TW202333747A - 調節ｐｃｓｋ９之方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示案提供基於CRISPR/Cas9之融合分子及嚮導RNA，其係用於活體內靶向減少或消除PCSK9基因產物。本揭示案亦係關於其調配物、生產方法及使用方法。

Description

調節PCSK9之方法及其用途
可定製以靶向哺乳動物細胞中之任何基因的工程改造之DNA結合蛋白已能夠促進生物醫學研究之快速進展且為基因療法之具前景之平台。RNA引導之CRISPR-Cas9系統已成為可程式化靶向基因調控之具前景之平台。催化非活性「死」Cas9 (dCas9)與克魯勃相關框(Kruppel-associated box，KRAB)結構域之融合產生能夠實現細胞培養實驗中靶基因之高度特異性及強效調控或靜默之合成抑制子。
然而，使用合成dCas9-KRAB融合蛋白對內源基因之持續調節及靜默已對活體內療法中使用提出挑戰。合成抑制子超出病毒載體遞送方法之尺寸包裝限制。安全性、毒性、免疫原性及脫靶效應為限制活體內合成抑制子使用之其他挑戰。在此項技術中需要用於產生遺傳工程改造之合成基因抑制子之替代性方法及用作治療劑之合成基因抑制子之活體內遞送。本揭示案解決此項技術中此種未滿足之需要。
本揭示案提供一種用於調節(例如，減少或消除)細胞中前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶(Proprotein Convertase Subtilisin)/Kexin 9型(PCSK9)基因產物之表現的方法，該方法包括向該細胞中引入以下各物之步驟：包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列，其中該基因表現調節子提供PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾，從而調節(例如，減少或消除)該細胞中該PCSK9基因產物之表現。
本揭示案提供一種調節(例如，減少或消除)個體中PCSK9基因產物之表現的活體內方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟：包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列，其中該基因表現調節子提供PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾，從而調節(例如，減少或消除)該個體中該PCSK9基因產物之表現。
本揭示案提供一種調節(例如，減少)個體中之低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟：包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列，其中該基因表現調節子提供PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾，從而調節(例如，減少)該個體中之LDL膽固醇。
本揭示案提供一種用於治療或減輕個體之PCSK9相關病症之症狀的方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟：包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列，其中該基因表現調節子提供PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾，從而治療或減輕該個體之PCSK9相關病症之症狀。
本揭示案提供一種擴充PCSK9基因產物之表現減少之細胞群體的方法，該方法包括以下步驟：i)向複數個細胞中引入包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列，其中該基因表現調節子提供PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾，ii)擴充該複數個細胞以產生該PCSK9基因產物之表現減少之複數個經修飾細胞，其中相對於尚未引入該融合分子或該核酸序列之細胞，該複數個經修飾細胞之PCSK9基因產物表現減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，且其中該細胞為肝細胞。在一些實施例中，PCSK9基因產物之表現減少為瞬時減少的。在一些實施例中，PCSK9基因產物之表現減少為穩定減少的。
在一些實施例中，PCSK9調控元件為核心啟動子、近端啟動子、遠端增強子、靜默子、絕緣子元件、邊界元件或基因座控制區。
在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游300 bp內。
在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約300 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內及轉錄起始位點之下游300 bp內。
在一些實施例中，至少一個核苷酸之修飾為DNA甲基化。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)、DNA去甲基酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶或其一部分。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)或其一部分。在一些實施例中，DNA甲基轉移酶為DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。在一些實施例中，DNMT3A包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。在一些實施例中，DNMT3L包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。在一些實施例中，基於鋅指蛋白之轉錄因子為克魯勃相關抑制框(Kruppel-associated suppression box，KRAB)。在一些實施例中，KRAB包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶或其一部分及基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。在一些實施例中，DNA甲基轉移酶係選自DNMT3A及DNMT3L及其組合，且基於鋅指蛋白之轉錄因子為KRAB。
在一些實施例中，至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。在一些實施例中，至少一個DNA結合蛋白為dCas9。在一些實施例中，dCas9包含金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) dCas9、釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes) dCas9、空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni) dCas9、白喉棒狀桿菌( Corynebacterium diphtheria) dCas9、凸腹真桿菌( Eubacterium ventriosum) dCas9、巴氏鏈球菌( Streptococcus pasteurianus) dCas9、香腸乳桿菌( Lactobacillus farciminis) dCas9、球形球毛殼菌( Sphaerochaeta globus) dCas9、固氮螺菌( Azospirillum) (例如，菌株B510) dCas9、固氮葡糖醋桿菌( Gluconacetobacter diazotrophicus) dCas9、灰色奈瑟菌( Neisseria cinerea) dCas9、腸道羅氏菌( Roseburia intestinalis) dCas9、食清潔劑細小棒菌( Parvibaculum lavamentivorans) dCas9、鹵水硝酸鹽裂解菌( Nitratifractor salsuginis) (例如，菌株DSM 16511) dCas9、紅嘴鷗彎曲桿菌( Campylobacter lari) (例如，菌株CF89-12) dCas9或嗜熱鏈球菌( Streptococcus thermophilus) (例如，菌株LMD-9) dCas9。在一些實施例中，dCas9包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
在一些實施例中，融合分子包含融合至至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端之至少一個基因表現調節子。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子直接融合至至少一個DNA結合蛋白。在一些實施例中，至少一個基因表現調節子經由非調節子、第二調節子或連接子與至少一個DNA結合蛋白間接融合。在一些實施例中，融合分子包含與C末端上之KRAB及N末端上之DNMT3A及DNMT3L融合之dCas9。在一些實施例中，融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。
在一些實施例中，融合分子進一步包含至少一個核定位序列。在一些實施例中，至少一個核定位序列直接融合至至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。在一些實施例中，至少一個核定位序列經由連接子間接融合至至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。
在一些實施例中，編碼融合分子之核酸序列為去氧核糖核酸(DNA)。在一些實施例中，編碼融合分子之核酸序列為信使核糖核酸(mRNA)。
在一些實施例中，方法進一步包括以下步驟：引入至少一個與PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之DNA序列互補之單嚮導RNA (sgRNA)，從而將融合分子靶向PCSK9基因或PCSK9調控元件，或編碼sgRNA之DNA。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 27-95或98-108之核酸序列。
在一些實施例中，融合分子調配於脂質體或脂質奈米粒子中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA調配於脂質體或脂質奈米粒子中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA調配於同一脂質體或脂質奈米粒子中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA調配於不同脂質體或脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，脂質體或脂質奈米粒子包含可電離脂質(20%-70%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(0%-30%，莫耳比)、支持脂質(5%-50%，莫耳比)及膽固醇(10%-50%，莫耳比)。在一些實施例中，可電離脂質係選自由pH響應型可電離脂質、熱響應型可電離脂質及光響應型可電離脂質組成之群。
在一些實施例中，融合分子調配於AAV載體中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA調配於AAV載體中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA調配於同一AAV載體中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA調配於不同AAV載體中。
在一些實施例中，藉由局部注射、全身輸注或其組合將融合分子遞送至細胞。
在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，PCSK9相關病症為高動脈粥樣硬化性心血管病。在一些實施例中，PCSK9相關病症為高膽固醇血症。在一些實施例中，細胞為肝細胞。
本揭示案提供一種包含SEQ ID NO: 27-95或98-108中之任一者之核酸序列的sgRNA。本揭示案提供一種編碼本文所揭示之sgRNA中之任一者的DNA序列。
本揭示案提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包括包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列，其中該融合分子靶向PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之基因體區域，其中該至少一個基因表現調節子提供PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)、DNA去甲基酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶或其一部分，或基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分，或其組合，且其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
在一些實施例中，PCSK9調控元件為轉錄起始位點、核心啟動子、近端啟動子、遠端增強子、靜默子、絕緣子元件、邊界元件或基因座控制區。
在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游300 bp內。
在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約300 bp內。在一些實施例中，PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾位於PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內及轉錄起始位點之下游300 bp內。
在一些實施例中，至少一個核苷酸之修飾為DNA甲基化。在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)或其一部分。在一些實施例中，DNA甲基轉移酶為DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。在一些實施例中，DNMT3A包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。在一些實施例中，DNMT3L包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。在一些實施例中，基於鋅指蛋白之轉錄因子為克魯勃相關抑制框(KRAB)。在一些實施例中，KRAB包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶或其一部分及基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。在一些實施例中，DNA甲基轉移酶係選自DNMT3A及DNMT3L及其組合，且基於鋅指蛋白之轉錄因子為KRAB。在一些實施例中，至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
在一些實施例中，至少一個DNA結合蛋白為dCas9。在一些實施例中，dCas9包含金黃色葡萄球菌dCas9、釀膿鏈球菌dCas9、空腸彎曲桿菌dCas9、白喉棒狀桿菌dCas9、凸腹真桿菌dCas9、巴氏鏈球菌dCas9、香腸乳桿菌dCas9、球形球毛殼菌dCas9、固氮螺菌(例如，菌株B510) dCas9、固氮葡糖醋桿菌dCas9、灰色奈瑟菌dCas9、腸道羅氏菌dCas9、食清潔劑細小棒菌dCas9、鹵水硝酸鹽裂解菌(例如，菌株DSM 16511) dCas9、紅嘴鷗彎曲桿菌(例如，菌株CF89-12) dCas9或嗜熱鏈球菌(例如，菌株LMD-9) dCas9。在一些實施例中，dCas9包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
在一些實施例中，融合分子包含融合至至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端之至少一個基因表現調節子。
在一些實施例中，至少一個基因表現調節子直接融合至至少一個DNA結合蛋白。在一些實施例中，至少一個基因表現調節子經由非調節子、第二調節子或連接子與至少一個DNA結合蛋白間接融合。
在一些實施例中，融合分子包含與C末端上之KRAB及N末端上之DNMT3A及DNMT3L融合之dCas9。在一些實施例中，融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。
在一些實施例中，融合分子進一步包含至少一個核定位序列。在一些實施例中，至少一個核定位序列直接融合至至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。在一些實施例中，至少一個核定位序列經由連接子間接融合至至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。
在一些實施例中，編碼融合分子之核酸序列為去氧核糖核酸(DNA)。在一些實施例中，編碼融合分子之核酸序列為信使核糖核酸(mRNA)。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含至少一個與PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之DNA序列互補之單嚮導RNA (sgRNA)。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 27-95或98-108之核酸序列。
在一些實施例中，融合分子包裝於脂質體或脂質奈米粒子中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA包裝於脂質體或脂質奈米粒子中。在一些實施例中，sgRNA包裝於同一脂質體或脂質奈米粒子中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA包裝於不同脂質體或脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，脂質體或脂質奈米粒子包含可電離脂質(20%-70%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(0%-30%，莫耳比)、支持脂質(5%-50%，莫耳比)及膽固醇(10%-50%，莫耳比)。在一些實施例中，可電離脂質係選自由pH響應型可電離脂質、熱響應型可電離脂質及光響應型可電離脂質組成之群。
在一些實施例中，融合分子包裝於AAV載體中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA包裝於AAV載體中。在一些實施例中，融合分子及sgRNA包裝於同一AAV載體中。
在一些實施例中，融合分子及sgRNA包裝於不同AAV載體中。
相關申請案
本申請案主張2021年11月26日提交申請之PCT申請案第PCT/CN2021/133681號之優先權及權益，該PCT申請案之內容以全文引用的方式併入。 序列表之援引併入
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本揭示案藉由提供用於靶向減少或消除在活體內基因療法中使用之細胞中之基因產物(例如，PCSK9)的遺傳工程改造之融合分子(例如，DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB融合分子)來克服與目前技術相關之問題。本揭示案之遺傳工程改造之融合分子適用於治療遺傳疾病，包括例如肝臟疾病、與高膽固醇相關之疾病及與膽固醇(例如，低密度脂蛋白(LDL)膽固醇)調控異常相關之疾病。因此，亦提供製造用於活體內遞送之遺傳工程改造之融合分子及其醫藥調配物(例如，脂質奈米粒子調配物)的方法。 I. 定義
如本文所用，術語「編碼序列」或「編碼核酸」意指包含編碼蛋白質之核苷酸序列之核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列可進一步包括可操作地連接至包括啟動子及聚腺苷酸化訊號之調控元件的起始及終止訊號，該等調控元件能夠指導核酸所投與之個體或哺乳動物之細胞中之表現。編碼序列可經密碼子最佳化。
如本文所用，關於核酸之術語「補體」或「互補」可意指核酸分子之核苷酸或核苷酸類似物之間的沃森-克里克(Watson-Crick) (例如，A-T/U及C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)鹼基配對。「互補性」係指兩個核酸序列之間共享之特性，以使得當其彼此反向平行比對時，各位置處之核苷酸鹼基將為互補的。
術語「校正」、「基因體編輯」及「恢復」係指編碼突變蛋白、截短蛋白或根本無蛋白之突變基因，以便獲得全長功能性或部分全長功能性蛋白表現。校正或恢復突變基因可包括使用修復機制，諸如同源性指導之修復(HDR)用不具有突變之基因之複本置換具有突變之基因區域或置換整個突變基因。校正或恢復突變基因亦可包括修復框移突變，此藉由在基因中產生雙股斷裂，接著使用非同源末端連接(NHEJ)進行修復來產生提前終止密碼子、異常剪接受體位點或異常剪接供體位點。NHEJ可在修復期間添加或缺失至少一個鹼基對，此可恢復適當閱讀框且消除提前終止密碼子。校正或恢復突變基因亦可包括破壞異常剪接受體位點或剪接供體序列。校正或恢復突變基因亦可包括藉由兩個核酸酶對同一DNA股之同時作用使非必需基因區段缺失以藉由移除兩個核酸酶靶位點之間的DNA且藉由NHEJ修復DNA斷裂來恢復適當閱讀框。
如本文所用，術語「供體DNA」、「供體模板」及「修復模板」係指包括所關注基因之至少一部分的雙股DNA片段或分子。供體DNA可編碼全功能蛋白或部分功能蛋白。
如本文所用，術語「框移」或「框移突變」可互換使用且係指一種類型之基因突變，其中一或多個核苷酸之添加或缺失引起mRNA中之密碼子之閱讀框移位。閱讀框移位可導致蛋白質轉譯處之胺基酸序列改變，諸如誤義突變或提前終止密碼子。
如本文所用，術語「功能」及「全功能」描述具有生物活性之蛋白質。「功能基因」係指轉錄成mRNA之基因，該mRNA轉譯成功能蛋白。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指經由最初編碼單獨蛋白質之兩個或更多個基因直接或間接共價或非共價連接而產生之嵌合蛋白。在一些實施例中，融合基因之轉譯產生具有來源於原始蛋白質中之每一者之功能特性的單一多肽。
如本文所用，術語「基因構築體」係指包含編碼蛋白質之核苷酸序列之DNA或RNA分子。編碼序列包括可操作地連接至包括啟動子及聚腺苷酸化訊號之調控元件的起始及終止訊號，該等調控元件能夠指導細胞中之表現。
如本文中可互換使用之術語「同源性指導之修復」或「HDR」係指當DNA之同源段存在於細胞核中時，主要在細胞週期之G2及S期中，用以修復雙股DNA損傷之細胞中之機制。HDR使用供體DNA模板以引導修復且可用於產生基因體之特定序列變化，包括全基因之靶向添加。若供體模板連同位點特異性核酸酶一起，諸如與基於CRISPR/Cas9之系統一起提供，則細胞機器將藉由同源重組修復斷裂，此在DNA裂解存在下為增強之若干數量級。當同源DNA段不存在時，可替代地發生非同源末端連接。
如本文所用，術語「基因體編輯」係指改變基因。基因體編輯可包括校正或恢復突變基因。基因體編輯可包括剔除基因，諸如突變基因或正常基因。基因體編輯可用於藉由改變所關注之基因來治療疾病。
如本文所用，術語「一致」或「一致性」在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形中意指序列具有在指定區域上相同之殘基之指定百分比。百分比可藉由以下方式計算：最佳地比對兩個序列，比較指定區域上之兩個序列，確定一致殘基在兩個序列中出現之位置的數目以得到匹配位置之數目，用匹配位置之數目除以指定區域中位置之總數，及用結果乘以100以得到序列一致性之百分比。在兩個序列具有不同長度或比對產生一或多個交錯末端且比較之指定區域僅包括單一序列之情況下，單一序列之殘基包括於計算之分母而非分子中。當比較DNA及RNA時，胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)可視為等效的。可手動地或藉由使用諸如BLAST或BLAST 2.0之電腦序列演算法執行一致性。可藉由已知方法容易地計算相關肽之一致性。此類方法包括但不限於以下文獻中所述之彼等：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, 第1部分, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M. Stockton Press, New York, 1991；及Carillo等人, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)，以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，如本文中可互換使用之術語「突變基因」或「突變之基因」係指已經歷可偵測突變之基因。突變基因已經歷變化，諸如遺傳物質之損失、增加或交換，此影響基因之正常傳輸及表現。如本文所用，「破壞之基因」係指具有產生提前終止密碼子之突變的突變基因。破壞之基因產物相對於未破壞之全長基因產物為截短的。
如本文所用，術語「表觀遺傳修飾調節子」係指經由表觀遺傳修飾(例如，經由組蛋白乙醯化或甲基化，或在靶基因之調控元件，例如啟動子、增強子或轉錄起始位點處之DNA甲基化)靶向基因表現之劑。染色質重塑及DNA甲基化為用於調控基因轉錄之兩種主要機制。特定表觀遺傳標誌(例如，DNA甲基化)結構上或生物化學上指導基因轉錄或基因靜默/抑制。舉例而言，調控轉錄活性之區域之DNA甲基化改變基因表現，而不改變潛在DNA序列。使用表觀遺傳修飾(例如，DNA甲基化)之轉錄調控允許靶向調節基因表現，而不影響其他基因產物之表現。
如本文所用，術語「非同源末端連接(NHEJ)路徑」係指藉由直接接合斷裂末端而無需同源模板來修復DNA中之雙股斷裂的路徑。藉由NHEJ對DNA末端之模板非依賴性再接合為在DNA斷裂點處引入無規微插入及微缺失(indel)之隨機易錯修復過程。此方法可用於有意破壞、缺失或改變靶向基因序列之閱讀框。NHEJ典型地使用稱為微同源之短同源DNA序列以引導修復。此等微同源常常存在於雙股斷裂之末端上的單股懸垂物中。當懸垂物完美相容時，NHEJ通常準確地修復斷裂，而導致核苷酸損失之非精確修復亦可能發生，但在懸垂物不相容時常見得多。
如本文所用，術語「正常基因」係指已經歷變化，諸如遺傳物質之損失、增加或交換之基因。正常基因經歷正常基因傳輸及基因表現。
如本文所用，術語「核酸酶介導之NHEJ」係指在諸如cas9之核酸酶切割雙股DNA之後起始之NHEJ。
如本文所用，如本文所用之術語「核酸」或「寡核苷酸」或「聚核苷酸」意指共價連接在一起之至少兩個核苷酸。單股之描繪亦定義互補股之序列。因此，核酸亦涵蓋所描繪之單股之互補股。核酸之許多變異體可用於與給定核酸相同之目的。因此，核酸亦涵蓋實質上一致之核酸及其補體。單股提供在嚴格雜交條件下可雜交至靶序列之探針。因此，核酸亦涵蓋在嚴格雜交條件下雜交之探針。核酸可為單股或雙股，或可含有雙股及單股序列兩者之部分。核酸可為DNA、基因體及cDNA、RNA或雜交體，其中核酸可含有去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸之組合，及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶及異鳥嘌呤之鹼基之組合。核酸可藉由化學合成方法或藉由重組方法獲得。
如本文所用，術語「可操作地連接」意指基因表現在空間上連接之啟動子控制下。啟動子可位於在其控制下之基因之5' (上游)或3' (下游)。啟動子與基因之間的距離可與彼啟動子與其在啟動子所來源之基因中控制之基因之間的距離近似相同。如此項技術中所知，可適應此距離之變化而不損失啟動子功能。
如本文所用，術語「部分功能」描述由突變基因編碼且具有比功能蛋白更小但大於非功能蛋白之生物活性的蛋白質。在一個實施例中，部分功能蛋白顯示出小於相應功能蛋白之生物活性之95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%或30%的生物活性。
如本文中可互換使用之術語「提前終止密碼子」或「框外終止密碼子」係指DNA序列之無義突變，其在野生型基因中通常未發現之位置處產生終止密碼子。提前終止密碼子可使得蛋白質與蛋白質之全長型式相比截短或更短。
如本文所用，術語「啟動子」或「核心啟動子」意指能夠賦予、活化或增強細胞中核酸之表現的合成分子或源自天然之分子。啟動子可包含一或多個特定轉錄調控序列以進一步增強核酸之表現及/或改變核酸之空間表現及/或時間表現。啟動子亦可包含遠端增強子或抑制子元件，該等元件可位於距轉錄起始位點多達數千個鹼基對處。啟動子可來源於包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲及動物之來源。啟動子關於表現發生之細胞、組織或器官，或關於表現發生之發育階段，或響應於諸如生理應激、病原體、金屬離子或誘導劑之外部刺激可組成性地或差異性地調控基因組分之表現。啟動子之代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、lac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子及CMV IE啟動子。
如本文所用，術語「靶基因」係指編碼已知或假定基因產物之任何核苷酸序列。靶基因可為遺傳疾病或病症中所涉及之突變基因。
如本文所用，術語「靶區」係指位點特異性核酸酶經設計所結合之靶基因之區域。
如本文所用，術語「轉殖基因」係指含有已自一個生物體中分離且引入不同生物體中之基因序列的基因或遺傳物質。或者，術語「轉殖基因」亦係指以化學方式合成且引入生物體中之基因或遺傳物質。DNA之此非原生區段可保留在轉殖基因生物體中產生RNA或蛋白質之能力，或其可改變轉殖基因生物體之遺傳密碼的正常功能。轉殖基因之引入具有改變生物體之表型的潛力。
如本文所用，術語「變異體」當關於核酸使用時意指(i)參考核苷酸序列之部分或片段；(ii)參考核苷酸序列或其一部分之補體；(iii)與參考核酸或其補體實質上一致之核酸；或(iv)在嚴格條件下雜交至參考核酸、其補體或與其實質上一致之序列的核酸。關於肽或多肽之「變異體」藉由胺基酸之插入、缺失或保守取代在胺基酸序列中不同，但保留至少一種生物活性。
變異體亦可意指胺基酸序列與具有保留至少一種生物活性之胺基酸序列之參考蛋白實質上一致的蛋白質。胺基酸之保守取代，亦即，胺基酸經具有類似特性(例如，電荷區之親水性、程度及分布)之不同胺基酸置換在此項技術中公認為典型地涉及微小變化。如此項技術中所了解，此等微小變化可部分地藉由考慮胺基酸之疏水性指數來鑑定。Kyte等人, J. Mol. Biol. 157: 105-132(1982)，以全文引用之方式併入本文中。胺基酸之疏水性指數係基於其疏水性及電荷之考慮因素。在此項技術中已知具有類似疏水性指數之胺基酸可經取代且仍保留蛋白功能。在一個態樣中，疏水性指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可用於揭露將產生保留生物功能之蛋白質的取代。在肽情形中胺基酸之親水性之考慮因素允許計算彼肽之最大局部平均親水性。可用親水性值在彼此±2以內之胺基酸進行取代。胺基酸之疏水性指數及親水性值均受彼胺基酸之特定側鏈所影響。與彼觀測結果一致，與生物功能相容之胺基酸取代應理解為取決於胺基酸且特別為彼等胺基酸之側鏈的相對相似性，如疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性所揭露。
如本文所用，如本文所用之術語「載體」意指含有複製起點之核酸序列。載體可為病毒載體、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可為DNA或RNA載體。載體可為自複製染色體外載體，諸如DNA質體。
如本文所用，術語「基因轉移」、「基因遞送」及「基因轉導」係指用於將特定核苷酸序列(例如，DNA或RNA)、融合蛋白、多肽及類似物可靠地插入靶向細胞中之方法或系統。
如本文所用，術語「腺病毒相關病毒(AAV)載體」、「AAV基因療法載體」及「基因療法載體」係指具有功能或部分功能ITR序列及轉殖基因之載體。如本文所用，術語「ITR」係指反向末端重複(ITR)。ITR序列可來源於腺相關病毒血清型，包括但不限於AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5及AAV-6。然而，ITR無需為野生型核苷酸序列，且可進行改變(例如，藉由核苷酸之插入、缺失或取代)，只要序列保留提供功能挽救、複製及包裝之功能即可。AAV載體可具有全部或部分缺失之AAV野生型基因中之一或多者，較佳為rep及/或cap基因，但保留功能側翼ITR序列。功能ITR序列作用於例如挽救、複製及包裝AAV病毒體或粒子。因此，「AAV載體」定義於本文中以包括將轉殖基因插入個體之細胞中所需之至少彼等序列。視情況包括病毒之複製及包裝(例如，功能ITR)所必需之呈順式之彼等序列。
如本文所用，術語「基因療法」係指一種治療患者之方法，其中將多肽或核酸序列轉移至患者之細胞中以便調節特定基因之活性及/或表現。在某些實施例中，抑制基因之表現。在某些實施例中，增強基因之表現。在某些實施例中，調節基因之時間或空間表現模式。
「轉殖基因」可含有轉殖基因序列或原生或野生型DNA序列。轉殖基因可成為個體之基因體之一部分。轉殖基因序列可為部分或完全物種異源的，亦即，轉殖基因序列或其一部分可來自不同於其所引入之細胞的物種。
如本文所用，術語「穩定地維持」係指經多代細胞維持其轉殖基因元件(亦即，所需之元件)中之至少一者的轉殖基因個體(例如，人類或非人類靈長類動物)之特徵。舉例而言，該術語旨在涵蓋最初轉染之細胞的所有細胞分裂週期。術語「穩定轉染」或「穩定地轉染」係指將外來DNA引入及整合至細胞之基因體中。術語「穩定轉染株」係指已將外來DNA穩定地整合至基因體DNA中之細胞。
如本文所用，術語「轉殖基因編碼」、「核酸分子編碼」、「DNA序列編碼」及「DNA編碼」係指沿一股去氧核糖核酸之去氧核糖核苷酸之次序或順序。此等去氧核糖核苷酸之次序可例如決定沿多肽(蛋白質)鏈之胺基酸之次序。DNA序列由此可編碼胺基酸序列。
如本文所用，術語「野生型」(wt)係指當自天然存在之來源中分離時具有彼基因或基因產物之特徵的基因或基因產物。野生型基因為在群體中最頻繁觀測到且因此任意設計為基因之「正常」或「野生型」形式之基因。相比之下，術語「經修飾」或「突變體」係指當與野生型基因或基因產物比較時展現序列及/或功能特性之修飾(亦即，改變之特徵)的基因或基因產物。應注意，可分離天然存在之突變體，其係藉由當與野生型基因或基因產物比較時獲取改變之特徵來鑑定。
如本文所用，術語「轉染」係指由細胞攝取外來核酸(例如，DNA或RNA)。當外源核酸(DNA或RNA)已引入細胞膜內時，細胞已「轉染」。許多轉染技術在此項技術中一般為已知的(參見例如Graham等人, Virol., 52:456 (1973)；Sambrook等人, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989)；Davis等人, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, (1986)；及Chu等人, Gene 13:197 (1981)，以全文引用之方式併入本文中)。此類技術可用於將一或多個外源DNA部分，諸如基因轉移載體及其他核酸分子引入適合之接受細胞中。
如本文所用，術語「穩定轉染」及「穩定地轉染」係指將外來DNA引入及整合至轉染之細胞的基因體中。術語「穩定轉染株」係指已將外來DNA穩定地整合至基因體DNA中之細胞。
如本文所用，術語「瞬時轉染」或「瞬時地轉染」係指將外來DNA引入細胞中，其中外來DNA未能整合至轉染之細胞的基因體中且保持呈游離體。在此期間，外來DNA經受調控控制，其主導染色體中內源基因之表現。術語「瞬時轉染株」係指已攝取外來DNA，但未能整合此DNA之細胞。如本文所用，術語「轉導」表示活體內或活體外經由複製缺陷型病毒載體，諸如經由重組AAV病毒體將DNA分子遞送至接受細胞。
如本文所用，術語「接受細胞」係指已由帶有所關注之所選核苷酸序列之核酸構築體或載體轉染或轉導，或能夠轉染或轉導之細胞。該術語包括母細胞之子代，無論該子代之形態或基因組成是否與原始母體相同，只要所選核苷酸序列存在即可。接受細胞可為基因療法粒子及/或基因療法載體已投與之個體之細胞。
如本文所用，術語「重組DNA分子」係指由藉助於分子生物技術連接在一起之DNA區段組成之DNA分子。
如本文所用，術語「調控元件」係指可控制核酸序列之表現的遺傳元件。舉例而言，啟動子為有助於起始可操作地連接之編碼區之轉錄的調控元件。其他調控元件為剪接訊號、聚腺苷酸化訊號、終止訊號等。
術語DNA「控制序列」共同地係指調控元件，諸如啟動子序列、聚腺苷酸化訊號、轉錄終止序列、上游調控結構域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子及類似物，其共同地提供接受細胞中編碼序列之複製、轉錄及轉譯。並非所有此等控制序列皆需要存在。
如本文所用，術語「增強子」係指含有多個活化子及抑制子結合位點之非編碼DNA序列。增強子之長度在50 bp至1500 bp之範圍內且可在近端，啟動子之上游5′處，經調控基因之任何內含子內，或在遠端，鄰近基因之內含子中，或遠離基因座之基因間區域，或不同染色體上之區域上。多於一個增強子可與啟動子相互作用。類似地，增強子可調控多於一個基因而無連接限制且可「跳過」鄰近基因以調控更遠端之基因。轉錄調控可涉及位於與啟動子所處之染色體不同之染色體中的元件。鄰近基因之近端增強子或啟動子可充當募集更遠端元件之平台。所用之增強子及啟動子相對於其可操作地連接之基因可為「內源」、「外源」或「異源」。「內源」增強子/啟動子為與基因體中之給定基因天然相關聯之增強子/啟動子。「外源」或「異源」增強子或啟動子為藉助於遺傳操縱(亦即，分子生物技術)與基因並置以使得由連接之增強子/啟動子指導彼基因之轉錄的增強子或啟動子。
如本文所用，術語「絕緣子」或「絕緣子元件」係指阻斷增強子與啟動子之間的相互作用之遺傳邊界元件。藉由處於增強子與啟動子之間，絕緣子可抑制其後續相互作用。絕緣子可確定增強子可影響之基因組。在染色體上之兩個相鄰基因具有極為不同之轉錄模式且一個基因之誘導或抑制機制不干擾鄰近基因之情況下，需要絕緣子。亦已發現絕緣子在拓撲相關結構域(TAD)之邊界處簇集且可在將基因體分隔至「染色體鄰區」-調控發生之基因體區域中起作用。據信絕緣子活性主要經由包括CTCF之蛋白質介導之DNA的3D結構發生。絕緣子可能經由多個機制起作用。許多增強子形成DNA環，該等DNA環在轉錄活化期間將該等增強子置於與啟動子區域物理接近。絕緣子可促進DNA環之形成，該等DNA環阻止啟動子-增強子環形成。障壁絕緣子可阻止異染色質自靜默之基因擴散至主動轉錄之基因。
如本文所用，術語「基因座控制區」係指增強遠端染色質位點處連接之基因之表現的長程順式調控元件。該元件以複本數依賴性方式起作用且為組織特異性的，如紅系細胞中3-球蛋白基因之選擇性表現所見。可由LCR及基因近端元件，諸如啟動子、增強子及靜默子修飾基因之表現水準。LCR藉由募集染色質修飾共活化子及轉錄複合物起作用。其序列在許多脊椎動物中為保守的，且特定位點之保留可表明功能中之重要性。
如本文中可互換使用之術語「靜默子」或「抑制子」係指能夠結合轉錄調控因子且阻止基因表現為蛋白質之DNA序列。靜默子為誘導對其特定基因之轉錄之負性作用的序列特異性元件。靜默子元件可位於DNA中之許多位置。在靶基因之上游發現最常見位置，在此其可幫助抑制基因轉錄。此距離可在基因之上游約-20 bp至-2000 bp之間極大地變化。可在位於基因本身之內含子或外顯子內之啟動子之下游發現某些靜默子。亦已在mRNA之3′未轉譯區(3′ UTR)內發現靜默子。DNA中存在兩種主要類型之靜默子，其為典型靜默子元件及非典型負性調控元件(NRE)。在典型靜默子中，基因由靜默子元件主動地抑制，主要藉由干擾通用轉錄因子(GTF)組裝。NRE被動地抑制基因，通常藉由抑制基因之上游的其他元件。
如本文所用，術語「組織特異性」係指調控元件或控制序列，諸如啟動子、增強子等，其中核酸序列之表現在特定細胞類型或組織中實質上更高。
表現載體上「剪接訊號」之存在常常使得重組轉錄物之表現水準更高。剪接訊號介導內含子自初級RNA轉錄物中移除且由剪接供體及受體位點組成(Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), 第16.7-16.8頁，以全文引用之方式併入本文中)。通常使用之剪接供體及受體位點為來自SV40之16S RNA之剪接接合點。
轉錄終止訊號一般在聚腺苷酸化訊號之下游發現且長度為數百個核苷酸。如本文所用，術語「聚A位點」或「聚A序列」表示指導初生RNA轉錄物之終止及聚腺苷酸化之DNA序列。當缺乏聚A尾之轉錄物不穩定且快速降解時，重組轉錄物之有效聚腺苷酸化為需要的。表現載體中利用之聚A訊號可為「異源」或「內源」。內源聚A訊號為在基因體中給定基因之編碼區之3'末端處天然地發現之訊號。異源聚A訊號為已自一個基因中分離且可操作地連接至另一個基因之3'末端的訊號。通常使用之異源聚A訊號為SV40聚A訊號。SV40聚A訊號包含於237 bp BamHI/BclI限制片段上且指導終止及聚腺苷酸化(Sambrook等人, 同上, 16.6-16.7，以全文引用之方式併入本文中)。
如本文所用，術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用且係指人類及非人類動物。本揭示案之術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、乳牛、雞、兩棲動物、爬行動物及類似動物。
如本文所定義，「治療有效量」或「治療有效劑量」為能夠產生足量之所需蛋白質以按所需方式調節蛋白質之活性，由此提供用於臨床干預之舒緩工具的融合蛋白、多肽、核酸、脂質奈米粒子、脂質體、AAV粒子或病毒體之量或劑量。在一些實施例中，如本文所述之轉染之融合蛋白、多肽、核酸、AAV粒子或病毒體之治療有效量或劑量足夠賦予由融合蛋白/基因療法構築體靶向之基因的抑制。
如本文所用，術語「治療」例如病症意指當投與融合分子或編碼融合分子之核酸，及/或gRNA或編碼gRNA之核酸(例如，如本文所述)時與從未投與融合分子或編碼融合分子之核酸，及/或gRNA或編碼gRNA之核酸相比，患有病症，處於患有病症之風險下及/或經歷病症之症狀的個體(例如，人類)將在一個實施例中罹患較不嚴重之症狀及/或將較快恢復。 II. DNA 結合蛋白
在某些實施例中，在根據本揭示案之如本文所定義之方法及組合物中，DNA結合蛋白(例如，DNA靶向劑)包含(DNA)核酸酶，諸如可按序列特異性方式靶向DNA或可指導或指示按序列特異性方式靶向DNA之核酸酶，諸如CRISPR-Cas系統、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)或兆核酸酶。在一些實施例中，DNA結合蛋白為來源於CRISPR-Cas系統之DNA核酸酶。 轉錄活化子樣效應核酸酶 (TALEN) 系統
在某些實施例中，核酸結合蛋白(例如，DNA結合蛋白)為(經修飾)轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)系統。轉錄活化子樣效應子(TALE)可經工程改造以實際上結合任何所需之DNA序列。使用TALEN系統之基因體編輯之示例性方法可見於例如以下文獻中：Cermak T. Doyle EL. Christian M. Wang L. Zhang Y. Schmidt C等人, Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 2011;39:e82；Zhang F. Cong L. Lodato S. Kosuri S. Church GM. Arlotta P Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nat Biotechnol. 2011;29: 149-153；及美國專利第8,450,471號、第8,440,431號及第8,440,432號，各文獻以全文引用之方式併入。
藉助於進一步導則且不受限制，天然存在之TALE或「野生型TALE」為由變形菌門之眾多菌種分泌之核酸結合蛋白。TALE多肽含有由高度保守之單體多肽之串聯重複組成之核酸結合結構域，該等單體多肽之長度主要為33、34或35個胺基酸且主要在胺基酸位置12及13處彼此不同。在一些實施例中，核酸為DNA。
如本文所用，術語「多肽單體」或「TALE單體」將用於指代TALE核酸結合結構域內高度保守之重複多肽序列且術語「重複可變二殘基」或「RVD」將用於指代多肽單體之位置12及13處之高度可變胺基酸。
如本揭示案通篇所提供，使用胺基酸之IUPAC單字母代碼描繪RVD之胺基酸殘基。包含於DNA結合結構域內之TALE單體之一般表示為X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35，其中下標指示胺基酸位置且X代表任何胺基酸。X12X13指示RVD。在一些多肽單體中，位置13處之可變胺基酸缺失或不存在，且在此類多肽單體中，RVD由單一胺基酸組成。在此類情況下，RVD可替代地表示為X*，其中X代表X12且(*)指示X13不存在。DNA結合結構域包含TALE單體之若干重複且此可表示為(X1-l l-(X12X13)-X14-33或34或35)z，其中在一個有利實施例中，z為至少5至40。在又一個有利實施例中，z為至少10至26。TALE單體具有由其RVD中之胺基酸之身份所確定之核苷酸結合親和力。舉例而言，RVD為NI之多肽單體優先結合至腺嘌呤(A)，RVD為NG之多肽單體優先結合至胸腺嘧啶(T)，RVD為HD之多肽單體優先結合至胞嘧啶(C)，且RVD為NN之多肽單體優先結合至腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)兩者。在本揭示案之又一個實施例中，RVD為IG之多肽單體優先結合至T。因此，TALE之核酸結合結構域中之多肽單體重複之數目及次序決定其核酸標靶特異性。在本揭示案之其他實施例中，RVD為NS之多肽單體識別全部四個鹼基對且可結合至A、T、G或C。TALE之結構及功能進一步描述於例如Moscou等人, Science 326: 1501 (2009)；Boch等人, Science 326: 1509-1512 (2009)；及Zhang等人, Nature Biotechnology 29: 149-153 (2011)中，各文獻以全文引用之方式併入。在某些實施例中，由結合TALEN片段之聚核酸實現靶向。在某些實施例中，靶向結構域包含或由催化非活性TALEN或其核酸結合片段組成。 鋅指核酸酶 (ZFN) 系統
在某些實施例中，核酸結合蛋白(例如，DNA結合蛋白)包含或由(經修飾)鋅指核酸酶(ZFN)系統組成。ZFN系統使用藉由使鋅指DNA結合結構域融合至可經工程改造以靶向所需DNA序列之DNA裂解結構域而產生之人工限制酶。使用ZFN之基因體編輯之示例性方法可見於例如美國專利第6,534,261號、第6,607,882號、第6,746,838號、第6,794,136號、第6,824,978號、第6,866,997號、第6,933,113號、第6,979,539號、第7,013,219號、第7,030,215號、第7,220,719號、第7,241,573號、第7,241,574號、第7,585,849號、第7,595,376號、第6,903,185號及第6,479,626號中，各專利以全文引用之方式併入。藉助於進一步導則且不受限制，人工鋅指(ZF)技術涉及ZF模組之陣列以靶向基因體中之新DNA結合位點。ZF陣列中之各指模組靶向三個DNA鹼基。個別鋅指結構域之定製陣列組裝成ZF蛋白(ZFP)。ZFP可包含功能結構域。藉由使ZF蛋白融合至IIS型限制酶FokI之催化結構域來開發第一合成鋅指核酸酶(ZFN)。(Kim, Y. G.等人, 1994, Chimeric restriction endonuclease, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 883-887；Kim, Y. G.等人, 1996, Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160)。藉由使用各自靶向由短間隔子隔開之不同核苷酸序列的成對ZFN異二聚體獲得增加之裂解特異性及降低之脫靶活性。(Doyon, Y.等人, 2011, Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods 8, 74-79)。ZFP亦可設計成轉錄活化子及抑制子且已用於靶向多種生物體中之許多基因。在某些實施例中，靶向結構域包含或由結合鋅指核酸酶之核酸或其核酸結合片段組成。在某些實施例中，結合鋅指核酸酶(片段)之核酸為催化非活性的。 兆核酸酶
在某些實施例中，核酸結合蛋白(例如，DNA結合蛋白)包含(經修飾)兆核酸酶，其為由大識別位點(12至40個鹼基對之雙股DNA序列)表徵之去氧核糖核酸內切酶。使用兆核酸酶之示例性方法可見於美國專利第8,163,514號、第8,133,697號、第8,021,867號、第8,119,361號、第8,119,381號、第8,124,369號及第8,129,134中，各專利以全文引用之方式併入。在某些實施例中，由結合兆核酸酶片段之聚核酸實現靶向。在某些實施例中，由結合催化非活性兆核酸酶(片段)之聚核酸實現靶向。因此，在特定實施例中，靶向結構域包含或由結合兆核酸酶之核酸或其核酸結合片段組成。 CRISPR-Cas 系統
在一些實施例中，本揭示案之核酸結合蛋白(例如，DNA結合蛋白)及單嚮導RNA序列來源於CRISPR-Cas系統。本揭示案提供用於基因體編輯及治療遺傳疾病之基於CRISPR/Cas9之工程改造系統。基於CRISPR/Cas9之工程改造系統可經設計以靶向任何基因(例如，PCSK9)，包括遺傳疾病、肝臟疾病及膽固醇(諸如LDL)調控異常中所涉及之基因。本揭示案提供一種包含遺傳工程改造之Cas蛋白及/或嚮導RNA之CRISPR-Cas系統，該系統具有所需特異性及活性(例如，減少或消除PCSK9基因產物之表現)。基於CRISPR/Cas9之系統可包括Cas9蛋白、突變Cas9蛋白或Cas9融合蛋白(例如，DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB融合分子)及至少一個sgRNA (例如，PCSK9 sgRNA)。Cas9融合蛋白可例如包括具有與對Cas9內源之融合蛋白(例如，DNMT3A、DNMT3L或KRAB)不同之活性的結構域。
一般而言，Cas蛋白(在本文中與CRISPR蛋白、CRISPR酶、CRISPR-Cas蛋白、CRISPR-Cas酶、Cas、CRISPR效應子或Cas效應蛋白可互換使用)及/或嚮導序列為CRISPR-Cas系統之組分。CRISPR-Cas系統或CRISPR系統共同地係指CRISPR相關(「Cas」)基因之表現或指導Cas基因之活性中所涉及之轉錄物及其他元件，包括編碼Cas基因之序列、tracr (反式活化CRISPR)系統(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侶序列(在內源CRISPR系統之情形中涵蓋「正向重複」及tracrRNA加工之部分正向重複)、嚮導序列(在內源CRISPR系統之情形中亦稱作「間隔子」)或「RNA」，彼術語在本文中使用(例如用以引導Cas之RNA，例如CRISPR RNA及反式活化(tracr) RNA或單嚮導RNA (也稱為sgRNA；嵌合RNA))，或來自CRISPR基因座之其他序列及轉錄物。
一般而言，CRISPR系統係由促進在靶序列之位點處形成CRISPR複合物之元件(在內源CRISPR系統之情形中亦稱作原間隔子)表徵。在本揭示案之工程改造系統中，正向重複可涵蓋天然存在之序列或非天然存在之序列。本揭示案之正向重複不限於天然存在之長度及序列。此外，本揭示案之正向重複可包括核苷酸插入，諸如結合至轉接蛋白(用於與功能結構域相關聯)之適體或序列。在某些實施例中，含有諸如插入之正向重複之一個末端約為短DR之前一半且末端約為短DR之後一半。
在形成CRISPR複合物之情形中，「靶序列」或「靶聚核苷酸」係指嚮導序列經設計以與其具有互補性之序列，其中靶序列與嚮導序列之間的雜交促進CRISPR複合物形成。靶序列可包含任何聚核苷酸，諸如DNA或RNA聚核苷酸。在一些實施例中，靶序列位於細胞之細胞核或細胞質中。
一般而言，嚮導序列(或間隔序列)可為與靶聚核苷酸序列具有足夠互補性以與靶序列雜交且指導CRISPR複合物與靶序列之序列特異性結合的任何聚核苷酸序列。在一些實施例中，當使用適合之比對演算法最佳比對時，嚮導序列與其相應靶序列之間的互補性程度為約或大於約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
在某些實施例中，可藉由在間隔序列與靶序列之間引入錯配，例如1個或多個錯配，諸如1個或2個錯配，包括沿間隔子/標靶之錯配位置來利用裂解效率之調節。舉例而言，雙重錯配更處於中心(亦即，並非3'或5')，則裂解效率更受影響。因此，藉由選擇沿間隔子之錯配位置，可調節裂解效率。舉例而言，若需要標靶小於100%裂解(例如，在細胞群體中)，則可將間隔序列與靶序列之間的1個或多個，諸如較佳2個錯配引入間隔序列中。沿錯配位置之間隔子更處於中心，則裂解百分比更低。
CRISPR-Cas系統或其組分可用於將一或多個突變引入靶基因座或核酸序列中。突變可包括經由嚮導RNA或sgRNA在細胞之各靶序列處一或多個核苷酸之引入、缺失或取代。突變可包括經由嚮導RNA在該(該等)細胞之各靶序列處1-75個核苷酸之引入、缺失或取代。
典型地，在內源CRISPR-Cas系統之情形中，CRISPR複合物(包含雜交至靶序列且與一或多個Cas蛋白復合之嚮導序列)的形成使得靶序列中或附近(例如，自靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個或更多個鹼基對內)發生裂解，但可取決於例如二級結構，特別在RNA標靶之情況下。在一些情況下，在內源CRISPR系統之情形中，CRISPR複合物(包含雜交至靶序列且與一或多個Cas蛋白復合之嚮導序列)的形成使得靶序列中或附近(例如，自靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個或更多個鹼基對內)之一股或兩股(若適用)發生裂解。
在一些實施例中，嚮導RNA (能夠將Cas引導至靶基因座)可包含(1)能夠雜交至真核細胞中之靶基因座(聚核苷酸靶基因座，諸如RNA靶基因座)之嚮導序列；(2)正向重複(DR)序列，其處於單一RNA中，亦即，sgRNA (以5'至3'方向排列)或crRNA。
關於CRISPR-Cas系統、其組分及此類組分之遞送，包括方法、材料、遞送運載體、載體、粒子、AAV及其製造及使用，包括關於量及調配物(全部適用於實施本揭示案)之一般資訊，參考：美國專利第8,999,641號、第8,993,233號、第8,945,839號、第8,932,814號、第8,906,616號、第8,895,308號、第8,889,418號、第8,889,356號、第8,871,445號、第8,865,406號、第8,795,965號、第8,771,945號及第8,697,359號；美國專利公開案第US 2014-0310830號、第US 2014-0287938 A1號、第US 2014-0273234 A1號、第US 2014-0273232 A1號、第US 2014-0273231 A1號、第US 2014-0256046 A1號、第US 2014-0248702 A1號、第US 2014-0242700 A1號、第US 2014-0242699 A1號、第US 2014-0242664 A1號、第US 2014-0234972 A1號、第US 2014-0227787 A1號、第US 2014-0189896 A1號、第US 2014-0186958號、第US 2014-0186919 A1號、第US 2014-0186843 A1號、第US 2014-0179770 A1號及第US 2014-0179006 A1號、第US 2014-0170753號；歐洲專利EP 2784162 B1及EP 2771468 B1；歐洲專利申請案EP 2771468、EP 2764103及EP 2784162；及PCT專利公開案WO 2021/183807A1 (PCT/US2021/021973)、WO 2014/093661 (PCT/US2013/074743)、WO 2014/093694 (PCT/US2013/074790)、WO 2014/093595 (PCT/US2013/074611)、WO 2014/093718 (PCT/US2013/074825)、WO 2014/093709 (PCT/US2013/074812)、WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US2013/074691)、WO 2014/093655 (PCT/US2013/074736)、WO 2014/093712 (PCT/US2013/074819)、WO 2014/093701 (PCT/US2013/074800)、WO 2014/018423 (PCT/US2013/051418)、WO 2014/204723 (PCT/US2014/041790)、WO 2014/204724 (PCT/US2014/041800)、WO 2014/204725 (PCT/US2014/041803)、WO 2014/204726 (PCT/US2014/041804)、WO 2014/204727 (PCT/US2014/041806)、WO 2014/204728 (PCT/US2014/041808)、WO 2014/204729 (PCT/US2014/041809)，各專利以全文引用之方式併入本文中。 Cas 蛋白
Cas蛋白(例如，工程改造之Cas蛋白)可具有與野生型對應物Cas蛋白實質上相同(例如，介於80%與100%之間、介於90%與100%之間、介於95%與100%之間、介於98%與100%之間、介於99%與100%之間、介於99.9%與100%之間或約100%)之核酸酶活性。在某些情況下，工程改造之Cas蛋白具有比野生型對應物Cas蛋白高(例如，高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)之核酸酶活性。
替代地或另外，Cas蛋白(例如，工程改造之Cas蛋白)具有比野生型對應物Cas蛋白高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之特異性。在一個特定實例中，Cas蛋白(例如，工程改造之Cas蛋白)可具有比野生型對應物Cas蛋白高至少30%之特異性。如本文所用，Cas之術語「特異性」可對應於相對於所有聚核苷酸裂解事件(包括中靶及脫靶事件)之數目或百分比的中靶聚核苷酸裂解事件之數目或百分比。Cas蛋白之活性及特異性與以下文獻中所述之彼等一致：Hsu PD等人, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases, Nat Biotechnol. 2013年9月; 31(9): 827- 832；及Slaymaker IM等人, Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity, Science. 2016年1月 l; 351(6268): 84-88，其亦描述用於偵測Cas蛋白之活性及特異性之方法的實例，且以全文引用之方式併入本文中，且在本文別處詳述。
在一些實施例中，Cas蛋白(例如，其RuvC結構域)可使一個鹼基向上游滑動(相對於PAM)，且產生交錯切口，該交錯切口可經填充且引起單一鹼基之複製(亦即，+1插入)。+1插入位置之一個實例描述於Zuo, Z.及Liu, J. (2016). Cas9-catalyzed DNA Cleavage Generates Staggered Ends: Evidence from Molecular Dynamics Simulations. Scientific Reports 6, 37584中。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白具有不同於野生型對應物Cas蛋白之+1插入頻率。舉例而言，當鳥嘌呤相對於PAM存在於-2位置處時的+1插入頻率高於當胸苷、胞苷或腺嘌呤相對於PAM存在於-2處時的+1插入頻率。在一些情況下，+1插入取決於人類細胞中之宿主機器。在一些實例中，Cas蛋白可產生交錯切口。交錯切口可為1-bp或1-核苷酸5'懸垂物。交錯切口可為1-bp或1-核苷酸3'懸垂物。
編碼Cas之核酸分子可經密碼子最佳化。在此種情況下，密碼子最佳化序列之一個實例為針對在真核生物，例如人類中之表現(亦即，針對在人類中之表現進行最佳化)或針對如本文所論述之另一種真核生物、動物或哺乳動物進行最佳化之序列；參見例如WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)中之SaCas9人類密碼子最佳化序列。儘管此為較佳的，但將了解，可能存在其他實例且針對除人類以外之宿主物種之密碼子最佳化或針對特定器官之密碼子最佳化為已知的。在一些實施例中，編碼Cas之酶編碼序列針對在特定細胞，諸如真核細胞中之表現進行密碼子最佳化。真核細胞可為特定生物體之彼等或來源於特定生物體，諸如哺乳動物，包括但不限於人類，或如本文所論述之非人類真核生物或動物或哺乳動物，例如，小鼠、大鼠、兔、犬、家畜或非人類哺乳動物或靈長類動物。在一些實施例中，可排除用於修改人類之種系遺傳一致性之過程及/或用於修改動物之遺傳一致性之過程(該等過程可能導致其不具有人類或動物之任何實質性醫學效益)，以及由此類過程產生之動物。一般而言，密碼子最佳化係指修飾核酸序列用於增強所關注之宿主細胞中之表現的過程，該過程係藉由將原生序列之至少一個密碼子(例如，約或多於約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個或更多個密碼子)用彼宿主細胞之基因中更頻繁或最頻繁使用之密碼子置換，同時維持原生胺基酸序列。各種物種展現出特定胺基酸之某些密碼子之特定偏倚。密碼子偏倚(生物體之間的密碼子使用之差異)常常與信使RNA (mRNA)之轉譯效率相關，據信轉譯效率繼而尤其取決於所轉譯之密碼子之特性及特定轉移RNA (tRNA)分子之可用性。細胞中所選tRNA之優勢一般反映肽合成中最頻繁使用之密碼子。因此，基因可基於密碼子最佳化針對給定生物體中之最佳基因表現作調整。密碼子使用表易獲得，例如，在www.kazusa.orjp/codon/獲得之「密碼子使用資料庫」，且此等表可按許多方式進行改適。參見Nakamura, Y.等人, 「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000」 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)。用於針對在特定宿主細胞中之表現對特定序列進行密碼子最佳化之電腦演算法亦可用，諸如Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA)亦可用。在一些實施例中，編碼Cas之序列中之一或多個密碼子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個或更多個或所有密碼子)對應於針對特定胺基酸最頻繁使用之密碼子。
在一些實施例中，Cas蛋白可具有核酸裂解活性。Cas蛋白可具有RNA結合及DNA裂解功能。在一些實施例中，Cas可指導靶序列或靶序列附近之位置處，諸如靶序列內及/或靶序列之補體內或與靶序列相關之序列處，例如，在來自靶序列之第一個或最後一個核苷酸之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500個或更多個鹼基對內的一或兩個核酸股之裂解。在一些實施例中，Cas蛋白可指導靶序列內及/或靶序列之補體內或與靶序列相關之序列處及/或在來自靶序列之第一個或最後一個核苷酸之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500個或更多個鹼基對內的一股或兩股之多於一個裂解(諸如一個、兩個、三個、四個、五個或更多個裂解)。在一些實施例中，裂解可為平齊的，亦即，產生平齊末端。在一些實施例中，裂解可為交錯的，亦即，產生黏性末端。
在一些實施例中，載體編碼核酸靶向Cas蛋白，其可相對於相應野生型酶發生突變以使得突變之核酸靶向Cas蛋白缺乏使含有靶序列之靶聚核苷酸之一股或兩股裂解之能力，例如，HNH結構域中之改變或突變以產生實質上缺乏所有DNA裂解活性之突變Cas，例如，突變酶之DNA裂解活性大約不超過酶之非突變形式之核酸裂解活性的25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%或更低；一個實例可為當突變形式之核酸裂解活性與非突變形式相比為零或可忽略時。如本文所用，關於酶之術語「所得」意指所得酶主要基於與野生型酶具有高度序列同源性之意義上，但其以與此項技術中已知或本文所述相同之方式發生突變(修飾)。
典型地，在內源核酸靶向系統之情形中，核酸靶向複合物(包含雜交至靶序列且與一或多個核酸靶向效應蛋白復合之嚮導RNA或crRNA)的形成使得靶序列中或附近(例如，自靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個或更多個鹼基對內)之DNA股發生裂解。如本文所用，術語「與所關注之靶基因座相關之序列」係指靶序列之鄰處附近(例如，自靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個或更多個鹼基對內，其中靶序列包含於所關注之靶基因座內)之序列。
將了解，效應蛋白係基於或來源於酶，因此術語「效應蛋白」在一些實施例中當然包括「酶」。然而，亦將了解，在一些實施例中，效應蛋白在需要時可具有DNA或RNA結合，但不一定具有切割或切口活性，包括死Cas蛋白功能。
在一些實施例中，Cas蛋白可形成可誘導系統之組分。系統之可誘導性質將允許使用一種形式之能量進行基因編輯或基因表現之時空控制。能量之形式可包括但不限於電磁輻射、聲能、化學能及熱能。可誘導系統之實例包括四環素可誘導啟動子(Tet-On或Tet-Off)、小分子雙雜交轉錄活化系統(FKBP、ABA等)或光可誘導系統(植物色素、LOV結構域或隱花色素)。在一個實施例中，CRISPR效應蛋白可為光可誘導轉錄效應子(LITE)之一部分以按序列特異性方式指導轉錄活性之變化。光之組分可包括CRISPR效應蛋白、光響應型細胞色素異二聚體(例如，來自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana))及轉錄活化/抑制結構域。可誘導DNA結合蛋白之其他實例及其使用方法提供於US 61/736465及US 61/721,283及WO 2014018423 A2中，該等文獻藉此以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，突變之Cas可具有一或多個突變，從而降低脫靶效應，例如，改善CRISPR酶用於實現修飾以靶向基因座，但減少或消除偏向於脫靶之活性，諸如當與嚮導RNA復合時，以及改善CRISPR酶用於增加CRISPR酶之活性，諸如當與嚮導RNA復合時。應了解，如下文所述之突變酶可用於如本文別處所述之根據本揭示案之方法中之任一者中。如本文別處所述之方法、產物、組合物及用途中之任一者同等地適用於如下文進一步詳述之突變CRISPR酶。
可按各種組合形式採用以增加或減小中靶對比脫靶活性之活性及/或特異性，或增加或減小中靶對比脫靶結合之結合及/或特異性的方法及突變可用於補償或增強為促進其他作用所進行之突變或修飾。為促進其他作用所進行之此類突變或修飾包括對Cas之突變或修飾或者對嚮導RNA進行之突變或修飾。本揭示案之方法及突變用於調節Cas核酸酶活性及/或與化學修飾之嚮導RNA之結合。
在某些實施例中，改變或修飾本揭示案之Cas蛋白之催化活性。應了解，若催化活性不同於相應野生型Cas蛋白(例如，未突變之Cas蛋白)之催化活性，則突變之Cas具有改變或修飾之催化活性。催化活性可藉由此項技術中已知之方式確定。舉例而言且不受限制，催化活性可在活體外或活體內藉由確定indel百分比(例如，在給定時間後或在給定劑量下)來確定。在某些實施例中，催化活性增加。在某些實施例中，催化活性增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。在某些實施例中，催化活性減小。在某些實施例中，催化活性減小至少5%，較佳至少10%，更佳至少20%，諸如至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或(實質上) 100%。本文中之一或多個突變可滅活催化活性，此可實質上減小所有催化活性，將活性減至低於可偵測水準，或減至不可量測之催化活性。
工程改造之Cas蛋白之一或多種特徵可不同於相應野生型Cas蛋白。此類特徵之實例包括Cas蛋白之催化活性、gRNA結合、特異性(例如，編輯所定義之標靶之特異性)、Cas蛋白之穩定性、脫靶結合、靶結合、蛋白酶活性、切口酶活性、PFS識別。在一些實例中，工程改造之Cas蛋白可包含相應野生型Cas蛋白之一或多個突變。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白之催化活性與相應野生型Cas蛋白相比增加。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白之催化活性與相應野生型Cas蛋白相比減小。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白之gRNA結合與相應野生型Cas蛋白相比增加。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白之gRNA結合與相應野生型Cas蛋白相比減小。在一些實施例中，Cas蛋白之特異性與相應野生型Cas蛋白相比增加。在一些實施例中，Cas蛋白之特異性與相應野生型Cas蛋白相比減小。在一些實施例中，Cas蛋白之穩定性與相應野生型Cas蛋白相比增加。在一些實施例中，Cas蛋白之穩定性與相應野生型Cas蛋白相比減小。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白進一步包含一或多個滅活催化活性之突變。在一些實施例中，Cas蛋白之脫靶結合與相應野生型Cas蛋白相比增加。在一些實施例中，Cas蛋白之脫靶結合與相應野生型Cas蛋白相比減小。在一些實施例中，Cas蛋白之靶結合與相應野生型Cas蛋白相比增加。在一些實施例中，Cas蛋白之靶結合與相應野生型Cas蛋白相比減小。在一些實施例中，工程改造之Cas蛋白與相應野生型Cas蛋白相比具有較高蛋白酶活性或聚核苷酸結合能力。在一些實施例中，PFS識別與相應野生型Cas蛋白相比改變。 Cas 蛋白之實例
Cas蛋白之實例包括I類(例如，I型、III型及IV型)及2類(例如，II型、V型及VI型) Cas蛋白之彼等，例如，Cas9、Cas12 (例如，Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d)、Cas13 (例如，Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d)、CasX、CasY、Cas14、其變異體(例如，突變形式、截短形式)、其同源物及其異種同源物。術語「異種同源物」及「同源物」在此項技術中為熟知的。藉助於進一步導則，如本文所用，蛋白質之「同源物」為相同物種之蛋白質，其執行與作為其同源物之蛋白質相同或相似之功能。同源蛋白可能但無需結構上相關，或僅部分結構上相關。如本文所用，蛋白質之「異種同源物」為不同物種之蛋白質，其執行與作為其異種同源物之蛋白質相同或相似之功能。異種同源蛋白可能但無需結構上相關，或僅部分結構上相關。 2 類 Cas 蛋白
在一些實施例中，Cas蛋白為2類Cas蛋白，亦即，2類CRISPR-Cas系統之Cas蛋白。2類CRISPR-Cas系統可具有亞型，例如，II-A型、II-B型、II-C型、V-A型、V-B型、V-C或V-U型。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c或Cas12d。在一些實施例中，Cas9可為SpCas9、SaCas9、StCas9及其他Cas9異種同源物。Cas12可為Cas12a、Cas12b及Cas12c，包括FnCas12a，或其同源物或異種同源物。CRISPR-Cas系統之定義及示例性成員包括Kira S. Makarova及Eugene V. Koonin, Annotation and Classification of CRISPR-Cas systems, Methods Mol Biol. 2015; 1311: 47-75；及Sergey Shmakov等人, Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems, Nat Rev Microbial. 2017年3月; 15(3): 169-182中所述之彼等。 Cas 蛋白連接子
在一些實例中，Cas蛋白包含至少一個RuvC結構域及至少一個HNH結構域。Cas蛋白可進一步包含連接RuvC結構域及HNH結構域之第一及第二連接子結構域。連接Cas9中之HNH及RuvC結構域之第一連接子(L1)及第二連接子(L2)描述於Nishimasu, H.等人 「Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target RNA」 Cell 156 (2014年2月27日): 935-949及Ribeiro, L.等人 (2018) 「Protein engineering strategies to expand CRISPR-Cas9 applications」 International Journal of Genomics Volume 2018, 文章ID 1652567 (doi.org/10.1155/2018/1652567)之研究中。Ribeiro之圖1展示Cas9之總體組織、結構及功能，特定地以引用之方式併入本文中。特定地，圖1A展示SpCas9之結構域組織之示意性代表圖，其指示包括如本文所述之連接子L1 (跨越胺基酸765-780)及L2 (跨越胺基酸906-918)之HNH及RuvC結構域之遺傳架構。
類似地，當提及第一及第二連接子結構域時，可利用金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)之結構域組織。在一個態樣中，連接子1結構域區域跨越殘基481-519，且將SaCas9中之RuvC-II結構域連接至HNH結構域。在一些實施例中，連接子2區域跨越殘基629-649，且連接SaCas9之RuvC-III結構域及HNH結構域。因此，第一及/或第二連接子結構域可在Cas9異種同源物中發生突變，且可參考對應於野生型SaCas9之胺基酸的胺基酸殘基。參見Nishimasu, Cell. 2015年8月27日; 162(5): 1113-1126; doi: 10.1016/j.cell.2015.08.007，以引用之方式併入本文中。特別地，Nishimasu之圖1 S1-S3詳述Cas9蛋白之結構域組織，且關於其教示內容特定地以引用之方式併入本文中。
第一及第二連接子可包含約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45個或更多個胺基酸。第一及第二連接子可對應於野生型連接子。在一些態樣中，第一及第二連接子可包含第一及/或第二連接子中之一或多個突變。在一個態樣中，第一及/或第二連接子包含一或多個改善Cas9蛋白特異性之突變。
在一些實施例中，連接Cas9之HNH及RuvC結構域之連接子L1及L2含有野生型胺基酸序列。在一些實施例中，連接HNH及RuvC結構域之連接子含有一或多個胺基酸之突變。在一個示例性實施例中，第一連接子(L1)含有對應於SpCas9之胺基酸T769I之突變及/或第二連接子(L2)含有對應於SpCas9之胺基酸G915M之突變。在一個示例性實施例中，一或多個連接子突變，例如T769I及G915M，向Cas9蛋白賦予改善之特異性。
在一個實施例中，如本文所述，第一及第二連接子中之一或多個突變可與Cas9蛋白之其他部分中之一或多個突變組合用於進一步改善特異性及/或保留實質上等效於野生型Cas9蛋白之活性。在一個實施例中，連接子中之突變及/或Cas蛋白內之額外突變可利用本文詳述之方法鑑定，該等方法增強/改善特異性且實質上保留野生型Cas9之野生型活性。 2 類 II 型 Cas 蛋白 ( 例如， Cas9)
在一些實施例中，Cas蛋白可為2類II型CRISPR-Cas系統之Cas蛋白(II型Cas蛋白)。在一些實施例中，Cas蛋白可為2類II型Cas蛋白，例如，Cas9。在一些實施例中，基於CRISPR/Cas9之系統可包括Cas9蛋白或其片段、Cas9融合蛋白、編碼Cas9蛋白或其片段之核酸，或編碼Cas9融合蛋白之核酸。「Cas9 (CRISPR相關蛋白9)」意指與NCBI寄存編號NP_269215具有至少約85%胺基酸一致性且具有RNA結合活性、DNA結合活性及/或DNA裂解活性(例如，核酸內切酶或切口酶活性)之多肽或其片段。「Cas9功能」可藉由許多檢定中之任一者來定義，包括但不限於基於螢光偏振之核酸結合檢定、基於螢光偏振之股侵入檢定、轉錄檢定、EGFP破壞檢定、DNA裂解檢定及/或量測器檢定，例如，如本文所述。「Cas 9核酸分子」意指編碼Cas9多肽或其片段之聚核苷酸。示例性Cas9核酸分子序列以基因體序列編號NC_002737提供。在一些實施例中，本文揭示Cas9，例如，釀膿鏈球菌( S. pyogenes) (SpCas9)或金黃色葡萄球菌( S. aureus) (SaCas9)中天然存在之Cas9，或其變異體之抑制劑。Cas9使用原間隔子鄰近基元(PAM)序列及由嚮導RNA (gRNA)對靶DNA之鹼基配對來識別外來DNA。由Cas9在任何基因體基因座處誘導靶向股斷裂之相對簡易性能夠在多個細胞類型及生物體中進行有效基因體編輯。Cas9衍生物亦可用作轉錄活化子/抑制子。
在一些情況下，CRISPR-Cas蛋白為Cas9或其變異體。在一些實例中，Cas9可為包括任何天然存在之細菌Cas9之野生型Cas9。Cas9異種同源物典型地共享3-4個RuvC結構域及HNH結構域之一般組織。5'最末RuvC結構域使非互補股裂解，且HNH結構域使互補股裂解。所有標識皆參考嚮導序列。經由所關注之Cas9與其他Cas9異種同源物(來自釀膿鏈球菌II型CRISPR基因座、嗜熱鏈球菌( S. thermophilus) CRISPR基因座1、嗜熱鏈球菌CRISPR基因座3及新兇手弗朗西斯菌( Franciscilla novicida) II型CRISPR基因座)之同源性比較來鑑定5' RuvC結構域中之催化殘基，且保守Asp殘基(D10)突變成丙胺酸以使Cas9轉化成互補股切口酶。因此，Cas酶可為包括任何天然存在之細菌Cas9之野生型Cas9。CRISPR、Cas或Cas9酶可經密碼子最佳化，或為經修飾型式，包括任何嵌合體、突變體、同源物或異種同源物。在本揭示案之另一個態樣中，Cas9酶可包含一或多個突變且可用作融合至或不融合至功能結構域之通用DNA結合蛋白。
突變可為人工引入之突變或功能獲得型或功能喪失型突變。在一些實施例中，轉錄活化結構域可為VP64。在一些實施例中，轉錄抑制結構域可為KRAB或SID4X。本揭示案之其他態樣係關於融合至結構域之突變Cas9酶，包括但不限於核酸酶、轉錄活化子、抑制子、重組酶、組蛋白重塑子、去甲基酶、DNA甲基轉移酶、隱花色素、光可誘導/可控制結構域或化學可誘導可誘導/可控制結構域。本揭示案可涉及允許增強細胞中此等RNA之效能的sgRNA或tracrRNA或嚮導或嵌合嚮導序列。此II型CRISPR酶可為任何Cas酶。在一些情況下，Cas9酶來自或來源於SpCas9或SaCas9。如本文所用，關於酶之術語「所得」意指所得酶主要基於與野生型酶具有高度序列同源性之意義上，但其以與此項技術中已知或本文所述相同之方式發生突變(修飾)。在一個實例中，突變可包含蛋白質之第一連接子結構域、第二連接子結構域及/或其他部分中之一或多個突變。高度序列同源性可包含相對於野生型酶至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
Cas酶可為經鑑定之Cas9，因為此可指代與來自II型CRISPR系統之多個核酸酶結構域共享最大核酸酶同源性之酶之通用類別。在一些情況下，Cas9酶來自或來源於SpCas9 (釀膿鏈球菌Cas9)或saCas9 (金黃色葡萄球菌Cas9)。「StCas9」係指來自嗜熱鏈球菌(UniProt ID: G3ECR1)之野生型Cas9。類似地，「SpCas9」係指來自釀膿鏈球菌(UniProt ID: Q99ZW2)之野生型Cas9。如本文所用，關於酶之術語「所得」意指所得酶主要基於與野生型酶具有高度序列同源性之意義上，但其以與此項技術中已知或本文所述相同之方式發生突變(修飾)。將了解，除非另外顯而易見，否則術語Cas及CRISPR酶在本文中一般可互換使用。如上文所提及，本文所用之許多殘基編號係指來自釀膿鏈球菌中之II型CRISPR基因座之Cas9酶。
在特定實施例中，DNA結合蛋白為來自或源於以下菌屬之生物體的Cas9蛋白，該菌屬包括鏈球菌屬( Streptococcus)、彎曲桿菌屬( Campylobacter)、硝酸鹽裂解菌屬( Nitratifractor)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)、細小棒菌屬( Parvibaculum)、羅氏菌屬( Roseburia)、奈瑟菌屬( Neisseria)、葡糖醋桿菌屬( Gluconacetobacter)、固氮螺菌屬、球毛殼菌屬( Sphaerochaeta)、乳桿菌屬( Lactobacillus)、真桿菌屬( Eubacterium)、棒狀桿菌屬( Corynebacte)、肉食桿菌屬( Carnobacterium)、紅桿菌屬( Rhodobacter)、李斯特菌屬( Listeria)、帕魯迪菌屬( Paludibacter)、梭菌屬( Clostridium)、毛螺旋菌屬( Lachnospiraceae)、梭狀芽孢桿菌屬( Clostridiaridium)、纖毛菌屬( Leptotrichia)、弗朗西斯菌屬( Francisella)、軍團菌屬( Legionella)、脂環酸芽孢桿菌屬( Alicyclobacillus)、甲烷嗜甲基菌屬( Methanomethyophilus)、卟啉單胞菌屬( Porphyromonas)、普雷沃菌( Prevotella)、擬桿菌門( Bacteroidetes)、創傷球菌屬( Helcococcus)、鉤端螺旋體屬( Letospira)、脫硫弧菌屬( Desulfovibrio)、脫硫彎曲桿菌屬( Desulfonatronum)、豐佑菌科( Opitutaceae)、腫塊芽孢桿菌屬( Tuberibacillus)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、短小芽孢桿菌屬( Brevibacilus)、甲基桿菌屬( Methylobacterium)或胺基酸球菌屬( Acidaminococcus)、鏈球菌屬、彎曲桿菌屬、硝酸鹽裂解菌屬、葡萄球菌屬、細小棒菌屬、羅氏菌屬、奈瑟菌屬、葡糖醋桿菌屬、固氮螺菌屬、球毛殼菌屬、乳桿菌屬、真桿菌屬、棒狀桿菌屬、薩特氏菌屬( Sutterella)、軍團菌屬、密螺旋體屬( Treponema)、產線菌屬( Filifactor)、真桿菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、黴漿菌屬( Mycoplasma)、擬桿菌屬( Bacteroides)、黃腐菌屬( Flaviivola)、黃桿菌屬( Flavobacterium)、球毛殼菌屬、固氮螺菌屬、葡糖醋桿菌屬、奈瑟菌屬、羅氏菌屬、細小棒菌屬、葡萄球菌屬、硝酸鹽裂解菌屬、黴漿菌屬或彎曲桿菌屬。
在一些實施例中，Cas9蛋白來自或源於選自以下之生物體：變異鏈球菌( S. mutans)、無乳鏈球菌( S. agalactiae)、似馬鏈球菌( S. equisimilis)、血鏈球菌( S. sanguinis)、肺炎鏈球菌( S. pneumonia)、空腸彎曲桿菌( C. jejuni)、大腸彎曲桿菌( C. coli)；鹵水硝酸鹽裂解菌( N salsuginis)、特加硝酸鹽裂解菌( N tergarcus)；耳葡萄球菌( S. auricularis)、肉葡萄球菌( S. carnosus)；腦膜炎奈瑟菌( N meningitides)、淋病奈瑟菌( N gonorrhoeae)、產單核細胞李斯特菌( L. monocytogenes)、伊氏李斯特菌( L. ivanovii)；肉毒梭菌( C. botulinum)、艱難梭菌( C. difficile)、破傷風梭菌( C. tetani)或索氏梭菌( C. sordellii)、土拉弗朗西斯菌1 (Francisella tularensis 1)、土拉弗朗西斯菌新兇手亞種( Francisella tularensis subsp. novicida)、阿爾伯普雷沃菌( Prevotella albensis)、毛螺旋菌( Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1、瘤胃溶纖維丁酸弧菌( Butyrivibrio proteoclasticus)、異域菌門菌GW2011 GWA2_33_10、儉菌總門菌( Parcubacteria bacterium) GW2011 GWC2_44_17、密斯氏菌種( Smithella sp.) SCADC、胺基酸球菌種BV3L6、毛螺旋菌MA2020、候選白蟻甲烷黴漿菌( Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真桿菌( Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌237 ( Moraxella bovoculi 237)、稻田氏鉤端螺旋體( Leptospira inadai)、毛螺旋菌ND2006、犬口腔卟啉單胞菌3 ( Porphyromonas crevioricanis 3)、解糖腖普雷沃菌( Prevotella disiens)及獼猴卟啉單胞菌( Porphyromonas macacae)。在一些實施例中，Cas9蛋白來自於來自或源於釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌或嗜熱鏈球菌Cas9之生物體。
在一個更佳實施例中，Cas9蛋白來源於選自釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌或嗜熱鏈球菌Cas9之菌種。在某些實施例中，Cas9來源於選自土拉弗朗西斯菌1、阿爾伯普雷沃菌、毛螺旋菌MC20171、瘤胃溶纖維丁酸弧菌、異域菌門菌GW2011 GWA2 33 JO、儉菌總門菌GW2011 GWC2_44_17、密斯氏菌種SCADC、胺基酸球菌種BV3L6、毛螺旋菌MA2020、候選白蟻甲烷黴漿菌、挑剔真桿菌、牛眼莫拉氏菌237、稻田氏鉤端螺旋體、毛螺旋菌ND2006、犬口腔卟啉單胞菌3、解糖腖普雷沃菌及獼猴卟啉單胞菌之菌種。在某些實施例中，Cas9蛋白來源於選自胺基酸球菌種BV3L6、毛螺旋菌MA2020之菌種。在某些實施例中，效應蛋白來源於土拉弗朗西斯菌1之亚種，包括但不限於土拉弗朗西斯菌新兇手亞種。
Cas9酶包括但不限於釀膿鏈球菌血清型M1 (UniProt ID: Q99ZW2)、金黃色葡萄球菌Cas9 (UniProt ID: J7RUA5)、凸腹真桿菌Cas9 (UniProt ID: A5Z395)、固氮螺菌(菌株B510) Cas9 (UniProt ID: D3NT09)、固氮葡糖醋桿菌(菌株ATCC 49037) Cas9 (UnitProt ID: A9HKP2)、灰色奈瑟菌Cas9 (UniProt ID: D0W2Z9)、腸道羅氏菌Cas9 (UniProt ID: C7G697)、食清潔劑細小棒菌(菌株DS-1) Cas9 (UniProt ID: A7HP89)、鹵水硝酸鹽裂解菌(菌株DSM 16511) Cas9 (UniProt ID: E6WZS9)、紅嘴鷗彎曲桿菌Cas9 (UniProt ID: G1UFN3)。
來源於釀膿鏈球菌之Cas9或任何密切相關Cas9之酶促作用在靶位點序列处產生雙股斷裂，該等靶位點序列雜交至嚮導序列之20個核苷酸且在靶序列之20個核苷酸之後具有原間隔子鄰近基元(PAM)序列(實例包括如本文所述可確定之NGG/NRG或PAM)。經由Cas9對位點特異性DNA識別及裂解之CRISPR活性係由嚮導序列、部分雜交至嚮導序列之tracr序列、及PAM序列定義。CRISPR系統之更多態樣描述於Karginov及Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea, Mole Cell 2010年1月15日; 37(1): 7中。II型CRISPR基因座來自釀膿鏈球菌SF370，其含有四個基因Cas9、Cas1、Cas2及Csnl之簇，以及兩個非編碼RNA元件，tracrRNA及由非重複序列之短延伸段(間隔子，各自約30bp)間隔之重複序列(正向重複)之特徵陣列。在此系統中，在四個順序步驟中產生靶向DNA雙股斷裂(DSB)。第一，自CRISPR基因座轉錄兩個非編碼RNA，前crRNA陣列及tracrRNA。第二，tracrRNA雜交至前crRNA之正向重複，接著加工成含有個別間隔序列之成熟crRNA。第三，成熟crRNA:tracrRNA複合物經由在crRNA之間隔子區域與原間隔子DNA之間形成異雙鏈體將Cas9引導至由原間隔子及相應PAM組成之DNA靶。最後，Cas9介導PAM上游之靶DNA裂解以在原間隔子內產生DSB。術語「tracr伴侶序列」)亦涵蓋由側接有兩個正向重複(DR)之單一間隔子組成之前crRNA陣列。在某些實施例中，Cas9可組成性地存在或誘導性地存在或條件性地存在或投與或遞送。Cas9最佳化可用於增強功能或開發新功能。吾人可產生嵌合Cas9蛋白且Cas9可用作通用DNA結合蛋白。關於Cas9所提供之結構資訊可用於對CRISPR-Cas系統進行進一步工程改造及最佳化且將此外推以查詢其他CRISPR酶系統中之結構功能關係以及特別為其他II型CRISPR酶或Cas9異種同源物中之結構功能關係。晶體結構資訊(描述於2013年12月12日提交申請之美國臨時申請案61/915,251、2014年1月22日提交申請之美國臨時申請案61/930,214、2014年4月15日提交申請之美國臨時申請案61/980,012；及Nishimasu等人, 「Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA」, Cell 156(5):935- 949, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001 (2014)中，該等文獻各自及全部以引用之方式併入本文中)提供結構資訊以截短及產生模組化或多部分CRISPR酶，該等酶可併入可誘導CRISPR-Cas系統中。特別地，提供關於釀膿鏈球菌Cas9 (SpCas9)之結構資訊且可將此外推至其他Cas9異種同源物或其他II型CRISPR酶。Cas9基因見於若干不同細菌基因體中，典型地在具有casl、cas2及cas4基因及CRISPR卡匣之同一基因座中。此外，Cas9蛋白含有可易於鑑定之C端區域，該區域與轉位子ORF-B同源且包括活性RuvC樣核酸酶，富精胺酸區域。 dCas9
Cas9蛋白可發生突變以使得核酸酶活性滅活。無核酸內切酶活性之來自釀膿鏈球菌之滅活Cas9蛋白(iCas9，亦稱作「dCas9」)最近已由gRNA靶向細菌、酵母及人類細胞中之基因以經由位阻使基因表現靜默。如本文所用，「dCas分子」可指代dCas蛋白或其片段。如本文所用，「dCas9分子」可指代dCas9蛋白或其片段。如本文所用，術語「iCas」及「dCas」可互換使用且係指催化非活性CRISPR相關蛋白。在一個實施例中，dCas分子包含DNA裂解結構域中之一或多個突變。在一個實施例中，dCas分子包含RuvC或HNH結構域中之一或多個突變。在一個實施例中，dCas分子包含RuvC及HNH結構域中之一或多個突變。在一個實施例中，dCas分子為野生型Cas分子之片段。在一個實施例中，dCas分子包含來自野生型Cas分子之功能結構域，其中該功能結構域係選自Reel結構域、橋螺旋結構域或PAM相互作用結構域。在一個實施例中，dCas分子之核酸酶活性與相應野生型Cas分子之核酸酶活性相比降低至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
適合之dCas分子可來源於野生型Cas分子。Cas分子可來自I型、II型或III型CRISPR-Cas系統。在一個實施例中，適合之dCas分子可來源於Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9或Cas10分子。在一個實施例中，dCas分子來源於Cas9分子。可例如藉由將點突變(例如，取代、缺失或添加)引入Cas9分子中之DNA裂解結構域，例如核酸酶結構域，例如RuvC及/或HNH結構域處來獲得dCas9分子。參見例如Jinek等人, Science (2012) 337:816-21，以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，將兩個點突變引入RuvC及HNH結構域中會降低Cas9核酸酶活性，同時保留Cas9 sgRNA及DNA結合活性。在一個實施例中，RuvC及HNH活性位點內之兩個點突變為釀膿鏈球菌Cas9分子之D10A及H840A突變。或者，釀膿鏈球菌Cas9分子之D10及H840可缺失以消除Cas9核酸酶活性，同時保留其sgRNA及DNA結合活性。在一個實施例中，RuvC及HNH活性位點內之兩個點突變為釀膿鏈球菌Cas9分子之D10A及N580A突變。
在一個實施例中，dCas分子為在根據SEQ ID NO: 1編號之D10及/或N580處包含突變之金黃色葡萄球菌dCas9分子。在一個實施例中，dCas分子為包含根據SEQ ID NO: 1編號之D10A及/或N580A突變之金黃色葡萄球菌dCas9分子。 金黃色葡萄球菌dCas9 MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (SEQ ID NO: 1)
在一個實施例中，dCas9分子為金黃色葡萄球菌dCas9分子，該分子包含SEQ ID NO: 2或3之胺基酸序列，與SEQ ID NO: 2或3實質上一致(例如，序列一致性為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)之序列，或相對於SEQ ID NO: 2或3具有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個變化，例如胺基酸取代、插入或缺失之序列，或其任何片段。
類似突變亦可應用於任何其他天然存在之Cas9 (例如，來自其他物種之Cas9)或工程改造之Cas9分子。在某些實施例中，dCas9分子包含釀膿鏈球菌dCas9分子、金黃色葡萄球菌dCas9分子、空腸彎曲桿菌dCas9分子、白喉棒狀桿菌dCas9分子、凸腹真桿菌dCas9分子、巴氏鏈球菌dCas9分子、香腸乳桿菌dCas9分子、球形球毛殼菌dCas9分子、固氮螺菌(菌株B 510) dCas9分子、固氮葡糖醋桿菌dCas9分子、灰色奈瑟菌dCas9分子、腸道羅氏菌dCas9分子、食清潔劑細小棒菌dCas9分子、鹵水硝酸鹽裂解菌(菌株DSM 1651 1) dCas9分子、紅嘴鷗彎曲桿菌(菌株CF89-12) dCas9分子、嗜熱鏈球菌(菌株LMD-9) dCas9分子，或其片段。
在某些實施例中，本揭示案提供一種載體，該載體包含編碼以下之核苷酸：釀膿鏈球菌dCas9分子、金黃色葡萄球菌dCas9分子、空腸彎曲桿菌dCas9分子、白喉棒狀桿菌dCas9分子、凸腹真桿菌dCas9分子、巴氏鏈球菌dCas9分子、香腸乳桿菌dCas9分子、球形球毛殼菌dCas9分子、固氮螺菌(菌株B510) dCas9分子、固氮葡糖醋桿菌dCas9分子、灰色奈瑟菌dCas9分子、腸道羅氏菌dCas9分子、食清潔劑細小棒菌dCas9分子、鹵水硝酸鹽裂解菌(菌株DSM 1651 1) dCas9分子、紅嘴鷗彎曲桿菌(菌株CF89-12) dCas9分子、嗜熱鏈球菌(菌株LMD-9) dCas9分子，或其片段。
示例性dCas9蛋白包括但不限於表1中所列之彼等。 表1. 示例性dCas9蛋白
描述 序列 SEQ ID NO:
金黃色葡萄球菌dCas9 (突變體：D10A及H557A) MKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDAIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG SEQ ID NO: 2
金黃色葡萄球菌dCas9 (突變體：D10A及N580A) MKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVHAIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG SEQ ID NO: 3
釀膿鏈球菌dCas9 (D10A、H840A) MKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVHAIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG SEQ ID NO: 4
空腸彎曲桿菌dCas9 (D8A、H559A) MARILAFAIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFSHLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQRAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYSGEKIKISDLQDEKMLEIDAIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK SEQ ID NO: 5
白喉棒狀桿菌dCas9 (D8A、H573A) MKYHVGIAVGTFSVGLAAIEVDDAGMPIKTLSLVSHIHDSGLDPDEIKSAVTRLASSGIARRTRRLYRRKRRRLQQLDKFIQRQGWPVIELEDYSDPLYPWKVRAELAASYIADEKERGEKLSVALRHIARHRGWRNPYAKVSSLYLPDGPSDAFKAIREEIKRASGQPVPETATVGQMVTLCELGTLKLRGEGGVLSARLQQSDYAREIQEICRMQEIGQELYRKIIDVVFAAESPKGSASSRVGKDPLQPGKNRALKASDAFQRYRIAALIGNLRVRVDGEKRILSVEEKNLVFDHLVNLTPKKEPEWVTIAEILGIDRGQLIGTATMTDDGERAGARPPTHDTNRSIVNSRIAPLVDWWKTASALEQHAMVKALSNAEVDDFDSPEGAKVQAFFADLDDDVHAKLDSLHLPVGRAAYSEDTLVRLTRRMLSDGVDLYTARLQEFGIEPSWTPPTPRIGEPVGNPAVDRVLKTVSRWLESATKTWGAPERVIIEHVREGFVTEKRAREMDGDMRRRAARNAKLFQEMQEKLNVQGKPSRADLWRYQSVQRQNCQCAYCGSPITFSNSEMDAIVPRAGQGSTNTRENLVAVCHRCNQSKGNTPFAIWAKNTSIEGVSVKEAVERTRHWVTDTGMRSTDFKKFTKAVVERFQRATMDEEIDARSMESVAWMANELRSRVAQHFASHGTTVRVYRGSLTAEARRASGISGKLKFFDGVGKSRLDRRHHAIDAAVIAFTSDYVAETLAVRSNLKQSQAHRQEAPQWREFTGKDAEHRAAWRVWCQKMEKLSALLTEDLRDDRVVVMSNVRLRLGNGSAHKETIGKLSKVKLSSQLSVSDIDKASSEALWCALTREPGFDPKEGLPANPERHIRVNGTHVYAGDNIGLFPVSAGSIALRGGYAELGSSFHHARVYKITSGKKPAFAMLRVYTIDLLPYRNQDLFSVELKPQTMSMRQAEKKLRDALATGNAEYLGWLVVDDELVVDTSKIATDQVKAVEAELGTIRRWRVDGFFSPSKLRLRPLQMSKEGIKKESAPELSKIIDRPGWLPAVNKLFSDGNVTVVRRDSLGRVRLESTAHLPVTWKVQ SEQ ID NO: 6
凸腹真桿菌dCas9 (D8A、H592A) MGYTVGLAIGVASVGVAVLDENDNIVEAVSNIFDEADTSNNKVRRTLREGRRTKRRQKTRIEDFKQLWETSGYIIPHKLHLNIIELRNKGLTELLSLDELYCVLLSMLKHRGISYLEDADDGEKGNAYKKGLAFNEKQLKEKMPCEIQLERMKKYGKYHGEFIIEINDEKEYQSNVFTTKAYKKELEKIFETQRCNGNKINTKFIKKYMEIYERKREYYIGPGNEKSRTDYGIYTTRTDEEGNFIDEKNIFGKLIGKCSVYPEEYRASSASYTAQEFNLLNDLNNLKINNEKLTEFQKKEIVEIIKDASSVNMRKIIKKVIDEDIEQYSGARIDKKGKEIYHTFEIYRKLKKELKTINVDIDSFTREELDKTMDILTLNTERESIVKAFDEQKFVYEENLIKKLIEFRKNNQRLFSGWHSFSYKAMLQLIPVMYKEPKEQMQLLTEMNVFKSKKEKYVNYKYIPENEVVKEIYNPVVVKSIRTTVKILNALIKKYGYPESVVIEMPRDKNSDDEKEKIDMNQKKNQEEYEKILNKIYDEKGIEITNKDYKKQKKLVLKLKLWNEQEGLCLYSGKKIAIEDLLNHPEFFEIDAIIPKSISLDDSRSNKVLVYKTENSIKENDTPYHYLTRINGKWGFDEYKANVLELRRRGKIDDKKVNNLLCMEDITKIDVVKGFINRNLNDTRYASRVVLNEMQSFFESRKYCNTKVKVIRGSLTYQMRQDLHLKKNREESYSHHAVDAMLIAFSQKGYEAYRKIQKDCYDFETGEILDKEKWNKYIDDDEFDDILYKERMNEIRKKIIEAEEKVKYNYKIDKKCNRGLCNQTIYGTREKDGKIHKISSYNIYDDKECNSLKKMINSGKGSDLLMYNNDPKTYRDMLKILETYSSEKNPFVAYNKETGDYFRKYSKNHNGPKVEKVKYYSGQINSCIDISHKYGHAKNSKKVVLVSLNPYRTDVYYDNDTGKYYLVGVKYNHIKCVGNKYVIDSETYNELLRKEGVLNSDENLEDLNSKNITYKFSLYKNDIIQYEKGGEYYTERFLSRIKEQKNLIETKPINKPNFQRKNKKGEWENTRNQIALAKTKYVGKLVTDVLGNCYIVNMEKFSLVVDK SEQ ID NO: 7
巴氏鏈球菌dCas9 (D10A、H599A) MTNGKILGLAIGIASVGVGIIEAKTGKVVHANSRLFSAANAENNAERRGFRGSRRLNRRKKHRVKRVRDLFEKYGIVTDFRNLNLNPYELRVKGLTEQLKNEELFAALRTISKRRGISYLDDAEDDSTGSTDYAKSIDENRRLLKNKTPGQIQLERLEKYGQLRGNFTVYDENGEAHRLINVFSTSDYEKEARKILETQADYNKKITAEFIDDYVEILTQKRKYYHGPGNEKSRTDYGRFRTDGTTLENIFGILIGKCNFYPDEYRASKASYTAQEYNFLNDLNNLKVSTETGKLSTEQKESLVEFAKNTATLGPAKLLKEIAKILDCKVDEIKGYREDDKGKPDLHTFEPYRKLKFNLESINIDDLSREVIDKLADILTLNTEREGIEDAIKRNLPNQFTEEQISEIIKVRKSQSTAFNKGWHSFSAKLMNELIPELYATSDEQMTILTRLEKFKVNKKSSKNTKTIDEKEVTDEIYNPVVAKSVRQTIKIINAAVKKYGDFDKIVIEMPRDKNADDEKKFIDKRNKENKKEKDDALKRAAYLYNSSDKLPDEVFHGAKQLETKIRLWYQQGERCLYSGKPISIQELVHNSNNFEIDHILPLSLSFDDSLANKVLVYAWTNQEKGQKTPYQVIDSMDAAWSFREMKDYVLKQKGLGKKKRDYLLTTENIDKIEVKKKFIERNLVDTRYASRVVLNSLQSALRELGKDTKVSVVRGQFTSQLRRKWKIDKSRETYHHHAVDALIIAASSQLKLWEKQDNPMFVDYGKNQVVDKQTGEILSVSDDEYKELVFQPPYQGFVNTISSKGFEDEILFSYQVDSKYNRKVSDATIYSTRKAKIGKDKKEETYVLGKIKDIYSQNGFDTFIKKYNKDKTQFLMYQKDSLTWENVIEVILRDYPTTKKSEDGKNDVKCNPFEEYRRENGLICKYSKKGKGTPIKSLKYYDKKLGNCIDITPEESRNKVILQSINPWRADVYFNPETLKYELMGLKYSDLSFEKGTGNYHISQEKYDAIKEKEGIGKKSEFKFTLYRNDLILIKDIASGEQEIYRFLSRTMPNVNHYVELKPYDKEKFDNVQELVEALGEADKVGRCIKGLNKPNISIYKVRTDVLGNKYFVKKKGDKPKLDFKNNKK SEQ ID NO: 8
香腸乳桿菌dCas9 (D10A、H611A) MTDRISLGLAIGVASVGFSVLDIDKGKVIELGARLFNATVAAGNQDRRDMRGSRRLLNRNKQRRKDVSKLFQEYGLLDNFDRDNFHTAFNNNWNPYELRVKGLTKQLNKEELADSLYQIIKRRGISYALKDADANEDGTDYSSSLKINSQELIEKTPAQIQLQRLNDYGKVRGKVIVGDDIDDQKVLLNVFPTNAYEKEARQIIATQQQFYPEILTGEFVKEYCQILTRKRDYFVGPGNEKSRTDYGIYKTDGRTLDNLFEELIGHDKIYPDELRASAASYTAQLFNVLNDLNNLRILSYEDGKLTQIDKEKIIAEIKNNTTVVNMLNVIKKVTGCQKDDIKGFRLNEKDKPEISSMPIYRKAHKDFLKVGIDITDWPIDFIDRLSFILTLNTENGEIRKQINKRLVPDFDFLNDDLVQLIIDNKDSFDIKTNNKWHRFSLKTMNKLIPTMIERPVEQMTLLTEMGLIKKDTKRFEGNKYLPYKEIANDIFNPVASKSVREALKIVNAVLKKYGHIEYIVIEMPRDKNLDEERKQIADFQKKNKKIKDAAFNAFVKAVGSKKNVKIALSKNRKLQMGIRLWHQQQGIDPYNGEEINANDLISNPDKFEIDAIIPQSISFDDGINNKTLCFASMNQVKGQKTPYEFLNEGHGQGYAKFKAIVSKNKNFSKAKRDNYLFEENVSNIETRKRFLSRNLVDTRYSSRVVLNSLQEFFHEKSDDTKVTVIRGKFTSNMRKHWHIDKTRDTFHHHAIDASIIAATPFLRMWKKGSTIFPTKINETSIDIETGEILDDKNFDKVMYEEPYSGFISEIMNADDRIKFSHQVDKKMNRKVSDATIYSTRIGKLSKDKKDAEYVVAKVKDIYSVDGYENFKKVYKKDKTKFLLYKYDPRTFSELEKIVIDYPDKIEKVQTNGKIKAVDISPFELYRRDNGMVRKYSKKTGPAIKQLKYLDKKLGSHIDITPKNANNKHVVLQSLKPWRTDVYLNHETGEYEIMGIKYSDLKFNKNEGYGIKKDKYLKIKNIEGVSENSEFMFSLYRKDRIKVQDMETNESVELLFWSRNFSNKKYAELKPISQIDNDKVLPIYGRGRLIKRLIPKNCKIWKVNTSILGDTYYLEKESNYPQKILD SEQ ID NO: 9
球形球毛殼菌dCas9 (D30A、H635A) MSKKVSRRYEEQAQEICQRLGSRPYSIGLALGVGSIGVAVAAYDPIKKQPSDLVFVSSRIFIPSTGAAERRQKRGQRNSLRHRANRLKFLWKLLAERNLMLSYSEQDVPDPARLRFEDAVVRANPYELRLKGLNEQLTLSELGYALYHIANHRGSSSVRTFLDEEKSSDDKKLEEQQAMTEQLAKEKGISTFIEVLTAFNTNGLIGYRNSESVKSKGVPVPTRDIISNEIDVLLQTQKQFYQEILSDEYCDRIVSAILFENEKIVPEAGCCPYFPDEKKLPRCHFLNEERRLWEAINNARIKMPMQEGAAKRYQSASFSDEQRHILFHIARSGTDITPKLVQKEFPALKTSIIVLQGKEKAIQKIAGFRFRRLEEKSFWKRLSEEQKDDFFSAWTNTPDDKRLSKYLMKHLLLTENEVVDALKTVSLIGDYGPIGKTATQLLMKHLEDGLTYTEALERGMETGEFQELSVWEQQSLLPYYGQILTGSTQALMGKYWHSAFKEKRDSEGFFKPNTNSDEEKYGRIANPVVHQTLNELRKLMNELITILGAKPQEITVELARELKVGAEKREDIIKQQTKQEKEAVLAYSKYCEPNNLDKRYIERFRLLEDQAFVCPYCLEHISVADIAAGRADVDAIFPRDDTADNSYGNKVVAHRQCNDIKGKRTPYAAFSNTSAWGPIMHYLDETPGMWRKRRKFETNEEEYAKYLQSKGFVSRFESDNSYIAKAAKEYLRCLFNPNNVTAVGSLKGMETSILRKAWNLQGIDDLLGSRHWSKDADTSPTMRKNRDDNRHHGLDAIVALYCSRSLVQMINTMSEQGKRAVEIEAMIPIPGYASEPNLSFEAQRELFRKKILEFMDLHAFVSMKTDNDANGALLKDTVYSILGADTQGEDLVFVVKKKIKDIGVKIGDYEEVASAIRGRITDKQPKWYPMEMKDKIEQLQSKNEAALQKYKESLVQAAAVLEESNRKLIESGKKPIQLSEKTISKKALELVGGYYYLISNNKRTKTFVVKEPSNEVKGFAFDTGSNLCLDFYHDAQGKLCGEIIRKIQAMNPSYKPAYMKQGYSLYVRLYQGDVCELRASDLTEAESNLAKTTHVRLPNAKPGRTFVIIITFTEMGSGYQIYFSNLAKSKKGQDTSFTLTTIKNYDVRKVQLSSAGLVRYVSPLLVDKIEKDEVALCGE SEQ ID NO: 10
固氮螺菌(菌株B510) dCas9 (D75A、H680A) MARPAFRAPRREHVNGWTPDPHRISKPFFILVSWHLLSRVVIDSSSGCFPGTSRDHTDKFAEWECAVQPYRLSFALGTNSIGWGLLNLDRQGKPREIRALGSRIFSDGRDPQDKASLAVARRLARQMRRRRDRYLTRRTRLMGALVRFGLMPADPAARKRLEVAVDPYLARERATRERLEPFEIGRALFHLNQRRGYKPVRTATKPDEEAGKVKEAVERLEAAIAAAGAPTLGAWFAWRKTRGETLRARLAGKGKEAAYPFYPARRMLEAEFDTLWAEQARHHPDLLTAEAREILRHRIFHQRPLKPPPVGRCTLYPDDGRAPRALPSAQRLRLFQELASLRVIHLDLSERPLTPAERDRIVAFVQGRPPKAGRKPGKVQKSVPFEKLRGLLELPPGTGFSLESDKRPELLGDETGARIAPAFGPGWTALPLEEQDALVELLLTEAEPERAIAALTARWALDEATAAKLAGATLPDFHGRYGRRAVAELLPVLERETRGDPDGRVRPIRLDEAVKLLRGGKDHSDFSREGALLDALPYYGAVLERHVAFGTGNPADPEEKRVGRVANPTVHIALNQLRHLVNAILARHGRPEEIVIELARDLKRSAEDRRREDKRQADNQKRNEERKRLILSLGERPTPRNLLKLRLWEEQGPVENRRCPYSGETISMRMLLSEQVDIDAILPFSVSLDDSAANKVVCLREANRIKRNRSPWEAFGHDSERWAGILARAEALPKNKRWRFAPDALEKLEGEGGLRARHLNDTRHLSRLAVEYLRCVCPKVRVSPGRLTALLRRRWGIDAILAEADGPPPEVPAETLDPSPAEKNRADHRHHALDAVVIGCIDRSMVQRVQLAAASAEREAAAREDNIRRVLEGFKEEPWDGFRAELERRARTIVVSHRPEHGIGGALHKETAYGPVDPPEEGFNLVVRKPIDGLSKDEINSVRDPRLRRALIDRLAIRRRDANDPATALAKAAEDLAAQPASRGIRRVRVLKKESNPIRVEHGGNPSGPRSGGPFHKLLLAGEVHHVDVALRADGRRWVGHWVTLFEAHGGRGADGAAAPPRLGDGERFLMRLHKGDCLKLEHKGRVRVMQVVKLEPSSNSVVVVEPHQVKTDRSKHVKISCDQLRARGARRVTVDPLGRVRVHAPGARVGIGGDAGRTAMEPAEDIS SEQ ID NO: 11
固氮葡糖醋桿菌dCas9 (D11A、H587A) MIDESLTFGIALGIGSCGWAVLRRPSAFGRKGVIEGMGSWCFDVPETSKERTPTNQIRRSNRLLRRVIRRRRNRMAAIRRLLHAAGLLPSTDSDALKRPGHDPWELRARGLDKPLKPVEFAVVLGHIAKRRGFKSAAKRKATNISSDDKKMLTALEATRERLGRYRTVGEMFARDPDFASRRRNREGKYDRTTARDDLEHEVHALFAAQRRLGQGFASPELEEAFTASAFHQRPMQDSERLVGFCPFERTEKRAAKLTPSFERFRLLARLLNLRITTPDGERPLTVDEIALVTRDLGKTAKLSIKRVRTLIGLEDNQRFTTIRPEDEDRDIVARTGGAMTGTATLRKALGEALWTDMQERPEQLDAIVQVLSFFEANETITEKLREIGLTLAVLDVLLTALDAGVFAKFKGAAHISTKAARNLLPHLEQGRRYDEACTMAGYDHAASRLSHHGQIVAKTQFNALVTEIGESIANPIARKALIEGLKQIWAMRNHWGLPGSIHVELARDVGNSIEKRREIEKHIEKNTALRARERREVHDLLDLEDVNGDTLLRYRLWKEQGGKCLYTGKAIHIRQIAATDNSVQVDAILPWSRFGDDSFNNKTLCLASANQQKKRSTPYEWLSGQTGDAWNAFVQRIETNKELRGFKKRNYLLKNAKEAEEKFRSRNLNDTRYAARLFAEAVKLLYAFGERQEKGGNRRVFTRPGALTAALRQAWGVESLKKQDGKRINDDRHHALDALTVAAVDEAEIQRLTKSFHEWEQQGLGRPLRRVEPPWESFRADVEATYPEVFVARPERRRARGEGHAATIRQVKERECTPIVFERKAVSSLKEADLERIKDGERNEAIVEAIRSWIATGRPADAPPRSPRGDIITKIRLATTIKAAVPVRGGTAGRGEMVRADVFSKPNRRGKDEWYLVPVYPHQIMNRKAWPKPPMRSIVANKDEDEWTEVGPEHQFRFSLYPRSNIEIIRPSGEVIEGYFVGLHRNTGALIPTPVGPDSYVIA SEQ ID NO: 12
灰色奈瑟菌dCas9 (D16A、H588A) MAAFKPNPMNYILGLAIGIASVGWAIVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAAARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVADNTHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFNRKDLQAELNLLFEKQKEFGNPHVSDGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPTEPKAAKNTYTAERFVWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLDLDDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGNRYDEACTEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKSAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDAALPFSRTWDDSFNNKVLALGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYINRFLCQFVADHMLLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTIAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKAHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHKYVTPLFISRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGISVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVHNHNGIADNATIVRVDVFEKGGKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWTVMDDSFEFKFVLYANDLIKLTAKKNEFLGYFVSLNRATGAIDIRTHDTDSTKGKNGIFQSVGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVR SEQ ID NO: 13
腸道羅氏菌dCas9 (D24A、H628A) MRENGSDERRRNMDEKMDYRIGLAIGIASVGWAVLQNNSDDEPVRIVDLGVRIFDTAEIPKTGESLAGPRRAARTTRRRLRRRKHRLDRIKWLFENQGLINIDDFLKRYNMAGLPDVYQLRYEALDRKLTDEELAQVLLHIAKHRGFRSTRKAETAAKENGAVLKATDENQKRMQEKGYRTVGEMIYLDEAFRTGCSWSEKGYILTPRNKAENYQHTMLRAMLVEEVKEIFSSQRRLGNEKATEELEEKYLEIMTSQRSFDLGPGMQPDGKPSPYAMEGFSDRVGKCTFLGDQGELRGAKGTYTAEYFVALQKINHTKLVNQDGETRNFTEEERRALTLLLFTQKEVKYAAVRKKLGLPEDILFYNLNYKKAATKEEQQKENQNTEKAKFIGMPYYHDYKKCLEERVKYLTENEVRDLFDEIGMILTCYKNDDSRTERLAKLGLVPIEMEGLLAYTPTKFQHLSMKAMRNIIPFLEKGMTYDKACEEAGYDFKADSKGTKQKLLTGENVNQTINEITNPVVKRSVSQTVKVINAIIRTYGSPQAINIELAREMSKTFEERRKIKGDMEKRQKNNEDVKKQIQELGKLSPTGQDILKYRLWQEQQGICMYSGKTIPLEELFKPGYDIDAILPYSITFDDSFRNKVLVTSQENRQKGNRTPYEYMGNDEQRWNEFETRVKTTIRDYKKQQKLLKKHFSEEERSEFKERNLTDTKYITTVIYNMIRQNLEMAPLNRPEKKKQVRAVNGAITAYLRKRWGLPQKNRETDTHHAMDAVVIACCTDGMIQKISRYTKVRERCYSKGTEFVDAETGEIFRPEDYSRAEWDEIFGVHIPKPWETFRAELDVRMGDDPKGFLDTHSDVALELDYPEYIYENLRPIFVSRMPNHKVTGAAHADTIRSPRHFKDEGIVLTKTALTDLKLDKDGEIDGYYNPQSDLLLYEALKKQLLLYGNDAKKAFAQDFHKPKADGTEGPVVRKVKIQKKQTMGVFVDSGNGIAENGGMVRIDVFRVNGKYYFVPVYTADVVKKVLPNRASTAHKPYGEWKVMEDKDFLFSLYSRDLIHIKSKKDIPIKMVNGGMEGIKETYAYYIGADISAANIQGIAHDSRYKFRGLGIQSLDVLEKCQIDVLGHVSVVRSEKRMGFS SEQ ID NO: 14
食清潔劑細小棒菌dCas9 (D8A、H601A) MERIFGFAIGTTSIGFSVIDYSSTQSAGNIQRLGVRIFPEARDPDGTPLNQQRRQKRMMRRQLRRRRIRRKALNETLHEAGFLPAYGSADWPVVMADEPYELRRRGLEEGLSAYEFGRAIYHLAQHRHFKGRELEESDTPDPDVDDEKEAANERAATLKALKNEQTTLGAWLARRPPSDRKRGIHAHRNVVAEEFERLWEVQSKFHPALKSEEMRARISDTIFAQRPVFWRKNTLGECRFMPGEPLCPKGSWLSQQRRMLEKLNNLAIAGGNARPLDAEERDAILSKLQQQASMSWPGVRSALKALYKQRGEPGAEKSLKFNLELGGESKLLGNALEAKLADMFGPDWPAHPRKQEIRHAVHERLWAADYGETPDKKRVIILSEKDRKAHREAAANSFVADFGITGEQAAQLQALKLPTGWEPYSIPALNLFLAELEKGERFGALVNGPDWEGWRRTNFPHRNQPTGEILDKLPSPASKEERERISQLRNPTVVRTQNELRKVVNNLIGLYGKPDRIRIEVGRDVGKSKREREEIQSGIRRNEKQRKKATEDLIKNGIANPSRDDVEKWILWKEGQERCPYTGDQIGFNALFREGRYEVEAIWPRSRSFDNSPRNKTLCRKDVNIEKGNRMPFEAFGHDEDRWSAIQIRLQGMVSAKGGTGMSPGKVKRFLAKTMPEDFAARQLNDTRYAAKQILAQLKRLWPDMGPEAPVKVEAVTGQVTAQLRKLWTLNNILADDGEKTRADHRHHAIDALTVACTHPGMTNKLSRYWQLRDDPRAEKPALTPPWDTIRADAEKAVSEIVVSHRVRKKVSGPLHKETTYGDTGTDIKTKSGTYRQFVTRKKIESLSKGELDEIRDPRIKEIVAAHVAGRGGDPKKAFPPYPCVSPGGPEIRKVRLTSKQQLNLMAQTGNGYADLGSNHHIAIYRLPDGKADFEIVSLFDASRRLAQRNPIVQRTRADGASFVMSLAAGEAIMIPEGSKKGIWIVQGVWASGQVVLERDTDADHSTTTRPMPNPILKDDAKKVSIDPIGRVRPSND SEQ ID NO: 15
鹵水硝酸鹽裂解菌(菌株DSM 16511) dCas9 (D8A、H611A) MKKILGVALGITSFGYAILQETGKDLYRCLDNSVVMRNNPYDEKSGESSQSIRSTQKSMRRLIEKRKKRIRCVAQTMERYGILDYSETMKINDPKNNPIKNRWQLRAVDAWKRPLSPQELFAIFAHMAKHRGYKSIATEDLIYELELELGLNDPEKESEKKADERRQVYNALRHLEELRKKYGGETIAQTIHRAVEAGDLRSYRNHDDYEKMIRREDIEEEIEKVLLRQAELGALGLPEEQVSELIDELKACITDQEMPTIDESLFGKCTFYKDELAAPAYSYLYDLYRLYKKLADLNIDGYEVTQEDREKVIEWVEKKIAQGKNLKKITHKDLRKILGLAPEQKIFGVEDERIVKGKKEPRTFVPFFFLADIAKFKELFASIQKHPDALQIFRELAEILQRSKTPQEALDRLRALMAGKGIDTDDRELLELFKNKRSGTRELSHRYILEALPLFLEGYDEKEVQRILGFDDREDYSRYPKSLRHLHLREGNLFEKEENPINNHAVKSLASWALGLIADLSWRYGPFDEIILETTRDALPEKIRKEIDKAMREREKALDKIIGKYKKEFPSIDKRLARKIQLWERQKGLDLYSGKVINLSQLLDGSADIEAIVPQSLGGLSTDYNTIVTLKSVNAAKGNRLPGDWLAGNPDYRERIGMLSEKGLIDWKKRKNLLAQSLDEIYTENTHSKGIRATSYLEALVAQVLKRYYPFPDPELRKNGIGVRMIPGKVTSKTRSLLGIKSKSRETNFHHAEDALILSTLTRGWQNRLHRMLRDNYGKSEAELKELWKKYMPHIEGLTLADYIDEAFRRFMSKGEESLFYRDMFDTIRSISYWVDKKPLSASSHKETVYSSRHEVPTLRKNILEAFDSLNVIKDRHKLTTEEFMKRYDKEIRQKLWLHRIGNTNDESYRAVEERATQIAQILTRYQLMDAQNDKEIDEKFQQALKELITSPIEVTGKLLRKMRFVYDKLNAMQIDRGLVETDKNMLGIHISKGPNEKLIFRRMDVNNAHELQKERSGILCYLNEMLFIFNKKGLIHYGCLRSYLEKGQGSKYIALFNPRFPANPKAQPSKFTSDSKIKQVGIGSATGIIKAHLDLDGHVRSYEVFGTLPEGSIEWFKEESGYGRVEDDPHH SEQ ID NO: 16
紅嘴鷗彎曲桿菌dCas9 (D7A、H567A) MKILGFAIGINSIGWAFVENDELKDCGVRIFTEAENPSNKESLALPRRNARSSRRRLKRRKARLVAIKRILAKELKLNFKDYVAADGELPKAYEGKLTSIYELRYKALIQQLETKDLARVILHIAKHRGYMNKNEKKSNDTKKGKILSALKNNALKLENYQSVGEYFYKEFFQKYKENTKNFIKIRNTKDNYNNCVLSSDLEKELKLILEKQKEFGYNYSEDFINEILKVAFFQRPLKDFSHLVGACTFFEEEKRACKNSYSAWEFVALTKIINEIKSLEKISGEIVPTQTINEILNLILDKGSITYKKFRSCINLHESISFKSLKYDKENAENAKLIDFRKLVEFKKALGVHSLSRQELDQISTHITLIKDNVKLKTVLEKYNLSNEQINNLLEIEFNDYINLSFKALGMILPLMREGKRYYEACEITNLKPKTVDEKEDFLPAFCDSIFAHELSNPVVNRAISEYRKVLNALLKKYGKVHKIHLELARDVGLSKKAREKIEDQQKNNKAINDWALKECENIGIKASAKNILKLKLWKEQKEICIYSGNKISIEHLKDEKALEVDAIYPYSRSFDDSFINKVLVFTKENQEKLNKTPFEAFGKNIEKWSKIQTLAQNLPYKKKNKILDENFKDKQQQDFISRNLNDTRYITTLIAKYTKEYLNFLPLSENENTNLKSGEKGSKIHIQTISGMLTSVLRHTWGFDKKDRNNHLHHALDAIIVAYSTSSIIKAFSDFKKNQELLKARFYAKELTSDNYKHQVKFFEPFKGFREKILSKIDEIFVSTPPRKRARGALHEETFYSEDKMIKKYNSKEGLQIALSCGRVRKIGTKYVENDTMVRVDIFKKQNKFYAIPIYVMDFALGILPNKIVITGKDKNNNPKQWQTIDESYEFCFSLYKNDLILLQKKNMQEPEFAYYNSFDIDRSRIKIKKHDNKFENLTSNQKLLFTNKDKGKNRTGIQNLKIFEKYIVTPLGDKIKADFQPRENISLKTSKKHGL SEQ ID NO: 17
嗜熱鏈球菌(菌株LMD-9) dCas9 (D10A、H847A) MTKPYSIGLAIGTNSVGWAVTTDNYKVPSKKMKVLGNTSKKYIKKNLLGVLLFDSGITAEGRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSTEMATLDDAFFQRLDDSFLVPDDKRDSKYPIFGNLVEEKAYHDEFPTIYHLRKYLADSTKKADLRLVYLALAHMIKYRGHFLIEGEFNSKNNDIQKNFQDFLDTYNAIFESDLSLENSKQLEEIVKDKISKLEKKDRILKLFPGEKNSGIFSEFLKLIVGNQADFRKCFNLDEKASLHFSKESYDEDLETLLGYIGDDYSDVFLKAKKLYDAILLSGFLTVTDNETEAPLSSAMIKRYNEHKEDLALLKEYIRNISLKTYNEVFKDDTKNGYAGYIDGKTNQEDFYVYLKKLLAEFEGADYFLEKIDREDFLRKQRTFDNGSIPYQIHLQEMRAILDKQAKFYPFLAKNKERIEKILTFRIPYYVGPLARGNSDFAWSIRKRNEKITPWNFEDVIDKESSAEAFINRMTSFDLYLPEEKVLPKHSLLYETFNVYNELTKVRFIAESMRDYQFLDSKQKKDIVRLYFKDKRKVTDKDIIEYLHAIYGYDGIELKGIEKQFNSSLSTYHDLLNIINDKEFLDDSSNEAIIEEIIHTLTIFEDREMIKQRLSKFENIFDKSVLKKLSRRHYTGWGKLSAKLINGIRDEKSGNTILDYLIDDGISNRNFMQLIHDDALSFKKKIQKAQIIGDEDKGNIKEVVKSLPGSPAIKKGILQSIKIVDELVKVMGGRKPESIVVEMARENQYTNQGKSNSQQRLKRLEKSLKELGSKILKENIPAKLSKIDNNALQNDRLYLYYLQNGKDMYTGDDLDIDRLSNYDIDAIIPQAFLKDNSIDNKVLVSSASNRGKSDDVPSLEVVKKRKTFWYQLLKSKLISQRKFDNLTKAERGGLSPEDKAGFIQRQLVETRQITKHVARLLDEKFNNKKDENNRAVRTVKIITLKSTLVSQFRKDFELYKVREINDFHHAHDAYLNAVVASALLKKYPKLEPEFVYGDYPKYNSFRERKSATEKVYFYSNIMNIFKKSISLADGRVIERPLIEVNEETGESVWNKESDLATVRRVLSYPQVNVVKKVEEQNHGLDRGKPKGLFNANLSSKPKPNSNENLVGAKEYLDPKKYGGYAGISNSFTVLVKGTIEKGAKKKITNVLEFQGISILDRINYRKDKLNFLLEKGYKDIELIIELPKYSLFELSDGSRRMLASILSTNNKRGEIHKGNQIFLSQKFVKLLYHAKRISNTINENHRKYVENHKKEFEELFYYILEFNENYVGAKKNGKLLNSAFQSWQNHSIDELCSSFIGPTGSERKGLFELTSRGSAADFEFLGVKIPRYRDYTPSSLLKDATLIHQSVTGLYETRIDLAKLGEG SEQ ID NO: 18
Cas9 融合蛋白
基於CRISPR/Cas9之系統可包括融合分子(例如，DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB)。融合分子可包含至少一個DNA結合蛋白(例如，dCas9)及至少一個基因表現調節子(例如，KRAB、DNMT3A、DNMT3L、DNMT3A-DNMT3L融合肽)。在一些實施例中，基因表現調節子係選自基因表現抑制子(例如，KRAB)、基因表現活化子或表觀遺傳修飾調節子(例如，DNMT3A、DNMT3L、DNMT3A-DNMT3L融合肽)或其任何組合。不同基因表現調節子在此項技術中為已知的，參見例如Thakore等人, Nat Methods. 2016; 13: 127-37，以全文引用之方式併入本文中。 基因表現抑制子
在一些實施例中，基因表現調節子包含基因表現抑制子。抑制子可為任何已知之基因表現抑制子，例如，選自以下之抑制子：克魯勃相關框(KRAB)結構域、mSin3相互作用結構域(SID)、MAX相互作用蛋白1 (MXI1)、色素陰影結構域(chromo shadow domain)、EAR抑制結構域(SRDX)、真核釋放因子1 (ERFl)、真核釋放因子3 (ERF3)、四環素抑制子、lad抑制子、長春花G框結合因子1及2、果蠅格魯蛋白(Drosophila Groucho)、含三聯基元28 (TRTM28)、核受體共抑制子1、核受體共抑制子2，或其片段或融合體。 克魯勃相關框 (KRAB)
KRAB結構域為存在於許多基於鋅指蛋白之轉錄因子之N端部分中之一種類型之轉錄抑制結構域。KRAB結構域當由DNA結合結構域栓系至靶DNA時充當轉錄抑制子。KRAB結構域富含帶電荷胺基酸且可分成子結構域A及B。KRAB A及B子結構域可由可變間隔區段隔開且許多KRAB蛋白僅含有A子結構域。已顯示KRAB A子結構域中45個胺基酸之序列對於轉錄抑制為重要的。B子結構域本身不抑制轉錄，但加強由KRAB A子結構域施加之抑制。KRAB結構域募集共抑制子KAP1 (KRAB相關蛋白1，亦稱為轉錄中介因子1β、KRAB-A相互作用蛋白及三聯基元蛋白28)及異染色質蛋白1 (HP1)，以及其他染色質調節蛋白，從而經由異染色質形成進行轉錄抑制。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至KRAB結構域或其片段之dCas9分子。在一個實施例中，KRAB結構域或其片段融合至dCas9分子之N端。在一個實施例中，KRAB結構域或其片段融合至dCas9分子之C端。在一個實施例中，KRAB結構域或其片段融合至dCas9分子之N端及C端。在一個實施例中，融合分子包含KRAB結構域，該結構域包含SEQ ID NO: 22之序列，與SEQ ID NO: 22實質上一致(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高一致)之序列，或相對於SEQ ID NO: 22具有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個變化，例如胺基酸取代、插入或缺失之序列，或其任何片段。 示例性KRAB結構域序列 RTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP (SEQ ID NO: 22) mSin3 相互作用結構域 (SID)
mSin3相互作用結構域(SID)為存在於若干轉錄抑制蛋白上之相互作用結構域。其與mSin3之成對兩親α-螺旋2 (PAH2)結構域，連接至轉錄抑制蛋白，諸如mSin3 A共抑制子之轉錄抑制結構域相互作用。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至mSin3相互作用結構域或其片段之dCas9分子。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至四個連結之mSin3相互作用結構域(SID4X)之dCas9分子。在一個實施例中，四個連結之mSin3相互作用結構域(SID4X)融合至dCas9分子之C端。 MAX 相互作用蛋白 1 (MXI1)
Mxi1為MYC之抑制子。Mxi1可能藉由競爭結合至MYC相關因子X (MAX)來拮抗MYC轉錄活性，該MAX結合至MYC且為MYC起作用所需要的。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至Mxi1或其片段之dCas9分子。在一個實施例中，Mxi1融合至dCas9分子之C端。 基因表現活化子
在一些實施例中，基因表現調節子包含基因表現活化子。活化子可為任何已知之基因表現活化子，例如，VP16活化結構域、VP64活化結構域、p65活化結構域、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus) R反式活化子Rta分子或其片段。可用於dCas9分子之活化在此項技術中為已知的。參見例如Chavez等人, Nat Methods.(2016) 13 : 563-67，以全文引用之方式併入本文中。 VP16 、 VP64 、 VP160
VP16為16個胺基酸之病毒蛋白序列，其將轉錄活化子募集至啟動子及增強子。VP64為包含VP 16之四個複本之轉錄活化子，例如，包含由Gly-Ser連接子連接之VP16之四個串聯複本之分子。VP160為包含VP16之10個複本之轉錄活化子。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至VP16之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個複本之dCas9分子。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至VP64之dCas9分子。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至VP 160之dCas9分子。在一個實施例中，VP64融合至dCas9分子之C端、N端或N端及C端。 p65 活化結構域 (p65AD)
p65AD為F-κΒ轉錄因子之核形式之65kDa多肽的主要反式活化結構域。人類轉錄因子p65之示例性序列在Uniprot資料庫中以寄存編號Q04206可得。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至p65或其片段，例如p65AD之dCas9分子。 愛潑斯坦 - 巴爾病毒 (EBV) R 反式活化子 (Rta)
Rta，EBV之即刻早期蛋白，為誘導溶解性基因表現且觸發病毒再活化之轉錄活化子。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至Rta或其片段之dCas9分子。 VP64 、 p65 、 Rta 融合體
在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至VP64、p65、Rta或其任何組合之dCas9分子。其中三個轉錄活化結構域使用短胺基酸連接子融合之三聯活化子VP64-p65-Rta (亦稱為VPR)當融合至dCas9分子時可有效地上調靶基因表現。在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至VPR之dCas9分子。 協同活化介體 (SAM)
在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括包含以下三個組分之CRISPR-Cas系統：(1) dCas9-VP64融合體，(2)在四環及莖環處併入兩個MS2 RNA適體之gRNA，及(3) MS2- P65-HSF1活化輔助蛋白。此系統，稱為協同活化介體(SAM)，將三個活化結構域 - VP64、P65及HSFl橋聯在一起且已描述於Konermann等人, Nature. 2015;517:583-8中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。 Ldbl 自締合結構域
在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至Ldbl自締合結構域之dCas9分子。Ldbl自締合結構域募集增強子相關內源Ldbl。 表觀遺傳修飾調節子
在一個實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至基因表現調節子之dCas9分子。在一些實施例中，基因表現調節子包含表觀遺傳修飾調節子。在一個實施例中，融合分子經由表觀遺傳修飾，例如經由組蛋白乙醯化或甲基化，或在靶基因之調控元件，例如啟動子、增強子或轉錄起始位點處之DNA甲基化來調節靶基因表現。調節子可為任何已知之表觀遺傳修飾調節子，例如，組蛋白乙醯轉移酶(例如，p300催化結構域)、組蛋白去乙醯酶、組蛋白甲基轉移酶(例如，SUV39H1或G9a (EHMT2))、組蛋白去甲基酶(例如，LSD1)、DNA甲基轉移酶(例如，DNMT3a或DNMT3a-DNMT3L)、DNA去甲基酶(例如，TET1催化結構域或TDG)，或其片段。 組蛋白修飾活性
在一些實施例中，表觀遺傳修飾調節子可具有組蛋白修飾活性。組蛋白修飾活性可包括但不限於組蛋白去乙醯酶、組蛋白乙醯轉移酶、組蛋白去甲基酶或組蛋白甲基轉移酶活性。
在一些實施例中，表觀遺傳修飾調節子可具有組蛋白乙醯轉移酶活性。組蛋白乙醯轉移酶可為p300或CREB結合蛋白(CBP)蛋白，或其片段。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至乙醯轉移酶p300或其片段，例如p300之催化核心的dCas9分子。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至CREB結合蛋白(CBP)蛋白或其片段之dCas9分子。
在一些實施例中，表觀遺傳修飾調節子可具有組蛋白去甲基酶活性。舉例而言，表觀遺傳修飾調節子可包括自核酸或蛋白質(例如，組蛋白)中移除甲基(CH3-)基團之酶。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至Lys特異性組蛋白去甲基酶1 (LSD1)或其片段之dCas9分子。
在一些實施例中，表觀遺傳修飾調節子可具有組蛋白甲基轉移酶活性。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至SUV39H1或其片段之dCas9分子。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至G9a (EHMT2)或其片段之dCas9分子。 DNA 去甲基酶活性
在一些實施例中，表觀遺傳修飾調節子可具有DNA去甲基酶活性。舉例而言，表觀遺傳修飾調節子可將甲基轉化成羥甲基胞嘧啶作為使DNA去甲基化之機制。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至10-11易位甲基胞嘧啶二氧酶1 (TET1)或其片段之dCas9分子。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)或其片段之dCas9分子。 DNA 甲基化酶活性
在一些實施例中，表觀遺傳修飾調節子可具有DNA甲基化酶活性。舉例而言，表觀遺傳修飾調節子可具有甲基化酶活性，其涉及將甲基轉移至DNA、RNA、蛋白質、小分子、胞嘧啶或腺嘌呤。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至DNMT3A或其片段之dCas9分子。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至DNMT3L或其片段之dCas9分子。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至DNMT3A及DNMT3L或其片段之dCas9分子。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物包括融合分子，該融合分子包含融合至DNMT3A-DNMT3L融合肽之dCas9分子。 DNMT3A MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV (SEQ ID NO: 23) DNMT3L MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL (SEQ ID NO: 24) DNMT3A-DNMT3L融合肽 MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL (SEQ ID NO: 96)
在一個實施例中，Cas9融合蛋白亦包含核定位序列(NLS)，例如，融合至Cas9之N端及/或C端之LS。
核定位序列在此項技術中為已知的。在一個實施例中，NLS包含SEQ ID NO: 25或26之胺基酸序列，與SEQ ID NO: 25或26實質上一致(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高一致)之序列，或相對於SEQ ID NO: 25或26具有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個變化，例如胺基酸取代、插入或缺失之序列，或其任何片段。 SEQ ID NO: 25 (示例性核定位序列) APKKKRKVGIHGVPAA SEQ ID NO: 26 (示例性核定位序列) KRPAATKKAGQAKKKK
在一些實施例中，基於CRISPR/Cas9之系統可包括dCas9分子及基因表現調節子，或編碼dCas9分子及基因表現調節子之核酸。在一個實施例中，dCas9分子及基因表現調節子共價連接。在一個實施例中，基因表現調節子直接共價融合至dCas9分子。在一個實施例中，基因表現調節子間接，例如經由非調節子或連接子或經由第二調節子共價融合至dCas9分子。在一個實施例中，基因表現調節子在dCas9分子之N端及/或C端處。在一個實施例中，dCas9分子及基因表現調節子非共價連接。示例性序列包括但不限於表2中所列之彼等。在一些實施例中，dCas9與至少一個基因表現調節子之間的連接子包含對應於表2中所列之連接子的胺基酸序列。 表2. 示例性連接子序列
描述 序列 SEQ ID NO:
連接子 SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH    SEQ ID NO: 19
XTEN80 連接子 GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE SEQ ID NO: 20
XTEN16 連接子 SGSETPGTSESATPES    SEQ ID NO: 21
在一個實施例中，dCas9分子融合至第一標籤，例如，第一肽標籤。在一個實施例中，基因表現調節子融合至第二標籤，例如，第二肽標籤。在一個實施例中，第一及第二標籤，例如第一肽標籤及第二肽標籤，彼此非共價相互作用，從而使dCas9分子及基因表現調節子緊密靠近。
在一個實施例中，基於CRISPR/Cas9之系統包括融合分子或編碼融合分子之核酸。在一個實施例中，融合分子包括包含融合至基因表現調節子之dCas9的序列。在一個實施例中，dCas9分子包含釀膿鏈球菌dCas9分子、金黃色葡萄球菌dCas9分子、空腸彎曲桿菌dCas9分子、白喉棒狀桿菌dCas9分子、凸腹真桿菌dCas9分子、巴氏鏈球菌dCas9分子、香腸乳桿菌dCas9分子、球形球毛殼菌dCas9分子、固氮螺菌(菌株B510) dCas9分子、固氮葡糖醋桿菌dCas9分子、灰色奈瑟菌dCas9分子、腸道羅氏菌dCas9分子、食清潔劑細小棒菌dCas9分子、鹵水硝酸鹽裂解菌(菌株DSM 16511) dCas9分子、紅嘴鷗彎曲桿菌(菌株CF89-12) dCas9分子、嗜熱鏈球菌(菌株LMD-9) dCas9分子，或其片段。
在一個實施例中，融合分子為DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB融合分子，其自N端至C端包含：DNMT3A-DNMT3L融合肽(3A3L)、dCas9肽及KRAB肽結構域，直接或間接(例如，經由連接子)融合。
在一個實施例中，融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，與SEQ ID NO: 97實質上一致(例如，序列一致性為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)之序列，或相對於SEQ ID NO: 97具有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個變化，例如取代、插入或缺失之序列，或其任何片段。 DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB MNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE PKKKRKV MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD AYPYDVPDYASLGSGS PKKKRKV ED PKKKRKV DG SGSETPGTSESATPES RTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP (SEQ ID NO: 97) gRNA
如本文所用，術語「嚮導序列」在CRISPR-Cas系統之情形中包含與靶核酸序列具有足夠互補性以與靶核酸序列雜交且指導核酸靶向複合物與靶核酸序列之序列特異性結合的任何聚核苷酸序列。嚮導序列可與靶序列形成雙鏈體。雙鏈體可為DNA雙鏈體、RNA雙鏈體或RNA/DNA雙鏈體。術語「嚮導分子」及「嚮導RNA」及「單嚮導RNA」在本文中可互換使用以指代基於RNA之分子，該等分子能夠與CRISPR-Cas蛋白形成複合物且包含與靶核酸序列具有足夠互補性以與靶核酸序列雜交且指導複合物與靶核酸序列之序列特異性結合的嚮導序列。嚮導分子或嚮導RNA特定地涵蓋基於RNA之分子，該等分子具有如本文所述之一或多個化學修飾(例如，藉由化學連接兩個核糖核苷酸或藉由用一或多個去氧核糖核苷酸置換一或多個核糖核苷酸)。
CRISPR-Cas蛋白之嚮導分子或嚮導RNA可包含tracr伴侶序列(在內源CRISPR系統之情形中涵蓋「正向重複」)及嚮導序列(在內源CRISPR系統之情形中亦稱作「間隔子」)。在一些實施例中，如本文所述之CRISPR-Cas系統或複合物不包含及/或不依賴於tracr序列之存在。在某些實施例中，嚮導分子可包含、基本上由或由融合或連接至嚮導序列或間隔序列之正向重複序列組成。
一般而言，CRISPR-Cas系統係由促進在靶序列之位點處形成CRISPR複合物之元件表徵。在形成CRISPR複合物之情形中，「靶序列」係指嚮導序列經設計以與其具有互補性之序列，其中靶DNA序列與嚮導序列之間的雜交促進CRISPR複合物形成。
在某些實施例中，嚮導分子之嚮導序列或間隔子長度為15至50個核苷酸之長度。在某些實施例中，嚮導RNA之間隔子長度為至少15個核苷酸之長度。在某些實施例中，間隔子長度為15至17個核苷酸之長度、17至20個核苷酸之長度、20至24個核苷酸之長度、23至25個核苷酸之長度、24至27個核苷酸之長度、27-30個核苷酸之長度、30-35個核苷酸之長度或大於35個核苷酸之長度。
在一些實施例中，嚮導序列之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個核苷酸。
在一些實施例中，嚮導分子(正向重複及/或間隔子)之序列經選擇以減小嚮導分子內二級結構之程度。在一些實施例中，當最佳折疊時，核酸靶向嚮導RNA之約或小於約75%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%或更少核苷酸參與自互補鹼基配對。最佳折疊可藉由任何適合之聚核苷酸折疊演算法確定。一些程式係基於計算最小吉布斯自由能(Gibbs free energy)。一種此類演算法之實例為mFold，如由Zuker及Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)所述。折疊演算法之另一個實例為線上網路伺服器RNAfold，由維也納大學理論化學研究所開發，使用質心結構預測演算法(參見例如A.R. Gruber等人, 2008, Cell 106(1): 23-24；及PA Carr及GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62)。
如上文所述，CRISPR/Cas9系統利用提供基於CRISPR/Cas9之細胞之靶向的gRNA。gRNA為兩個非編碼RNA之融合體：crRNA及tracrRNA。sgRNA可藉由將編碼經由互補鹼基配對賦予靶向特異性之20 bp原間隔子之序列與所需DNA靶交換來靶向任何所需DNA序列。gRNA模擬II型效應系統中所涉及之天然存在之crRNA:tracrRNA雙鏈體。可包括例如42-核苷酸crRNA及75-核苷酸tracrRNA之此雙鏈體用作Cas9之嚮導以使靶核酸裂解。
如本文中可互換使用之術語「靶區」、「靶序列」或「原間隔子」係指基於CRISPR/Cas9系統所靶向之靶基因之區域。基於CRISPR/Cas9之系統可包括至少一個gRNA，其中該等gRNA靶向不同DNA序列。靶DNA序列可為重疊的。靶序列或原間隔子之後為原間隔子之3'末端處之PAM序列。不同II型系統具有不同PAM需求。舉例而言，釀膿鏈球菌II型系统使用「NGG」序列，其中「N」可為任何核苷酸。
在一些實施例中，向細胞投與之gRNA之數目可為至少1個gRNA、至少2個不同gRNA、至少3個不同gRNA、至少4個不同gRNA、至少5個不同gRNA、至少6個不同gRNA、至少7個不同gRNA、至少8個不同gRNA、至少9個不同gRNA、至少10個不同gRNA、至少11個不同gRNA、至少12個不同gRNA、至少13個不同gRNA、至少14個不同gRNA、至少15個不同gRNA、至少16個不同gRNA、至少17個不同gRNA、至少18個不同gRNA、至少19個不同gRNA、至少20個不同gRNA、至少25個不同gRNA、至少30個不同gRNA、至少35個不同gRNA、至少40個不同gRNA、至少45個不同gRNA或至少50個不同gRNA。
在一些實施例中，向細胞投與之gRNA之數目可介於以下之間：至少1個gRNA至至少50個不同gRNA、至少1個gRNA至至少45個不同gRNA、至少1個gRNA至至少40個不同gRNA、至少1個gRNA至至少35個不同gRNA、至少1個gRNA至至少30個不同gRNA、至少1個gRNA至至少25個不同gRNA、至少1個gRNA至至少20個不同gRNA、至少1個gRNA至至少16個不同gRNA、至少1個gRNA至至少12個不同gRNA、至少1個gRNA至至少8個不同gRNA、至少1個gRNA至至少4個不同gRNA、至少4個gRNA至至少50個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少45個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少40個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少35個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少30個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少25個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少20個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少16個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少12個不同gRNA、至少4個不同gRNA至至少8個不同gRNA、至少8個不同gRNA至至少50個不同gRNA、至少8個不同gRNA至至少45個不同gRNA、至少8個不同gRNA至至少40個不同gRNA、至少8個不同gRNA至至少35個不同gRNA、8個不同gRNA至至少30個不同gRNA、至少8個不同gRNA至至少25個不同gRNA、8個不同gRNA至至少20個不同gRNA、至少8個不同gRNA至至少16個不同gRNA，或8個不同gRNA至至少12個不同gRNA。
在一些實施例中，gRNA經選擇以增加或減少靶基因之轉錄。在某個實施例中，gRNA靶向靶基因(例如，PCSK9)之轉錄起始位點(TSS)之上游的區域，例如，介於靶基因之轉錄起始位點之上游0-1000 bp之間。在一些實施例中，gRNA靶向介於靶基因之轉錄起始位點之上游0-50 bp、0-100 bp、0-150 bp、0-200 bp、0-250 bp、0-300 bp、0-350 bp、0-400 bp、0-450 bp、0-500 bp、0-550 bp、0-600 bp、0-650 bp、0-700 bp、0-750 bp、0-800 bp、0-850 bp、0-900 bp、0-950 bp或0-1000 bp之間的區域。在一些實施例中，gRNA靶向靶基因之轉錄起始位點之上游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內之區域。在一個實施例中，gRNA靶向靶基因之TSS之上游0-300bp的區域。
在一些實施例中，gRNA靶向靶基因之轉錄起始位點之下游的區域，例如，介於靶基因之轉錄起始位點之下游0-1000 bp之間。在一些實施例中，gRNA靶向介於靶基因之轉錄起始位點之下游0-50 bp、0-100 bp、0-150 bp、0-200 bp、0-250 bp、0-300 bp、0-350 bp、0-400 bp、0-450 bp、0-500 bp、0-550 bp、0-600 bp、0-650 bp、0-700 bp、0-750 bp、0-800 bp、0-850 bp、0-900 bp、0-950 bp或0-1000 bp之間的區域。在一些實施例中，gRNA靶向靶基因之轉錄起始位點之下游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內之區域。在一個實施例中，gRNA靶向靶基因之TSS之下游0-300bp的區域。
前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)亦可稱作枯草桿菌蛋白酶/Kexin樣蛋白酶PC9。人類PCSK9具有1p32.3之細胞發生位置且基因體坐標在正向股之染色體1上之位置55,039,548-55,064,852處。BSND為正向股上之PCSK9之上游的基因。人類PCSK9具有NCBI基因ID 255738、參考序列寄存編號NM_174936.4、參考序列寄存編號NP_777596.2及Ensembl基因ID ENSG00000169174。
小鼠PCSK9具有基因體位置4, 4 C7且在位置NC_000070.07處具有染色體4之基因體序列。BSND為正向股上之小鼠PCSK9之上游的基因。小鼠PCSK9具有NCBI基因ID 100102、參考序列寄存編號NM_153565.2、參考序列寄存編號NP_705793.1及Ensembl基因ID ENSMUSG00000044254。
恆河猴( Macaca mulatta) PCSK9具有基因體位置NC_041754.1。ENSMMUG0000005740為正向股上之猴PCSK9之上游的基因。猴PCSK9具有參考序列寄存編號NM_001112660.1、參考序列寄存編號NP_001106130.1及Ensembl基因ID ENSMMUG00000005736。
本揭示案提供靶向小鼠PCSK9靶基因之sgRNA序列。示例性sgRNA包括但不限於表3中所列之彼等。本揭示案亦提供靶向人類PCSK9之sgRNA序列。示例性sgRNA包括但不限於表4中所列之彼等。本揭示案亦提供靶向猴PCSK9之sgRNA序列。示例性sgRNA包括但不限於表5中所列之彼等。 表3. 示例性小鼠PCSK9 sgRNA序列
描述 序列 SEQ ID NO:
小鼠PCSK9 sgRNA1 TGGACGCGCAGGCTGCCGGT SEQ ID NO: 27
小鼠PCSK9 sgRNA2 CCACCTTCACGTGGACGCGC SEQ ID NO: 28
小鼠PCSK9 sgRNA3 GTGGACGCGCAGGCTGCCGG SEQ ID NO: 29
小鼠PCSK9 sgRNA4 CTCTCTCTTTCTGAGGCTAG SEQ ID NO: 30
小鼠PCSK9 sgRNA5 CACGTGGACGCGCAGGCTGC SEQ ID NO: 31
小鼠PCSK9 sgRNA6 TTAAGAGGGGGGAATGTAAC SEQ ID NO: 32
小鼠PCSK9 sgRNA7 AACCTGATCCTTTAGTACCG SEQ ID NO: 33
小鼠PCSK9 sgRNA8 TCAGAGAGGATCTTCCGATG SEQ ID NO: 34
小鼠PCSK9 sgRNA9 GGATCTTCCGATGGGGCTCG SEQ ID NO: 35
小鼠PCSK9 sgRNA10 GCGTCATTTGACGCTGTCTG SEQ ID NO: 36
小鼠PCSK9 sgRNA11 TCATTTGACGCTGTCTGGGG SEQ ID NO: 37
小鼠PCSK9 sgRNA12 GATCCTTTAGTACCGGGGCC SEQ ID NO: 38
小鼠PCSK9 sgRNA13 TGCAGCCCAATTAGGATTTG SEQ ID NO: 39
表4. 示例性人類PCSK9 sgRNA序列
描述 序列 SEQ ID NO:
人類PCSK9 sgRNA1 GGCTCAGACCCTGAACTGAA SEQ ID NO: 40
人類PCSK9 sgRNA2 GAGGCGCTCATGGTTGCAGG SEQ ID NO: 41
人類PCSK9 sgRNA3 TCAGACCCTGAACTGAACGG SEQ ID NO: 42
人類PCSK9 sgRNA4 AGGCGCTCATGGTTGCAGGC SEQ ID NO: 43
人類PCSK9 sgRNA5 AGTTCAGGGTCTGAGCCTGG SEQ ID NO: 44
人類PCSK9 sgRNA6 CGGGCGCCGCCGTTCAGTTC SEQ ID NO: 45
人類PCSK9 sgRNA7 GGGCGCCGCCGTTCAGTTCA SEQ ID NO: 46
人類PCSK9 sgRNA8 ACTGCCTGGCTCACTCCTCC SEQ ID NO: 47
人類PCSK9 sgRNA9 TGAGCCTGGAGGAGTGAGCC SEQ ID NO: 48
人類PCSK9 sgRNA10 TTCAGTTCAGGGTCTGAGCC SEQ ID NO: 49
人類PCSK9 sgRNA11 CCAGGCAGTGAGACTGGCTC SEQ ID NO: 50
人類PCSK9 sgRNA12 TGAGCGCCTCGACGTCGCTG SEQ ID NO: 51
人類PCSK9 sgRNA13 AGGTTTCCGCAGCGACGTCG SEQ ID NO: 52
人類PCSK9 sgRNA14 GCCAGGCAGTGAGACTGGCT SEQ ID NO: 53
人類PCSK9 sgRNA15 GTCGAGGCGCTCATGGTTGC SEQ ID NO: 54
人類PCSK9 sgRNA16 CCCGAGCCAGTCTCACTGCC SEQ ID NO: 55
人類PCSK9 sgRNA17 GGCAGTGAGACTGGCTCGGG SEQ ID NO: 56
人類PCSK9 sgRNA18 CAGCGACGTCGAGGCGCTCA SEQ ID NO: 57
人類PCSK9 sgRNA19 GCAGTGAGACTGGCTCGGGC SEQ ID NO: 58
人類PCSK9 sgRNA20 GAGACTGGCTCGGGCGGGCC SEQ ID NO: 59
人類PCSK9 sgRNA21 TGAGACTGGCTCGGGCGGGC SEQ ID NO: 60
人類PCSK9 sgRNA22 GGAGACCTAGAGGCCGTGCG SEQ ID NO: 61
人類PCSK9 sgRNA23 CGGCGGCGCCTTGAGCCTTG SEQ ID NO: 62
人類PCSK9 sgRNA24 GCGCCTTGAGCCTTGCGGTG SEQ ID NO: 63
人類PCSK9 sgRNA25 GGCGCCTTGAGCCTTGCGGT SEQ ID NO: 64
人類PCSK9 sgRNA26 CCTCCCCACCGCAAGGCTCA SEQ ID NO: 65
人類PCSK9 sgRNA27 GCACAGTCCTCCCCACCGCA SEQ ID NO: 66
人類PCSK9 sgRNA28 CGGCGCCTTGAGCCTTGCGG SEQ ID NO: 67
人類PCSK9 sgRNA29 AGGCCGTGCGCGGTCCACGC SEQ ID NO: 68
人類PCSK9 sgRNA30 CTGTGCAGGAGCTGAAGTTC SEQ ID NO: 69
人類PCSK9 sgRNA31 CCTTGAGCCTTGCGGTGGGG SEQ ID NO: 70
人類PCSK9 sgRNA32 GTGGACCGCGCACGGCCTCT SEQ ID NO: 71
人類PCSK9 sgRNA33 GGCTCAAGGCGCCGCCGGCG SEQ ID NO: 72
人類PCSK9 sgRNA34 TGCGGTGGGGAGGACTGTGC SEQ ID NO: 73
人類PCSK9 sgRNA35 CGCAAGGCTCAAGGCGCCGC SEQ ID NO: 74
人類PCSK9 sgRNA36 CCGTGCGCGGTCCACGCCGG SEQ ID NO: 75
人類PCSK9 sgRNA37 CCGCCGGCGTGGACCGCGCA SEQ ID NO: 76
人類PCSK9 sgRNA38 GGAGCTGACGGTGCCCATGA SEQ ID NO: 77
人類PCSK9 sgRNA39 TCAGGAGCAGGGCGCGTGAA SEQ ID NO: 78
人類PCSK9 sgRNA40 GGGACGCGTCGTTGCAGCAG SEQ ID NO: 79
人類PCSK9 sgRNA41 GAGAGGTTGCTGTCCTGGCG SEQ ID NO: 80
人類PCSK9 sgRNA42 TGAAGGGGCGCGCGGAATCC SEQ ID NO: 81
人類PCSK9 sgRNA43 ACCTCTCCCCTGGCCCTCAT SEQ ID NO: 82
人類PCSK9 sgRNA44 GCGGCTCCCAGCTCCCAGCC SEQ ID NO: 83
人類PCSK9 sgRNA45 CAAATCCTAACTGGGCTGGA SEQ ID NO: 84
人類PCSK9 sgRNA46 TCCCGCCTCTCACCCTGCGT SEQ ID NO: 85
人類PCSK9 sgRNA47 GGAGTCTGGCATCCCACGCA SEQ ID NO: 86
人類PCSK9 sgRNA48 AAACCTGATCCTCCAGTCCG SEQ ID NO: 87
人類PCSK9 sgRNA49 GTGTGGGTGCTTGACGCCTG SEQ ID NO: 88
人類PCSK9 sgRNA50 TTAAACATTAACGGAACCCC SEQ ID NO: 89
人類PCSK9 sgRNA51 AACCTGATCCTCCAGTCCGG SEQ ID NO: 90
人類PCSK9 sgRNA52 GCCAGACTCCAAGTTCTGCC SEQ ID NO: 91
人類PCSK9 sgRNA53 ATCCCACGCAGGGTGAGAGG SEQ ID NO: 92
人類PCSK9 sgRNA54 GGCATCCCACGCAGGGTGAG SEQ ID NO: 93
人類PCSK9 sgRNA55 GCGGAAACCTTCTAGGGTGT SEQ ID NO: 94
人類PCSK9 sgRNA56 ATCGTCCGATGGGGCTCTGG SEQ ID NO: 95
表5. 示例性猴PCSK9 sgRNA序列
描述 序列 SEQ ID NO:
猴PCSK9 sgRNA1 CTGTGCACAGGCTTCATCAT SEQ ID NO: 98
猴PCSK9 sgRNA2 GCACAGTAACAACCCCTGGT SEQ ID NO: 99
猴PCSK9 sgRNA3 GGTCCCAAAGAGCAGCAGCA SEQ ID NO: 100
猴PCSK9 sgRNA4 CTAGGAGGAGGCCTTTGATG SEQ ID NO: 101
猴PCSK9 sgRNA5 AACAACCCCTGGTAGGTGAG SEQ ID NO: 102
猴PCSK9 sgRNA6 CTGGTAGGTGAGAGGCCAAG SEQ ID NO: 103
猴PCSK9 sgRNA7 CTGGGTGCACAGTAACAACC SEQ ID NO: 104
猴PCSK9 sgRNA8 TCCATTCTTTCTCTAGGAGG SEQ ID NO: 105
猴PCSK9 sgRNA9 TGTCCCTCTGTGCACAGGCT SEQ ID NO: 106
猴PCSK9 sgRNA10 GGGTGCACAGTAACAACCCC SEQ ID NO: 107
猴PCSK9 sgRNA11 TCCAGTTACAGGCAACAGGA SEQ ID NO: 108
在一個實施例中，gRNA靶向靶基因之啟動子區域。在一個實施例中，gRNA靶向靶基因之增強子區域。gRNA可分成靶結合區、Cas9結合區及轉錄終止區。靶結合區與靶基因中之靶區雜交。用於設計此類靶結合區之方法在此項技術中心為已知的，參見例如Doench等人, Nat Biotechnol. (2014) 32: 1262-7；及Doench等人, Nat Biotechnol. (2016) 34: 184-91，以全文引用之方式併入本文中。設計工具在例如Feng Zhang lab之target Finder、Michael Boutros lab之Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools (Cas-OF Finder)、CasFinder及CRISPR Optimal Target Finder可得。在某些實施例中，靶結合區之長度可介於約15與約50個核苷酸之間(長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或約50個核苷酸)。在某些實施例中，靶結合區之長度可介於約19與約21個核苷酸之間。在一個實施例中，靶結合區之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。
在一個實施例中，靶結合區與靶基因中之靶區互補，例如，完全互補。在一個實施例中，靶結合區與靶基因中之靶區實質上互補。在一個實施例中，靶結合區包含不多於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個與靶基因中之靶區不互補之核苷酸。
在一個實施例中，靶結合區經工程改造以改善穩定性或延長半衰期，例如，藉由將非天然核苷酸或經修飾核苷酸併入靶結合區中，藉由移除或修飾RNA去穩定化序列元件，藉由添加RNA穩定化序列元件，或藉由增加Cas9/gRNA複合物之穩定性。在一個實施例中，靶結合區經工程改造以增強其轉錄。在一個實施例中，靶結合區經工程改造以減少二級結構形成。在一個實施例中，gRNA之Cas9結合區經修飾以增強gRNA之轉錄。在一個實施例中，gRNA之Cas9結合區經修飾以改善Cas9/gRNA複合物之穩定性或組裝。 遞送系統
本揭示案亦提供用於將本文中之系統及組合物之組分引入細胞、組織、器官或生物體之遞送系統。遞送系統可包含一或多個遞送運載體及/或貨物。 貨物
遞送系統可包含一或多個貨物。貨物可包含本文中之系統及組合物之一或多個組分。貨物可包含以下一或多者：i)編碼一或多個Cas蛋白之質體；ii)編碼一或多個嚮導RNA之質體；iii)一或多個Cas蛋白之mRNA；iv)一或多個嚮導RNA；v)一或多個Cas蛋白；vi)其任何組合。在一些實例中，貨物可包含編碼一或多個Cas蛋白及一或多個(例如，複數個)嚮導RNA之質體。在一些實施例中，貨物可包含編碼一或多個Cas蛋白及一或多個嚮導RNA之mRNA。
在一些實例中，貨物可包含一或多個Cas蛋白及一或多個嚮導RNA，例如，呈核糖核蛋白複合物(RNP)之形式。核糖核蛋白複合物可由本文中之方法及系統遞送。在一些情況下，核糖核蛋白可經由基於多肽之輸送劑遞送。在一個實例中，核糖核蛋白可使用合成肽遞送，該等合成肽包含可操作地連接至細胞穿透結構域(CPD)、富組胺酸結構域及CPD之核內體洩漏結構域(ELD)，例如，如WO2016161516中所述。 物理遞送
在一些實施例中，可藉由物理遞送方法將貨物引入細胞中。物理方法之實例包括微注射、電穿孔及流體動力學遞送。 微注射
貨物直接至細胞中之微注射可達成高效率，例如，高於90%或約100%。在一些實施例中，可使用顯微鏡及針(例如，具有0.5-5.0 µm直徑)進行微注射以刺穿細胞膜且將貨物直接遞送至細胞內之靶位點。微注射可用於活體外及離體遞送。
可微注射包含Cas蛋白及/或嚮導RNA、mRNA及/或嚮導RNA之編碼序列的質體。在一些情況下，微注射可用於i)將DNA直接遞送至細胞核，及/或ii)將mRNA遞送(例如，活體外轉錄)至細胞核或細胞質。在某些實例中，微注射可用於將sgRNA直接遞送至細胞核且將編碼Cas之mRNA遞送至細胞質，例如，促進Cas轉譯及輸送至細胞核。
微注射可用於產生遺傳修飾之動物。舉例而言，可將基因編輯貨物注射至接合子中以允許有效種系修飾。此種方法可得到帶有所需修飾之正常胚胎及足月小鼠幼崽。微注射亦可用於提供瞬時上調或下調細胞基因體內之特定基因，例如，使用CRISPRa及CRISPRi。 電穿孔
在一些實施例中，貨物及/或遞送運載體可藉由電穿孔遞送。電穿孔可使用脈衝高壓電流以瞬時打開懸浮於緩衝液中之細胞之細胞膜內的奈米尺寸之孔，從而允許具有數十奈米之流體動力學直徑之組分流入細胞中。在一些情況下，電穿孔可對各種細胞類型使用且有效地將貨物轉移至細胞中。電穿孔可用於活體外及離體遞送。
電穿孔亦可用於藉由施加特定電壓及試劑，例如藉由核轉染將貨物遞送至哺乳動物細胞之細胞核中。此類方法包括Wu Y等人, (2015). Cell Res 25:67-79；Ye L等人, (2014). Proc Natl Acad Sci USA 111:9591-6；Choi PS, Meyerson M. (2014). Nat Commun 5:3728；Wang J, Quake SR. (2014). Proc Natl Acad Sci 111:13157-62中所述之彼等。電穿孔亦可用於活體內遞送貨物，例如，使用Zuckermann M等人, (2015). Nat Commun 6:7391中所述之方法。 流體動力學遞送
流體動力學遞送亦可用於遞送貨物，例如，用於活體內遞送。在一些實例中，流體動力學遞送可藉由將含有基因編輯貨物之大體積(8-10%體重)溶液推送至個體(例如，動物或人類)之血流中來進行，例如，對於小鼠，經由尾靜脈。當血液不可壓縮時，大團注之液體可使得流體動力學壓力增加，此暫時增強進入內皮細胞及實質細胞中之滲透性，從而使貨物通常不能跨越細胞膜以傳送至細胞中。此方法可用於遞送裸DNA質體及蛋白質。所遞送之貨物可富集於肝、腎、肺、肌肉及/或心臟中。 轉染
可藉由用於將核酸引入細胞中之方法將貨物(例如，核酸)引入細胞中。轉染方法之實例包括磷酸鈣介導之轉染、陽離子轉染、脂質體轉染、樹枝狀聚合物轉染、熱休克轉染、磁轉染、脂轉染、穿刺轉染、光學轉染、專屬劑增強之核酸攝取。 遞送運載體
遞送系統可包含一或多個遞送運載體。遞送運載體可將貨物遞送至細胞、組織、器官或生物體(例如，動物或植物)中。貨物可經包裝、攜帶或以其他方式與遞送運載體相關聯。遞送運載體可基於有待遞送之貨物之類型來選擇，及/或遞送為活體外及/或活體內。遞送運載體之實例包括本文所述之載體、病毒、非病體運載體及其他遞送試劑。
根據本揭示案之遞送運載體可具有小於100微米(µm)之最大尺寸(例如，直徑)。在一些實施例中，遞送運載體具有小於10 µm之最大尺寸。在一些實施例中，遞送運載體可具有小於2000奈米(nm)之最大尺寸。在一些實施例中，遞送運載體可具有小於1000奈米(nm)之最大尺寸。在一些實施例中，遞送運載體可具有小於900 nm、小於800 nm、小於700 nm、小於600 nm、小於500 nm、小於400 nm、小於300 nm、小於200 nm、小於150 nm或小於100 nm、小於50 nm之最大尺寸(例如，直徑)。在一些實施例中，遞送運載體可具有介於25 nm與200 nm之間的範圍內之最大尺寸。
在一些實施例中，遞送運載體可為或包含粒子。舉例而言，遞送運載體可為或包含奈米粒子(例如，具有不大於1000nm之最大尺寸(例如，直徑)之粒子)。粒子可按不同形式提供，例如，呈固體粒子(例如，金屬(諸如銀、金、鐵、鈦)、非金屬、基於脂質之固體、聚合物)、粒子懸浮液，或其組合。可製備金屬、介電質及半導體粒子，以及混合結構(例如，核-殼粒子)。 載體
系統、組合物及/或遞送系統可包含一或多個載體。本揭示案亦包括載體系統。載體系統可包含一或多個載體。在一些實施例中，載體係指能夠轉運其所連接之另一個核酸的核酸。載體包括單股、雙股或部分雙股之核酸分子；包含一或多個游離末端、無游離末端(例如，環狀)之核酸分子；包含DNA、RNA或兩者之核酸分子；及此項技術中已知之其他種類之聚核苷酸。載體可為質體，例如，可諸如藉由標準分子選殖技術插入額外DNA區段之環狀雙股DNA環。某些載體可能能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體，及附加型哺乳動物載體)。一些載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中之後整合至宿主細胞之基因體中，從而與宿主基因體一起複製。在某些實例中，載體可為表現載體，例如，能夠指導與其可操作地連接之基因的表現。在一些情況下，表現載體可用於真核細胞中之表現。在重組DNA技術中利用之常用表現載體常常呈質體之形式。
載體之實例包括pGEX、pMAL、pRIT5、大腸桿菌表現載體(例如，pTrc、pET l ld)、酵母表現載體(例如，pYepSecl、pMFa、pJRY88、pYES2及picZ)、桿狀病毒載體(例如，用於在昆蟲細胞，諸如SF9細胞中表現) (例如，pAc系列及pVL系列)、哺乳動物表現載體(例如，pCDM8及pMT2PC)。
載體可包含i) Cas編碼序列，及/或ii)單個或至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少14個、至少16個、至少32個、至少48個、至少50個嚮導RNA編碼序列。在單個載體中，可存在用於各RNA編碼序列之啟動子。替代地或另外，在單個載體中，可存在控制多個RNA編碼序列(例如，驅動轉錄及/或表現)之啟動子。 調控元件
載體可包含一或多個調控元件。調控元件可操作地連接至Cas蛋白之編碼序列、輔助蛋白、嚮導RNA (例如，單嚮導RNA、crRNA及/或tracrRNA)，或其組合。術語「可操作地連接」欲意指以允許核苷酸序列表現(例如，在活體外轉錄/轉譯系統中或當將載體引入宿主細胞中時在宿主細胞中)之方式將所關注之核苷酸序列連接至調控元件。在某些實例中，載體可包含：可操作地連接至編碼Cas蛋白之核苷酸序列之第一調控元件，及可操作地連接至編碼嚮導RNA之核苷酸序列之第二調控元件。
調控元件之實例包括啟動子、增強子、內部核糖體進入位點(IRES)及其他表現控制元件(例如，轉錄終止訊號，諸如聚腺苷酸化訊號及聚U序列)。此類調控元件描述於例如Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif (1990)中。調控元件包括指導核苷酸序列在許多類型之宿主細胞中組成性表現之彼等及指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表現之彼等(例如，組織特異性調控序列)。組織特異性啟動子可指導主要在所關注之所需組織，諸如肌肉、神經元、骨骼、皮膚、血液、特定器官(例如，肝臟、胰臟)或特定細胞類型(例如，淋巴細胞)中表現。調控元件亦可按時間依賴性方式，諸如按細胞週期依賴性或發育階段依賴性方式指導表現，其亦可能為或可能不為組織或細胞類型特異性的。
啟動子之實例包括一或多個pol III啟動子(例如，1、2、3、4、5個或更多個pol III啟動子)、一或多個pol II啟動子(例如，1、2、3、4、5個或更多個pol II啟動子)、一或多個pol I啟動子(例如，1、2、3、4、5個或更多個pol I啟動子)，或其組合。pol III啟動子之實例包括但不限於U6及HI啟動子。pol II啟動子之實例包括但不限於反轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV) LTR啟動子(視情況與RSV增強子一起)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(視情況與CMV增強子一起)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子及EF1a啟動子。 病毒載體
貨物可由病毒遞送。在一些實施例中，使用病毒載體。病毒載體可包含用於包裝至病毒(例如，反轉錄病毒、複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒、複製缺陷型腺病毒及腺相關病毒)中的源自病毒之DNA或RNA序列。病毒載體亦包括由病毒攜帶以用於轉染至宿主細胞中之聚核苷酸。病毒及病毒載體可用於活體外、離體及/或活體內遞送。 腺相關病毒 (AAV)
本文中之系統及組合物可由腺相關病毒(AAV)遞送。AAV載體可用於此種遞送。依賴病毒屬及細小病毒科之AAV為單股DNA病毒。在一些實施例中，AAV可提供所提供之DNA的持續來源，此係因為AAV遞送之基因體材料可不定地存在於細胞中，例如，作為外源DNA，或具有某種修飾，直接整合至宿主DNA中。在一些實施例中，AAV不引起或涉及人類之任何疾病。病毒本身能夠有效地感染細胞，同時幾乎不誘發相關毒性之先天性或適應性免疫反應。
可用於本文中之AAV之實例包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-8及AAV-9。AAV之類型可針對所靶向之細胞進行選擇；例如，吾人可選擇AAV血清型1、2、5或混合衣殼AAVl、AAV2、AAV5或其任何組合用於靶向腦或神經元細胞；且吾人可選擇AAV4用於靶向心臟組織。AAV8適用於遞送至肝臟。最初提議基於AAV-2之載體用於CFTR遞送至CF氣道，諸如AAV-1、AAV-5、AAV-6及AAV-9之其他血清型在多種肺上皮模型中展現出改善之基因轉移效率。由AAV靶向之細胞類型之實例描述於Grimm, D.等人, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)及WO 2021/183807A1中，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
CRISPR-Cas AAV粒子可在HEK 293 T細胞中產生。一旦已產生具有特定向性之粒子，其將用於以與原生病毒粒子極為相同之方式感染靶細胞株。此可允許CRISPR-Cas組分在受感染之細胞類型中持續存在，且使得此種型式之遞送特別適於需要長期表現之情況。可使用之AAV之劑量及調配物的實例包括美國專利第8,454,972號及第第8,404,658號中所述之彼等。
各種策略可用於使用AAV遞送本文中之系統及組合物。在一些實例中，Cas及gRNA之編碼序列可直接包裝至一個DNA質體載體上且經由一個AAV粒子遞送。在一些實例中，AAV可用於將gRNA遞送至先前已工程改造以表現Cas之細胞中。在一些實例中，Cas及gRNA之編碼序列可進入兩個獨立AAV粒子中，其用於靶細胞之共轉染。在一些實例中，標誌物、標籤及其他序列可與Cas及/或gRNA之編碼序列包裝於相同AAV粒子中。 慢病毒
本文中之系統及組合物可由慢病毒遞送。慢病毒載體可用於此種遞送。慢病毒為具有在有絲分裂及有絲分裂後細胞中感染及表現其基因之能力的複雜反轉錄病毒。
慢病毒之實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV)，其可使用其他病毒之包膜糖蛋白以靶向大範圍之細胞類型；基於馬傳染性貧血病毒(EIAV)之最小非靈長類動物慢病毒載體，其可用於眼療法。在某些實施例中，具有靶向由HIV tat/rev共享之共同外顯子、核仁定位TAR誘餌及抗CCR5特異性錘頭狀核酶之siRNA的自滅活慢病毒載體(參見例如DiGiusto等人 (2010) Sci Transl Med 2:36ra43)可用於及/或適於本文中之核酸靶向系統。
慢病毒可用其他病毒蛋白，諸如水疱性口炎病毒G蛋白製成假型。在此種情況下，可改變慢病毒之細胞向性以在需要時可寬可窄。在一些情況下，為改善安全性，第二代及第三代慢病毒系統可跨越三個質體分裂必需基因，此可降低細胞內之活病毒粒子偶然重構之可能性。
在一些實例中，藉助於整合能力，慢病毒可用於產生包含各種遺傳修飾之細胞之文庫，例如，用於篩選及/或研究基因及訊號傳導路徑。 腺病毒
本文中之系統及組合物可由腺病毒遞送。腺病毒載體可用於此種遞送。腺病毒包括具有含雙股DNA基因體之二十面體核衣殼的無包膜病毒。腺病毒可感染分裂及非分裂細胞。在一些實施例中，腺病毒不整合至宿主細胞之基因體中，其可用於限制基因編輯應用中CRISPR-Cas系統之脫靶效應。 非病毒運載體
遞送運載體可包含非病毒運載體。一般而言，能夠遞送核酸及/或蛋白質之方法及運載體可用於遞送本文中之系統組合物。非病毒運載體之實例包括脂質奈米粒子、細胞穿透肽(CPP)、DNA奈米線團、金奈米粒子、鏈球菌溶血素0、多功能包膜型奈米裝置(MEND)、脂質包覆之介孔二氧化矽粒子及其他無機奈米粒子。 脂質粒子
遞送運載體可包含脂質粒子，例如，脂質奈米粒子(LNP)及脂質體。 脂質奈米粒子 (LNP)
LNP可將核酸囊封於陽離子脂質粒子(例如，脂質體)內，且可相對容易地遞送至細胞。在一些實例中，脂質奈米粒子不含任何病毒組分，其有助於使安全性及免疫原性問題減至最小。脂質粒子可用於活體外、離體及活體內遞送。脂質粒子可用於各種規模之細胞群體。
在一些實例中，LNP可用於遞送DNA分子(例如，含有Cas及/或gRNA之編碼序列之彼等)及/或RNA分子(例如，Cas之mRNA、gRNA)。在某些情況下，LNP可用於遞送Cas/gRNA之RNP複合物。
在一些實施例中，LNP用於遞送mRNA及gRNA (例如，包含DNMT3A-DNMT3L(3A-3L)-dCas9-KRAB之mRNA融合分子及至少一個靶向PCSK9之sgRNA)。
LNP之組分可包含陽離子脂質1,2-二亞油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油烯基氧基-3-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞油烯基氧基酮基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLinK-DMA)、l,2-二亞油烯基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[l,3]-二氧雜環戊烷(DLinKC2-DMA)、(3-o-[2-(甲氧基聚乙二醇2000)丁二醯基]-1,2-二肉豆蔻醯基-sn-乙二醇(PEG-S-DMG)、R-3-[(ro-甲氧基-聚(乙二醇) 2000)胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)，及其任何組合。LNP製備及囊封可改編自Conway等人, Molecular Therapy, 第27卷, 第4期, 第866-877頁, 2019年4月及Rosin等人, Molecular Therapy, 第19卷, 第12期, 第1286-2200頁, 2011年12月。
在一些實施例中，LNP可包含可電離脂質。在一些實施例中，可電離脂質包括但不限於pH響應型可電離脂質、熱響應型可電離脂質及光響應型可電離脂質。在一些實施例中，可電離脂質包括在某些條件(諸如但不限於pH、溫度或光)下電離之陽離子脂質及陰離子脂質。在一些實施例中，LNP之可電離脂質之莫耳比為20%至約70% (例如，約20%至約70%、約20%至約65%、約20%至約60%、約20%至約55%、約20%至約50%、約20%至約45%、約20%至約40%、約20%至約35%、約20%至約30%、約20%至約25%、約30%至約70%、約30%至約65%、約30%至約60%、約30%至約55%、約30%至約50%、約30%至約45%、約30%至約40%、約30%至約35%、約40%至約70%、約40%至約65%、約40%至約60%、約40%至約55%、約40%至約50%、約40%至約45%、約50%至約70%、約50%至約65%、約50%至約60%、約50%至約55%、約60%至約70%，或約60%至約65%)。在一些實施例中，LNP之可電離脂質之莫耳比為約45%至約50%。
在一些實施例中，LNP可包含聚乙二醇化脂質。在一些實施例中，LNP之聚乙二醇化脂質之莫耳比為0%至約30% (例如，約0%至約30%、約0%至約25%、約0%至約20%、約0%至約15%、約0%至約10%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%、約20%至約30%，或約20%至約25%)。在一些實施例中，LNP之聚乙二醇化脂質之莫耳比為約1%。
在一些實施例中，LNP可包含支持脂質。在一些實施例中，LNP之支持脂質之莫耳比為5%至約50% (例如，約5%至約50%、約5%至約45%、約5%至約40%、約5%至約35%、約5%至約30%、約5%至約25%、約5%至約20%、約5%至約15%、約5%至約10%、約10%至約50%、約10%至約45%、約10%至約40%、約10%至約35%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%、約20%至約50%、約20%至約45%、約20%至約40%、約20%至約35%、約20%至約30%、約20%至約25%、約30%至約50%、約30%至約45%、約30%至約40%、約30%至約35%、約40%至約50%、約40%至約45%、約30%至約50%、約30%至約45%、約30%至約40%、約30%至約35%、約40%至約50%，或約40%至約45%)。在一些實施例中，LNP之支持脂質之莫耳比為約9%。
在一些實施例中，LNP可包含膽固醇。在一些實施例中，LNP之膽固醇之莫耳比為10%至約50% (例如，約10%至約50%、約10%至約45%、約10%至約40%、約10%至約35%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%、約20%至約50%、約20%至約45%、約20%至約40%、約20%至約35%、約20%至約30%、約20%至約25%、約30%至約50%、約30%至約45%、約30%至約40%、約30%至約35%、約40%至約50%，或約40%至約45%)。在一些實施例中，LNP之膽固醇之莫耳比為約40%至約45%。
在一些實施例中，LNP可包含可電離脂質(20%-70%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(0%-30%，莫耳比)、支持脂質(5%-50%，莫耳比)及膽固醇(10%-50%，莫耳比)之混合物。在一些實施例中，LNP可包含可電離脂質(45-50%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(1%，莫耳比)、支持脂質(9%，莫耳比)及膽固醇(40-50%，莫耳比)之混合物。 脂質體
在一些實施例中，脂質粒子可為脂質體。脂質體為由包圍內部水性區室之單室或多室脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層組成之球形囊泡結構。在一些實施例中，脂質體為生物相容性的、無毒的，可遞送親水性及親脂性藥物分子，保護其貨物免於由血漿酶降解，且跨越生物膜及血腦障壁(BBB)轉運其載荷。
脂質體可由若干不同類型之脂質，例如磷脂製成。脂質體可包含天然磷脂及脂質，諸如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼(DSPC)、神經鞘磷脂、卵磷脂醯膽鹼、單唾液酸神經節苷脂，或其任何組合。
可將若干其他添加劑添加至脂質體中以改變其結構及特性。舉例而言，脂質體可進一步包含膽固醇、神經鞘磷脂及/或1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，例如，以增加穩定性及/或阻止脂質體內部貨物之洩漏。 穩定核酸脂質粒子 (SNALP)
在一些實施例中，脂質粒子可為穩定核酸脂質粒子(SNALP)。SNALP可包含可電離脂質(DLinDMA) (例如，在低pH下為陽離子)、中性輔助脂質、膽固醇、可擴散聚乙二醇(PEG)脂質，或其任何組合。在一些實例中，SNALP可包含合成膽固醇、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、3-N-[(w-甲氧基聚乙二醇)2000)胺甲醯基]-l,2-二肉豆蔻基氧基丙胺及陽離子1,2-二亞油烯基氧基-3-N,N-二甲基胺基丙烷。在一些實例中，SNALP可包含合成膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、PEG-cDMA及l,2-二亞油烯基氧基-3-(N;N-二甲基)胺基丙烷(DLinDMA)。 其他脂質
脂質粒子亦可包含一或多種其他類型之脂質，例如，陽離子脂質，諸如胺基脂質2,2-二亞油烯基-4-二甲基胺基乙基-[l,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)、DLin-KC2-DMA4、Cl2- 200及共脂質二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-DMG。 脂質複合物 (lipoplex) 及 / 或陽離子多聚物 (polyplex)
在一些實施例中，遞送運載體包含脂質複合物及/或陽離子多聚物。脂質複合物可結合至帶負電荷之細胞膜且誘導胞吞至細胞中。脂質複合物之實例可為包含脂質及非脂質組分之複合物。脂質複合物及陽離子多聚物之實例包括FuGENE-6試劑(一種含有脂質及其他組分之非脂質體溶液)、兩性離子胺基脂質(ZAL)、Ca2p (例如，形成DNA/Ca 2+微複合物)、聚乙烯亞胺(PEI) (例如，分支PEI)及聚(L-離胺酸) (PLL)。 細胞穿透肽
在一些實施例中，遞送運載體包含細胞穿透肽(CPP)。CPP為有助於各種分子貨物(例如，自奈米尺寸粒子至小化學分子及大DNA片段)之細胞攝取的短肽。
CPP可具有不同尺寸、胺基酸序列及電荷。在一些實例中，CPP可使血漿膜易位且有助於各種分子貨物遞送至細胞質或細胞器。CPP可經由不同機制引入細胞中，例如，直接穿透膜中、胞吞作用介導之進入及經由形成瞬態結構易位。
CPP可具有含有高相對豐度之帶正電荷之胺基酸(諸如離胺酸或精胺酸)或具有含有交替模式之極性/帶電荷胺基酸及非極性疏水胺基酸之序列的胺基酸組成。此兩種類型之結構分別稱作聚陽離子的或兩親的。第三類CPP為疏水肽，僅含有非極性殘基，具有低淨電荷或具有對細胞攝取至關重要之疏水胺基酸基團。另一種類型之CPP為來自免疫缺陷病毒I (HIV-I)之反式活化轉錄活化子(Tat)。CPP之實例包括穿膜肽(Penetratin)、Tat (48-60)、轉運肽(Transportan)及(R-AhX-R4) (Ahx係指胺基己醯基)。CPP及相關應用之實例亦包括美國專利8,372,951中所述之彼等。
CPP可相當容易地用於活體外及離體工作，且通常需要各貨物及細胞類型之廣泛最佳化。在一些實例中，CPP可直接共價連接至Cas蛋白，其接著與gRNA復合且遞送至細胞。在一些實例中，可進行CPP-Cas及CPP-gRNA至多個細胞之單獨遞送。CPP亦可用於遞送RNP。 DNA 奈米線團
在一些實施例中，遞送運載體包含DNA奈米線團。DNA奈米線團係指DNA之球狀結構(例如，具有紗線球之形狀)。奈米線團可藉由用有助於結構自組裝之迴文序列進行滾環擴增來合成。該球接著可加載有有效載荷。DNA奈米線團之一個實例描述於Sun W等人, J Am Chem Soc. 2014年10月22日;136(42):14722-5；及Sun Wet等人, Angew Chem Int Ed Engl. 2015年10月5日;54(41):12029-33中。DNA奈米線團可具有與Cas:gRNA核糖核蛋白複合物內之gRNA部分地互補之迴文序列。DNA奈米線團可經包覆，例如，經PEI包覆以誘導核內體逃逸。 金奈米粒子
在一些實施例中，遞送運載體包含金奈米粒子(亦稱作AuNP或膠體金)。金奈米粒子可與貨物形成複合物，例如，Cas:gRNA RNP。金奈米粒子可經包覆，例如，包覆於矽酸鹽及核內體破壞聚合物PAsp(DET)中。金奈米粒子之實例包括AuraSense Therapeutics之球形核酸(SNA™)構築體，及Mout R等人, (2017). ACS Nano 11:2452-8；Lee K等人, (2017). Nat Biomed Eng 1:889-901中所述之彼等。 iTOP
在一些實施例中，遞送運載體包含iTOP。iTOP係指小分子之組合驅動原生蛋白之高效細胞內遞送，而不依賴於任何轉導肽。iTOP可用於藉由滲透壓作用及丙烷甜菜鹼，使用NaCl介導之高滲透壓性以及轉導化合物(丙烷甜菜鹼)以觸發大胞飲攝取至細胞外大分子之細胞中來進行誘導型轉導。iTOP方法及試劑之實例包括D'Astolfo DS, Pagliero RJ, Pras A等人, (2015). Cell 161:674-690中所述之彼等。 基於聚合物之粒子
在一些實施例中，遞送運載體可包含基於聚合物之粒子(例如，奈米粒子)。在一些實施例中，基於聚合物之粒子可模擬膜融合之病毒機制。基於聚合物之粒子可為流感病毒機器之合成複本且與細胞經由胞吞路徑所攝取之各種類型之核酸(siRNA、miRNA、質體DNA或shRNA、mRNA)形成轉染複合物，一種涉及形成酸性區室之過程。晚期核內體中之低pH用作促使粒子表面疏水且有助於跨膜之化學開關。一旦處於細胞溶質中，粒子將釋放其有效載荷用於細胞作用。此主動核內體逃逸技術為安全的且使轉染效率達到最大，此係因為其使用天然攝取路徑。在一些實施例中，基於聚合物之粒子可包含烷基化及羧烷基化分支聚乙烯亞胺。在一些實例中，基於聚合物之粒子為VIROMER，例如，VIROMER RNAi、VIROMER RED、VIROMER mRNA、VIROMER CRISPR。遞送本文中之系統及組合物之方法的實例包括Bawage SS等人, Synthetic mRNA expressed Casl3a mitigates RNA virus infections, www.biorxiv.org/content/l0. l l01/370460v1.full doi: doi.org/10.1101/370460, Viromer® RED, a powerful tool for transfection of keratinocytes. doi: 10.13140/RG.2.2.16993.61281, Viromer® Transfection - Factbook 2018: technology, product overview, users' data., doi:10.13140/RG.2.2.23912.16642中所述之彼等。 鏈球菌溶血素 O (SLO)
遞送運載體可為鏈球菌溶血素O (SLO)。SLO為由A群鏈球菌產生之毒素，其藉由在哺乳動物細胞膜中產生孔而起作用。SLO可按可逆方式作用，此允許將蛋白質(例如，高達100 kDa)遞送至細胞之細胞溶質而不損害總體存活力。SLO之實例包括Sierig G等人, (2003). Infect Immun 71:446-55；Walev I等人, (2001). Proc Natl Acad Sci US A 98:3185-90；Teng KW等人, (2017). Elife 6:e25460中所述之彼等。 多功能包膜型奈米裝置 (MEND)
遞送運載體可包含多功能包膜型奈米裝置(MEND)。MEND可包含凝集質體DNA、PLL核心及脂質薄膜殼。MEND可進一步包含細胞穿透肽(例如，硬脂基八精胺酸)。細胞穿透肽可在脂質殼中。脂質包膜可用一或多個功能組分，例如以下一或多者修飾：聚乙二醇(例如，以增加血管循環時間)、用於靶向特定組織/細胞之配位體、額外細胞穿透肽(例如，用於更高細胞遞送)、用以增強核內體逃逸之脂質，及核遞送標籤。在一些實例中，MEND可為四室MEND (T-MEND)，其可靶向細胞核及粒線體。在某些實例中，MEND可為PEG-肽-DOPE結合之MEND (PPD-MEND)，其可靶向膀胱癌細胞。MEND之實例包括Kogure K等人, (2004). J Control Release 98:317-23；Nakamura T等人, (2012). Ace Chem Res 45:1113-21中所述之彼等。 脂質包覆之介孔二氧化矽粒子
遞送運載體可包含脂質包覆之介孔二氧化矽粒子。脂質包覆之介孔二氧化矽粒子可包含介孔二氧化矽奈米粒子核心及脂質膜殼。二氧化矽核心可具有大內表面面積，從而產生高貨物加載能力。在一些實施例中，可改變孔徑、孔化學及總粒度用於加載不同類型之貨物。亦可改變粒子之脂質包衣以使貨物加載達到最大，增加循環時間，且提供精確靶向及貨物釋放。脂質包覆之介孔二氧化矽粒子之實例包括Du X等人, (2014). Biomaterials 35:5580-90；Durfee PN等人, (2016). ACS Nano 10:8325-45中所述之彼等。 無機奈米粒子
遞送運載體可包含無機奈米粒子。無機奈米粒子之實例包括碳奈米管(CNT) (例如，如Bates Kand Kostarelos K. (2013). Adv Drug Deliv Rev 65:2023-33中所述)、裸介孔二氧化矽奈米粒子(MSNP) (例如，如Luo GF等人, (2014). Sci Rep 4:6064中所述)及緻密二氧化矽奈米粒子(SiNP) (如Luo D及Saltzman WM. (2000). Nat Biotechnol 18:893-5中所述)。 使用方法
本文中之組合物及系統可用於多種應用，包括修飾非動物生物體，諸如植物及真菌，及修飾動物，治療及診斷植物、動物及人類之疾病。一般而言，可將組合物及系統引入細胞、組織、器官或生物體中，其中該等組合物及系統改變一或多個基因(例如， PCSK9)之表現及/或活性。
在一些實施例中，PCSK9基因產物之表現在引入本文所述之組合物及系統之細胞中減少。在一些實施例中，PCSK9基因產物表現之減少為瞬時的。在一些實施例中，PCSK9基因產物表現之減少為穩定的。在一些實施例中，PCSK9基因產物表現之減少為可遺傳的。
在一些實施例中，由本文中之組合物及系統修飾之複數個細胞包含相對於尚未引入本文所述之組合物及系統之細胞，表現減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之PCSK9基因產物。
在一些實施例中，自本文所述之組合物及系統修飾之複數個細胞擴充或得到之細胞亦包含相對於自尚未引入本文所述之組合物及系統之細胞擴充或得到之細胞，表現減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之PCSK9基因產物。 細胞及生物體
本揭示案提供細胞、組織、生物體，其包含工程改造之Cas蛋白、CRISPR-Cas系統、編碼CRISPR-Cas系統之一或多個組分之聚核苷酸及/或包含聚核苷酸之載體。本揭示案亦提供編碼針對在本文所述之方法或組合物中之任一者中於真核生物或真核細胞中之表現進行密碼子最佳化之效應蛋白的核苷酸序列。在本揭示案之一個實施例中，密碼子最佳化之效應蛋白為本文所論述之任何Cas蛋白且針對在真核細胞或生物體，例如，如本文別處所提及之此種細胞或生物體中之可操作性進行密碼子最佳化，該細胞或生物體例如但不限於酵母細胞，或哺乳動物細胞或生物體，包括小鼠細胞、大鼠細胞，及人類細胞或非人類真核生物體，例如，植物。
在某些實施例中，所關注之靶基因座之修飾可產生：包含表現改變之至少一個基因產物之真核細胞；包含表現改變之至少一個基因產物之真核細胞，其中該至少一個基因產物之表現增加；包含表現改變之至少一個基因產物之真核細胞，其中該至少一個基因產物之表現減少；或包含編輯之基因體的真核細胞。
在某些實施例中，真核細胞可為哺乳動物細胞或人類細胞。
在其他實施例中，如本說明書中所述之非天然存在或工程改造之組合物、載體系統或遞送系統可用於：位點特異性基因剔除；位點特異性基因體編輯；RNA序列特異性干擾；或多重基因體工程改造。
亦提供一種來自如本文所述之細胞、細胞株或生物體之基因產物。在某些實施例中，所表現之基因產物之量可大於或小於來自不具有改變之表現或編輯之基因體之細胞的基因產物之量。在某些實施例中，與來自不具有改變之表現或編輯之基因體之細胞的基因產物相比，基因產物可改變。 示例性療法
本揭示案提供CRISPR-Cas系統用於治療多種疾病及病症之用途。在一些實施例中，本文所述之揭示內容係關於一種用於療法之方法，其中由CRISPR或鹼基編輯器離體編輯細胞以調節至少一個基因，隨後向有需要之患者投與編輯之細胞。在一些實施例中，編輯涉及敲入、剔除或減弱細胞中至少一個靶基因之表現。在特定實施例中，編輯將可包含一或多個外顯子且呈反式或天然或反式合成之外源基因、微小基因或序列插入靶基因之基因座、熱點基因座、基因基因體位置之安全港基因座中，其中可引入新基因或遺傳元件而不破壞鄰近基因之表現或調控，或藉由編碼靶基因之調控元件之DNA序列中之一或多個突變之插入或缺失進行的校正。在某個實施例中，編輯包括將一或多個點突變引入靶細胞中之核酸(例如，基因體DNA)中。
在一些實施例中，治療係用於器官之疾病/病症，包括肝病、眼病、肌肉病、心臟病、血液病、腦病、腎病，或可包括用於自體免疫疾病、中樞神經系統疾病、癌症及其他增生性疾病、神經退化性病症、炎性疾病、代謝病症、肌肉骨骼病症及類似疾病之治療。
在一些實施例中，疾病與高膽固醇相關，且提供膽固醇(例如，LDL)之調控。在一些實施例中，調控受靶基因PCSK9中之修飾影響。PCSK9已與疾病及病症相關，諸如但不限於無β脂蛋白血症、腺瘤、動脈硬化、動脈粥狀硬化、心血管病、膽石病、冠狀動脈硬化、冠狀動脈心臟病、非胰島素依賴性糖尿病、高膽固醇血症、家族性高膽固醇血症、高胰島素血症、高脂血症、家族性混合型高脂血症、低β脂蛋白血症、慢性腎衰竭、肝病、肝腫瘤、黑色素瘤、心肌梗塞、嗜睡病、腫瘤轉移、腎胚細胞瘤、肥胖症、腹膜炎、彈性纖維假黃瘤、腦血管意外病變、血管病、黃瘤病、外周血管病、心肌缺血、血脂異常、葡萄糖耐量受損、黃瘤、多基因性高膽固醇血症、繼發性惡性肝腫瘤、失智症、過重、C型肝炎、慢性頸動脈粥樣硬化、Ha型高脂蛋白血症、顱內動脈粥樣硬化、缺血性中風、急性冠狀動脈症候群、主動脈鈣化、心血管發病、lib型高脂蛋白血症、外周動脈病、II型家族性高醛固酮症、家族性低β脂蛋白血症、體染色體隱性高膽固醇血症、體染色體顯性高膽固醇血症3、冠狀動脈病、肝癌、缺血性腦血管意外病變及動脈硬化性心血管病NOS。使用本文所述之方法中之任一者對PCSK9基因之表觀遺傳修飾可用於治療、預防及/或減輕本文所述之疾病及病症之症狀。
血脂異常為以促成動脈阻塞發展(動脈粥樣硬化)之血液中脂質水準升高為特徵之遺傳疾病。此等脂質包括血漿膽固醇、三酸甘油酯、高密度脂蛋白或低密度脂蛋白。血脂異常增加心臟病發作、中風或其他循環問題之風險。目前管理包括生活方式改變，諸如運動及飲食調整以及使用脂質降低藥物，諸如斯他汀類(statin)。非斯他汀類脂質降低藥物包括膽酸螯合劑、膽固醇吸收抑制劑、用於同型接合家族性高膽固醇血症之藥物、貝特類(fibrate)、菸鹼酸、ω-3脂肪酸及/或組合產品。治療選項通常取決於特異性脂質異常，但不同脂質異常通常共存。兒童治療更具挑戰性，此係因為飲食改變可能難以實施且尚未證明脂質降低療法為有效的。使用本文所述之方法中之任一者對PCSK9基因之表觀遺傳修飾可用於治療、預防及/或減輕血脂異常(例如，LDL調控異常)之症狀。
PCSK9之活性在極大程度上主要局限於肝臟且PCSK9與血脂異常、PCSK9相關家族性高膽固醇血症、高膽固醇血症(家族性)、胃乳頭狀腺癌、同型接合家族性高膽固醇血症及鼻咽炎相關聯，PCSK9相關家族性高膽固醇血症為遺傳性疾病(體染色體顯性)，其中身體危險地發展血液膽固醇水準，此係歸因於低密度脂蛋白膽固醇之受體缺乏。PCSK9相關家族性高膽固醇血症在世界範圍內影響500名異型接合人群中之1名至1,000,000名同型接合人群中之1名且在南非白人、法裔加拿大人、黎巴嫩基督教徒及芬蘭人群體中更常見。PCSK9相關家族性高膽固醇血症之常見症狀包括單獨在低密度脂蛋白中以及亦在極低密度脂蛋白中所含之循環膽固醇升高。PCSK9相關家族性高膽固醇血症之目前治療包括投與斯他汀類以抑制肝臟中之羥甲基戊二醯基CoA還原酶(HMG-CoA還原酶)。用於治療PCSK9相關家族性高膽固醇血症之另一個選項為依澤替米貝(ezetimibe)以抑制腸道中之膽固醇吸收。
在一些實施例中，本文所述之方法中之任一者對PCSK9基因之表觀遺傳修飾可靶向肝臟，PCSK9活性之主要位置。 實例 實例 1 ：融合分子質體構築及減弱效率
構築兩個質體以形成「EPICAS」系統(與「CRISPRoff」系統可互換使用) ( 圖 1A)。「融合分子」或「催化蛋白」質體編碼dCas9、DNMT3A、DNMT3L及KRAB肽。融合之DNMT3A及DNMT3L (3A3L)肽在dCas9之N端，且KRAB在dCas9之C端。因此，融合分子自N末端至C末端具有3A3L-dCas9-KRAB。「sgRNA」質體編碼靶向PCSK9基因之sgRNA序列。設計多個sgRNA以靶向小鼠 Pcsk9基因之轉錄起始位點(TSS)之上游及下游250bp內之區域。
將個別sgRNA質體與催化蛋白質體一起共轉染至小鼠AML12細胞株中。72小時後，藉由FACS分選頂部10% GFP+及mCherry+細胞。進行RT-QPCR實驗以評價 Pcsk9之mRNA表現水準。所測試之13個sgRNA中之12者顯示出AML12細胞中 Pcsk9之表現顯著下調。用sgRNA9轉染之細胞顯示出高達約82%之有效減弱( 圖 1B)。
緊接著，測試sgRNA9與其他個別sgRNA之組合以確定多於一個sgRNA之組合是否可進一步降低AML12細胞中 Pcsk9之基因表現水準( 圖 1C)。在所測試之組合當中，sgRNA7及sgRNA9一起顯示出最高抑制水準。亦測試sgRNA之個別組合以確定多於一個sgRNA之組合是否可降低Ai9初級肝細胞中 Pcsk9之基因表現水準( 圖 1D)。所有組合皆顯著減弱 Pcsk9之表現水準。在與sgRNA7、sgRNA8及sgRNA9一起共轉染之細胞中觀測到最低程度降低。 Pcsk9靜默在初級肝細胞中持續至少超過兩週，且sgRNA7與sgRNA9一起之組合顯示出 Pcsk9基因表現之最高效率(高達81%)抑制。總之，此顯示EPICAS系統可用於誘導小鼠肝細胞中 Pcsk9基因之有效及持續靜默。 實例 2 ：編碼融合分子之 mRNA 之活體外轉錄
活體外轉錄及純化用於產生對應於EPICAS系統之融合分子或催化蛋白之mRNA。首先，構築含有所有融合分子元件，包括5'UTR-DNMT3A-DNMT3L-dCas9-KRAB-3'UTR-聚A之卡匣的質體。藉由 XbaI及 BpiI限制酶消化使質體序列線性化( 圖 2A)。進行含有線性化DNA模板、T7 RNA聚合酶、NTP及帽類似物之活體外轉錄反應以產生含有N1-甲基假尿苷之mRNA。用DNase I消化DNA模板後，mRNA產物經歷純化及緩衝液更換，且使用毛細管凝膠電泳評估最終mRNA產物之純度( 圖 2B)。由商業供應商在固相合成條件下以化學方式合成具有最小末端修飾之100聚體sgRNA。為測試活體外轉錄之mRNA之功能，在HEK293T細胞中構築Snrpn-GFP報告系統( 圖 2C)。報告系統使用合成甲基化感測啟動子(來自印跡基因 Snrpn之啟動子之保守序列元件)控制GFP之表現。將此報告構築體插入基因體基因座中顯示出鄰近序列之甲基化狀態。將上文所述之活體外轉錄之mRNA與靶向 Snrpn基因之sgRNA一起共轉染至報告細胞中，轉染後8天，報告細胞中25.3%之細胞為GFP陰性的，此顯著高於用非靶向sgRNA轉染之對照組( 圖 2D)。藉由FACS分選GFP陰性細胞且培養30天。轉染後30天，報告系統中93.2%之細胞為GFP陰性的，而在對照組中幾乎未發現GFP陰性細胞( 圖 2D、 2E)。轉染後70天及90天，報告系統中分別有86.1%及87.3%之細胞為GFP陰性的( 圖 2I)。轉染後150天及400天(亦即，高達約400次細胞分裂)，報告系統中分別有92.7%及88.1%之細胞為GFP陰性的。此表明使用CRISPRoff系統之表觀基因體編輯之持久性( 圖 2D)。此外，藉由亞硫酸氫鹽PCR檢定分析 Snrpn基因座上之DNA甲基化水準。報告細胞(GFP-OFF組)之甲基化水準顯著高於對照細胞(GFP-ON組) ( 圖 2F)。係結果伴隨有Snrpn基因座上高CpG甲基化之觀測結果( 圖 2F 、 2G 、 2I)。總之，此等結果顯示EPICAS系統之瞬時表現及mRNA掃描使靶向基因之表現靜默一段長持續時間。 實例 3 ：編碼融合分子之 mRNA 及 sgRNA 之脂質奈米粒子囊封 LNP 形成及表徵
此項技術中已知之標準方法用於調配LNP以將融合分子mRNA及sgRNA遞送至人類肝細胞。對於小鼠研究，如先前所述調配LNP，具有一些修改( 1)。簡言之，使用(線式)混合器以1:3 (乙醇:水相)之流量比將1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、膽固醇、PEG脂質及可電離陽離子脂質之乙醇溶液與含有mRNA及sgRNA (1:1重量比)之水溶液(pH 4)快速混合。在整個研究中維持可電離脂質與核酸之間的N:P比率為4-6。
相對於1× PBS透析所得LNP調配物隔夜，進行0.2-μm無菌過濾且在4℃下儲存直至使用。粒度在70-90 nm (Z平均，流體動力學直徑)之範圍內，如藉由動態光散射(Malvern NanoZS Zetasizer)所確定之多分散性指數＜ 0.2。藉由Quant-iT Ribogreen檢定(Life Technologies)量測LNP中RNA之囊封效率。 低溫 TEM 樣品製備及成像
將LNP樣品(3-5 μl)分配於95%相對濕度之FEI Vitrobot腔室中電漿清潔之柵格(Quantifoil，R1.2/1.3 300或400銅網)上且靜置30-60秒。接著，將柵格用濾紙印漬3秒且投入由液氮冷卻之液體乙烷中。在200 kV加速電壓下操作之FEI Talos F200C上進行低溫EM成像。
LNP含有以1:1重量比靶向 Pcsk9基因之融合分子mRNA及sgRNA ( 圖 3A)。使用良好設計之撞擊流反應器或微流體裝置調配可電離脂質(20%-70%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(0%-30%，莫耳比)、支持脂質(5%-50%，莫耳比)及膽固醇(10%-50%，莫耳比)、脂質奈米粒子(LNP)之混合物。藉由改變可電離脂質之比率，可修改sgRNA及mRNA之釋放動力學。可電離脂質之比例愈高(莫耳比高於55%)，sgRNA釋放比mRNA快得多。透射電子顯微鏡(TEM)影像顯示LNP為球形及奈米尺寸之粒子( 圖 3B)。使用動態光散射(NanoSZ, Malvern)，LNP具有均勻尺寸(78.2 ± 5.2 nm，PDI ＜ 0.10) ( 圖 3C)。 實例 4 ：小鼠中使用編碼融合分子之 mRNA 及 sgRNA 之 LNP 遞送的 PCSK9 基因靜默
緊接著，測試用於活體內使Pcsk9表現靜默之EPICAS系統(亦稱為「CRISPRoff」系統)的使用。經由注射至側尾靜脈中向C57CB/6J小鼠投與LNP ( 圖 3E)。注射後五天，對小鼠施以無痛致死術，且獲得肝樣品且進行加工以用於mRNA純化。進行RT-QPCR實驗以評價小鼠中 Pcsk9基因之減弱效率。LNP注射之小鼠中 Pcsk9之表現水準顯著低於對照組( 圖 3F)，指示EPICAS系統活體內使 Pcsk9基因表現靜默之功效。
為測試LNP是否可將mRNA活體內成功地遞送至小鼠肝細胞，產生含有螢光素酶mRNA之LNP且藉由肌肉內注射而注射至野生型小鼠中。 活體內 Luc mRNA 遞送
為偵測Luc mRNA-LNP之活體內分布，向6-8週齡之雌性Balb/c小鼠(n = 5)活體內注射5 μg Luc mRNA。在規定之偵測時間點，向小鼠注射0.2ml D-螢光素(15 mg/ml，於DPBS中)且使用IVIS Lumina系統(Perkin Elmer)成像。
對於活體外成像，向6-8週齡之雌性BALB/c小鼠(n = 2)注射5 μg Luc mRNA。十二小時後，向動物腹膜內(i.p.)注射0.2 mL D-螢光素(15 mg/ml，於DPBS中)，繼而反應5分鐘。立即收集包括心、肝、脾、肺及腎之組織，且由IVIS Lumina系統監測各組織之螢光訊號。
藉由螢光之活體內成像，顯示LNP將螢光素酶mRNA高效遞送至小鼠肝細胞中 ( 圖 3D)。顯示LNP亦可將相對大尺寸之mRNA經由尾靜脈注射高效遞送至小鼠肝臟中，如由幾乎所有肝細胞展現tdTomato螢光所示 ( 圖 6A )。此外，LNP遞送之螢光素酶mRNA在注射後6小時在小鼠肝臟中積聚 ( 圖 6B)，在注射後12小時及24小時在小鼠肝臟中逐漸減少，且在注射後48小時不存在於肝臟中 ( 圖 6C )。 小鼠之 LNP 處理
小鼠研究係由Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.及SLAC實驗室核准且用於實驗。將Ai9 (C57Bl/6J遺傳背景)及C57Bl/6J野生型小鼠維持於特定無病原體飼養及12小時光/12小時暗週期。動物之使用及照護遵守中國科學院上海生物科學研究所之生物醫學研究倫理委員會之導則。雄性C57BL/6J小鼠在8-10週齡用於實驗，將小鼠隨機分配至各個實驗組，且以盲法方式進行資料之收集及分析。經由注射至側尾靜脈中向小鼠投與200μl PBS中之LNP。在指定時間點處死小鼠，且藉由屍體剖檢獲得肝樣品及血清用於RNA提取或血清生物化學分析。
對於C57CB/6J成年野生型小鼠中之CRISPRoff遞送，藉由靜脈內注射LNP以1:1重量比遞送CRISPRoff mRNA及sgRNA (sgRNA 7 (SEQ ID NO: 33)及sgRNA 9 (SEQ ID NO: 35)) ( 圖 9A 、圖 9B)。在注射後7天收集肝組織用於qPCR分析。與注射PBS之對照小鼠相比，Pcsk9之表現明顯減少( 圖 6D)。進一步研究顯示1.5、3.0、6.0及10 mg/kg含CRISPRoff之LNP之劑量使得Pcsk9表現抑制76%、93%、97%及98%，在3.0 mg/kg下接近平台效應( 圖 6D)。血液中之Pcsk9蛋白水準在CRISPRoff處理之小鼠中亦顯著降低，以與肝組織中之Pcsk9表現類似之劑量依賴性( 圖 6E)。在3.0及6.0 mg/kg Pcsk9基因之啟動子下觀測到高水準之DNA甲基化，而血液化學(AST、ALT、ALP及ALB)無異常 ( 圖 9C 、圖 9D)。 在肝切除及再生後穩定 PCSK9 甲基化及減少之表現 部分肝切除 (PHx) 誘導之肝再生小鼠模型
如前文所述(2)進行小鼠部分肝切除(PHx)。簡言之，吾等使用全身麻醉、上中線小切口、用以將待移出之葉瓣結扎之絲線縫合、暖墊及光，以及用以確保最低致殘率之皮下鹽水注射。 高脂肪膳食誘導之高膽固醇血症鼠類模型
高脂肪膳食小鼠獲自The GemPharmatech Co., Ltd. (Nanjing, China)。將其圈養於特定無病原體飼養及12小時光/12小時暗週期，且餵食高脂肪膳食，獲自Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ)之60 kcal %飽和(豬油)脂肪膳食(HFD)，持續24週。選擇血液LDL-c水準高於25 mg/dL之小鼠用於實驗。
緊接著，評估6 mg/kg劑量下CRISPRoff誘導之Pcsk9減少的持久性。在CRISPRoff處理之小鼠之血液中，Pcsk9之蛋白表現水準在LNP注射後2、4、6及8週分別展現出88%、81%、82%及77%降低，指示活體內由CRISPRoff使靶向基因持續靜默 ( 圖 6F )。為進一步證明CRISPRoff介導之表觀基因體編輯之可遺傳性，進行肝切除實驗以量測肝再生後之基因靜默效應。特定地，第0天向小鼠投與含CRISPRoff之LNP，且第7天進行70%部分肝切除(PHx) ( 14)或假手術 ( 圖 6G )。第14天當肝再生接近完成時收集PHx實驗後之肝組織樣品 ( 圖 6G )。PHx後肝臟中Pcsk9 mRNA之表現顯示出與使用假手術之組類似水準之減少(93 +/- 11%及92% +/- 9%，P ＜ 0.0001，t檢驗) ( 圖 6H)。另外，在Pcsk9之啟動子下CpG甲基化在PHx後維持於高水準 ( 圖 6I)。因為大量肝細胞在PHx後時段內經由細胞分裂而再生，所以此等結果指示CRISPRoff介導之表觀基因體編輯在活體內細胞分裂期間為可遺傳的，此對治療設計有利。 餵食高脂肪膳食之小鼠中血液 LDL 之持續減少
已顯示血清LDL-C水準隨高脂肪膳食(HFD)而增加 (15)。評價表觀基因體編輯對降低餵食HFD之小鼠中之Pcsk9水準的影響。特定地，向六週齡雄性C57BI/6J小鼠餵食HFD持續6個月，接著經由尾靜脈注射用囊封CRISPRoff mRNA連同靶向Pcsk9之sgRNA之LNP或PBS處理 ( 圖 7A )。在注射後7天及14天，與PBS組相比，血液中之Pcsk9水準在4 mg/kg及6 mg/kg之劑量下明顯降低 ( 圖 7B 、 圖 7C )。另外，分別地，血清LDL-C水準在注射後14天在4 mg/kg及6 mg/kg下降低約44%及約58%，且在注射後21天降低約43%及約51% ( 圖 7D)。此等結果顯示藉由表觀基因體編輯減少Pcsk9可高效且持續降低HFD小鼠中之血清LDL-C水準，此在治療設計中有利。 由 EPICAS 系統使 PCSK9 精確靜默而無脫靶效應
為研究表觀基因體編輯之潛在脫靶效應，評價在轉錄體及基因體層面上CRISPRoff編輯之特異性。在遞送CRISPRoff mRNA及靶向Pcsk9之sgRNA後7天對小鼠肝組織進行RNA-seq。CRISPRoff處理之小鼠中之轉錄體廣基因表現水準未顯示出與PBS處理之小鼠中所發現之彼等顯著之差異，靶向基因Pcsk9除外，其為靜默的 ( 圖 8A及 圖 10A )。在距Pcsk9 1-Mb窗口內鄰近基因之表現水準亦未展現出小鼠之兩個組之間的顯著差異 ( 圖 8B)。觀測到在CRISPRoff處理之組中變化大於2倍(FDR ＜ 0.05)之若干非靶轉錄物 ( 圖 10B)，但此等非靶轉錄物上之DNA甲基化水準未顯示出CRISPRoff處理與PBS處理之小鼠之間的顯著差異 ( 圖 10B)。此外，進行高通量全基因體亞硫酸氫鹽定序(WGBS)以檢查肝組織上CpG之脫靶甲基化。甲基化水準在小鼠之兩個組之間在除Pcsk9以外之所有CpG位點處無顯著不同，Pcsk9顯示出在CRISPRoff處理之小鼠中在Pcsk9啟動子下DNA甲基化明顯增加 ( 圖 8C )。詳細檢查揭露DNA甲基化僅在由sgRNA靶向之啟動子區域處上調，未擴展至Pcsk9基因主體或鄰近基因 ( 圖 8D及 圖 10C )。檢視非靶差異性甲基化之區域處或附近之基因揭露無轉錄差異 ( 圖 10D)，表明非特異性甲基化差異對基因表現具有極小影響。吾等亦比較潛在sgRNA依賴性脫靶位點(與中靶基因座具有高序列相似性)之甲基化及基因表現水準，且未發現CRISPRoff處理與PBS處理之小鼠之間的顯著差異 ( 圖 8E)。此等結果一起證明表觀遺傳介導之基因靜默活體內誘導極少sgRNA非依賴性及sgRNA依賴性脫靶效應。
總之，結果證明EPICAS (CRISPRoff)系統可有效地使小鼠肝臟中靶向基因Pcsk9之表現抑制高達98%，其功效高於現有藥物(斯他汀類、抗體及siRNA)及使用CRISPR/Cas9或鹼基編輯器之目前基因編輯技術 (8-12)。使用EPICAS (CRISPRoff)系統之無裂解表觀基因體編輯減輕靶向基因座處非所需之DNA修復介導之編輯的潛在風險，此對人類治療設計有利。其亦不會誘導可偵測之脫靶DNA甲基化及基因表現改變。此種CRISPRoff誘導之甲基化可由CRISPR介導之去甲基化工具逆轉 (4)。值得注意地，靶向基因之CRISPRoff依賴性下調在瞬時遞送CRISPRoff mRNA下在許多輪細胞分裂後持續。具有LNP之基因編輯工具之活體內遞送可更優於AAV，此係因為藉由AAV遞送對編輯工具之長期表現不必要亦不需要。瞬時LNP介導之mRNA遞送避免由編輯器之長期存在及AAV之其他副作用，諸如免疫反應及編輯工具之基因體整合引起之脫靶效應。 (16)。最後，表觀基因體編輯誘導之Pcsk9靜默及血液LDL-C減少為穩固且持久的，從而提供用於治療FH之潛在治療策略。此類方法亦可適用於其他慢性疾病之治療性處理。 實例 5 ：猴細胞中之猴 PCSK9 基因靜默
設計多個sgRNA以靶向猴 Pcsk9基因之轉錄起始位點(TSS)之上游及下游250bp內之區域( 圖 4A)。
將個別sgRNA質體與催化蛋白(DNMT3A-DNMT3L-dCas9-KRAB)質體一起共轉染至猴細胞中。進行RT-QPCR實驗以評價猴 Pcsk9之mRNA表現水準。所測試之5個sgRNA中之3者顯示出猴細胞中 Pcsk9之表現顯著下調( 圖 4B)。用S2、S8或S9 sgRNA轉染之細胞使得猴 Pcks9下調約90%。 實例 6 ：人類細胞株中之人類 PCSK9 基因靜默
構築報告細胞株以測試人類細胞株中PCKS9基因靜默之功效。構築質體以具有CMV啟動子驅動之卡匣，其中該卡匣在5'至3'方向上具有以下元件：5'-pCMV-300bp-TSS-+300bp-PCSK9外顯子1-2A-GFP-3'。在此報告系統中，CMV啟動子驅動PCSK9及GFP螢光之表現。若PCSK9為靜默的，則GFP之轉錄終止。與PiggyBac轉座酶(PBase)質體一起，將報告質體轉染至HEK293T細胞中。根據GFP螢光之表現藉由FACS分選具有成功報告卡匣整合之細胞( 圖 5A)。
設計109個sgRNA以靶向 PCSK9TSS之上游300bp及下游300 bp之區域。構築質體以編碼sgRNA中之每一者。將個別sgRNA質體與編碼融合分子之質體一起共轉染至人類報告細胞株中。分析轉染後72小時及120小時之平均GFP強度率的降低。GFP強度率之普遍降低指示報告系統之敏感性( 圖 5B)。轉染後120小時維持降低之GFP強度率。許多sgRNA顯示出在120小時與轉染後72小時相比低得多的GFP強度率。此等結果表明人類細胞株中EPICAS系統之功效及持續性。
緊接著，使用sgRNA中之每一者重複進行實驗且在轉染後72小時時間點量測平均GFP強度率以供比較( 圖 5C)。多於一半經設計之sgRNA顯示出平均螢光強度率之顯著降低，表明EPICAS系統可誘導人類細胞中 PCSK9表現之靶向減弱。
緊接著，在人類Hep3B細胞株中測試內源PCSK9表現之靜默中EPICAS系統的使用。將編碼融合分子之質體與各種sgRNA質體一起共轉染至Hep3B細胞中。轉染後48小時，藉由RT-PCR量測人類 PCSK9之mRNA表現水準。六個sgRNA使得 PCSK9表現水準最高程度降低(約＞ 65%)。此等sgRNA亦使得報告人類細胞株中之螢光強度率降低約＞50% ( 圖 5D)。此等結果顯示EPICAS系統可高效且持久地使人類細胞中內源 PCSK9之表現靜默。
總之，此等結果顯示EPICAS系統成功地高效且持續使小鼠細胞及人類細胞中PCSK9之表現靜默，從而支持藉由表觀遺傳編輯使PCSK9基因表現靜默。LNP成功地用於活體內遞送EPICAS系統。因此，EPICAS系統之LNP調配物可用於藉由減少PCSK9表現來治療PCSK9相關疾病，諸如動脈粥樣硬化性心血管病，從而降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。
本揭示案之額外實施例包括以下： 實施例1.    一種用於減少或消除細胞中前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)基因產物之表現的方法，該方法包括向該細胞中引入以下各物之步驟： 包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而減少或消除該細胞中該PCSK9基因產物之表現。
實施例2.    一種減少或消除個體中PCSK9基因產物之表現的活體內方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟： 包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而減少或消除該個體中該PCSK9基因產物之表現。
實施例3.    一種減少個體中之低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟： 包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而減少該個體中之LDL膽固醇。
實施例4.    一種用於治療或減輕個體之PCSK9相關病症之症狀的方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟：  包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而治療或減輕該個體之PCSK9相關病症之症狀。
實施例5.    一種擴充PCSK9基因產物之表現減少之細胞群體的方法，該方法包括以下步驟： i)向複數個細胞中引入包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， ii)擴充該複數個細胞以產生該PCSK9基因產物之表現減少之複數個經修飾細胞， 其中相對於尚未引入該融合分子或該核酸序列之細胞，該複數個經修飾細胞之該PCSK9基因產物表現減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，且 其中該細胞為肝細胞。
實施例6.    如實施例5之方法，其中該PCSK9基因產物之表現為瞬時減少的。
實施例7.    如實施例5之方法，其中該PCSK9基因產物之表現為穩定減少的。
實施例8.    如實施例1至7中任一項之方法，其中該PCSK9調控元件為核心啟動子、近端啟動子、遠端增強子、靜默子、絕緣子元件、邊界元件或基因座控制區。
實施例9.    如實施例1至8中任一項之方法，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。
實施例10.  如實施例9之方法，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內。
實施例11.  如實施例9之方法，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游300 bp內。
實施例12.  如實施例1至11中任一項之方法，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。
實施例13.  如實施例12之方法，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約300 bp內。
實施例14.  如實施例1至8中任一項之方法，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內及轉錄起始位點之下游300 bp內。
實施例15.  如實施例1至14中任一項之方法，其中至少一個核苷酸之該修飾為DNA甲基化。
實施例16.  如實施例1至15中任一項之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)、DNA去甲基酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶或其一部分。
實施例17.  如實施例16之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)或其一部分。
實施例18.  如實施例17之方法，其中該DNA甲基轉移酶為DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。
實施例19.  如實施例18之方法，其中該DNMT3A包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
實施例20.  如實施例18之方法，其中該DNMT3L包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
實施例21.  如實施例1至20中任一項之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
實施例22.  如實施例21之方法，其中該基於鋅指蛋白之轉錄因子為克魯勃相關抑制框(Kruppel-associated suppression box，KRAB)。
實施例23.  如實施例22之方法，其中該KRAB包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
實施例24.  如實施例1至23中任一項之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶或其一部分及基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
實施例25.  如實施例24之方法，其中該DNA甲基轉移酶係選自DNMT3A及DNMT3L及其組合，且該基於鋅指蛋白之轉錄因子為KRAB。
實施例26.  如實施例1至25中任一項之方法，其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
實施例27.  如實施例26之方法，其中該至少一個DNA結合蛋白為dCas9。
實施例28.  如實施例27之方法，其中該dCas9包含金黃色葡萄球菌dCas9、釀膿鏈球菌dCas9、空腸彎曲桿菌dCas9、白喉棒狀桿菌dCas9、凸腹真桿菌dCas9、巴氏鏈球菌dCas9、香腸乳桿菌dCas9、球形球毛殼菌dCas9、固氮螺菌(例如，菌株B510) dCas9、固氮葡糖醋桿菌dCas9、灰色奈瑟菌dCas9、腸道羅氏菌dCas9、食清潔劑細小棒菌dCas9、鹵水硝酸鹽裂解菌(例如，菌株DSM 16511) dCas9、紅嘴鷗彎曲桿菌(例如，菌株CF89-12) dCas9、嗜熱鏈球菌(例如，菌株LMD-9) dCas9。
實施例29.  如實施例27之方法，其中該dCas9包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
實施例30.  如實施例1至29中任一項之方法，其中該融合分子包含融合至該至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端之該至少一個基因表現調節子。
實施例31.  如實施例30之方法，其中該至少一個基因表現調節子直接融合至該至少一個DNA結合蛋白。
實施例32.  如實施例30之方法，其中該至少一個基因表現調節子經由非調節子、第二調節子或連接子與該至少一個DNA結合蛋白間接融合。
實施例33.  如實施例30至32中任一項之方法，其中該融合分子包含與C末端上之KRAB及N末端上之DNMT3A及DNMT3L融合之dCas9。
實施例34.  如實施例33之方法，其中該融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。
實施例35.  如實施例1至34中任一項之方法，其中該融合分子進一步包含至少一個核定位序列。
實施例36.  如實施例35之方法，其中該至少一個核定位序列直接融合至該至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。
實施例37.  如實施例35之方法，其中該至少一個核定位序列經由連接子間接融合至該至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。
實施例38.  如實施例1至37中任一項之方法，其中編碼該融合分子之該核酸序列為去氧核糖核酸(DNA)。
實施例39.  如實施例1至37中任一項之方法，其中編碼該融合分子之該核酸序列為信使核糖核酸(mRNA)。
實施例40.  如實施例1至39中任一項之方法，該方法進一步包括以下步驟：引入至少一個與該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之DNA序列互補之單嚮導RNA (sgRNA)，從而將該融合分子靶向該PCSK9基因或PCSK9調控元件，或編碼該sgRNA之DNA。
實施例41.  如實施例40之方法，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 27-95或98-108之核酸序列。
實施例42.  如實施例1至41中任一項之方法，其中該融合分子調配於脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例43.  如實施例40至41中任一項之方法，其中該融合分子及該sgRNA調配於脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例44.  如實施例43之方法，其中該融合分子及該sgRNA調配於同一脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例45.  如實施例43之方法，其中該融合分子及該sgRNA調配於不同脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例46.  如實施例42至45中任一項之方法，其中該脂質體或脂質奈米粒子包含可電離脂質(20%-70%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(0%-30%，莫耳比)、支持脂質(5%-50%，莫耳比)及膽固醇(10%-50%，莫耳比)。
實施例47.  如實施例46之方法，其中該可電離脂質係選自由pH響應型可電離脂質、熱響應型可電離脂質及光響應型可電離脂質組成之群。
實施例48.  如實施例1至41中任一項之方法，其中該融合分子調配於AAV載體中。
實施例49.  如實施例40至41中任一項之方法，其中該融合分子及該sgRNA調配於AAV載體中。
實施例50.  如實施例49之方法，其中該融合分子及該sgRNA調配於同一AAV載體中。
實施例51.  如實施例49之方法，其中該融合分子及該sgRNA調配於不同AAV載體中。
實施例52.  如實施例1至51中任一項之方法，其中藉由局部注射、全身輸注或其組合將該融合分子遞送至該細胞。
實施例53.  如實施例2至4及8至52中任一項之方法，其中該個體為人類。
實施例54.  如實施例4及8至53中任一項之方法，其中該PCSK9相關病症為高動脈粥樣硬化性心血管病。
實施例55.  如實施例4及8至53中任一項之方法，其中該PCSK9相關病症為高膽固醇血症。
實施例56.  如實施例1至55中任一項之方法，其中該細胞為肝細胞。
實施例57.  一種sgRNA，其包含SEQ ID NO: 27-95或98-108中之任一者之核酸序列。
實施例58.  一種DNA序列，其編碼如實施例54之sgRNA。
實施例59.  一種醫藥組合物，其包括包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該融合分子靶向PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之基因體區域， 其中該至少一個基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)、DNA去甲基酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶或其一部分，或基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分，或其組合，且 其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
實施例60.  如實施例59之醫藥組合物，其中該PCSK9調控元件為轉錄起始位點、核心啟動子、近端啟動子、遠端增強子、靜默子、絕緣子元件、邊界元件或基因座控制區。
實施例61.  如實施例59至60中任一項之醫藥組合物，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。
實施例62.  如實施例61之醫藥組合物，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內。
實施例63.  如實施例61之醫藥組合物，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游300 bp內。
實施例64.  如實施例59至63中任一項之醫藥組合物，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約100 bp、約200 bp、約300 bp、約400 bp、約500 bp、約600bp、約700 bp、約800 bp、約900 bp、約1000 bp、約1100 bp、約1200 bp、約1300 bp、約1400 bp或約1500 bp內。
實施例65.  如實施例64之醫藥組合物，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之下游約300 bp內。
實施例66.  如實施例59至65中任一項之醫藥組合物，其中該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之該修飾位於該PCSK9基因之轉錄起始位點之上游1000 bp內及轉錄起始位點之下游300 bp內。
實施例67.  如實施例59至66中任一項之醫藥組合物，其中至少一個核苷酸之該修飾為DNA甲基化。
實施例68.  如實施例59至67之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)或其一部分。
實施例69.  如實施例68之醫藥組合物，其中該DNA甲基轉移酶為DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。
實施例70.  如實施例69之醫藥組合物，其中該DNMT3A包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
實施例71.  如實施例69之醫藥組合物，其中該DNMT3L包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
實施例72.  如實施例59至71中任一項之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子包含基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
實施例73.  如實施例72之醫藥組合物，其中該基於鋅指蛋白之轉錄因子為克魯勃相關抑制框(KRAB)。
實施例74.  如實施例73之醫藥組合物，其中該KRAB包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
實施例75.  如實施例59至74中任一項之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶或其一部分及基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
實施例76.  如實施例75之醫藥組合物，其中該DNA甲基轉移酶係選自DNMT3A及DNMT3L及其組合，且該基於鋅指蛋白之轉錄因子為KRAB。
實施例77.  如實施例59至76中任一項之醫藥組合物，其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
實施例78.  如實施例77之醫藥組合物，其中該至少一個DNA結合蛋白為dCas9。
實施例79.  如實施例78之醫藥組合物，其中該dCas9包含金黃色葡萄球菌dCas9、釀膿鏈球菌dCas9、空腸彎曲桿菌dCas9、白喉棒狀桿菌dCas9、凸腹真桿菌dCas9、巴氏鏈球菌dCas9、香腸乳桿菌dCas9、球形球毛殼菌dCas9、固氮螺菌(例如，菌株B510) dCas9、固氮葡糖醋桿菌dCas9、灰色奈瑟菌dCas9、腸道羅氏菌dCas9、食清潔劑細小棒菌dCas9、鹵水硝酸鹽裂解菌(例如，菌株DSM 16511) dCas9、紅嘴鷗彎曲桿菌(例如，菌株CF89-12) dCas9、嗜熱鏈球菌(例如，菌株LMD-9) dCas9。
實施例80.  如實施例78之醫藥組合物，其中該dCas9包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
實施例81.  如實施例59至80中任一項之醫藥組合物，其中該融合分子包含融合至該至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端之該至少一個基因表現調節子。
實施例82.  如實施例81之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子直接融合至該至少一個DNA結合蛋白。
實施例83.  如實施例81之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子經由非調節子、第二調節子或連接子與該至少一個DNA結合蛋白間接融合。
實施例84.  如實施例81至83之醫藥組合物，其中該融合分子包含與C末端上之KRAB及N末端上之DNMT3A及DNMT3L融合之dCas9。
實施例85.  如實施例84之醫藥組合物，其中該融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。
實施例86.  如實施例59至85中任一項之醫藥組合物，其中該融合分子進一步包含至少一個核定位序列。
實施例87.  如實施例86之醫藥組合物，其中該至少一個核定位序列直接融合至該至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。
實施例88.  如實施例86之醫藥組合物，其中該至少一個核定位序列經由連接子間接融合至該至少一個DNA結合蛋白之C端、N端或兩端。
實施例89.  如實施例59至88中任一項之醫藥組合物，其中編碼該融合分子之該核酸序列為去氧核糖核酸(DNA)。
實施例90.  如實施例59至88中任一項之醫藥組合物，其中編碼該融合分子之該核酸序列為信使核糖核酸(mRNA)。
實施例91.  如實施例59至90中任一項之醫藥組合物，其進一步包含至少一個與該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之DNA序列互補之單嚮導RNA (sgRNA)。
實施例92.  如實施例91之醫藥組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 27-95或98-108之核酸序列。
實施例93.  如實施例59至92中任一項之醫藥組合物，其中該融合分子包裝於脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例94.  如實施例91至92中任一項之醫藥組合物，其中該融合分子及該sgRNA包裝於脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例95.  如實施例94之醫藥組合物，其中該融合分子及該sgRNA包裝於同一脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例96.  如實施例94之醫藥組合物，其中該融合分子及該sgRNA包裝於不同脂質體或脂質奈米粒子中。
實施例97.  如實施例93至96中任一項之醫藥組合物，其中該脂質體或該脂質奈米粒子包含可電離脂質(20%-70%，莫耳比)、聚乙二醇化脂質(0%-30%，莫耳比)、支持脂質(5%-50%，莫耳比)及膽固醇(10%-50%，莫耳比)。
實施例98.  如實施例93至97中任一項之醫藥組合物，其中該可電離脂質係選自由pH響應型可電離脂質、熱響應型可電離脂質及光響應型可電離脂質組成之群。
實施例99.  如實施例59至92中任一項之醫藥組合物，其中該融合分子包裝於AAV載體中。
實施例100. 如實施例91至92中任一項之醫藥組合物，其中該融合分子及該sgRNA包裝於AAV載體中。
實施例101. 如實施例100之醫藥組合物，其中該融合分子及該sgRNA包裝於同一AAV載體中。
實施例102. 如實施例100之醫藥組合物，其中該融合分子及該sgRNA包裝於不同AAV載體中。
無
圖 1A為展示「EPICAS」(亦稱作「CRISPRoff」)雙質體系統及靶向小鼠PCSK9表現之sgRNA拼鋪篩選設計的示意圖。第一質體(「催化蛋白」質體或「融合分子」質體)編碼在CAG啟動子控制下之DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB，及由2A元件隔開之GFP標誌物。第二質體(「sgRNA」質體)具有在U6啟動子控制下之sgRNA支架及在CMV啟動子控制下之mCherry標誌物。拼鋪篩選之sgRNA靶向小鼠PCSK9蛋白編碼序列(CDS)之上游的轉錄起始位點(TSS) +250bp。 圖 1B為展示用催化蛋白質體及單一PCSK9 sgRNA質體轉染小鼠AML12細胞株後之相對mRNA表現的條形圖。對於各組，n=3個生物學重複。 圖 1C為展示用催化蛋白質體及各種PCSK9 sgRNA質體之混合物轉染小鼠AML12細胞株後之相對mRNA表現的條形圖。 圖 1D為展示用催化蛋白質體及各種PCSK9 sgRNA質體之混合物轉染小鼠Ai9初級肝細胞後之相對mRNA表現的條形圖。 圖 2A為展示EPICAS mRNA質體設計之示意圖。EPICAS ORF包含DNMT3A-DNMT3L-dCas9-KRAB卡匣。質體可在 XbaI及 BpiI限制位點處消化以形成線性化質體。 圖 2B為自EPICAS mRNA質體表現之經純化mRNA之電泳圖。 圖 2C為展示Snrpn-GFP報告系統之示意圖。 圖 2D為展示用Snrpn sgRNA或非靶向sgRNA轉染後8天，或用Snrpn sgRNA轉染後30天、150天及400天之Snrpn-GFP表現的一系列流式細胞分析圖。 圖 2E為展示用Snrpn sgRNA或非靶向gRNA (NT-sgRNA)轉染後8天，或用Snrpn sgRNA轉染後30天、150天及400天之具有GFP-off之細胞百分比的線圖。 圖 2F為使用亞硫酸氫鹽PCR分析之Snrpn基因座之DNA甲基化水準的示意圖。轉染後8天展示CRISPRoff靶向細胞與非靶向細胞之間的Snrpn基因座之亞硫酸氫鹽定序分析。各列代表一個單純系及定序讀數，且各行指示一個特定基因體位置。白點代表未甲基化CpG二核苷酸且黑點代表甲基化CpG二核苷酸。下圖代表Snrpn基因座之13個位置處之甲基化。 圖 2G為轉染後400天之CRISPRoff靶向細胞與非靶向細胞之間的 Snrpn基因座之亞硫酸氫鹽定序分析的示意性代表圖。圓形之后區代表各CpG二核苷酸之甲基化之平均度(n=9個定序讀數)。 圖 2H為展示藉由活體外轉錄之CRISPRoff mRNA之純度的毛細管凝膠電泳。 圖 2I為展示CRISPRoff轉染後70天及90天之GFP-off細胞百分比之一系列圖。 圖 3A為脂質奈米粒子(LNP)設計之示意圖。表觀遺傳CRISPR/Cas元件及sgRNA元件可由LNP囊封。 圖 3B為展示含有EPICAS之LNP的透射電子顯微鏡影像。 圖 3C為展示LNP之尺寸分布的圖。 圖 3D為展示藉由肌肉內注射經脂質奈米粒子遞送至小鼠肝細胞之螢光素酶mRNA之活體內螢光成像的一系列相片。 圖 3E為用於遞送含有EPICAS mRNA及小鼠PCSK9靶向sgRNA之LNP之活體內實驗設計的示意圖。經由注射至側尾靜脈中向C57CB/6J小鼠投與LNP且注射後5天分析PCSK9基因表現。 圖 3F為展示注射PBS或含有EPICAS mRNA及小鼠PCSK9靶向sgRNA之LNP後之小鼠PCSK9之相對mRNA表現的條形圖。 圖 4A為猴PCSK9之sgRNA拼鋪篩選設計之示意圖。拼鋪篩選之sgRNA靶向猴PCSK9蛋白編碼序列(CDS)之上游的轉錄起始位點(TSS) +250bp。 圖 4B為展示用催化蛋白質體及單一PCSK9 sgRNA質體轉染猴細胞後之相對mRNA表現的條形圖。 圖 5A為展示靶向人類PCSK9之sgRNA拼鋪篩選之實驗設計的示意圖。 圖 5B為展示用靶向人類PCSK9 TSS之上游300bp及下游300bp之區域的各種sgRNA轉染人類PCSK9報告細胞株後之PCSK9之平均螢光強度率的一系列條形圖。左圖展示轉染後72小時之結果。右圖展示轉染後120小時之結果。 圖 5C為展示用靶向人類PCSK9 TSS之上游300bp及下游300bp之區域的各種sgRNA轉染人類PCSK9報告細胞株後72小時，PCSK9之平均螢光強度率的一系列圖。 圖 5D為展示用EPICAS雙質體系統使用靶向PCSK9之各種sgRNA轉染後之PCSK9 mRNA表現的一系列圖。左圖展示用各種sgRNA轉染後48小時，內源地表現人類PCSK9之Hep3B細胞株中之PCSK9 mRNA表現。右圖展示用各種sgRNA轉染人類PCSK9報告細胞株後120小時，PCSK9之平均螢光強度率。 圖 6A為展示小鼠肝臟之螢光染色之影像。展示tdTomato染色(CRISPRoff mRNA)及DAPI染色。展現tdTomato螢光之大比例之細胞顯示出小鼠肝臟中LNP介導之CRISPRoff mRNA之功效。 圖 6B為展示LNP介導之CRISPRoff mRNA遞送後之小鼠器官的影像。螢光素酶成像顯示CRISPRoff mRNA定位至肝臟。 圖 6C為展示在投與後6小時、12小時、24小時及48小時，藉由螢光素酶成像之Luc mRNA-LNP之活體內分布的一系列影像。 圖 6D為展示野生型小鼠肝臟中之 Pcsk9mRNA水準之圖。用指示劑量(mg RNA/kg體重)之具有CRISPRoff mRNA及靶向 Pcsk9之sgRNA的LNP調配物處理後一周評估相對mRNA表現水準。對於PBS， n= 5，且對於LNP調配物組， n= 6。mg/kg (MPK)。 圖 6E為展示用指示劑量(mg RNA/kg體重)之具有CRISPRoff mRNA及靶向 Pcsk9之sgRNA的LNP調配物處理之小鼠之血液中的Pcsk9蛋白水準。對於PBS， n= 5，且對於LNP調配物組， n= 6。 圖 6F為展示3mg/kg具有CRISPRoff mRNA及靶向 Pcsk9之sgRNA的LNP調配物處理後2週、4週、6週及8週，小鼠之血液中之Pcsk9蛋白水準的圖。對於各組， n= 4。 圖 6G為部分肝切除(PHx)及肝再生實驗之示意圖。 圖 6H為展示PHx或假手術後7天，小鼠中之肝臟 Pcsk9mRNA水準之比較的圖。 圖 6I為展示 Pcsk9基因之啟動子處之CpG二核苷酸之靶向亞硫酸氫鹽定序分析的圖。由來自4個或3個生物學重複之平均β值定量各CpG二核苷酸處之甲基化水準。對於PBS、假手術及PHx， n= 4、3及4。PHx，部分肝切除。藉由司徒頓氏t檢驗(student's t-test)計算 P值。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01，*** P＜ 0.001，**** P＜ 0.0001。 圖 7A為高脂肪膳食(HFD)之小鼠中藉由表觀基因體編輯之 Pcsk9抑制之示意圖。 圖 7B為展示用PBS、4mg/kg或6mg/kg具有CRISPRoff mRNA及靶向 Pcsk9之sgRNA的LNP調配物處理後7天，HFD小鼠之血液中之Pcsk9相對蛋白水準的圖。mg/kg (MPK)。 圖 7C為展示處理後14天，HFD小鼠之血液中之Pcsk9相對蛋白水準的圖。 圖 7D為展示處理前及處理後，HFD小鼠中之血漿LDL-C水準之比較的圖。對於各組， n= 5個生物學重複。藉由司徒頓氏t檢驗計算 P值。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01，*** P＜ 0.001，**** P＜ 0.0001。 圖 8A為兩個組中之基因之log2變換TPM的散點圖。標記點與 Pcsk9基因對應。資料代表三個獨立生物學重複之平均值。 圖 8B為靶向基因 Pcsk9之上游及下游1Mb內之基因表現變化的圖形描繪。x軸代表各基因之基因體位置。 圖 8C為展示CRISPRoff與PBS處理之小鼠之間的全基因體上之差異性甲基化CpG的曼哈頓圖(Manhattan plot)。高於0之-log10 (p值)之點指示基因座之甲基化水準在CRISPRoff處理之小鼠中較高，且低於0之-log10 (p值)之點指示甲基化水準在PBS處理之小鼠中較高。箭頭標記 Pcsk9之基因體位置。 圖 8D為 Pcsk9之上游及下游1kb內之甲基化變化的圖形描繪。x軸代表基因體位置。y軸代表-log (p值)。紅點指示處於自轉錄起始位點至其終止密碼子末端之 Pcsk9基因之範圍內，且藍點指示處於此範圍之外。由兩個sgRNA靶向之原間隔子位點標記為「sgRNA7」及「sgRNA9」。 圖 8E為展示預測sgRNA依賴性脫靶基因及靶基因之基因表現變化的火山圖。x軸代表藉由DESeq2獲得之指示基因之log2變換倍數變化且y軸代表log10變換經調整 P值。對於各組， n= 3個生物學重複。 圖 9A為展示囊封CRISPRoff及靶向 Pcsk9之sgRNA之LNP之尺寸分布的圖。 圖 9B為囊封CRISPRoff及靶向 Pcsk9之sgRNA之LNP的低溫EM影像。 圖 9C為展示用不同劑量之LNP囊封之CRISPRoff處理之 Pcsk9基因的CpG二核苷酸之靶向亞硫酸氫鹽定序分析之圖。由來自4個或3個生物學重複之平均β值定量各CpG二核苷酸處之甲基化水準。對於各組， n= 3。mg/kg (MPK)。 圖 9D為展示在3或6 mg/kg LNP囊封之CRISPRoff處理前、處理後4天及7天，小鼠中之天冬胺酸轉胺酶(ALT)、丙胺酸轉胺酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)及白蛋白(ALB)之血液水準之絕對值的一系列圖。對於各組， n= 6。藉由司徒頓氏t檢驗計算 P值。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01，*** P＜ 0.001，**** P＜ 0.0001。 圖 10A為展示全轉錄體基因之基因表現變化的火山圖。指示代表 Pcsk9之點。 圖 10B為展示側接 Pcsk9基因之50kb基因體窗口內之甲基化水準之比較的圖。高於x軸之條形代表甲基化水準大於0.5之基因座且低於x軸之條形代表甲基化水準小於0.5。由兩個sgRNA靶向之原間隔子位點標記為「sgRNA7」及「sgRNA9」。 圖 10C為展示指示基因之甲基化及基因表現水準之log2變換倍數變化的條形圖，其顯示CRISPRoff與PBS處理之小鼠之間的基因表現水準之統計顯著性。 圖 10D為展示指示基因之甲基化及基因表現水準之log2變換倍數變化的條形圖，其顯示CRISPRoff與PBS處理之小鼠之間的甲基化水準之統計顯著性。對於各組， n= 3個生物學重複。
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Claims (42)

  1. 一種用於減少或消除細胞中前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶(Proprotein Convertase Subtilisin)/Kexin 9型(PCSK9)基因產物之表現的方法，該方法包括向該細胞中引入以下各物之步驟：  包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而減少或消除該細胞中該PCSK9基因產物之表現。
  2. 一種減少或消除個體中PCSK9基因產物之表現的活體內方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟： 包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之一融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而減少或消除該個體中該PCSK9基因產物之表現。
  3. 一種減少一個體中之低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟： 包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而減少該個體中之LDL膽固醇。
  4. 一種用於治療或減輕一個體之PCSK9相關病症之症狀的方法，該方法包括向該個體之細胞中引入以下各物之步驟： 包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， 從而治療或減輕該個體之PCSK9相關病症之症狀。
  5. 一種擴充一PCSK9基因產物之表現減少之細胞群體的方法，該方法包括以下步驟： i) 向複數個細胞中引入包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之一融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之修飾， ii) 擴充該複數個細胞以產生該PCSK9基因產物之表現減少之複數個經修飾細胞， 其中相對於尚未引入該融合分子或該核酸序列之細胞，該複數個經修飾細胞之該PCSK9基因產物表現減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，且 其中該細胞為肝細胞。
  6. 如請求項1至請求項5中任一項所述之方法，其中該PCSK9調控元件為核心啟動子、近端啟動子、遠端增強子、靜默子、絕緣子元件、邊界元件或基因座控制區。
  7. 如請求項1至請求項6中任一項所述之方法，其中至少一個核苷酸之該修飾為DNA甲基化。
  8. 如請求項1至請求項7中任一項所述之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含一DNA甲基轉移酶(DNMT)、DNA去甲基酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶或其一部分。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該DNMT為包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之DNMT3A。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該DNMT為包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之DNMT3L。
  11. 如請求項1至請求項10中任一項所述之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含一基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該基於鋅指蛋白之轉錄因子為克魯勃相關抑制框(Kruppel-associated suppression box，KRAB)。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該KRAB包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
  14. 如請求項1至請求項13中任一項所述之方法，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶或其一部分及基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該DNA甲基轉移酶係選自DNMT3A及DNMT3L及其組合，且該基於鋅指蛋白之轉錄因子為KRAB。
  16. 如請求項1至請求項15中任一項所述之方法，其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該至少一個DNA結合蛋白為dCas9。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該dCas9包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至請求項18中任一項所述之方法，其中該融合分子包含與C末端上之KRAB及N末端上之DNMT3A及DNMT3L融合之dCas9。
  20. 如請求項1至請求項19中任一項所述之方法，其中該融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。
  21. 如請求項1至請求項20中任一項所述之方法 ，該方法進一步包括以下步驟：引入至少一個與該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之DNA序列互補之單嚮導RNA (sgRNA)，從而將該融合分子靶向該PCSK9基因或PCSK9調控元件，或編碼該sgRNA之DNA。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 27-95或98-108之核酸序列。
  23. 一種sgRNA，其包含SEQ ID NO: 27-95或98-108中之任一者之核酸序列。
  24. 一種DNA序列，其編碼如請求項23所述之sgRNA。
  25. 一種醫藥組合物，其包括包含至少一個DNA結合蛋白及至少一個基因表現調節子之一融合分子，或編碼該融合分子之核酸序列， 其中該融合分子靶向一PCSK9基因附近及/或一PCSK9調控元件內之基因體區域， 其中該至少一個基因表現調節子提供該PCSK9基因附近及/或PCSK9調控元件內之至少一個核苷酸之一修飾， 其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶(DNMT)、DNA去甲基酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶或其一部分，或基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分，或其組合，且 其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
  26. 如請求項25所述之醫藥組合物，其中該PCSK9調控元件為轉錄起始位點、核心啟動子、近端啟動子、遠端增強子、靜默子、絕緣子元件、邊界元件或基因座控制區。
  27. 如請求項25至請求項26中任一項所述之醫藥組合物，其中至少一個核苷酸之該修飾為DNA甲基化。
  28. 如請求項25至請求項27所述之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子包含一DNA甲基轉移酶(DNMT)或其一部分。
  29. 如請求項28所述之醫藥組合物，其中該DNMT為包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之DNMT3A。
  30. 如請求項28所述之醫藥組合物，其中該DNMT為包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之DNMT3L。
  31. 如請求項25至請求項30中任一項所述之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子包含基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
  32. 如請求項31所述之醫藥組合物，其中該基於鋅指蛋白之轉錄因子為克魯勃相關抑制框(KRAB)。
  33. 如請求項32所述之醫藥組合物，其中該KRAB包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
  34. 如請求項25至請求項33中任一項所述之醫藥組合物，其中該至少一個基因表現調節子包含DNA甲基轉移酶或其一部分及基於鋅指蛋白之轉錄因子或其一部分。
  35. 如請求項34所述之醫藥組合物，其中該DNA甲基轉移酶係選自DNMT3A及DNMT3L及其組合，且該基於鋅指蛋白之轉錄因子為KRAB。
  36. 如請求項25至請求項35中任一項所述之醫藥組合物，其中該至少一個DNA結合蛋白為Cas9、dCas9、Cpf1、鋅指核酸酶(ZNF)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、歸巢核酸內切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
  37. 如請求項36所述之醫藥組合物，其中該至少一個DNA結合蛋白為dCas9。
  38. 如請求項37所述之醫藥組合物，其中該dCas9包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
  39. 如請求項25至請求項38所述之醫藥組合物，其中該融合分子包含與C末端上之KRAB及N末端上之DNMT3A及DNMT3L融合之dCas9。
  40. 如請求項39所述之醫藥組合物，其中該融合分子包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。
  41. 如請求項25至請求項40中任一項所述之醫藥組合物，其進一步包含至少一個與該PCSK9基因附近及/或一PCSK9調控元件內之DNA序列互補之單嚮導RNA (sgRNA)。
  42. 如請求項41所述之醫藥組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 27-95或98-108之核酸序列。
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