CN108192922A - 受磷蛋白基因反义rna重组aav载体、病毒、构建方法及应用 - Google Patents

受磷蛋白基因反义rna重组aav载体、病毒、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、病毒、构建方法及应用。所述受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体是分别将如SEQ ID NO.1所示的PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV‑MCS分别经EcoRI和BamHI双酶切后，将PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV‑MCS的酶切产物连接而成的。所述重组腺相关病毒由受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体和辅助质粒共转染工程细胞后包装而成。本发明制备的重组腺相关病毒载体克服了非病毒载体的低转染效率，制备的rAAV‑asPLB也克服了重组腺病毒的免疫原性、表达时间短等缺点，具有高转染效率、安全和持久表达等优势。

Description

受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、病毒、构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、病毒、构建方法及应用。
背景技术
随着人类基因组计划的开展和分子生物学研究的逐步深入，众多疾病的分子机制的阐明和致病基因不断发现，基因治疗已经从单基因遗传性疾病的治疗发展到多基因常见多发病的治疗，尤其在心脑血管疾病及各种肿瘤的治疗中展现出良好应用前景。基因治疗中的三个关键问题为：1、人类疾病病因和致病机理的进一步明确，尤其是从分子机制角度来研究并提出有效的基因治疗方案。2、基因治疗及相应的治疗策略的优化和合理配伍，以提高整体上对疾病的治疗效果。3、安全、高效、稳定的基因表达系统即理想的载体的构建和应用。据此，合理的基因治疗方案必须具备三个要素：目的基因、靶细胞以及基因传递的方法。选择合适的靶基因、合适的载体以及合适的治疗策略是基因治疗研究中的热点和难点。
心脏收缩和舒张障碍的一个主要原因是由于心肌细胞的兴奋－收缩偶联的异常。钙离子(Calcium，Ca2+)是心肌兴奋－收缩偶联的关键因子，在胞浆钙浓度的调节中，肌浆网Ca2+-ATPase发挥主要作用，而其功能主要由受磷蛋白(磷酸受纳蛋白，磷酸兰苯，phospholamban,PLB)的调节。心肌收缩时心肌细胞内Ca2+离子浓度会明显影响心肌细胞的收缩能力，增加Ca2+浓度会产生心肌的正性肌力作用。
心肌细胞的收缩时肌浆内质网Ca2+离子释放通道开放，使Ca2+由肌浆内质网进入胞浆中，而舒张时肌浆内质网上的Ca2+-ATPase将钙重新摄取。心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase活性影响了细胞对钙的调控，而肌浆网Ca2+-ATPase的活性受PLB的调节。在非磷酸化状态下，PLB抑制肌浆网Ca2+-ATPase；cAMP依赖性蛋白激酶和钙调蛋白依赖性蛋白激酶则使PLB磷酸化而活化肌浆网Ca2+-ATPase。减少PLB的表达可以减少对肌浆网Ca2+-ATPase的抑制作用，从而增加心肌的收缩和舒张，改善心功能。采用PLB的反义核酸或其突变体的高表达可提高肌浆网Ca2+-ATPase的活性。在扩张性心肌病鼠模型中，敲除该基因可成功预防心功能异常。最近的研究中发现在转基因模型中，随着靶点PLB的剔除，严重心力衰竭的发展会完全停止。对PLB基因的深入研究，有望为心功能障碍、钙调节异常等疾病的基因治疗提供新的靶基因。
基因治疗是将基因转移到体细胞以治疗和预防疾病的治疗方法。基因治疗的策略主要有以下几种：①基因替换：用正常功能基因替代原有突变的异常基因；②基因纠正：用外源正常基因改变基因突变的缺失部分，并保持基因的正常功能；③基因增强：导入外源正常基因，调节原有基因表达水平的不足；④基因抑制：转入反义核酸，抑制变异的表达。
反义RNA技术是调节基因表达的一种常用手段，称之为基因封条(gene blocker)。其原理是通过基因重组，构建人工表达载体，基因载体在离体或体内所转录的反义RNA能通过碱基互补与目标RNA特异结合，影响其转录后加工，或阻止核蛋白体在目标mRNA上的移动，导致目标蛋白翻译异常；而且反义RNA与目标RNA结合后会激活内源性RNA酶，导致目标RNA降解；应用覆盖mRNA 5’端的反义RNA可以有效抑制特定基因的表达和功能，从而影响细胞和机体功能。因而，反义RNA技术作为一种基因治疗的手段，具有重要的理论和现实意义。
成功的基因治疗需要安全高效、稳定、持久的转基因载体。非病毒载体所具有安全性高、容量大和易制备等优点可能较病毒载体具有更好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。腺病毒相关病毒(AAV)属于微小病毒科依赖病毒属，是一种对人和动物不致病的单链DNA病毒。将AAV病毒自身的编码基因去除,仅保留基因组两末端的反向末端重复序列(ITR)，使其能装载治疗基因及表达元件而产生重组AAV病毒(rAAV)。AAV病毒可感染多种组织细胞,能稳定的表达外源基因。AAV载体理化性质稳定，是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。传统制备重组AAV是采用腺病毒辅助的转染方法，然而腺病毒污染的问题是其应用的障碍。寻找新的、更安全的制备方法可以使AAV载体进一步推广应用。
综上，现有技术存在的问题是：(1)腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等具有肝脏毒性、致炎性，(2)传统制备重组AAV是采用腺病毒辅助的转染方法，但是容易造成腺病毒污染，限制其应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、病毒、构建方法及应用，解决了现有技术中存在的腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等具有肝脏毒性、致炎性，传统制备重组AAV是采用腺病毒辅助的转染方法，但是容易造成腺病毒污染的技术问题。本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体，所述受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体是分别将如SEQ ID NO.1所示的PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS分别经EcoRI和BamHI双酶切后，将PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS的酶切产物连接而成的。
本发明提供了一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体构建方法，具体包括以下步骤：
步骤1，PLB基因片段的扩增
提取大鼠心肌中RNA，用M-MLV逆转录酶将其反转录为cDNA；然后以cDNA为模板进行RT-PCR；RT-PCR使用的引物有5’端引物序列：5’-cgggatccCGCAGCTGAGCTGAGCTCCCAGACTTCA-3’，3’端引物序列：5’-cggaattcTTTAAATTTCATTTATTCCCCAA-3’；
步骤2，受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体的构建
将步骤1扩增得到的PLB基因片段经EcoRI和BamHI双酶切后得到目的基因片段，腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS经EcoRI和BamHI双酶切后得到载体片段，目的基因片段和载体片段经T4DNA连接酶4℃连接过夜；得到受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体。
本发明提供了一种利用上述受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体包装得到的重组腺相关病毒。
优选的，上述重组腺相关病毒中，所述重组腺相关病毒由受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体和辅助质粒共转染工程细胞后包装而成。
优选的，上述重组腺相关病毒中，所述辅助质粒为pAAV-RC载体和pHelper载体；所述工程细胞为293细胞。
本发明提供了一种上述重组腺相关病毒的构建方法：包括以下步骤：
以pH 7.5的TE缓冲液分别溶解受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、pAAV-RC载体和pHelper载体，分别得到重组AAV载体溶液、pAAV-RC溶液和pHelper溶液，然后分别吸取重组AAV载体溶液、pAAV-RC溶液和pHelper溶液10μL，用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，包装出重组腺相关病毒，成功包装出重组腺相关病毒的细胞产生病变；反复冻融产生病变的细胞，12000rpm室温离心10min，弃上清，即可获得重组腺相关病毒。
本发明提供了一种上述的受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体在感染体外培养的心肌细胞、制备感染心肌细胞的基因药物的应用。
本发明提供了一种上述的重组腺相关病毒在感染体外培养的心肌细胞、制备感染心肌细胞的基因药物的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、病毒、构建方法及应用，具有以下有益效果：
1、本发明的方法制备出的受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体(pAAV-asPLB)，转染细胞或组织后能够表达出PLB基因的反义RNA，通过碱基互补的原则与目标RNA结合来影响基因的转录和翻译，从而达到抑制基因表达、进行相关基因功能研究等作用。
2、本发明的PLB靶基因是存在于肌浆网上的调节蛋白，通过控制心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase来调节胞浆内钙浓度，减少PLB基因的表达可以减少对肌浆网Ca2+-ATPase的抑制作用，从而增加心肌的收缩和舒张，改善心功能。
3、本发明制备的重组腺相关病毒载体克服了非病毒载体的低转染效率，制备的重组腺相关病毒(rAAV-asPLB)也克服了重组腺病毒的免疫原性、表达时间短等缺点，具有高转染效率、安全和持久表达等优势。并且本发明生产过程中全部使用载体质粒，避免了传统方法中的腺病毒的污染问题，生物安全性更高。rAAV-asPLB纯化后，其滴度可以达到3×1013IU/L，滴度较高。
4、本发明制备的rAAV-asPLB不仅可以应用于在感染体外培养的心肌细胞，而且能够在大鼠等动物整体内有作用；同时，给药途径可以采用直接心肌注射，也可以静脉给药和经冠状动脉给药，应用范围广，感染效率高；使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达；本发明rAAV-asPLB设备要求不高，AAV载体的理化性质稳定，制备、储存和用药比较简便。
本发明的药效实验表明，rAAV-asPLB可以有效的转染心肌细胞和组织，抑制PLB的mRNA和蛋白表达；降低胞浆Ca2+离子浓度，减轻钙超负荷；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性；提高心功能。
按照病毒与细胞比值(MOI)为10、50、100、200加入重组腺相关病毒rAAV-asPLB，感染培养的大鼠心肌细胞。结果显示：MOI为10、50、100时，心肌细胞PLB的mRNA和蛋白水平随着剂量增长而下降；而MOI为200时，PLB的mRNA和蛋白水平与MOI为100时无明显差别。药效实验结果说明rAAV-asPLB可以有效抑制PLB的mRNA和蛋白表达，MOI为100是其对心肌细胞的最有效剂量。
本发明的毒性实验表明，rAAV-asPLB不影响心肌细胞的活力和增殖，安全性好。MTT(甲基噻唑基四唑)可以被活细胞的线粒体脱氢酶还原为蓝紫色结晶，溶于有机溶剂后，可用比色法测定其吸光度值，从而简便、准确和安全地测定细胞的活力和增殖情况。
按照病毒与细胞比值(MOI)为10、50、100、200加入重组腺相关病毒，感染培养的大鼠心肌细胞。采用MTT比色法检测重组病毒对心肌细胞的活力和增殖的影响，结果显示：感染各个剂量的心肌细胞与正常心肌细胞的吸光度值无明显变化。药效实验结果说明rAAV-asPLB对心肌细胞的活力和增殖无明显影响，可以安全地作为基因治疗药物感染心肌细胞。
附图说明
图1是RT-PCR扩增PLB基因片段产物和pAAV-asPLB酶切鉴定结果；
其中泳道1为pUC Mix Marker；泳道2为PLB基因片段(695bp)；泳道3为重组质粒pAAV-asPLB的EcoR I/BamH I酶切产物；泳道4为Marker；
图2是RT-PCR检测心肌细胞转染rAAV-asPLB后转录产物的电泳结果；
其中泳道1为pUC Mix Marker；泳道2为rAAV-asPLB转染的心肌细胞；泳道3为空病毒载体转染的对照组细胞；泳道4为正常心肌细胞；
图3是Western-blot检测心肌细胞转染rAAV-asPLB后蛋白的表达电泳结果；
其中泳道1为rAAV-asPLB转染的心肌细胞；泳道2为空病毒载体转染的对照组细胞；泳道3为正常心肌细胞；
图4是RT-PCR检测糖尿病大鼠各组PLB mRNA表达水平；
图5是Weatern-blot检测各组PLB蛋白表达水平；
图4和图5中，M为Marker；normal为正常大鼠；DM为未作治疗的糖尿病大鼠；DM-saline injection为注射生理盐水作为对照的糖尿病大鼠；DM-rAAV-asPLB injection为注射rAAV-asPLB的糖尿病大鼠；图4中，GADPH为内参基因。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
一、本发明提供了一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体，所述受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体是分别将如SEQ ID NO.1所示的PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS分别经EcoRI和BamHI双酶切后，将PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS的酶切产物连接而成的。
二、受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体的构建方法包括以下步骤：
S1，PLB基因片段的扩增；
提取Wistar大鼠心肌中RNA，用M-MLV逆转录酶将其反转录为cDNA。设计带有BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)酶切位点的PCR引物，5’端引物序列：5’-cgggatccCGCAGCTGAGCTGAGCTCCCAGACTTCA-3’(小写字母为酶切位点，SEQ ID NO.2)，3’端引物序列：5’-cggaattcTTTAAATTTCATTTATTCCCCAA-3’(小写字母为酶切位点，SEQIDNO.3)，RT-PCR扩增得到PLB基因片段(695bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
RT-PCR扩增反应体系为20μL：cDNA 1μL(1ng/μL)；5’端引物1μL、3’端引物1μL；2×Tap PCR Master Mix(带染料，康为世纪公司购买)10.0μL；ddH2O 7.0μL。其中上述引物的浓度均为4pmol/μL。
以下述条件进行RT-PCR反应：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸min，共30个循环。
S2，受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体(pAAV-asPLB)的构建；
本发明采用质粒辅助AAV重组系统构建pAAV-asPLB：腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS、pAAV-RC载体、pHelper载体，上述质粒均购于Stratagene公司，美国。
所述受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体是分别将如SEQ ID NO.1所示的PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS分别经EcoRI和BamHI双酶切后，将PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS的酶切产物连接而成的。具体步骤如下：将S1的PLB基因片段经EcoRI和BamHI双酶切后得到目的基因片段，腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS经EcoRI和BamHI双酶切后得到4650bp的载体片段，目的基因片段和载体片段经T4DNA连接酶4℃连接过夜(12h及以上)；连接产物转化进入感受态细胞XL10-Gold(Stratagene公司，美国)，用含氨苄青霉素的LB固态培养基筛选；挑取单克隆，抽提出受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体(pAAV-asPLB)；酶切和测序鉴定插入方向和序列的正确性。
酶切体系如下：
质粒(PLB基因片段或者pAAV-MCS质粒，浓度均是500ng/μL)4μL；EcoRI和BamHI各1μL；10×buffer 2μL；ddH2O 12μL；总体系20μL。
RT-PCR扩增PLB基因片段产物和pAAV-asPLB酶切鉴定结果如图1所示，图1中可以明显看出条带，成功获得了PLB基因片段和pAAV-asPLB酶切产物。pAAV-asPLB的测序鉴定结果也说明重组载体构建成功。
三、本发明还提供了一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体包装得到的重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒由受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体和辅助质粒共转染工程细胞后包装(制备)而成。
四、由受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体和辅助质粒共转染工程细胞(293细胞)，包装成重组腺相关病毒rAAV-asPLB，包括以下步骤：
步骤1，rAAV-asPLB的包装(制备)；
以pH 7.5的TE缓冲液分别溶解质粒pAAV-asPLB(该载体上含有CMV启动子、asPLB、polyA、ITR、氨苄抗性基因、ITR1位点)、pAAV-RC载体(该载体上含有AAV-2rep基因和AAV-2cap基因)和pHelper载体(该载体上含有腺病毒E2A基因、腺病毒E4基因和腺病毒VA基因)，分别得到重组AAV载体溶液、pAAV-RC溶液和pHelper溶液，然后分别吸取重组AAV载体溶液、pAAV-RC溶液和pHelper溶液10μL，用磷酸钙共沉淀法转染工程细胞(293细胞，购自上海汉恒)，在工程细胞中包装出重组腺相关病毒rAAV-asPLB。其中pAAV-RC和pHelper为辅助质粒。
同时设立rAAV-asPLB的阳性对照(rAAV-LacZ，rAAV-LacZ的制备方法与rAAV-asPLB的制备方法相似，区别在于将PLB基因替换为LacZ基因)、阴性对照(pAAV-RC载体)以及空白对照(pH 7.5的TE缓冲液)。转染后，293细胞用10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5％(v/v)CO2的培养箱中培养，转染6h后换新鲜培养液，继续培养66-72h，期间观察培养基颜色变化和293细胞病变情况。若用于包装rAAV-asPLB和阳性对照的293细胞48h出现细胞变圆、脱壁等细胞病变，并且培养基逐渐变为橙黄色；同时阴性对照、空白对照的293细胞和培养基没有明显变化，说明有重组病毒产生。
步骤2，rAAV-asPLB的收集、纯化、鉴定和滴度测定
(1)rAAV-asPLB的收集：
收集步骤1的病变细胞，反复冻融4次，12000rpm室温离心10min，弃上清，即可获得重组腺相关病毒rAAV-asPLB。
(2)rAAV-asPLB的纯化、鉴定和滴度测定
若要提高本发明基因药物rAAV-asPLB的纯度和滴度，可以作进一步的纯化，用PEG/NaCL沉淀法纯化：用蒸馏水复溶(1)中收获的rAAV-asPLB，加入1/10体积的氯仿，置37℃摇床中剧烈振摇1h，加入固体氯化钠至终浓度1mol/L，振摇溶解。4℃，12 000rpm离心15min。取出上层水相，弃去氯仿和沉淀。加PEG8000至终浓度10％(w/v)，振摇溶解后冰浴放置1h，11000rpm离心15min。将上清弃去，用PBS缓冲液将各离心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并，将其分装至1.5mL离心管中。加入DNase和RNase至终浓度1μg/mL，室温下消化30min。加等体积的氯仿抽提。4℃，12 000rpm离心5min，在无菌操作下小心吸出上层水相，即为浓缩和纯化的重组病毒液；然后以PCR法作rAAV-asPLB的鉴定和滴度测定：取部分纯化后的病毒液进行10倍稀释，脱氧核糖核酸酶Dnase I 37℃孵育30min灭活病毒外基因组DNA，56℃孵育15min后，加等体积50μg/ml蛋白酶K溶液，37℃反应1h，酚氯仿抽提后溶于10μL纯水中；然后以此为模板作PCR进行鉴定和滴度测定。rAAV-asPLB纯化后，其滴度可以达到3×1013IU/L。
五、rAAV-asPLB在培养的乳鼠心肌细胞中的应用
取1－3日龄大鼠心室肌，剪成1mm3左右的小块，0.125％(v/v)胰酶重复消化，200目钢网过滤，1000rpm离心5min收集细胞，5％(v/v)CO2细胞培养箱中37℃培养1h，除去贴壁细胞。将细胞调整至1×106/ml接种于6孔板中培养。按照病毒与细胞比值(MOI)为100加入，感染培养的大鼠心肌细胞。
图2是RT-PCR检测心肌细胞转染rAAV-asPLB后转录产物的电泳结果，图3是Western-blot检测心肌细胞转染rAAV-asPLB后蛋白的表达电泳结果。
结果显示：rAAV-asPLB抑制培养的乳鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录和蛋白翻译；降低胞浆Ca2+离子浓度，减轻钙超负荷，增强肌浆网Ca2+-ATPase活性；提高心功能。按照病毒与细胞比值(MOI)为10、50、100、200分别加入重组腺相关病毒rAAV-asPLB，感染培养的大鼠心肌细胞。PLB基因的mRNA和蛋白水平分别用逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot方法来检测。结果显示：MOI为10、50、100时，心肌细胞PLB的mRNA和蛋白水平随着剂量增长而下降，而MOI为200时，PLB的mRNA和蛋白水平与MOI为100时无明显差别。药效实验结果说明rAAV-asPLB可以有效抑制PLB的mRNA和蛋白表达，MOI为100是其对心肌细胞的最有效剂量。
六、rAAV-asPLB用于研究糖尿病大鼠钙调节蛋白的量和活性的变化：
大鼠称重后，按照剂量65mg/kg腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)溶液，制作成功的糖尿病大鼠洁级环境饲养6周后，水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位，气管切开，连接动物呼吸机，打开胸腔，暴露心脏，得到糖尿病大鼠模型。吸取rAAV-asPLB100μL(约1×109IU)分别于糖尿病大鼠模型。心尖和左心室壁各注射50μL。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后，清洁级环境普通饲料饲养。
图4是RT-PCR检测糖尿病大鼠各组PLB mRNA表达水平，图5是Weatern-blot检测各组PLB蛋白表达水平。结果显示：rAAV-asPLB抑制糖尿病大鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录和蛋白翻译；对肌浆网Ca2+-ATPase的量(mRNA转录和蛋白翻译)无明显影响；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性。
七、rAAV-asPLB用于糖尿病大鼠：
按照“六”中的方法复制成功糖尿病大鼠模型，作为糖尿病组；糖尿病大鼠模型心肌注射rAAV-asPLB，作为糖尿病大鼠治疗组；糖尿病大鼠模型注射生理盐水作为糖尿病注射盐水组；正常大鼠注射生理盐水作为对照组。基因治疗6周后，大鼠经腹腔注射10g/100mL水合氯醛(400mg/kg)全身麻醉，取仰卧位，分离右颈总动脉，插入动脉留置管，100u/mL肝素盐水抗凝。留置管前端进入左心室后，后端连接压力传感器，用多导生理MedLab数据记录系统测量左室收缩压(LVSP)，左室舒张末期压(LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt)。血流状态稳定后，将异丙肾上腺素(ISO)按照剂量0.2mg/kg腹腔注射，再记录上述指标。结果如表1所示，表1结果表明：rAAV-asPLB能提高糖尿病大鼠的左心室收缩和舒张能力，改善心功能。
表1异丙肾上腺素刺激后各组血流动力学变化
注：*P<0.05与对照组比较。
八、rAAV-asPLB在冠状动脉结扎的急性心肌梗死大鼠中的应用
大鼠称重后，腹腔注射10g/100mL水合氯醛(400mg/kg)全身麻醉，气管插管，打开胸腔，暴露心脏，结扎冠状动脉的左前降支，造成急性心肌梗死。吸取重组病毒100μL(约1×109IU)在梗死区周围注射重组病毒。关闭胸腔，清洁级饲养。6周后检测心肌PLB的mRNA转录和蛋白表达水平；测定心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性；测量左室收缩压(LVSP)，左室舒张末期压(LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt)。结果显示rAAV-asPLB可以抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录和蛋白翻译；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性；提高左心室收缩和舒张能力，改善心功能。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、病毒、构建方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 695
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 1
cgcagctgag ctcccagact tcacacaact aaacagtctg cattgtgacg atcacagaag 60
ccaaggcctc ctaaaaggag acagctcgcg tttggctgcc tgctgtcaac tttttatctt 120
tctcttgact acttaaaaaa gacttgtctt cctacttttg tcttcctggc atcatggaaa 180
aagtccaata ccttactcgc tcggctatca ggagagcctc gactattgaa atgccccagc 240
aagcgcgtca gaacctccag aacctcttta tcaatttctg tctcatcttg atatgtctgc 300
tgctgatctg catcattgtg atgcttctgt gacaagctgt cgccaccgca gacctgcacc 360
atgccaacgc agcttacaac ctggccctcc accacgaggg aggcagtgcc gccgccttcc 420
tgctggacat cgtcgtgaag gtcacgatta agagtgagac tgatggcagc cagtgtgatc 480
atcggctgga tcttgtaaac tttaccacga ctaagtgtgc acaatgtagc tgcccgtttc 540
ctcagtgtgg ctcataaatg tctttcctaa atacttctga cattgtagta tgagttttaa 600
ttttgaaaca gcactacaaa aaaagttcac tttctatatc cagcactaga aagttcaact 660
tatagcttca gtttggggaa taaatgaaat ttaaa 695
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgggatcccg cagctgagct gagctcccag acttca 36
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggaattctt taaatttcat ttattcccca a 31

Claims (8)

1.一种受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体，其特征在于，所述受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体是分别将如SEQ ID NO.1所示的PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS分别经EcoRI和BamHI双酶切后，将PLB基因片段和腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS的酶切产物连接而成的。
2.一种权利要求1所述的受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1，PLB基因片段的扩增
提取大鼠心肌中RNA，用M-MLV逆转录酶将其反转录为cDNA；然后以cDNA为模板进行RT-PCR；RT-PCR使用的引物有5’端引物序列：5’-cgggatccCGCAGCTGAGCTGAGCTCCCAGACTTCA-3’，3’端引物序列：5’-cggaattcTTTAAATTTCATTTATTCCCCAA-3’；
步骤2，受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体的构建
将步骤1扩增得到的PLB基因片段经EcoRI和BamHI双酶切后得到目的基因片段，腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS经EcoRI和BamHI双酶切后得到载体片段，目的基因片段和载体片段经T4DNA连接酶4℃连接过夜；得到受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体。
3.一种利用权利要求1所述的受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体包装得到的重组腺相关病毒。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒由受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体和辅助质粒共转染工程细胞后包装而成。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述辅助质粒为pAAV-RC载体和pHelper载体；所述工程细胞为293细胞。
6.一种权利要求5所述的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
以pH 7.5的TE缓冲液分别溶解受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体、pAAV-RC载体和pHelper载体，分别得到重组AAV载体溶液、pAAV-RC溶液和pHelper溶液，然后分别吸取重组AAV载体溶液、pAAV-RC溶液和pHelper溶液10μL，用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，包装出重组腺相关病毒，成功包装出重组腺相关病毒的细胞产生病变；反复冻融产生病变的细胞，12000rpm室温离心10min，弃上清，即可获得重组腺相关病毒。
7.一种根据权利要求1所述的受磷蛋白基因反义RNA重组AAV载体在感染体外培养心肌细胞、制备感染心肌细胞的基因药物的应用。
8.一种根据权利要求3所述的重组腺相关病毒在感染体外培养的心肌细胞、制备感染心肌细胞的基因药物的应用。
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