに関する。
【0017】
一態様において、核酸は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む。本発明によると、本発明の毒性剤は同一標的または異なる標的に作用することができる。
【0018】
本発明は、任意の既知の分類学上の科、属または種の任意の細胞、ウイルス、細菌、真菌または他の単細胞もしくは多細胞生物を標的とする毒性剤および/またはトランス作用性リボザイムに関する。本発明の別の態様は、細菌、真菌、酵母、異常細胞などの異常に致死的または毒性である毒性剤に関する。
【0019】
本明細書に記載されている抗菌リボザイム治療の標的は、侵入している微生物または正常な細菌叢の微生物のRNAである。本明細書に記載されている抗菌毒性剤治療の標的は侵入している微生物または正常な細菌叢の微生物のRNA、タンパク質、遺伝子および他の分子を含む。本発明は、1つまたは一連の候補微生物の必須遺伝子、ハウスキーピング遺伝子または病原性遺伝子に対して一連のリボザイムおよび/または毒性剤を送達することを提供する。必須タンパク質および病原性決定因子の不活性化は、侵入している微生物を不活性化し、それらの増殖を遅くするが、同時に宿主の必須課程には大きな影響を与えない。
【0020】
本発明はまた、非生物系または生物系によって、細胞または病原菌に本発明の毒性剤を送達することに関する。特定の態様において、本発明の毒性剤は、病原菌に感染することができる改変されたバクテリオファージによって、細菌細胞に送達される。さらに別の態様において、バクテリオファージは、特定の種または属の細菌に感染する能力について選択され、宿主からこのような細菌種を根絶させるために毒性剤を送達するのに使用される。好ましい態様において、送達媒体に固有の核酸を送達するには不十分な量しか遺伝情報を含有しないように、送達媒体または送達媒体に固有の核酸を改変する。従って、改変された送達媒体(例えば、ビリオンまたはバクテリオファージ)は、標的細胞または病原菌に、本発明のリボザイムおよび/または毒性剤を送達する分子媒体として働くことができるが、送達媒体に固有の複製可能な核酸を送達しない。または、非生物送達系(例えば、リポソーム)を使用して、リボザイムおよび/または毒性剤の適切な発現に必要で、十分な遺伝子エレメントを保有する核酸をパッケージングすることができる。一態様において、病原菌に毒性剤を送達することは、関心のある病原菌を標的とするバクテリオファージまたは他の送達媒体を使用することによる。一態様において、組換えバクテリオファージは、毒性剤または毒性剤をコードする核酸を病原菌に送達する。
【0021】
本発明は、標的微生物に毒性剤および/またはリボザイムを含む核酸を送達することができる、不活性化し、改変したウイルス(ビリオン)、バクテリオファージまたは非生物送達媒体によって、標的微生物に特異的な基礎的および必須の細胞過程に対するリボザイムおよび/または毒性剤を1つ以上送達するための方法および組成物を開発することによって得られたものの組成物を提供する。微生物は、任意のウイルス、非ウイルス、細菌または真菌、酵母、寄生虫、原生動物などの下等真核生物、またはヒト、動物、魚類、植物または他の植物体の病原菌であると考えられる他の真核生物であってもよい。従って、本発明は、ヒトおよび獣医医学に重要な関係がある。
【0022】
ある好ましい態様において、本発明の毒性剤を抗菌治療剤として使用する。毒性剤は、単独で使用しても、または1つ以上の他の毒性剤と併用して使用してもよい。従って、侵入している微生物への毒性剤の送達はその微生物を死滅させるか、または適応性を低下させる。毒性剤は、1つ以上のリボザイムと併用して使用してもよい。さらに、リボザイムと毒性剤との組み合わせを抗菌治療剤として使用することができる。
【0023】
本発明の毒性剤方法は、(1)最新の(sophisticated)微生物が持っているまたは形成する可能性のある、新生(de novo)または組み込み型(built−in)薬剤耐性の回避、(2)それらに送達されるリボザイムまたは毒性剤を中和する細胞能力の低さ、(3)同時に攻撃することができる、微生物中で利用可能な広域RNA標的および非−RNA標的の使用、(4)異なる科の生物または異なる種の生物に容易に適合させることができる本発明の送達媒体に特定設計の柔軟性、(5)改変された送達基剤の集成的構成および製造の容易さ、(6)局所、注射、吸入または摂取等などの、本発明の薬学的製剤の種々の投与方法の利用性、(7)薬学的製剤を凍結乾燥し、それによって抗菌治療剤に安定性を与えることができること、(8)治療用製剤の免疫原性の低さおよび(9)本発明のリボザイムおよび/または毒性剤の評価を可能にする動物試験系の利用性を含むが、これらに限定されない抗菌治療の進歩を提供する。従って、病原菌に必須または重要な遺伝子産物を送達する独自の送達方法および攻撃的な機序が、感染した宿主内の病原菌を適時的に破壊することができる。従って、本発明は、薬物耐性病原菌の根絶に重要な関係がある。
【0024】
本発明はまた、形質転換またはプラスミドコピー数制御に関連する少なくとも1つのウイルスタンパク質をコードするmRNAに生理的条件下において特異的にハイブリダイズする、またはウイルスのポリアデニル化シグナルにハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。本発明のさらに別の態様は、mRNAがE6/E7mRNAである、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。本発明のよりさらに別の態様は、mRNAがパピローマウイルスRNAまたはB型肝炎ウイルスRNAである、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。本発明は、生理的条件下において、パピローマウイルスE6/E7mRNAまたはパピローマウイルスポリアデニル化シグナルに特異的にハイブリダイズする1つ以上のアンチセンス核酸の精製調製物であって、アンチセンス核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはDNAzymeである精製調製物を提供する。
【0025】
本発明のさらに別の態様は、関連HPVまたはHBV株の配列番号:AA〜BDからなる群より選択される配列または相同配列に生理的条件下において特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、好ましくは、本出願の開示内容に同定されている標的部位と、少なくとも約70%または75%または80%または85%または86%または87%または88%または89%または90%または91%または92%または93%または94%または95%または96%または97%または98%または99%一致する。
【0026】
本発明のさらに別の態様は、上記の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物であって、核酸分子がDNAzymeまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムの単独または併用したものである精製調製物に関する。
【0027】
本発明のさらに別の態様は、上記の核酸分子のいずれかの精製調製物であって、核酸分子が、当業者に周知の任意の手段によってヌクレアーゼ分解に抵抗性にしてある精製調製物に関する。
【0028】
好ましい態様において、本発明の核酸分子は、3’末端に3’−3’逆位Tを挿入することによってヌクレアーゼ分解に抵抗性にするように、それらの3’末端が改変されている。3’末端の改変は、3’末端に3’−3’逆位チミジン、アデニン、グアニンまたはシトシン(それぞれ、逆位T、逆位A、逆位G、逆位C)を挿入してもよい。
【0029】
本発明のさらに別の態様は、上記の核酸分子のいずれかと薬学的に許容されうる担体とを含有する薬学的組成物に関する。よりさらに別の態様において、薬学的組成物のいずれかは、美容剤および/または局所適用剤として製剤化されていてもよい。局所製剤は、軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはローションの形態であってもよい。薬学的組成物のいずれかは、核酸分子がリポソーム製剤または脂質製剤に製剤化されるように、製剤化されていてもよい。さらに別の態様において、リポソームは、肝臓において組織特異的に取り込まれることができる。よりさらに別の態様において、リポソームは、アシアロフェチュイン(asialofetutuin)または1つ以上の糖を使用して修飾される。
【0030】
よりさらに別の態様は、本発明の核酸分子が、パピローマウイルスまたはB型肝炎ウイルスが感染した細胞において細胞毒性または細胞増殖抑制作用を生ずるのに十分な量が製剤化されている薬学的組成物に関する。細胞はまた、パピローマウイルスによって形質転換されていても、またはB型肝炎ウイルスによって形質転換されていてもよい。
【0031】
本発明のさらに別の態様は、パピローマウイルス性状態またはB型肝炎ウイルス性状態を治療する方法であって、上記の薬学的組成物のいずれかを対象に投与する段階を含む方法に関する。さらに別の態様において、パピローマウイルス性状態は、疣(例えば、手、足、喉頭の疣および/または子宮頚部の偏平な疣)、子宮頚癌、喉頭乳糖腫、せんけいコンジローム、疣状表皮異形成、子宮頚部上皮細胞間異形成またはパピローマウイルスに関係する任意の他の感染症からなる群より選択される。本発明の方法は、扁平上皮、皮膚上皮および粘膜上皮などの上皮細胞またはパピローマウイルスが感染したもしくはパピローマウイルスが感染した可能性のある任意の他の細胞治療を含む。
【0032】
本発明のさらに別の態様は、局所適用を含む、上記の薬学的組成物のいずれかを投与する方法に関する。投与は頚部または表皮に対して行ってもよい。さらに別の態様において、投与は、扁平上皮、皮膚上皮および粘膜上皮などの上皮細胞に対して行われる。
【0033】
本発明はまた、パピローマウイルス性状態を治療する方法であって、本明細書に記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムの1つ以上を、パピローマウイルスが感染した細胞に局所適用によって対象に投与する段階を含む方法に関する。パピローマウイルス性状態を治療する方法には、頚部適用または皮膚もしくは表皮適用が含まれる。
【0034】
本発明のよりさらに別の態様において、パピローマウイルスを治療する方法は、ヒトパピローマウイルス(HPV)によって誘導される状態の治療を含む。
【0035】
さらに別の態様において、本発明のアンチセンス核酸の薬学的組成物は美容適用であってもよい。
【0036】
薬学的組成物は、疣ウイルスが感染した細胞またはウイルスに細胞毒性または細胞増殖抑制作用を生じるのに十分な量の本発明の核酸が存在するように、製剤化することができる。特定の態様において、疣ウイルスはパピローマウイルスである。よりさらに別の態様において、細胞はパピローマウイルスによって形質転換されている。
【0037】
好ましい態様において、本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムの薬学的組成物は、局所適用用に製剤化される。このような製剤は軟膏、膏薬、ゲル、クリーム、ローションまたは坐剤を含む。
【0038】
本発明のよりさらに別の態様において、本発明の核酸の薬学的組成物はリポソーム製剤または脂質製剤に製剤化することができる。
【0039】
薬学的組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムからなる群より選択される本発明の1つ以上の核酸を含有してもよく、核酸は、HPV E6/E7mRNAまたはHPV ポリアデニル化シグナルに生理的条件下において特異的にハイブリダイズするか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはDNAzymeは3’末端に3’−3’逆位チミジンを有し、および/または薬学的組成物は軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはローションなどの局所適用用に製剤化される。
【0040】
別の好ましい態様において、B型肝炎ウイルス(HBV)RNAに生理的条件下において特異的にハイブリダイズする本発明の1つ以上の核酸の精製調製物であって、該1つ以上の核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムである精製調製物が提供される。
【0041】
5. 発明の詳細な説明
本発明は、細菌、寄生虫もしくはウイルス感染症または細胞増殖および癌に関連する疾患および疾病を治療するための毒性剤および/またはリボザイムと、組織特異的、標的特異的または病原菌特異的なそれらの用途とを提供する。本発明のリボザイムおよび/または毒性剤は、宿主の特定の細胞または組織に含有される1つ以上の特定のRNAを標的とするように操作することができる。本発明のリボザイムは、特定の病原菌、ウイルスまたは微生物によってコードされる1つ以上の特定のRNAを標的とするように操作することもできる。本発明の毒性剤は、特定の病原菌、ウイルスまたは微生物の1つ以上のRNA、タンパク質または分子を標的とするように操作することもできる。
【0042】
本発明はまた、選択された病原菌に致死的または毒性である毒性剤を提供する。本発明の一態様において、本発明の毒性剤は、病原菌または選択された細胞(例えば、異常細胞)を致死させるか、または病原菌または選択された細胞を適用性を低下させる毒性タンパク質を含む。一態様において、本発明のこのような毒性タンパク質は、病原菌または選択された細胞において過剰発現されるとき、致死的である。他の態様において、毒性タンパク質は、病原菌または選択された細胞内で発現されるとき毒性である外因性タンパク質である。本発明の毒性タンパク質は、毒性を増強するようにさらに操作することができる。例えば、突然変異、欠損、挿入等を既知の配列に導入するための多数の方法が当技術上知られている。従って、最適な毒性タンパク質が提供される。本発明はまた、毒性タンパク質を産生中の細胞中で産生または製造されるように、毒性タンパク質の毒性が抑制される方法を提供する。毒性の抑制は、当技術上周知の任意の方法によって実施することができ、例えば、毒性タンパク質は、適当な条件下において発現のスイッチをオン/オフすることができる誘導プロモーターから発現させることができる。毒性タンパク質は、同じ細胞において解毒剤タンパク質を過剰発現することによって、細胞を致死させることなく、細胞中で発現することができる。他の方法は当業者に明らかであり、本発明の範囲内である。
【0043】
本発明は、毒性剤と、細菌または細菌感染細胞または他の病原菌に毒性剤を特異的に標的とする方法とを提供する。本発明の毒性剤は、1つ以上の標的に向けられるので、細菌を根絶するために単独または併用して使用することができる。詳細には、本発明は、感染性細菌または病原菌を根絶するために、毒性タンパク質、アンチセンスRNA、マルチリボザイムまたはこれをコードする核酸またはそれらの組み合わせの1つ以上を、このような細菌または病原菌を含有する細胞、組織または対象に送達することを提供する。
【0044】
本発明はさらに、治療薬および薬学的組成物としての、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの用途を含む。本発明の特定の態様において、本発明の毒性剤は、重症の火傷、嚢胞性繊維症、癌または他の免疫寛容状態に関連する微生物感染症を治療するのに有用である。
【0045】
本発明はさらに、研究およびスクリーニング目的のための、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの使用を含む。本発明の一態様において、リボザイムおよび/または毒性剤は、選択されたウイルスもしくは微生物または選択された細胞を効果的に抑制するために、標的とされたウイルス、微生物、原核生物または真核生物の遺伝子産物または分子をスクリーニングするために使用することができる。
【0046】
5.1. 病原菌特異的および組織特異的毒性剤
本発明は、毒性剤として作用し、または毒性剤をコードし、従って抗菌剤として有用である特定の核酸を提供する。種々の毒性剤が本発明の範囲内である。明らかにするために、本発明の毒性剤は、本明細書の以下にいくつかのサブタイプで記載されている。本発明の毒性剤は、アンチセンス核酸、毒性遺伝子産物、センス核酸を含むが、これらに限定されない。
【0047】
5.1.1. 毒性遺伝子産物
本発明は、細菌、寄生虫、真菌またはウイルス感染症または細胞増殖および癌、または異常な細胞に関連する疾患および疾病を治療するための毒性剤としての毒性遺伝子産物または毒性タンパク質の用途に関する。本発明の毒性遺伝子産物は、病原菌または(異常細胞などの)選択された細胞に毒性である(DNA、RNAまたはタンパク質など)任意の遺伝子産物である。このような毒性遺伝子産物は、標的病原菌または選択された細胞において天然であっても(内因性)、または非天然(外因性)であってもよい。本発明の毒性剤は、染色体でコードされても、プラスミドでコードされていても、病原菌でコードされていても、合成であってもまたは任意の他の核酸もしくはヌクレオチド配列でコードされていてもよい。本発明は、病原菌または選択された細胞において発現され、病原菌または選択された細胞を死滅または適応性を低下させる内因性毒性遺伝子産物である毒性剤を提供する。本発明はまた、病原菌または選択された細胞に導入されるかまたはそれらにおいて発現され、病原菌または選択された細胞を死滅または適応性を低下させる外因性毒性遺伝子産物である毒性剤を提供する。適応性が低下した病原菌または選択された細胞は、弱毒化されたもの、または(医薬品、毒素、製剤、突然変異原、溶媒等などの)化学的処理に感受性の高いもの、または(温度などの)物理的ストレスに感受性の高いもの、または(照射またはUVによるなどの)遺伝的改変に感受性の高いもの、または(利用可能な栄養素などの)環境変化に感受性の高いものである。
【0048】
いくつかの態様において、本発明は、細菌または選択された細胞において発現されるとき、毒性剤としてのプラスミド嗜癖系タンパク質の用途を提供する。例えば、ある種のバクテリオファージにおいて、溶原性(潜伏)経路は、プラスミドの携帯のバクテリオファージDNAのシングルコピーだけを保持する細菌細胞によって発現される。娘細菌細胞が共にプラスミドのコピーを受け取っていることを確信するために、「プラスミド嗜癖系」または「分離後系(post−segregation system)」がその細胞によって使用されており、プラスミドのコピーを受け取っている細菌細胞だけが生存していることを保証している。
【0049】
本発明の一態様において、分離後系またはプラスミド嗜癖系毒素は、毒素を過剰発現することによって、(細菌などの)病原菌に対する毒性剤として使用される。このような毒素の過剰発現は毒素と解毒剤を分離し、過剰発現された毒性剤を含有する細胞において毒性、好ましくは致死を生じる。
【0050】
例えば、一態様において、本発明は、(複製、パッケージングなどの)病原菌の生存または生活周期に必須の遺伝子産物を特異に標的とする毒性剤を提供する。一態様において、本発明は、嗜癖系解毒剤が存在しない場合に発現されるように改変されている天然型嗜癖系毒素を提供する。別の態様において、本発明は、嗜癖系解毒剤より高レベルに発現されるように改変されている天然型嗜癖系毒素を提供する。一例において、嗜癖系毒素(例えば、doc、chpBK、kicBまたはgef)は、毒性剤として使用され、解毒剤から離れている。本発明の別の態様において、(chpBK、kicBまたはgefなどの)染色体によりコードされる毒性遺伝子産物は、毒性遺伝子産物を過剰発現することによって病原菌に対する毒性剤として使用される。
【0051】
ある態様において、毒性剤は、大腸菌(E. coli)の志賀毒素様毒素、ビブリオ コレラ(Vibrio cholerae)のコレラ毒素および緑膿菌(P. aeruginosa)の細胞毒を含むが、これらに限定されない。例えば、ファージK139はビブリオ コレラ(V. cholerae)に、コレラ毒素の酵素活性を増強する遺伝子産物を与える。このような毒素は本発明の範囲内であり、本発明の方法および組成物に関連して毒性剤として使用することができる。本発明のある態様において、殺菌性毒性剤は、黄色ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェーカリス(Enterococcus faecalis)または緑膿菌を含むが、これらに限定されない細菌から誘導される。
【0052】
別の態様において、毒素の解毒剤は、本発明のトランス作用性リボザイムまたは毒性剤の標的である。従って、解毒剤がトランス作用性リボザイムまたは毒性剤によって不活性化されると、毒素は解毒剤によって中和または不活性化されず、従って、病原菌に毒性、好ましくは致死を生じる。
【0053】
さらに別の態様において、解毒剤自体がアンチセンスRNAである場合には、センスRNAを毒性剤として合成し、アンチセンス解毒剤を不活性化するために送達することができる。従って、解毒剤がセンスRNAによって不活性化されると、解毒剤は毒素を不活性化するために利用できず、従って毒性、好ましくは致死を生ずる。
【0054】
本発明に関連して使用することができる嗜癖系毒素の一例はdocである(death on curing; Lehnherr H.ら、1993、J. Mol. Biol. 233: 414−28)。docによってコードされるタンパク質はグラム陰性菌およびグラム陽性菌(例えば、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびエンテロコッカス・フェーカリス)に致死的または毒性である。docは、Phd(prevention of host death)が解毒剤である細菌の細胞毒素として作用する。従って、本発明は、病原菌を適応性を低下し、好ましくは病原菌を根絶するために、病原性細菌に送達することができる、docを発現するプラスミドを提供する。docの特定の利点は、docが真核細胞にほとんどまたは全く毒性を示さないことであり、真核細胞宿主に安全に投与することができる。
【0055】
本発明に関連して使用することができる嗜癖系毒素または染色体によってコードされる毒素または他の毒素の具体的な例は、ccdB、kid、perK、parE、doc、higB、chpAK、chpBK、kicB、hoc、srnB’、flmA、pmdA、relF、gef、kilA、kilB、kilC、kilE、traL、traE、sigB、hok、pemK、リソスタフィン(lysostaphin)およびkikAを含むが、これらに限定されない。本発明の方法に使用することができる解毒剤の例は、ccdA、kis、pemI、parD、phd、higA、chpAI、chpBI、kicA、soc、srnC、flmB、pndB、sof、korA、korB、korC、korD、korEおよびkorFを含むが、これらに限定されない。従って、本明細書の本発明は、本発明の毒性剤として、(docなどの)嗜癖系毒素または他の毒素タンパク質を使用する方法を提供する。本発明はまた、毒素の解毒剤を抑制または不活性化する方法を提供する。本発明はさらに、製造目的のために、毒素および対応するその解毒剤の同時発現を提供する。
【0056】
ある特定の態様において、本発明は、毒性剤chpBK、kicBおよびgefを提供する。kicBまたはgefのタンパク質の各々は大腸菌には致死的であるが、緑膿菌には致死的ではない。従って、本発明は、大腸菌の細菌感染症を根絶または治療する際のkicBまたはgefの使用を提供する。一態様において、kicBまたはgefをコードする核酸を、kicBまたはgef毒性剤(またはその両方)をコードする伝達プラスミドを含有する本発明のP1バクテリオファージによって大腸菌に送達する。
【0057】
本発明の別の特定の態様において、chpBKタンパク質は本発明の毒性剤であり、大腸菌に致死的で、緑膿菌に毒性または致死的である。従って、本発明は、大腸菌または緑膿菌の感染症を根絶または治療する際のchpBKの使用を提供する。一態様において、chpBK核酸を、chpBK毒性剤コードする伝達プラスミドを含有する、本発明のP1バクテリオファージによって大腸菌または緑膿菌に送達する。chpBK機能に拮抗する解毒剤タンパク質をChpBlと呼ぶ。従って、本発明は、製造目的のために、解毒剤ChpBlおよびchpBKの同時発現を提供する。
【0058】
本発明のいくつかの態様において、doc、chpBK、kicBまたはgefなどの毒性剤は誘導プロモーターの制御下に置かれ、解毒剤から離れている。一態様において、プロモーターは、P1溶菌プロモーターP53である。好ましい態様において、プロモーターはLEASHIプロモーターである。好ましい態様において、緑膿菌感染症を治療するためには、本発明は、緑膿菌特異的プロモーターanr、arcまたはproCを提供する。
【0059】
本発明の他の特定の態様において、コンセンサスリボソーム結合部位(
ここで、Xは任意のヌクレオチドである)を、毒性剤をコードする核酸のすぐ上流に挿入することができ、毒性剤の発現が増加する。本発明は、毒性剤またはリボザイムの発現を調節するための、プロモーターとリボザイム進入部位とを組み合わせての使用を提供する。
【0060】
感染症を根絶または治療するために2つ以上の毒性剤を使用することができることも本発明の範囲内である。例えば、バクテリオファージによる送達のために、2つ以上の毒性剤を1つの伝達プラスミドに操作することが考慮されている。このようなバクテリオファージは、細菌を標的とするための複数の毒性剤をコードする核酸を送達する働きをすると思われる。または、各伝達プラスミドが異なる毒性剤をコードする2つ以上の伝達プラスミドが1つのバクテリオファージに保有されてもよい。この態様では、2つ以上の伝達プラスミドを使用する場合には、このようなプラスミドは、2つ以上のプラスミドが組換えによらず発生される(non−recombinigenic)ように設計される。組換えによらず発生される(non−recombinigenic)配列を操作するこのような方法は当技術上周知である。また、この態様において、操作された2つ以上のプラスミドは、好ましくは、異なる複製起点を有する。このように、バクテリオファージは、複数の毒性剤をコードする核酸を送達する働きをする。さらに第3の態様において、バクテリオファージは、複数の伝達プラスミド上に複数の毒性剤を保有するように設計することができる。2つ以上の毒性剤が1つのバクテリオファージにコードされる場合には、このような毒性剤をコードする核酸は同一プロモーターまたは異なるプロモーターに機能的に結合することができる(例えば、本明細書の5.4および5.4.1の項を参照)。
【0061】
5.1.2. アンチセンス
本発明は、毒性剤として作用するので、抗菌剤として有用である特定の核酸を提供する。本発明は、病原菌または選択された細胞のRNAを標的とするアンチセンスRNA分子を提供する。本発明の標的RNAは病原菌特異的RNA、組織特異的細胞RNAまたは疾患特異的RNAであってもよい。本発明はまた、改変されて増強されたアンチセンス核酸を提供し、病原菌特異的RNA、組織特異的細胞RNAまたは疾患特異的RNAを標的とする。
【0062】
本発明の毒性アンチセンス分子の提案されている標的は、病原菌の生存に重大な役割を果たす、または病原菌の生活周期に必須である遺伝子のRNAである。本発明はまた、病原菌の必須遺伝子産物の発現を調節する天然型アンチセンス分子の改変を含む。例えば、上記のように、本発明のアンチセンスの提案されている1つの標的は、その遺伝子産物が大腸菌の細胞分裂の開始に重大な役割を果たしているftsZ遺伝子である。
【0063】
別の態様において、本発明の毒性剤は、標的RNAの阻止を増強するように設計されたアンチセンス分子を含む。本発明のアンチセンス分子を含む毒性剤は、このような毒性アンチセンス分子の配列が、病原菌または選択された細胞の必須RNAなどの標的配列と高い相補性を有するように設計されているという点において、標的RNAとより特異的に結合するように操作される。このような毒性アンチセンス分子は、従って、標的にさらに特異的であり、従って、効率が高い。本発明は、より安定な分子を作製するために、ヘアピン構造で改変されたアンチセンス毒性剤およびリボザイムを提供する。本発明のアンチセンス毒性剤は、当技術上周知の任意の方法によって、標的病原菌または細胞内で高レベルに発現させることもできる。例えば、アンチセンス毒性剤は、強い調節プロモーターを使用して、多コピー発現プラスミドからイントランス(in trans)で発現させることができる。アンチセンス毒性剤はまた、同じプロモーターを使用する病原菌または細胞においてアンチセンス分子だけが発現されるように、組織特異的または病原菌特異的プロモーターに機能的に結合することができる。
【0064】
詳細には、本発明は、複製または生存に必須なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を特異的に標的とするDicF1またはDicF1様アンチセンス分子などの、必須ヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスRNAを提供する。さらに、本発明は、細菌中で発現されるとき、致死剤として作用するために安定性が増加した改変されたアンチセンス構造を提供する。本発明はまた、必須アンチセンス分子を標的とするように設計された毒性のセンス分子を提供する。
【0065】
本発明の別の態様において、毒性剤は、病原菌または細胞の生存に必要なアンチセンスRNAを標的とするセンスRNA分子を含む。例えば、(嗜癖系毒素などの)毒性タンパク質の解毒剤は、毒素の発現を調節するアンチセンス分子の形態であってもよい。このようなアンチセンス解毒剤により、病原菌または細胞は、このような毒素の存在下においても生存することができる。本発明は、センスRNA分子の形態の毒性剤によるアンチセンス解毒剤の抑制を提供する。
【0066】
ある態様において、致死を生ずるために、2つ以上の毒性分子の組み合わせを(大腸菌、緑膿菌等などの)病原菌に送達することができる。この態様において、毒性アンチセンスは同じ標的または異なる標的に向けることができる。病原菌または細胞の異なる標的を標的とする場合には、このような標的は、病原菌の同じ生物経路または異なる生物経路に関与することができる。
【0067】
特定の態様において、アンチセンス配列はDicFに基づいている(Bouche F.ら、1989、Mol Microbiol. 3: 991−4)。このような改変されたDicF配列はDicF1(配列番号:8)と呼ばれる。天然型DicFは、大腸菌(Escherichia coli)内で発現されるとき、細胞分裂の阻止を生ずるシストロン間領域の一部である。この阻止は、DicFmRNAのタンパク質への翻訳を必要とせず、代わりに、DicFRNAは、アンチセンス分子として阻止作用を発揮する。
【0068】
DicFの提案されている標的は、その遺伝子産物が、大腸菌の細胞分裂の阻止に重大な役割を果たすftsZ遺伝子である。ftsZ遺伝子の温度感受性突然変異は、それが、大腸菌の生存に必須であることを示している。機序を限定するわけではないが、DicFRNAは、ftsZmRNAの5’側非翻訳領域に特異的に結合し、それによってftsZタンパク質の発現を阻止すると考えられる。ftsZタンパク質を欠損する細胞は、分裂することができず、最終的に死滅する。DicF相同物は、種々の他の細菌において同定されているが、それらが同様の機能を発揮するかどうかは不明である。
【0069】
本発明は、本発明の抗菌剤または毒性剤として使用され、DicF1またはDicF1様RNAと呼ばれる、改変されたDicF核酸を提供する。DicF1RNAは、内因性DicF1RNAより優れたアンチセンス分子である。それは、ftsZ5’側非翻訳mRNAとの相補性を増加することによって改変されている。従って、標的にさらに特異的であるので、効率が高い。さらに安定な分子を作製するために、オートヘアピン構造がさらに増強された。本発明はまた、病原菌の生活周期または生存に必須の遺伝子産物の発現を調節する際に、DicFと同様の機能を有するヌクレオチド配列などの他の天然型アンチセンス分子の改変を提供する。このような核酸分子はDicF1様分子と呼ばれる。内因性とDicF1は異なり、本発明のDicF1またはDicF1様核酸分子は、マルチ−コピー発現プラスミドからイントランス(in trans)で発現される。さらに、DicF1またはDicF1様核酸分子は、このような発現の強度、時期または分布を制御するために使用することができる種々のプロモーターに機能的に結合することができる。DicF1またはDicF1様核酸分子はまた、リボザイムカセットからイントランス(in trans)で発現される。これらの特徴を組み合わせることにより、(大腸菌)などの病原菌に対する効果的な抗菌剤であるDicF1またはDicF1様核酸分子が得られる。他の態様において、本発明のアンチセンスの配列を改変することにより、種々の他の細菌を標的とすることができる。他の態様において、本発明のアンチセンスの配列を改変することにより、病原菌特異的に標的とすることができる。本発明はまた、相補的RNA標的を有する細菌、細菌感染細胞または他の病原菌の毒性剤として使用することができるDicF1様核酸分子を提供する。
【0070】
5.1.3. アンチセンスオリゴヌクレオチド
標的配列の少なくとも一部と生理的条件下においてハイブリダイゼーションまたはアニーリングするアンチセンスオリゴヌクレオチドも、本発明の組成物および方法に使用するために提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的には、鎖長が短く(例えば、隣接ヌクレオチドまたはそれらの類似物の任意の数は約6〜約50)、当技術上周知の任意の方法によって細胞に送達される(例えば、以下のセクション5.9に記載の例示的な投与方法を参照)。このようなオリゴヌクレオチドは、2’−デオキシ−D−リボースを含有するポリデオキシヌクレオチド、D−リボースを含有するポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、または非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー(例えば、ペプチド核酸またはRNA、以下参照および市販の任意の他の合成配列特異的核酸様ポリマー)またはポリマーが構造中にヌクレオチドを含有し、それによってDNAおよびRNAに見られるような塩基対または塩基スタッキングが可能になる非標準的結合を含むが、これらに限定されない。それらは、2本鎖および1本鎖DNA、ならびに2本鎖および1本鎖RNAおよびDNA:RNAハイブリッド、ならびに全ての既知の種類の改変、例えば、ラベル、「キャップ」、メチル化、1つ以上の天然ヌクレオチドの1つ以上の類似物との置換を含んでいてもよい。追加の既知の改変は、例えば、種々の非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホロトリエステル、ホスホールアミデート、カルバメート等)、荷電結合または含硫黄結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)、側基部分(例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジン等を含むタンパク質上などの)および糖類(例えば、単糖類等)、挿入剤(例えば、アクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等)、アルキル化剤および修飾された結合(例えば、αアノマー核酸等)などの内部ヌクレオチド(internucleotide)改変を含む。
【0071】
ペプチド核酸(PNA)は、本発明の組成物および方法に使用することができる、当技術上周知の核酸誘導体または類似物のまさに一例である。PNAはニールセン(Nielsen)らによって1991年に最初に記載され(1991、Science 254、1497−1500)、負に荷電した糖−リン酸塩骨格の代わりに中性のペプチド様骨格を有する核酸模倣物と記載されている。しかし、DNAおよびRNAに見られるものと同じ窒素塩基(すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン)がPNAに使用されており、PNAはDNAおよびRNAとワトソン−クリック塩基対を形成する。PNAは、DNAポリメラーゼ、核酸結合タンパク質またはプロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む他の酵素の基質と一般に認識されていないが、いくつかの例外が存在する(例えば、Lutzら、1997、J. Am. Chem. Soc. 119、3177−3178参照)。PNAの化学構造は、アミド結合によって結合されたN−(2−アミノエチル)−グリシンの反復単位からなる。窒素塩基は、メチレンカルボニル結合によってこの中性の骨格に結合する。天然の核酸骨格とは異なり、デオキシリボース、リボースまたはホスフェート基は存在しない。結果として、標的核酸とのPNA結合は、従来の核酸の場合より強力であり、結合は実際には塩濃度に無関係である。定量的には、これは、PNAを含有する2本鎖の高い熱安定性によって反映される。
【0072】
PNAは、核酸およびペプチドの合成に使用されるものと同様の化学を使用して、当技術上周知の方法によって合成することができる。このような合成に使用されるPNAモノマーは、ヌクレオシドとアミノ酸のハイブリッドである。PNAオリゴマーの中性の骨格によりいくつかの独自の特性がある。天然の核酸と比較した特性には、(a)高い親和性、(b)早いハイブリダイゼーションおよび(c)塩濃度とは比較的無関係のハイブリダイゼーションがある。一般に、1つ以上のミスマッチを有する天然の核酸と2本鎖を形成した所定のPNAは融点が大きく変化する(すなわち、ΔTm)。PNA産物、提供および技術的支援は、Applied Biosystemsの一部門であるPerSeptive Biosystems, Inc.(www.pbio.com)を利用することができる。例えば、PNAはキットを使用して合成することも、または特注のPNA合成を注文することもできる。PNAオリゴマーは、Fmocまたはt−Boc系モノマーと標準的なペプチド化学プロトコールとを使用して手動で合成することもできる。標準的なペプチド精製条件を使用して、合成後にPNAを精製することができる。
【0073】
種々の広範なPNAの総説が報告されており、その各々は参照として本明細書に組み入れられている(例えば、Nielsenら、1992、「アンチセンス研究および応用(Antisense Research and Applications)」、CrookeおよびLebleu編、CRC Press、363−372頁; Nielsenら、1993、Anti−Cancer Drug Design 8、53−63; Buchardtら、1993、TIB TECH 11、384−386; Nielsenら、1994、Bioconjugate Chem. 5、3−7; Nielsenら、1996、「アンチセンス治療(Antisense Therapeutics)」Vol. 4、Trainor編、SECOM Science Publishers B.V., Lieden、76−84頁; Nielsen、1995、Ann. Rev. Biohys. Biomol. Struct. 24、167−183; HyrupおよびNielsen、1996、Bioorg. Med. Chem. 4、5−23; Mesmaekerら、1995、Curr. Opin. Struct. Biol. 5、343−355; DeuholmおよびNielsen、1997、New J. Chem. 21、19−31; KundsenおよびNielsen、1997、Anti−Cancer Drug 8、113−118; Nielsen、1997、Chem. Eur. J. 3、505−508; Corey、1997、TIB TECH 15、224−229; NielsenおよびOrum、1995、「分子生物学:現行の革新および将来の動向(Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends)」、Part 2、Horizon Scientific Press、73−89頁; NielsenおよびHaaima、1997、Chem Soc. Rev.、73−78;Orumら、1997、「核酸増幅技術:疾患診断への応用(Nucleic Acid Amplification Technologies: Application to Disease Diagnostics)」、Leeら編、Bio Techniques Books Div.、Eaton Publishing、29−48頁を参照)。
【0074】
5.1.4. DNAzyme
DNAzymeは、その全てが参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、ウスマニ(Usman)らに付与された米国特許第6,159,714号、Sunらに付与された国際公開公報第00/09673号およびJoyceらに付与された米国特許第5,807,718号を含む、種々の文献に記載されている。この用語が本出願において使用されるとき、DNAzyme(触媒DNA酵素またはデオキシリボザイムとしても当技術上周知である)は、ヌクレオチド塩基配列特異的に別個の標的RNA分子を切断する(好ましくは、反復的に切断する)ことができる酵素活性を有するキメラDNA分子またはRNA不含DNA分子である。
【0075】
DNAzymeは、最初に、標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、RNA基質に近接している、DNAzymeのDNA結合部分を介してこの部分に生じる。次いで、DNAzymeの触媒配列が標的RNAを切断する。従って、DNAzymeは最初に相補的な塩基対を介して標的RNAを認識して、次いで結合し、適切な部位に一旦結合したら、酵素的に作用して、標的RNAを切断する。このような標的RNAの戦略的な切断は、コードされているタンパク質を合成しようとする能力を破壊する。DNAzymeがそのRNA標的に結合して切断したら、DNAzymeはそのRNAから放出され、遊離して、別の標的と結合する。従って、1つのDNAzyme分子は新たな標的と反復的に結合し、切断することができる。
【0076】
一般に、DNAzymeは、基質結合領域において特定の遺伝子標的配列と相補性を有し、RNA標的配列を特異的に切断することができるDNA分子である。すなわち、DNAzyme分子はRNAを分子内切断することができ、それによって標的RNA分子を不活性化することができる。所定のDNAzymeの相補的な配列は、標的RNAにDNAzymeが十分にハイブリダイズして切断を生じさせる働きをする。100パーセントの相補性が好ましいが、50〜75%程度の相補性も本発明に有用である。特に、ミスマッチは、切断領域に隣接していない標的認識部位内に残ることがある。
【0077】
DNAzymeの触媒中心は、RNA基質に対する酵素活性を有する数多くの可能な配列のいずれかから選択することができる。一態様において、触媒中心の配列は、
(配列番号:)である。他の触媒中心の配列は、例えば、Joyceらに付与された米国特許第5,807,718号に開示されている。
【0078】
5.1.5. アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeおよびそれらの3’末端および/または5’末端が改変された類似物
3’末端および/または5’末端が改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、ロッシャー(Rosch)らに付与された米国特許第5,750,669号に記載されている。これらのオリゴヌクレオチドの特徴的な構造の改変は、3’末端のヌクレオチド内結合が改変されており、すなわち、生物的な3’−5’結合の代わりに3’−3’結合が存在するということである。この小さな構造の改変でも、ヌクレアーゼ分解からこのような化合物を安定させるのには十分である。チミジン、シトシン、グアノシンまたはアデニンなどの逆位塩基を使用することができるが、他の塩基も可能である。このわずかな構造の改変によって、未改変のオリゴヌクレオチドとほぼ同じハイブリダイゼーション挙動を生じる。この改変により、これらの化合物は一般に遺伝子発現の阻害剤として利用可能になる。本発明のDNAzymeはまた、3’末端に上記に開示されている改変を有することもある。
【0079】
5.1.6. 核酸の相同性
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルの相同性または同一性は、配列の類似性検索のために適合されているプログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxによって使用されるアルゴリズムを使用したBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析を含む、当業者に周知の任意の方法によって判定することができる(Karlinら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2264−2268およびAltshul、1993、J. Mol. Evol. 36、290−330、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている)。BLASTプログラムに使用される方法は、最初に質問配列とデータベース配列との類似したセグメントを考慮し、次いで同定されている全ての整合の統計的有意さを評価し、最後に予め選択しておいた有意さの閾値を満足する整合だけをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題に関する考察は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Altschulら、1994、Nature Genetics 6、119−129を参照。本出願の目的のためには、ヒストグラム(histogram)、記述(description)、アライメント(alignment)、予想(expect)(すなわち、データベース配列との整合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ値(cutoff)、行列(matrix)およびフィルター(filter)の検索パラメーターをデフォルト設定に使用することができる。blastp、blastx、blastn、tblastnおよびtblastxによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Henikoffら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、10915−10919)。blastnでは、スコアリングマトリックスは、N(すなわち、ミスマッチ残基のペナルティスコア)に対するM(すなわち、整合している残基対のリワードスコア)の比で設定され、MおよびNのデフォルトスコアは、それぞれ、5および−4である。4つのblastnパラメーターは以下のように調整された:Q=10(ギャップ形成ペナルティ)、R=10(ギャップ伸長ペナルティ)、wink=1(質問配列の全てのwink番目の位置においてワードヒット(word hit)を形成する)およびgaps=16(ギャップを入れた整列が形成されるウィンドウ幅を設定する)。相当するBlastpパラメーターの設定は、Q=9、R=2、wink=1およびgaps=32であった。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間のベストフィット(Bestfit)比較は、DNAパラメーターGAP=50(ギャップ形成ペナルティ)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティ)を使用し、タンパク質比較の相当する設定はGAP=8およびLEN=2である。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、本出願の開示の標的部位と少なくとも約70%一致する配列である。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、さらに好ましくは、本出願の開示内容に同定されている標的部位と、少なくとも75%または80%または85%または86%または87%または88%または89%または90%または91%または92%または93%または94%または95%または96%または97%または98%または99%一致する。例えば、配列番号:AHおよび配列番号:AMとして同定された標的配列は、関連のHPV株の相同配列である(それぞれ、HPV16およびHPV11)。結果として、関連HPVまたはHBV株の標的部位はそれらの相同性に基づいて同定可能である。相同部位は、関連ウイルスのタンパク質配列を整列させ、ついで相同または対応する標的部位を見つけるために、基礎となる核酸配列を整列させることによっても同定することができる。
【0080】
5.1.7. リボザイム
本発明は、本発明の毒性剤以外に、トランス作用性リボザイムを使用することができる方法を提供する。さらに、マルチリボザイムを、毒性剤またはトランス作用性リボザイムの1つ以上の発現系として使用することができる。本発明のこれらのリボザイムは、例えば、組織特異的疾患を破壊するため、または細菌、ウイルスもしくは寄生虫感染症を治療するために使用することができる。本発明のリボザイムは1つ以上のマルチリボザイムを含んでいてもよい。
【0081】
本発明によると、マルチリボザイムは1つ以上のリボザイムまたは1つ以上のリボザイムカセットを含んでいてもよい。各カセットは触媒中心(例えば、1つ以上のトランス作用性リボザイムを含有するか、または1つ以上の毒性剤を含有する)と1つ以上の隣接領域からなる。触媒中心は、病原菌特異的標的を特異的に抑制することによって、病原菌を標的とすることができる。触媒中心は、(疾患特異的標的などの)組織特異的標的を特異的に抑制することによって、(異常細胞などの)細胞を標的とすることができる。さらに、以下の項に記載するように、本発明のマルチリボザイムは、細胞もしくは組織特異的または病原菌特異的に、細胞へ毒性剤を送達し、(アンチセンスRNA、毒性遺伝子産物を含む)本発明の毒性剤を発現する手段を提供する。一態様において、リボザイムカセットは、5’側自己触媒的切断リボザイム配列、トランス作用性リボザイムを含むコア触媒リボザイム、および3’側自己触媒的切断リボザイムから構成されていてもよい。別の態様において、マルチリボザイムは、増強された5’側および3’側自己触媒的切断リボザイム配列を含むカセットを含む。別の態様において、マルチリボザイムは1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有する。このようなトランス作用性リボザイムは同一RNAの同一部位、同一RNAの異なる部位または異なるRNAに向けられていてもよい。従って、本発明のトランス作用性リボザイムは病原菌特異的RNAまたは組織特異的RNAを標的とすることができる。
【0082】
本発明はまた、マルチリボザイムと、細菌感染症などの疾患を治療するための、組織特異的または病原菌特異的にRNAを標的とするそれらの用途とを提供する。本発明は、1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有するマルチリボザイムを提供する。トランス作用性リボザイムは標的特異的に作用するので、ある態様では、毒性剤の用途を増強するために、(細菌などの)病原菌または(異常細胞などの)選択された細胞に作用することができる。本発明によると、マルチリボザイムは、a)5’側および3’側自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイム、b)5’側または3’側自己触媒的切断リボザイムが隣接したトランス作用性リボザイムまたは毒性剤、あるいはc)5’側および3’側自己触媒的切断リボザイムまたは増強された自己触媒的切断リボザイムの一方もしくは両方が隣接したマルチ−トランス作用性リボザイムおよび/またはマルチ毒性剤を含んでもよい。例えば、特定の態様において、本発明は、第1のトランス作用性リボザイムがHBV標的を切断し、第2のトランス作用性リボザイムがHCV標的を切断する、2つのトランス作用性リボザイムを有するマルチリボザイムを提供する。この態様では、例えば、肝臓特異的プロモーターとの機能的な結合によって、このようなマルチリボザイムの発現を肝臓に標的とすることが望ましいことがある。従って、本発明のマルチリボザイムは、細菌または細菌感染細胞または組織に1つ以上の毒性剤を送達することができる。本発明によると、マルチ−トランス作用性リボザイムは同一RNAの同一部位、同一RNAの異なる部位または異なるRNAを標的とすることができる。本発明によると、マルチ毒性剤は、(細胞RNAまたはタンパク質などの)同一標的の同一部位、同一標的の異なる部位または異なる標的を標的とすることができる。
【0083】
本発明のリボザイムは、標的としたRNAのRNAを不活性化するのに十分な触媒能力を有する。抗菌的な見地からは、mRNAのホスホジエステル結合を切断することによって、分子が遺伝子発現を触媒作用により不活性化するので、ハンマーヘッド型リボザイムが本質的に好ましい。さらに、ハンマーヘッド型リボザイムは分子内またはトランスデューサ(トランス)作用性状態で機能するように再操作されている(Haseloffら、1988、Nature 334(6183): 585−91; Uhlenbeck, O.C.、1987、Nature 328(6131):59)。リボザイムの触媒活性は十分な濃度の2価陽イオン、Mg2+と基質を必要とする。基質は、切断部位が認識エレメントNUX(ここで、Nは任意のヌクレオチドであり、Uはウラシルに相当し、XはG以外の任意のヌクレオチドである)を含有する限り、任意の配列を有していてもよい(Koizumiら、1989、Nucleic Acids Resonant. 17(17): 7059−71)。リボザイムはインビボにおいて機能することが広範に証明されている(Christoffersenら、1995、J. Med. Chem.38(12): 2023−37; Inokuchiら、1994、J. Biol. Chem. 269(15): 11361−6)。本発明は、リボザイムカセットからなるマルチリボザイムを構築することによって、最初に設計されたハンマーヘッド型リボザイム(Tairaら、1991、NAR 19(9): 5125−5130)を改善している。リボザイムカセットは、標的としたRNAを不活性化するリボザイムに隣接している1つ以上のシス作用性ハンマーヘッドリボザイムと、1つ以上の隣接配列とを含有する。転写の結果、標的とされたリボザイムは、非特異的相互作用を減少することによってその特異性の改善だけでなく、その触媒活性も改善した60〜70塩基の転写物として放出される。本発明は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第5,824,519号、PCT公開公報国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第97/17433号、国際公開公報第98/24925号、国際公開公報第99/67400号に記載されているリボザイムの改変および用途を含む。
【0084】
5.2. 毒性剤またはリボザイムをコードする核酸
本発明はまた、本発明のリボザイムおよび/または毒性剤をコードする核酸および発現カセットを提供する。これらの核酸は、選択された部位において本発明のリボザイムまたは毒性剤を発現するために使用することができる。部位は、組織特異的な癌または疾患を治療する場合には組織特異的であってもよく、または感染症(例えば、肝炎、ヘルペス、マラリア、結核、細菌感染症等)を治療するためには、感染菌の増殖を抑制するリボザイムまたは毒性剤の場合には病原菌特異的であってもよい。本発明は、標的特異的である毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を提供する。本発明はまた、組織特異的または病原菌特異的プロモーターに機能的に結合する毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を提供する。
【0085】
マルチリボザイムをコードする配列を構築するためにはいくつかの選択肢がある:1)同一病原菌の異なる標的に向かうリボザイム、2)同一リボザイムの複数のコピー、3)複数の標的に向かう複数のリボザイムおよび4)同一標的の異なる部位に向かう複数のリボザイム。毒性剤をコードする配列を構築するためにもいくつかの選択肢がある:1)同一病原菌の異なる標的に向かう毒性剤、2)同一毒性剤の複数のコピー、3)複数の標的に向かう複数の毒性剤および同一標的に向かう複数の毒性剤。さらに、毒性剤およびリボザイムを種々の方法で組み合わせることができ、例えば、マルチリボザイムと毒性剤をコードする核酸とを1つのプロモーターの制御下において1つの構築物に操作することができる。プロモーターは、本明細書に記載されている特性のレベルを選択することができる。
【0086】
本発明の核酸は、本発明の1つ以上の毒性剤をコードする。従って、本発明の毒性タンパク質をコードする核酸は、嗜癖系毒素を含むが、これらに限定されない。本発明は、改変されて増強された嗜癖系毒素を提供し、特定の標的病原菌にさらに毒性またはさらに特異的であるように操作されている。本発明は、病原菌の生存に重大な役割を果たす、または病原菌の生活周期に必須である遺伝子のRNAを標的とするアンチセンス分子をコードする核酸を提供する。本発明にはまた、病原菌の必須遺伝子産物の発現を調節する天然型アンチセンス分子の改変を含む核酸が含まれる。
【0087】
本発明の核酸は、本発明のアンチセンス分子をコードするものに関する。本発明は、改変されて増強されたアンチセンスを提供し、増強された安定性、標的RNAとの増強された相補性または標的RNAもしくは標的病原菌に対する増強された特異性を有する。本発明はまた、病原菌の生活周期または生存に必須の遺伝子産物の発現を調節する際にDicFと同様の機能を有するヌクレオチド配列などの、改変された天然型アンチセンス分子をコードする核酸を提供する。
【0088】
本発明の核酸は、必須アンチセンス分子を標的とすることができるセンスRNA分子をコードする核酸に関する。
【0089】
ccdB、kid、perK、parE、doc、higB、chpAK、chpBK、kicB、hoc、srnB’、flmA、pmdA、relF、gef、kilA、kilB、kilC、kilE、traL、traE、sigB、hok、pemK、リソスタフィンおよびkikAからなる群より選択される毒性剤をコードする核酸が提供される。毒性剤DicF1またはDicF1様をコードする核酸が提供される。
【0090】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、a)標的RNAを切断する触媒配列(「触媒中心」としても知られる)およびb)シス作用性自己触媒的切断リボザイムを含む隣接領域を含む2つの分離可能な機能的領域を含有する触媒マルチリボザイムをコードする。上記のように、触媒中心は1つ以上のトランス作用性リボザイムおよび/または1つ以上の毒性剤からなる。本発明は、2つ以上のトランス作用性リボザイムを含有する内部標的リボザイムをコードする核酸を提供し、別個のトランス作用性リボザイムの各々は同一または異なる標的RNA分子を標的とすることができる。核酸の相補性によって、結合部位はリボザイム中心に向かい、標的RNA分子の特異的部位を切断する。隣接する配列の鎖長は、特異性だけでなく、個々のリボザイム分子の切断効率にも関係を持つ。本発明の触媒リボザイムでは、隣接する配列は標的RNAに特異性が高いが、切断が生じると、標的RNAから容易に分離することができる。これにより、リボザイムはサイクリング(cycling)し、有効であることが必要なリボザイムの量を低下する。16〜21 Kalの範囲の結合/分離値が有効であると予想される。本発明は、2つ以上の毒性剤をコードする核酸を提供し、毒性剤の各々は同一または異なる標的分子を標的とすることができる。
【0091】
本発明はさらに、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸および発現カセットを提供する。これらの核酸は、選択された部位において本発明の毒性剤および/またはリボザイムを発現するために使用することができる。一態様において、核酸は、毒性剤に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、本発明の核酸および発現カセットは、1つ以上の標的RNA特異的トランス作用性リボザイムおよび1つ以上の毒性剤を含む触媒リボザイムをコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、毒性剤をコードする配列由来の病原菌特異的プロモーターを含む。別の態様において、本発明の核酸および発現カセットは、5’側自己触媒的切断リボザイム配列、1つ以上の標的RNA特異的トランス作用性リボザイムおよび/または病原菌特異的毒性剤を含む触媒リボザイム、ならびに3’側自己触媒的切断リボザイム配列、をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む。本発明によると、発現カセットは、同一または異なる標的に作用するトランス作用性リボザイムを含有する2つ以上のマルチリボザイムを発現するように操作することができる。発現カセットはまた、切断活性が遅い、または増強されている5’側および3’側自己触媒的切断リボザイムを含有する2つ以上のマルチリボザイムを発現するように操作することができる。
【0092】
本発明の発現カセットまたは本発明の毒性剤をコードする核酸は、当技術上周知のいかなる好適な(バクテリオファージ伝達プラスミド、細菌プラスミドまたは真核細胞発現プラスミドなどの)プラスミドに配置することができる。本発明はまた、本発明により使用するための新規かつ改変されたプラスミドを提供する。
【0093】
分子遺伝学的レベルでは、本発明の毒性剤、リボザイムまたはマルチリボザイムのコード配列は、以下の遺伝子エレメントの1つ以上の制御下におくことができる:標的とされる微生物の天然型で、強い、中程度もしくは弱い構成的発現プロモーターもしくは調節プロモーター、または望ましいレベルのリボザイムおよび/もしくは毒性剤発現を与える、強い、中程度もしくは弱いコンセンサス配列を含有する人工的に考案された構成的発現プロモーターもしくは調節プロモーター。本発明は、病原菌特異的であるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、本発明の毒性剤の病原菌特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、組織特異的であるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、本発明の毒性剤の組織特異的な発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。従って、本発明は、病原菌特異的であるプロモーターエレメントをコードする核酸を提供する。本発明は、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原菌特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、組織特異的であるプロモーターエレメントを提供する。本発明は、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの組織特異的発現を達成するために使用されるプロモーターエレメントを提供する。
【0094】
一態様において、核酸は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、少なくとも1つの自己触媒的リボザイムおよび1つ以上のトランス作用性リボザイムをコードする配列に機能的に結合した組織特異的または病原菌特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、少なくとも1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的または病原菌特異的プロモーターを含む。別の態様において、核酸は、少なくとも1つの自己触媒的リボザイムおよび1つ以上のトランス作用性リボザイムおよび1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む。本発明によると、本発明のトランス作用性リボザイムおよび/または毒性剤は同一または異なる標的に作用することができる。
【0095】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする新規ベクターまたはプラスミドを提供する。本発明の新規ベクターは、組織特異的、病原菌特異的、プロモーター特異的、抗菌特異的、抗ウイルス特異的、抗癌特異的、抗腫瘍特異的または標的特異的を含むが、これらに限定されない多種多様の毒性剤および/またはリボザイムを操作するために使用することができる。本発明はまた、細胞または病原菌のベクターまたはプラスミドの複製の特異性を調節するベクターまたはプラスミドの複製起点に関する。本発明はまた、毒性剤および/またはリボザイムの用量を調節するための、選択された細胞または病原菌中のベクターまたはプラスミドのコピー数に関する。
【0096】
特定の態様において、本発明は、毒性タンパク質をコードする新規プラスミドを提供する。別の特定の態様において、本発明は、突然変異体バクテリオファージpac部位または突然変異体バクテリオファージpacABC配列をコードする新規プラスミドを提供する。
【0097】
5.2.1. 真核細胞および原核細胞発現ベクター
本発明は、本発明の毒性剤および/またはマルチリボザイムを発現させるために使用することができる、発現系、真核細胞および原核細胞発現ベクターを含む。本発明の毒性剤をコードする核酸を含有するDNA発現ベクターおよびウイルスベクターは、当技術上周知の技法を使用した組換えDNA技術によって作製することができる。従って、毒性剤および/またはマルチリボザイム配列をコードする核酸を発現させることによって、本発明の発現ベクターおよびウイルスベクターを作製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を使用して、遺伝子産物をコードする配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えDNA技法、合成技法およびインビトロ遺伝子組換えを含む。例えば、サムブルック(Sambrook)ら、1989, 上記およびオウスベル(Ausubel)ら、1989、上記に記載されている技法を参照。または、毒性剤および/またはリボザイム配列をコードすることができる核酸は、例えば、合成装置を使用して化学的に合成することができる。例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」、1984、Gait, M.J.編、IRL Press、Oxfordに記載されている技法を参照。
【0098】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムを発現するために使用することができる。このような宿主発現系は、本発明の毒性剤またはリボザイムをコードする配列をインビボおよびインビトロにおいて細胞、組織または病原菌に導入することができる媒体であるが、配列をコードする適当なヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされたとき、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを発現することができる細胞でもある。これらは、選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物;選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia));選択された毒性剤および/またはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;選択された毒性剤および/もしくはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させた、もしくは選択された毒性剤および/もしくはマルチリボザイムコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;あるいは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)を含むが、これらに限定されない。
【0099】
5.3. 毒性剤の送達および発現
本発明はまた、本発明の毒性剤またはリボザイムを送達するための新規媒体を提供する。本発明は、コード配列を発現させる調節エレメントが機能的に結合した上記のコード配列のいずれかを含有するDNA発現ベクターおよびウイルスベクターと、宿主細胞または病原菌においてコード配列またはRNAを発現させる調節エレメントが機能的に結合した上記のコード配列のいずれかを含有する遺伝子操作された宿主細胞とを含む。本発明の主要な点は、標的とした微生物または病原菌に毒性剤および/またはリボザイムを送達するために使用する方法である。一方は性質が生物的で、他方は非生物的である、2つの別個のクラスの送達系を製造することができる。
【0100】
従って、本発明はまた、非生物的または生物的な系によって、細胞または病原菌に本発明の毒性剤を送達することを提供する。本発明は、不活性化され、変更され、または改変されたウイルス(ビリオン)またはバクテリオファージ送達媒体によって、標的微生物に特異的な基礎的および必須の細胞過程にリボザイムおよび/または毒性剤を1つ以上送達するための方法および組成物を開発することによって得られたものの組成物を提供する。本発明はまた、標的微生物に、毒性剤および/またはリボザイムを含む核酸を送達することができる非生物送達媒体を提供する。
【0101】
5.3.1. 生物送達媒体
本発明の生物送達媒体は、一般的な形質導入粒子がウイルス送達媒体由来のDNAを欠損しているということ、またはウイルス送達媒体由来のDNAを導入する能力が低いということを利用している。本発明の好ましい態様において、ウイルス送達媒体はバクテリオファージまたは改変されたバクテリオファージである。一態様において、このようなウイルスまたはバクテリオファージ粒子だけが宿主起源の配列を含有する。他の態様において、このような粒子は、送達される毒性剤またはリボザイムをコードする操作されたプラスミド/ベクターを含有する。他の態様において、このような粒子は、送達される毒性剤またはリボザイムをコードする操作されたプラスミド/ベクターを含有し、送達媒体由来のDNAを移入する送達媒体の能力を不活性化する突然変異を含有する。結果として、本発明は、毒性剤および/またはリボザイムの望ましいレベルの発現を保証する必要な遺伝子エレメントを含有する核酸の周囲に、ウイルスの頭部タンパク質(抗菌治療のためのパッケージング構成要素)の生物集成物を使用する。本発明の重要な特徴は、ウイルス送達を用いる毒性剤またはリボザイムとプラスミドの特徴の独自の組み合わせを使用したビリオンの集成の組み合わせである。
【0102】
好ましい一態様において、本発明は、本発明の毒性剤を送達するバクテリオファージを提供する。本発明のバクテリオファージは、1つ以上の毒性遺伝子産物、タンパク質、アンチセンスRNA、センスRNAまたはそれらの組み合わせなどの、本発明の1つ以上の毒性剤を送達するように構築することができる。本発明の別の態様において、宿主細胞は、病原菌特異的毒性剤またはリボザイムを発言するように構築することができる。本発明のよりさらに別の態様において、宿主細胞は、本発明に使用するプロモーターのリプレッサーを発現するように構築することができる。
【0103】
他の態様において、宿主細胞は、毒性剤の解毒剤を過剰発現するように操作して宿主細胞を毒性から保護することができ、産生株または製造株として使用できる。
【0104】
本発明はまた、バクテリオファージ、ウイルスベクター等などの毒性剤および/またはリボザイムを発現させるために使用することができる発現系を含む。例えば、種々のバクテリオファージ系を使用して、本発明の選択されたリボザイムおよび/または毒性剤を発現させることができる。例えば、このようなバクテリオファージ系は、毒性剤および/またはリボザイムをコードする配列をインビボおよびインビトロにおいて標的細菌に導入することができる媒体である。いくつかの態様において、選択された特定のバクテリオファージは、バクテリオファージによって標的とされ、感染させられる細菌の種類を決定する。
【0105】
一態様において、病原菌への毒性剤の送達は、関心のある病原菌を標的とするバクテリオファージまたは他の送達媒体を使用することによる。一態様において、バクテリオファージ(または送達媒体)は、病原菌に、毒性剤または毒性剤をコードする核酸を送達する。特定の態様において、本発明の毒性剤は、病原菌に感染することができる改変されたバクテリオファージによって、細菌細胞に送達される。さらに別の態様において、バクテリオファージは、特定の種または属の細菌に感染する能力について選択され、このような細菌の種または属を宿主から根絶させるための毒性剤を送達するために使用される。好ましい態様において、送達媒体に固有の核酸を送達するには不十分な量しか遺伝情報を含有しないように、送達媒体または送達媒体に固有の核酸を改変する。従って、改変された送達基剤(例えば、ビリオンまたはバクテリオファージ)は、標的細胞または病原菌に、本発明のリボザイムおよび/または毒性剤を送達する分子媒体として働くことができるが、送達媒体に固有の複製可能な核酸を送達しない。または、非生物送達系(例えば、リポソーム)を使用して、リボザイムおよび/または毒性剤の適切な発現に必要で、十分な遺伝子エレメントを保有する核酸をパッケージングすることができる。
【0106】
本発明の毒性剤および/またはリボザイムは、種々の病原菌による感染症を治療するために使用することができる。これらは、細菌などの微生物、寄生虫および真菌を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の態様において、(改変されたバクテリオファージなどの)ウイルス送達媒体によって送達される、本発明の毒性剤は、重症の火傷、嚢胞性繊維症、癌または他の免疫寛容状態に関連する微生物感染症を治療するために使用することができる。
【0107】
5.3.1.1. ウイルスベクターによる送達および発現
本発明によると、多種多様のウイルスおよびウイルスベクターを使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードするヌクレオチド配列を送達することができ、その例をいくつか以下に記載する。これに関しては、種々のウイルスは、特定の病原菌を標的とするために、選択された毒性剤および/またはリボザイムを発現するように遺伝子操作することができる。
【0108】
本発明はまた、非生物的または生物的系によって、細胞または病原菌に、本発明の毒性剤を送達することに関する。特定の態様において、例えば、本明細書に記載されているように、本発明の毒性剤は、病原菌に感染することが可能なバクテリオファージによって細菌細胞に送達される。さらに別の態様において、バクテリオファージは、特定の種の細菌に感染する能力について選択され、宿主からこのような細菌種を根絶するための毒性剤を送達するために使用される。
【0109】
本発明は、本発明の病原菌に特異的に感染する任意のバクテリオファージならびに本発明の病原菌に感染させるために特異的に標的されうる任意のウイルスであってもよいビリオンの用途を提供する。例えば、バクテリオファージは、以下の属の細菌細胞に特異的な、バシラス(Bacillus)、カンピロバクター(Campylobacter)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、エンテロバクター(Enterobacter)、腸球菌(Enterococcus)、エシェリキア(Escherichia)、クレブシェラ(Klebsiella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、シュードモナス(Pseudomonas)、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ビブリオ(Vibrio)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、 エルシニア(Yersinia)等(例えば、「細菌とバクテリオファージのアメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ(the Amerian Type Culture Collection Catalogue of Bacteria and Bacteriophages)」、最新版、Rockville、MD参照)ならびに本発明の細菌に特異的に感染することが現在知られているまたは後に同定される任意の他のバクテリオファージを含んでもよいが、これらに限定されない。本発明はまた、真菌病原菌に特異的に感染するビリオンの用途を提供する。
【0110】
この送達系は、ウイルス粒子にパッケージングされた毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を保有するDNAプラスミドからなる。特異性は、毒性剤および/またはリボザイムのプロモーター駆動性転写およびウイルス媒体の宿主特異性によって与えられる。特性はまた、ベクター複製を制御する複製起点によって与えられる。
【0111】
本発明のビリオンでは、非ウイルスDNAは1つ以上の毒性剤および/または1つ以上のリボザイムをコードすることができる。ビリオンでは、非ウイルスDNAは、1つ以上の毒性剤またはリボザイムをコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的または組織特異的プロモーターを含むことができる。
【0112】
ビリオンによって送達される核酸は、1つ以上の毒性剤および/または1つ以上のリボザイムまたはそれらの組み合わせをコードすることができる。ビリオンは、リボザイムまたは毒性剤、特に本明細書に記載されているものをコードする任意の核酸を含むことができる。
【0113】
バクテリオファージP1
本発明は、毒性剤またはリボザイムを標的細胞に送達するための任意のビリオンの用途を提供する。例えば、大腸菌の一般的なバクテリオファージP1は、数多くの理由により、本発明の好ましい送達媒体である。第一に重要なことは、P1は広域属間および種間範囲を有する(Yarmolinskyら、1988、Mol. Gen. Genet. 113−273−284)。大腸菌のP1受容体は、細菌外膜のリポ多糖類(LPS)コアのリセルグ環の末端グルコースである(「普遍形質導入(Generalized Transduction)」、2421−2441頁、F. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、Vol.2、ASM Press、Washington、DC.)。ヤルモリンスキー(Yarmolinsky)およびステルンバーグ(Sternberg)は、この特定のファージは、大腸菌以外に、多数(>25)の異なるグラム陰性菌に核酸を注入する能力を有することを報告している(Yarmolinskyら、1988、Mol. Gen. Genet. 113: 273−284)。
第2に、P1は、相当量の遺伝情報、大腸菌のDNAの2%(100,000 bp)以上を収容することができる(「普遍形質導入(Generalized Transduction)」、2421−2441頁、F. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、Vol.2、ASM Press、Washington、DC.)。結果として、リボザイムまたは毒性剤の遺伝子量は、毒性剤および/またはリボザイムの倍増によって増加させることができ、毒性剤および/またはリボザイムの殺菌活性を増加することができる。従って、バクテリオファージP1は、送達媒体または分子シリンジとして使用される。1)非病原性固有微生物叢への望ましくない産物(例えば、P1バクテリオファージ由来のDNA)の播種、2)顕著に狭い宿主範囲、3)宿主の細網内皮系による遺伝材料の早急な除去および4)免疫寛容患者では偏共生細菌への溶解感染が制御不能になる可能性があるという問題、をリスクとして有することがある溶解ファージ治療よりもP1には利点がある。これらの態様のうちある態様では、P1送達系は、標的病原微生物に毒性剤を送達するための好ましい送達媒体である。P1送達媒体の別の利点は、宿主に内因性ファージDNAを移入できないようにファージが操作されている場合には、望ましくない産物のファージ媒介性移入が低下または回避されることである。この態様では、ファージ粒子は、標的細菌細胞に伝達プラスミドDNAを注入する。コードされる毒性剤の発現により、微生物の抗生物質への耐性に無関係に、微生物細胞が死滅する。
【0114】
また、インビトロパッケージングを使用する方法も可能である。インビトロパッケージングは、毒性剤またはリボザイム構築物の遺伝情報にPAC部位を添加することにより実施することができる。P1パッケージングは、P1 PAC遺伝子の1つのなかで開始する(Steinberg, N.、1987、J. Mol. Bil. 194(3): 469−79)。活性なPAC部位は、P1 EcoR1断片20の161塩基対のセグメント内に含有されることが報告されている(Steinberg, N.、1987、J. Mol. Bio. 194(3): 469−79)。従ってファージ頭部は、不活性化用のリボザイムおよび/または毒性剤を病原菌に送達する分子シリンジとして働く。
【0115】
本発明の特定の好ましい態様において、毒性剤は伝達プラスミドにコーティングされ、P1バクテリオファージ送達系と関連して使用される。このような伝達プラスミドは、好ましくは、1)複製起点、2)選択マーカー、3)P1 PAC部位を有するPac ABC遺伝子、4)P1溶菌レプリコンおよび5)本発明の1つ以上の毒性剤をコードする核酸(例えば、アンチセンス分子、リボザイムまたは毒性タンパク質等)を含有する。伝達プラスミドは細菌産生細胞において作製することができる(例えば、P1溶菌ファージ)。本発明の好ましい態様において、バクテリオファージP1プラスミド(例えば、P1ファージ前駆体)は、ファージ頭部にパッケージングされないように操作される。この態様では、伝達プラスミドだけがビリオンにパッケージングされる。このようなP1プラスミドパッケージングの阻止は、P1プラスミドがビリオンまたはファージ頭部にパッケージングされないようにする突然変異または欠損をP1プラスミドに導入することによって、実施される。パッケージングを阻止するP1プラスミドの突然変異または欠損は、P1プラスミドPAC部位の1つ以上の突然変異および/または欠損を含むが、これらに限定されない。バクテリオファージP1プラスミドのパッケージングを阻止するP1プラスミドの任意の突然変異および/または欠損は本発明の範囲内である。このような突然変異または欠損は、当技術上周知の標準的な技法によって導入される。いくつかの態様において、P1溶菌ファージは温度感受性リプレッサー突然変異を有する(例えば、C1. 100)。好ましくは、P1溶菌ファージの導入により、パッケージングされた伝達プラスミドだけを含有するP1ファージ頭部が作製される。次いで、パッケージングされた伝達プラスミド核酸を含有するバクテリオファージを使用して、病原菌などの標的細胞に感染することができる。バクテリオファージは、細菌に核酸を注入することによって、病原菌に感染する。従って、バクテリオファージ核酸にコーティングされた毒性剤が細菌に送達される。細菌内で、伝達プラスミド核酸は再び環状化(recircularize)し、毒性剤が細菌内で発現され、毒性および死滅を生じる。欠損および/または突然変異により、本発明の毒性剤またはリボザイムをコードする核酸のパッケージングが可能になるが、1つ以上のウイルス遺伝子またはプラスミドをコードする核酸のパッケージングを抑制するように、同様の突然変異および/または欠損を本発明の他のウイルス送達系に使用することができる。このような方法により、安全性が増加したウイルス送達系が構築される(例えば、本発明の治療に関連して使用する場合)。
【0116】
特定の態様において、本発明は、病原菌標的に感染するP1ビリオンに伝達プラスミドをパッケージング/送達することができるバクテリオファージを提供する。別の特定の態様において、バクテリオファージP1(PAC部位)ノックアウトは伝達プラスミドDNAをパッケージング/送達することができるが、P1 DNAを組み込むことができないので、非病原性の固有微生物叢への望ましくない産物の水平導入を抑制することができる。本発明の別の特定の態様において、ファージ送達系は、抗菌剤をコードする遺伝子を保有する伝達プラスミド、プラスミド複製起点、P1溶菌複製起点および最小PAC部位(図12、配列番号:7に示す最小P1 pac部位などの)を含む。この態様では、プラスミドは、自身のDNAをパッケージングすることができないバクテリオファージP1溶菌ファージ内に維持される。欠損溶菌ファージは、伝達プラスミド上でP1複製起点を活性化するのに必要な全ての複製因子および成熟ビリオンを形成するのに必要な全ての構造的構成要素を提供する。溶菌ファージはまた、C1.100温度感受性リプレッサー突然変異を保有する。C1は、増殖期ファージを生ずる機能の抑制を担う。温度変化によって溶菌ファージを誘導すると、DNAが増幅され、伝達プラスミドがP1ファージ頭部にパッケージングされ、産生株が溶菌される。ビリオンを回収し、伝達プラスミドを病原菌に送達するために使用する。ファージ頭部は伝達プラスミドDNAの複数のコピーを含有し、バクテリオファージの天然の受容体媒介性機序によって病原菌に標的される。送達の結果、プラスミドDNAが再び環状化(recircularize)し、毒性剤が環境、毒性調節的または種特異的プロモーターの制御下において発現すると、細胞死が迅速に生じる。
【0117】
特定の態様において、本発明は、宿主の細菌感染症を治療するために、バクテリオファージ送達系と併用して使用することができる毒性剤をコードする新規伝達プラスミドを提供する。
【0118】
バクテリオファージλ
大腸菌に対して向かうリボザイムおよび/または毒性剤を保有するDNAをパッケージングするバクテリオファージビリオンを使用した系の他の例は、バクテリオファージλである。同様の方法を使用して、他の微生物に対して向かうリボザイムおよび/または毒性剤を送達することができるビリオンを作製する。バクテリオファージλ外被由来のビリオンなどの、DNAをパッケージングするために使用されるビリオンは種特異的であってもよく、または上記のように、バクテリオファージP1由来のビリオンなど、広域宿主範囲を保有していてもよい。種特異的プロモーターは、種特異的で標的とされているRNA配列に対して向けられるリボザイムを転写させるために使用されるので、広域宿主範囲のウイルスは、種特異性を損失せずに、抗菌剤の産生を促進する。例えば、λバクテリオファージは、リボザイムおよび/または毒性剤、プラスミド複製起点、プラスミド維持のための選択マーカー、最小λ複製起点およびDNAをλビリオンにパッケージングするのに必要な、cos部位を保有するプラスミドを使用する。このプラスミドは、組み込み/切断および組換え機能が欠損しているλ溶菌ファージに維持される。欠損溶菌ファージは、プラスミド上でλ複製起点を活性化するのに必要な全ての複製因子および成熟ビリオンを形成するのに必要な全ての構造的構成要素を提供するが、溶菌ファージは、複製して、自身のDNAをビリオンにパッケージングすることができない。溶菌ファージは温度感受性リプレッサー突然変異(cI857など)を保有していてもよい。
【0119】
他のウイルスベクター
レトロウイルスベクターも、インビボおよびエクスビボの両方において遺伝子を宿主細胞に送達するために通常使用される。レトロウイルスベクターは、細胞に入るとき、検出可能な害を生じない極めて効率的な遺伝子送達媒体である。レトロウイルスの核酸は宿主染色体DNAに組み込むことができるので、長期間持続され、子孫に安定して伝播され、このようなベクターは、慢性疾患もしくは遺伝的疾患に関与する細胞遺伝子産物を標的とする、または慢性感染症もしくは持続感染症に関与するウイルス遺伝子もしくは微生物遺伝子または寄生虫遺伝子を標的とするために使用される毒性剤および/またはリボザイムを送達するのに有用であると思われる。適当なレトロウイルスベクターの例は、非分裂細胞に感染し、形質導入するという利点を有するレンチウイルスである。このような態様では、レトロウイルスの機能的補助遺伝子全てが欠損しているプロモーターに機能的に結合したパッケージングRNAベクターゲノムをコードするレンチウイルスベクターを使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードするDNAを移入する。このようなベクターの例は、その各々が参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、国際公開公報第98/17815号、国際公開公報第98/17816号および国際公開公報第98/17817号に記載されている。
【0120】
よりさらに別の態様において、アデノウイルスベクターなどの、非分裂細胞に感染して、形質導入する非組み込みウイルスベクターを使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを送達することができる。アデノウイルスベクターを使用すると、宿主細胞ゲノムの永久的な変更、または 挿入突然変異の促進に関連したリスクが回避されるので、アデノウイルスベクターは、いくつかの利点を有する。アデノウイルスは、開発された中で最良の非組み込み型ウイルスベクターの1つで、75 kb以下の発現カセットを導入するために使用することができる。組換えアデノウイルスは非常に高い力価で作製することができ、感染性が高く、多種多様の非複製細胞および複製細胞に遺伝子を効率的に導入し、インビボにおける哺乳類の遺伝子導入に理想的である。
【0121】
アデノウイルス系ベクターは比較的安全で、望ましい毒性剤および/またはリボザイムをコードするように操作することができると同時に、通常のウイルスの生活周期において複製する能力に関しては不活性化することができる。アデノウイルスは気道上皮に天然の親和性を有する。従って、アデノウイルス系ベクターは、呼吸器遺伝子治療適用に特に好ましい。特定の態様において、アデノウイルス系遺伝子治療ベクターはアデノウイルスの2つのセロタイプのゲノムを含み、ウイルス複製の早期段階に関与する、ElaおよびElbのゲノムは、関心のあるヌクレオチド配列が欠損および置換されている。さらに別の態様において、アデノウイルス系遺伝子治療ベクターは、アデノウイルス早期領域(E4)の必須オープンリーディングフレーム(ORF3またはORF6)だけを含有し、他のE4オープンリーディングフレームは全て欠損しているか、またはE3領域の欠損をさらに含むこともある(例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第5,670,488号参照)。別の態様において、使用されるアデノウイルス系治療ベクターは、有害なウイルス遺伝子を含有せず、約36 kbの外来遺伝材料の理論的容量を有する、シュード−アデノウイルス(pseudo−adenovirus(PAV))であってもよい。
【0122】
別の態様において、アデノ関連ウイルス(AVV)系を使用して、本発明の毒性剤および/またはリボザイムを送達することができる。AAVは広域宿主範囲を有し、ヘルパーウイルスを必要としないAAVベクターが現在設計されている。このようなベクターの例は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、国際公開公報第97/17458号に記載されている。
【0123】
大きい断片のDNAが容易にゲノムにクローニングされ、組換え弱毒化ワクシニア変種が記載されいてるので(Meyerら、1991、J. Gen. Virol. 72: 1031−1038)、ワクシニアウイルスベクターを本発明により使用することができる。インフルエンザを含むオルソミクソウイルス(Orthomyxovirus);呼吸器発疹ウイルスおよびセンダイウイルス(Sendai virus)を含むパラミクソウイルス(Paramyxovirus);ならびにラブドウイルス(Rhabdovirus)は、弱毒化表現型を生ずる突然変異を発現するように操作することができる(1996年11月26日に付与された、米国出願番号第5,578,473号参照)。これらのウイルスゲノムはまた、本発明の選択された毒性剤および/またはリボザイムなどの外来ヌクレオチド配列を発現するように操作することができる(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、1992年11月24日に付与された米国出願番号第5,166,057号参照)。インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルス、シンドビスウイルスおよびポリオウイルスにおいて証明されているように(Paleseら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11354−11358)、弱毒化表現型を生ずる突然変異を導入するように、負鎖および正鎖RNAウイルスゲノムを操作するために逆遺伝子技法を適用することができる。これらの技法はまた、本発明により使用される組換えウイルスベクターを作製するための、外来DNA、すなわち、選択された毒性剤および/またはリボザイムを導入するために使用することができる。また、毒性剤および/またはリボザイムを発現するために、弱毒化されたアデノウイルスおよびレトロウイルスを操作することができる。従って、本発明のリボザイム送達媒体を設計するために、多種多様のウイルスを操作することができる。
【0124】
毒性剤および/またはリボザイムを組織特異的に発現するために、本発明のウイルスベクターを操作することができる。例えば、癌胎児性抗原(LEA)のプロモーターは乳癌、肺癌および結腸直腸癌に平行して発現されるが、健康な組織ではほとんど発現されない。肝癌を標的とするためには、α−フェトプロテイン(AFP)プロモーターの活性は悪性細胞に限定されている。増殖中の細胞は、増殖中の内皮細胞を優先的に標的にできることが示されているflt−1プロモーターで標的とすることができる。参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Millerら、1997、Human Gene Therapy 8: 803−815を参照。
【0125】
5.3.2. 非生物送達媒体
1つ以上の毒性剤および/またはリボザイムの非生物送達は、毒性剤および/またはリボザイムをリポソームにコーティングする遺伝子を保有するパッケージングプラスミドDNAを含む種々の方法によって、または毒性剤および/またはリボザイムをコードする遺伝子を保有するプラスミドDNAと脂質またはリポソームとを複合体として、DNA−脂質またはDNA−リポソーム複合体を形成することによって実施される。リポソームは、インビトロにおいて細胞をトランスフェクトするために通常使用される陽イオンおよび中性脂質を含む。陽イオン脂質はプラスミドDNAと複合体を形成して、リポソームを形成する。
【0126】
a)5’側自己触媒的切断リボザイム配列、b)標的RNA特異的結合部位を含む触媒リボザイム、およびc)3’側自己触媒的切断リボザイム配列、を含むトランス作用性リボザイムをコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む核酸が含まれているリポソームを提供する。
【0127】
1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターをコードする核酸を含むリポソームが提供される。
【0128】
核酸が、2つ以上のトランス作用性リボザイムおよび/または2つ以上の毒性剤をコードする、本発明のリポソームを提供する。リポソームは、任意のリボザイムをコードする核酸または任意の毒性剤をコードする核酸、特に本明細書に記載されているものを含んでいてもよい。このような核酸は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターに機能的に結合することができる。
【0129】
本発明のリポソーム送達系は、a)5’側自己触媒的切断リボザイム配列、b)標的RNA特異的結合部位を含む触媒リボザイム、およびc)3’側自己触媒的切断リボザイム配列、を含むマルチリボザイムをコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む核酸を送達するために使用することができる。
【0130】
本発明のリポソーム送達系は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む核酸を送達するために、使用することができる。本発明のリポソーム送達系は、1つ以上の毒性剤をコードする配列に機能的に結合した病原菌特異的プロモーターを含む核酸を送達するために、使用することができる。
【0131】
陽イオンおよび中性リポソームは本発明によって考慮されている。陽イオンリポソームは、これらの成分を混合し、それらを荷電により結合させることによって、負に荷電した生物活性分子(例えば、DNA)と複合体を形成することができる。陽イオンリポソームは、生物活性分子が核酸である場合には、核酸の負荷電のために特に有用である。陽イオンリポソームの例には、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクテース(lipofectace)およびDOTAP(Hawley−Nelsonら、1992、Focus 15(3): 73−83; Felgnerら、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413; Stewartら、1992、Human Gene Therapy 3: 267−275)が挙げられる。物質を入れた陽イオンリポソームを形成する手法は当技術上標準的で(Nicolauら、1987、Methods Enzymol. 149: 157)、本発明の複合体を入れるために、当業者によって容易に使用することができる。
【0132】
本発明のよりさらに別の態様において、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする遺伝子を保有するプラスミドDNAは、全身送達および遺伝子発現を増加するために改善された方法を使用してリポソームと複合体を形成する(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Templetonら、1997、Nature Biotechnology 15: 647−652)。本発明によると、陽イオン脂質の改善された製剤は、インビボにおける長い半減期と特定の組織をインビボにおいて標的とする手法を用いて、宿主細胞へのDNA送達効率を大幅に増加する。例えば、これらに限定されないが、肝臓等への送達が実質的に増大される、肝臓特異的タンパク質などの外側の脂質二重膜にペプチドおよびタンパク質を操作することができる。
【0133】
本発明の一態様において、全身送達ならびにインビボおよびエクスビボにおける遺伝子送達は、市販の陽イオン脂質、例えば、ジメチルジジオクタデクルアンモニウムブロミド(dimethyldioctadeclammonium bromide)(SSAB)、生物分解性脂質1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)を使用して最適化される。これらのリポソームは中性脂質、例えば、全身送達のために通常使用される2つの中性脂質であるL−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)またはコレステロール(Chol)と混合することができる。DNA:リポソーム比は、当業者によって使用される方法を使用して最適化することができる(例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Templetonら、1997、Nature Biotechnology 15: 647−152)。
【0134】
本発明のさらに別の態様において、本発明の毒性剤および/またはリボザイムをコードする核酸を保有するプラスミドDNAは、複数の正荷電を保有し、インビボおよびエクスビボにおいて遺伝子導入を実施するために使用される分子である、ポリ陽イオンにより送達することができる。ポリエチレンイミン(polyethilenimine)などのポリ陽イオンは、インビボおよびエクスビボにおいて遺伝子導入を成功させるために使用することができる(例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Bolettaら、1996、J. Am. Soc. Nephrol. 7: 1728)。
【0135】
リポソームは、局所適用用軟膏に組み入れられても、膿瘍に注射することができる溶液などの他の形態で送達されても、または全身送達されても、またはエアゾールによって送達されてもよい。
【0136】
以下の理由により、リボザイムまたは毒性剤で実施するのではなく、リボザイムまたは毒性剤をコードするプラスミドDNAが使用される。プラスミドDNAにより標的細胞は毒性剤またはリボザイムを産生することができ、従ってリポソームによりリボザイムRNAまたは毒性剤を送達することによって期待されるより、細胞への送達量が大量になる。DNAはまた、標的配列特異性に基づいた作用の特異性を提供する。リポソームは、宿主の細胞を含む、投与領域の任意の細胞にDNAを送達する。毒性剤またはリボザイムの転写を駆動するプロモーターは標的とされた微生物に特異的であるので、他の細胞種では不活性である。従って、毒性剤またはリボザイムをコードするDNAのリポソーム送達は増殖および特性を提供する。本発明は、病原菌特異的または組織特異的であるプロモーターエレメントに関する。このようなプロモーターエレメントは、本発明の毒性剤および/またはリボザイムの病原菌特異的または組織特異的発現を達成するために使用される。本発明はまた、複製の特異性または細胞もしくは病原菌におけるベクターもしくはプラスミドのコピー数を調節する複製起点の使用に関する。
【0137】
5.3.2.1. マルチリボザイムを使用した送達および発現
本発明の別の態様において、毒性剤の発現は、組織特異的、病原菌特異的および/または標的特異的リボザイムまたはリボザイムカセットによって駆動される。本発明は、触媒作用において標的RNA特異的であり、発現において組織特異的または病原菌特異的である独自の特徴を有するリボザイムを提供する。リボザイムは、組織特異的疾患を治療する場合には組織特異的であってもよく、または大腸菌などの病原菌を治療する場合には、病原菌特異的であってもよい。マルチリボザイムは1つ以上の標的特異的リボザイム(例えば、トランス作用性触媒リボザイム)ならびに組織特異的または病原菌特異的発現を制御するエレメントを有することができる。
【0138】
一態様において、本発明の核酸は、a)5’側自己触媒的切断リボザイム配列、b)標的RNA特異的結合部位を含む触媒リボザイムおよびc)3’側自己触媒的切断リボザイム配列、をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。
【0139】
リボザイム産生構築物における組織特異的プロモーターにより、選択されたプロモーターからRNAに活発に転写する組織においてリボザイムが組織特異的に発現される。従って、このプロモーターを使用する組織の標的RNAだけがこのリボザイムによって切断される。
【0140】
さらに、本発明によると、マルチリボザイムは1つ以上のリボザイムカセットからなってもよい。各カセットは触媒中心および1つ以上の隣接配列からなっていてもよい。一態様において、リボザイムカセットは、5’側自己触媒的切断リボザイム配列、トランス作用性リボザイムを含むコア触媒リボザイムおよび3’側自己触媒的切断リボザイムからなっていてもよい。よりさらに別の態様において、触媒中心は1つ以上の毒性剤をコードする配列を含有する。一態様において、マルチリボザイムは、増強された5’側および3’側自己触媒的切断リボザイム配列を含むカセットを含む。別の態様において、マルチリボザイムは1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有する。好ましい態様において、本発明のマルチリボザイムは、トリプルリボザイムカセットを含むが、これらに限定されない。別の態様において、マルチリボザイムは、互いに結合した1つ以上のトリプルリボザイムカセットを含むが、これらに限定されない。さらに別の態様において、マルチリボザイムは1つ以上の内部トランス作用性リボザイムを含有するリボザイムカセットを含む。別の態様において、マルチリボザイムは、1つ以上の内部トランス作用性リボザイムまたはそれらの任意の組み合わせを含有する一連の1つ以上のリボザイムカセットを含む。さらに別の態様において、マルチリボザイムまたは毒性剤は、組織特異的または病原菌特異的に発現される。本発明の好ましい態様において、病原菌特異的発現を病原菌特異的プロモーターに結合する。
【0141】
5.4. プロモーターの選択
プロモーターの選択は、当技術上利用可能な技法を使用して実施される。本明細書において使用される、調節エレメントは、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターならびに発現を駆動および調節する当業者に周知の他のエレメントを含むが、これらに限定されない。詳細には、本発明は、転写制御が高く、発現レベルが高い誘導プロモーターを提供する。プロモーターは、標的とされる微生物の天然型で、強い、中程度または弱い構成的発現プロモーターまたは調節プロモーターであってもよく、または望ましいレベルの毒性剤および/またはリボザイム発現を送達する、強い、中程度または弱いコンセンサス配列を含有する人工的に考案された構成的発現プロモーターまたは調節プロモーターであってもよい。
【0142】
問題の標的(例えば、特定の病原菌、属)に特異的なプロモーターは、プロモーターのないリポーター遺伝子を活性化する能力について、ゲノム配列をスクリーニングすることによって選択することができる。プロモーターのないリポーター遺伝子は、プラスミドpMC1871を用いて使用するために開発された方法に基づいている(Casadabanら、1983、Meth. Enzymol. 100: 293)。非ウイルス病原菌では、微生物代役(understudy)において安定に複製および維持することができるプラスミドは、リポーター遺伝子のコード領域を保有するように、標準的な分子生物技法によって改変される(Sambrookら、最新版)。リポーター遺伝子は、β−ラクタマーゼをコードするする大腸菌のlacZ遺伝子を含むが、これらに限定されない数多くの標準的なリポーター遺伝子のいずれかであってもよい。総ゲノムDNAが病原菌細胞から単離され、制限エンドヌクレアーゼで切断して、平均数百塩基対の断片を生ずる。次いで、これらの断片を、リポーター遺伝子コード領域の5’末端の独自の制限エンドヌクレアーゼ切断部位にライゲーションして、プラスミドのライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーを標準的な技法によって病原菌に形質転換し、得られた形質転換体をリポーター遺伝子の発現についてスクリーニングする。lacZの場合には、発色ガラクトシダーゼ基質X−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−D−ガラクトシド)を含有する培地で形質転換体を培養することができる。プロモーターを保有する挿入物を有するプラスミドを含有する形質転換体はβ−ガラクトシダーゼを発現し、X−Gal平板培地で青色になる。青色の強度は発現レベルに関係があり、強度の異なるプロモーターを、青色の強度に基づいて選択することができる。
【0143】
上記スクリーニング手法は調節プロモーターを同定するために改良することができる。例えば、炭素源の利用性によって調節されるプロモーターは、異なる炭素源を含有する培地でスクリーニングすることができる。他の改良も可能であり、一部には、問題の生物に依存している。種特異性を試験するためには、同定されたプロモーターを、異なる生物において複製および維持することができるプロモーターのないリポータープラスミドに導入する。種特異的または病原菌特異的プロモーターは、実際には、いかなる他の種においてもリポーターを活性化しない。プロモーターのないリポータープラスミドに挿入された合成オリゴヌクレオチドを含む人工的プロモーターを同定し、試験するために、明らかな改良を用いてもよい。
【0144】
一態様において、本発明の核酸は5’側自己触媒的切断リボザイム配列、1つ以上の触媒標的特異的トランス作用性リボザイムまたは1つ以上の毒性剤および3’側自己触媒的切断リボザイム配列、をコードする配列に機能的に結合した組織特異的プロモーターを含む。
【0145】
リボザイム産生構築物の組織特異的プロモーターは、選択されたプロモーターからRNAを活発に転写する組織においてリボザイムが組織特異的に発現される。従って、プロモーターを使用する組織の標的RNAだけがリボザイムによって切断される。リボザイム産生構築物における病原菌特異的プロモーター結合部位は、選択されたプロモーターからRNAを活発に転写する病原菌または微生物においてリボザイムが病原菌特異的に発現される。従って、プロモーターを使用する病原菌の標的RNAだけがリボザイムによって切断される。
【0146】
組織特異的プロモーターは本発明の核酸構築物において使用することができる。これらのプロモーターの例は、プロバシンプロモーター、プロモーター前立腺上皮前立腺特異的抗原に特異的(前立腺)、ケラチン、k7(表皮皮脂腺)、アルブミン(肝臓)、脂肪酸結合タンパク質(回腸)、乳漿酸性タンパク質(乳房)、ラクトアルブミン、平滑筋アクチン(平滑筋)等の配列を含む。特定の態様において、GenBank(商標)アクセッション番号U04199の338〜668位のヌクレオチド、続く配列
、続くアクセッション番号J04738の1762〜1846位のヌクレオチド、続くヌクレオチド配列
、続くアクセッション番号J04738の1864〜2063位のヌクレオチドからなる、マウスアルブミンプロモーター/エンハンサーが使用される。一態様において、マウスプロモーター/エンハンサーは肝細胞(例えば、ヒト肝細胞、肝細胞培養物等)において活性であり、肝臓組織における組織特異的発現に有用である。同定されていない組織特異的プロモーターを、選択された組織に本発明のリボザイムの発現を標的とするために使用することができることも明らかである。標的特異的プロモーターが同定されたら、使用することができる配列分析などの通常の方法によって結合配列を決定することができる。プロモーターは、欠損分析、突然変異性、フットプリント法、ゲルシフトおよびトランスフェクション分析によって規定される(Sambrookら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1988)。病原菌特異的プロモーターを本発明の核酸構築物に使用することができる。
【0147】
5.4.1 細菌特異的プロモーター/発現
本発明は、転写および増大された発現の厳重な調節を可能にする細菌プロモーターを提供する。一態様において、LEASHIと呼ばれる新規プロモーターが3つのエレメントから構築されている(図1参照)。RIPと名づけられた第1のエレメントは、転写開始位置に対して−10(TATAAT)と−35(TTGACA)の2つのコンセンサスの組み合わせである。第2のエレメントは、−10と−35コンセンサス部位の間に配置された(lacオペレーター配列と名づけられた)lacIリプレッサー結合配列に基づいている。これは、lacオペレーターが−10コンセンサスエレメントの下流に見られる従来のlacおよびtacプロモーターと異なる。−10と−35部位の間にlacオペレーターを配置すると、プロモーターへのRNAポリメラーゼの結合をより効果的に遮断し、それによってプロモーターからの転写制御を増強する。従って、オペレーター配列に結合し、転写速度を決定する、存在するlacIリプレッサータンパク質のレベルは2つの方法で制御される;1)内因的に発現されるlacIタンパク質による方法、および2)lacI遺伝子を発現するプラスミドによる方法。通常の条件下では、lacIリプレッサータンパク質はlacオペレーター配列に結合し、RNAポリメラーゼ結合を遮断することによって転写を抑制する。イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドはリプレッサータンパク質に結合し、その後滴定するが、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドを付加することにより、プロモーターが「スイッチ オン」される。次いで、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合して、転写を進行させることができる。
【0148】
LEASHIプロモーターの第3のエレメントはUPエレメントと名づけられる。UPエレメントは、−35エレメントのすぐ上流に配置される高アデニン/チミン配列である。UPエレメントが付加されると、このプロモーターからの発現がさらに増加する。従って、本発明は、本発明の毒性剤を発現するLEASHIプロモーターの用途を提供する。
【0149】
本発明の特定の態様において、毒性剤またはリボザイムをコードする核酸に機能的に結合するプロモーターはLEASHIプロモーターである。
【0150】
特定の態様において、本発明のリボザイムはLEASHIプロモーターに機能的に結合する。本発明の別の特定の態様において、本発明の毒性剤はLEASHIプロモーターに機能的に結合する。
【0151】
特定の態様において、本発明は、LEASHIプロモーターなどの調節プロモーターの制御下においてリボザイムカセットからのDicF1の発現を含む。
【0152】
本発明の別の態様において、LEASHIプロモーターのlacIオペレーター配列は、−35コンセンサス部位の5’側に配置される。本発明の別の態様において、LEASHIプロモーターのlacIオペレーター配列は−10コンセンサス部位の3’側に配置される。本発明の他の態様において、1つ以上の追加のlacオペレーター配列をLEASHIプロモーターに加えて、−35コンセンサス部位の5’側および/または−10コンセンサス部位の3’側に配置する。
【0153】
他の特定の態様において、本発明は、anr、arcまたはproCプロモーターの用途を提供する。共に大腸菌において転写がオフで、緑膿菌においてオンである。これらのプロモーターは、病原菌(シュードモナス)において毒性剤の制御された発現を可能にするが、毒性剤治療薬の毒性作用からはパッケージング株(大腸菌)が保護されるという利点を提供する。このようなプロモーターはまた、患者への遺伝子治療薬の細菌特異的標的を可能にする。特定の態様において、anrプロモーターは、(doc、gef、chpBKまたはkicB等などの)毒性剤をコードする配列に機能的に結合し、例えば、シュードモナスを根絶するために使用することができる。
【0154】
他の特定の態様において、本発明はTSST−1プロモーターの用途を提供する。TSST−1は、環境的に調節されたブドウ球菌特異的プロモーターである。TSST−1は、docまたは他の毒性剤を発現するのに有用である。黄色ブドウ球菌株に伝達プラスミドを送達することができるブドウ球菌特異的ファージは、ブドウ球菌病原菌を特異的に標的とするのに使用される。
【0155】
他の典型的な細菌誘導プロモーターは、転写を厳重に制御できないことが知られており、大きいレベルのバックグラウンド発現が特徴的に観察される。本発明のプロモーターの大きな利点は、誘導プロモーターに一般に観察される高いレベルのバックグラウンドを軽減することである。関心のあるプロモーターが高コピー数プラスミド上にある場合に、高いバックグラウンドレベルの転写を生ずる制限因子は、プロモーターに結合するために利用可能なリプレッサー分子がないことによる。本発明は、lacI発現プラスミドを使用することによって、第2に、通常の条件下において転写を効果的に遮断する−35と−10コンセンサスエレメントの間にlacオペレーターを配置することによって、この問題を克服している。さらに、−35領域のすぐ上流にUPエレメントが配置されると、コアプロモーターからの転写が増強される。
【0156】
本発明はまたrrnBプロモーターに関する。本発明の一態様において、プロモーターは、1つ以上のlacIオペレーター部位がプロモーターに加えられるように改良されたrrnBプロモーターである。このような改変されたrrnBプロモーターの一例を図1Bに示す。本発明の別の態様において、rrnBプロモーターのlacIオペレーター配列は−10コンセンサス部位の3’側に配置される。本発明の他の態様において、1つ以上の追加のlacIオペレーター配列がrrnBプロモーターに加えられ、−35コンセンサス部位の5’側および/または−10コンセンサス部位の3’側に配置される。
【0157】
5.5. 宿主細胞
本発明は、インビトロスクリーニングアッセイ放およびエクスビボ遺伝子治療のための、初代細胞、動物、昆虫、真菌、細菌および酵母細胞における毒性剤および/またはリボザイムの発現を含む。本発明はまた、インビトロスクリーニングアッセイ放およびエクスビボ遺伝子治療のための、細胞系統における毒性剤および/またはリボザイムの発現を含む。本発明によると、少数を挙げると、皮膚、骨髄、肝臓、膵臓、腎臓、副腎および神経組織から単離された細胞を含むが、これらに限定されない種々の一次または二次細胞または細胞株を使用することができる。本発明により使用することができる他の細胞種は、免疫細胞(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞等など)、マクロファージ/単球、脂肪細胞、周細胞、線維芽細胞、神経細胞、細網細胞等である。さらに別の態様において、CWSV、NR、チャン肝細胞などの肝細胞系統またはCHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、373、HUVEC、CaSkiおよびW138細胞系統などの他の細胞系統を含むが、これらに限定されない二次細胞系統を本発明により操作された応答細胞および組織として使用することができる。本発明の毒性剤またはリボザイムは、毒性剤またはリボザイムの影響に感受性でない任意の細胞系統(例えば、特定の毒性剤またはリボザイムに抵抗性の細胞、または中和剤または解毒剤を同時発現する細胞)においても発現することができる。
【0158】
組換えタンパク質の長期高収率の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、選択された毒性剤および/またはリボザイムを安定に発現する細胞系統を操作することができる。毒性剤が安定に発現されるとき、発現は誘導プロモーターによって制御されても、または毒性剤の産生中に細胞が生存できるように、毒性剤に対する解毒剤を同時発現するように操作されてもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞を適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)および選択マーカーによって制御されたDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作された細胞を栄養強化培地で1〜2日間増殖させることができ、次いで選択培地に移される。組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択に対して抵抗性を示し、細胞を増殖させて細胞増殖巣を形成し、細胞系統にクローニングし、増殖することができる。本発明の方法は、有利なことに、細胞系統を操作するために使用することができる。本発明の方法は、有利なことに、選択された遺伝子産物を発現する細胞系統を操作するために使用することができる。このような細胞系統は、選択された遺伝子産物の内因的活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であると思われる。
【0159】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977、Cell 11: 223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybaska & Szybalski、1962、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lpwryら、1980、Cell 22:817)遺伝子を含むが、これらに限定されない数多くの選択系を、それぞれtk−、hgprt−またはaprt−細胞において使用することができる。また、抗代謝抵抗性を、以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる:メトトレキセート抵抗性を与えるdhfr(Wiglerら、1980、Natl, Acad. Sci. USA 77: 3567; O’Hareら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527)、ミコフェノール酸抵抗性を与えるgpt(Mulligan & Berg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072)、アミノグリコシドG−418抵抗性を与えるneo(Colberre−Garapinら、1981、J. Mol. Biol. 150: 1)およびヒグロマイシン抵抗性を与えるhygro(Santerreら、1984、Gene 30: 147)。
【0160】
5.6. 標的
本発明は、任意の既知の分類である科、属または種由来の任意の細胞、ウイルス、細菌、真菌または他の単細胞もしくは多細胞生物を標的とする毒性剤またはトランス作用性リボザイムを提供する。本発明の別の態様は、細菌、真菌、酵母などの病原菌、異常細胞に致死的または毒性である毒性剤を提供する。このような毒性剤は、本発明の方法によって病原菌に送達することができる。微生物は、任意のウイルス、非ウイルス、微生物または真菌、酵母、寄生虫、原生動物などの下等真核細胞またはヒト、動物、魚、植物もしくは他の生命形態の病原菌であると考えられることができる他の真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載されている抗菌リボザイム治療薬の標的は、侵入性または通常の微生物叢の微生物のRNAである。他の態様において、本明細書に記載されている抗菌毒性剤治療薬の標的は、侵入性および通常の微生物叢の微生物のRNA、タンパク質、遺伝子および他の分子を含む。従って、本発明は、ヒトおよび獣医医学に重要な関係がある。
【0161】
本発明の毒性剤は、寄生虫の成長、細菌、ウイルスの生活周期等に必要な必須の遺伝子、遺伝産物または過程を標的とするように操作することができ、発現は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターで駆動させることができる。本発明の毒性剤またはトランス作用性触媒リボザイムは、多種多様の細胞RNA、腫瘍または癌関連RNA、細菌RNA、寄生虫RNA等を標的とするように操作することができる。例えば、リボザイム標的部位を本明細書において表11、13および13に示す。毒性剤またはトランス作用性リボザイムは、寄生虫の成長、細菌、ウイルスの生活周期等に必要な非細胞性RNAを標的とすることができ、発現は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターで駆動させることができる。
【0162】
本発明の方法に使用されるビリオン構築物は、毒性剤またはリボザイム、特に病原菌または異常細胞の必須遺伝子を標的とするために本明細書において記載されているものをコードする任意の核酸を含んでもよい。ビリオンは、バクテリオファージまたは特定の細胞種、微生物または動物を標的とする能力について選択される他のウイルスであってもよい。バクテリオファージはλ、P1、Phi−11または他のファージであってもよい。P1がビリオンである場合には、伝達プラスミドは、PAC部位およびPAC ACB遺伝子をさらに含んでもよい。この構築物は、P1を使用する場合に好ましい。または、ビリオンは広域標的を有するので、選択することができる。
【0163】
本出願において特に示される重要な例は以下のようである:
A) doc、gef、chpBK、kicBまたはDicF1などの毒性剤を発現させるための、LEASHIプロモーターと(大腸菌などの)細菌標的との使用、
B) SofセンスRNAを含む毒性剤を発現させるための、LEASHIプロモーターと大腸菌などの)細菌標的との使用、
C) doc、gef、chpBK、kicBまたはDicF1などの毒性剤を発現させるための、anr、arcまたはproCプロモーターと(緑膿菌などの)シュードモナス標的との使用、
D) doc、gef、chpBK、kicB、DicF1、pemK、hok、relF、sigBまたはリソスタフィンなどの毒性剤を発現させるための、TSST−1、hlaまたはSrcBプロモーターと(黄色ブドウ球菌などの)ブドウ球菌標的との使用、
E) アルブミンプロモーターと、(同一リボザイム標的部位を使用して、ウイルスRNAプレゲノム、Sタンパク質およびポリメラーゼ/およびxタンパク質転写物を切断するために選択される)B型肝炎ウイルス標的との使用、
F) アルブミンとプロモーターと、(B型肝炎およびC型肝炎ウイルスのトランス作用性リボザイム標的部位を使用した)B型肝炎およびC型肝炎ウイルス標的との使用、
G) マラリアの細胞接着および抗原性変種に必要な熱帯マラリア原虫(P. falciparum)由来のEMP−1タンパク質ファミリーの高度に保存された領域を標的とするリボザイムを使用した、赤血球において活性な一般的なプロモーターの使用、および
H) ケラチン7プロモーターと、E6タンパク質の翻訳開始部位近傍の特定の部位、子宮頚部癌に密接に関係するE6およびE7タンパク質の発現に重要であることが知られている部位、ならびにE6タンパク質の高度に保存されている領域の3’側に近い部位を標的とするトランス作用性リボザイムとの使用。
【0164】
本発明の毒性剤またはトランス作用性リボザイムによって標的とすることができる病原性細菌の例は、以下の属の種、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、クラミジア(Chlamydia)、ヘリコバクター(Helicobacter)、エルシニア(Yersinia)、ボルデテラ(Bordatella)、シュードモナス(Pseudomonas)、ナイセリア(Neisseria)、ビブロ(Vibro)、ヘモフィルス(Haemophilus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、トレポネーマ(Treponema)、コクシエラ(Coxiella)、エシェリキア(Escherichia)、ブルセラ(Brucella)、ストレプトバシラス(Streptobacillus)、フソスパイロキータ(Fusospirocheta)、スピリルム(Spirillum)、ウレアプラズマ(Ureaplasma)、スパイロキーt(Spirochaeta)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、アクチノマイセス(Actinomyces)、ボレリア(Borrelia)、バクテロイデス(Bacteroides)、トリコモラス(Trichomoras)、ブランハメラ(Branhamella)、パストレラ(Pasteurella)、クロストリジウム(Clostridium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、リステリア(Listeria)、バシラス(Bacillus)、エリジペロスリックス(Erysipelothrix)、ロドコックス(Rhodococcus)、エシェリキア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、シュードモナス(Pseudomonas)、エンテロバクター(Enterobacter)、セラチア(Serratia)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、レジオネラ(Legionella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、プロテウス(Proteus)、カンピロバクター(Campylobacter)、腸球菌(Enterococcus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、モルガネラ(Morganella)、モラクセラ(Moraxella)、シトロバクター(Citribacter)、リケッチア(Rikettsia)、ロシャリメア(Rochlimae)ならびに緑膿菌(P. aeruginosa)、大腸菌(E. coli)、P.セパシア(P. cepacia)、S.エピデルミス(S. epidermis)、E.フェーカリス(E. faecalis)、S.ニューモニア(S. pneumonias)、S.キシローサス(S. xylosus)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、髄膜炎菌(N. meningitidis)、S.ピオゲネス(S. pyogenes)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)およびP.ミラビリス(P. mirabilis)などの細菌種を含むが、これらに限定されない。
【0165】
本発明の病原菌は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans);ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis);アジェロミセス・デルマチチジス(Aiellomyces dermatitidis);ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum);コクスディオイデス・イミチス(Coccidioides immitis);C.アルビカンス(C. albicans)、C.トロピカリス(C. tropicalis)、C.パラプシロシス(C. parapsilosis)、C.ギリエルモンディ(C. guilliermondii)およびC.クルセイ(C. krusei)を含むカンジダ(Candida)種;A.フミガーツス(A. fumigatus)、A.フラーブス(A. flavus)およびA.ニガー(A. niger)を含むアスペルギルス(Aspergillus)種;リゾープス(Rhizopus)種;リゾムコール(Rhizomucor)種;クンニングアメラ(Cunninghamella)種;A.サクセネア(A. saksenaea)、A.ムコール(A. mucor)およびA.アブシジア(A. absidia)を含むアポフィソミセス(Apophysomyces)種;スポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix shenckii);パラコクシディオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis);シュードアレシェリア・ボイジ(Pseudallescheria boydii);トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata);トリコフィトン(Trichophyton)種;ミクロスポルム(Microsporum)種ならびにデルマトフィルス(Dermatophyres)種、同様に病原菌であると現在知られているまたは後に同定される、いかなるの他の酵母または真菌も含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【0166】
さらに、本発明の病原菌は、例えば、バベシア(Babesia)、トキソプラズマ(Toxoplasma)、プラズモディウム(Plasmodium)、アイメリア(Eimeria)、イソスポラ(Isospora)、アトキソプラズマ(Atoxoplasma)、シストイソスポラ(Cystoisospora)、ハモンディア(Hammondia)、ベスノイチア(Besnoitia)、肉胞子虫属(Sarcocystis)、フレンケリア(Frenkelia)、ヘモプロテウス(Haemoproteus)、ロイコシトゾーン(Leucocytozoon)、タイレリア(Theileria)、ペルキンスス(Perkinsus)およびグレガリナ種(Gregarina spp.)などのアピコンプレクサ門(Apicomplexa phylum)のメンバー;ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii);例えば、ノセマ(Nosema)、エンテロシトゾーン(Enterocytozoon)、エンセファリトゾーン(Encephalitozoon)、セプタタ(Septata)、メラゼキア(Mrazekia)、アムブリオスポラ(Amblyospora)、アメソン(Ameson)、グルゲア(Glugea)、プリストフォーラ(Pleistophora)およびミクロスポリジウム種(Microsporidium spp.)などのミクロスポラ門(Microspora phylum)のメンバー;ならびに例えば、ハプロスポリジウム種(Haplosporidium spp.)などのアセトスポラ門(Ascetospora phylum)のメンバー、同様に熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malaria)を含む種;トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii);メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana)、熱帯リーシュマニア(L. tropica)、大形リーシュマニア(L. major)、エチオピアリーシュマニア(L. aethiopica)、ドノバンリーシュマニア(L. donovani)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、トリパノソーマ・ブルーセイ(T. brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ビルハルツ住血吸虫(S. haemoatobium)、日本住血吸虫(S. japonium);旋毛虫(Trichinella spiralis);バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti);マレー糸状虫(Brugia malayi);赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);蟯虫(Enterobius vermiculoarus); カギサナダ(Taeniasolium)、カギナシサナダ(T. sanginata)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginatis)、腸トリコモナス(T.hominis)、口腔トリコモナス(T.tenax)、ランブルべん毛虫(Giardia lamblia); クリプトスポリジウム・パルヴム(Cryptosporidium parvum);ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carnii)、バベシア・ボービス(Babesia bovis)、B.ディバージエンス(B. divergens)、B.ミクロチ(B. microti)、イソスポラ・ベリ(Isospora belli)、L.ホミニス(L. hominis);2核アメーバ(Dientamoeba fragilis);回旋糸状虫(Onchocerca volvulus);回虫(Ascaris lumbricoides);アメリカ鉤虫(Necator americanis);十二指腸虫(Ancylostoma duodenale);糞線虫(Strongyloides stercoralis);フィリピン毛頭虫(Canpillaria philippinensis);広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis);小形条虫(Hymenolepiasis nana);ミゾサナダ(Diphyllobothrium latum);単包包虫(Echinococcus granulosus)、多包条虫(E. multicularis);ウェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、P.カリエンシス(P. caliensis);肝吸虫(Clonorchis sinensis);ネコ肝吸虫(Opisthorchis felineas)、G.ビベリニ(G. Viverini)、肝蛭(Fasciola hepatica)、ヒゼンダニ(Sarcoptes scabiei)、ヒトジラミ(Pediculus humanus);恥毛ジラミ(phthirius pubis);およびヒトヒフバエ(Dermatobia hominis)ならびに病原性であることが現在知られているまたは後に同定される、いかなる他の寄生虫を含むが、これらに限定されない寄生虫であってもよい。
【0167】
ウイルス病原菌の例は、レトロウイルス(ヒト免疫不全ウイルス)、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、帯状疱疹ウイルス)、オルソミクソウイルス(インフルエンザ)、パラミクソウイルス(はしかウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸系発疹ウイルス)、ピコナウイルス(コクサッキーウイルス、ライノウイルス)、肝炎ウイルス(C型肝炎)、ブンヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、アレナウイルス(ラッサ熱ウイルス)、フラビウイルス(デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、チクングニヤウイルス)、アデノウイルス、ビルナウイルス、フレボウイルス(phlebovirus)、カリチウイルス、ヘパドナウイルス、オルビウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、ラブドウイルス、パルボウイルス、αウイルス、ペスチウイルス、ルビウイルス、フィルウイルス(filivirus)、 コロナウイルスならびにピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科およびポックスウイルス科のいかなるウイルスを含むが、これらに限定されない。
【0168】
5.7. 標的の選択
本発明の治療薬を開発する際の重要な要素は適当な標的の選択である。
【0169】
毒性剤の標的
本発明の毒性剤は、病原菌もしくは選択された細胞の増殖を阻止する能力または病原菌もしくは選択された細胞を致死させる能力、または病原菌もしくは選択された細胞の適応性を低下する能力に基づいて選択される。本発明の毒性剤の選択を例示する働きをする毒性のいくつかの特定の例を本明細書に記載する。
【0170】
例えば、毒性剤は、(docなどの)嗜癖系毒素であってもよい。Docは、phdと呼ばれるタンパク質に翻訳過程により結合する毒素をコードする。Phdはdocの解毒剤であり、docの毒性作用を中和する作用をする。2つのタンパク質、phdおよびdocは、P1プラスミド上でオペロンを形成し、phdはdocの上流に位置する。さらに、phd遺伝子はリボソーム進入部位を含有し、効率的に翻訳される。しかし、未処理のdoc遺伝子は、認識可能なリボソーム進入部位を欠損しており、十分に翻訳されない。従って、対応する解毒剤、phdを欠損する細胞または病原菌において発現される場合に毒性を生じる可能性があるので、docが選択された。この態様では、docはphdから分離しているように操作されている。例えば、、docはphdとは別のプラスミド内に操作される。docの翻訳レベルを増加するために、docをコードする核酸の上流にリボソーム進入部位が構築されるように、docを含有するプラスミドも操作されている。このプラスミドは、伝達プラスミドと呼ばれる本発明の毒性剤および/またはリボソームを含有している。本発明の特定の一態様において、伝達プラスミドは毒性剤docをコードする。
【0171】
次いで、パッケージング株(例えば、大腸菌)を使用して、バクテリオファージの頭部にdocを含有する伝達プラスミドをパッケージングする。パッケージング株細胞はP1プラスミドならびに未結合のdocおよびリボソーム進入部位を有する伝達プラスミドを含有する。パッケージングはまた、適宜、docの毒性からパッケージング細胞を保護する作用をすることができる追加のphdタンパク質をコードする第3のプラスミドを含んでいてもよい(例えば、伝達プラスミドのプロモーターがパッケージング細胞内に漏洩して、docが産生される場合)。
【0172】
従って、パッケージング株は、(docなどの)毒性剤を含有する伝達プラスミドをファージ頭部またはビリオンにパッケージングする作用をする。パッケージング株のファージ溶解産物は感染性バクテリオファージビリオンを含有する。
【0173】
次いで、ファージ溶解産物を使用して選択された病原菌(例えば、大腸菌、緑膿菌等)に感染させる。さらに、ファージ溶解産物を使用して、薬学的調製物などの本発明の治療薬を調製するこができる。ファージは、本明細書に記載されている方法または当技術上周知の任意の方法によって、細菌または病原菌または病原菌感染症宿主に送達される。例えば、ファージ溶解産物は凍結乾燥され、細菌感染症、真菌感染症等の治療を必要としている宿主に送達することができる。
【0174】
ビリオンがバクテリオファージである、上記の標的方法が提供される。バクテリオファージはλ、P1または他のファージであってもよい。伝達プラスミドがPAC部位およびPAC ABC遺伝子をさらに含む標的方法も提供される。パッケージング欠損であるように操作されるバクテリオファージP1も提供される。
【0175】
アンチセンスの標的
本発明の毒性剤は、毒性剤の解毒剤を標的とするように選択されるアンチセンス、または病原菌もしくは選択された細胞の生存に重要な必須RNAを標的とするように選択されるアンチセンスであってもよい。本発明の毒性アンチセンス分子の提案されている標的は、病原菌の生存に重大な役割を果たす任意の遺伝子のRNAであっても、または病原菌の生活周期に必須の任意の遺伝子のRNAであってもよい。本発明はまた、病原菌の必須遺伝産物の発現を調節する天然型アンチセンス分子の改変を含む。例えば、以下に記載するように、本発明のアンチセンスの提案されている標的は、その遺伝産物が大腸菌の細胞分裂の開始に重要な役割を果たすftsZ遺伝子である。例えば、毒性剤は、標的RNAに相同であるように改変され、増強されるように構築されているアンチセンス分子であってもよい。従って、DicFの場合と同様に、アンチセンス配列は、標的RNAとの相補性を増加したDicF1アンチセンス毒性剤を操作するように改変され、増強されている。さらに、、本発明の方法によって発現され、送達されて、毒性アンチセンスRNAレベルが増加した標的細胞を提供するという点において、DicF1またはDicF1様アンチセンス分子は増強された特性を有する。
【0176】
第三に、毒性剤は、必須アンチセンス分子を標的とするように選択することができる。従って、毒性剤は、必須アンチセンスRNAと相補的であるように設計されるセンス分子であってもよい。必須アンチセンス分子の例はSofである。Sofは、gefと呼ばれる染色体によってコードされる毒素のアンチセンス解毒剤である(Poulsen,L.ら、1991、Mol. Microbiology 5: 1639−48)。Sofは、通常は、細菌においてgefのレベルを調節する作用をする。本発明者らは、Sofに相補的であるセンス分子を設計した。Sofのセンス分子は、Sofがgefを調節する能力を阻害する作用をするので、内因性gefレベルを毒性にすることによって、病原菌に毒性をもたらす。
【0177】
リボザイムの標的
効果的な抗菌治療であるリボザイムは、侵入微生物を完全に不活性にし、脱出を防ぐために、例えば、いくつかの主要なタンパク質、tRNA、rRNAまたは細胞の生存もしくは適応に必須の任意の他のRNA分子のようなRNAを標的とすることが好ましい。
【0178】
ヒトRNAの複雑性はヒトDNAの約100倍低いので、特異性は12〜15程度の塩基対で得られる。RNA−RNA2本鎖の安定性は、GC含量、温度、pH、イオン濃度および構造によって得られる。隣接ルールは、2本鎖の安定性に有用な推定を与える(Castanottoら、「治療薬としてのアンチセンス触媒RNA(Antisense Catalytic RNAs as Therapeutic Agents)」、Advances in Pharmacol. 25: 289−317、1994)。
【0179】
本発明の触媒リボザイムは、標的RNA特異的配列が結合する部位の中間付近において標的RNAを切断する触媒配列も含む。ハンマーヘッド型のリボザイムでは、触媒配列は、一般に、高度に保存されている。保存されている触媒中心の残基は、進化により保存されているステムループ構造によって結合された5’GUGANGA3’および5’GAAA3’である。
【0180】
標的RNAの最もよく保存され、おそらく最も効率的に切断される配列は5’GUC3’である。しかし、NUX(ここで、X=A、UまたはCである)も効率的に切断されうる。このような切断部位はほとんどのRNAにおいて独自であるので、本質的に全てのRNAを標的にすることができる(Whitton, J. Lindsay、「ウイルス感染のアンチセンス治療(Antisense Treatment of Viral Infection)」、Adv. in Virus Res.Vol.44,1994)。
【0181】
標的RNAの適当な部位の選択に関しては、標的部位の二次構造がインビトロにおいて切断になんらかの影響を有することが知られている(Whitton、1994上記)。RNA標的の利用可能な部位を選択するために、数多くの手法が利用可能である。好ましい手法では、ライブラリースクリーニングを使用して、標的RNAの適当な部位を選択することができる。次いで、当業者に周知の技法を使用して選択された部位の利用性を確認することができる。従って、選択された標的分子の配列は、プログラムRNAFOLD(PCGENEグループ製のプログラムまたはインターネットを利用)を使用して、可能な二次構造について通常スクリーニングすることができる。標的の利用性の合理的な予測を立てることができる。コンピュータ支援RNAフォールディング(Castanottoら、1994)およびRNAの3次元モデリングのコンピュタ解析(Majorら、science 253: 1255−1260、1991、およびCastanotteら、1994)は、切断部位選択誘導に確かに有効である。
【0182】
少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが、病原菌のccdA、kis、pemI、parD、phd、higA、chpAI、chpBI、kicA、soc、sos、srnC、flmB、pndB、sof、korA、korB、korC、korD、korEまたはkorF転写物を標的とする核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが病原菌のrpoA転写物を標的とする核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが病原菌のsecA転写物を標的とする核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが、病原菌のdnaG転写物に向けられる核酸が提供される。少なくとも1つのトランス作用性リボザイムが病原菌のftsZ転写物に向けられる核酸が提供される。マルチリボザイムをコードする核酸は上記のトランス作用性リボザイムの全てまたは一部をコードすることができる。リボザイムは全て1つのプロモーターの制御下にあってもよい。
【0183】
例えば、生存に必須であるが、活性に無関係のいくつかの細菌遺伝子が選択されており、原核細胞標的に対する抗菌剤の好ましい構成のために適当なmRNA標的の選択がどのように実施されるかを強調するために本明細書に記載されている。交差属RNA標的を使用して、プロモーターの特異性によって改変された広域的な適用を有する抗菌剤を設計することができる。また、原核細胞標的に対する抗菌剤の好ましい構成のために適当な毒性剤の選択がどのように実施されるかを強調するためにいくつかの毒性剤が本明細書に記載されている。
【0184】
本発明の一態様において、第1のリボザイムは必須転写因子を標的とし、第2のリボザイムは必須の一般的な分泌成分を標的とし、第3のリボザイムはDNA生合成に必要なプライモソームの必須成分を標的とし、第4のリボザイムは細胞分裂に必要な酵素を標的とする。結果として、リボザイムは、細菌の増殖に必要な基本的な過程を特異的に標的とすることによって増殖を阻止するという点において冗長である。従って、これは、抗菌治療薬に対する耐性の形成を最小にすることができる。
【0185】
例えば、1つの標的は、必須タンパク質、rpoAまたはRNAコアポリメラーゼのαサブユニットである。rpoAは、活性なRNAポリメラーゼ酵素複合体の集成を容易にすると考えられているので、RNAポリメラーゼホロ酵素の他の成分ではなくrpoAが選択される。rpoA転写物が不活性化されると、ホロ酵素RNAポリメラーゼの細胞内濃度が低下し、新たな宿主に侵入すると、細胞をそれに必要な変化に対応できなくする。rpoAのヌクレオチド配列は、大多数の微生物(>20)について周知であり、GenBank(商標)から容易に入手可能である。
【0186】
リボザイム標的の第2の例は、細菌のsecA遺伝子のmRNAであってもよい。この遺伝子の産物は、細菌における一般的な分泌経路の必須で、律速成分である(Bassfordら、1994、Nucleic Acids Reserach Apr. 11、22(7):1326; Nucleic Acid Reserach. 22(3)293−300)。SecAは、これまで検討された全ての原核細胞で見つけられている。また、その生合成は翻訳過程により上流の遺伝子Xに結合され(Schmidtら、1991、J. Bacteriol. 173(20): 6605−11)、リボザイムの都合のよい標的となる。SecAの合成の阻害または低下も、細胞の生存度の低下を示すのに十分である(Schmidtら、1987、J. Bateriol. 171(2): 643−9)。さらに、病原菌が感染過程に必要な変化に応答するとき、SecAなどの主要タンパク質の利用性の変化は病原菌に不利益になり、宿主は病原菌を妨害することができる。最後に、SecAの分泌−応答発現の制御は翻訳レベルであり(Christoffersenら、1995、J. Med. Chem. 38(12): 2023−37)、多シストロンメッセージ内の調節配列は、上流の遺伝子Xの末端部およびsecAの開始部を含む領域に局在化している。結果として、リボザイムの触媒切断による転写物の不活性化は、侵入微生物の生存に深刻な結果を与える。
【0187】
第3のリボザイムは、DnaGなどのDNA生合成に必須の因子を標的とすることができる。1または2秒ごとに、細胞プライマーゼdnaG(Boucheら、1975、J. Biol. Chem. 250: 5995−6001)とdnaB(Marians, K. J. 1996、「複製フォーク伝播(Replication Fork Propagation)」、749−763頁、F. C. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、vol.1. American society for Microbiology、Washington、DC)との相互作用の結果として、岡崎フラグメントの大腸菌プライミングの各複製点について少なくとも1,000回反復される。複製中1〜2秒ごとに必要なタンパク質について予測されるように、DnaGの損傷またはその濃度の変化が生じると途中で停止した表現型が生ずる(Marians, K. J.、1996、「複製フォーク伝播(Replication Fork Propagation)」、749−763頁、F. C. Neidhardt(編)、「大腸菌およびサルモネラ菌:分子および細胞生物学(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology)」、第2版、vol.1. American society for Microbiology、Washington、DC); Weschlerら、1971、Mol. Gen. Genet. 113: 273−284)。従って、排除されない場合には、ラギング鎖の一般的なプライミングが低下するという点において、リボザイムによるDnaGメッセージの不活性化は深刻な細胞結果をもたらすはずである。DnaGは、複製を開始する責任を担うマルチ−タンパク質複合体である、プライモソームの一成分である。プライモソームの成分のいずれかは、個別にまたは任意の組み合わせで、プライモソーム不活性化の標的として働くことができるので、細胞を死滅させる。プライモソームの他の成分は、DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriBおよびPriCである。従って、プライモソームは、トランス作用性リボザイムによる不活性化の数多くの他の標的(DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriBおよびPriC)となるのに十分に複雑である。
【0188】
第4の標的はftsZであってもよい。これらの遺伝子も、分離の開始の責任を担うという点において細胞分裂に必要である必須タンパク質、ftsZをコードする。ftsZRNAの切断により細胞分裂が阻害され、生存が低下するので、ftsZが選択される。(DicF1などの)ftsZを標的とする任意の毒性剤またはリボザイムを使用して、ftsZ遺伝産物を必要とする細胞の分裂を阻害することができる。また、例えば、リボザイムによるftsZメッセージの切断の結果、このようなリボザイムはftsZメッセージの追加のコピーを攻撃して、細胞分裂を阻害することができる。選択された他の標的と同様に、ftsZのヌクレオチド配列は通常GenBank(商標)から利用可能である。
【0189】
病原菌の任意の他の必須タンパク質は、本発明において標的とされるメッセージを有することができ、どのタンパク質が必須であるかの決定は当技術上標準的なプロトコールにより通常決定しうることが明らかである。実際、 国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(National Center for Biotechnology Information)のアントレ(Entrez)データベースの公共セクションには、52,000個を超えるウイルス、41,000個を超える細菌および12,300個を超える真菌の配列が寄託されている。これらのいずれも、本発明の触媒トランス作用性リボザイムを設計するために使用することができる。
【0190】
必須タンパク質のmRNAを標的とする以外に、リボザイムは、細胞内の他のRNA種を標的とすることができる。詳細には、細菌、真菌または他の下等真核生物の適当な標的は、スモールサブユニットRNA(SSU)またはラージサブユニットRNA(LSU)などのリボソームRNAおよびタンパク質の合成に必要なtRNA分子を含む。病原性ブドウ球菌に関しては、翻訳されない比較的少量のRNA III部分は切断に利用可能であるはずである。標的とされるRNAが正規のリボザイム切断ドメインを含有する限り、リボザイム治療薬は相補的RNAにハイブリダイズし、切断して、微生物細胞の適応性に影響を与える。さらに、3000個を超えるrRNA種が配列決定され、整列されている。この情報はリボソームデータベースプロジェクト(Ribosomal Database Project)から入手可能で、このような標的に対するリボザイムの迅速な設計および適合を容易にするはずである。例えば、細菌の16S rRNA分子は、細胞あたり4000コピーを上回る16S rRNAが存在するという点において特に好ましい。結果として、数の低下は、16S rRNA分子が翻訳開始過程に関与するタンパク質合成過程を遅くする。従って、mRNAおよびrRNAに対して向かう毒性剤またはリボザイムは、侵入微生物の適応性に影響を与える。
【0191】
5.8. 毒性および/またはリボザイム産生細胞の保護
毒性剤またはリボザイムをコードする核酸は、毒性剤またはリボザイムを保有するビリオンを産生することを必要とされている細胞に毒性となることができる。P1のような広域宿主範囲ビリオンを使用する場合、ビリオンを作製するために使用する生物は標的生物と異なっていてもよい。このように、毒性剤またはリボザイムは、種特異的プロモーターエレメントのために産生株中では効率的には発現されず、リボザイムは、リボザイムを標的とする種特異性配列により、攻撃する任意の標的RNA分子を持たないので、産生株は毒性剤またはリボザイムの毒性作用に抵抗性である。標的微生物の株内で発現され、集成される必要のある種特異的ウイルスを使用する場合には、この毒性は大きな問題となる。λにパッケージングされた抗大腸菌リボザイムまたは毒性剤遺伝子からなるビリオンの集成は、毒性を阻止するために使用される方法を例示している。例えば、大腸菌のRNA種に対して向かうリボザイムは、コンセンサスプロモーターエレメントを含有する人工的プロモーターから発現される。このプロモーターにより、標的細胞の感染直後に、リボザイムが高レベルに転写される。大腸菌の産生株の望ましくない死滅を防止するために、死滅の標的となる野生型株には利用されない機序によって産生株において転写を抑制する。異種転写因子のDNA結合部位を構成する配列を、リボザイムプロモーターの必須活性化エレメントの間に配置する。産生株における異種転写因子の発現は、プロモーターエレメントの活性化およびRNAポリメラーゼの結合の防止の閉鎖(occlusion)を生じる。一例として、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)転写因子Ste12pの遺伝子を大腸菌において発現させることができ、リボザイムプロモーター内に配置されているフェロモン応答エレメントである結合部位に結合することができる。Ste12pは野生型には見られない。従って、リボザイムプロモーターは、標的細胞にプラスミドを送達した後にRNAポリメラーゼに接近することができる。
【0192】
リボザイムの毒性から産生株を保護することができる別の方法は、標的とされるRNA分子のリボザイム耐性種を使用する。標的RNA分子がタンパク質をコードする場合に、この方法を使用することができる。翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列は変化がないが、mRNA配列はリボザイムの基質として働かないように、mRNA分子内のリボザイム標的部位を部位特異的突然変異によって突然変異させる。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムでは、切断が生じるためには、標的mRNA内にNUX配列を必要とする。この配列をほかの何かに変更することによって、リボザイムはmRNAを切断しない。標的RNAのこの種類のリボザイム抵抗性種はプラスミドから発現され、産生細胞の染色体に組み込まれるので、この株をリボザイムの毒性抵抗性にする。
【0193】
産生細胞を毒性剤の毒性から保護することができる別の方法は、中和剤または解毒剤の同時発現を使用する。解毒剤または中和剤のこのような同時発現は、コードされる毒性剤の毒性作用からパッケージング細胞を保護する。毒性を発現するために使用されるプロモーターが漏洩して、産生細胞内で毒性剤を発現する場合には、この方法は特に有用である。例えば、パッケージング株(例えば、細菌細胞)を使用して、毒性剤を含有するウイルスベクターをバクテリオファージ頭部内にパッケージングすることができる。パッケージング細胞の生存または産生細胞によって作製されるベクターまたはファージの量の最適化は、産生細胞における解毒剤または中和剤の同時発現を必要とする。中和剤は、毒性剤の毒性作用を中和する任意の分子(タンパク質、アンチセンス、センスまたは他の分子(薬剤、化合物等の)ような)任意の分子である。具体的な実施例における例として、パッケージング株細胞は、バクテリオファージP1プラスミドならびに毒性剤docおよびリボザイム進入部位を含む伝達プラスミドを含有する。伝達プラスミドがパッケージング株に毒性であると判定される場合には、phdタンパク質などのdocの解毒剤をコードする第3のプラスミドを導入することができる。解毒剤を有する追加のプラスミドは、docの毒性からパッケージング株を保護する作用をする。
【0194】
本発明の改善箇所は、無傷のバクテリオファージに典型的な溶菌感染サイクルとは異なり、ファージ外被が核酸を標的微生物に注入すると、毒性剤またはリボザイムの発現が微生物を破壊するという点において、非反復送達シス作用性が利点を有するということである。結果として、ファージ外被の増幅は問題とはならず、非反復的なファージ送達系が免疫応答を形成して、その後送達系が使用できなくなる可能性は低い。さらに、患者が耐性病原菌に暴露され、本発明の治療薬が有効で、進入微生物を中和する場合には、微生物抗原は治療薬の作用の結果として遊離し、液性免疫および細胞性免疫を誘発して、その後の攻撃に対する防御となる。
【0195】
5.9. 治療薬および薬学的調製物/製剤および投与方法
本発明はさらに、疾患、ウイルス感染症、寄生虫感染症および微生物感染症を治療するための本発明の毒性剤および/またはリボザイムの用途をさらに含む。
本発明はさらに、組織における細胞増殖を阻害することによって特定組織の増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、組織特異的プロモーター配列に機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、プロモーターは異常組織に特異的であり、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、細胞増殖を阻止し、増殖性疾患を治療する方法を含む。
【0196】
本発明はさらに、病原菌の複製を阻止することによって、病原菌感染症または疾患を有する対象を治療する方法であって、病原菌特異的プロモーターに機能的に結合した毒性剤および/またはリボザイムを対象に投与する段階を含み、核酸によってコードされるリボザイムおよび/または毒性剤が発現され、病原菌は複製が阻止されるかまたは死滅させられるかまたは適応性を低下され、感染症または疾患が治療される方法を提供する。本発明は、薬学的製剤の形態の本発明の毒性剤および/またはリボザイムを含む。
【0197】
本発明のいくつかの態様において、本発明の毒性剤またはリボザイムは、抗菌治療薬として特に好適である。例えば、標的RNA転写物との核酸ハイブリダイゼーションの結果、リボザイム−RNA複合体は、標的RNAを切断するヌクレアーゼとして作用する触媒形態をとる。従って、切断により、侵入微生物は必須細胞過程を奪われ、死滅するかまたは適応性が低下される。また、本発明の毒性剤は抗菌治療薬として使用することもできる。毒性剤は単独で使用しても、または1つ以上の他の毒性剤と併用して使用してもよい。従って、毒性剤の侵入微生物への送達は死滅させるかまたは適応性を低下する。毒性剤は1つ以上のリボザイムと併用して使用してもよい。さらに、リボザイムと毒製剤との組み合わせを抗菌治療薬として使用することができる。
【0198】
本発明は、1つまたは1系列の候補微生物の必須遺伝子、ハウスキーピング遺伝子または毒性遺伝子に向かう1つ以上のリボザイムおよび/または毒性剤の使用を提供する。必須タンパク質および毒性決定因子の不活性化は、侵入微生物を不活性にするかまたは増殖を遅くすると同時に、宿主の必須課程は有意に影響されない。
【0199】
a)プロモーターと、毒性剤またはリボザイムをコードする配列とを含むリポソームを作製する段階、およびb)リポソームを対象に送達する段階を含み、標的特異的プロモーターが、標的細胞において毒性剤またはリボザイムを転写させる、毒性剤またはリボザイムを対象の標的(例えば、病原菌)に送達する方法が提供される。標的は、病原菌、例えば、細菌、真菌、酵母、寄生虫、ウイルスまたは非ウイルス病原菌であってもよい。
【0200】
a)本発明の非ウイルスDNAを含むビリオンを作製する段階、b)それをリポソームと組み合わせる段階、およびb)ビリオンを含有するリポソームを対象に送達する段階を含み、リポソームが真核細胞に進入し、ビリオンを放出し、これがDNAを病原菌に送達して、病原菌特異的プロモーターが病原菌細胞において毒性剤またはリボザイムを転写させる、毒性剤またはリボザイムを対象の病原菌に標的送達する方法が提供される。
【0201】
標的特異的プロモーターを含むDNAと毒性剤またはリボザイムをコードする配列とを含むリポソームを対象に投与する段階を含み、DNAによってコードされる毒性剤またはリボザイムが発現され、感染菌が死滅されるか弱体化される方法が提供される。この方法に使用されるリポソームは、任意のリボザイムコード核酸または任意の毒性剤コード核酸であってもよく、特に病原菌の遺伝子を標的とする本明細書に記載されているものであってもよい。感染症は細菌、真菌、酵母、寄生虫、ウイルスまたは非ウイルスであってもよい。
【0202】
リポソーム(edleyら、1987)またはウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム(Nicolauら、1983)にDNAが捕獲されている製剤を用いて、およびポリリジン−糖タンパク質担体複合体に結合したDNAを用いて、直接インビボ遺伝子移入を実施することができる。また、「遺伝子銃(gene guns)」を、細胞への遺伝子送達に使用している(オーストラリア特許第9068389号)。最後に、細胞にDNAを移入するために、 間隙に注射するための液体担体溶液の形態で裸のDNA(nakedDNA)またはリポソームが結合したDNAを製剤化することができる(国際公開公報第90/11092号)。アシアロフェチュイン標識リポソームは、アシアログリコプロテイン受容体を介して肝細胞を選択的に標的化することが知られている(その各々は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Wuら、1998、Hepatology 27/3: 772−8; Haraら、1996、Biochem. Biophys. Acta 1278/1:51−8; Haraら、1995、Gene Therapy 2/10: 784−8; Haraら、1995、Gene 159/2: 167−74)。アシアログリコプロテイン受容体媒介性エンドサイトーシスは、関心のある核酸を付加したアシアロフェチュイン標識リポソームを使用した遺伝子導入またはトランスフェクションを実施する手段として使用されている。使用糖またはアシアログリカンなどの、リポソームの他の改良も周知である。
【0203】
従って、本発明の一態様において、本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを送達するための非ウイルスベクターとして、アシアロフェチュイン標識リポソームを使用する。それによって、動物の肝臓への本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのインビボまたはインビトロにおける送達が達成される。
【0204】
標的細胞が生体から取り出され、本発明の、設計された核酸を保有するベクターがトランスフェクトまたは感染され、生体に移植されるエクスビボ遺伝子治療も提供される。細胞にインビトロにおいてDNAを移入するために現在使用される技法は、リン酸カルシウム−DNA沈降法、DEAE−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性DNA移入、例えば、Lipofectamine(登録商標)などの液体媒介性トランスフェクションまたは組換えウイルスベクターによる形質導入(一般に、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Ausubelら、2001、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.)を含む。これらのトランスフェクションプロトコールは、上皮細胞(米国特許第4,868,166号、Morganら、1987)、内皮細胞(国際公開公報第89/05345号)、肝細胞(Ledleyら、1987; Wilsonら、1990)、繊維芽細胞(Rosenbergら、1988; 米国特許第4,963,489号)、リンパ球(米国特許第5,399,346号、Blaeseら、1995)および造血幹細胞(Limら、1989; 米国特許第5,399,346号)を含む種々の異なる細胞種にDNAを移入するために使用されている。
【0205】
ウイルスベクターは最も効率的な遺伝子治療送達系であることが多く、数多くの組換え複製欠損ウイルスベクターがエクスビボおよびインビボにおいて細胞に形質導入(すなわち、感染)することが当技術上知られている。このようなベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルスおよびヘルペスウイルスベクターを含む。
【0206】
非経口投与は、使用する場合には、注射(静脈内、皮内、皮下および筋肉内)によって一般に特徴づけられる。注射剤は、液体または懸濁液、注射時に溶液または懸濁液に調製するのに好適な固形形態または乳剤などの従来の形態で調製することができる。さらに最近考案された非経口投与方法は、一定レベルの用量が維持される徐放性または持続性放出系の使用に関係する。例えば、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第3,610,795号参照。本発明のある種の好ましい態様において、投与は非経口である。
【0207】
本発明は予防的投与に関する。例えば、多数の入院患者または免疫寛容宿主は、病原菌感染を特に受けやすい。さらに、多数の病原菌の院内株は、ペニシリンなどの従来の抗生物質に耐性がある。本発明の治療薬は、病原菌感染症を予防する、または耐性病原菌株によって生じる感染症を治療するのに特に有用である。
【0208】
滅菌溶液または懸濁液の形態で物質を非経口投与するのに好適な担体は、エチルオレエートまたはイソプロピルミリステートなどの添加剤を含有してもよい滅菌生理食塩液を含んでもよく、例えば、静脈内ならびに皮下組織または粘膜内組織に注射することができる。
【0209】
局所投与は、クリーム、ゲル、坐剤、エアゾール、スプレー等によってもよい。エクスビボ(体外)送達は、他の内容において典型的に使用されるようであってもよい。好ましい治療用途において、本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはリボザイムは、手の疣、足の疣、喉頭の疣、せんけいコンジローム、疣状表皮異形成、子宮頚部の偏平な疣、子宮頚癌またはパピローマウイルスに関係する任意の他の感染症を1つ以上有する対象に投与される。本発明による治療薬を局所的または病巣内に適用することが一般に好ましい。経皮または筋肉内投与などの他の形態の投与も有用である場合がある。軟膏、膏薬、ゲル、クリーム、ローション、スプレー、吸入剤または坐剤に加えることは、現在では、有用性が高いと考えられている。本発明のDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはリボザイムは予防にも使用することができる。例えば、コンドームのコーティングとして、または単独もしくはコンドーム、女性用避妊具等と併用して使用する殺精子製剤中に薬物を提供することによってこれを実施することができる。本発明の好ましい態様において、投与は局所治療としてである。本発明の一態様において、火傷または開放創に関連する感染症の治療には、局所投与が好ましい場合がある。
【0210】
経口投与も提供される。経口投与の好適な担体は、矯味剤、潤滑剤、懸濁剤または保護剤として作用することもできる1つ以上の物質を含む。好適な固形担体はリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、カルボキシポリメチレンまたはシクロデキストランを含む。好適な液体担体は水、発熱物質を含まない生理食塩液、薬学的に許容されうるオイルまたはこれらのいずれかの混合物であってもよい。液体はまた、緩衝液、保存剤、矯味剤、粘性または浸透圧調節剤、安定剤または懸濁剤などの他の好適な薬学的に許容されうる添加剤を含有してもよい。好適な液体担体の例は、pH調節ゲルとしてのカルボキシポリメチレンを含む、種々の添加剤を含むまたは含まない水を含む。
【0211】
本発明の治療薬は、抗生物質作用を生ずる、または標的病原菌の活性を阻止または低下するのに十分な量を対象に投与することができる。最適な用量は、年齢、体格、体重、状態等ならびに誘導される特定の調節作用に基づいて、患者個人により異なる。当業者は用量は担当医によって最適に決定されることを知っており、用量設定方法は、例えば、「レミントンの薬学(Remington’s Pharmaceutical Science)」(Martin, E. W.編、Remington’s Pharmaceutical Science、最新版、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania)に記載されている。治療は、特定の感染症に関連する徴候、症状および臨床パラメーターをモニターすることによって示されるように、間欠的であっても、無限に継続してもよい。感染症に関連するパラメーターは多数の病原菌について周知であり、治療経過中定期的に評価される。
【0212】
好ましい一態様において、本発明は、ウイルス感染症を治療するために使用することができる本発明の核酸を1つ以上含有する組成物を提供する。個々の患者の必要量は異なるが、組成物中の各成分の有効量の最適範囲の設定は当業者の認識範囲内である。典型的な用量は0.001〜100 mg/kg体重を含む。好ましい用量は0.1〜10mg/kg体重を含む。最も好ましい用量は0.1〜1mg/kg体重を含む。好ましい局所適用は、パピローマを覆うのに十分な量であるか、または膣鏡検査によって同定される子宮頚管病変全体を覆うのに十分な量である。局所適用されるDNAzymeまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適用あたり1μg〜250μgの範囲、好ましくは50μg〜100μgの範囲であるように含まれる。例えば、典型的なHPV局所適用は50μl中50μgである。本発明のHBV剤では、総用量が500μg〜1000μgの範囲であるように含まれる。最適な用量範囲の設定は、毒性研究の考え方を含み、当業者の認識範囲内である。
【0213】
本発明の組成物は、薬理学的に活性な薬剤以外に、作用部位への送達に使用することができる製剤への作用化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む薬学的に許容されうる担体を含有してもよい。
【0214】
非経口投与に好適な製剤は、例えば、水溶性の塩のような水溶性の形態の作用剤の水溶液を含む。また、適当な油性注射用懸濁液としての作用化合物の懸濁液が投与される場合もある。好適な親油性溶媒または媒体は脂肪油、例えば、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドを含む。水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加する物質を含有してもよい。必要に応じて、懸濁液は安定剤を含有してもよい。リポソームは、細胞に送達するための薬剤を封入するためにも使用される。
【0215】
上記のように、本発明による全身投与のための薬学的組成物は、経腸、非経口または局所投与用に製剤化することができる。実際、作用成分の全身投与を実施するために、3種類の製剤全てを同時に使用する場合もある。
【0216】
好適な経口投与製剤は、硬または軟ゼラチンカプセル、ピル、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤およびそれらの徐放性形態を含む。
【0217】
6. 実施例:プロモーターの構築および特徴づけ
既に確立されている細菌誘導プロモーターは、転写を厳重に制御できないことで有名であり、有意なレベルのバックグラウンド発現が特徴的に観察される。
【0218】
Leashiプロモーター
本発明は、転写および増大された発現の厳重な調節を可能にする細菌プロモーターを提供する。LEASHIと呼ばれる新規プロモーターは3つのエレメントから構築されている(図1A参照)。RIPと呼ばれる第1のエレメントは、転写開始位置に対して−10(TATAAT)および−35(TTGACA)に位置する2つのコンセンサス部位の組み合わせであった。第2のエレメントはlacIリプレッサー結合配列(lacオペレーター配列と呼ばれる)に基づいており、−10〜−35コンセンサス部位に位置した。−10〜−35の間に配置されるlacオペレーターは、RNAポリメラーゼのプロモーターへの結合を効果的に遮断したので、プロモーターによる転写制御を増強した。プロモーターは、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドを添加することにより「スイッチ オン」されるように設計され、イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシドはリプレッサータンパク質に結合し、その後リプレッサータンパク質を滴定する。次いで、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合することができ、転写が進行することができる。
【0219】
LEASHIプロモーターの第3のエレメントはUPエレメントであった。UPエレメントはアデニン/チミンに富む配列で、−35エレメントのすぐ上流に配置された。UPエレメントの追加はこのプロモーターによる発現をさらに増加した。
LEASHIプロモーター配列:(配列番号:1)
【0220】
本発明のLEASHIプロモーターの重要な利点は、それは、誘導プロモーターに通常観察される高いレベルのバックグラウンドを軽減することである。関心のあるプロモーターが高コピー数プラスミド上にある場合に、転写の高いバックグラウンドレベルを生ずる制限因子は、プロモーターに結合するのに利用可能なリプレッサー分子がないことによる。本発明は、lacI発現プラスミドを使用し、第2に、−35と−10のコンセンサスエレメントの間に、通常の条件下では転写をより効果的に遮断するlacオペレーターを配置することによって、この問題を克服している。さらに、−35領域のすぐ上流に配置されたUPエレメントがプロモーターによる転写を増大した。
【0221】
LEASHIプロモーター(図1B)は、多種多様の細菌に対する広域スペクトルプロモーター活性を有するlacI調節プロモーターとして設計された。IPTG誘導性LEASHIは大腸菌において機能し、厳重に調節されている。それは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方において活性である。
【0222】
本明細書に記載されるように、本発明のリボザイムはLEASHIプロモーターに機能的に結合している。本発明の別の特定の態様において、本発明の毒性剤はLEASHIプロモーターに機能的に結合している。
【0223】
改変型rrnBプロモーター
改変型rrnBと呼ばれる新規プロモーターが構築された(図1C参照)。改変型rrnBプロモーターの配列:(配列番号:2)
【0224】
Anr、Arc、およびProcプロモーター
Anr(図1D)、proC(図1E)およびArc(図1F)プロモーターは種特異的である。anrおよびproCは共に大腸菌において転写がオフで、緑膿菌においてオンである。これらのプロモーターは、病原菌(シュードモナス)において毒性剤の制御された発現を可能にすると同時に、パッケージング株(大腸菌)を治療薬の毒性作用から保護することができるという利点を提供する。このようなプロモーターは、送達媒体の製造を容易にするのに特に有用である。このようなプロモーターは、患者の遺伝子治療の細菌特異的標的化も可能にする。
緑膿菌「特異的」プロモーター(5’側から3’側)
ANRプロモーター(配列番号:3)
Proプロモーター(配列番号:4)
ARCプロモーター(配列番号:5)
【0225】
緑膿菌において主に発現されたAnr、ArcおよびproCプロモーターが単離され、この病原菌において毒性剤を特異的に発現することが示されている(表1および2ならびに図2参照)。詳細には、表1に示すように、プロモーターは、複数の転写ターミネーターが隣接したカセットのβ−ラクタマーゼリポーター遺伝子の上流にクローニングされた。構築物を大腸菌または緑膿菌に形質転換し、異なる量のカルベニシリンを含有する寒天上で培養した。3回の反復評価では同じ結果が得られた。
【0226】
【表1】β−ラクタマーゼをリポーター遺伝子として使用したプロモーターの評価
【0227】
表2に示すように、chpBK遺伝子を、緑膿菌プロモーターproCおよびanrの制御下において両方向にクローニングした。等量のDNA(500ng)を大腸菌および緑膿菌に形質転換して、寒天上で培養した。模擬の形質転換も「DNAなし」で実施した。+はコロニーが100より多いことを示し、−は検出可能なコロニーがないことを示す。括弧はプロモーターに対するchpBK遺伝子の方向を示す。実験は少なくとも2回反復し、同じ結果を得た。重要なことに、chpBK発現を調節するためにproCおよびanrを使用したプラスミドは大腸菌において細胞死を誘発せず、これは転写活性化機能の欠損を示している。
【0228】
【表2】緑膿菌において主に発現されるプロモーターの評価
【0229】
種特異的プロモーターの開発は、固有の偏共生細菌を本発明の毒性剤から保護すると同時に、病原性緑膿菌を標的とするすることが望ましい本発明の局面において特に重要である。
【0230】
TSST−1プロモーター
環境的に調節されたブドウ球菌特異的プロモーターTSST−1が得られ、このプロモーターを使用する伝達プラスミドを使用してdocまたは他の毒性剤を発現する。黄色ブドウ球菌株に伝達プラスミドを送達することができるブドウ球菌特異的ファージを使用して、ブドウ球菌病原菌を特異的に標的とする。
TSSTI−プロモーター(配列番号:6)(GanBank(商標)アクセッション番号U93688、また、Lindsay, J. A.ら、1998、「毒素ショックトキシンに対する遺伝子を黄色ブドウ球菌における移動性病原性島のファミリーが保有している(The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus」、Mol. Microbiol. 29(2)、527−543も参照):
【0231】
7. 実施例:細菌の増殖に及ぼす毒性剤の影響
本発明の方法を証明するために、本発明者らは、病原菌に対するいくつかの毒性剤を発現し、標的とした。毒性剤は、病原菌もしくは異常細胞の増殖を阻止する能力または病原菌もしくは異常細胞に致死を生じる能力に基づいて選択した。本明細書の以下の実施例は、いくつかの天然型ファージ、プラスミドおよび染色体によってコードされたタンパク質の毒性剤を例示しており、抗菌治療剤としての有効性を証明している。
【0232】
詳細には、SecA、16S RNA、dicF、 sof、dicFアンチセンス、16Sアンチセンス、毒素/解毒剤対の毒性タンパク質doc/Phd、gef/Sof、chpBK/ChpB1またはkicB/KicAを含むが、これらに限定されない、いくつかの天然型ファージ、プラスミドおよび染色体によりコードされる毒性タンパク質を同定し、抗菌治療剤として有効であることを証明した。
【0233】
毒性剤が、嗜癖系毒素の毒性遺伝子産物、染色体によってコードされる毒素の毒性遺伝子産物またはアンチセンス分子であることを例示するために、doc、gef、chpBK、kicBまたはDicF1をコードする核酸を、P1バクテリオファージ送達系に使用する伝達プラスミドに操作した。プラスミドの構築は当技術上周知の標準的な方法によって実施した。
【0234】
図3に示すように、毒性剤をクローニングするための発現ベクターを操作した。詳細には、lacI調節プロモーターの制御下において毒性タンパク質chpBK、kicB、docおよびgefをコードする遺伝子を、複製起点ColE1(300〜500コピー/細胞)、pMB1(15〜20コピー/細胞)またはp15A(10〜12コピー/細胞)および選択マーカーCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)を含有する大腸菌ベクターにクローニングした。しかし、当技術上周知の任意の選択マーカーを使用してもよい(例えば、bla、アンピシリン抵抗性)。lacI発現プラスミド由来のlacIリプレッサータンパク質を過剰発現する大腸菌株に毒性剤をクローニングした。lacI調節プロモーターの制御下において毒性タンパク質chpBK、kicB、docおよびgefをコードする遺伝子をPCRによって入手し、大腸菌シャトルベクターにクローニングした。lacI発現プラスミド由来のlacIリプレッサータンパク質を過剰発現する大腸菌株に致死剤をクローニングした。
【0235】
docまたはgefの翻訳レベルを増加するために、リボソーム進入部位が、毒性剤をコードする核酸の上流に構築されているように、毒性剤docまたはgefを含有するプラスミドを構築した。毒性剤を保有するプラスミドは伝達プラスミドと呼ばれる。伝達プラスミドは、1)複製起点、2)選択マーカー、3)P1 PAC部位およびPAC ABC遺伝子4)P1溶菌レプリコン、5)毒性剤(例えば、doc、gefまたはDicF1)をコードする核酸を含有するように構築された。
【0236】
詳細には、伝達プラスミドは、pBluescript(ColE1起源)およびpBBR 122(広域宿主範囲起源)親ベクターに基づいて構築した。毒性剤docまたはgefをコードする核酸を広域宿主範囲伝達プラスミドにクローニングした。dicFをコードする核酸をCo1E1伝達プラスミドにクローニングした。各ベクターの構造は入手可能である。docおよびgefはともにlacI調節プロモーターの制御下においた。伝達プラスミドは、ファージの溶菌サイクル中にローリングサークル複製を受けるように設計された。
【0237】
毒性剤をコードする核酸をバクテリオファージ頭部に含有する伝達プラスミドをパッケージングするために、パッケージング株(例えば、細菌細胞)を使用した。3つの毒性剤の各々のパッケージング株は、P1バクテリオファージのファージ前駆体および毒性剤をコードする核酸を含有する伝達プラスミドを含有した。いくつかの場合において、パッケージング株は、適宜、毒性剤の毒性からパッケージング株を保護する作用をする追加の解毒剤タンパク質をコードするか、または伝達プラスミドのプロモーターのスイッチをオフするための追加のリプレッサータンパク質をコードする第3のプラスミドも含有した。
【0238】
従って、毒性剤(例えば、doc、gefまたはDicF1)を含有する伝達プラスミドをファージ頭部またはビリオンにパッケージングするためにパッケージング株(P1溶菌ファージ)を使用した。パッケージング株のファージ溶解物は感染性バクテリオファージビリオンを含有し、以下の方法で細菌標的に感染させるために使用した。
【0239】
毒性剤(docまたはgefまたはDicF1)を有する伝達プラスミドを保有するP1溶菌ファージ(P1 cm C1.100)を、30℃において、LB、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2、12.5μg/mlクロラムフェニコール中で、A450が0.8に達するまで増殖させ、A450が0.8に達したら、培養物を42℃の水浴に移し、1時間活発に通気した。クロロホルムを添加し、37℃においてさらに20分間インキュベーションを継続した。ファージストックは4,000 gにおいて20分間遠心分離して透明にした。DNase(1μg/ml)およびRNase(10μg/ml)を添加し、37℃において30分間インキュベーション後、ファージを4,000 gにおいて20分間遠心分離した。NaClを1 Mおよびポリエチレングリコール6000を10%(w/v)添加することによって、ファージ粒子をファージストックから沈殿させた。氷上で2時間インキュベーションした後、11,000 gにおいて15分間遠心分離することによってファージをペレットにした。ペレットを50 mMのTris Cl pH 7.5、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2、0.01%ゼラチンに慎重に溶解した。クロロホルムで抽出してポリエチレングリコールを除去した。
【0240】
選択された病原菌(例えば、大腸菌)に感染させるためにファージ溶解物を使用した。標的細胞(105 CFU/ml、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2で処理済)は、上記のファージ溶解物の各々を用いて、種々のM.O.I(0.1、1、10、100)で感染させた。30℃において30分間インキュベーションした後、コロニー形成単位の総数についてプレートを計数することによって、細胞死を評価した。
【0241】
両方の種類の伝達プラスミド(Co1E1および広域宿主範囲系)が、インビトロにおいてP1送達系によって種々の大腸菌株に移入された。広域宿主範囲伝達プラスミドをインビトロにおいて緑膿菌に送達するためにもP1系を使用した。Co1E1伝達プラスミドはインビボにおける大腸菌への移入が成功し、広域宿主範囲伝達プラスミドはインビボにおいて緑膿菌および大腸菌に送達された。
【0242】
結果は、毒性剤を含有する感染性ビリオンを含むファージ溶解物による細菌細胞の感染は、感染した細菌細胞を死滅させることができることを示した。さらに、高M.O.I.により多量の細胞死を生じたので、細菌細胞の死滅は用量依存的であることがわかった。従って、本発明の方法および組成物は、病原菌感染症を治療する抗菌剤として有用である。
【0243】
毒性剤の致死試験は、doc、gef、chpBKおよびkicBは全て大腸菌に対して殺菌性であることを明らかにした(図4参照)。詳細には、毒性タンパク質の発現が抑制される条件下においてコロニーを液体培地で増殖させた。IPTGで1時間誘発することによってタンパク質を発現させた後、IPTGを欠損する寒天上で培養物を終夜培養した。コロニーが見られないのは、タンパク質が致死的であることを示している(結果の表4も参照)。構築物を大腸菌に形質転換し、1 mM IPTGが存在する場合または存在しない場合において寒天上で培養した。等量のDNA(500 ng)を緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)にも形質転換した。模擬の形質転換も「DNAなし」で実施した。+はコロニーが100より多いことを示し、−は検出可能なコロニーがないことを示す。実験は少なくとも2回反復し、同じ結果を得た。全ての薬剤は大腸菌に致死的であったが、docだけは4種全てにおいて毒性であった。
【0244】
【表4】広域宿主範囲プラスミドを使用した大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)における毒性タンパク質の評価
【0245】
図5に示すように、doc発現プラスミドを保有する大腸菌の増殖は、docの発現がITPGによって誘発される場合には、阻止されることが証明された。詳細には、細胞を32℃においてLB中で終夜増殖させ、新鮮なLB培地で1:100希釈し、32℃において180分インキュベーションした。次いで、培養物を均等に分けて、2 mM IPTGが存在しない場合(○)または存在する場合(○)において32℃においてインキュベーションすると、致死的な薬剤docが発現された。増殖は、1 mlの試料のOD600における分光学的測定によって算出した。
【0246】
細菌の増殖を遅くするだけの従来の抗生物質とは異なり、細胞死の99%は、細胞をIPTGで20分間誘導した場合に達成されることをdocの致死試験は示している。細胞が、doc発現プラスミドを維持する非選択的なプレッシャー(no selective pressure)条件下に置かれている場合には、有意な低下(92%の細胞死)が証明された。従って、細菌の迅速な死滅は、耐性株を生ずる選択的プレッシャーの可能性を低下しており、これは多剤耐性菌を根絶する際に重要である。
【0247】
DOCに対する低い耐性
docに対する耐性頻度を検討するために、耐性突然変異体を単離した。根本的理由は自然突然変異を選択することであったので、突然変異原は使用しなかった。致死量以下の濃度の40 docに長期暴露した後、耐性大腸菌クローンを単離した。これらのクローンから単離したDNAは、doc感受性細胞への形質転換によって試験したが、IPTGの存在が細胞死滅を誘発しなかった。これは、耐性はdoc発現プラスミドにおける突然変異または組換え事象によることを示しており、doc標的の染色体の突然変異は非常に低い頻度でしか生じないことを示唆している。
【0248】
緑膿菌に対する毒性
docおよびchpBKは緑膿菌に毒性であることが証明された。特に注目すべきことは、docはグラム陰性菌(大腸菌および緑膿菌)およびグラム陽性菌(黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis))の両方に広域スペクトル活性を有したことである(上記表4参照)。表4からわかるように、毒性剤docは試験した全ての細菌種を死滅させた。doc、gef、chpBKおよびkicBは全て大腸菌を死滅させることができた。chpBKは大腸菌および緑膿菌を死滅させた。
【0249】
バクテリオファージ毒性剤送達系の開発
伝達プラスミド(図6Aおよび6B参照)をパッケージングして、大腸菌および緑膿菌に送達するためにバクテリオファージP1系を使用するための毒性剤送達系を実施した。図6Aは、パッケージングに必須のシグナル(P1 P53プロモーターの制御下におけるpac部位および溶菌レプリコン)、検出のための選択マーカー(bla、アンピシリン)およびCo1E1複製起点を大腸菌内に含有する伝達プラスミドを図示する。図6Bは、C1リプレッサー制御P53プロモーターアンチセンスおよび遺伝子kilAおよびrepLを含む溶菌レプリコンを図示する。kilAはフレーム欠損が52%である。P53アンチセンスはP1レプリコンの安定性に関係している。本発明の方法は、病原性グラム陰性菌に送達するためのP1ビリオンに効率的にパッケージングすることができる2つの伝達プラスミドによって本明細書において例示されている。重要なことには、送達系は重感染排除の抑圧下にはない(図7)。P1送達系による伝達プラスミドの大腸菌への送達効率を証明するために、以下のアッセイ法を実施した。伝達プラスミドを保有する大腸菌P1 Cm clts 100溶菌ファージは、熱誘導によって誘導して、ファージ粒子を作製した。ファージ溶解物はDNaseおよびRNaseで作製して、沈殿した粒子を50 mMのTris. Cl pH 7.5、10 mM MgSO4、5 mM CaCl2、0.11%ゼラチン、大腸菌C600に再懸濁させ、大腸菌P1 C600標的細胞(105 CFU/ml;10 mM MgSO4、5 mM CaCl2で処理済)にファージ溶解物の各々を感染させた。30℃において30分間インキュベーションした後、感染物を選択培地で培養し、抗生物質耐性コロニーを計数した。値は抗生物質耐性コロニー数±標準誤差、n=6を示す。
【0250】
さらに、ファージに基づく送達系は、P1およびλなどの定住ファージまたは適合性プラスミドによってブロックされない。自然の生態系(湖沼の水、土砂、土壌および汚水)における緑膿菌株の40%が、ファージゲノムに相同なDNA配列を含有することを環境試料の分析が示唆しているので、これは重要である。バクテリオファージに基づく系は、感染症のマウス腹膜炎モデルにおいて大腸菌および緑膿菌に対する抗生物質マーカーを発現する伝達プラスミドを送達することによって、インビボにおいて遺伝情報を導入するのに有用である。プラスミド導入は、腹腔内腔から回収した細菌から単離したプラスミドDNAの制限分析および配列決定によって確認した。インビボにおける導入の証明も得られた。
【0251】
伝達プラスミドをパッケージングすることができるが、P1 DNAを組み込むことができないバクテリオファージP1ノックアウトの開発
未改変のファージを送達媒体として使用する理由は、溶原化変換のリスクの可能性があるからである。伝達プラスミドを標的細菌に送達することができるが、自身のDNAを標的細菌に送達できないバクテリオファージ送達ベクターを開発するために、改変されたP1ファージを開発した。
【0252】
図8に示すように、P1ファージ前駆体DNAを改変して、pac部位ノックアウトを作製した。破壊カセットは、P1ファージ前駆体と相同な配列が隣接した栄養マーカーまたは抗生物質マーカーを含有する。鎖状断片は、ホスホロチオエート基を導入することによってエキソヌクレアーゼの結合から保護した。インビトロにおいて改変した配列とP1ファージ前駆体との間のダブルクロスオーバー事象によりpac部位が欠損し、選択マーカーが獲得される。このノックアウトの機能は、自身のDNAを標的細菌にパッケージングまたは導入するP1バクテリオファージの能力を阻止する働きをする。
【0253】
図9に示すように、改変されたP1は、ゲノムに結合するクロラムフェニコールマーカーを導入することができず、pac突然変異体から作製されるファージ粒子はファージDNAを欠損していることを示唆している。図9の上のパネルは、pac部位に破壊カセットを組み込むことによるP1ファージ前駆体の物理的マップと予測されるP1ノックアウトとを示す。矢印は、P1 pac部位のS. cerevisiae TRP1遺伝子との置換を証明するために使用されるPCRプライマーの位置を示す。ゲルは、P1特異的プライマーを使用したPCRの産物(1、3、5および6)ならびに野生型P1ファージ前駆体またはP1ノックアウトを検出するための破壊カセット特異的プライマー(2および4)を示す。プライマー1および3は、破壊カセットのP1配列内に結合しないので、プライマー1+2および3+4だけによるPCRは、pac部位のS. cerevisiae TRP1遺伝子との置換を生ずる特定の組み込み事象を検出する。
【0254】
pac部位がpacABCオペロン内に存在している結果として、改変されたファージは、pacase酵素とトランス相補性である必要があった。pacABC相補プラスミドの構成を示す(図10および表5)。
【0255】
【表5】pacABC相補プラスミドの構成
【0256】
P1 pacABCは、早期プロモーターPr94から発現した。タンパク質、C1リプレッサーおよびBof修飾因子をコードした2つのファージを使用して、Pr94プロモーターからの発現を調節した。Bof単独はDNAに結合しないが、C1と一体として、リプレッサー−オペレーター相互作用の効率を増加した。c1リプレッサーはclts 100突然変異を有するので、温度感受性であった。これにより、pacABC遺伝子へのファージの 溶菌サイクル中の同調発現が可能になった。
【0257】
相補プラスミドにより、P1 pac突然変異体は伝達プラスミドをパッケージングするが、自身のウイルスDNAをパッケージングしない。pacase酵素との相補性により、P1 pac突然変異は伝達プラスミドをパッケージングするが、pac突然変異体から作製されるファージ粒子の一部はP1ウイルスDNAを含有した。クロラムフェニコール耐性形質導入体の分析は、大多数が2回目の増殖を生じることができいことを示し、それらは欠陥溶原菌であることを示唆している。pac突然変異体は、相補プラスミドとの組換えによってpac部位を獲得し、それによって突然変異体は自身のウイルスDNAをパッケージングし、送達することができると思われた。
【0258】
サザンブロット分析は、相補プラスミドのpacABC遺伝子がScTRP1破壊コピーで置換されていることを証明した(図11)。詳細には、伝達プラスミドおよびpac ABC相補プラスミドを保有するP1突然変異溶原ファージを32℃において増殖し、6時間ごとに新鮮な培地で1:100希釈した。1日、2日、3日、4日および5日目にDANを抽出し、Hind IIIで消化し、高ストリンジェンシー条件下においてScTRP1 EcoR1−BamH1断片で探索した。
【0259】
伝達プラスミドと改変されたP1ファージゲノムとの間の組換え事象によって、機能的(pacABC pac酵素の再構成を防止するために、図12に示すように、サイレント突然変異を相補プラスミドに導入した。相補プラスミドpac部位サイレント突然変異により、組換えが生じた場合でも、欠陥pac部位が生じ、欠陥pac部位はP1pacノックアウトに確実に導入された(図12)。162 bpのpac部位は、pac切断およびP1パッケージングを促進するのに十分である。HEX4およびHEX3ドメインを有するヘキサヌクレオチドエレメントの位置は□で示す。IHF結合部位、コンセンサス配列
を示す。pac切断の調節は5’側GATC部位のアデニンのメチル化に関係する。pac部位に導入されるサイレント突然変異は下側の活字ケースの文字で示される。
【0260】
P1ビリオンによる治療薬のインビボ送達
表6に掲載した5匹の動物モデル全てを本明細書において例示する。LD50は、大腸菌および緑膿菌の腹膜炎モデルにおいて確立されており、必要な菌量は多い(107〜108細菌細胞/動物)。さらに、マウスにおけるシュードモナス感染症の嚢胞性繊維症モデルは、この疾患に特徴的な日和見肺感染症を治療するための、本発明の毒性剤および方法の効率を証明するために使用される。
【0261】
【表6】原核細胞による遺伝子治療の動物モデル
【0262】
腹膜炎モデル
本発明の伝達プラスミドは、マウス腹膜炎モデルにおいてインビボで大腸菌およびシュードモナスにP1送達系を用いて送達した。移入は、腹腔内腔から回収した細菌からプラスミドを単離し、回収したプラスミドの制限分析によって確認した。結果は、本発明の送達媒体は、感染患者に毒性を生ずることなく、細菌標的に本発明の毒性剤を送達することができることを証明している。
【0263】
インビボにおけるファージに対する免疫応答およびファージ除去動態も検討した。結果は、マウスあたり2×109の溶原ファージ形成単位(lfu)のP1ファージを1回注射すると、8〜14日後に抗ファージ抗体が形成されたことを示している。2群のマウス4匹に、2×109lfuの長期循環型(long−circulating)P1ファージを腹腔内(IP)注射した。抹消血は、注射後1時間、4時間、8時間および24時間経過時にテールクリップによって採取し、大腸菌C600標的細胞で滴定した。以前にファージを投与した群は、この実験の18日前に、等量の同じファージ調製物を腹腔内投与した。プレ免疫群は事前処置を行わなかった。これにより、インビボにおいてファージが迅速に除去された(図13)。しかし、ヒトでの治療を考慮すると、多数の感染患者(特にシュードモナス感染患者)は免疫寛容状態であり、強力な免疫応答を形成することができない。従って、本発明の治療および組成物は、このようなヒト対象に特に有用である。
【0264】
また、P1の長期循環型変種は、マウスによる継代によって選択され、注射後24および30時間経過時には循環液中に残存するファージは200倍多い(図14)。6匹のマウスの群に5×108 lfuのファージまたは5×108 lfuの長期循環型P1ファージを腹腔内注射した。注射後1、6、24および30時間経過時にテールクリップによって抹消血を採取し、大腸菌C600標的細胞で滴定した。各時間経過時において血液1 mlあたり残存する生きているファージの数を図14に示す。循環液中に持続する改善の倍数は表の最後の欄に示す(lfu長期間循環型P1ファージ/lfu元のP1ファージ)。従って、長期間循環型P1は本発明の範囲内である。高い濃度のファージが感染患者の循環液中に望ましい場合には、このような変種は特に好ましい。例えば、対象が血中の病原菌または細菌感染症を有する場合にはそれが望ましい。
【0265】
孵化(embryonated)鶏卵モデル
P1送達媒体によって送達される毒性剤の効率を証明するために、感染の孵化鶏卵モデルを報告されているプロトコールから改良した。外見的には、Hartl, A.ら(1997、「孵化鶏卵における緑膿菌感染(Pseudomonas aeruginosa infection in embryonated hen’s eggs)」、Arzneim.−Forsch. 47(II): 1061−1064)のモデルを、卵をインキュベーションし、卵殻に穴をあけて、投与を実施するように改良した。簡単に説明すると、卵は、広い方の極を上にした垂直位置でインキュベーションし、4日ごとに90度の弧で自動的に回転させた。殻は、接着剤で殻を補強し、はさみで丸い局をテープと殻を切断することによって広い方の局から開けた(開口部径約1cm)。下層の卵殻膜を滅菌水で湿らせ、滅菌したピンセットで1 cm2の卵殻膜をはがし、透明な漿尿膜(CAM)を露出させる。水分が損失しないように接着テープで卵殻を密閉して、インキュベーションを18〜24時間継続した。その時点においてキャンドリング(明るい光源の前に卵を置くことによって胚を観察すること)によって生存度を評価した。自然な動きが観察されれば生存の証拠である。細菌懸濁液をCAMにピペットで適用することによって、生きている卵に接種した。治療薬をCAMにピペットで適用するか、またはシリンジで卵殻の他の位置から注射した。卵殻の開口部をテープで密封して、インキュベーションを継続し、上記のキャンドリングによって生存度を評点した。細菌およびファージは、卵殻に作製した開口部から卵に導入し、次いで密封し、孵卵(gestation)を継続した。
【0266】
インビボ系として種々の利点を有する孵化鶏卵モデルは上記のように確立した。詳細には、卵モデルは非常に低いLD50しか必要とせず(緑膿菌では<10 cfu/卵および毒性株の大腸菌では>50 cfu/卵)、卵モデルはまた迅速で、自己充足しており、未成熟免疫系を提供する。大腸菌および緑膿菌(PA01)のヒト臨床単離株は、非常に低い細菌量でも(100〜1000細胞)このモデルに致死的な感染症を常にもたらし、治療薬を証明することができる。これらのテストは、docなどの毒性剤のインビボにおける効果を示す。
【0267】
本発明の送達媒体が伝達プラスミドをインビボにおいて送達する能力を証明するために、カナマイシン耐性遺伝子を保有する伝達プラスミドを大腸菌および緑膿菌にインビボにおいてマウスおよび孵化鶏卵に送達した。結果は、P1系による毒性剤の送達がインビボにおいて成功していることを示した。
【0268】
緑膿菌鶏卵モデル
ニワトリ胚へのインビボにおけるプラスミド移入:孵化鶏卵を使用して、インビボにおいて伝達プラスミドpBHRをP1ファージによって細菌細胞に送達した。詳細には、孵化鶏卵6個の群に、孵卵10日目の漿尿膜を介して細菌およびファージを接種した。P1溶原ファージは、doc遺伝子をコードする伝達プラスミド、pDocを保有する。このファージ調製物は、p1 DNAまたはpDocを含有する粒子の混合物であった。ファージ溶解産物は、pDoc含有粒子に対するP1含有ファージ粒子の比が約99:1であった。
【0269】
結果は、ヒト臨床緑膿菌PA01を接種した直後にP1またはP1−pDoc溶解産物を加えたとき、卵の生存率が増加したことを証明した(図15)。
【0270】
大腸菌鶏卵モデル:
P1 DNAによる形質導入に不応である大腸菌のヒト臨床単離株は孵化鶏卵において致死的な感染症を生ずることが見出されている。この単離株はEC−4と命名され、2つの理由により重要である。第一には、この株は安定なP1溶原ファージを形成できず、doc保有ファージ調製物によるEC−4細胞の死滅は、毒性剤docの致死的な活性を証明した。
【0271】
詳細には、P1−pDoc溶解産物は、P1−pBHRファージ単独より効率的にEC−4大腸菌をインビトロにおいて死滅させた(図16参照)。詳細には、図16に示す感染多重度(MOI)で、毒性剤doc(P1−pDoc)を含有するファージまたは対照の伝達プラスミドpBHR(P1−pBHR)でEC−4細胞(500 cfu)を処理し、非選択培地で培養し、緩衝液単独で処理した生細胞の割合として計数した。結果は、毒性剤docは、大腸菌EC−4の適応を低下させ、病原菌の死滅を増加することができた。また、大腸菌の死滅はインビトロにおいてP1の50〜700のMOIで確認され、docは、5〜7のMOI、すなわち、総P1粒子の1%で大腸菌を死滅することができた(図16)。
【0272】
第2に、地元の病院の臨床単離株のランダム試料にこの株が存在することは、溶菌性ファージに抵抗性であるが、毒性剤ファージ送達系に感受性である病原菌株ヒト集団中にが存在することを証明した。詳細には、以下の表7に示すように、大腸菌の3つの臨床単離株を、P1 DNAで形質導入される能力(クロラムフェニコール耐性の獲得で示される)および伝達プラスミドDNAで形質される能力(カナマイシン耐性の獲得で示される)について、大腸菌の実験株C600を比較した。3つの臨床単離株は全て伝達プラスミドで形質導入されたが、2つだけがP1で溶原性になった。これらの結果は、ファージ抵抗性機序はP1 ウイルスDNAの形質導入を抑制しており、伝達プラスミドのEC−4細胞への送達を抑制できなかったことを示している。
【0273】
【表7】臨床単離株−P1形質導入の感受性
【0274】
さらに、2×103のEC−4細胞による感染は、P1の700〜800MOIで、細菌を接種した直後に投与したP1−pDoc溶解産物治療により卵内で治癒された(ビリオンを含有するdocは総ファージ粒子の1%である)(図17)。詳細には、7つの孵化鶏卵群に、孵卵10日目に、漿尿膜を介して細菌およびファージを接種した。p1−pDocファージは、pDocを有するP1溶原ファージ、doc遺伝子をコードする伝達プラスミドまたは対照の伝達プラスミドpBHRから作製した。このファージ調製物は、P1 DNAまたはpDocを含有するビリオンの混合物である。ファージ溶解産物は、pDocを含有する粒子に対するP1を含有するファージ粒子の比が約99:1であった。これらの結果は、病原菌感染症が、P1送達媒体を介するdocなどの、本発明の治療薬によって根絶されることを示している。
【0275】
哺乳類動物モデル
3匹のマウスおよびラットモデルを使用して、本発明の毒性剤の効果を証明した。各モデルは、免疫寛容で、次いで細菌を投与される動物を使用する。モデルは、細菌投与経路および免疫障害を生じる手段が異なる。
【0276】
2つのモデルにおいて、免疫障害は火傷モデルに形成する。詳細には、ヒトまたは他の動物の全体表面積の10〜20%の火傷により、10〜14日継続し、免疫系のほぼ全ての支流に関係する、ある期間の免疫障害を生じる。緑膿菌による実験的感染症のために文献において十分に記載されている2つの火傷モデル(例えば、J.P. Waymackら、1988、「複数の敗血性動物モデルにおける免疫調節物質としてのシクロホスファミドの評価(An evaluation of cyclophosphamide as an immunomodulator in multiple septic animal models)」、J. Burns and Clinical Rehabilitation 9(3): 271−274を参照、また、Stieritz, D. D.およびHolder, I. A.、1975、「緑膿菌による感染の病原性の実験的研究:火傷マウスモデルの記述(Experimental Studies of the pathogenesis of infections due to Pseudomonas aeruginosa: Description of a burned mouse model)」、J. Infect. Dis. 131(6): 688−691も参照 )を使用して、この種類の創傷に生じる種類の感染症に対する毒性剤治療薬の有効性を証明した。
【0277】
第3のモデルは、胃腸管の内因性微生物叢が体腔に侵入して、敗血症を生じる、免疫寛容状態(白血球減少症)を生ずる生物修飾因子シクロホスファミドを使用する。この種類の敗血症は免疫不全患者において記載されている(Furuyaら、1993、「多様な源からの緑膿菌分離株によって生じるマウス内在性敗血症における死亡率(Mortality rates amongst mice endogenous septicemia caused by Pseudomonas aeruginosa isolates from various sources)」、J. Medical Microbiology 39: 141146; Woodsら、1997、「好中球減少マウスにおける病原性と臨床および環境的単離株からの緑膿菌ビルレンス因子との相関(Correlation of Pseudomonas aeruginosa virulence factors from clinical and environmental isolates with pathogenicity in the neutropenic mouse)」、Can. J. Microbiol. 43: 541−551参照)。
【0278】
モデル1:成体マウス、背面火傷、創傷表面への細菌投与
第1の使用モデルは、Strieritz, D. D. およびHolderm I. A. のものである(1975、J. Infect. Dis. 13(6): 688−691);また、Neely, A. N. and Holder, I. A.、1996、「敗血性宿主における抗菌誘導性内毒素の放出の研究に関連する臨床局面でのマウスモデル(A murine model with aspects of clinical relevance for the study of antibiotic−induced endotoxin release in septic hosts)」、J. Endotoxin Research 3: 229−235.も参照)。若い成体雌マウス、22〜25g、ICR株(または、Balb/c、CD1、C3HEB/FeJ、C3H/HeJ、C57BL/6、DBA/2、A/J、CBA、C3H/HeNの場合もある)をペントバルビトール(pentobarbitol)で麻酔し、背面を剃毛した。1×1.5インチの開口部を有する耐熱性プラスチックカードを剃毛した背中に配置し、0.5mlのエタノールを露出した皮膚にピペットで適用し、10秒間焼いた。炎を消し、腹腔内注射(IP)により、1〜2mlの生理食塩液を補液としてマウスに投与した。この手法は、22〜25gのマウスの体表面積の12〜15%を覆う、非致死的で中間層熱傷を生ずる(NeelyおよびHolder、1996、上記)。火傷の1時間後、マウスに鎮痛性を与えた後(ブプレノルフィン2mg/kg,IM)、少量の細菌(100 cfuの緑膿菌)を0.1 mlの生理食塩液に加えたものを創傷に皮下注射した。毒性剤治療薬または偽薬を、病原菌投与1時間後または直前に、同じ部位に同時に投与(生理食塩液に加えたもの0.1 ml)するか、またはIP注射した(生理食塩液に加えたもの0.5ml以下)。動物は敗血症について観察し、12時間を越えない間隔で疼痛の治療を行った(ブプレノルフィン 2mg/kg、IM)。通常の食餌および水は随時与えた。死亡は、約48時間以内に未処理の火傷群において予期される。12〜24時間間隔で、尾静脈採血により血液試料(10〜25 ul)を採取して細菌負荷をモニターした。死亡時または安楽死時に血液および器官を採取し、細菌負荷をモニターし、緑膿菌敗血症による死亡または処理動物における感染症の除去を確認する。
【0279】
モデル2:成体マウス、背面火傷、IPまたは創傷表面への細菌投与
第2のモデルは、Waymackら、(J.P. Waymack, G.D. Warden, J. W. Alexander, P. M.およびS. Gorne.、1988、「複数の敗血性動物モデルにおける免疫調節物質としてのシクロホスファミドの評価(An evaluation of cyclophosphamide as an immunomodulator in multiple septic animal models)」、J. Burns and Clinical Rehabilitation 9(3): 271−274)。若い雄Lewisラット(100〜125g)をペントバルビトール(pentobarbitol)(〜40mg/kg)を腹腔内注射して麻酔し、背面を剃毛した。剃毛した領域(総体表面積の20%)を露出している耐熱性鋳型に動物を押し付けた。この鋳型を10秒間95℃の水浴に漬けた。水浴を除去後、体液維持療法のために(循環血液量の約1/2が推奨される)、動物に5〜10 mlのリンガー乳酸(Ringer’s Lactate)液を投与し、鎮痛作用のためにブプレノルフィン(0.1〜0.5mg/kg、12時間ごと)を投与した。この傷害は全層皮膚火傷で、さらに傷害がない場合には死亡率は0であると報告されている。50%致死量の細菌投与(1×108 cfuの緑膿菌を0.5mlの生理食塩液に加えたもの)を火傷から4日目に腹腔内注射によって、または火傷から1日目に細菌懸濁液を塗布することによって実施した。腹腔内感染経路は24時間以内に(すなわち、火傷から5日目)敗血症を生じ、火傷から12日目までには全動物が死亡することが報告されている。従って、腹腔内注射の証明は火傷から12日目に終了することができる。火傷部位へのシュードモナスの塗布は、接種後7〜8日で敗血症を生じることが報告されており(火傷から8〜9日目)、生存率は20日目までは安定である。この方法を実施した動物は火傷から21日目に安楽死させる。通常の食餌および水は随時与えた。一部の動物は、火傷領域への局所投与または腹腔内注射によって投与する本発明の治療薬(毒性剤をコードする伝達プラスミドを含むP1ファージ)で治療する。血液試料(50〜100 ul)をペントバルビトール(pentobarbitol)麻酔したラットの眼窩後方採血によって12〜24時間間隔で採血して、細菌負荷をモニターすることができる。死亡時または安楽死時に血液および器官を採取して、細菌負荷をモニターし、緑膿菌敗血症による死亡を確認する。
【0280】
モデル3:成体マウス、抗生物質およびシクロホスファミドの注射、経口細菌投与
これは、Furuyaらの内因性敗血症のモデルである(Furuya, N.、Hirakata, Y.、Tomono, K.、Matsumono, T.、Tateda, K.、Kaku, M.およびYamaguchi, K.、1993、「多様な源からの緑膿菌分離株によって生じるマウス内在性敗血症における死亡率(Mortality rates amongst mice with endogenous septicemia caused by Pseudomonas aeruginoza isolates from various sources)」、J. Medical Microbiology 39: 141−146)。体重20〜25gのマウスを滅菌環境で飼育し(例えば、隔離箱)、滅菌した食餌および水を与えた。アンピシリンナトリウム(200mg/kg)を1日目および2日目に腹腔内注射して、通常の腸内細菌叢を妨害し、緑膿菌によるコロニー形成を助ける。シクロホスファミドを6日目および9日目に腹腔内注射した(250mg/kg)。この投与量は、感染症が存在しない場合に致死させることなく白血球減少症を誘発する。2〜4日目に飲料水中に混入させて細菌をマウスに投与する。本発明の治療薬による治療(毒性剤をコードする伝達プラスミドを含むP1ファージ)を9日目に開始し、腹腔内注射により投与する。細菌投与前および感染期間中種々の間隔で糞ペレットを回収し、緑膿菌の有無をモニターする。敗血症の発症は、シクロホスファミドの2回目の投与の24〜48日後であると予期され(11日目)、約80%の死亡率が14日目までに予期される。尾静脈採血によって採取される血液試料も、4日目以降12〜24時間間隔で採血することができる。または、最終のシクロホスファミド注射後その日に腹腔内注射によって細菌を導入することによってアンピシリンの注射を行わなくてもよい(Woods, D.E.、Lam, J. S.、Paranchych, D.P.、Speert, D.P.、Campbell, M.およびGodfrey, A. J.、1997、「好中球減少マウスにおける病原性と臨床および環境的単離株からの緑膿菌ビルレンス因子との相関(Correlation of Pseudomonas aerginosa virulence factors from clinical and environmental isolates with pathogenicity in the neutropenic mouse)」、Can. J. Microbiol. 43: 541−551)。
【0281】
【表8】マウスモデルに使用した、以下の様式での治療用製剤
総動物数:112匹のマウス/モデル×2モデル=224匹のマウス
【0282】
【表9】用量依存の証明は以下のように実施される
総動物数:36匹のマウス/モデル/薬剤×8薬剤×2モデル=576匹のマウス
【0283】
【表10】以下の様式での治療用製剤をラットモデルに使用する
総動物数:36匹のマウス/薬剤×8薬剤=278匹のマウス
【0284】
動物による証明の結果は、本発明の毒性剤を含むファージ治療薬は、対象の細菌感染症を治療するのに好適である。ウシ、ブタ、コヒツジ、モルモット、ウサギ等を含むが、これらに限定されない、当技術上周知の他の動物モデルも本発明の範囲内である。本発明の好ましい局面において、本発明の治療薬を必要とする対象は、火傷傷害を有する哺乳類である。
【0285】
嚢胞性繊維症のマウスモデルにおける日和見感染症の治療
本発明の毒性剤は、嚢胞性繊維症に関連する感染症などの細菌感染症の治療に有用である。本発明の利用性(unility)の証明として、ヒト嚢胞性繊維症(CF)患者に見られる種類の感染症に類似している、シュードモナス呼吸器感染症のマウスモデルを使用する。このモデルは、cftr遺伝子のDF508突然変異(C57BL/6DF508マウス)およびそれらの野生型(C57BL/6マウス)またはcftr突然変異のないBALB/c成体マウス(6〜8週齢)を使用する。DF508突然変異は、ヒトCF患者に見られる最も一般的な突然変異の1つであり、C57BL/6DF508マウスはこの疾患を有する患者に似た症状を多数有する。離乳後、cftr突然変異によるこれらのマウスに共通する致命的腸閉塞を予防するために、DF508 cftr同型接合突然変異体はペプタミン(Peptamin)液状飼料(Clintec Nutrition Co.、Deerfield、MI)およびゴリテリ(golytely)を含有する水で飼育管理しなければならない(Zaidai, T. S.ら、1999 「緑膿菌の角膜上皮細胞摂取を正常に介する嚢胞性線維症の膜コンダクタンスは実験マウス角膜炎の病原性において鍵となる要素である(Cystic fibrosis transmembrane conductance regular−mediated corneal epithelial cell ingestion of Pseudomonas aerginosa is a key component in the pathogenesis of experimental murine keratitis)」、Infection and Immunity 67(3): 1481−1492参照)。C57BL/6DF508マウスが入手できない場合には、BALB/cマウスを使用することもできる。
【0286】
実験手法は以下のとおりである(例えば、Pier, G. B.ら、1996、「肺感染に対する嚢胞性線維症患者の過感受性における突然変異体CFTRの役割(Role of mutant CFTR in hypersusceptibity of cystic fibrosis patients to lung infections)」、Science 271: 64−7参照)。成体マウスを、塩酸ケタミン(65 mg/kg)およびキシラジン(13mg/kg)の調製直後の混合物を腹腔内注射することによって麻酔する。次いで、マウスを立位で保定し、10 ulの細菌懸濁液を各鼻孔に入れる(総量20 ul)。マウスの意識を回復させ、72時間まで生存を観察するか、または種々の組織、特に肺における細菌負荷を求めるために、感染後24時間までの種々の経過時間においてCO2過剰投与によって屠殺する。麻酔は感染手法の必要な部分である。無麻酔のマウスは、効率的に接種物を吸引することができず、感染しない。本発明の1つ以上の毒性剤を含む治療用ファージは、例えば、鼻腔内、静脈内または腹腔内投与する。本発明の治療薬を投与されたマウスは、未処理の対照マウスより長く生存する。従って、本発明の毒性剤は、感染症を改善または根絶する目的のために、病原菌(例えば、細菌)感染症を有する対象に送達することができる。
【0287】
8. 実施例:毒性剤としてのSOFセンスの構築および特徴づけ
毒性剤がリボザイムカセットを使用して送達されて発現されることを証明するために、本発明者らは、Sofと呼ばれる必須分子に対して向かう毒性剤を操作し、細菌細胞を死滅させるために、細菌細胞にリボザイムカセット内の毒性剤を送達する。
【0288】
本明細書で上述のように、毒性剤は、病原菌または選択された細胞の必須分子を標的とするように設計されている分子であってもよい。細菌の必須アンチセンス分子の一例はSofである。Sofは、gefと呼ばれる染色体によりコードされる毒素のアンチセンス解毒剤である。Sofは、通常、病原菌のgefレベルを調節する作用をし、従ってgefの存在下において細胞は生存することができる。本発明の発明者らは、Sofに相補的なセンス分子を設計した。Sofに対するセンス分子は、Sofがgefを調節する能力を阻止する作用をすると、内因性gefレベルを細菌にとって毒性にすることによって、病原菌内に毒性をもたらした。
【0289】
詳細には、Sofセンスをトリプルリボザイムカセット内に構築した(5’側および3’側シス作用性リボザイム)。Sofセンス毒性剤を含有するリボザイムカセットをLEASHIプロモーターに結合した。リボザイムカセットをコードする核酸を使用して大腸菌を形質転換した。細菌細胞をLB Amp+IPTGで培養した。プレートは37℃において終夜インキュベーションした。次いで、形質転換体の存在、コロニーのサイズ、増殖速度および形態的な差についてプレートを計測した。
【0290】
これらの検討の結果は、リボザイムカセットからのSofセンス分子の発現により標的細菌に毒性作用を生ずることを示した。
【0291】
9. 実施例:リボザイムおよびリボザイムカセット
本発明の方法に特に有用なリボザイムカセットは、以下を含むが、これらに限定されない:
【0292】
pClip(図19に記載する遺伝子エレメント)は、示すカセットがpBluescriptのNotI部位にあるpBluescriptの改変体である。毒性剤またはトランス作用性リボザイムをBgl II部位(TGCTCT)に構築する。真核細胞に送達されるとき、pClipからの内部リボザイムまたは毒性剤の遊離により、核に約20%および細胞質に80%の毒性剤またはリボザイムが分布される。pClipはまた原核細胞を標的とするために使用される。
【0293】
本発明の方法に関連して有用な第2のリボザイムカセット/ベクターはpChopである。pChopは、内部トランス作用性リボザイムまたは毒性をより効率的および効果的に遊離させるために、pClipから改変されている。pChopリボザイムカセットを図20に示す。真核細胞に送達されたとき、pChopから内部触媒中心リボザイムが遊離すると、核に局在化する。
【0294】
本発明の方法に関連して有用な第3のリボザイムカセットはpSnipである。pSnipマルチリボザイムは、pChopの5’側にpClipカセットを操作することによって構築される。また、pSnipマルチリボザイムは、各カセットにトランス作用性リボザイムまたは毒性剤を有する触媒中心配列を含有する。トランス作用性リボザイムまたは毒性剤の各ペアは短いスペーサーによって結合され、ペアの3’側に位置するヘアピンループによって安定化される。図21は、pSnipカセットの略図である。
【0295】
トランス作用性リボザイムまたはアンチセンス毒性は、アニーリングされたとき、2つのシス作用性リボザイム間の領域に含有される制限エンドヌクレアーゼにより消化することによって作製されるものと同一の1本鎖末端を形成するように消化される逆相補重複オリゴデオキシヌクレオチドとして合成される。この特定の実施例において、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、Bgl IIによって認識されるものである。本質的に全てのRNAを標的とすることができ、特異性は、標的とされるRNA分子の選択された切断部位に隣接する配列に逆方向または相補性であるリボザイムの配列を選択することによって与えられる。次いで、毒性剤またはトランス作用性リボザイムをダブルリボザイムカセット内のクローニング領域(ポリリンカー)内にクローニングして、標的とする毒性剤またはリボザイムを作製する。大腸菌 secA、(EcosecA、AE000119 U00096)、 geneX(EcosecA、AE000119 U00096)ftsZ(AE000119;U00096)、dnaG(AE000388 U00096)、rpoA(AE000407 U00096)およびtRNA−asp(X14007)、ストレプトマイセス・リビデンス(Streptomyces lividins) secA(Z50195)、エンテロコッカス・フェーカリス ftsZ(U94707)シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)dnaG(U85774)、ストレプトマイセス・ケリコロール(Streptomyces coelicolor) rpoA(X92107)、スタヒロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)tRNA−Asp(X66089S42075)、ブドウ球菌(Staphylococcus)RNAIIIを含むが、これらに限定されない原核細胞の配列を標的とするトランス作用性リボザイムが構成されている。
【0296】
真核細胞の配列を用いる設計を使用して、a)反復B2転写物(B2);b)RNAポリメラーゼI(po1I);c)B型肝炎ウイルス(HBV);d)ソニックヘッジホッグ(SH)e)ヒトパピローマウイルスE6/E7タンパク質(HPV);f)RNAポリメラーゼII(polII)、g)インスリン様増殖因子1(IGF1);h) 網膜芽細胞腫タンパク質(RB);i)およびj)多触媒性プロテイナーゼαサブユニットC3およびC9(それぞれ、C3およびC9);k)テロメラーゼ(tel);l)形質転換増殖因子β(TGFβ)、m)カタラーゼ(CAT);n) ペルオキシソーム増殖結合受容体(PpaTα);ならびにo)チトクロームP450 1E1(p4501E1);KiSS−1、NudC、アンドロゲン受容体およびSF−1転写因子も評価した。標的RNA(遺伝子座の名称およびアクセッション番号)ならびに選択された標的部位を示す(表11)。
【0297】
【表11】標的とされたRNAおよび標的部位の要約
【0298】
【表12】ライブラリー選択によるHPV E6/E7標的RNAの同定される部位
【0299】
【表13】ライブラリー選択により同定されるHBV RNA上の部位
ヌクレオチドトリプレットおよび部位
* X75664、X75657、X75665、X75663およびX75658を含むが、これらに限定されない。
# X75664、X75657、X75656およびX75665を含むが、これらに限定されない。
【0300】
HBV、Pol IおよびPTEN mRNAの特定の標的部位に向かうリボザイムを構築し、表XおよびYに掲載する。表Xに関しては、接頭語「Rz−」の次の数は関連するmRNAの切断部位を示す。表Yは、標的部位に結合するリボザイムのRNA配列に相当する隣接配列を同定している。これらの隣接配列は触媒中心の5’側および3’側に見られ、配列
(配列番号)を有する。本発明のトリプルリボザイムのシスエレメントは開示されている関連のベクターに見られる。好ましい態様において、2つのリボザイム(同一または異なる)を、両者の間に短い(3〜15 nt)リンカーを入れて組み合わせることができる。
【0301】
1回の代謝回転条件を使用して、sRzおよびmRzの触媒活性を求めた。少量の[32P]で標識した標的RNAを5 mM MgCl2、20 mM Tris−HCl( pH 7.4)において37℃において40または200 nM Rzと共に30分間インキュベーションし、切断産物を変性性PAGEで分離した(HBV標的Rzsのインビトロ切断結果は図23および24参照)。sRzのうち3つは、30分間の切断反応中、「高い」活性を示し、40 nM Rzを使用したとき標的RNAの39〜44%を切断し、200 nM Rzを使用したとき標的RNAの48〜71%を切断した。sRzの1つおよびmRzの1つは、「中程度」活性を示し、それらは40 nM Rzにおいて標的RNAの8〜10%または200 nMにおいて10〜15%を切断する。別のmRzは不活性であった。追加の実験において、Rz濃度を1.6 nMに低下しても、活性が高い3つのsRzの切断産物がPAGEにより見られた(データは示していない)。全体として、sRzの92%が効率的な活性レベルを示し、54%は活性が高く、38%は活性が中程度であった。一方、mRzはどれも活性が高くなく、50%は中程度または低い活性を示し、50%は不活性であった(表X)。
【0302】
【表X】Rzの相対的な触媒活性の要約
【0303】
動態分析では、40 nM Rzおよび1〜100 nMの標的RNAを種々の期間インキュベーションして、1回および多数回の代謝回転条件下の動態データを得た。HBV標的sRzの結果(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図10)は、26 nMのKmおよび1×106(M−1分−1)のKcat/Kmを示した。他のsRzの同様の分析は0.6×106(M−1分−1)のKcat/Km値を示した。比較すると、これらの標的および他の標的に対するmRzで得られたKcat/Km値は(Benedictら、1998、Carcinogenesis 19: 1223−1230、Renら、1999、Gene Ther. Mol. Biol. 3:257−269、およびCroneら、1999、Hepatology 29: 1114−1123)は、典型的には、1オーダー程度低い。
【0304】
細胞においてsRzの有効性を試験するために、HBV DNA(それらはウイルスに直接感染できない)をトランスフェクションさせた後、HBV複製および分泌を支持することができるHepG2細胞(ヒト肝芽腫細胞系統)を使用した。HepG2細胞に、CLIP TripleリボザイムカセットのHBV DNA構築物およびHBV標的sRzを同時トランスフェクトした(Benedictら、1998、Carcinogenesis 19: 1223−1230、Renら、1999、Gene Ther. Mol. Biol. 3: 257−269、およびCroneら、1999、Hepatology 29: 1114−1123)。CLIPカセットは、HBVを標的とする内部トランス作用性Rzに隣接する2つのシス作用性Rzをコードする。2つのシス作用性Rzは、一次転写物から自身を放出して、最小非特異的隣接配列を有するトランス作用性内部ハンマーヘッドRzを遊離する機能を有し、この過程は重大な利点となる。
【0305】
HBV構築物およびTrz構築物をHepG2細胞に同時トランスフェクトし、HBV複製に対するsRzを影響について培養物を分析した。sRz777またはsRz885を含有するCLIP構築物をトランスフェクションした後4日および5日経過時に、HBV分泌の劇的な阻止が観察され(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルC)、同時に、HbsAg分泌の阻止(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルD)およびHBV RNA標的転写物の顕著な低下(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、それぞれパネルAおよびB)も観察された。sRz777およびsRz885の標的部位は、3つの主要なHBV転写物全てが標的とされる位置に配置される。比較のために、5’側隣接配列にヌクレオチド置換を含有するmRz408 CLIP構築物も使用した。このRzは、「中程度の活性」を示し、sRz408の速度の約20%の速度でHBV標的を切断し(示していない)、その活性はmRz247に相当する。mRz408CLIP構築物は、HBV複製を遮断する際に有効ではなかった(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルA−D)。また、mFold選択部位へのCLIP構築物標的は、この系ではHBVに対する活性がないことを示した(データは示していない)。
【0306】
777および885 CLIP構築物を用いた2つの追加の反復実験も、HBVの分泌の顕著な低下を示したが(参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルE)、HbsAg分泌およびHBV RNA転写物の低下はばらつきが大きかった。関連の実験において、別のHBVリボザイム、pCHOPベクターのシスエレメントから遊離されるとき、配列
(配列番号:)を有するHBV Rz881は、リポソームに複合体形成して(Templetonら、1997)、腹腔内注射するとき、マウス肝臓細胞からのHBV分泌およびマウス肝臓細胞におけるHBV複製を低下することが示されている。
【0307】
要約すると、HBVを標的とする選択されたRzも、HBV複製の細胞培養モデルにおいて有効であることが示されている。
【0308】
【表Y】リボザイム隣接配列
【0309】
材料と方法
インビトロにおける切断試験
ガイド−RNAライブラリーの作成について記載されているT7(HBVおよびPolI)またはSp6(PTEN)ポリメラーゼを使用して、個別の部位を標的とするRzを2本鎖DNAオリゴヌクレオチドから転写した。Rzの標準的なスクリーニングでは、インキュベーションは少量の[32P]標識標的RNA、40 nM Rz RNAを含有し、37℃において、20 mM Tris−HCl(pH 7.4)、5 mM MgCl2中で30分間(または2時間)実施した。インキュベーション後、試料を尿素ポリアクリルアミドゲルで分離し、次いでゲルを乾燥し、Phosphor−Imagerを使用して放射能を分析した。
【0310】
動的分析では、少量の[32P]標識標的RNAを未標識標的RNA(最終濃度1、10または100 nM 標的RNAを得る)およびRz−RNA(最終濃度40 nM)と混合して、インキュベーション時間を変更(20秒、40秒、1分、3分、10分、30分および2時間)した以外は上記のインビトロライブラリー選択と同じ条件を使用して、インキュベーションを実施した。次いで、尿素ポリアクリルアミドゲルで試料を分離し、次いで乾燥し、Phosphor−Imagerを使用して分析した。
【0311】
細胞培養物中の HBV 複製に対する Rz の影響
細胞培養物中のsRzの有効性を試験するために、10%熱不活性化ウシ胎児血清を補給した最小必須培地において30℃、5%CO2の加湿恒温槽においてHepG2細胞を維持した。これらの細胞に、pBB4.5HBV1.3(1.3×単位長さのHBV DNAプラスミド構築物;Delaney & Isom、1998、Hepatology 28: 1134−2246参照)およびpLSCLIP、pLSCCLIPmRz408、pLSCLIPsRz777またはpLSCLIPsRz885(pLSCLIPは、Stratagene製のLacSwitchベクターのCLIPカセットを示す)を同時トランスフェクトした。pLSCLIPsRz777およびpLSCLIPsRz885は、逆相補オリゴヌクレオチド(それぞれ、CLAW437/CLAW438およびCLAW397/CLAW398)をアニーリングし、pLSCLIPのBgl II部位にそれらを挿入することによって構築した。pLSCLIPmRz408は、オリゴヌクレオチドCLAW435/CLAW436と同じ方法で構築した。しかし、これらのオリゴヌクレオチドは、不注意なことに、5’側隣接領域がミスマッチを含有するように合成され、その後のインビトロにおける試験は、このRzは、sRz408の触媒活性の約20%を有することを示し、これはmRz247の活性に相当するので、この実験には「中程度」の比較として含まれた。
【0312】
FuGENE6トランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim)を使用して、HepG2細胞をトランスフェクトした。合計5μgのDNA(0.5μgのpBB4.5HBV1.3および2.7μgのPLSCLIP構築物)、24μlのエンハンサーおよび30μlのEffectenceトランスフェクション試薬。血清を含有する培地においてDNA/試薬混合物中で細胞を6時間培養した。
【0313】
ノーザンブロット分析では、トランスフェクション後4日目および5日目に総RNAをトランスフェクトしたHepG2細胞から単離し(Chomczynski & Sacchi、1987、Anal Biochem 162: 156−159)、上記のように、10μgの総RNAを使用してノーザンブロット分析を実施した(Davisら、1986、「真核細胞からのRNAの調製および分析(Preparation and analysis of RNA from eukaryotic cells):分子生物学における基礎方法(Basic Methods in Molecular Biology)」、New York: Elsevier Science Publishing Co., Inc.、129−156)。ランダムプライミング(Boehringer−Mannheim Ramdom Prime DNA Labeling kits)によって作製した[32P]放射性標識HBVプローブを使用してハイブリダイゼーションを実施した。同時にHBVおよびGAPDH転写物についてブロットを探索した。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー条件下においてブロットを洗浄し、オートラジオグラフィーに暴露した。
【0314】
分泌された細胞外HBV DNAの分析は、トランスフェクション後4日目および5日目に培地を回収し、6,000×gにおいて5分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。記載されているように、3本組の試料をプールし、HBV粒子を沈殿させ、分析した(Weiら、1996 J. Virol. 70: 6455−6458)。ウイルスのペレットをPBSに懸濁させ、プロティナーゼ(Proteinase)Kで消化し、次いでフェノール/クロロホルムで抽出した。0.1容量の3 M 酢酸ナトリウムと1容量のイソプロパノールでDNAを沈殿させた。10μgのtRNAを沈殿の担体として添加した。ペレットをTEに懸濁し、0.5mg/mlのRNaseで1時間消化した。次いで、DNAを電気泳動およびサザンブロット法、その後のオートラジオグラフィーで分析した。
【0315】
選択されたHBV表面抗原(HbsAg)を分析するために、Sorin診断キットを使用して、ラジオイムノアッセイで検出を実施した。トランスフェクトした細胞の培地を回収して、6,000×gで遠心分離して、細胞残渣を除去した。総計数を分析のために比較した。
【0316】
10. 実施例:好ましい標的配列およびいくつかの好ましいDNAzyme
本出願の開示内容において同定されるヒトパピローマウイルス(HPV)およびB型肝炎ウイルス(HBV)標的部位は、これらの部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAzymeまたはリボザイムのハイブリダイゼーションの部位として有用である。好ましい標的は、HPV E6/E7 mRNAまたは肝炎ウイルスのコア、プレコアもしくはポリメラーゼコード配列である。
【0317】
HPV16−Dz57と名づけられる、HPV16に特異的なDNAzymeの好ましい態様は以下のようである:
触媒中心に下線をつけ、隣接5’側および3’側配列は、生理的条件下において、配列番号:AAとして同定される標的配列にハイブリダイズする。
【0318】
一般に、本発明のDNAzymeは、触媒中心の配列に5’側および3’側隣接配列を加えることによって作製した。5’側および3’側隣接配列は、関心のある標的配列に相補的であるように設計される。例えば、表14に同定されている標的配列(配列番号:AA〜BD)は、開示されている標的部位の各々に特異的なDNAzymeを設計するために使用することができる。表14は、標的mRNAのセンス方向に相当するDNA配列を示す。表15のDNAzymeは、表14の逆相補性である隣接配列を有する。各標的配列(配列番号:AA〜BD)の下線は、DNAzymeによって標的部位に相当するRNAが切断される切断部位である。本発明のDNAzymeは、特定の標的配列中の関心のある下線をつけた切断部位に隣接するがこれを含まない核酸を同定し、切断部位に隣接する標的配列に結合する相補的核酸配列を設計することによって設計される。相補的配列は、当技術上周知の技法を使用して化学的に合成し、DNAzymeの触媒中心の5’および3’末端に結合することができる。DNAzymeの触媒中心の5’および3’末端に結合する相補的核酸配列は、5’側および3’側隣接配列が生理的条件下において関心のある標的部位に特異的にハイブリダイズするので、関心のある標的部位に特異性を提供する。DNAzymeの触媒中心に結合する5’側および3’側隣接配列は、6〜15ヌクレオチド長であってもよく、さらに好ましくは、それらは7〜10ヌクレオチド長であってもよく、さらにより好ましくは、それらは8〜9ヌクレオチド長であってもよい。本発明の特定の態様において、表15に記載のするDNAzyme(配列番号:BE〜BQ)は、それぞれ、配列番号:AA〜AMとして開示されているHPV標的配列に特異的であるように設計される。当業者に明らかであるように、本出願の標的配列に特異的であるDNAzymeの設計は、上記に詳細に記載されている方法を使用して実施することができる。本明細書の具体的な例示は本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【0319】
【表14】標的配列
【0320】
【表15】HPV標的に特異的なDNAzyme。各配列の下線をつけた太字の部分は、DNAzymeの触媒中心であり、5’側および3’側隣接配列は標的配列にハイブリダイズする。
【0321】
11. 実施例:遺伝子組換えマウスのHBV部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
以下の表16〜21のデータに示すように、DNAzyme
またはその触媒的に不活性な相対物(すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
)は、ヒトHBVを発現する遺伝子組換えマウスにおいて、すなわち、インビボにおいてHBV複製および分泌を低下する際に効果的であった。
【0322】
【表16】HBV 遺伝子組換えマウスにおける血清 HBV ゲノム等価物に対する DNAzyme(Dz879) または触媒的に不活性な相対物 (m879) の影響
50 ugのDz879またはm879を、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で、1週間あたり2回、2週間投与し、最後の治療の48時間後に屠殺した。明らかなように、Dz879およびm879は共に、2週間の処置後インビボにおいてHBV分泌の低下に効果的であった。しかし、おそらくアシアロフェチュインに対する免疫応答のため、この影響は5週間後には低下した。
【0323】
【表17】HBV 遺伝子組換えマウスの肝臓における HBV コア( Core ) Ag に対する Dz879 および m879 の影響
Dz879およびm879は、記載されているように、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で投与した。肝組織を採取し、固定し、処理し、中心静脈周囲においてHBVコア抗原について免疫組織化学的分析を実施した。明らかなように、2週間後、HBVコア抗原の染色は劇的に低下した。また、染色の強度も大幅に低下し、細胞質染色数によって示されるものよりさらに顕著な影響を示している。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:2回/1週間、(火曜日、金曜日)×2または5週間
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:2または5週間
a 染色された細胞質数/中心静脈内腔の総細胞数 平均5本の血管を計数した。
b 各処理群の動物数
c 最初の処理後の日数
* 未処理と比較して、P<0.05
*** 未処理と比較して、P<0.001。
【0324】
【表18】HBV 遺伝子組換えマウスにおける HBV RNA 転写物に対する Dz879 および m879 の影響
Dz879およびm879は、記載されているように投与し、肝組織をRNAについて抽出した。RNAは、ノーザンブロット分析およびその次に実施したデンシトメトリーによって分析した。結果は、HBV RNA転写物レベルの顕著な低下を示した(細胞培養物の結果の場合と同様に、全ての転写物)。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:2回/1週間、(火曜日、金曜日)2週間
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:2または5週間
a ノーザンブロット分析±標準偏差を使用して、HBV RNAの平均シグナルをGAPDHハウスキーピング遺伝子のシグナルで割ったもの
b 各処理群の動物数
* 未処理と比較して、P<0.05
注:5週間処理群のRNA試料は強度が低く、測定困難であった。
【0325】
【表19】遺伝子組換えマウスの HBV 肝臓 DNA に対する Dz879 および m879 の影響
Dz879およびm879は、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で投与した。肝組織をDNAについて抽出し、HBVゲノムDNAをクロスオーバーPCRで定量した。Dz879およびm879の投与により、HBV肝DNAは劇的に低下した。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:2回/1週間、(火曜日、金曜日)×2または5週間
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:2または5週間
a 各処理群の動物数
b 最初の処理後の日数
c 別の実験の対照(ISA−2、対照)
d 不良調製試料、不良結果
* 未処理と比較して、P<0.05
【0326】
【表20】遺伝子組換えマウスにおける HBV 肝 DNA に対する Dz879 または対照 DNAzyme の影響
これは、肝HBV DNAに対するDNAzymeの顕著な影響を示す反復実験を示す。さらに別の実験は、DNAzymeの触媒中心またはオリゴヌクレオチドから一リン酸ヌクレオチドへの迅速な分解が偽薬群において観察される影響の一因であるかどうかを判定するために実施されている。遺伝子発現分析は、例えば、デオキシシチジンキナーゼの発現の増加を示すと同時に、サイトカインがそれらの影響の原因でないことを示している。
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:以下参照
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:3週間
a 各処理群の動物数。
【0327】
【表21】遺伝子組換えマウスにおける HBV コア抗原染色に対する Dz879 または対照 DNAzyme の影響
動物:雌遺伝子組換えマウス(初代細胞 1.3.32)
処置計画:以下参照
ウイルス:ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路:腹腔内注射
薬剤:ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間:3週間
a 各処理群の動物数。
b 最初の処理後の日数
* P<0.05、群17と比較
【0328】
12. 実施例:ワタオウサギにおけるパピローマ増殖を阻止するためのマルチリボザイムの用途
DNAzymeを、モデルのワタオウサギ系においても試験した。ワタオウサギの一部の皮膚を軽く剃毛し、 ショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)の懸濁液を適用した。10日目以降、DNAzymeの生理食塩液を、30μg/日で、4週間局所適用し、次いで60μg/日をさらに2週間局所適用した。以下のDNAzymeを個別に、および混合物として試験した:群L1(配列番号:WW)、群L2(配列番号:XX)、群L3(配列番号:YY)。DNAzymeの標的部位は、以前に同定されたHPV部位との相同性によって選択した。触媒機能が欠損しているDNAzyme(群mL2、配列番号:ZZ)も試験した。次いで、パピローマを測定し、平均容積を算出した。図25に示すように、個々のDNAzymeおよび触媒機能が欠損したDNAzymeは、パピローマ増殖阻止に効果的ではなかった。しかし、3つのDNAzyme全ての混合物(L1/L2/L3)は、パピローマ増殖の低下に効果が高かった。
(配列番号:WW)は、ヌクレオチド614に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)のLS1DNAzymeである。
(配列番号:XX)は、ヌクレオチド935に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)のLS2DNAzymeである。
(配列番号:YY)は、ヌクレオチド1006に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)のDNAzyme、LS3である。
(配列番号:ZZ)は、ショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)(GenBank(商標)アクセッション番号AJ404003)の触媒機能欠損DNAzyme、mLS2である。
【0329】
13. 実施例:送達およびインビボにおける試験
生物送達
本発明の毒性剤および/またはリボザイムは、本明細書に記載され、本明細書の上記に例示されているように、多種多様のウイルスベクターおよびバクテリオファージによって送達することができる。
【0330】
本発明の一態様において、毒性剤は伝達プラスミドにコードされ、P1バクテリオファージ送達系と関連して使用される。このような伝達プラスミドは、好ましくは、1)複製起点、2)選択マーカー、3)P1 PAC部位およびPAC ABC遺伝子、4)P1溶菌レプリコン、5)本発明の1つ以上の毒性剤をコードする核酸を含有する。好ましい態様において、バクテリオファージP1ファージ前駆体(P1プラスミド)は、P1プラスミドからPAC部位を欠損することによって、ウイルスDNAがビリオンにパッケージングされるように操作される。
【0331】
別の態様において、毒性剤および/またはリボザイムは、毒性剤および/またはリボザイム、プラスミド複製起点、プラスミド維持のための選択マーカー、最小λ複製起点およびDNAをλビリオンにパッケージングするのに必要なcos部位をコードするプラスミドを介して送達することができる。このプラスミドは、組み込み/切断および組換え機能が欠損しているλ溶原ファージに維持される。欠陥溶原ファージは、プラスミドのλ複製起点を活性化するのに必要な複製因子の全ておよび成熟ビリオンを形成するのに必要な構造的成分の全てを提供するが、溶原ファージは複製することができず、自身のDNAをビリオンにパッケージングできない。溶原ファージはまた、cI857温度感受性リプレッサー突然変異も保有する。42℃に温度を変化させることによる、または5J/m2の紫外線照射に暴露するなどの他の手段による溶原ファージの誘導はプラスミドを誘発し、複製し、λビリオンにパッケージングする。次いで、ビリオンを回収し、大腸菌タンパク質を含有しないように精製し、大腸菌に毒性剤および/またはリボザイム遺伝子を送達するために使用することができる。緑膿菌に毒性剤および/またはリボザイムを送達するために、同様の方法を緑膿菌に実施する。
【0332】
非生物送達
毒性剤および/またはリボザイムの非生物送達は、標的組織または病原菌内で発現されるように操作されている構築物を用いて実施される。簡単に説明すると、プロモーターおよび毒性剤および/またはリボザイムを含有する遺伝子エレメントを1:10の比で陽イオンリポソーム(リポフェクタミン−−Gibco BRL)と複合体とし、0.2 mlの総容量の核酸−リポソーム混合物の単回注射または多数回注射によって試験動物に導入される。
【0333】
急性細菌感染症の予防的投与および予防
本発明の毒性剤および/またはリボザイムが、インビトロにおいて(細菌培養物に直接または感染組織培養物細胞アッセイ系において)生物活性を有する証明により、毒性剤および/またはリボザイムの有効性が、例えば、上記のインビボモデル系において示されている。本発明の毒性剤および/またはリボザイムの効果をインビボにおいて証明するために、本明細書に記載されているものなどの実験動物モデル系を使用する。毒性剤および/またはリボザイムの効果をインビボにおいて最初に証明するために、マウスに、毒性および/またはリボザイム構築物に感受性であることが以前に示されている病原微生物を感染させ、投与した毒性剤および/またはリボザイムのインビボにおける効果を求める。最初の一連のインビボ試験において、毒性剤および/またはリボザイムがインビボに投与される前に微生物に直接加えられる場合には、マウスモデル系における急性感染症を予防する際の毒性剤および/またはリボザイムの有効性が求まる。
【0334】
次の一連の試験は、感染後に投与した毒性剤および/またはリボザイムが、急性細菌感染症を予防する際に効果的であることを証明する。感染マウスの臨床状態以外に、剖検時に採取された組織を組織学的に検査し、組織試料中に複製中の微生物が存在するかどうかを標準的な方法によって判定する。動物は種々の経路(全身および/または粘膜)によって感染させることができ、全身、粘膜または局所的な経路によって、感染後、経時的に毒性剤および/またはリボザイムが送達される。毒性および/またはリボザイムの非生物送達ならびに生物送達が使用される。管理された実験モデル系における毒性剤および/またはリボザイムの陽性の影響を証明するには、調製物の効果の注目すべき証拠を提供し、標準的な臨床試験条件下において調製物が評価を保証するかどうかを判定する。
【0335】
本発明は、本明細書に記載されている具体的な態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているもの以外の、本発明の種々の改良が、上記の説明および添付の図面から当業者に明らかである。このような改良は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。
【0336】
本出願全般にわたって、種々の文献が参照されている。これらの文献の全体の内容における開示内容は、本発明が属する分野をより詳細に説明するために、本出願に参照として組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【図1A】lacI調節広域スペクトルプロモーターの構成要素を示す略図である。
【図1B】LEASHIプロモーター(配列番号:1)の配列を示す。
【図1C】改変されたrrnBプロモーター(配列番号:2)の配列を示す。
【図1D】Anrプロモーター(配列番号:3)の配列を示す。
【図1E】Procプロモーター(配列番号:4)の配列を示す。
【図1F】Arcプロモーター(配列番号:5)の配列を示す。
【図1G】TSST−1プロモーター(配列番号:6)の配列を示す。
【図2】β−ラクタマーゼリポータープラスミドの略図である。
【図3Aから3B】毒性剤をクローニングする発現ベクターを示す。
【図4】毒性剤の致死性についてのアッセイ法を示す。
【図5】doc発現プラスミドを保有する大腸菌の増殖を示す。
【図6Aから6B】輸送プラスミドの構造を示す。
【図7】P1バクテリオファージ媒体による大腸菌への輸送プラスミドの送達効率を示す。
【図8】P1 pac部位ノックアウトを作製する図式である。
【図9】PCRスクリーニングによるP1 pac部位ノックアウトの同定および確認を示す。
【図10】pacABC相補プラスミドの略図である。
【図11】P1 pac 突然変異体とpacABC相補プラスミド間の組換えを示す。
【図12】最小P1 pac部位(配列番号:7)の配列を示す。
【図13】マウスで複製しているファージの免疫原性を示す。
【図14】インビボにおける元のファージと長期循環型P1ファージの持続性の比較を示す。
【図15】孵化鶏卵における緑膿菌(P. aeruginosa)(PA01)感染症の治療を示す。
【図16】大腸菌EC−4細菌細胞のインビトロにおける死滅を示す。
【図17】孵化鶏卵における大腸菌EC−4感染症の治療を示す。
【図18】DciF1分子(配列番号:8)の配列を示す。
【図19】pClipリボザイムカセットの略図およびヌクレオチド配列である。
【図20】pChopリボザイムカセットの略図およびヌクレオチド配列配列である。
【図21】pSnipリボザイムカセットの略図を示す。pSnipはpClipトリプルリボザイムカセットの配列、2つが結合したトランス作用性リボザイムを含有する触媒中心標的リボザイムおよびpClopトリプルリボザイムカセットの配列を含む。
【図22A】リボザイム成熟化および作用における事象の分子配列に使用されるリボザイムをコードするDNAの略図である。
【図22B】一次RNA転写物を示す。自己触媒的切断が転写の終結により生じる。
【図22C】トランス作用性リボザイムの放出を示す。2つのシス作用性リボザイムの切断の直接的な結果として、mRNA標的に対して逆方向で相補的な配列を含有する内部リボザイムが放出される。
【図22D】リボザイムの配列特異的ハイブリダイゼーションを示す。内部リボザイムまたはトランス作用性リボザイムは、短いヌクレオチドの「スペーサー」によって結合された2つのトランス作用性リボザイムを含有する。2つのトランス作用性リボザイムは各々、同一または異なる部位の標的メッセージに逆方向で、相補的な配列を含有する。リボザイムは、標的化された転写物の全てまたは実質的に全てに局在化し、ハイブリダイズするのに十分な濃度が合成される。
【図22E】トランス触媒切断を示す。内部トランス作用性リボザイムリボザイムが標的化されたmRNA転写物にハイブリダイズすると、内部リボザイムは触媒トポロジーを実施し、標的化されたメッセージを切断する。切断の結果、トランス作用性リボザイムが放出され、その活性および機能がリサイクルされる。
【図23】HBV標的化Rzのインビトロにおける切断分析を示す。試験した6Rzの位置は、参照として本明細書に組み入れられている、2000年12月7に出願された優先権仮出願番号第60/251,810号の図7に示す。個々のRzが構築され、インビトロにおいて転写され、[32P]−標識HBV標的RNA(917nt)と混合した。インキュベーションは、37℃において、20 mM Tris−HCl(ph 7.4)、5 mM MgCl2中で30分間実施した。切断後、産物を変性PAGEによって分離し、得られたものをPhosphor−Imagerを使用して定量した。切断産物の大きさは、右に示し、Rzの濃度(40 mMまたは200mM)は上に示した。
【図24】HBV標的Rzの切断分析を示す。RzおよびHBV標的RNAを種々の比(40:1、40:10または40:100、上に示す)で混合し、種々の期間の間(各比について20秒、40秒、1分、3分、10分、30分または2時間、それぞれ、左から右方向に示す)。インキュベーション後、変性PAGEによって産物を分析し、Phosphor−Imagerを使用して定量した。
【図25】ワタオウサギにおけるパピローマ増殖に対するDNAzymeの局所適用の影響を示す。ショープ乳頭腫ウイルス(Shope Papilloma Virus)mRNA部位を標的化するDNAzymeを単独で(群L1、群L2、群L3)、または併用して(群L1/L2L3)適用した。結果は、併用療法がパピローマ容積の低下に有効であることを示した。触媒的に不活性なDNAzyme(群mL2)は、パピローマ容積の低下に無効であった。
Claims (27)
- 形質転換またはプラスミドコピー数制御に関連する少なくとも1つのウイルスタンパク質をコードするmRNAに生理的条件下において特異的な的にハイブリダイズするか、またはウイルスポリアデニル化シグナルまたはコア、プレ−コアまたはポリメラーゼコード配列にハイブリダイズし、少なくとも1つの配列が配列番号:AA〜BDまたはそれらの相同配列からなる群より選択される、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- mRNAがE6/E7mRNAである、請求項1に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- mRNAがパピローマウイルスRNAまたはB型肝炎ウイルスRNAである、請求項1または2に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 配列番号:AA〜BDまたは関連するHPVもしくはHBVの相同配列からなる群より選択される配列と生理的条件下において特異的にハイブリダイズする、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 核酸分子がDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 核酸分子がDNAzymeである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 核酸分子がリボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 核酸分子がヌクレアーゼ分解に抵抗性である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 核酸分子の3’末端が修飾されており、ヌクレアーゼ分解に抵抗性で、かつ3’末端に3’−3’逆位Tを有する、請求項9に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
- 請求項1〜10に記載の核酸分子のいずれかと、薬学的に許容されうる担体とを含む、薬学的組成物。
- 請求項11に記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、パピローマウイルス性状態または肝炎ウイルス性状態を治療する方法。
- 投与が頚部への局所適用を含む、請求項12に記載の方法。
- 投与が表皮への局所適用を含む、請求項12に記載の方法。
- 核酸分子が美容剤として製剤化される、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 核酸分子は、パピローマウイルスまたはB型肝炎ウイルスに感染した細胞に細胞毒性または細胞増殖抑制作用を生ずるのに十分な量が製剤化される、請求項11または15に記載の薬学的組成物。
- 細胞がパピローマウイルスによって形質転換される、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 細胞がB型肝炎ウイルスによって形質転換される、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 核酸分子が局所投与用に製剤化される、請求項16〜18に記載の薬学的組成物。
- 核酸が軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはローションに製剤化される、請求項19に記載の薬学的組成物。
- 核酸分子がリポソーム製剤または脂質製剤に製剤化される、請求項11または15〜20のいずれかに記載の薬学的組成物。
- パピローマウイルス性状態が、疣、子宮頚部異形成、子宮頚癌、上皮内癌および喉頭パピローマからなる群より選択される、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 投与が上皮細胞に対する、請求項22に記載の方法。
- 上皮細胞が、扁平上皮、皮膚上皮および粘膜上皮からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- 1つ以上の核酸が、リポソームでの送達のために製剤化される、請求項11および15〜21のいずれかに記載の薬学的組成物。
- リポソームが、肝臓に組織特異的に取り込まれることができる、請求項25に記載の薬学的組成物。
- リポソームがアシアロフェチュイン(asialofetuin)または1つ以上の糖を使用して修飾される、請求項26に記載の薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US54844900A | 2000-04-13 | 2000-04-13 | |
US25181000P | 2000-12-07 | 2000-12-07 | |
PCT/US2001/012130 WO2001079524A2 (en) | 2000-04-13 | 2001-04-13 | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, dnazymes and antisense oligonucleotides, and methods of use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004525602A true JP2004525602A (ja) | 2004-08-26 |
JP2004525602A5 JP2004525602A5 (ja) | 2005-11-17 |
Family
ID=26941841
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001577507A Pending JP2004525602A (ja) | 2000-04-13 | 2001-04-13 | 組織特異的および病原菌特異的毒性剤、リボザイム、DNAzymeおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの使用方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1397489A4 (ja) |
JP (1) | JP2004525602A (ja) |
AU (2) | AU5347101A (ja) |
CA (1) | CA2406403A1 (ja) |
WO (1) | WO2001079524A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8183011B2 (en) * | 2003-06-13 | 2012-05-22 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | RNA interferases and methods of use thereof |
WO2005046579A2 (en) * | 2003-10-06 | 2005-05-26 | Gangagen, Inc. | Defined dose therapeutic phage |
SG10201805660WA (en) | 2013-12-30 | 2018-08-30 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
WO2019171191A1 (en) * | 2018-03-05 | 2019-09-12 | Dr. Reddy's Institute Of Life Sciences | Embryonic zebrafish models using dnazyme mediated knockdown |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0502994B1 (en) * | 1989-12-01 | 1995-09-06 | Amoco Corporation | Detection of hpv transcripts |
GB9015845D0 (en) * | 1990-07-19 | 1990-09-05 | Emery Vincent C | Diagnostic method |
FR2679254B1 (fr) * | 1991-07-17 | 1993-11-19 | Clonatec | Sondes oligonucleotidiques pour le typage et la detection des papillomavirus humains. |
WO1993023569A1 (en) * | 1992-05-11 | 1993-11-25 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting viral replication |
US5767259A (en) * | 1994-12-27 | 1998-06-16 | Naxcor | Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains |
EP0655091A1 (en) * | 1993-05-06 | 1995-05-31 | Baxter Diagnostics Inc. | Human papillomavirus detection assay |
US6015686A (en) * | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
US5989804A (en) * | 1994-07-08 | 1999-11-23 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | E6 binding proteins |
US5985662A (en) * | 1995-07-13 | 1999-11-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense inhibition of hepatitis B virus replication |
AU5298699A (en) * | 1998-08-13 | 2000-03-06 | Johnson & Johnson Research Pty. Limited | Dnazymes and methods for treating hpv-related disorders |
AU2875602A (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-18 | Univ Pennsylvania | Selection of catalytic nucleic acids targeted to infectious agents |
-
2001
- 2001-04-13 CA CA002406403A patent/CA2406403A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-13 EP EP01926973A patent/EP1397489A4/en not_active Withdrawn
- 2001-04-13 AU AU5347101A patent/AU5347101A/xx active Pending
- 2001-04-13 AU AU2001253471A patent/AU2001253471B2/en not_active Ceased
- 2001-04-13 WO PCT/US2001/012130 patent/WO2001079524A2/en active IP Right Grant
- 2001-04-13 JP JP2001577507A patent/JP2004525602A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2406403A1 (en) | 2001-10-25 |
WO2001079524A2 (en) | 2001-10-25 |
EP1397489A4 (en) | 2005-05-11 |
AU5347101A (en) | 2001-10-30 |
WO2001079524A3 (en) | 2004-01-08 |
EP1397489A2 (en) | 2004-03-17 |
AU2001253471B2 (en) | 2007-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20060223774A1 (en) | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, dnazymes and antisense oligonucleotides, and methods of use thereof | |
US6271359B1 (en) | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes | |
AU2023200490A1 (en) | Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing | |
US6372427B1 (en) | Cooperative oligonucleotides | |
US7575918B2 (en) | Tissue-specific and pathogen-specific ribozymes | |
CN111133107A (zh) | 用于治疗性核酸递送的跨界平台 | |
TW202333747A (zh) | 調節pcsk9之方法及其用途 | |
US7732197B2 (en) | Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes | |
US20170233742A1 (en) | Compositions Comprising Small Interfering RNA Molecules for Prevention and Treatment of Ebola Virus Disease | |
WO2021021636A1 (en) | Oligonucleotide antagonists for rna guided genome editing | |
JP2004525602A (ja) | 組織特異的および病原菌特異的毒性剤、リボザイム、DNAzymeおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの使用方法 | |
US6485973B1 (en) | Oligonucleotides specific for the marORAB operon | |
AU2001253471A1 (en) | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, dnazymes and antisense oligonucleotides, and methods of use thereof | |
WO1998024925A1 (en) | Tissue specific and target rna-specific ribozymes as antimicrobial therapeutics against microbial pathogens | |
EP1702983A2 (en) | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, DNAzymes and antisense oligonucleotides and methods of use thereof | |
AU743119B2 (en) | Tissue specific and target RNA-specific ribozymes as antimicrobial therapeutics against microbial pathogens | |
US20030125280A1 (en) | Tissue specific and target RNA-specific ribozymes as antimicrobial therapeutics against microbial pathogens | |
EP4008785A1 (en) | Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses | |
AU2004201285B8 (en) | Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes | |
WO1997038097A1 (en) | Cooperative oligonucleotides | |
AU2022313315A1 (en) | Guide rnas for crispr/cas editing systems | |
Cho et al. | Adam M. Dinan and Brendan J. Loftus |