CN1657631A - 表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒及其制备方法，属于生物工程技术领域，用于心力衰竭及其他相关疾病的基因治疗。该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成，该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1和pXXUF3，并在真核表达载体pXXUF1内反向插入了人类受磷蛋白基因编码序列。本发明的表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒制备方法成功，所制备的重组腺相关病毒滴度高，能驱动目的基因长期有效的表达，可以用于心梗及其他相关性疾病所致心力衰竭的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，能表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒重组体(rAAV-asPLB)的构建和制备方法，更具体地说涉及人类受磷蛋白基因的克隆及含反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。
背景技术
受磷蛋白(phospholamban，简称PLB)是一种分子量较小的蛋白质，由52个氨基酸残基构成，主要存在于心肌和平滑肌(J Biol Chem，249：6174-6180(1974))。体外研究提示PLB可被不同的蛋白激酶磷酸化，而磷酸化的PLB解除了其对SERCA2a的抑制效应，引起磷酸化介导的刺激作用(J Biol Chem，261：13333-13341(1986)；Biochem J，252：269-273(1988))。因此，在正常心肌，PLB是肌浆网钙ATPase(SERCA2a)的抑制剂。研究发现心衰时收缩功能异常与PLB磷酸化减少及PLB/SERCA2a比值的升高有关(Circulation Research，79：1059-1063(1996))。因此通过降低PLB的水平或增加PLB的磷酸化，减少其对SERCA2a的抑制，间接提高SERCA2a水平是基因治疗心衰的一个重要策略。
在PLB基因敲除或过表达的大鼠，研究表明PLB/SERCA2a的比值是改善心肌舒张功能的一个潜在靶点。用腺病毒载体导入反义phospholamban(Ad.asPL)基因可提高大鼠心肌细胞SERCA2a的钙敏感性，调节钙的自身平衡。Monte等亦用腺病毒载体将反义phospholamban(Ad.asPL)基因及SERCA2a基因分别转染终末期心衰患者的游离心肌细胞，发现Ad.asPL基因起到与SERCA2a基因相同的改善心肌细胞功能的作用(J Mol Cell Cardiol，31：479-91(1999))。但腺病毒载体表达时间短、对机体有免疫原性，不适合将来的临床应用。
在各种情况下，有重要的原因开发和制备表达人类受磷蛋白反义基因的重组腺相关病毒重组体，因为它可以用作治疗各种原因尤其是原发性心肌病等所致心力衰竭，改善心肌的收缩和舒张功能的潜在药物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供含有反义人受磷蛋白基因的重组腺相关病毒；
本发明的第二个目的是提供含有反义人受磷蛋白基因的重组腺相关病毒的包装和制备过程；
本发明的第三个目的是提供利用含有反义人受磷蛋白基因的重组腺相关病毒治疗心力衰竭的动物实验方法和结果。
为了实现本发明的上述目的，本发明人已经成功从人心肌细胞中克隆出PLB基因，并成功将PLB cDNA反向插入真核表达载体pXXUF1中构成重组质粒pXXUF1-asPLB。之后，将pXX2、pXX6、pXXUF1-asPLB用钙磷共转染法转入293细胞包装制备能表达人反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒，采用肝素柱纯化，斑点杂交法测定滴度。另外，将包装制备的重组腺相关病毒经静脉导入心肌梗塞大鼠发现大鼠心肌组织中PLB蛋白质的表达长期受到明显抑制，说明重组腺相关病毒能介导反义PLB基因长期有效表达，从而抑制心肌PLB蛋白质的表达。并且发现心肌梗塞大鼠心肌的收缩和舒张功能得到明显的改善，主动脉对血管舒缩因子的反应能力增强。
为了获得人PLB基因，本发明人首先设计了扩增PLB cDNA片段的特异性引物，利用从人心肌细胞分离的总RNA作为模板进行RT-PCR。作为结果，获得了显示阳性反应的PLB cDNA，将获得的片断插入克隆载体，在寄主细胞(大肠杆菌)中导入这样获得的载体。另外为了获得含人反义PLB基因的重组腺相关病毒，本发明人又将PLB cDNA反向插入真核表达载体pXXUF1，构成重组质粒pXXUF1-asPLB，同样导入寄主细胞即大肠杆菌，获得阳性克隆。
本发明一种表达人类受磷蛋白反义基因的重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成，该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1和pXXUF3，并在真核表达载体pXXUF1内反向插入了人类受磷蛋白基因编码序列，
1)包装质粒pXX2：它含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍；
2)辅助质粒pXX6：其删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量；
3)真核表达载体pXXUF1：所用的是CMV启动子，有较强的表达效率，其含有Not I多克隆位点，可以连接不同的目的基因，pXXUF1反向连接人受磷蛋白基因，该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端ITRs重复序列，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因，
本发明一种药物组合物，它包括有效量的权利要求1所述的表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
本发明一种制备表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒的方法，
1)提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因——pXX6质粒；
2)提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并反向插入人类受磷蛋白基因，形成重组质粒pXXUF1-asPLB；
3)将步骤1)中的pXX2、pXX6和pXXUF1-asPLB步骤2)共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度；
4)将步骤3)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入心力衰竭动物体内，检测其生物学活性。
本发明在步骤3)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法，真核表达载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子，纯化是用氯化铯梯度离心法，而检测滴度是用斑点杂交法。
本发明一种表达人类受磷蛋白反义基因的重组腺相关病毒，已保藏于武汉大学内中国典型培养物保护中心，保藏日期：2003年7月9日，保藏编号：V200308分类命名：反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒antiphospholamban/AAV
本发明的优越性在于它克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，从而成为基因治疗最有前途的载体。为了能使心力衰竭的基因治疗真正实现，我们将人类受磷蛋白cDNA与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测已获得了可以满足治疗要求的高滴度，在动物实验中也已证实了其可以有效改善心脏收缩和舒张功能，从而有希望真正满足临床治疗的需要。
另一方面，研究了我们包装制备的含人反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒对心急梗死大鼠心功能及心肌重塑的影响，证明rAAV-asPLB经静脉转染心肌梗塞大鼠模型后，能有效阻断大鼠心肌组织PLB的表达，明显改善左室血流动力学各项指标，提高LVSP及+dp/dtmax，降低LVEDP及-dp/dtmax，并增强主动脉环对血管活性物质(去甲肾上腺素)的收缩反应性，减轻心肌胶原沉积、改善心肌的重塑。
显示上面提到的本发明的表达人反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒制备方法成功，所制备的重组腺相关病毒滴度高，能驱动目的基因长期有效的表达，可以用于心梗及其他相关性疾病所致心力衰竭的治疗。
附图说明
图1显示了PLB的序列(取自GENEBANK)，
图2是显示pXXUF1-asPLB的质粒构成，
图3显示了腺相关病毒的核苷酸序列及具体分区，
图4是显示腺相关病毒的基因组构造图，
图5是显示腺相关病毒的ITR序列及二级结构图，
图6是显示腺相关病毒的转录和翻译(一)，
图7是显示腺相关病毒的转录和翻译(二)，
图8是显示pXX2、pXX6质粒图谱构成，
图9是显示pXXUF1质粒构成(注：该质粒构成图只显示质粒的主要部分，实际上这两种质粒已加工为5000-7000bp的环状结构，其余部分无重要性，故不写入)，
图10是显示斑点杂交测定病毒滴度结果。
具体实施方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
[实施例1]PLB cDNA的克隆
为了克隆人PLB cDNA根据图1公开的PLB基因序列首先设计了可扩增PLB cDNA的PCR引物：即5，-ATTGGATCCGCTGGTATCATGGAG-3的正向引物和5，-ATCCTCGAGTCAGAGAAGCATCAC-3的反向引物。然后用自胎儿心肌细胞中提取的总RNA作为模板，进行RT-PCR。逆转录反应在20μl的反应体系中进行，该体系含有10×缓冲液2μl，25nMMgCl2 4μl，10mmol/L dNTPs 2μl，25U/μl的逆转录酶1μl(GibcoBRL)，5μg由胎儿心肌细胞经Trizole试剂提取的总RNA，50pmol/Lrandom 9mers 1μl，30℃10min，55℃30min，99℃5min，5℃5min，该RT产物用作PCR模板。
PCR反应在50μl的反应体系中进行，上述RT产物10μl，10×PCR缓冲液4μl，终浓度为0.3μmol/L的上、下游引物各1μl，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PCR热循环仪中，94℃预变性4min，然后94℃45s，55℃45s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min，电泳后回收1080bp目的片段。以限制性内切酶BamH I和Xho I酶切后的PLB及载体pBluscript KS+(pBS)片段经T4 DNA连接酶连接。5μl DNA连接产物转化DH5α感受态细菌，挑取克隆接种于5ml含氨苄青霉素(70μg/ml)的LB培养基中，培养16h后小量提取质粒DNA，酶切鉴定DNA目的片段正确构建于pBS载体中(pBS·PLB)，并经大连宝生物公司测序证实。
[实施例2]pXXUF1·asPLB重组质粒的制备
将实施例1中获得的PLB基因产物与pXXUF1相连。测序正确的重组体pBS·PLB经酶切位点的转导，最终使得目的基因PLB两端均含有Not I位点，以限制性内切酶Not I分别对PLB及载体pXXUF1进行单酶切后琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收所要片段，按上述方法制备重组质粒pXXUF1·asPLB。PLB cDNA将pXXUF1中的gfp基因取代，质粒图如图2。
[实施例3]rAAV-asPLB重组病毒的包装、回收与纯化
一、天然腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)载体的特点：
腺相关病毒是一种动物单链DNA病毒，它属于细小病毒科，细小病毒亚科，依赖病毒属，自然缺陷、无包被和无致病原性。
1、AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，含4680个核苷酸(序列如图一)，其特点在于：
1)其基因组由4个开放阅读宽读框(ORF)组成，分称rep区、lip区、inf区和cap区(见图1、图2)。位于基因组DNA左端的一个大ORF由于移码突变或缺失会阻止DNA复制，因而被称为rep区，。右端的一个大ORF(cap)编码合成3种外壳蛋白。另有两个小ORF位于基因组DNA的中央区，即inf区和lip区，具体功能尚不清；
2)在分子单链每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(ITR)(见图1)。ITR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件(见图3)。
3)腺相关病毒的复制和转录调节相当复杂，按有无辅助病毒的共转染分，有增殖性和潜伏性两种表达方式(如图4)。
在AAV的增殖性表达中，可转录生成6种mRNA，分别由启动子P5、P19、P40启动合成(如图5)。在腺病毒(Ad)共转染的情况下，Ad的E1A基因负责AAV基因表达的反式激活；Ad E2A基因编码单链DNA结合蛋白，可刺激AAV启动子所启动的转录，还可促进AAV转录后从胞核向胞质转运；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能够正调节和负调节自身基因和辅助病毒基因的表达。AAV的rep基因能够正调节和负调节P5、P19、P40启动子所启动的转录，在有Ad的情况下，rep基因产物行使正调节功能，这是AAV基因大量合成所必须的；而在无辅助病毒共转染的情况下，rep基因产物则起负调节作用。
在无辅助病毒的情况下，AAV DNA以双链形式整合到宿主细胞基因组中，在那里以潜伏状态持续存在，形成AAV的潜伏感染。AAV整合的特异位点是在人染色体的19q13.3-19q ter上。Rep基因产物除了负调节作用外，还可识别和结合特异的整合位点，即GGTC序列，并介导了ITR与整合位点的重组。而腺病毒的感染可使其进入增殖感染状态。
2、AAV作为基因克隆的载体。
AAV是目前已知的唯一能够在宿主基因组特异染色体位点整合的真核细胞病毒。这个发现使基因治疗产生了新的希望，AAV基因治疗载体不仅仅能够和非整合载体(如腺病毒为基础的载体)相比更持续稳定地表达转基因，而且能够减少理论上的由于转基因的随机整合导致的插入突变几率。我们使用的这一套载体系统是将天然腺相关病毒和腺病毒用分子生物学方法经一系列剪切和修饰而成，它们保留了腺相关病毒复制和转录所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因辅助成份，其他多余的部分均已删除，既能实现病毒长期稳定的潜伏感染，又能避免腺病毒的致病危险，而且腺病毒晚期基因的表达可以保证被克隆基因的表达效率。这一载体系统的构成如下：
pXX2：(如图6)保留了AAV的cap基因和rep基因(此时得到pACG-2)，并在下游区域又插入了一个p5启动子(在原来区域用XbaI和PstI切下，再连接到pACG-2的适当位置)。另外我们对照组所使用的报告基因(lacZ)也连在pXX2的下游。方法是：先在pXX2下游造一个ClaI的切口，再在其切口上加一个Sse8387I的接头(5’-CGCCTGCAGG-3’)，把两端为Pst I切口的lacZ片段连接于其上。
PXX6：(如图6)在腺病毒改造质粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包装信号)上用PmeI和SgfI切下一个8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6则是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，仅仅留下E2A、E4和VA编码区。
pXXUF1(如图7)：rAAV包装所用的质粒pXXUF1含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因，它是将腺相关病毒的编码基因全部删除后再由NotI位点导入的。
二、rAAV-asPLB重组病毒的包装与回收
pXX2、pXX6、pXXUF1-asPLB质粒的大量提取，所用大提试剂盒购自Promega公司。方法依产品说明书所述。
将293细胞(人肾母胚胎肿瘤细胞系)传入数个150mm培养板中，传代培养需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、新生小牛血清(购自Gibco公司)。待细胞生长到60％到70％聚集度时，按85μg DNA/150mm培养盘的总量，按摩尔比1∶1∶1(质量比为1.7∶3.8∶1)用钙磷转染法转入293细胞。分别将pXX2、pXX6、pXXUF1-asPLB质粒加入一无菌的250ml培养瓶中，然后依次加入2.5MCaCl2溶液(160μl/盘)和无菌去离子水，最后加入2×BBS(pH6.95，1.6ml/盘)，逐滴加入振摇混合液，以形成较小的钙磷颗粒。之后室温下孵育30min。随即吸弃293细胞培养盘中的培养基，加入3ml DNA-钙磷混合液，于35℃、3％CO2培养16～24小时后换液，转入37℃，5％CO2继续培养36～48小时。转染后48-72小时吸弃所有培养基，加入少量PBS缓冲液，刮取盘中293细胞，后-80℃冻存。
为祛除细胞中的异型蛋白，须用肝素柱纯化，方法如下：将收集的含病毒的293细胞反复冻溶三次，加入0.1mg的DNase I及0.1mg的RNase A酶，37℃抚育2小时；再加入0.5％的脱氧胆酸，37℃抚育30分钟；离心数分钟，上清分别经5μm和0.8μm的滤膜过滤；取8ml肝素琼脂糖混悬液加入一直径为2.5cm装有阀门的玻璃柱中；待琼脂糖混悬液流尽后，在形成的琼脂床上放置一滤膜，用25mlPBS(PH7.4)平衡琼脂床；关闭阀门，将上述经过过滤的病毒原液加入玻璃柱中，打开阀门，控制病毒以1滴/秒的速度滴下；待病毒液滴完后，用25mlPBS(PH7.4)+0.1M NaCl洗两次；用15mlPBS(PH7.4)+0.4MNaCl洗脱病毒；用Millipore Biomax-100k NMWL过滤装置(UFV2BHK40)浓缩病毒液至3～5ml。
[实施例4]rAAV-asPLB病毒滴度的测定一斑点杂交
a)PLB cDNA探针的标记和纯化：
同位素标记的核苷酸α-P32购自北京雅辉公司。用Not I切下pXXUF1-PLB-AS中的PLB片段做为已知序列的探针。随机引物法标记PLB片段并纯化(试剂盒购自QIAGEN公司，方法如说明书)。
b)回收物和定量标准的准备：
回收物经适量DNAse I和RNAse消化，消化细胞基因组的DNA、RNA。反应终止后再加Proteinase K，消化病毒的蛋白质外壳(以上试剂均购自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中为病毒中的DNA。将上清按体积比对倍稀释。标准物采用目的基因片段，即PLB片段，测定浓度后按分子数对倍稀释(具体计算方法略)。并作加热和碱变性处理。
c)杂交与放射自显影
配好斑点杂交装置，并按装置大小安置一块0.45μm的尼龙膜，将待测病毒样品和标准样品按体积梯度和分子梯度分别上样，上样后将膜80℃干烤2小时，后42℃预杂交1小时(预杂交液购自INTERGEN公司)。再加加热处理的标记探针，45℃杂交12-16小时。洗膜后-80℃放射自显影2-3天。结果如图十：此结果说明我们制备的rAAV具备足够的滴度(1×1011pfu/L)，可以用于动物实验和临床治疗。
[实施例5]rAAV-asPLB对心梗心力衰竭大鼠心功能的影响和其他效应
1)心肌梗塞大鼠模型的复制
雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，180-220克，用20％的乌拉坦，按40mg/kg腹腔注射麻醉动物，经口气管插管，接小动物人工呼吸机，调整有效通气量为1.0ml/g.min。连接标准II导联，用MS-302多媒体生物信号采集分析系统监测大鼠心电图，左胸前备皮，碘复消毒皮肤2次，于第3-4肋间作横切口，依次分离各层组织，暴露心脏，剪开心包，用无损伤缝针穿过左旋支下方的心肌表层，结扎左旋支。结扎成功后心电图ST-T立即呈弓背向上抬高。手术成功率约为80％，术后6周存活率月为70％。
2)成功结扎左旋支后2周，实验组经尾静脉注入rAAV-asPLB，对照组给予rAAV-LacZ。观测基因转染后对大鼠心脏血流动力学的影响及主动脉环对血管活性物质反应性的改变，同时通过病理切片的研究观察其对心肌结构的影响。证明rAAV-asPLB经静脉转染心肌梗塞大鼠模型后，能有效阻断PLB的表达，明显改善左室血流动力学各项指标，提高LVSP及+dp/dtmax，降低LVEDP及-dp/dtmax，并增强主动脉环对血管活性物质(去甲肾上腺素)的收缩反应性，减轻心肌胶原沉积、改善心肌的重塑。
Claims (5)
1、一种表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成，该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1和pXXUF3，并在真核表达载体pXXUF1内反向插入了人类受磷蛋白基因编码序列，
1)包装质粒pXX2：它含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍；
2)辅助质粒pXX6：其删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量；
3)真核表达载体pXXUF1：所用的是CMV启动子，有较强的表达效率，其含有Not I多克隆位点，可以连接不同的目的基因，pXXUF1反向连接人受磷蛋白基因，该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端ITRs重复序列，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因。
2、一种药物组合物，它包括有效量的权利要求1所述的表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
3、一种制备表达人类反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒的方法，
1)提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因——pXX6质粒；
2)提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并反向插入人类受磷蛋白基因，形成重组质粒pXXUF1-asPLB；
3)将步骤1)中的pXX2、pXX6和pXXUF1-asPLB步骤2)共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度；
4)将步骤3)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入心力衰竭动物体内，检测其生物学活性。
4、根据权利要求书3所述的方法，在步骤3)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法，真核表达载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子，纯化是用氯化铯梯度离心法，而检测滴度是用斑点杂交法。
5、根据权利要求1所述的一种表达人类受磷蛋白反义基因的重组腺相关病毒，已保藏于武汉大学内中国典型培养物保护中心，保藏口期：2003年7月9日，保藏编号：V200308，分类命名：反义受磷蛋白基因的重组腺相关病毒antiphospholamban/AAV。
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