CN101970051A - 用于治疗心力衰竭的rna干扰 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过调节缺陷的心脏Ca²⁺稳态而治疗心力衰竭的靶向RNAi，所述调节是经由使用腺伴随病毒(AAV)转染心肌细胞来降低受磷蛋白(PLB)的表达或活性。还公开了在受治疗者中降低室性心律失常的方法，以及全面改善心力衰竭存活的方法。此外，本发明提供了可用于诊断对RNAi治疗的易感性的方法，并包括包含RNAi序列的药物组合物、试剂盒和载体。

Description

用于治疗心力衰竭的RNA干扰

发明背景

发明领域

本发明总体涉及治疗心脏疾病的方法，并且更具体地，涉及使用RNAi降低受磷蛋白(PLB)以治疗慢性心力衰竭的方法，包括通过靶向AAV9载体腺伴随病毒(AAV)递送，和诊断对慢性心力衰竭的RNAi治疗的易感性的方法。

背景信息

心力衰竭目前影响超过两百万美国人，并且其经济和人员损失将随着人口的老龄化而继续增加。对于65岁和以上的患者，充血性心力衰竭是最常见的住院患者诊断，每年报道超过400,000新病例。预后差，5年内死亡率60％，并且23-52％的死亡可归因于致死性心律失常(心源性猝死；SCD)。

心力衰竭是心输出量不能满足生理需求。因此心力衰竭不是特殊病，而是代表大多数心脏疾病的终点的综合征，所述心脏疾病包括缺血性心脏病、心肌疾病(舒张性、限制性、或肥大性)、瓣膜性心脏病以及慢性高血压和糖尿病。另外，在如急性心肌梗死、心脏手术后(心肌顿抑、心肌冬眠(hybernation))或再血管化治疗后(即再灌注损伤、溶栓后、经皮穿刺冠状动脉成形术或冠状动脉旁路移植术)的情形中，心力衰竭的症状也可急性呈现(即急性心力衰竭、或心源性休克)。

降低的收缩性是充血性心力衰竭的关键特征，而储存心肌细胞中的钙的肌质网(SR)在心脏收缩性以及兴奋和收缩的偶联中起关键作用。收缩性力的形成依赖于SR中积累的Ca²⁺的量。肌质网钙ATP酶(SERCAa)丰度的增加或受磷蛋白(PLB)磷酸化的增加和/或PLB丰度的降低可促进SR的Ca²⁺摄取的增加，由此增强心肌细胞的收缩性。

PLB是53氨基酸、肌肉特异性磷蛋白。去磷酸化的PLB与SERCA2a结合并调节进入心脏组织的SR中的钙的量。当被蛋白激酶A磷酸化时，SERCA2a的PLB抑制被复活，增加进入SR的钙流量和增强肌肉的收缩性。

心肌基因治疗可用于许多心血管疾病的治疗，所述心血管疾病包括缺血性心肌疾病、充血性心力衰竭和恶性心律失常。用于心肌基因递送的有用载体将允许在直接心肌内注射或输注到冠状动脉或窦中之后有效和稳定地向心肌细胞转导许多转基因。例如，直接注射到左心室心肌的质粒DNA载体已被邻近注射区域的心肌细胞表达6个月。然而，此方法的治疗有用性受到心肌细胞转导效率低(注射区域中0.1％至1.0％的心肌细胞)的限制。

复制缺陷型腺病毒(RDAd)载体的心肌内注射和冠状动脉内输注两种方法已被用于在体内有效转导啮齿动物、兔和猪中的心肌细胞。然而，腺病毒介导的基因转移的可行性受到对病毒和外源转基因蛋白的免疫应答的限制，所述免疫应答引起严重的心肌炎症，感染30天内病毒转导细胞的消除，并由此造成在免疫活性宿主中短暂的重组基因表达。

发明概述

本发明涉及通过调节缺陷的心脏Ca²⁺稳态而治疗严重心力衰竭的靶向RNAi，所述调节是经由使用腺伴随病毒(AAV)转染心肌细胞来降低受磷蛋白(PLB)的表达。该方法还涉及使用所公开的方法在受治疗者中降低室性心律失常、以及全面改善心力衰竭的存活。此外，本发明提供可用于诊断对RNAi治疗的易感性的方法，并包括基本上由降低PLB活性的RNAi组成的药物组合物、试剂盒和载体。

同样地，本发明提供用于治疗受治疗者的心力衰竭的方法。该方法包括向有相应需要的受治疗者施用包括RNAi表达盒的载体，其中所述盒包含其表达产物降低受磷蛋白(PLB)活性的RNAi序列，所述载体的施用是以与施用载体之前相比，有效治疗所述受治疗者的心力衰竭和改善所述受治疗者的收缩功能的量。在一种实施方案中，所述载体是病毒体。在另一种实施方案中，所述载体是质粒。在另一种实施方案中，所述病毒体是细小病毒。在另一种实施方案中，所述细小病毒是腺伴随病毒(AAV)，包括AAV血清型9。在又一种实施方案中，所述RNAi表达盒包括SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。在相关的实施方案中，SEQ ID NO：1的侧翼为AAV末端重复序列。在另一种实施方案中，PLB基因表达被抑制至少10％。在另一种实施方案中，所述RNAi序列包括SEQ ID NO：2所列的靶序列。同样地，所述RNAi表达盒编码至少一个RNA，包括在严格条件下与PLB基因的核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列，和为所述第一核苷酸序列的互补反向重复序列并与所述第一核苷酸序列杂交形成发夹结构的第二核苷酸序列。在一种实施方案中，所述两种核苷酸序列通过RNA环状结构连接。在另一种实施方案中，所述受治疗者是哺乳动物，诸如人类。

本发明进一步提供药物组合物，该药物组合物包括重组的腺伴随病毒(AAV)载体和药学可接受的载运体，其中所述载体包含其RNA表达产物导致受磷蛋白(PLB)的表达和/或活性的降低的RNAi表达盒。在一种实施方案中，所述RNAi表达盒的RNA表达产物包括在严格条件下与PLB基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中严格条件包括但不限于，在42℃下在包含50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS的溶液中杂交，并在65℃下在包含0.2x SSC和0.1％SDS的溶液中清洗。在另一种实施方案中，所述RNAi表达盒包括SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述RNA表达产物包括SEQ ID NO：2所列的靶序列。在另一种实施方案中，所述组合物适于静脉内施用、动脉内施用、心室内施用、或心瓣膜灌注。

本发明还提供一种腺病毒伴随病毒(AAV)载体，该载体包括至少一个AAV末端重复序列，其中所述载体包含其RNAi表达产物导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或PLB活性降低的RNAi表达盒。在实施方案中，所述RNAi表达盒的RNA表达产物包括在严格条件下与PLB基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述RNAi表达盒包括SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述RNA表达产物包括SEQ ID NO：2所列的靶序列。

本发明还提供增加肌质网(SR)的钙摄取的方法。该方法包括使肌肉组织样品与腺伴随病毒(AAV)载体接触，其中所述载体包括编码RNAi表达产物的多核苷酸序列，由此增加SR中的钙摄取，并与和载体接触之前的收缩性相比增强心肌细胞的收缩性。在一种实施方案中，所述RNAi包括在严格条件下与PLB靶基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述载体包括SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述RNAi包括SEQ ID NO：2所列的靶序列。在另一种实施方案中，所述RNAi表达盒的RNA编码区造成PLB基因的表达下调。在另一种实施方案中，所述RNAi载体包括与PLB靶基因的RNA编码区具有至少约90％同一性的序列。

本发明进一步提供试剂盒，该试剂盒包括腺伴随病毒(AAV)载体，其中所述载体包含编码导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或PLB活性降低的RNAi表达产物的多核苷酸序列，一种或多种缓冲液，使用这些组成部分的说明，和包含这些组成部分的容器。在实施方案中，所述RNAi包括在严格条件下与PLB靶基因mRNA转录物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

本发明还提供诊断受治疗者对所述受治疗者中的胞内钙失调所致的慢性心力衰竭(HF)的RNAi治疗的易感性的方法。该方法包括使受治疗者的肌肉组织样品与腺伴随病毒(AAV)载体接触，其中所述载体包括编码导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或活性降低的RNAi表达产物的多核苷酸序列，和确定所述肌肉组织样品与AAV载体接触之前和之后所述组织样品中钙ATP酶泵(SERCA)的活性，其中SERCA活性的增加与受治疗者对HF的RNAi治疗的易感性相关。

本发明还提供改善具有慢性心力衰竭的受治疗者的存活的方法。该方法包括施用腺伴随病毒(AAV)载体，其中所述载体包括编码导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达降低和细胞中的PLB蛋白的量减少的RNAi表达产物的多核苷酸序列，并且所述RNAi包括在严格条件下与PLB靶基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在一种实施方案中，所述载体改善收缩功能，由此改善受治疗者的存活。在另一种实施方案中，所述AAV是血清型9。

本发明还提供降低受治疗者的室性心律失常的方法。该方法包括施用包含编码导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或PLB活性降低的RNAi表达产物的多核苷酸序列的病毒体，改善心室功能，由此降低所述受治疗者的室性心律失常。在一种实施方案中，所述病毒体是AAV9。

附图简述

图1A是显示Northern印迹图的图像图示，所述Northern印迹图展示在开发用于心力衰竭(HF)治疗的RNA干扰(RNAi)载体中通过不同载体的靶向沉默。所示为原代新生大鼠心肌细胞(primary neonatal rat cardiomyocyte，PNCM)中shRNA表达载体的靶向沉默效力。分别在用在泳道上方给出的以颗粒/细胞(p/c)计的剂量的相应载体治疗后5天(上面部分)或10天(下面部分)收获细胞。然后使用大鼠PLB-特异性探针进行Northern印迹。为了确保等量的RNA上样，剥离印迹并使其与β-肌动蛋白-特异性探针重新杂交。泳道1至18显示基于腺伴随病毒(AAV)的载体AAV-shPLB(泳道1-6)、AAV-shPLB-CMV-β-内含子(泳道7-12)和AAV-shPLB-CMV-GFP(泳道13-18)的RNAi-介导的PLB-mRNA下调的剂量依赖性。泳道19-24显示引起用AAV-shGFP治疗后的PLB-mRNA表达的非特异性shRNA的对照，其产生shRNA序列靶向的绿色荧光蛋白(GFP)(泳道19-24)。为了与AAV进行比较，使用了腺病毒载体AdV-shPLB(泳道25-28)。至第10天，＞98％的PLB-mRNA被4x10³p/c的最低剂量的rAAV-shPLB除去(泳道1，2)，类似于AdV-shPLB(泳道25-28)。在rAAV-shPLB载体中并入CMV-GFP表达盒(泳道7-12)以向此载体提供被体内成像易于检测的标签，导致感染细胞中的强GFP表达(未显示)，但意外地消除了其PLB基因沉默效应。并入CMV-β-内含子盒(泳道12-18)具有相似但较不显著的效应。

图1B是显示图1A的载体产生的细胞shRNA水平的图形图示。在CMV-GFP盒存在下，shPLB产生被消除(泳道13-18)，而不具有其它序列的U6-shPLB载体显示5天(泳道1-3)和10天(泳道4-6)的稳定表达。在NRCM中，AdVshPLB在第5天产生非常高的shPLB水平，然后该水平相当迅速地下降。

图1C是显示腺病毒和AAV载体的详细图谱的图像图示。AAV-shPLB具有与AdV-shPLB和它们对应的shGFP对照载体相同的U6-shRNA表达系统。此外，四种含有CMV的载体携带盒，CMV-GFP盒或CMV-β-内含子盒与U6-shRNA序列处于头接头方向，并且它们被牛生长激素(bgH)末端信号隔开。

图1D是图像和图形图示，左图显示治疗NRCM过程中的PLB蛋白的Western印迹，而右图显示加入载体后第3、5和7天的PLB蛋白定量。在第7天，AdV-shPLB和rAAV6-shPLB造成细胞内PLB分别下调至基线的9％和13％。

图1E是显示以下的图形图示：与具有与未治疗细胞不可分辨的[Ca²⁺]_i瞬变(transient)的AAV9-shGFP组相比，AAV9-shPLB治疗过程中NRCM中的[Ca²⁺]_i瞬变显示显著更高的振幅和加快的瞬变动力学(缩短的TTP和τ)。AdV-shPLB治疗还造成比AdV-shGFP对照显著更高的振幅。与AAV9组相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP组的TTP被延长，该组未显示τ的差异。

图1F是显示图1E中所示的[Ca²⁺]_i瞬变的统计评估的图形图示。^*表示p＜0.05和^**p＜0.01。

图2A是说明体内RNAi治疗HF的方案的流程图。最初将用于体内RNAi治疗的动物分成两组：一组为大动脉被绑扎(TAB)的56只动物，第二组是12只进行模拟手术的动物。在TAB动物中，在心脏RNAi载体转移之前，经过25-30周以允许它们形成左心室(LV)舒张和允许缩短分数(FS)下降25％，如通过连续超声波心动描记术所评估的。在经历TAB的初始的56只动物中，40只动物存活，并进一步分组以接受Ad-shGFP(n＝10)或Ad-shPLB(n＝10)，或对照载体AAV9-shGFP(n＝10)或AAV9-shPLB(n＝10)。载体注射经由含有200μl腺病毒(3x10¹⁰pfu)或AAV9(5x10¹¹载体基因组)载体溶液的22G导管进行。使导管从LV尖前进至主动脉根，在远离导管位点的一端将主动脉和肺动脉主干夹住40秒钟并注射溶液。腺病毒载体组在一个月后、AAV载体治疗组在三个月后通过超声波心动描记术、尖端导管(tip catheter)、形态测定法和组织学进行结果评估(参见，图3A-3F)。在AdV组，8/10和9/10的动物在1个月后存活。3个月后，rAAV-shPLB组中9/10的动物存活，rAAV-shGFP组中6/10的动物存活。同时对这些组中心脏表达的微RNA进行了进一步研究。

图2B是显示i.v.注射表达绿色荧光蛋白的rAAV9-GFP载体(下)或盐水(上)的大鼠心脏的图像图示。注射后一个月，摘除心脏并通过GFP成像显现，GFP成像显示在rAAV9-GFP组中有心脏横截面大致均匀的信号，而在盐水组中则没有信号。

图2C是显示rAAV9-GFP-治疗的大鼠的心脏的GFP荧光在一个月时达到90％表面积的概况的图像图示。

图2D是显示向大鼠i.v.注射rAAV9-GFP后一个月不同器官中的GFP免疫组织化学染色的图像图示。但在i.v.注射腺病毒载体(AdV-GFP)后，未在心脏中检测到GFP(a)，rAAV9-GFP治疗造成强烈的GFP表达(b)和(c)，该表达是大致均匀的。少数区域全无GFP免疫反应性(已圈出)，其他区域显示均匀的细胞质染色(已圈出)。在一个月的高表达已明显造成在细胞中稳定的GFP的沉淀(箭头)形成的部位，染色尤其致密，这与RNAi载体产生的shRNA相反。平均70％的心肌细胞是免疫组织化学阳性的，而个体细胞之间的表达有差异。(e)显示一部分细胞具有微弱的染色的骨骼肌，而肝显示仅个别细胞的显著信号(d)。肺中没有可见的信号。关于AAV9分布的进一步数据在图2J中给出，其中GFP通过Western印迹分析定量，记录心脏的rAAV9-GFP表达的最高亲和性。肝和骨骼肌显示低表达，而肺仅显示非常微弱的表达。

图2E是显示i.v.注射rAAV9-GFP后1周和4周的肝苏木精-曙红染色的图像图示，显示无毒性证据。rAAV-shRNA载体也未造成肝毒性。

图2F是显示Northern印迹图的图像图示，所述Northern印迹图展示，与shGFP对照组相比，AdV-shPLB治疗后1个月和rAAV9-shPLB治疗后3个月的心脏PLB蛋白显著减少。NCX和GAPDH蛋白保持不变。与模拟(sham)组相比，处于心力衰竭的shGFP组中SERCA2a降低，而两个shPLB组的SERCA2a均显著增加。

图2G是显示不同治疗组的Western印迹的统计评估的图形图示。^*表示与AdV-shGFP相比p＜0.05，#表示与rAAV9-shGFP相比p＜0.05。

图2H是显示静脉内rAAV9-GFP注射后一个月的心脏GFP表达的图像图示。左侧的四个图(rAAV9-GFP)显示有初级GFP抗体，而右侧的两个图(对照)显示没有。关于AAV9分布的进一步数据证明心脏的rAAV9-GFP表达的最高亲和性。肝和骨骼肌显示低表达，而肺仅显示非常微弱的表达。

图2I是显示静脉内rAAV9-GFP注射后1个月其他器官中的GFP表达的图像图示。左侧的图(RAAV9-GFP)显示有初级GFP抗体，而右侧图(对照)显示没有。

图2J是显示静脉内rAAV9-GFP注射后不同器官中通过免疫印迹的GFP定量的图像和图形图示。

图3A是展示RNAi治疗对HF的功能和形态效应的系列图形图示。其中总结了RNAi治疗对舒张期LV功能的血液动力学参数的影响。与shGFP对照(泳道2，4)相比，TAB后大鼠中高LV充盈压(LVEDP)被shPLB载体显著降低(泳道3，5)。最大压力下降速率(maximal rate of pressure fall)(-dP/dt)以及等容松弛时间常数(isovolumetric relaxation time constant)Tau被shPLB治疗显著增加。rAAV-shPLB治疗(泳道5)后3个月值被恢复到正常范围(泳道1)。

图3B是显示与图3A类似的对收缩期LV功能的治疗效应的图形图示。超声波心动描记术显示rAAV-shPLB治疗后3个月的标准化的缩短分数(FS)，而AdV-shPLB的FS改善虽然是明显的，但较不显著。与对照相比，最大压力上升速率(maximal rate of pressure rise)(+dP/dt)以及收缩期压力(LVSP)得到改善。

图3C是显示死后形态测定法的系列图形图示，显示TAB诱导的显著的LV肥大(泳道2，4)，LV重量和LV/体重(LV/BW)比≈2/3三分之一高于基线(thirds above baseline)(泳道1)。后者在用AdV-shPLB或rAAV9-shPLB(泳道3、5)治疗1或3个月后被降低至正常的范围内。两种载体类型均显著减低心脏肥大。

图3D是总结心脏形态学的超声波心动描记术数据的系列图形图示，这与确证形态测定发现的图3C相似。

图3E是显示RNAi治疗后的HF动物中的心脏胶原蛋白含量的图形图示。3个月时，rAAV9-shRNA治疗造成显著降低的纤维化。对照载体则无效果。

图3F是显示两种治疗模式均诱导心肌细胞直径的显著下降的图形图示。

图3G是显示RNAi治疗过程中心脏BNP mRNA水平的图形图示。表示对于AAV9-shGFP比AAV9-shPLB，p＜0.05；

表示对于AdV-shGFP比AdV-shPLB，p＜0.05。

图4A是显示RNAi治疗过程中细胞微RNA的评估的系列图形图示。如所示的，在用稍后将用于体内治疗的载体(AAV-shPLB、AAV--shGFP、AdV-shPLB)进行治疗的过程中，与未治疗的PNCM相比，五种心脏表达的微RNA(miR)的细胞水平未发生变化，而含有CMV启动子的载体改变了这些水平。

图4B是显示以下的系列图形图示：与在标准PNCM的培养条件下获得的图4A的数据相反，在肥大诱导药物存在下，细胞miRNA水平发生显著改变。

图4C是显示RNAi治疗过程中的心脏miRNA-1和miRNA-133水平的系列图形图示。

表示对于AAV9-shGFP比AAV9-shPLB，p＜0.05；

表示对于AdV-shGFP比AdV-shPLB，p＜0.05。

图5A是显示CMV启动子对shRNA产生的干扰的图形图示。如所示的，除了图1A和1B中分析的不同AAV载体之外，还直接比较了载体AAV-ShPLB-CMF-GFP(具有功能性GFP盒)与AAV-shPLB-GFP(无CMV启动子)，以及AAV-shPLB-CW-β-内含子与AAV-shPLB-β-内含子(无CMV)。

图5B是显示与AAV6shPLB-CMF-GFP标记载体孵育后第5天培养的心肌细胞单层的图像图示，符合AAV6假型的非常高的转导率。

图5C是表明在从MCV经由终止信号通读至极短的shRNA序列中U6-shPLB-bGH方向上扰乱的shRNA产生的可能原因的图像图示，随后其影响了介导RNAi的短发夹的正确形成。

图5D是显示RNAi治疗过程中NRCM中的钙稳态变化的系列图形图示。

图5E是显示RNAi治疗过程中NRCM中的钙稳态变化的系列图形图示。

图6是显示具有心力衰竭并用AAV9/PL-RNAi治疗的大鼠中改善的存活的图形图示。其显示与使用单独的载体或具有GFP的载体的对照相比，通过使用AAV9/PL-RNAi的表达的RNAi基因转移的受磷蛋白抑制对具有转变为心力衰竭的压力过大性肥大的大鼠的存活的效应。

图7是显示猪缺血性再灌注模型中降低的室性心律失常结果的图形图示。与使用GFP的对照载体相比，该实验使用AAV9/PL-RNAi的表达。

图8是显示猪缺血性再灌注模型中改善的心室功能结果的图形图示。与使用单独的载体或具有GFP的载体的对照相比，该实验使用AAV9/PL-RNAi的表达。

发明详述

在描述本发明组合物、方法和治疗方法之前，应理解，此发明不限于所述的特定组合物、方法和实验条件，因为此类组合物、方法和条件可进行变化。还应理解，本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不意图为限制，因为本发明的范围将仅在所附权利要求中限制。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”的含义包括在本领域技术人员阅读本公开等等之后将变得明显的一种或多种方法和/或本文所述类型的步骤。

除非另外指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与此发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料可用于本发明的实践或检验，但是现在描述非限制性方法和材料。

除非另外说明，本发明的实践将利用本领域技术内的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。此类技术在文献中有详尽说明，参见，如Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)(现行版)；DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆实用方法)，第I&II卷(D.Glover，编辑)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(N.Gait编辑，现行版)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.Hames & S.Higgins编辑，现行版)；Transcription and Translation(转录和翻译)(B.Hames & S.Higgins编辑，现行版)；CRC Handbook of Parvoviruses，(CRC细小病毒手册)，第I&II卷(P.Tijessen编辑)；Fundamental Virology(基础病毒学)，第2版，第I&II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑)。

本发明成功展示了使用与心脏Ca²⁺稳态的关键调节物PLB互补的RNAi治疗受治疗者中的心力衰竭(HF)。合成的小干扰RNA介导RNAi，但是它们的体内使用受到在血浆中不稳定和进入靶细胞的低转移的限制。申请人已展示，腺病毒短发夹RNA载体(AdV-shRNA)沉默心肌细胞(PNCM)中的PLB，并在体内改善HF动物的血液动力学。申请人还开发了携带RNAi的向心脏的腺伴随病毒(AAV)载体，其实现了心脏功能的恢复、心脏舒张和肥大的逆转，并改善了存活。在PNCM中，苯肾上腺素诱导的肥大相关的微RNA失调被所述RNAi载体校正。除了它们对收缩功能的效应外，RNAi靶向改变微RNA水平，由此在不存在血液动力学因子或神经体液活化下直接改变细胞内转录程序。

在一种实施方案中，公开了治疗心力衰竭的方法，包括向有相应需要的受治疗者施用治疗有效量的RNAi表达盒，其中所述盒包括病毒体载体和其表达产物降低受磷蛋白(PLB)的表达和/或活性的RNAi序列，所述施用以有效转导所述受治疗者的心肌细胞的量进行，由此造成所述RNAi表达盒的表达并治疗所述受治疗者中的心力衰竭。

本发明公开了通过局部诱导的RNAi治疗心脏疾病的策略。HF仍是发达国家中死亡的主要因素。目前的药物治疗效力有限，而在晚期HF中，左心室辅助设备或心脏移植是最终的选择。虽然HF可由多种病因学引起，但是缺陷的心脏Ca²⁺稳态已被鉴定为重要的最终共同途径。衰竭的心脏的机能失调部分是由于降低的SERCA2a表达和/或PLB磷酸化造成的PLB-控制的肌质网Ca²⁺ATP酶泵(SERCA2a)的功能不良(Schmidt等人，Am J Physiol(1999)277：H474～480)。未磷酸化的PLB保持SERCA2a的低Ca²⁺亲和力，造成降低的SR Ca²⁺摄取、缓慢的松弛和降低的SR Ca²⁺负荷，而响应于β-肾上腺素能刺激的PLB磷酸化解除这一抑制(MacLennan，D.H.& Kranias，E.G.Phospholamban：a crucial regulator of cardiac contractility(受磷蛋白：心脏收缩性的关键调节物).Nature Reviews Molecular Cell Biology 4，566-77(2003))。PLB基因的种系切除(Luo等人，Circ Res(1994)75：401-409)、和显性阴性PLB突变体的体细胞基因转移(Hoshijima等人，Mature Medicine(2002)8：864-871；Iwanaga等人，J Clin Invest(2004)113：727-736)、PLB-反义-RNA(Eizema等人，Circulation(2000)101：2193-2199；He等人，Circulation(1999)100：974-980)、或细胞内抑制性PLB抗体被用于增加SERCA2a活性、收缩功能和拯救心力衰竭模型(Dieterle等人，Cardiovasc Res(2005)67：678-688；Meyer等人，FASEB J(2004)18：1312-1314；Minamisawa，S.等人，Chronic phospholamban-sarcoplasmic reticulum calcium ATPase interaction is the critical calcium cycling defect in dilated cardiomyopathy(慢性受磷蛋白-肌质网钙ATP酶相互作用是舒张性心肌病中的关键钙循环缺陷.Cell 99、313-22(1999))。心肌细胞中由化学合成的短干扰RNA(siRNA)介导的RNAi甚至在体外也显示低效力和低稳定性(Watanabe等人，J Mol Cell Cardiol(2004)37：691-698)。

合成siRNA的两个基本限制是它们在血浆和靶细胞中的快速降解，以及在体内实现足够的转移和靶向的问题。病毒载体具有克服这些限制的潜能。在本发明中，其他心脏蛋白包括Ca²⁺调控蛋白(Ca²⁺handling protein)的表达未发生改变，表明高度的靶特异性。同样地，功能表征一系列载体和它们的效力决定因素后，在严重HF的动物模型中沿传统的腺病毒载体确定了优化的细小病毒(即AAV)，并确定了RNAi治疗过程中的心肌细胞微RNA(miR)途径。因此，本文呈现的数据展示心脏功能的体内恢复以及病理性肥大和扩张的降低。

本文使用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科(Parvoviridae)，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括以下属的成员：细小病毒属(Parvovirus)、红细胞病毒属(Erythrovirus)、浓核病毒属(Densovirus)、重复病毒属(Iteravirus)和康特拉病毒属(Contravirus)。示例性自主细小病毒包括但不限于，小鼠细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫全白细胞缺乏症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、番鸭(muscovy duck)细小病毒、B19病毒和任何其他细小病毒。其他自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见，如BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒学)，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。

细小病毒科是小的单链无包膜DNA病毒科，基因组长大约5000核苷酸。该科的成员包括腺病毒(Ad)和腺伴随病毒(AAV)。腺病毒代表感染呼吸道、眼睛、肠和泌尿道的膜的一组病毒。腺病毒代表最大的无包膜病毒，因为它们是能够通过核内体运输的最大尺寸(即包膜融合不是必需的)。病毒体还具有与衣壳的每个五邻体基质有关的独特的“刺突”(spike)或纤维(fibre)，所述“刺突”或纤维有助于附着宿主细胞。AAV是依赖性细小病毒，根据定义，其需要与另一病毒(通常是腺病毒或疱疹病毒)共感染以启动和维持有生产能力的感染周期。不存在这样的辅助病毒时，AAV仍能通过受体介导的结合和内化、刺入非分裂细胞和分裂细胞的核而感染或转导靶细胞。

进入核以后，病毒脱壳并从许多不同的形式表达转基因，其中最持久的形式是环状单体。AAV将整合到稳定转导的细胞中的1-5％的细胞的基因组(Nakai等人，J.Virol.76：11343-349，2002)。转基因的表达可以是特别稳定的，在一个用AAV递送因子IX的研究中，狗模型在用该病毒进行单次直接输注后4.5年持续表达治疗水平的该蛋白。因为在辅助病毒不存在时AAV感染不产生后代病毒，所以转导的范围仅限于用AAV感染的初始细胞。这一特征使得AAV成为用于本发明的合适的基因治疗载体。此外，与逆转录病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒不同，AAV显示缺乏人类致病性和毒性(Kay等人，Nature 424：251，2003和Thomas等人，Nature Reviews，Genetics 4：346-58，2003)。

通常，AAV的基因组仅含有两个基因。“rep”基因编码DNA复制中使用的至少四种单独的蛋白。“cap”基因产物被差异剪接以产生构成病毒衣壳的三种蛋白。当将基因组包装成新生病毒时，只有反向末端重复序列(ITR)是必需的序列；rep和cap可被从基因组中缺失，并被替换为选择的异源序列。然而，为了产生复制和将基于AAV-的异源构建体包装成新生病毒体需要的蛋白，必需以反式提供rep和cap蛋白。通常由与辅助病毒诸如腺病毒或疱疹病毒共感染提供的辅助功能也可以一种或多种DNA表达质粒的形式反式提供。由于基因组通常仅编码两个基因，因此，作为递送运载体AAV的包装能力限制为4.5千碱基(kb)单链也就不足为奇。不过，虽然此尺寸限制可能限制可以被递送以替换基因治疗的基因，但是它并不有害地影响较短序列诸如RNAi的包装和表达。

AAV对于RNAi应用的功效已在使用AAV体外递送shRNA以抑制p53和半胱天冬酶8表达的实验中展示(Tomar等人，Oncogene 22：5712-15，2003)。将适当的序列克隆到空壳(gutted)AAV-2载体之后，在HEK293细胞中产生了感染性AAV病毒体，并将该病毒体用于感染HeLa S3细胞。展示了内源半胱天冬酶8和p53水平的剂量依赖性减少。Boden等人还使用AAV体外递送shRNA以抑制组织培养系统中的HIV复制(Boden等人，J.Virol.77(21)：115231-35，2003)，如通过耗尽的培养基中的p24产生所评估的。

但是，必须解决使用AAV作为用于RNAi表达构建体的运载体的技术障碍。例如，人口的不同百分比可拥有针对某些AAV血清型的中和抗体。不过，由于存在若干种AAV血清型，含有其中一些血清型的中和抗体的个体百分比大大降低，可使用其他血清型，或可采用假分型(pseudo-typing)。存在至少九种不同的已表征的血清型，还有数十种其他血清型已被分离但是描述较不充分。另一限制是由于对AAV的可能的免疫应答，基于AAV的治疗可能仅施用一次；不过，使用替代的、非人类来源的血清型可允许重复施用。施用路径、血清型和所递送的基因组的组成均影响组织特异性。

将未修改的AAV系统用于RNAi表达构建体的另一限制是转导可能是效率低下的。体内稳定转导可限于5-10％的细胞。不过，本领域已知加强稳定转导水平的不同的方法。一种方法是采用假分型，其中使用其他血清型来源的cap蛋白包装AAV-2基因组。例如，通过用AAV-5cap基因置换其AAV-2对等物，Mingozzi等人使稳定转导增加至大约15％的肝细胞(Mingozzi等人，J.Virol.76(20)：10497-502、2002)。Thomas等人使用AAV8衣壳基因体内转导了超过30％的小鼠肝细胞(Thomas等人，J.Virol.，发行中)。Grimm等人(Blood.2003-02-0495)详尽地用AAV-1、AAV-3B、AAV-4、AAV-5和AAV-6将AAV-2假分型以用于组织培养研究。转基因表达的最高水平由用AAV-6假分型的病毒体诱导；产生比AAV-2高接近2000％的转基因表达。因此，本发明包括使用假分型AAV病毒来实现高转导水平，RNAi多启动子表达构建体的表达相应增加。

如本文所用，术语“腺伴随病毒”(AAV)，包括但不限于，AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV和现在已知的任何其他AAV。参见，如BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒学)，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。最近，许多推定的新的AAV血清型和进化枝已被鉴定(参见，如Gao等人，(2004)J.Virology 78：6381-6388；Moris等人，(2004)Virology 33-：375-383)。在一种实施方案中，所述AAV是AAV9型。

AAV的各种血清型的基因组序列和自主细小病毒的基因组序列，以及末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可在文献或公共数据库诸如GenBank中找到，包括但不限于，GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；其公开内容通过引用并入本文以教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。另参见，如Srivistava等人，(1983)J.Virology 45：555；Chiorini等人，(1998)J.Virology71：6823；Chiorini等人，(1999)J.Virology 73：1309；Bantel-Schaal等人，(1999)J.Virology 73：939；Xiao等人，(1999)J.Virology 73：3994；Muramatsu等人，(1996)Virology 221：208；Shade等人，(1986)J.Virol 58：921；Gao等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：11854；Moris等人，(2004)Virology 33-：375-383；国际专利公布WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；和美国专利第6,156,303号，通过引用并入本文。

如本文所用的术语“趋向性”指病毒优先进入某些细胞或组织，任选地接着在所述细胞中表达(如转录和，任选地，翻译)病毒基因组携带的序列，如，对于重组的病毒，表达异源核苷酸序列。本领域技术人员将理解，在不存在反式作用因子时，异源核酸序列从病毒基因组的转录可能不被启动，如对于诱导型启动子或以其他方式调节的核酸序列。在rAAV基因组的情形中，病毒基因组的基因表达可来自稳定整合的原病毒、来自未整合的附加体以及病毒在细胞内可采取的任何其他形式。

如本文所用，除非另外说明，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质(包括天然存在的或非天然存在的)。

如本文所用，“分离的”多肽(如，“分离的肽”或“分离的蛋白质”)意指多肽至少部分地与天然存在的有机体或病毒的至少一些其他组分分开，所述其他组分例如，细胞或病毒结构组分或通常被发现与所述多肽缔合的其他多肽或核酸。

“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂种序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)，但在代表性实施方案中，其为单链或双链DNA序列。

如本文所用，“分离的”多核苷酸(如“分离的DNA”或“分离的RNA”)意指多核苷酸至少部分地与天然存在的有机体或病毒的至少一些其他组分分开，所述其他组分例如，细胞或病毒结构组分或通常被发现与所述多核苷酸缔合的其他多肽或核酸。

如本文所用，“分离”或“纯化”(或语法等同物)病毒载体意指使病毒载体至少部分地与起始材料中的至少一些其他组分分开。

“治疗多肽”是可缓解或减轻细胞或受治疗者中由蛋白质的缺乏或缺陷造成的症状的多肽。可选地，“治疗多肽”是以另外方式赋予受治疗者益处、如抗心律失常效应或从心力衰竭中存活的能力的改善的多肽。

“转染”用于指细胞对核酸组合物的摄取。当外源核酸组合物穿过细胞膜时，细胞即被“转染”。许多转染技术是本领域通常已知的。参见，如[69，70]，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)，Elsevier，和[71]。此类技术可用于将一种或多种核酸组合物诸如质粒载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞。该术语指遗传物质的稳定摄取和瞬时摄取两方面。对于此发明目的，“转导”是经由病毒载体的特殊“转染”形式。

“转导”表示经由病毒或病毒载体诸如经由重组的AAV病毒体，在体内、体外或活体外(ex vivo)递送核酸组合物到达、进入受体细胞或在受体细胞内。转导是转染的特殊形式，即术语转染包括术语转导。

术语“治疗”，包括其语法等同物，意指受治疗者的病症的严重度得到减轻或至少部分改善或缓解，和/或实现至少一种临床症状的某种程度的缓解、缓和或降低，和/或病症的进展有延迟，和/或阻止或延迟了疾病或疾患的发作。因此，术语“治疗”指预防性方案和治疗性方案两方面。

“异源核苷酸序列”或“异源核酸”是指不是病毒中天然存在的序列。通常，异源核酸包含感兴趣的多肽或非翻译RNA的开放阅读框(如，用于递送到细胞或受治疗者)。

如本文所用，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”指充当核酸递送运载体的病毒(如，AAV)颗粒，以及包含包装到AAV衣壳内的载体基因组(如，病毒DNA[vDNA])的病毒颗粒。可选地，在一些上下文中，术语“载体”可用于指单独的载体基因组/vDNA。

“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一种或多种异源核苷酸序列的AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体通常只需要顺式的145碱基末端重复序列(TR)来产生病毒。所有其它序列是非必须的，并可以反式提供(Muzyczka，(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158：97)。通常，rAAV载体基因组将仅保留最小TR序列以使可被载体有效包装的转基因的尺寸最大。结构和非结构蛋白质编码序列可以反式提供(如，从载体，诸如质粒，或通过将序列稳定地整合到包装的细胞中)。rAAV载体基因组包含至少一个TR序列(如，AAV TR序列)、任选地两个TR(如，两个AAV TR)，其通常在异源核苷酸序列的5′和3′端，但不需与所述异源核苷酸序列邻接。TR可以彼此相同或不同。

“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。AAV末端重复序列不需要具有野生型末端重复序列序列(如，野生型序列可通过插入、缺失、截短或错义突变而被改变)，只要该末端重复序列介导所需的功能，如复制、病毒包装、整合、和/或原病毒拯救和类似功能。

术语“末端重复序列”或“TR”包括形成发夹结构并充当反向末端重复序列的任何病毒末端重复序列和合成序列，诸如授予Samulski等人的美国专利第5,478,745号中描述的“双-D序列”。自主细小病毒和AAV的衣壳结构更详细地描述于BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒学)，第2卷，第69&70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。另参见对以下的晶体结构的描述：AAV2(Xie等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99：10405-10)、AAV4(Padron等人、(2005)J Virol.79：5047-58)、AAV5(Walters等人、(2004)J Virol.78：3361-71)和CPV(Xie等人，(1996)J Mol.Biol.6：497-520和Tsao等人、(1991)Science 251：1456-64)。“AAV小基因”指至少包含AAV ITR和异源核酸组合物的构建体。对于根据本发明的rAAV产生，小基因可被携带在任何适合的载体包括病毒载体、质粒载体和类似载体上。

本发明的病毒载体还可以是如国际专利公布WO 00/28004和Chao等人，(2000)Molecular Therapy 2：619中所述的“靶向”病毒载体(如，具有定向的趋向性)和/或“杂种”细小病毒(即，其中rAAV基因组和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。

本发明的病毒载体还可以是如国际专利申请公布第WO 01/92551号中所述的双链体细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，可将双链(双链体)基因组包装到本发明的病毒衣壳中。

此外，病毒衣壳或基因组可含有其它修饰，包括插入、缺失和/或置换。

因此，如本文所用，术语“病毒载体”涵盖细小病毒和AAV的杂种、靶向和双链体病毒颗粒，以及其他修饰形式。

如本文所用，术语“脊椎动物”涵盖哺乳动物、禽类物种、鱼或爬行动物。例如，脊椎动物可以是哺乳动物。术语“哺乳动物”包括人类和非人灵长类、农畜类动物(如绵羊、牛、山羊、猪、驴、马)、实验室测试动物(如大鼠、小鼠、兔、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(如狗、猫)或捕获的野生动物。哺乳动物包括但不限于、人类和鼠科哺乳动物。

本发明部分是基于应用促进经由RNAi的基因沉默的试剂下调或沉默一种或多种转录活性基因区域作为治疗心力衰竭的方法，所述转录活性基因区域与心脏细胞中的钙流量调节直接或间接相关。在一种实施方案中，公开了治疗心力衰竭的方法，包括向有相应需要的受治疗者施用治疗有效量的RNAi表达盒，其中所述盒包括病毒体载体和其表达产物降低受磷蛋白(PLB)mRNA的表达的RNAi序列，所述施用以有效转导所述受治疗者的心肌细胞的量进行，由此造成所述RNAi表达盒的表达并治疗所述受治疗者中的心力衰竭。

术语“RNA干扰”通常指双链RNA分子改变与双链或短发夹分子具有大致的或完全的同源性的核酸序列的表达的过程。虽然不受理论束缚，作用的机制可包括但不限于，PLB基因的表达的直接或间接下调，PLBmRNA的减少，和/或PLB活性的降低。术语“RNAi”指引发RNA干扰并从载体转录的RNA序列。术语“短发夹RNA”或“shRNA”指具有双链体区域和环状区域的RNA结构。该术语还应被理解为特别包括具有茎-环或锅柄样二级结构的RNA分子。在本发明的一些实施方案中，RNAi最初被表达为shRNA。

术语“RNAi表达盒”指根据本发明的实施方案具有至少一个[启动子-RNAi-终止子]单元的盒。术语“多启动子RNAi表达盒”指包含两个或多个[启动子-RNAi-终止子]单元的RNAi表达盒。术语“RNAi表达构建体”或“RNAi表达载体”指含有至少一个RNAi表达盒的载体。

RNAi通常通过靶和RNAi之间的相同序列优化。RNA干扰现象可在低于100％同源性下观察到，但是互补区域必须彼此足够同源以形成特异性双链区域。尚未完全鉴定得到有效造成RNA干扰的双链区域的精确结构规则，但是大约70％的同一性通常是足够的。因此，在本发明的一些实施方案中，RNAi和PLB之间的同源性是至少70％核苷酸序列同一性，并且可以是至少75％核苷酸序列同一性。同源性包括但不限于，至少80％核苷酸序列同一性，和至少85％或甚至90％核苷酸序列同一性。在一种实施方案中，靶序列和RNAi的有义链之间的序列同源性是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性。

另一考虑因素是RNA中的碱基配对与DNA中的略有不同，即在RNA双链体中G将与U配对，虽然不如与C的强烈。而且，对于RNAi效力，反义链与靶序列同源更为重要。在一些情况中，已知21个核苷酸中有17个同源足以启动RNAi，但在其他情况中，需要21个核苷酸中有19或20个核苷酸具有同一性。虽然不受理论束缚，在通常的水平，双链区域的中央部分比其末端需要更大同源性。在仅寻求一定程度的沉默的情况中，可向特定构建体中设计入完美同源性的某种预定程度的缺乏，以降低其RNAi活性，这将造成靶基因产物的部分沉默或抑制。在此类情形中，反义序列中仅有一个或两个碱基可被改变。另一方面，有义链对突变更具耐受性。虽然不受理论束缚，这可能是因为反义链是具有催化活性的那个。因此，有义链和靶基因的区域的转录物之间较低的同一性未必会降低RNAi活性，特别是当反义链与该转录物完美杂交时。有义链中的突变(从而使它与靶基因的区域的转录物不同)可用于辅助发夹构建体的测序并可能用于其它目的，诸如调节发夹转录物的切酶(dicer)加工或RNAi途径的其他方面。

术语“杂交”和“退火”，包括其语法等同物，在本说明书中涉及核苷酸序列时可互换使用，并指由于其互补性而能够形成Watson-Crick碱基对的核苷酸序列。本领域技术人员将理解，非Watson-Crick碱基配对也是可能的，尤其是在RNA序列环境中。例如，在RNA中的鸟嘌呤核苷和尿嘧啶残基之间可形成所谓的“摆动配对”。

RNAi表达盒的RNA表达产物导致双链RNA(dsRNA)复合体的产生以诱导RNA干扰并由此下调或降低哺乳动物基因的表达。“dsRNA”指包含两条Watson-Crick碱基配对的互补RNA链的核糖核酸复合体。dsRNA复合体包含在严格条件下，包括在65℃的0.2x SSC清洗步骤，与至少一个哺乳动物基因的核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列和与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列可通过第三核苷酸序列(如RNA环)与所述第二核苷酸序列连接，从而使所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列成为同一RNA分子的部分；可选地，第一核苷酸序列可以是一个RNA分子的部分，而第二核苷酸序列可以是另一RNA分子的部分。因此，dsRNA复合体可通过分子内杂交或退火形成，或者ds RNA复合体通过分子间杂交或退火形成。

“互补”在本文以其通用方式使用以指Watson-Crick碱基配对，而“非互补”用于指非Watson-Crick碱基配对，即使此类非互补序列可形成摆动配对或其他相互作用。然而，在本发明的上下文中，“非配对”序列的含义具体地指其间不形成Watson-Crick碱基对的序列。因此，根据本发明的间隔或鼓泡(bubble)序列的实施方案在本文被描述和阐明为非配对序列，无论理论上或实际上是否可发生Watson-Crick碱基配对。

用于描述两个或多个多核苷酸之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“大致相似的”和“大致同一性”。“参考序列”长度为至少10个但常常15至25个、经常大于25或以上诸如30个单体单元，包括核苷酸。因为两个多核苷酸可各自包含(1)在所述两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅为完整多核苷酸序列的一部分)和(2)在所述两个多核苷酸之间差异的序列，所以两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗”比较两个多核苷酸以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较窗”指与参考序列进行比较通常至少约10连续残基的概念区段。与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可包含约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以最优地比较两个序列。用于对比较窗进行比对的序列的最优比对可通过算法的计算机化实现来实施(如，Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，Wis，USA)或通过目测和由选择的多种算法中的任何算法产生的最佳比对(即，在比较窗上产生最高同源性百分比)来实施。也可参考BLAST程序家族，如，例如由Altschul等人所公开的。序列分析的详细讨论可在Ausubel等人的单元19.3中找到。例如，“序列同一性百分比”可通过以下来计算：在比较窗上比较两个最优比对的序列，确定两个序列中出现相同核酸碱基(如，A、T、C、G、I)的位置的数目以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即，窗尺寸)，将结果乘以100以产生序列同一性百分比。对于本发明目的，“序列同一性”将被理解为意指通过DNASIS计算机程序(用于windows的版本2.5；可获自Hitachi Software engineering Co，Ltd，South San Francisco、Calif，USA)，使用软件随附的参考手册中使用的标准默认值计算的“匹配百分比”。

可选地，多核苷酸的同源性/同一性可通过杂交实验确定。如本文所用，认为第一核酸序列或片段(诸如例如，引物或探针)与第二核酸序列选择性杂交，因此，如果在以下条件下，此第二序列能够与所述第一序列或变体特异性杂交或能够特异性引发聚合酶链式反应，即表明“大致同源性”：(i)在典型的杂交和清洗条件下，诸如，例如在Maniatis，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第2版，1989)中描述的那些，其中杂交条件可以是具有更低严格性或更高严格性的那些；或(ii)使用允许至多约25-30％碱基对错配的严格清洗条件，例如，在2x SSC、0.1％SDS、室温下清洗两次，每次30分钟；然后，在2x SSC、0.1％SDS、37℃下清洗一次30分钟；在2x SSC、室温下清洗两次，每次10分钟，或(iii)在标准PCR条件下或在“降落(touch-down)”PCR条件下。

如本文所用的术语“杂交条件”将指允许广义地核酸的两条互补链之间和特别地具有至少七个核苷酸长度的RNA的两条互补链之间杂交的条件。杂交条件是本领域公知的，包括但不限于，生理条件，诸如但不限于胞内生理条件。

本发明的RNAi可包含在正常的哺乳动物细胞中无毒的短的、双链或部分双链(如，锅柄、茎-环和发夹)RNA。对本发明的RNAi的长度没有特别限制，只要它们不显示细胞毒性。RNAi可以是，例如，约10至71bp长、约15至49bp长、约15至35bp长和约19至29bp长或约19至21bp长。RNAi的双链RNA部分可以是完全同源的，或可由于序列错配(每条链上的对应核苷酸不互补)、凸出(一条链上缺乏对应的互补核苷酸)和类似原因而含有非配对的部分。在非配对的部分不显著干扰RNAi双链体形成或效力的程度，此类非配对的部分可被耐受。

“siRNA”或短干扰RNA可通过本领域已知的方法诸如通过典型的寡核苷酸合成来制造，并且经常包括化学修饰以增加siRNA的半衰期和/或效力、和/或以允许更强的递送制剂。寡核苷酸的许多修饰是本领域已知的。例如，美国专利第6,620,805号公开了与具有净正电荷的大环诸如卟啉化合的寡核苷酸；美国专利第6,673,611号公开了各种式；美国专利申请公布第2004/0171570、2004/0171032和2004/0171031号公开包括包含多环糖代用品的修饰的寡聚体；诸如环丁基核苷、环戊基核苷、脯氨酸核苷、环己烯核苷、己糖核苷或环己烷核苷；和包括不含磷的核苷间连接的寡聚体；美国专利申请公布第2004/0171579号公开了其中修饰为糖部分上的2’组成基团不是H或OH的修饰寡核苷酸；美国专利申请公布第2004/0171030号公开了用于结合相反链上的胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶碱基的修饰碱基，该相反链包含具有选自由以下组成的组的含硼取代基的膨化的C和U或T修饰的结合碱基：-BH₂CN、-BH₃和-BH₂COOR，其中R是C1至C18烷基；美国专利申请公布第2004/0161844号公开了具有氨基磷酸酯核苷间连接诸如3′氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯或氨基烷基硫代氨基磷酸酯核苷间连接的寡核苷酸；美国专利申请公布第2004/0161844号公开了其它修饰的糖和/或主链修饰，其中在一些实施方案中，所述修饰是肽核酸、肽核酸模拟物、吗啉代核酸、具有酰胺连接的己糖、环己烯基核酸(CeNA)或无环主链部分；美国专利申请公布第2004/0161777号公开了具有3′末端帽基团的寡核苷酸；美国专利申请公布第2004/0147470号公开了包括一种或多种交联的寡聚化合物，所述交联改善所述寡聚化合物的核酸酶抗性，或者修改或增强所述寡聚化合物的药物动力学性质和药效学性质，其中此类交联包含二硫化物、酰胺、胺、肟、羟基胺、氧亚胺(oxyimine)、吗啉代、硫醚、脲、硫脲或磺酰胺部分；美国专利申请公布第2004/0147023号公开了包含具有第一类型的核苷酸的两个末端RNA区段和具有第二类型的核苷酸的内部RNA区段的gapmer，其中所述第一类型的核苷酸独立地包括至少一个糖取代基，其中所述糖取代基包含卤素、氨基、三氟烷基、三氟烷氧基、叠氮基、氨基氧、烷基、烯基、炔基、O--、S--或N(R^*)-烷基；O--、S--或N(R^*)-烯基；O--、S--或N(R^*)-炔基；O--、S--或N-芳基、O--、S--或N(R^*)-芳烷基基团；其中所述烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基可以是取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基；并且其中，如果取代，所述取代是烷氧基、硫代烷氧基、酞酰亚胺基、卤素、氨基、酮、羧基、硝基、亚硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑基、叠氮基、肼基、氨基氧、异氰酸基、亚砜、砜、二硫化物、甲硅烷基、杂环或碳环基团或嵌入剂、报告基团、轭合物、聚胺、聚酰胺、聚亚烷基二醇或式(--O-烷基)_m的聚醚，其中m是1至约10；和R^*是氢、或保护基团；或美国专利申请公布第2004/0147022号公开了具有修饰的糖和/或主链修饰的寡核苷酸，诸如糖部分上的2′-OCH₃取代基。

因此，在一方面，本发明公开了用于治疗心力衰竭的方法，包括向有相应需要的受治疗者施用治疗有效量的RNAi表达盒，其中所述盒包括病毒体载体和其表达产物降低受磷蛋白(PLB)mRNA的表达的RNAi序列，所述施用以有效转导所述受治疗者的心肌细胞的量进行，由此造成所述RNAi表达盒的表达并治疗所述受治疗者中的心力衰竭。

“启动子”或“启动子序列”在本文取其最广泛背景下的含义，并包括能够在细胞中结合RNA聚合酶和启动转录多核苷酸或多肽编码序列的DNA调节区域，所述编码序列诸如信使RNA、核糖体RNA、小核核仁RNA(small nuclear of nucleolar RNA)或由任何RNA聚合酶的任何类型转录的任何种类的RNA。本文预期的“启动子”还可包括经典基因组基因的转录调节序列，包括真核细胞中精确的转录起始所需的TATA框，含或不含CCAAT框序列和其它的调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。

启动子通常，但不是必须地，位于其所调节的序列的上游或5′。而且，包含启动子的调节元件通常位于要被调节的序列的转录起始位点的2kb以内。

在本发明背景中，术语“启动子”还用于描述赋予、激活或增强分离的核酸分子在哺乳动物细胞中的表达的合成或融合分子或衍生物。还可需要另一或同一启动子以在植物、动物、昆虫、真菌、酵母或细菌细胞中行使功能。启动子可含有进一步增强结构基因的表达的一种或多种特异性调节元件的另外拷贝，其转而调节和/或改变基因的空间表达和/或时间表达。例如，赋予结构基因的表达的可诱导性的调节元件可被置于与驱动核酸分子的表达的异源启动子序列相邻。

将序列置于启动子序列的调节控制下意指放置所述分子以使得表达受到启动子序列的控制。启动子通常被放置在它们控制的基因的5′(上游)。在构建异源启动子/结构基因组合中，通常启动子位置距基因转录起始位点的距离可以与启动子和它在其天然背景下控制的基因，即启动子衍生自的基因，之间的距离大约相同。如本领域已知的，可调整此距离的一些变化而不丧失启动子功能。相似地，调节序列元件相对于置于其控制下的异源基因的位置由该元件在其天然背景，即其所衍生自的基因的位置确定。同样，如本领域已知的，此距离也可发生一些变化。

启动子可组成地调节序列的表达，或就表达发生的细胞、组织或器官而言差异地调节序列的表达，或就表达发生的发育阶段而言差异地调节序列的表达，或响应于诸如生理应激、调节蛋白质、激素、病原体或金属离子以及其它的刺激而差异地调节序列的表达。

在本发明的一些实施方案中有用的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”在应用于启动子时指能够指导感兴趣的核苷酸序列在特定类型的组织(如，肌肉组织)中的选择性表达，而相对不存在感兴趣的相同核苷酸序列在不同类型的组织(如，心脏)中的表达的启动子。术语“细胞特异性”在应用于启动子时指能够指导感兴趣的核苷酸序列在特定类型的细胞中的选择性表达，而相对不存在感兴趣的相同核苷酸序列在相同组织的不同类型的细胞中的表达的启动子(参见，如Higashibata等人，J.Bone Miner.Res.19(1)：78-88，2004；Hoggatt等人，Circ.Res.91(12)：1151-59，2002；Sohal等人，Circ.Res.89(1)：20-25，2001；和Zhang等人，Genome Res.14(1)：79-89、2004)。术语“细胞特异性”在应用于启动子时还意指启动子能够促进感兴趣的核苷酸序列在单个组织内的区域中的选择性表达。可选地，启动子可以是组成型的或可调节的。另外，启动子可被修改以便拥有不同的特异性。

术语“组成型”在用于提及启动子时意指启动子能够在不存在特异刺激(如，热激、化学物、光和类似刺激)下指导可操作地连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够指导编码序列在几乎任何细胞和任何组织中的表达。用于转录RNAi的启动子可以是组成型启动子，诸如RNA聚合酶II控制的泛素、CMV、β-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1α或pgk基因启动子，或RNA聚合酶I控制的启动子元件。在其它实施方案中，采用Pol II启动子，诸如CMV、SV40、U1、β-肌动蛋白或杂种Pol II启动子。在其它实施方案中，使用RNA聚合酶III控制的启动子元件，诸如U6启动子(如，U6-1、U6-8、U6-9)、H1启动子、7SL启动子、人类Y启动子(hY1、hY3、hY4(参见Maraia等人，Nucleic Acids Res 22(15)：3045-52，1994)和hY5(参见Maraia等人，Nucleic Acids Res 24(18)：3552-59，1994)、人类MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人类tRNA启动子、5s核糖体RNA启动子以及这些启动子中任何启动子的功能杂种和组合。

可选地，在一些实施方案中，选择允许RNAi的可诱导表达的启动子可能是最优的。使用此类启动子的可诱导表达的许多系统是本领域已知的，包括但不限于四环素响应系统和lac操纵子-阻遏物系统(参见WO03/022052 A1；和US 2002/0162126 A1)、蜕化素调节系统或受糖皮质激素、孕酮、雌激素、RU-486、类固醇、甲状腺激素、环式AMP、细胞因子、钙化醇家族调节物调节的启动子或金属硫蛋白启动子(受无机金属调节)。

一种或多种增强子也可存在于病毒多启动子RNAi表达构建体以增加感兴趣的基因的表达。适合用于本发明的实施方案的增强子包括Apo EHCR增强子、最近已描述的CMV增强子(参见，Xia等人，Nucleic Acids Res 31-17，2003)和本领域技术人员已知的其他增强子。

在本发明中，启动子可以能够调节核酸分子在哺乳动物细胞中的表达，至少在靶基因在其中表达期间，以及在靶基因在所述细胞中的可检测的表达即将开始之前。启动子可以是组成型的、诱导型的或发育调节的。

在本发明上下文中，术语“与…可操作地连接”或“可操作地处于…的控制下”或相似的诸如“可操作地连接于”将被视为表明细胞中结构基因的表达处于与其空间连接的启动子序列的控制下。

在一些实施方案中，可在RNAi表达盒内或包含多个RNAi表达盒的RNAi表达载体的不同盒之间采用不同强度的启动子。例如，使用两个或更多个强启动子(诸如Pol III-型启动子)可通过，如耗尽可利用的核苷酸库或转录所需的其它细胞组分，而使细胞承受重负。此外或可选地，使用数个强启动子可造成细胞中毒性水平的RNAi表达。因此，在一些实施方案中，多启动子RNAi表达盒中的一个或多个启动子可以比盒中的其它启动子更弱，或盒中的所有启动子可以低于最大速率的速率表达RNAi。启动子还可以或可以不使用分子技术或以其他方式如通过调节元件进行修改以实现较弱的转录水平。

载体还可含有其它的基因元件。载体中可包括的元件的类型不受任何形式的限制，并可由本领域技术人员选择。例如，其他基因元件可包括报告基因，诸如一个或多个以下基因：荧光标记蛋白诸如GFP或RFP；容易测定的酶诸如β-半乳糖苷酶、萤光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胚胎碱性磷酸酶；或易于进行免疫测定的蛋白质诸如激素或细胞因子。可用于本发明的实施方案的其它基因元件包括编码赋予细胞选择性生长优势的蛋白质诸如腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、药物抗性的那些基因，或编码提供营养缺陷型中缺失的生物合成能力的蛋白质的那些基因。如果RNAi表达盒中包括了报告基因，则可包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。其它的基因元件可与独立的启动子/增强子可操作地连接并受其控制。此外，可采用用于在细菌中繁殖载体的合适的复制起点。复制起点的序列通常与RNAi和将在靶细胞、组织和/或器官中表达的其它基因序列隔开。此类复制起点是本领域已知的，并包括pUC、ColE1、2-微米或SV40复制起点。

本文描述的载体或其部分还可进行修改以整合到表达其的细胞的基因组。本领域技术人员将理解，为了实现基因序列或表达盒与宿主细胞基因组的整合，可能需要某些其它的基因序列。

在一种实施方案中，所述载体的效应是降低PLB的功能表达而不显著降低PLB的转录水平。可选地或此外，包括合成基因的基因构建体不造成总RNA的稳态水平的显著下降。

因此，在另一方面，本发明包括以下RNAi表达载体，其中所述RNAi表达载体包含如本文所定义的一个或多个RNAi表达盒。

本发明的RNAi造成或以其它方式促进靶转录物翻译成表达产物的改变的翻译能力。虽然表达产物通常是蛋白质，但是本发明进一步包括参与基因调节的转录的非编码RNA、eRNA或从转录物中剪接下来的内含子形式的表达产物。

“改变的能力”的含义包括但不限于相对于未进行遗传修饰的细胞的翻译水平的下降，诸如约10％至约100％和约20％至约90％。在一种实施方案中，对应于靶内源序列的基因基本上没有被翻译为蛋白质产物。方便地，改变的翻译能力通过表型的任何变化确定，其中在未进行遗传修饰的细胞中，所述表型由编码PLB的基因的表达促成。携带本发明的遗传因子的任何细胞被称为是“遗传修饰的”。遗传修饰可以是永久的或瞬时的。瞬时的遗传修饰发生于，例如，当细胞摄取遗传因子并允许产生其转录物时。可选地，该遗传因子直接降低翻译的水平，诸如通过施用反义寡核苷酸或更大的核酸分子。在任一种情况下，该分子促进基因沉默机制，该机制可随着细胞分裂被移除。永久的基因沉默更可能发生于当该遗传因子整合到细胞的基因组并且该因子被传递给子代细胞时。

可使用标准方法将RNAi或RNAi表达构建体施用至细胞、组织或器官，目的是调节靶基因的表达。施用的有用方法包括脂质体介导的转染或转化、用减毒的病毒颗粒或细菌细胞转化细胞、细胞接合、本领域技术人员已知的或由Ausubel等人(1992)描述的转化或转染程序。例如，核酸分子可以作为裸DNA或RNA、任选地封装在脂质体中、在作为减毒病毒的病毒颗粒中或以与病毒外壳或运输蛋白质或惰性载运体诸如金缔合的形式或作为重组的病毒载体或细菌载体或作为构建体、以及其它形式引入。

在一种实施方案中，可使用基于任何合适的病毒的病毒递送系统来递送本发明的RNAi表达构建体。此外，杂种病毒系统也可能是有用的。病毒递送系统的选择将取决于多种参数，诸如递送至心肌细胞或其它靶组织的效率、系统的转导效率、致病能力、免疫和毒性考虑因素和类似参数。显然不存在适于所有应用的单一病毒系统。当选择用于本发明的病毒递送系统时，重要的是选择其中含有RNAi表达构建体的病毒颗粒具有以下性质的系统：1)重复和稳定地繁殖；2)能够纯化至高滴度；和3)能够介导靶向递送(将多启动子RNAi表达构建体递送至靶组织(如，心肌细胞)而不广泛传染)。

此外，可使用杂种病毒系统以组合两种或更多种病毒系统的有用性质。例如，野生型AAV的位点特异性整合机制可与腺病毒的有效内化和核靶向性质偶联。AAV在腺病毒或疱疹病毒存在下经历生产复制周期；然而，在不存在辅助功能时，AAV基因组整合到染色体19的特异性位点。AAV基因组的整合需要AAV rep蛋白质的表达。因为常规的rAAV载体缺失了包括rep在内的所有基因，所以它们不能特异性地整合到染色体19。但是，在合适的杂种系统中可利用这一特征。另外，可在病毒递送系统中使用非病毒基因元件以实现期望的性质，诸如允许位点特异性重组的基因元件。

将RNAi表达构建体包装到病毒颗粒中。可使用本领域已知的任何方法来产生感染性病毒颗粒，其基因组包含病毒RNAi表达构建体的拷贝。包装细胞系可以是能够表达病毒蛋白质的任何细胞系，包括但不限于293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、Cf2Th或本领域技术人员已知或开发的任何其它系。一种包装细胞系描述于，例如美国专利第6,218,181号，通过引用并入本文。

可选地，可将未稳定表达必需的病毒蛋白质的细胞系用两种或更多种构建体共转染以实现有效的功能颗粒产生。一种构建体包含病毒RNAi表达盒，而其它的质粒包含编码允许细胞产生功能病毒(复制和包装构建体)以及其它辅助功能的蛋白质的核酸。

包装细胞系或复制和包装构建体可不表达包膜基因产物。在这样的实施方案中，编码包膜基因的基因可在与病毒RNAi表达构建体共转染的单独的构建体上提供。因为包膜蛋白质部分负责病毒颗粒的宿主范围，病毒可以被假分型。“假分型的”病毒是具有来自与基因组所衍生自的病毒不同的病毒的包膜蛋白质的病毒颗粒。本领域技术人员可针对使用的病毒递送系统和要靶向的细胞而选择适当的假型。除了赋予特异的宿主范围外，选择的假型可允许病毒被浓缩至非常高的滴度。可选地，可用将感染限制于特定物种的亲嗜性包膜蛋白质(如，亲嗜性包膜仅允许感染例如鼠细胞，而双嗜性包膜允许感染如人类和鼠细胞两者)假分型病毒。另外，遗传修饰的配体可用于细胞特异性靶向，诸如去唾液酸糖蛋白用于肝细胞，或转铁蛋白用于受体介导的结合。

在包装细胞系中产生之后，纯化并定量(滴定)含有RNAi表达盒的病毒颗粒。纯化策略包括但不限于密度梯度离心或柱层析方法。

本文公开的RNAi或RNAi表达盒可通过经由但不限于注射或灌注应用于心脏而引入到心肌细胞。

在一种实施方案中，可在体外或活体外将RNAi表达盒引入靶细胞，然后接着置于动物内以实现治疗，或可通过体内施用将RNAi表达盒直接施用于有机体、器官或细胞。通过病毒感染递送可以是一种递送方法。可使用任何方便的方案将包含盒的载体施用于哺乳动物宿主，其中许多不同的此类方案是本领域已知的。

通过使AAV载体溶解、悬浮或乳化在适当的、药学可接受的载运体或稀释剂中，可将它们配置成用于注射或施用的制品。此类药学可接受的载运体或稀释剂的实例包括含水或不含水的溶剂诸如油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇；并且，如果需要，含有常规的添加剂诸如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

在一种实施方案中，公开了包括重组的腺伴随病毒(AAV)载体和药学可接受的载运体的药物组合物，其中所述载体包括RNAi表达盒，其RNA表达产物导致细胞中受磷蛋白(PLB)mRNA的表达的下降和PLB蛋白质的量的下降，并且其中所述RNAi表达盒的RNA表达产物包括在严格条件下与PLB基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在一方面，RNAi表达盒包括核苷酸序列5′GGATCCCGTACCTTACTCGCTCGGCTATTCAAGAGATAGCCGAGCGAGTAAGGTATTTTTTGGAAAAGCTT 3′(SEQ ID NO：1)。在另一方面，RNA表达产物包括靶序列5′UACCUUACUCGCUCGGCUA 3′(SEQ ID NO：2)。

在又一方面，本发明考虑了包括RNAi表达构建体的药物组合物，其中所述RNAi构建体包括各自包含RNAi靶向序列的一种或多种RNAi表达盒，所述RNAi靶向序列包括与包括PLB或其衍生物、直系同源物或同源物的核苷酸序列的至少部分具有至少70％同一性的核苷酸序列。

本发明的方法和组合物涉及施用有效量的RNAi或RNAi盒以实现预定的或期望的基因表达调节结果。这通常是在表型上测量的。设想在一些情况下，一定程度的常规试验和误差，如药学领域公知的，可能是确定施用的最有效的量所必需的。

“遗传治疗”在本文的含义包括基因治疗。本发明预期的遗传治疗还包括体细胞基因治疗，由此细胞被取出、进行遗传修饰然后再放回个体中。基因治疗可以是瞬时的或永久的。优选地，所述动物是人类。

在另一方面，本发明还扩展至包含如本文所述的ddRNAi表达盒或基因组整合形式或其部分的遗传修饰的细胞。在一方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在相关的方面，所述细胞是灵长类动物细胞或啮齿动物细胞，并可包括人类或小鼠细胞。

还公开了含有在用于施用的合适药物悬浮液中的AAV载体的药物试剂盒。在这一方面，本发明提供用于递送所述重组的腺伴随病毒载体或病毒体的药物试剂盒。所述试剂盒可含有用于施用预定剂量的容器。所述试剂盒还可含有用于递送预定剂量的含有基因转移载体或病毒体的悬浮液，所述悬浮液包含(a)包含RNAi表达盒的AAV基因转移载体或病毒体(b)生理学相容的载运体。

本发明还提供编码能够形成双链RNA复合体并因此能够诱导RNA干扰的RNA分子的RNAi表达盒。此类RNAi表达盒可以是作为rAAV基因组的部分的单一DNA分子，该DNA分子在被引入细胞中时产生能够形成分子内dsRNA复合体的单一RNA分子。然而，应理解，根据下列描述，可同时或顺序向细胞中引入多于一个rAAV基因组或RNAi表达盒或RNA编码区以产生能够形成分子内dsRNA复合体的两个或更多个RNA分子。通常，能够形成无论是分子内或分子间dsRNA复合体的两个RNA部分是其表达要被下调或降低的基因或核酸序列的至少部分正义序列和至少部分反义序列。

RNAi表达盒的设计不限制本发明的范围。可应用设计RNAi表达盒的不同策略，并且基于不同设计的RNAi表达盒将能够在体内诱导RNA干扰。所有RNAi表达盒共同的特征是它们包含编码能够通过形成分子内或分子间双链RNA复合体而单独或与另一RNA分子组合来诱导RNA干扰的RNA分子的RNA编码区。

可使用不同的设计原理来实现相同的目标，这些设计原理是本领域技术人员已知的。例如，RNAi表达盒可编码一种或多种RNA分子。在RNA从RNAi表达盒表达过程中或之后，可由单一的、自互补的RNA分子或两个互补RNA分子形成双链RNA复合体。dsRNA复合体的形成可在细胞核内或细胞核外启动。

在一方面，提供了双链RNA复合体，其包含能够在生理条件下与mRNA分子的至少一部分杂交的第一RNA部分，和第二RNA部分，其中所述第二RNA部分的至少一部分能够在生理条件下与所述第一部分杂交。在一方面，所述第一部分和第二部分是同一RNA分子的部分，并且能够在生理条件诸如细胞内存在的条件下杂交，杂交后，所述第一部分和第二部分形成双链RNA复合体。

在另一方面，提供形成双链RNA复合体的线性RNA分子，该RNA包含能够与细胞内mRNA分子的至少一部分杂交的第一部分，和第二部分，其中所述第二部分的至少一部分能够与所述第一部分杂交以形成发夹dsRNA复合体。

在又一方面，所述方法包括具有部分或完全体内双链性状的AAV-介导的RNA的表达。

在某些实施方案，本发明可采用含有核酶的RNA分子以产生dsRNA复合体，由此克服与产生dsRNA相关的某些已知的困难。例如，可使用核酶功能来移除聚腺苷酸化信号，由此阻止或最小化RNA分子从细胞核的释放。在其他实施方案中，本发明是基于RNA分子的部分编码增强dsRNA的比活性的RNA或蛋白质的能力。RNA分子的此比活性增强部分的一个实例是抑制细胞内dsRNA复合体降解的编码HIV Tat蛋白质的分子的部分。

本发明还提供通过抑制受治疗者心脏中的PLB表达治疗受治疗者中的心力衰竭、或降低室性心律失常、或增加心力衰竭后的受治疗者存活的方法，包括向所述受治疗者施用治疗有效量的包含rAAV病毒体的药物组合物，所述rAAV病毒体包含编码能够形成dsRNA复合体的至少一个RNA分子的一种或多种RNAi表达盒，其中在杂交条件下，所述dsRNA复合体的部分能够与PLB基因编码的mRNA的至少一部分杂交。

在另一实施方案中，公开了增加肌质网(SR)的钙摄取的方法，包括使肌肉组织样品与腺伴随病毒(AAV)载体接触，其中所述载体包括编码RNAi表达产物的多核苷酸序列，其中所述RNAi包括在严格条件下与PLB靶基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，由此增加SR中的钙摄取。

对于本发明目的，“哺乳动物受治疗者”意指哺乳动物类别的任何成员，包括但不限于人类和非人灵长类诸如黑猩猩以及其他猿和猴类物种；农畜诸如牛、绵羊、动物、山羊和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔和豚鼠以及类似动物。该术语不指明具体年龄或性别。因此，成年和新生受治疗者以及胎儿，无论是雄性或雌性，均意欲涵盖在内。

对于本发明目的，如本文所用的术语“个体”或“受治疗者”或“患者”指脊椎动物，特别是哺乳动物物种的成员，包括但不限于家养动物、体育动物(sports animal)、灵长类和人类；更特别地，该术语指人类。

本发明的病毒体可悬浮在药学可接受的递送运载体(即生理相容的载运体)中以施用于人类或非人类哺乳动物患者。合适的载运体可由本领域技术人员容易地选择，并可取决于选择的核酸转移载体的性质。药物组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的dsRNA复合体。药物组合物还将含有药学可接受的赋形剂。此类赋形剂包括自身不诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答并且其施用不造成过多毒性的任何药剂。药学可接受的赋形剂包括但不限于，液体诸如水、盐水、甘油和乙醇。其中可包括药学可接受的盐，例如矿物酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐和类似矿物酸盐；和有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、安息香酸盐和类似有机酸盐。另外，此类运载体中可存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和类似辅助物质。其他示例性载运体包括乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载运体的选择不是本发明的限制因素。任选地，本发明的组合物可在AAV病毒体和运载体之外含有其它常规的药物成分，诸如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯80、苯乙醇、氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、甘油、苯酚、对氯酚、明胶和白蛋白。药学可接受的赋形剂的详尽讨论可在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿药物科学)(Mack Pub.Co，NJ.1991)中获得。

可重建的递送系统的溶液、悬浮液和粉末包括运载体，诸如悬浮剂(如树胶类、黄原胶类(zanthans)、纤维素类和糖类)、湿润剂(如山梨醇)、助溶剂(如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性剂(如硫酸月桂酯钠、司盘(Spans)、吐温和十六烷基吡啶)、防腐剂和抗氧化剂(如对羟基苯甲酸酯类、维生素E和C、以及抗坏血酸)、抗结块剂、包衣剂和螯合剂(如EDTA)。

在此发明中，施用本发明药物组合物可使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任何方法和递送系统来实现或执行。施用可例如静脉内、口服、经由植入物、跨黏膜、经皮、肌肉内和皮下进行。组合物可适于静脉内施用、动脉内施用、心室内施用或心瓣膜灌注。此外，本发明药物组合物理想地含有一种或多种常规使用的药学可接受的载运体。此类载运体是本领域技术人员公知的。采用多种常规使用的载运体的下列递送系统仅是设想用于施用本发明组合物的许多实施方案的代表性实施方案。

可注射药物递送系统包括溶液、悬浮液、凝胶、微球和聚合物注射剂(polymeric injectables)，并可包含赋形剂诸如改变溶解性剂(如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(如聚己内酯(polycaprylactone)和PLGA)。可植入系统包括棒(rod)和盘(disc)，并可含有赋形剂诸如PLGA和聚己内酯。

确定本发明药物组合物的治疗或预防有效量可基于使用常规计算方法的动物数据进行。适当的剂量将取决于不限于以下的因素：选择的转移载体的特异性，施用路径，受治疗的哺乳动物(如人类或非人灵长类或其它哺乳动物)，所治疗的受治疗者的年龄、体重和一般状况，治疗的疾患的严重度、治疗的区域在心脏内的位置和施用模式。因此，适当的剂量可根据患者不同而变化。适当的有效量可由本领域技术人员容易地确定。

用于根据本发明的所述载体的体内递送的治疗有效的人类剂量认为是在约20至约50ml盐水溶液中含有约10¹⁰至10¹⁴功能载体/ml溶液的浓度范围。将调整剂量以平衡针对任何副作用的治疗益处。在又一实施方案中，药学有效的AAV剂量通常在约1x10⁵至1x10⁵⁰基因组rAAV、约10⁸至10²⁰基因组AAV、约10¹⁰至约10¹⁶基因组或约10¹¹至10¹⁶基因组AAV的浓度范围内。人类剂量可以是约1x10¹³AAV基因组AAV。此类浓度可在约0.001ml至100ml、0.05至50ml或10至25ml载运体溶液中递送。其它有效剂量可由本领域普通技术人员通过常规试验建立剂量响应曲线而容易地建立。

剂量治疗可以是单一剂量方案或多剂量方案。而且，受治疗者可接受适当的多剂量施用。本领域技术人员可容易地确定适当的剂量数。然而，剂量可能需要调整以考虑可选的施用路径、或平衡针对任何副作用的治疗益处。此类剂量可根据重组载体所用于的治疗应用而变化。

以充足的量施用载体颗粒以进入期望的细胞和保证转移的核酸组合物的足够的功能水平，以提供治疗益处而无过多的不利的效应或具有医学可接受的生理效应，其可由医学领域技术人员确定。

任选地，在具体实施方案中，根据本发明的AAV-介导的递送可与通过其它病毒和非病毒载体的递送组合。此类其他病毒载体，包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体和杆状病毒载体，可以容易地选择，并可根据本领域已知的方法产生。相似地，非病毒载体，包括但不限于脂质体、基于脂质的载体、多聚物(polyplex)载体、分子轭合物、多胺和聚阳离子载体，可以容易地选择，并可根据本领域已知的方法产生。当通过这些可选的路径施用时，剂量需要在上述范围内。

动物(包括人类)拥有针对具有dsRNA基因组的病原体的天然防御机制：dsRNA在胞质溶胶中的存在诱导干扰素相关途径的激活，这些途径抑制RNA干扰。因此，为了避免激活这些途径，dsRNA复合体长度不应超过30碱基对—设计siRNA构建体的首要规则。

在某些实施方案中，dsRNA复合体的长度是至少20、21或22碱基对，如对应于切酶依赖的切割产生的RNA产物的尺寸。

下列实施例意欲说明而不是限制本发明。

实施例1

材料和方法

重组的腺病毒载体和AAV载体的开发

开发重组的腺伴随病毒(rAAV)载体，假分型rAAV2.6用于体外研究，而rAAV2.9用于体内工作。二者含有相同的AAV2载体基因组以及所示的shRNA表达盒，并进行相同的加工，只是分别使用质粒AAV6cap用于rAAV2.6，使用AAV9cap用于rAAV2.9。在所有的体外和体内研究中，仅使用自互补的(“二聚的”)rAAV基因组，因为与单链(“单体的”)rAAV载体相比它们具有增强的表现。从腺病毒(AdV)载体AdV-shPLB中先前使用的shRNA表达盒开始，该shRNA表达盒有效和稳定地沉默了培养的原代新生大鼠心肌细胞(PNCM)中的PLB表达，试图开发共表达shRNA和作为标记的GFP的AdV和rAAV载体，这允许在使用心力衰竭(HF)动物的实验中通过体内成像跟踪载体。但是，构建体rAAV-shPLB-CMV-GFP与不含CMV-GFP组件的原始AdV-shPLB载体相比显示非常低的沉默活性(图1A)。rAAV载体在CMV的控制下产生GFP，CMV-GFP盒中的转录与U6-启动子-shRNA盒以相反的方向运行。为了检验是否CMV启动子本身和/或GFP序列造成了沉默活性的损失，使用内含子“填充”序列代替GFP构建了载体rAAV-shPLB-CMV-β-内含子。rAAV-shPLB-CMV-GFP(尺寸为2.30kb)和rAAV-shPLB-CMV-β-内含子(尺寸为2.55kb)二者均具有包装入衣壳的视为必要的尺寸。不含CMV也不含GFP或β-内含子，而仅含有来自AdV-PLB的原始U6-shPLB盒的第三载体赋予了1.15kb的总载体基因组尺寸。虽然如此，这一“极小化”rAAV-shPLB在标准方案中被有效包装，很可能是作为多联体。载体图谱显示于图1C。

病毒载体产生和纯化

rAAV9-shGFP和rAAV9-shPLB使用由Zolotukin等人(Gen Ther(1999)6(6)：973-985)描述的双质粒方案产生，方案有以下修改：在添加磷酸钙沉淀之前，在三个烧瓶中培养293-T细胞(ATCC，Manassas，VA)24h(DMEM，10％FBS)。72小时后，经碘克沙醇密度梯度(Optiprep，Greiner Bio-One Inc，Longwood，FL)、然后是肝素-琼脂糖I型亲和层析(Sigma-Aldrich Inc，St.Louis，MO)从benzonase处理的细胞粗裂解物中纯化病毒。最后，使用Vivaspin 20离心浓缩机50K MWCO(Vivascience Inc，Carlsbad，CA)浓缩病毒并将其配制成乳酸林格氏液(Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，IL)，储存在-80℃。

载体质量评估和滴定

通过电泳后的银染色评估载体贮液的生物化学纯度(＞95％)。含有基因组的颗粒(gcp)通过实时PCR方法(LightCycler，Roche Diagnostics)确定，使用SYBR^TM GREEN TAQ READYMIX^TM(SIGMA，Saint-Louis，MO)和引物CMV-F和CMV-R。

心肌细胞培养物中的载体评估

原代新生心肌细胞(NRCM)适于在决定性的体内检验之前预检验任何基于RNAi的心脏治疗，这是因为虽然SERCA2a/PLB系统是发育调节的，但是其在NRCM中功能正常，而且靶向SERCA2a/PLB系统的腺病毒基因转移策略在新生和成年心肌细胞二者中都取得了成功。虽然两种细胞类型都非常适于体外预检验，但是培养的心肌细胞和体内完整的心脏之间的许多其他差异使得培养细胞中对基于RNA的治疗的任何体外研究都是相当初步的。

细胞培养物：原代心肌细胞(PNCM)和原代新生心肌细胞(NRCM)从1-3天大的Wistar大鼠幼仔的心室组织制备。将PNCMs在6-孔皿中培养。

受磷蛋白沉默的评估：NRCM和大鼠心脏中的PLB、Tnl、NCX和SERCA2a mRNA和蛋白表达水平、以及大鼠心脏中的SERCA2a和NCX蛋白质通过所述的Northern印迹分析确定(Fechner等人，Gene Therapy(2006)；发行中)。

RNAi治疗过程中的钙瞬变：用8μM Fluo-4/AM加载NRCM 20分钟后，测量1Hz电刺激过程中的[Ca²⁺]_i瞬变(120Hz、8.3ms/图像下的图像捕获)。研究了五个NRCM治疗组(细胞数目)：AAV9-shPLB(n＝26)、AAV9-shGFP(n＝26)、AdV-shPLB(n＝71)、AdV-shGFP(n＝49)和未治疗的对照细胞(n＝32)。测量了瞬变振幅(收缩期[Ca²⁺](F/F₀))、其到达峰值的时间(TTP)(ms)和其衰变的时间常数τ(ms)。AAV9-shPLB治疗NRCM过程中的[Ca²⁺]_i瞬变的测量(图1E和1F)显示，与AAV9-shGFP组相比，此载体导致显著更高的振幅和加快的瞬变动力学(具有缩短的TTP和τ)，AAV9-shGFP组具有与未治疗的细胞不可分辨的瞬变。与AdV-shGFP组相比，AdV-shPLB治疗还造成显著更高的振幅。不过，与AAV9组相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP中的TTP被延长，而τ则无差异。因此，AdV组中的肌质网(SR)Ca²⁺负荷的其他研究(图1D)如下进行：在用8μMFluo-4/AM加载NRCM 20min、但接着迅速加入阻断经由SERCA2a的Ca²⁺进入SR的再摄取的20mM咖啡因后，再次测量1Hz电刺激过程中的[Ca²⁺]_i瞬变。比较电刺激的[Ca²⁺]_i瞬变和咖啡因诱导的[Ca²⁺]_i瞬变，并计算Ca²⁺的释放分数(参见等人Endothelin-1 enhances nuclear Ca2+transients in atrial myocytes through Ins(1，4，5)P3-dependent Ca2+ release from perinuclear Ca2+ stores(内皮缩血管肽-1通过核周Ca²⁺存储的Ins(1，4，5)P3-依赖性的Ca²⁺释放增强心房肌细胞中的核Ca²⁺瞬变).Journal of Cell Science.2008；121：186-195，和其中引用的参考文献)。

肥大的诱导：在部分体外研究中采用浓度为100μM的苯肾上腺素(PE)、10μM的血管紧张素II(Ang-II)和100nM的内皮缩血管肽-1(ET-1)作为肥大性刺激。定量细胞内miR的TAQMAN^TM测定在PNCM/NRCM中在基线条件下(图4A)或在肥大性剂存在下(图4B-4D)进行。肥大性剂在培养的第2天添加，其单独或与相应的RNAi载体一起添加。小RNA测定：使用下列引物通过TAQMAN^TM测定来确定短发夹RNA(shRNA)表达水平。在探究载体来源的shRNA对心脏细胞内miRNA途径的可能的载体剂量依赖性影响中，采用TAQMAN^TM测定定量已知在心脏中表达的以下miR：miRNA-1、miRNA-24、miRNA-133a、miRNA-208和miRNA-195。

通过Taqman测定定量基因表达和shRNA产生

微RNA测定：在探究载体来源的shRNA对心肌细胞miRNA的可能影响中，使用TAQMAN^TM测定来定量(图4A-4C)已知在心脏中功能表达的两种miRNA(miRNA-1、miRNA-133a)。BNP测定：通过TAQMAN^TM同样地定量载体治疗的大鼠的心脏中的心脏BNP基因表达(图3G)。shPLB产生：不同RNAi载体的短发夹RNA转录的定量(图1B)按先前公布的方案进行(Fechner等人，Highly Efficient and Specific Modulation of Cardiac Calcium Homeostasis by Adenovector-Derived short hairpin RNA Targeting Phospholamban(靶向受磷蛋白的腺病毒载体来源的短发夹RNA对心脏钙稳态的高效和特异性调节).Gene Therapy.2007；14：211-218；和Fechner等人，Coxsackievirus B3 and adenovirus infections of cardiac cells are efficiently inhibited by vector-mediated RNA interference targeting their common receptor(靶向柯萨奇病毒B3和腺病毒的共同受体的载体介导的RNA干扰有效抑制它们对心脏细胞的感染).Gene Ther.Jun 2007；14(12)：960-971)。

主动脉绑扎

用腹膜内戊巴比妥(65mg/kg)麻醉四周龄Sprague Dawley大鼠(70-80g)并将其置于通气机上。进行胸骨切口以暴露主动脉根，并将内径0.58mm的钽夹(Week，Inc.)夹在升主动脉上。模拟组中的动物经历相似的程序但不插入夹子。然后闭合锁骨切口，并将大鼠放回它们的笼子。进行锁骨方法是因为在基因递送过程中，开胸术是必需的，而通过在初始的主动脉绑扎中不打开胸腔，避免了进行基因递送时的粘连。

将动物初始地分为两组：一组56只动物进行主动脉绑扎，第二组12只动物进行模拟手术(模拟手术动物中有10只存活)。在进行主动脉绑扎的动物中，在进行心脏基因转移之前，我们等待了25-30周来让动物发展左心室舒张和使射血分数降低25％。在经历压力超负荷肥大(pressure overload hypertrophy)的初始的56只动物中，仅有40只动物存活，将它们进一步分为接受Ad-shGFP(n＝10)或Ad-shPLB(n＝10)，或AAV9-shGFP(n＝10)或AAV9-shPLB(n＝10)。

连续超声波心动描记评估

在绑扎二十二周后，在轻微麻醉的动物(戊巴比妥40mg/kg，腹膜内)中每周一次进行连续超声波心动描记图。使用GE Vivid-7超声机和12MHz宽频转换器进行经胸M-模式和二维超声波心动描记术。使用中乳头水平左心室短轴视图，并采集后壁厚度、左心室舒张期内径和缩短分数测量。在检测到与绑扎后12周的缩短分数(FS)相比FS下降＞25％的3天内在所有动物中进行基因转移。在模拟手术的大鼠中，基因递送在第27周进行。

静脉内注射后的AAV9载体的心脏分布

向大鼠静脉内(i.v.)注射表达标记蛋白质GFP的载体rAAV9-GFP或注射盐水。递送rAAV9-GFP或盐水后一个月，摘除心脏，并在510nm在荧光系统下显现(Maestro In Vivo Imaging，Woburn，MA)，490nm蓝光处的单激发峰(图2B和2C)显示观察到的图像。

除了宏观水平的此GFP表达显现外，还在i.v.注射rAAV9-GFP后一个月进行GFP免疫组织化学染色以在微观水平评估其分布(图2D、2H和2I)。30％过氧化氢阻断内源过氧化物酶之后，在PBS缓冲液中清洗，以1∶1000稀释度加入多克隆兔抗hrGFP抗体(VITALITY^TM，目录号240142，Stratagene)120min。清洗后，作为二级抗体，以1∶50稀释度使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/HRP抗体(目录号P0448，Dako，Glostrup，Denmark)60min。使用haemalaun的染色和复染如所述地进行(Noutsias等人，Human Coxsackie-Adenovirus-Receptor is Co-Localized with Integrins αvβ3 and αvβ5on the Cardiomyocyte Sarcolemma and Upregulated in Dilated Cardiomyopathy-Implications for Cardiotropic Viral Infections(人类柯萨奇-腺病毒-受体与整联蛋白αvβ3和αvβ5共定位于心肌细胞肌膜并在舒张性心肌病中上调-对亲心性病毒感染的暗示).Circulation.2001；104：275-280)。

对于不同器官中GFP表达的Western印迹分析，以1∶5000稀释度使用多克隆兔抗hrGFP抗体(VITALITY^TM，目录号240142 Stratagene)在4℃过夜。作为二级抗体，以1∶2000稀释度使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/HRP抗体(目录号P0448，Dako，Glostrup，Denmark)在室温60min。然后将GFPWestern印迹对X-光胶片曝光5min。这些胶片的定量在图2J中给出。

体内RNAi治疗的实验方案

腺病毒递送系统是本领域公知的。简要而言，在麻醉大鼠和进行开胸术后，将含有200μl腺病毒(3X10¹⁰pfu)溶液的22G导管从左心尖前进至主动脉根。在距导管部位的远端夹住主动脉和肺动脉主干40sec并注射溶液，然后闭合胸腔，让动物恢复。对于使用rAAV9的实验，使用5x10¹¹个任一种rAAV9shRNA的载体基因组进行简单的尾静脉注射。模拟组的动物注射盐水。

RNAi治疗过程中的血液动力学评估

将不同治疗组和处于腺病毒基因转移的不同阶段的大鼠用40mg/kg戊巴比妥麻醉和机械通气。然后通过中线切口打开胸腔，暴露出心脏。然后在左心尖开一小口，向左心室引入2.0Fr.高保真压力转换器(MILARInstruments，TX)。压力测量在1KHz下进行数字化并储存用于进一步的分析。测量或获得了不同组的左心室收缩压(LVSP)、舒张末期左心室压力(LVDP)、最大压力上升速率(+dP/dt)和最大压力下降速率(-dP/dt)和松弛时间常数(t)。使用以下等式测量了等容松弛的时间过程：V＝P₀e^-t/t+P_B，其中P是左心室等容压力，P₀是达到峰值-dP/dt时的压力，P_B是残余压力。

RNAi治疗后的心脏组织学

心肌细胞尺寸和心脏纤维化：对动物子集进行组织学分析以评估肌细胞尺寸(CMD)和胶原蛋白含量(CAP)。将LV样本用10％福尔马林固定并在石蜡中包埋。切片(3μm厚)用苏木精-曙红染色以确定CMD或用Azan-Mallory染色以评估CAP。在纵向定向的心肌细胞中，跨核宽度测量为CMD(图3F)。在每个Azan-Mallory切片的六个部位拍摄数码照片。使用NIH成像仪通过计数计算机化的像素分别确定间隙/血管周围胶原蛋白面积和肌细胞面积(图3E)。

统计分析

数据表示为平均值±SD。使用STATVIEW(Abacus Concepts，Barkeley，CA)通过ANOVA进行多重比较。接受P＜0.05水平的统计显著性。进行双因子ANOVA以比较不同组之间的不同血液动力学参数。对于回波数据，其中以不同的区间检查变量，进行重复测量的ANOVA。接受p＜0.05水平的统计显著性。

实施例2

RNAi载体系统的优化

研究了病毒RNAi载体沉默效力的决定因素，因为观察到具有显然很小结构差别的AAV-shPLB载体在体外在PNCM中显示显著不同的shRNA产生速率和靶沉默(图1)。对于PNCM中的这些初始研究，使用了AAV2.6假型，其在体外具有比AAV2.9更高的转导效力。对于图2和3中报告的稍晚的RNAi治疗研究，仅使用了AAV2.9，其显示更好的体内心脏转导。体外实验显示共表达向含有shPLB载体的细胞加标签的GFP标记蛋白质几乎消除了shPLB产生(图1B)和PLB沉默(图1A)。如果GFP由CMV驱动，以及如果CMV连接于β-内含子，含有用于shRNA转录的U6启动子的表达盒中CMV启动子的存在强烈降低shRNA产生(图5A)。图1显示到目前为止，最高的效力是由以前认为太短而无法进行有效包装的AAV构建体展示的。PNCM中AdV-shPLB与AAV6-shPLB的shRNA转录的比较显示，到第10天腺病毒的表达下降了三分之一，而AAV载体的表达则不变(图1B)。4x10³p/c剂量下，两种载体的PLB表达消除都＞98％。令人感兴趣的是，允许通过体内成像进行检测的CMV-GFP盒的并入意外地导致载体不能沉默其靶标。CMV启动子驱动的标记基因表达显然不适合用于U6-shRNA载体，因此仅有最简单和有效的U6-shRNA载体(图1)被选择用于体内RNAi。

由于rAAV9-shRNA与AdV-shPLB相比的高度稳定的shRNA产生和长期的体内稳定性，因此将其用于长期体内治疗。对于短期治疗，使用腺病毒载体。在体外，蛋白质水平的PLB消除比mRNA水平的PLB消除滞后数天，在第7天，蛋白质水平分别下降了基线的9％(AdV-shPLB)和12％(rAAV6-shPLB)(图1D)。与AAV9-shGFP组相比，对AAV9-shPLB治疗NRCM过程中的[Ca²⁺]_i瞬变的测量(图1E和1F)显示此载体导致显著更高的振幅和加快的瞬变动力学(缩短的TTP和τ)，AAV9-shPLB组具有与未治疗的细胞不可分辨的瞬变。与AdV-shGFP相比，AdV-shPLB治疗还造成显著更高的振幅。与AAV9组相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP中的TTP被延长，而τ则无差异。AdV组中的肌质网(SR)Ca²⁺负荷研究显示AdV-shPLB和AdV-shGFP组中增加的SR Ca²⁺负荷和自SR的Ca²⁺释放分数(FR)(图5D)。关于体外转导的细胞间差异，图5B显示用rAAV-GFP标记载体治疗的NRCM中大致均匀的GFP表达，其可充当对体外均匀的shPLB表达的直接展示的最佳可能逼近。使用现有的技术，均匀的shPLB表达可能无法直接显现，原因是GFP与shPLB的共表达消灭了其沉默能力(图1B和1C)。所述RNAi载体在体内在大鼠心脏中均匀的空间和时间分布还由与用于RNAi治疗(图3A-3D)的相同类型的GFP载体(rAAV9)的荧光成像(图2B和2C)间接推断出来。图2D和图2H-2J显示i.v.注射rAAV9-GFP后心脏和其它器官的GFP免疫组织化学染色。心脏中强烈和大致均匀的表达与肝和骨骼肌中的微弱染色以及肺中的无可见染色形成对比(定量参见图2J)。

实施例3

体内RNAi治疗的效力

跨主动脉的缢痕在30周后导致大鼠中严重的HF。体内RNAi治疗的实验方案概述于图2。与用于RNAi治疗的相同类型(rAAV9)的GFP载体的荧光成像和免疫组织学分析在宏观和微观水平显示了i.v.注射后一个月大致均匀的心脏GFP表达，并可被假定为接近RNAi载体产生的心脏shRNA表达水平(图2B-2D)。现有技术难以实施体内shPLB产生的直接测量。图2F和2G显示用AdV-shPLB或rAAV9-shPLB治疗后显著下降的心脏PLB蛋白质。SERC A2a蛋白质在衰竭的心脏中是降低的，而shPLB治疗伴有心脏SERCA2a蛋白质的增加。NCX未发生显著变化。

与AdV-shGFP对照载体(产生针对GFP的shRNA序列)相比，通过主动脉根注射AdV-shPLB的治疗充当严重HF的短期治疗模型。注射后一个月，AdV-shPLB中的舒张功能(图3A)显著(p＜0.05)好于对照组：左心室舒张末期压力(LVEDP)10±3mmHg对比14+4mmHg，LV压力下降速率(-dp/dt)5215±540对比4017+471mmHg/sec，等容松弛时间常数Tau(τ)17±3对比24+4msec。收缩功能(图3B)同样得到改善，LV收缩压(LVSP)90±5对比78±4mmHg、LV压力上升速率(+dp/dt)7.448±659对比5.624±698mmHg/sec，和缩短分数(FS)46.1±3.2对比39.1+3.7％。除了对血液动力学的有益效应之外，TAB后LV重量和舒张的大幅增加在一个月时也被显著降低：LV重量1.34±0.22对比1.87±0.21g，LV/体重(LV/BW)比2.4±0.2对比3.2±0.2x10^-3、LV/胫骨长度(LV/TL)比29.3±4对比43.3+5(图3C)。这些死亡后形态测定数据与超声波心动描记术相关(图3D)。存活率为8/10对比9/10。

与AAV9-shGFP载体相比，通过尾静脉注射最有效AAV9-shPLB的治疗充当慢性严重HF的长期治疗模型。注射后三个月，与对照组相比，AAV9-shPLB治疗中的舒张功能(图3A)得到显著改善，并且不再显著不同于模拟手术的(无主动脉绑扎)非HF组：LVEDP为8±3mmHg对比18±4(非HF：6±2)mmHg，-dp/dt 5.722±503对比3.877+643(非HF：6.032±344)mmHg/sec，Tau 16+3对比23±4(非HF：14±3)msec。收缩功能(图3B)也得到恢复，尽管逊色于舒张功能参数：LVSP 92±4对比80+3(非HF：98±4)mmHg，+dp/dt 7.851+803对比4.997±766(非HF：8.772±832)mmHg/sec，FS 50.1+2.1对比35.2+5.1％(非HF：52.2+4.1)。除了血液动力学之外，这一治疗在3个月时降低了LV肥大和舒张：LV重量1.34+0.12对比1.76±0.27g(非HF：1.11+0.09)，LV/BW 2.2±0.1对比3.1±0.2x10^-3(非HF：1.8+0.2)，LV/TL 27.2±4对比45.3±5(非HF：24.5+4)(图3C)。超声波心动描记术确证了LV壁厚和舒张的降低(图3D)。组织学显示rAAV9-shRNA治疗3个月后心肌细胞尺寸和心脏胶原蛋白二者均有降低(图3E和3F)。3个月后AAV9-shPLB-治疗的动物的存活率为9/10，对比对照组中的6/10。

实施例4

心力衰竭的RNAi治疗

这些数据表明，对于中间时间尺度，腺病毒载体可能是足够的，甚至可提供超过长期稳定的AAV的优点(Wang等人，Nat Biotechnol(2005)23：321-328；Gregorevic等人，Nature Medicine(2004)10：828-834；Inagaki等人，Mol Ther(2006)14：45-53；Pacak等人，CirRes(2006)99：e3-9)，原因是在急性和可能逆转的HF中仅短暂地需要RNAi。事实上，AdV-shPLB治疗后一个月舒张和收缩功能以及LV形态学的显著改善证明了腺病毒系统的至少功能性治疗益处。先前显示的用于经典基因转移治疗的内容(delMonte等人，Proc Natl AcadSci USA(2004)101：5622-5627；Sakata等人，J Mol Cell Cardiol(2007)42：852-861；Sakata等人，Am J Physiol Heart Circ Physiol(2007)292：H1204-1207；Sakata等人，Mol Ther(2006)13：387-996)显然也可适用于基于RNAi的策略，尽管存在对RNAi载体结构的其他限制因素以避免损失治疗效力(图1A和1B)和扰乱miRNA途径。

虽然从AAV产生shRNA在几个方面不同于经典的基因转移(图1)，但是来自本发明AAV组的数据提供了基于AAV的shRNA产生在能够改善心脏功能和可能的存活的水平保持稳定数个月的一手证据。本文使用的AAV9载体实现了应用于人类HF的一个首要要求，因为在灵长类中它是亲心性的(Pacak等人，(2006))。与啮齿动物相反，可调节的PLB调节是人类中最可能需要的，因为已将由基因组突变造成的永久性PLB缺乏或PLB功能失调与心肌疾病关联(Schmitt等人，Science(2003)299：1410-1413；Haghighi等人，Proc Natl AcadSci USA(2006)103：1388-1393；Zhao等人，(2006)113：995-1004)。然而，药物可调节的RNAi显示在现有载体平台上是可能的。

RNAi治疗后，发现与HF组相比，SERCA2a表达增加，这与RNAi治疗使LV功能正常化的事实一致。因为SERCA2a表达是HF程度的公知标志物，其通过shPLB的RNAi治疗后ERCA2a的增加反映了改善的心脏功能状态。

实施例5

RNAi治疗过程中的心肌细胞微RNA表达

RNAi的细胞机器经过数百万年的进化，是已知用于特异性基因沉默的最有效和通用的机制。shRNA采用这一机器通过模拟内源过程介导治疗效应，在远低于反义RNA的浓度下实现沉默，但可扰乱细胞miRNA途径(Grimm等人，Nature(2006)441：537-541)。因为miR在心脏形态发生(Zhao等人，Cell(2007)129：303-317)、肥大(Care等人，Nature Medicine(2007)13：613-618；van Rooij等人，Science(2007)316：575-579)、心律失常发生(Yang等人，Nature Medicine(2007)13：486-491)和衰竭(Thum等人，Circulation(2007)116：258-267；van Rooij等人，Proc Natl Acad Sci USA(2006)103：18255-18260)中起重要作用，在PNCM/NRCM中在miRNA水平探究了RNAi载体的可能副作用。首先，在标准培养条件下，然后在肥大诱导药物苯肾上腺素(PE)存在下。在无此肥大性刺激时，体内使用的载体无一对在心脏中具有已知的功能重要性的细胞miR 1、21、133a、195、208具有任何显著效应(图4B)。在PE存在下，在培养的第5天，几种心肌细胞miRNA有显著的下降(图4A)。显著地，具有抗肥大(Care等人(2007)MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy(微RNA-133控制心脏肥大).Nat Med 13，613-8；和van Rooij等人(2007)Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a MicroRNA(微RNA控制应激依赖的心脏生长和基因表达).Science 316，575-9)和抗心律失常发生(Yang等人(2007)The muscle-specific microRNA miR-1regulates cardiac arrhythmogenic potential by targetic GJA1 and KCNJ2(肌肉特异性微RNAmiR-1通过靶向GJA1和KCNJ2调节心脏心律失常发生潜能).Nat Med 13，486-191)潜能的miRNA的水平的这一下降在用AdV-shPLB或AAV6-shPLB治疗的PNCM中被反转，AdV-shPLB或AAV6-shPLB将这些miRNA的水平恢复至基线。

在PE存在下，在培养的第5天，心肌细胞miR有显著的下降(图4B)。显著地，具有抗肥大(Zhao等人，(2007)；Care等人，(2007))和抗心律失常发生(Yang等人，(2007))潜能的miR的这一下降在用AdV-shPLB或AAV6-shPLB治疗的PNCM中被反转，AdV-shPLB或AAV6-shPLB将这些miRNA的水平恢复至基线，其中特别值得关注的是miRNA-133和miRNA-1。由于恶性心律失常是HF中重要的并发症，新颖治疗对任何心律失常相关的微RNA诸如miRNA-1的脱调节(Yang等人，(2007))应被视为可能的严重有害作用。然而，体外数据显示PE-诱导的miRNA-1降低被shPLB治疗抵消(图4A-4C)。结合AAV-shPLN治疗组中存活改善的趋势，目前为止没有此治疗的心律失常发生的副作用的证据。用shPLB载体治疗的大鼠心脏具有比shGFP组更高的miRNA水平(图2H-2J)。关于RNAi载体的可能副作用，载体注射后肝(图2E)和其他器官的HE染色揭示无病理学发现。

miRNA-133在控制心肌细胞尺寸中起关键作用(Care等人，(2007))，并且在通过RNAi治疗降低肥大方面值得关注。不管体外shPLB治疗恢复miRNA-133水平的分子机制如何，必须承认它们的升高具有抗肥大效应。虽然RNAi治疗过程中改善的收缩和舒张功能是由其对经由总体Ca²⁺瞬变的兴奋-收缩偶联(ECC)的影响直接造成的，观察到的LV肥大和舒张的显著降低(图3C、3D和3F)是不容易推断的，原因是RNAi治疗主要仅靶向总体Ca²⁺循环的单个组分。意外的是，这一狭窄靶向的干预仍然将几种PE诱导的miRNA抑制恢复到正常水平(图4A)。由于在体外，无论是血液动力学应激，还是像体内HF中那样的细胞因子活化的神经体液，都不能起任何作用，因此这一恢复显然是由细胞水平的Ca²⁺稳态调节造成的。因为无法假定PLB消除对细胞内miRNA的直接效应，所以RNAi诱导的Ca²⁺稳态变化显然不仅影响收缩相关的总体Ca²⁺瞬变，而且还影响核周腔中产生的单独的和隔离的Ca²⁺信号(Wu等人，J Clin Invest(2006)116：675-682；Molkentin J，J Clin Invest(2006)116：623-626)，这些Ca²⁺信号决定肥大过程中的转录变化。被PE诱导并且被RNAi校正的miRNA抑制可能仅反映改变的Ca²⁺稳态引起的细胞调节网络的间接变化。可选地，后者可作为第一靶标直接影响miRNA表达。

基于这些结果，开发了针对心脏疾病的高效的局部化RNAi治疗策略。当使用优化的RNAi载体和主动脉根载体注射将RNAi限于心脏时，不存在毒性或扰乱miRNA途径的证据。不被理论束缚，载体miRNA对肥大相关的miRNA的脱调节的矫正表明miRNA参与治疗过程。虽然通过腺病毒载体的短期的RNAi-介导的PLB沉默在1个月后改善了心脏功能，但是来自优化的亲心性AAV9载体的长期RNAi在3个月的时间段内改善HF大鼠中的功能、形态和存活。

此外，使用所公开的载体在缺血灌注模型中造成降低的心室心律失常以及心室功能的改善。而且，PLB的抑制增加了具有转变为心力衰竭的压力超负荷肥大的动物的存活。

虽然已参考上述实施例描述了本发明，但是应理解，修改和变化涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受下列权利要求的限制。

Claims (63)

1.一种治疗受治疗者中心力衰竭的方法，包括向有相应需要的受治疗者施用有效治疗所述受治疗者的心力衰竭的量的包含RNAi表达盒的载体，其中所述盒包含RNAi序列，所述RNAi序列的表达产物降低受磷蛋白(PLB)的表达或活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNAi表达盒包含SEQ IDNO：1所列的核苷酸序列，由此与施用所述载体之前相比改善所述受治疗者的收缩功能。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是病毒体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是质粒。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述病毒体是细小病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细小病毒是腺伴随病毒(AAV)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述AAV是血清型9。

8.根据权利要求1所述的方法，其中PLB mRNA的表达被抑制。

9.根据权利要求2所述的方法，其中SEQ ID NO：1的侧翼为AAV末端重复序列。

10.根据权利要求3所述的方法，其中病毒体载体的基因组是自互补的。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述受治疗者是人类。

13.一种药物组合物，包含重组的腺伴随病毒(AAV)载体和药学可接受的载运体，其中所述载体包含其RNA表达产物导致受磷蛋白(PLB)的表达或PLB活性降低的RNAi表达盒。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述RNAi表达盒的RNA表达产物包含在严格条件下与PLB基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述RNAi表达盒包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

16.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述RNA表达产物还包含SEQ ID NO：2所列的靶序列。

17.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物适于静脉内施用。

18.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物适于动脉内施用。

19.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物适于心室内施用。

20.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物适于心瓣膜灌注。

21.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述AAV是血清型9。

22.一种腺伴随病毒(AAV)载体，包含至少一个AAV末端重复序列，其中所述载体包含其RNAi表达产物导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或PLB活性降低的RNAi表达盒。

23.根据权利要求22所述的腺伴随病毒，其中所述RNAi表达盒的RNA表达产物包含在严格条件下与PLB基因mRNA核苷酸序列杂交的核苷酸序列，由此转导心肌细胞。

24.根据权利要求22所述的AAV载体，其中所述RNAi表达盒包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

25.根据权利要求22所述的AAV载体，其中所述RNA表达产物还包含SEQ ID NO：2所列的靶序列。

26.根据权利要求22所述的AAV载体，其中所述AAV是血清型9。

27.一种增加肌质网(SR)的钙摄取的方法，包括使肌肉组织样品与腺伴随病毒(AAV)载体接触，其中所述载体包含编码RNAi表达产物的多核苷酸序列，由此增加SR中的钙摄取。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNAi包含在严格条件下与PLB靶基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，由此与接触所述载体之前的收缩性相比增强心肌细胞的收缩性。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体还包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNAi包含SEQ ID NO：2所列的靶序列。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNAi表达盒的RNA编码区的表达造成PLB基因的表达下调。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNAi载体包含与PLB靶基因的RNA编码区具有至少约90％同一性的序列。

33.根据权利要求27所述的方法，其中PLB基因表达被抑制至少10％。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述AAV基因组是自互补的。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述AAV是血清型9。

36.一种试剂盒，包含：

i)腺伴随病毒(AAV)载体，其中所述载体包含编码导致受磷蛋白(PLB)的表达或PLB活性降低的RNAi表达产物的多核苷酸序列；

ii)一种或多种缓冲液；

iii)使用(i)和(ii)组成部分的说明；以及

iv)包含(i)、(ii)和(iii)组成部分的容器。

37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述RNAi包含在严格条件下与PLB靶基因mRNA转录物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

38.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述载体包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

39.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述RNAi还包含SEQ IDNO：2所列的靶序列。

40.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述AAV是血清型9。

41.一种诊断受治疗者对所述受治疗者胞内钙失调所致的慢性心力衰竭(HF)的RNAi治疗的易感性的方法，该方法包括：

(a)使受治疗者的肌肉组织样品与腺伴随病毒(AAV)载体接触，其中所述载体包含编码导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或活性降低的RNAi表达产物的多核苷酸序列；和

(b)确定所述肌肉组织样品与AAV9载体接触之前和之后所述组织样品中肌质网钙ATP酶泵(SERCA)的活性，其中SERCA活性的增加与受治疗者对HF的RNAi治疗的易感性相关。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述RNAi包含在严格条件下与PLB靶基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述载体包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述RNAi还包含SEQ ID NO：2所列的靶序列。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述受治疗者是人类。

46.一种改善具有慢性心力衰竭的受治疗者的存活的方法，该方法包括施用载体，其中所述载体包含编码导致受磷蛋白(PLB)mRNA的表达或PLB活性降低和收缩功能改善的RNAi表达产物的多核苷酸序列，由此改善所述受治疗者的存活。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述RNAi包含在严格条件下与PLB靶基因mRNA的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述载体是病毒体或质粒。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述病毒体是细小病毒。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述细小病毒是腺伴随病毒(AAV)。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述AAV是血清型9。

52.根据权利要求48所述的方法，其中所述病毒体包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

53.根据权利要求52所述的方法，其中SEQ ID NO：1的侧翼为AAV末端重复序列。

54.根据权利要求46所述的方法，其中所述RNAi还包含SEQ ID NO：2所列的靶序列。

55.根据权利要求46所述的方法，其中所述受治疗者是人类。

56.一种降低受治疗者的室性心律失常的方法，该方法包括施用包含编码RNAi表达产物的多核苷酸序列的载体，其中所述RNAi包含改善心室功能的核苷酸序列，由此降低所述受治疗者的室性心律失常。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述载体是病毒体或质粒。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述病毒体是细小病毒。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细小病毒是腺伴随病毒(AAV)。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述AAV是血清型9。

61.根据权利要求57所述的方法，其中所述病毒体包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

62.根据权利要求56所述的方法，其中所述RNAi还包含SEQ ID NO：2所列的靶序列。

63.根据权利要求56所述的方法，其中所述受治疗者是人类。

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