KR20220034801A - 인간 심근병증에 대한 aav 심장 유전자 요법 - Google Patents

인간 심근병증에 대한 aav 심장 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 심장 상태를 치료하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 개시된 조성물 및 방법은 2개 이상의 트랜스진을 인간 대상체의 심장 내로 전달하기 위한 재조합 AAV 벡터를 포함하는 유전자 요법에 기초하며, 여기서 트랜스진은 S100A1 단백질 및 아폽토시스 억제제인 카스파제 동원 도메인을 갖는 심장 아폽토시스 리프레서 (cARC)를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 인간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 S100A1 및/또는 cARC cDNA 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 심장 상태의 복수의 원인을 표적화하는 것은 치료 동안 상승작용적 이익을 제공할 수 있다.

Description

인간 심근병증에 대한 AAV 심장 유전자 요법
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2019년 7월 19일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/876,540 (발명의 명칭: "AAV CARDIAC GENE THERAPY FOR CARDIOMYOPATHY IN HUMANS")의 출원일의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
심근병증은 대상체에서 심장 질환의 두 번째로 가장 흔한 원인이고, 속발성 징후의 의학적 관리가 유일한 치료 옵션이다. 이환된 대상체에 대한 예후는 질환의 병기 및 계통에 따라 달라진다. 심장 기능은 결정적으로 칼슘-의존성 신호전달에 의존한다. 심장 질환 동안, 심장 세포 내의 칼슘 채널의 기능부전이 칼슘 순환 이상을 촉진하며, 나아가 심장 기능을 억제한다. 칼슘 순환 이상을 감소시키는 유전자 전달 전략은 소형 및 대형 동물 모델에서, 뿐만 아니라 인간 임상 시험에서 심장 질환을 호전시키는 것으로 밝혀졌다.
확장성 심근병증 (DCM)은 인간 심근병증의 가장 흔한 유형이며, 대부분 20대에서 60대의 성인에서 발생한다. DCM은 각각 심장의 하부 및 상부 챔버인 심장의 심실 및 심방에 영향을 미친다. DCM의 대부분의 형태는 관상동맥 심장 질환, 심장 발작, 고혈압, 당뇨병, 갑상선 질환, 바이러스성 간염 및 심장 근육에 염증을 발생시키는 바이러스 감염을 포함하는 다수의 원인으로부터 획득된 형태이다. 또한 알콜 남용 및 특정 약물, 예컨대 코카인 및 암페타민, 뿐만 아니라 암을 치료하는데 사용되는 적어도 2종의 약물 (독소루비신 및 다우노루비신)이 DCM을 유도할 수 있다. 또한, 뒤시엔느 및 베커 근육 이영양증과 연관된 DCM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 유전적 형태의 DCM이 존재한다. 특정 형태의 베커 근육 이영양증의 경우에, 뿐만 아니라 뒤시엔느 근육 이영양증의 대부분의 경우에, 심근병증은 궁극적으로 환자의 생존을 제한할 수 있다.
요약
인간에서, 확장성 심근병증은 심근병증의 가장 흔한 유형이고, 다수의 후천성 상태뿐만 아니라 유전적 상태로부터 유래할 수 있다. 개 및 다른 동물 모델에서와 같이, 질환의 기원은 칼슘 취급 기능장애에 근간을 두지만, 질환의 궁극적인 진행은 심근세포의 미토콘드리아 기능장애 및/또는 신장-유도된 아폽토시스에 의해 유도된다. 칼슘 취급 단독을 다루는 것이 초기 질환 병기에서는 효과적일 수 있지만, 칼슘 취급, 미토콘드리아 기능장애 및 아폽토시스의 조합을 다루는 것이 모든 형태의 DCM 및 모든 병기의 질환 진행을 치료하는데 필요할 것이다.
심근병증 및 울혈성 심부전을 갖는 인간 대상체의 치료를 위한 유전자 전달 접근법이 본원에 개시된다. 이들 접근법은 칼슘 취급을 다루기 위한 S100A1의 발현 및 아폽토시스의 모든 원인을 차단하고 미토콘드리아 기능을 정상화하기 위한 ARC (카스파제 동원 도메인을 갖는 아폽토시스 리프레서)의 발현을 포함한다. 개시된 자기-상보적 AAV 벡터 접근법을 통한 S100A1 및 ARC 트랜스진의 발현은, 신속하며 (즉, 수시간 이내임) (이는 말기 심부전의 효과를 중화시키는데 중요함) 심장에 국한된다. 따라서, 이들 접근법은 DCM 개시 및 진행에 관한 모든 세 가지의 유도인자를 다루고, 따라서 질환 진행의 임의의 병기에서 임의의 형태의 DCM에 적용가능할 것이다.
또한, 인간-유래 단백질 ARC 및 S100A1을 코딩하는 유전자 전달을 위한 일련의 트랜스진이 본원에 개시된다. 이들 트랜스진은 cDNA 서열을 포함할 수 있고, 이들 서열은 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 시스템을 사용하여 전달 및 발현될 수 있다. 개시된 cDNA 서열은 모든 형태의 AAV, 렌티바이러스, 리포솜 및 엑소솜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 유전자 전달 벡터로 전달될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 이들 서열은 i) 인간 ARC를 코딩하는 야생형 또는 최적화된 cDNA 및 ii) 인간 S100A1을 코딩하는 야생형 또는 최적화된 cDNA를 포함하는 AAV 벡터 DNA의 자기-상보적 버전을 사용하여 발현될 수 있다. ARC 및 s100A1 cDNA 서열은, 5'에서 3' 방향으로 ARC가 제1 cDNA를 포함하고 S100A1이 제2 cDNA를 포함하거나, 또는 그 반대이도록 위치할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들 cDNA 서열은 1개의 프로모터보다는 2개의 프로모터 및 IRES를 사용하여 발현될 수 있다.
이들 cDNA 서열의 발현은 제1 cDNA의 5'에 위치한 심장 트로포닌 T 프로모터 (cTnT) 및/또는 제2 cDNA의 5'에 위치한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 작동가능하게 제어될 수 있다. cTnT 프로모터는 AAV가 심장 및 다른 조직 내로의 순환을 통해 또는 직접 주사를 통해 도입될 때 심근세포에 대한 2개의 트랜스진의 발현을 제한한다. 생성되는 ARC의 발현은 심근세포에서 발현되는 경우에 아폽토시스를 방지하고, 미토콘드리아 막 전위를 정상화시키는 것을 도와, 자유 라디칼 발생을 감소시키고 미토콘드리아 기능을 개선시킨다. S100A1 발현은 근육/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA) 펌프 (예를 들어, SERCA 이소형 2a 펌프, 또는 SERCA2a)에 의한 심근세포의 근형질 세망 (SR) 내로의 개선된 칼슘 펌핑 및 리아노딘 수용체 채널을 통한 SR로부터의 감소된 칼슘 누출을 유도한다. 조합은 심근세포 칼슘 취급의 정상화 및 심장에서의 개선된 수축기 및 확장기 기능을 가능하게 한다.
아폽토시스 효과의 부재, 개선된 미토콘드리아 기능, 및 개선된 칼슘 취급의 조합된 효과는 심부전의 진행을 늦추고 심장 기능을 개선시킨다. 개시된 rAAV 벡터는 모든 형태의 인간 심근병증 및 심부전에서 효과적일 수 있다. 따라서, 개시된 rAAV 벡터는 불량한 심장 기능을 포함하는 질환, 장애 또는 상태, 예를 들어 인간 심근병증 및 심부전을 앓고 있는 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 전달될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 트랜스진을 대상체의 심장 내로 전달하기 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 rAAV 벡터는, 하나는 S100 패밀리 단백질을 코딩하고 하나는 아폽토시스 억제제를 코딩하는 적어도 2개의 트랜스진을 포함한다. 이러한 rAAV 벡터는 5'에서 3'으로 순서대로 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 제2 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 트랜스진은 동일한 단일 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 각각의 트랜스진은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 또한 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, 단일 프로모터로부터 발현된 2개의 트랜스진의 3'에 또는 상이한 프로모터로부터 발현된 1개 또는 둘 다의 트랜스진의 3'에 위치함)를 포함한다. 본 개시내용의 측면은 2개 이상의 트랜스진을 대상체의 심장 내로 전달하기 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 핵산 벡터를 제공하며, 여기서 상기 벡터는 5'에서 3'으로, 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, 2개 이상의 트랜스진 및 2개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 제2 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함하며, 여기서 2개 이상의 트랜스진은 S100 패밀리 단백질 및 아폽토시스 억제제를 포함한다.
본 개시내용의 트랜스진은 S100 패밀리 단백질 및 아폽토시스 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, S100 패밀리 단백질은 심장 S100 칼슘-결합 단백질 A1 (cS100A1) 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 아폽토시스 억제제는 카스파제 동원 도메인을 갖는 심장 아폽토시스 리프레서 (cARC) 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 1개 이상의 트랜스진은 자연 발생 또는 야생형 서열이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 트랜스진 (예를 들어 cARC 트랜스진)은 인간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
다양한 실시양태에서, 프로모터, 폴리아데닐화 (폴리A) 신호, 및 2개 이상의 트랜스진을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 트랜스진은 S100 패밀리 단백질 (예를 들어 cS100A1 또는 그의 변이체)을 코딩하고, 제2 트랜스진은 cARC를 코딩한다. 특정한 실시양태에서, S100 패밀리 단백질 및 cARC 트랜스진은 인간으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 트랜스진 (S100 패밀리 단백질을 코딩함)은 서열식별번호(SEQ ID NO): 5로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 대안적으로, 제1 트랜스진은 서열식별번호: 8로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 트랜스진 (S100 패밀리 단백질을 코딩함)은 서열식별번호: 19-21 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 제1 트랜스진은 서열식별번호: 19-21 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스진은 서열식별번호: 21로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 제2 트랜스진은 서열식별번호: 6에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 트랜스진은 서열식별번호: 7에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 제2 트랜스진은 서열식별번호: 6 및 7의 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 트랜스진 (cARC 단백질을 코딩함)은 서열식별번호: 15-18 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 제1 트랜스진은 서열식별번호: 15-18로 기재된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스진은 서열식별번호: 16의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)는 2개 이상의 트랜스진 사이에 (예를 들어, cS100A1 트랜스진과 cARC 트랜스진 사이에) 존재한다. 일부 실시양태에서, S100 패밀리 단백질을 코딩하는 트랜스진은 아폽토시스 억제제를 코딩하는 트랜스진에 대해 5'이다. 다른 실시양태에서, 아폽토시스 억제제를 코딩하는 트랜스진은 S100 패밀리 단백질을 코딩하는 트랜스진에 대해 5'이다.
AAV 캡시드에 캡시드화된, 본원에 개시된 rAAV 벡터를 함유하는 rAAV 입자가 본원에 추가로 제공된다. 본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 rAAV 입자를 함유하는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 심장 질환에 대한 유전자 요법을 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 심장 질환은 대상체에서 심부전을 유발한다. 일부 실시양태에서, 심장 질환은 심근병증이다. 다른 실시양태에서, 심장 질환은 비대성 심근병증 또는 확장성 심근병증이다. 다른 실시양태에서, 심장 질환은 급성 허혈이다.
본 개시내용의 조성물은 상이한 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 심장 내로의 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물의 투여는 대상체의 심장에서 트랜스진 (예를 들어, 2종 이상의 트랜스진)의 발현을 발생시킨다. 다양한 실시양태에서, 조성물을 투여하는 단계는 대상체에서 개선된 심장 기능, 예컨대 10개월 초과 동안 대상체에서 개선된 심장 기능을 생성한다. 일부 실시양태에서, 투여는 12개월 초과, 14개월 초과, 16개월 초과, 17개월 초과, 20개월 초과, 22개월 초과, 또는 24개월 초과 동안 개선된 심장 기능을 생성한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 첨부 도면과 함께 하기 설명을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있으며, 여기서 유사한 참조 번호는 유사한 요소를 나타낸다:
도 1은 예시적인 AAV 구축물의 다이어그램을 도시한다. 제1 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)에 이어 심장 트로포닌 T 프로모터 (cTnT), 이어서 S100 칼슘-결합 단백질 A1 (cS100A1)을 코딩하는 서열, 이어서 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 이어서 카스파제 동원 도메인을 갖는 아폽토시스 리프레서 (cARC)를 코딩하는 서열, 이어서 폴리아데닐화 (PA) 서열, 및 제2 AAV ITR이 이어진다.
도 2는 처리된 근육 이영양증 개로부터의 기준선 및 유전자 전달 수주 후의 확장기 MRI 영상화를 도시한다. 데이터는 확장기 좌심실 부피의 경미한 감소를 갖는 안정한 또는 약간 개선된 심장 재형성을 뒷받침한다.
도 3은 처리된 근육 이영양증 개로부터의 기준선 및 유전자 전달 수주 후의 수축기 MRI 영상화를 도시한다. 데이터는 처리 후 안정한 또는 약간 개선된 좌심실 수축기 기능을 뒷받침하며, 수축기 부피의 경미한 감소는 개선된 수축성 및 좌심실 심장 박출량의 증가를 시사한다.
도 4는 AAVrh.10-S100A1/ARC 처리 후의 D2.mdx 마우스의 박출 계수, 피크 변형률, 및 심장 박출량을 보여준다. 24주 기간에 걸쳐, 치료용 AAV가 주사된 마우스는 모의 주사된 마우스와 비교하여 박출 계수, 변형률 발생, 및 심장 박출량을 더 잘 유지하였다.
도 5는 재조합 AAVrh.10-S100A1/ARC 벡터로 처리된 마우스 및 대조군 마우스에서의 S100A1 및 ARC 발현 수준을 보여준다. 단백질 분석 (웨스턴 블롯)은 S100A1 및 ARC 수준이 둘 다 대조군 (모의 주사됨)과 비교하여 처리된 조직에서 상승되었음을 확인하였다.
도 6은 10X 및 20X 배율 하의 대조군 및 처리된 마우스의 심근세포를 보여준다. 심장 조직학 데이터는 처리된 마우스가 대조군 심장과 비교하여 더 적은 DMD 병리상태를 나타냈음을 나타낸다.
도 7은 캘빈으로 명명된 (2마리 중) 제1 디스트로핀-결핍 개 (GRMD 개)가 재조합 AAVrh.10-S100A1/ARC 처리 후에 개선된 심장 기능 (박출 계수에 의해 측정됨)을 나타냈음을 보여준다. 주사된 개는 둘 다 처리 후 심장 MRI에 의해 측정되고 에코 데이터에 의해 확인된, 박출 계수 및 다른 심장 파라미터의 개선을 나타냈다.
도 8은 세바스티안으로 명명된 제2 GRMD 개가 AAVrh.10-S100A1/ARC 처리 후에 개선된 심장 기능을 나타냈다는 데이터를 보여준다.
도 9a 내지 9c는 AAV-S100A1/ARC 처리가 양쪽 다리의 면적 (도 9a), 최대 단면적 (CSA) (도 9b), 및 양쪽 다리의 부피 (도 9c)에 의해 측정시, GRMD 개의 사지 근육 질량의 MRI 측정에서 혈청 크레아틴 키나제 (CK) 수준을 감소시켰고 근육 위축을 방지하였음을 보여준다. 결과는 골격근 질량이 심장 치료 후에 증가되었거나 또는 변화하지 않고 유지되었음을 입증한다.
도 10은 GRMD 대상체의 골격근에서의 순환 크레아틴 키나제 수준 (CK) 수준이 AAVrh.10-S100A1/ARC 주사 후에 감소되었다는 것을 보여주며, 이는 진행중인 근육 손상의 감소를 나타낸다.
도 11은 코돈-최적화된 개 ARC cDNA 서열과 코돈-최적화된 인간 ARC cDNA 서열 사이의 서열 정렬을 예시한다. 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 15, 16, 및 6에 상응한다.
도 12는 코돈-최적화된 인간 ARC cDNA 서열과 천연 인간 ARC cDNA 서열 사이의 서열 정렬을 예시한다. 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 17, 18, 및 6에 상응한다.
도 13은 코돈-최적화된 인간 S100A1 cDNA 서열과 천연 인간 S100A1 cDNA 서열 사이의 서열 정렬을 예시한다. 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 19, 5, 및 8에 상응한다.
도 14는 코돈 최적화된 개 S100A1 cDNA 서열과 코돈 최적화된 인간 S100A1 cDNA 서열 사이의 서열 정렬을 예시한다. 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 20, 8, 및 21에 상응한다.
도 15는 D2.mdx 마우스 (n=12)의, 1개월령에서의 AAVrh.10-S100A1/ARC 처리 후 10개월령에서의 분획 단축률 및 박출 계수를 보여준다. AAVrh.10-S100A1/ARC 처리된 마우스에서의 분획 단축률 및 박출 계수 둘 다는 야생형 D2 마우스와 유의하게 상이하지 않은 반면, 비처리된 D2.mdx 마우스는 기능의 유의한 감소를 가졌다.
도 16은 D2.mdx 마우스 (n=12)의, 1개월령에서의 AAVrh.10-S100A1/ARC 처리 후 10개월령에서의 좌심실 부피 및 직경을 보여준다. 확장기 및 수축기 둘 다 동안 증가된 부피 및 직경은 확장성 심근병증을 나타낸다. AAVrh.10-S100A1/ARC 처리된 마우스에서의 부피 및 직경 둘 다는 야생형 D2 마우스와 유의하게 상이하지 않은 반면, 비처리된 D2.mdx 마우스는 두 파라미터 모두에서 유의한 증가를 가졌다.
도 17은 6주령에서 운동을 시작하도록 하였지만 6개월령까지 처리를 받지 않은 D2.mdx.sk_우트로핀 마우스 (연구 시작 시에 군당 n=12)의 50% 생존 나이를 보여준다. 처리를 받지 않은 대조군에서, 중앙값 생존은 10개월령이었다. AAVrh.10-ARC를 제공받은 군은 14개월의 중앙값 생존을 가졌고, AAVrh.10-S100A1을 제공받은 군은 16개월의 중앙값 생존을 가졌고, AAVrh.10-S100A1/ARC를 제공받은 군은 20개월의 중앙값 생존을 가졌다.
도 18은 콜로니의 비처리된 GRMD 개 (n=10)에서의 나이에 따른 박출 계수 변화, 및 적색 화살표에 의해 표시된 연령 (3 내지 7개월령)에서 AAVrh.10-S100A1/ARC 벡터로 처리를 받은 개별 GRMD 개에서의 박출 계수 변화를 보여준다. 처리된 개들 중 4마리 모두에서, 박출 계수가 처리 후에 개선되었고, 그 후에 안정하였다.
도 19는 정상 1세령의 골든 리트리버 (가장 좌측 패널) 및 7개월령에 AAVrh.10-S100A1/ARC 벡터로 처리를 받은 GRMD 개 (WnM3/캘빈) (가장 우측 패널)의 좌심실 조직학 (H & E 염색)을 보여준다. 처리된 개는 그의 심장 기능이 여전히 정상 범위에 있었음에도 불구하고 흡인 폐렴으로 인해 34개월령에 사망하였다 (도 18). 중간의 3개의 패널은 8, 24, 및 30개월령의 비처리된 GRMD 개로부터의 좌심실 조직학을 보여준다. 근육 조직을 대체하는 명백한 진행성 섬유증 (분홍색)이 존재한다. 최우측의 처리된 개 패널에서, 조직학은 정상 개의 조직학과 뚜렷하게 상이하지 않으며, 비처리된 GRMD 개보다 현저히 덜 섬유성(fibrotic)이고 더 무손상임을 주목한다.
상세한 설명
본 개시내용은 인간 대상체에서 심장 질환, 예를 들어 심근병증에 대한 심장 유전자 요법의 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은 2개 이상의 트랜스진의 공동 전달 및 발현을 위한 재조합 AAV (rAAV) 입자의 사용에 관한 것이다. 본 개시내용의 트랜스진은, 각각 심장 질환의 상이한 측면을 다루는 특이적 기능을 갖는, 적어도 2가지 부류의 단백질을 포함한다. 트랜스진의 한 부류는 심근세포, 예를 들어 S100 패밀리 단백질에서 칼슘 신호전달을 조절한다. 다른 부류의 트랜스진은 아폽토시스 리프레서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 심장 S100 칼슘-결합 단백질 A1 (cS100A1) 또는 그의 변이체, 및 카스파제 동원 도메인을 갖는 심장 아폽토시스 리프레서 (cARC) 또는 그의 변이체일 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 적어도 부분적으로, 2종의 트랜스진, 예를 들어 S100A1 및 ARC가 대상체의 심장에서 공동으로 전달되고 발현되는 경우에 이들의 상승작용적 효과에 기초한다. S100A1 단백질은 수축 기능의 정상화로 이어지는 근형질 세망 칼슘 과도상태의 정상화를 포함한 칼슘 취급의 측면을 개선시킨다. ARC 단백질은 미토콘드리아 및 비-미토콘드리아 메카니즘 (예컨대 신장-유도된 아폽토시스)에 의해 개시되는 아폽토시스를 차단하고, 미토콘드리아 기능을 개선시킨다. 다시 말해서, S100A1 및 ARC는 상승작용적 이익을 나타내는 심부전의 2가지 개별 요인 (칼슘 취급 기능장애 및 아폽토시스)을 다루어, 보다 우수한 장기간 치료 결과를 유도한다. 추가로, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 심부전의 임의의 질환 단계에서 효과적이다.
트랜스진, 예를 들어 S100A1 및 ARC 또는 그의 변이체를 대상체의 심장 내로 전달하는데 적합한 rAAV 입자를 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 이러한 rAAV 입자는 트랜스진을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 분자는 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 핵산 벡터를 포함한다. 재조합 AAV 게놈은 AAV 게놈의 숙주 게놈 내로의 통합 및 트랜스진의 발현을 용이하게 하는 서열 요소를 추가로 포함할 수 있는 단일-가닥 DNA이다. 예를 들어, 재조합 AAV 게놈은 표적 조직 또는 기관에서 트랜스진의 발현을 보장하기 위한 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 rAAV 입자는 심장 상태의 치료를 위한 조성물에 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 트랜스진을 대상체의 심장 내로 전달하기 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터는 하나는 S100 패밀리 단백질을 코딩하고 하나는 아폽토시스 억제제를 코딩하는 적어도 2개의 트랜스진을 포함한다. 이들 rAAV 벡터는 5'에서 3'으로 순서대로 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 제2 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 트랜스진은 동일한 단일 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 각각의 트랜스진은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 또한 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, 단일 프로모터로부터 발현된 2개의 트랜스진의 3'에 또는 상이한 프로모터로부터 발현된 1개 또는 둘 다의 트랜스진의 3'에 위치함)를 포함한다.
본 개시내용은 2개 이상의 트랜스진을 대상체의 심장 내로 전달하기 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 핵산 벡터를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 정확히 2개의 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 3개의 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 5'에서 3'으로, 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, 2개 이상의 트랜스진, 및 2개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 제2 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 2개 이상의 트랜스진은 S100 패밀리 단백질을 포함하는 제1 트랜스진 및 아폽토시스 억제제를 포함하는 제2 트랜스진을 포함한다.
본원에 사용된 "트랜스진"은 자연적으로, 또는 다수의 유전자 조작 기술 중 임의의 것에 의해 한 유기체로부터 또 다른 것으로 전달된 유전자 또는 유전 물질을 지칭한다. 트랜스진은 관심 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, S100A1, ARC) 또는 관심 RNA (예를 들어, siRNA 또는 마이크로RNA)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 rAAV 벡터는 1개 이상의 트랜스진에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 rAAV 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 트랜스진에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 S100A1 및 ARC 둘 다의 코딩 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 Rep 단백질을 코딩하는 영역을 추가로 포함한다. 본 개시내용의 트랜스진은 각각 하나 이상의 심장 상태의 상이한 측면을 다루는 특이적 기능을 갖는 2가지 부류의 단백질을 포함한다. 트랜스진의 한 부류는 심근세포, 예를 들어 S100 패밀리 단백질에서 칼슘 신호전달을 조절할 수 있다. 또 다른 부류의 트랜스진은 아폽토시스 리프레서를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 자연에서 발생하는 것으로부터 벗어나는 특징을 갖는 핵산을 지칭하며, 예를 들어 "변이체"는 야생형 핵산과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 예를 들어, 트랜스진 변이체는 그의 야생형 서열과 비교하여 트랜스진의 뉴클레오티드에 1개 이상의 치환을 포함하는 핵산이다. 이들 치환은 침묵 치환일 수 있으며, 즉 이들은 임의의 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변형시키지 않는다 (또는 달리 변이체 아미노산 서열을 생성함). 대안적으로, 이들 치환은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변형시켜, 야생형 단백질 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-15, 또는 15-20개의 아미노산 치환)을 갖는 코딩된 단백질을 생성할 수 있다. 이들 치환은 화학적 변형 뿐만 아니라 말단절단을 포함한다. 상기 용어는 야생형 핵산 서열의 기능적 단편을 추가로 포함한다. 참조 서열의 이들 변형은 참조 서열의 5' 또는 3' 말단에서, 또는 이러한 위치들 사이의 어디서든 참조 서열 내의 뉴클레오티드들 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 1개 이상의 인접한 기 내에 산재되어 발생할 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 예를 들어 트랜스진의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 질의 서열 (예를 들어, 본 개시내용의 서열)과 대상 서열 사이의 최상의 전체 매치를 결정하기 위한 바람직한 방법 (전반적 서열 정렬로도 지칭됨)은 문헌 [Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990))]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 또는 blastn 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 둘 다 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 전반적 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로서 표현된다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 파라미터는 매트릭스=PAM 0, k-투플=2, 미스매치 페널티=1, 연결 페널티=20, 무작위화 군 길이=0, 컷오프 점수=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 아미노산 서열의 길이 중 더 짧은 것이다. 뉴클레오티드가 매치/정렬되는지 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 상기 백분율을, 특정화된 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성으로부터 감산하여 최종 퍼센트 동일성 점수에 도달하게 된다. 상기 최종 퍼센트 동일성 점수는 본 개시내용의 목적을 위해 사용되는 것이다. 질의 서열에 비해 5' 및/또는 3' 말단에서 말단절단된 대상 서열에 대해, 퍼센트 동일성은 상응하는 대상 뉴클레오티드와 매치/정렬되지 않는, 질의 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하는 질의 서열의 뉴클레오티드의 수를 질의 서열의 총 염기의 퍼센트로서 계산함으로써 보정된다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 S100 패밀리 단백질은, 비제한적으로, S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5, S100A6, S100A7 (예를 들어, 프소리아신), S100A8 (예를 들어, 칼그라눌린 A), S100A9 (예를 들어, 칼그라눌린 B), S100A10, S100A11, S100A12 (예를 들어, 칼그라눌린 C), S100A13, S100A14, S100A15 (예를 들어, 코에브네리신), S100A16, S100B, S100P, 및 S100Z, 또는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, S100 패밀리 단백질은 S100 칼슘-결합 단백질 A1 (S100A1)일 수 있다. 일부 실시양태에서, S100A1은 심장 S100A1 (cS100A1) 또는 그의 변이체이다. cS100A1 단백질은 심근 수축성의 조절인자이다. cS100A1 단백질 수준은 폐고혈압의 모델에서 우심실 비대 조직에서 감소된다. 추가로, S100A1은, S100A1이 MYH7, ACTA1 및 S100B를 포함한 비후성 유전자의 알파1 아드레날린성 자극을 억제한다는 점에서 심장 비대의 기저를 이루는 유전자 프로그램의 조절인자이다.
심근세포에서, S100A1은 리아노딘 수용체 2 (RYR2), 근육/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA), 티틴 및 미토콘드리아 F1-ATPase 활성의 조정을 통해 SR, 근절 및 미토콘드리아 기능의 칼슘-제어 네트워크를 조절한다. 그 결과, 증가된 S100A1 발현을 갖는 심근세포 및 심장은 증가된 수축기 및 확장기 성능을 나타내며, 이는 증대된 SR Ca2+ 로드 및 후속 수축기 Ca2+ 방출과 함께 감소된 확장기 SR Ca2+ 누출 및 증진된 Ca2+ 재-격리로 인한 개선된 Ca2+ 일시적 진폭의 결과이다. 동시에, S100A1은 미토콘드리아 고-에너지 포스페이트 생산을 증가시키고, 따라서 증진된 심근세포 Ca2+ 전환에 의한 증가된 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP) 요구에 의해 에너지 공급을 조정한다. 심근세포에서의 감소된 S100A1 발현은 감소된 수축 기능과 연관되며, 이는 이 단백질의 병리생리학적 유의성을 입증한다.
일부 실시양태에서, 임의의 개시된 rAAV 벡터의 폴리뉴클레오티드의 S100A1 cDNA (트랜스진) 서열은 자연 발생 인간-유래 S100A1 서열에 대해 100% 동일성을 갖는다. 다른 실시양태에서, S100A1 cDNA 서열은 자연 발생 S100A1 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 동일성, 또는 적어도 약 99.9% 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, S100A1 cDNA 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, S100A1 cDNA (트랜스진) 서열은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 8에 대해 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, S100A1 cDNA 서열은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 약 70%의 동일성, 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 95%의 동일성, 적어도 약 96%의 동일성, 적어도 약 97%의 동일성, 적어도 약 98%의 동일성, 적어도 약 99%의 동일성, 적어도 약 99.5%의 동일성, 또는 적어도 약 99.9%의 동일성을 갖는다.
다른 실시양태에서, S100A1 cDNA 서열은 개 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 21에 대해 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 동일성, 또는 적어도 약 99.9% 동일성을 갖는 S100A1 cDNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 21을 포함한다.
S100A1 cDNA 서열의 비제한적 예는 하기 기재된다.
천연 S100A1 (호모 사피엔스)
Figure pct00001
최적화된 S100A1 (호모 사피엔스)
Figure pct00002
코돈-최적화된 인간 S100A1 cDNA 서열과 천연 인간 S100A1 cDNA 서열 (각각 서열식별번호: 8 및 5) 사이의 뉴클레오티드 서열 정렬이 도 13에 제시된다.
참조로, 동물-유래 S100A1 cDNA 서열의 특정 비제한적 예가 하기 기재된다. 코돈-최적화된 개 S100A1 cDNA 서열과 코돈-최적화된 인간 S100A1 cDNA 서열 (각각 서열식별번호: 21 및 8) 사이의 뉴클레오티드 서열 정렬이 도 14에 제시된다.
S100A1 (카니스 루푸스 파밀리아리스(canis lupus familiaris))
(NCBI 참조 서열: XM_005622816.2)
Figure pct00003
S100A1 (펠리스 카투스(felis catus))
(NCBI 참조 서열: XM_003999773.3)
Figure pct00004
본 개시내용의 측면은 아폽토시스 억제제 (예를 들어, 항아폽토시스제)를 코딩하는 트랜스진의 전달을 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 아폽토시스 억제제의 예시적인 예는 아데노바이러스로부터의 fink, p35, crmA, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, E1B-19K, 뿐만 아니라 아폽토시스촉진제 (예를 들어, 안티센스, 리보자임, 항체 등)의 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 억제제는 카스파제 동원 도메인을 갖는 심장 아폽토시스 리프레서 (ARC) 또는 그의 변이체이다. 다른 실시양태에서, 아폽토시스 억제제는 심장 ARC 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, S100 패밀리 단백질 및 아폽토시스 억제제를 개별적으로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, S100 패밀리 단백질을 코딩하는 트랜스진은 1종 이상의 소분자 아폽토시스 억제제와 공동으로 또는 순차적으로 전달된다. 다른 예시적인 소분자 아폽토시스 억제제는 c-Myc 억제제, Bax 억제제, p53 억제제, tBid 억제제, 카스파제 억제제, 및 아폽토시스촉진 BCL-2 패밀리 구성원의 억제제를 포함한다.
cARC는 거의 독점적으로 근형성 세포에서 발현되는 아폽토시스 조절 단백질이다. 이는 카스파제 동원 도메인 (CARD)을 함유하며, 이를 통해 일부 개시제 카스파제의 활성화를 차단한다. ARC는 또한 아폽토시스와 연관된 카스파제-비의존성 사건을 차단한다. 급성 허혈 및 후속 심실 재형성에 의해 유발된 아폽토시스는 심부전의 매개자로서 연루된다. 허혈후 심부전은 다수의 원인을 가질 수 있지만, 최근의 관심은 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸의 기여를 이해하는 것에 관한 것이다. 아폽토시스는 미토콘드리아 및 근초막의 보존, 핵 염색질 응축, 및 염증 반응을 촉발하지 않는 대식세포 또는 이웃 세포에 의한 식세포작용을 특징으로 한다. 아폽토시스의 활성화는 불활성 전구체로서 합성되고 그의 활성 형태로 단백질분해적으로 절단되는 시스테인 프로테아제의 패밀리인 카스파제를 수반하는 메카니즘을 통해 발생하는 것으로 공지되어 있다. ARC는 카스파제를 차단함으로써 아폽토시스의 활성화를 차단할 수 있다.
따라서, 일부 측면에서, 서열식별번호: 6-8, 16, 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터 (또는 rAAV 핵산 벡터)가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 6-8, 16 및 21 중 어느 하나의 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 12개 초과의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 특정 실시양태에서, 임의의 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 6-8, 16, 및 21 중 임의의 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 cARC 및 S100 트랜스진 서열은 야생형 서열에 비해 5' 또는 3' 말단에서 말단절단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 트랜스진 서열은 서열식별번호: 5-8 및 15-21에 비해 5' 또는 3' 말단에서 말단절단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호: 5-8 및 15-21 중 어느 하나의 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 12개 초과의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터의 폴리뉴클레오티드의 심장 ARC cDNA (또는 트랜스진) 서열은 자연 발생 인간-유래 cARC 서열에 대해 100% 동일성을 갖는다. 다른 실시양태에서, cARC cDNA 서열은 자연 발생 인간-유래 cARC 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 동일성, 또는 적어도 약 99.9% 동일성을 갖는다.
특정한 실시양태에서, cARC cDNA 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, cARC cDNA (트랜스진) 서열은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7에 대해 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, cARC cDNA 서열은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7에 대해 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 동일성, 또는 적어도 약 99.9% 동일성을 갖는다.
다른 실시양태에서, cARC cDNA 서열은 개 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 16에 대해 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 동일성, 또는 적어도 약 99.9% 동일성을 갖는 cARC cDNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 16을 포함한다.
cARC cDNA 서열의 비제한적 예는 하기 기재된다.
최적화된 ARC (호모 사피엔스)
Figure pct00005
최적화된 ARC (호모 사피엔스)
Figure pct00006
코돈-최적화된 인간 ARC cDNA 서열과 천연 인간 ARC cDNA 서열 (각각 서열식별번호: 6 및 18) 사이의 뉴클레오티드 서열 정렬이 도 12에 제시된다.
참조로, 동물-유래 ARC cDNA 서열의 특정 비제한적 예가 하기에 기재된다. 코돈-최적화된 개 ARC cDNA 서열과 코돈-최적화된 인간 ARC cDNA 서열 (각각 서열식별번호: 16 및 6) 사이의 뉴클레오티드 서열 정렬이 도 11에 제시된다.
ARC (카니스 루푸스 파밀리아리스)
(NCBI 참조 서열: NM_001048121.1)
Figure pct00007
Figure pct00008
ARC (펠리스 카투스)
(NCBI 참조 서열: XM_006941587.2)
Figure pct00009
다른 측면에서, 임의의 개시된 rAAV 벡터의 2개 이상의 트랜스진은 우성 음성 형태의 포스포람반 (또는 dn-PLN)을 포함하는 트랜스진을 포함한다. 포스포람반 (PLN)은 심근세포의 근형질 세망 (SR) 내로의 칼슘 이온 재흡수를 매개하는, 근육/내형질 세망 Ca2+ATPase 2a (SERCA2a) 펌프의 내인성 억제제이다. 우성 음성 형태는 SERCA2a에 결합하는 것에 대해 천연 포스포람반과 경쟁하여 SERCA2a에 대한 그의 억제 효과를 감소시키는 가인산화 형태이다 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Bish, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(8): 969-977] 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터의 제2 트랜스진은 dn-PLN을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터는 임의의 개시된 S100A1 트랜스진 (예를 들어, 인간 코돈-최적화된 S100A1 서열) 및 dn-PLN 트랜스진을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터는 S100A1 단백질 및 dn-PLN 단백질을 코딩하여 세포 내로 전달할 수 있다.
추가 측면에서, 임의의 개시된 rAAV 벡터는 3개 이상의 트랜스진을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 3개의 트랜스진을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제3 트랜스진은 dn-PLN 서열이다. 상기 3개의 트랜스진은 S100A1을 코딩하는 제1 트랜스진 (예를 들어, 인간 코돈-최적화 S100A1 서열), cARC를 코딩하는 제2 트랜스진 (예를 들어, 인간 코돈-최적화 cARC 서열), 및 dn-PLN을 코딩하는 제3 트랜스진을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터는 개 또는 고양이로부터 유래된 단백질을 코딩하지 않는다. 일부 실시양태에서, 임의의 개시된 벡터는 천연 개 또는 고양이 S100A1-코딩 또는 ARC-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 1 또는 2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 3 또는 4, 또는 서열식별번호: 1-4 중 임의의 것을 포함하지 않는다.
재조합 AAV (rAAV) 벡터
본 개시내용의 측면은 심장 질환에 대한 유전자 요법에 사용될 수 있는 재조합 AAV 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 게놈), 야생형 AAV 게놈, 또는 바이러스 게놈을 포함하는 바이러스를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "벡터"는 바이러스 입자, 예컨대 AAV 바이러스 입자를 지칭할 수 있다.
야생형 AAV 게놈은 양성- 또는 음성-센스 단일-가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA)이다. 게놈은 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR) (DNA 가닥의 각 말단에 하나씩), 및 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF): ITR 사이의 rep 및 cap를 포함한다. rep ORF는 AAV 생활 주기에 요구되는 Rep 단백질을 코딩하는 4개의 중첩 유전자를 포함한다. cap ORF는 바이러스 캡시드를 형성하기 위해 함께 상호작용하는 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3을 코딩하는 중첩 유전자를 포함한다. VP1, VP2 및 VP3은 하나의 mRNA 전사체로부터 번역되고, 이는 2가지 상이한 방식으로 스플라이싱될 수 있다. 보다 긴 또는 보다 짧은 인트론이 절제되어 mRNA의 2개의 이소형: ~2.3 kb- 및 ~2.6 kb-길이 mRNA이소형의 형성을 유발할 수 있다. 캡시드는 AAV 게놈을 보호할 수 있는 비-외피보유, T-1 이십면체 격자 내로 대략 60개의 개별 캡시드 단백질 서브유닛의 초분자 어셈블리를 형성한다. 성숙 AAV 캡시드는 약 1:1:10 비의 VP1, VP2, 및 VP3 (각각 대략 87, 73, 및 62 kDa의 분자 질량)으로 구성된다.
재조합 AAV (rAAV) 입자는 재조합 핵산 벡터 (이하 "rAAV 벡터"로 지칭됨)를 포함할 수 있으며, 이는 최소, (a) 트랜스진을 코딩하는 서열을 포함하는 1개 이상의 이종 핵산 영역; 및 (b) 대상체의 게놈 내로의 이종 핵산 영역 (임의로 발현을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 영역을 포함함)의 통합을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체의 게놈 내로의 이종 핵산 영역 (임의로 발현을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 영역을 포함함)의 통합을 용이하게 하는 서열은 1개 이상의 핵산 영역 (예를 들어, 이종 핵산 영역)에 플랭킹된 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열 (예를 들어, 야생형 ITR 서열 또는 조작된 ITR 서열)이다.
일부 실시양태에서, rAAV 핵산 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하며, 여기서 1개 이상의 트랜스진은 각각의 측면 상에 ITR 서열이 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 ITR이 플랭킹된 영역 내에 또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 영역 또는 핵산 외부에 함유된, 본원에 기재된 바와 같은 Rep 단백질을 코딩하는 영역을 추가로 포함한다. ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)으로부터 유래될 수 있거나 또는 1종 초과의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAV2 또는 AAV6 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제1 혈청형은 AAV2 또는 AAV8 혈청형이 아니다. 일부 실시양태에서, 제1 혈청형의 ITR 서열은 AAV3, AAV5 또는 AAV6으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAV2, AAV3, AAV5 또는 AAV6으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 캡시드와 동일한 혈청형 (예를 들어, AAV6 ITR 서열 및 AAV6 캡시드 등)이다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAVrh.10 혈청형으로부터 유래된다.
ITR 서열 및 ITR 서열을 함유하는 플라스미드는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 펜실베니아주 필라델피아 소재의 벡터 바이오랩스(Vector Biolabs); 캘리포니아주 샌디에고 소재의 셀바이오랩스(Cellbiolabs); 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 및 매사추세츠주 캠브리지 소재의 애드진(Addgene)으로부터 입수가능한 제품 및 서비스; 및 문헌 [Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; and Curtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 ⓒ Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. YoungJr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski]; 미국 특허 번호 5,139,941 및 5,962,313 (모두 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV2 ITR을 함유하는 플라스미드인 pTR-UF-11 플라스미드 백본을 포함한다. 이 플라스미드는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC MBA-331)으로부터 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 대상체에서의 그의 공동 전달 및 발현을 위해 cS100A1 트랜스진 및 cARC 트랜스진 둘 다를 포함한다. S100 패밀리 단백질을 코딩하는 트랜스진 (예를 들어, cS100A1)은 본원에 기재된 rAAV 핵산 벡터 내에서 아폽토시스 억제제를 코딩하는 트랜스진 (예를 들어, cARC)에 대해 5'에 위치할 수 있다. 대안적으로, 아폽토시스 억제제를 코딩하는 트랜스진은 기재된 rAAV 핵산 벡터 내에서 S100 패밀리 단백질을 코딩하는 트랜스진의 5'에 위치할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 트랜스진의 발현을 용이하게 하는 서열 (예를 들어, 이종 핵산), 예를 들어 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 1개 이상의 영역을 포함한다. 수많은 이러한 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 제어 서열의 비제한적 예는 프로모터, 인슐레이터, 사일런서, 반응 요소, 인트론, 인핸서, 개시 부위, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 종결 신호, 및 폴리(A) 신호를 포함한다. 이러한 제어 서열의 임의의 조합이 본원에서 고려된다 (예를 들어, 프로모터 및 폴리(A) 신호). 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 트랜스진의 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고 트랜스진의 발현을 용이하게 하는 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 "프로모터"는 나머지 핵산 서열의 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산의 제어 영역을 지칭한다. 프로모터는 그것이 조절하는 핵산 서열의 전사를 유도하며, 따라서 이는 전형적으로 유전자의 전사 개시 부위에, 또는 그 근처에 위치한다. 프로모터는 예를 들어 100 내지 1000개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 핵산, 또는 핵산의 서열 (뉴클레오티드 서열)에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는, 프로모터가 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및 배향에 있을 때 프로모터가 그 서열을 조절하도록 (예를 들어, 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어 ("유도") 하도록) 조절하는 핵산의 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 프로모터는 대상체의 심장에서 트랜스진의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 본원에 사용된 "조직-특이적 프로모터"는 특정 유형의 조직, 예를 들어 심장에서만 기능할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 따라서, "조직-특이적 프로모터"는 다른 유형의 조직에서 트랜스진의 발현을 유도할 수 없다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 프로모터는 심장-국한 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 심장 트로포닌 C, 심장 트로포닌 I, 및 심장 트로포닌 T (cTnT)로부터 선택된 심장-국한 프로모터이다.
대안적으로, 프로모터는 비제한적으로 하기 유전자 중 하나로부터의 프로모터일 수 있다: α-미오신 중쇄 유전자, 6-미오신 중쇄 유전자, 미오신 경쇄 2v (MLC-2v) 유전자, 미오신 경쇄 2a 유전자, CARP 유전자, 심장 α-액틴 유전자, 심장 m2 무스카린성 아세틸콜린 유전자, ANF, 심장 트로포닌 C, 심장 트로포닌 I, 심장 트로포닌 T (cTnT), 심장 근형질 세망 Ca-ATPase 유전자, 골격 α-액틴; 또는 MLC-2v 유전자로부터 유래된 인공 심장 프로모터.
개시된 rAAV 벡터의 일부 실시양태에서, 2개 이상의 트랜스진은 단일 프로모터에 의해 작동가능하게 제어된다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 트랜스진 각각은 별개의 프로모터에 의해 작동가능하게 제어된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 추가로 포함한다. IRES는 단백질 합성의 보다 큰 프로세스의 일부로서 메신저 RNA (mRNA) 서열의 중간에서 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이다. 통상적으로, 진핵생물에서, 번역은 mRNA 분자의 5' 말단에서만 개시될 수 있는데, 이는 5' 캡 인식이 개시 복합체의 어셈블리에 요구되기 때문이다. 일부 실시양태에서, IRES는 트랜스진 사이에 위치한다. 이러한 실시양태에서, 상이한 트랜스진에 의해 코딩된 단백질은 개별적으로 번역된다 (즉, 융합 단백질로서 번역되는 것과 대조적임).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 폴리아데닐화 (pA) 신호를 추가로 포함한다. 진핵 mRNA는 전형적으로 전구체 mRNA로서 전사된다. 폴리아데닐화 프로세스를 포함하여, 전구체 mRNA가 프로세싱되어 성숙 mRNA가 생성된다. 폴리아데닐화의 프로세스는 유전자의 전사가 종결됨에 따라 시작된다. 새로 제조된 전구체 mRNA의 가장 3'의 절편은 먼저 단백질 세트에 의해 절단된다. 이어서, 이들 단백질은 RNA의 3' 말단에서 폴리(A) 꼬리를 합성한다. 절단 부위는 전형적으로 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 AAUAAA를 함유한다. 폴리(A) 꼬리는 mRNA의 핵 유출, 번역 및 안정성에 중요하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 적어도 5'에서 3'의 순서로 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터, 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 IRES, 폴리아데닐화 신호, 및 제2 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV는 원형이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 선형이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일-가닥이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 자기-상보적 rAAV 벡터이다. 본원에 기재된 임의의 rAAV 벡터는 바이러스 캡시드, 예컨대 AAV6 캡시드 또는 임의의 다른 혈청형 (예를 들어, ITR 서열과 동일한 혈청형의 혈청형)에 의해 캡시드화될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 rAAV 벡터가 하기 기재된다. 하기 예시된 벡터는 서열식별번호: 9-12로 기재된 선형화된 플라스미드 서열을 포함한다. 본 개시내용의 벡터는 서열식별번호: 9-12로 기재된 서열에 대해 적어도 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 동일성, 또는 적어도 약 99.9% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 이어지는 특징에서 주석이 달린다.
일부 실시양태에서, 임의의 개시된 rAAV 핵산 벡터 서열은 서열식별번호: 9-12 중 어느 하나의 서열에 비해 5' 또는 3' 말단에서 말단절단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 rAAV 벡터는 서열식별번호: 9-12 중 어느 하나의 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개, 또는 18개 초과의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
pAAVsc.cTnT.Opt.hARC_Opt.hS100A1 (서열식별번호: 9)
Figure pct00010
Figure pct00011
pAAVsc.cTnT.Opt.hS100A1_Opt.hARC (서열식별번호: 10)
Figure pct00012
Figure pct00013
pAAVsc.cTnT.hS100A1.hARC_opt (서열식별번호: 11)
Figure pct00014
Figure pct00015
pAAVsc.cTnT.hARC_Opt.hS100A1 (서열식별번호: 12)
Figure pct00016
Figure pct00017
재조합 AAV (rAAV) 입자
rAAV 바이러스 입자 또는 이러한 입자를 함유하는 rAAV 제제가 본원에 추가로 제공된다. rAAV 입자는 바이러스 캡시드, 및 바이러스 캡시드에 의해 캡시드화되는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 포함한다. rAAV 입자를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167]; 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0015238 및 US 2012/0322861; 및 ATCC 및 셀 바이오랩스, 인크.로부터 입수가능한 플라스미드 및 키트 참조). 예를 들어, rAAV 벡터를 함유하는 플라스미드는, 예를 들어 rep 유전자 (예를 들어, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 코딩함) 및 cap 유전자 (본원에 기재된 바와 같은 변형된 VP3 영역을 포함한 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩함)를 함유하는 1개 이상의 헬퍼 플라스미드와 조합될 수 있고, rAAV 입자가 패키징되고 후속적으로 정제될 수 있도록 생산자 세포주 내로 형질감염될 수 있다.
rAAV 입자 또는 본원에 개시된 rAAV 제제 내의 입자는 임의의 유도체 또는 유사형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2/1, 2/5, 2/8, 2/9, 3/1, 3/5, 3/8, 또는 3/9)을 포함한 임의의 AAV 혈청형의 것일 수 있다. 본원에 사용된 rAAV 및 rAAV 입자의 혈청형은 재조합 바이러스의 캡시드 단백질의 혈청형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 rAAV6 또는 rAAV9이다. 유도체 및 유사형의 비제한적 예는 AAVrh.10, AAVrh.74, AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAV2/9, AAV2-AAV3 하이브리드, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV-HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6 (Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, AAV 클론 32/83, AAVShH10, AAV2 (Y->F), AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41, 및 AAVr3.45를 포함한다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/유사형, 및 이러한 유도체/유사형을 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.] 참조). 특정 실시양태에서, 임의의 본원에 개시된 rAAV 입자의 캡시드는 AAVrh.10 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV2/6 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 (a) 하나의 혈청형 (예를 들어, AAV2, AAV3)으로부터의 ITR을 포함하는 rAAV 벡터 및 (b) 또 다른 혈청형 (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10)으로부터 유래된 캡시드 단백질로 구성된 캡시드를 포함하는 유사형화 rAAV 입자이다. 유사형화 rAAV 벡터를 생산하고 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001] 참조).
심장 질환에 대한 rAAV 유전자 요법
본 개시내용은 또한 개시된 rAAV 입자 또는 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, rAAV 제제는 제1 혈청형 (예를 들어, AAV3, AAV5, AAV6, 또는 AAV9)의 ITR을 함유하는 rAAV 벡터 및 rAAV 벡터를 캡시드화하는 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 제1 혈청형 (예를 들어, AAV3, AAV5, AAV6, 또는 AAV9)의 것이다. 일부 실시양태에서, 제제는 AAV2 ITR을 함유하는 rAAV 벡터를 사용하여 제조된 제제에 비해 (예를 들어, 인간 간세포성 암종 세포주, 예컨대 Huh7에서) 적어도 4배 더 높은 형질도입 효율을 갖는다.
본원에 기재된 바와 같이, 이러한 조성물은 제약 부형제, 완충제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 동물, 특히 인간에서 생체외 또는 계내 숙주 세포에 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 임의로 리포솜, 지질, 지질 복합체, 마이크로구체, 마이크로입자, 나노구체 또는 나노입자를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 그를 필요로 하는 인간 대상체의 세포, 조직, 기관 또는 신체에 투여하기 위해 달리 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 유발하는 상태를 포함한, 예를 들어 펩티드 결핍, 폴리펩티드 결핍, 펩티드 과다발현, 폴리펩티드 과다발현과 같은 상태의 호전, 예방 및/또는 치료에서와 같은 다양한 요법에서 사용하기 위해 제제화될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV 벡터, rAAV 입자, 또는 rAAV 입자를 포함하는 조성물은 그를 필요로 하는 인간 대상체에서 심장 질환에 대한 유전자 요법에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 심장 질환의 예는 심근병증 및 급성 허혈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 심장 심근병증은 비대성 심근병증 또는 확장성 심근병증이다. 심근병증 또는 다른 심장 질환에 의해 유발된 심부전은 칼슘 취급 기능장애 및 아폽토시스의 2가지 구성요소를 포함한다. rAAV 벡터, 입자, 및 rAAV 입자를 포함하는 조성물은, 예를 들어 관상동맥으로의 혈관 전달 및/또는 심장으로의 직접 주사를 통해 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 이러한 심부전의 치료에 사용될 수 있다. rAAV 벡터, 입자, 및 rAAV 입자를 포함하는 조성물은 대상체의 심근세포에서 cS100A1 단백질 및 ARC 단백질의 공동 발현을 유도한다. S100A1은 수축 기능의 정상화로 이어지는 근형질 세망 칼슘 과도상태의 정상화를 포함한 칼슘 취급의 측면을 개선시킨다. ARC는 미토콘드리아 및 비-미토콘드리아 메카니즘 (예컨대 신장-유도된 아폽토시스)에 의해 개시되는 아폽토시스를 차단할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 기능을 개선시킬 것이다. 따라서, 본 개시내용의 트랜스진에 의해 발현된 2종의 단백질의 상승작용적 이익은 심근병증의 둘 다의 측면을 표적화함으로써 보다 우수한 장기간 치료 결과를 유도할 수 있다.
인간-유래 S100A1 및 ARC 단백질의 아미노산 서열은 하기에 기재된다.
인간 ARC:
Figure pct00018
인간 S100A1:
Figure pct00019
일부 측면에서, 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 13 또는 14에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 측면에서, 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 13에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열식별번호: 14에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 13을 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 14를 포함하는 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열식별번호: 13을 포함하는 제1 단백질 및 서열식별번호: 14를 포함하는 제2 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 임의의 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 13 또는 14의 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 12개 초과의 아미노산만큼 상이한 제1 단백질 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 임의의 개시된 rAAV 벡터는 서열식별번호: 13 또는 14의 임의의 서열에 비해 N-또는 C-말단에서 1, 2, 3개 또는 3개 초과의 아미노산만큼 말단절단된 단백질을 코딩한다.
따라서, 본 개시내용의 다른 측면은 그를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 rAAV 입자를 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 rAAV 입자의 수는 약 106 내지 약 1014개의 입자/mL 또는 약 103 내지 약 1013개의 입자/mL 범위, 또는 어느 한 범위에 대해 그 사이의 임의의 값, 예컨대 예를 들어 약 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 또는 1014개의 입자/mL일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 rAAV 입자의 수는 약 106 내지 약 1014개의 벡터 게놈 (vg)/mL 또는 103 내지 1015개의 vg/mL 범위, 또는 어느 한 범위에 대해 그 사이의 임의의 값, 예컨대 예를 들어 약 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 또는 1014개의 vg/mL일 수 있다. rAAV 입자는 단일 용량으로서 투여될 수 있거나, 또는 치료될 특정한 질환 또는 장애의 요법을 달성하는데 요구될 수 있는 2회 이상의 투여분으로 분할될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 0.0001 mL 내지 약 10 mL 범위의 용량이 대상체에게 전달된다.
원하는 경우에, rAAV 입자 및 rAAV 벡터는 치료 폴리펩티드, 생물학적 활성 단편 또는 그의 변이체의 1회 이상의 투여를 포함하여, 다른 작용제, 예컨대 예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 다양한 제약-활성제와 또한 조합되어 투여될 수 있다. 실제로, 추가의 작용제가 표적 세포 또는 숙주 조직과의 접촉시 유의한 유해 효과를 유발하지 않는 한, 포함될 수도 있는 다른 성분에는 사실상 제한이 없다. 따라서, rAAV 입자 또는 제제는 특정한 경우에 요구되는 바와 같은 다양한 다른 제약상 허용되는 작용제와 함께 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 또는 대안적으로 본원에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다.
제약상 허용되는 부형제 및/또는 담체 용액을 포함하는 제제는, 예를 들어 경구, 비경구, 정맥내, 비강내, 관절내 및 근육내 투여 및 제제를 포함한 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 이들 제제는 적어도 약 0.1% 또는 그 초과의 치료제 (예를 들어, rAAV 입자 또는 제제, 및/또는 rAAV 벡터)를 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 달라질 수 있고, 편리하게는 총 제제의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 또는 그 초과일 수 있다. 물론, 각각의 치료상 유용한 조성물 중 치료제(들)의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량으로 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 이러한 제약 제제를 제조할 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이다. 추가로, 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
특정 상황에서, rAAV 입자 또는 제제, 및/또는 rAAV 벡터를 본원에 개시된 적합하게 제제화된 제약 조성물로; 피하로, 혈관내로, 심장내로, 안내로, 유리체내로, 비경구로, 피하로, 정맥내로, 뇌실내로, 근육내로, 척수강내로, 경구로, 복강내로, 경구 또는 비강 흡입에 의해, 또는 1종 이상의 세포 (예를 들어, 심근세포 및/또는 다른 심장 세포), 조직 또는 기관으로의 직접 주사에 의해 전달하는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 입자 또는 rAAV 입자를 포함하는 조성물은 관상동맥으로 혈관내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 개시된 rAAV 입자 또는 조성물은 대상체의 심장으로의 직접 주사에 의해 투여된다. 심장으로의 직접 주사는, 예를 들어 바늘 카테터를 사용하여 심근 조직, 심장 내층, 또는 심장 주위의 골격근 중 하나 이상으로의 주사를 포함할 수 있다.
주사 용도에 적합한 조성물의 제약 제제는 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 멸균되고, 용이하게 주사가능해지는 정도로 유동성이다. 일부 실시양태에서, 형태는 제조 및 저장 조건 하에 안정하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는, 예를 들어 물, 염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일 또는 다른 제약상 허용되는 담체, 예컨대 미국 식품 의약품국에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 담체 (GRAS)를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
용어 "담체"는 rAAV 입자 또는 제제, 및/또는 rAAV 벡터와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유 오일, 예컨대 미네랄 오일, 식물성 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 및 참깨 오일, 동물성 오일, 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서 사용될 수 있다.
주사가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요한 경우에 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 될 수 있다. 이들 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 유리체내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 기지일 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 mL의 피하주입액에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량의 일부 변경이 치료되는 대상체의 상태에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여를 위해, 제제는 예를 들어 FDA 사무국의 생물제제 표준에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 및 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사가능한 용액은 rAAV 입자 또는 제제, Rep 단백질, 및/또는 rAAV 벡터를 요구되는 양으로 상기 열거된 여러 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성시키는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
rAAV 입자 또는 제제, 및/또는 rAAV 벡터 조성물의 양 및 이러한 조성물의 투여 시간은 본 발명의 교시내용의 이익을 갖는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 치료 유효량의 본 개시내용의 조성물의 투여는 이러한 치료를 받고 있는 환자에게 치료 이익을 제공하기에 충분한 수의 감염성 입자의 단일 투여, 예컨대 예를 들어, 단일 주사에 의해 달성될 수 있을 가능성이 있다. 대안적으로, 일부 상황에서, rAAV 입자 또는 제제, 및/또는 rAAV 벡터 조성물을, 이러한 조성물의 투여를 감독하는 의료 진료의에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 비교적 짧은 기간 또는 비교적 장기간에 걸쳐 다중 또는 연속 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 rAAV 입자 또는 제제, 및/또는 rAAV 벡터를 단독으로 또는 천연 또는 재조합 공급원으로부터 수득하거나 화학적으로 합성될 수 있는 1개 이상의 추가의 활성 성분과 조합하여 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자 또는 제제는 프로테아솜 억제제, 예컨대 보르테조밉 또는 히드록시우레아와 함께, 동일한 조성물로 또는 동일한 치료 요법의 일부로서 조합되어 투여된다.
본원에 사용된 용어 질환을 "치료하다"는 대상체가 경험한 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다. 상기 기재된 조성물은 전형적으로 목적하는 결과를 생성할 수 있는 양인 유효량으로 대상체에게 투여된다. 목적하는 결과는 투여되는 활성제에 좌우될 것이다. 예를 들어, rAAV 입자의 유효량은 이종 핵산을 숙주 기관, 조직 또는 세포에 전달할 수 있는 입자의 양일 수 있다.
본 개시내용의 방법에 이용되는 조성물의 독성 및 효능은 표준 제약 절차에 의해 배양물 또는 실험 동물 내의 세포를 사용하여 LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량)를 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성과 효능 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 조성물이 사용될 수 있지만, 이러한 부작용의 잠재적 손상을 최소화하는 전달 시스템을 설계하도록 주의를 기울여야 한다. 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다.
본 개시내용의 다른 측면은 대상체, 예컨대 인간 또는 비-인간 대상체, 대상체 내의 계내 숙주 세포, 또는 대상체로부터 유래된 숙주 세포에 사용하기 위한 방법 및 제제에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 반려 동물이다. 본원에 사용된 "반려 동물"은 애완동물 및 다른 가축을 지칭한다. 반려 동물의 비제한적 예는 개 및 고양이; 가축, 예컨대 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭; 및 다른 동물, 예컨대 마우스, 래트, 기니 피그 및 햄스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 소형 돼지 또는 미니-돼지이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 유전자 요법으로 치료될 수 있는 심장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 심부전의 임의의 병기에 있다. 일부 실시양태에서, 심부전은 심근병증에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, 심부전은 비대성 심근병증 또는 확장성 심근병증에 의해 유발된다.
하기 실시예는 본 개시내용의 특정 실시양태의 예시인 것으로 의도되고, 비제한적인 것으로 의도된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 (학술 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시-계류 중인 특허 출원 포함)의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 심부전의 다중 측면을 치료적으로 표적화함
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 심장 상태 (예를 들어, 심근병증, 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 심부전, 심장 질환 등)를 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 관상동맥으로 혈관내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 심장 내로의 다중 직접 주사를 통해 대상체에게 제공될 수 있다. 대상체에게 제공될 수 있는 예시적인 AAV 구축물이 도 1에 도시된다. 특정 실시양태에서, 이러한 예시적인 구축물은 재조합 AAV (예를 들어, AAVrh.10 또는 AAV6)에 의해 캡시드화되고, 하나 이상의 심장 상태 (예를 들어, 심근병증)의 2개의 개별 측면을 다루기 위해 S100 칼슘-결합 단백질 A1 (S100A1) 및 카스파제 동원 도메인을 갖는 아폽토시스 리프레서 (ARC)의 코딩 서열을 포함한다. 도 1의 예시적인 구축물의 양쪽 트랜스진은 심장 TnT 프로모터에 의해 유도되고, 따라서 심근세포에서만 발현될 것이다.
S100A1은 근형질 세망 칼슘 과도상태의 정상화를 포함하여 칼슘 취급의 측면을 개선시킴으로써 수축 기능을 정상화시킨다. ARC는 미토콘드리아 및 비-미토콘드리아 메카니즘에 의해 개시되는 아폽토시스 (예를 들어, 신장-유도된 아폽토시스)를 차단할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 기능을 개선시킬 것이다. 심부전의 이들 2종의 개별 구성요소 (칼슘 취급 기능장애 및 아폽토시스)는 개별적으로 다루어지지만, 결코 함께 다루어지지 않는다. 따라서, 이러한 접근법의 상승작용적 이익은 개선된 장기간 결과를 발생시킬 수 있는 치료 옵션을 제공한다. 심근병증의 둘 다의 측면을 표적화함으로써, 본 출원에 의해 제공된 조성물 및 방법은 다수의 심장 상태 (예를 들어, 비대성 또는 확장성 심근병증)를 다루는데 사용될 수 있고, 심부전의 임의의 병기에서 유익할 것이다.
본원 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 서열 데이터베이스 목록은 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 본원의 임의의 정의를 포함한 본 출원이 우선할 것이다.
실시예 2: 개에서의 확장성 심근병증의 유전자 요법
확장성 심근병증 (DCM)은 개에서 후천성 심장 질환의 두번째로 가장 흔한 원인이며, 가장 흔하게는 큰 품종 개, 예컨대 도베르만 핀셔(Doberman pinscher), 그레이트 데인(great Dane) 및 아이리쉬 울파운드(Irish Wolfhound)에 영향을 미친다. 이러한 질환에 걸린 인간에게는, 심장 이식 및 좌심실 보조 장치와 같은 수술 옵션이 있다. 그러나, 수의학 의약에서의 유일한 치료 옵션은 심부전과 연관된 징후의 의학적 관리이다. 이환된 개에 대한 예후는 질환의 병기 및 품종에 좌우된다. 예를 들어, 대부분의 도베르만 핀셔는 울혈성 심부전 (CHF)의 발생 후 6개월 미만 생존한다. 대조적으로, 코커 스패니엘과 같은 다른 품종은 더 오래 생존하는 경향이 있다. 심장 질환이 진행됨에 따라, 심장 세포 내에서 칼슘 이동을 조절하는 채널의 기능부전은 칼슘 순환 이상을 촉진하고, 추가로 심장의 수축 및 이완의 조절장애를 유발한다. 특히, 칼슘 수송 이상은 자연 발생 DCM5를 갖는 개에서 인식되었고, 또한 많은 상이한 병인에 속발성인 심부전과 함께 발생한다.
칼슘 순환 이상을 정상화하도록 설계된 유전자 전달 전략은 다양한 형태의 심장 질환을 갖는 소형 및 대형 동물 모델에서 심장 질환을 호전시킨다. 실제로, 임상 시험은 심근병증에 대한 이러한 치료 접근법을 시험하기 위해 인간에서 이미 진행 중이고, 예비 결과는 고무적이다. 파일럿 실험은 DCM에 이환되고 CHF를 나타내는 도베르만 핀셔에서 칼슘 취급을 정상화하도록 설계된 유전자 전달의 효능을 평가하는 것이다. 도베르만 핀셔가 이용되는데, 왜냐하면 DCM이 이 품종에서 널리 퍼져있고, CHF가 발생시 이 품종에서 상기 질환이 신속하고 균일하게 진행되는 경향이 있기 때문이다. DCM을 다루기 위한 신규 양식은, 이러한 특발성 질환에 대한 소인이 있는 도베르만 핀셔, 복서, 그레이트 데인, 저먼 셰퍼드, 골든 리트리버 등을 포함한 모든 개 품종에 대해 유의한 영향을 미칠 것이다. 특히, 자연 발생 심장 질환의 가장 흔한 형태 (개 퇴행성 판막 질환 및 DCM)를 갖는 개로부터의 샘플에서의 심근 단백질 수준에 대한 이전의 조사는 다중 단백질 (S100A1 포함) 수준이 비정상적임 (S100A1이 감소됨)을 발견하였다.
이들 발견은 S100A1을 표적화하는 유전자 전달이 DCM 뿐만 아니라 퇴행성 판막 질환에 속발성으로 발생하는 심근 부전을 효과적으로 치료할 수 있음을 시사한다. 추가로, 아폽토시스 (프로그램화된 세포 사멸)는 이환 심근에서 보다 흔하고, ARC는 아폽토시스의 강력하고 다중기능적인 억제제이다. 현재, 수의학적 심부전에 대한 표준 관리는 유체 과부하 및 울혈의 의학적 관리이다. 비정상적 심근 조절 분자에 관한 유전자 전달 기술은 수의학 임상의가 최초로 심근 질환 과정을 특이적으로 다루도록 할 수 있는 기계론적 표적을 제공한다. 또한, 현재의 벡터 생산 기술 및 벡터의 심근내 유전자 전달과 연관된 비용은 많은 소유자들이 이 요법의 비용을 감당할 수 있게 만들며, 비용은 시간이 지남에 따라 감소할 것으로 예상된다.
AAV 2/6 벡터를 사용한 유전자 전달의 최소 침습 방법은 정상 개에서 >75%의 심근 세포의 형질도입을 유발하였다 (문헌 [Bish LT, Sleeper MM, Brainard B, et al. Percutaneous transendocardial delivery of self-complementary adeno-associated virus 6 achieves global cardiac gene transfer in canines. Mol. Ther. 16, 1953-9 (2008)] 참조). 6마리의 정상 몽그렐 개를 포스포람반의 우성 음성 형태 (dn-PLN) (천연 포스포람반과 경쟁하여 SERCA2a에 대한 그의 억제 효과를 감소시키는 가인산화 형태) (n=4) 또는 AAV2/6 dn-PLN 및 S100A1 (n=2)을 코딩하는 AAV2 또는 AAV6 벡터로 처리하였다. 모든 개는 처리 후 2년에 걸쳐 정상 심혈관 기능을 갖는 건강한 채로 남아있었으며, 이는 요법이 심근염을 유발하지 않거나 또는 심장 기능을 유의하게 변경시키지 않았음을 나타내고, 따라서 이러한 치료 접근법의 안전성을 지지한다. 심장 기능은 박출 계수, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
실제로, 40마리 초과의 정상 및 이환 개 (하기 참조)에게 주사하였고, 지금까지의 결과는 주사 기술이 내약성이 우수함을 나타낸다. 또한, 펜실베니아 대학교의 매튜 제이. 라이언 동물 병원(Matthew J. Ryan Veterinary Hospital of the University of Pennsylvania)에서 20건의 무작위 개 사례를 rAAV2/6에 대한 항체에 대해 샘플링하였고, 20마리의 개 중 19마리에서 역가가 치료에 대해 허용되는 범위 내에 있는 것을 발견하였으며, 이는 사전 면역 반응이 유의한 비율의 치료 후보를 배제하지 않을 것임을 나타낸다. 이러한 치료 접근법이 DCM의 치료에 효과적인지 결정하기 위해, 급속 진행성 소아 DCM의 중증 형태를 갖는 포르투갈 워터 독을 이어서 처리하였다. 특히, AAV2/6 dn-PLN이 주사된 개는 인산화된 PLN의 현저한 감소를 나타냈고, 이는 이러한 질환 모델에서 칼슘 순환을 정상화하는 이러한 접근법의 잠재적인 능력을 뒷받침한다. 또한, dn-PLN 및 S100A1 둘 모두를 함유하는 벡터를 사용한 유전자 전달이 dn-PLN을 단독으로 함유하는 벡터의 전달보다 더 큰 정도로 DCM에 속발성인 CHF의 발달을 늦추었다. 조합 벡터는 dn-PLN 요법 단독과 비교하여 평균 4주만큼 CHF의 개시를 지연시켰다. 이러한 이유로, 유전자 요법이 성인-발병 DCM 및 울혈성 심부전에 이환된 도베르만의 수명을 연장하는데 효과적인지 여부를 결정하기 위한 파일럿 실험에서 상기 조합 벡터 접근법이 이용된다.
연구는 맹검, 위약 대조 설계를 갖는다. 처리된 DCM 및 CHF의 마지막 12건의 도베르만 핀셔 사례를 기초로, 평균 생존이 148일이었다 (160일의 표준 편차). 검정력 0.8, 알파 (양측) 0.05 및 대조군에 대한 사례의 비 1을 사용하여, 각각의 군에서 13마리의 개의 샘플 크기가 6개월 생존에서의 차이를 검출하는데 요구된다. 이 계산은 파라미터 샘플 크기 시험을 사용하여 결정하였다. DCM 및 제어된 CHF를 갖는 26마리의 도베르만 핀셔를 등록한다. 등록에 적격이기 위해, 개는 AAV2/6에 대한 순환 중화 항체 역가가 1:20 미만이어야 하고, 심장외 질환이 없어야 한다. 추가적으로, 동반되는 선천성 심장 질환 또는 원발성 승모판 질환의 증거가 있는 개가 배제된다. 기준선 (등록 시점)에서 항체 역가, CBC, 및 화학 패널이 스크리닝 목적을 위해 사용된다. 개는 3분 심전도 (ECG) 및 완전 심장초음파 (ECHO)를 받고, 소유자는 사전 검증된 삶의 질 설문지를 완성한다. ECG를 간격 지속기간 및 부정맥의 존재에 대해 평가한다. ECHO는 2D, M-모드 및 도플러 연구 (조직 도플러 포함)를 포함한다. 흉부 방사선사진을 사용하여 질환의 병기를 결정한다 (개를 울혈성 심부전의 병력으로 임상적으로 보완함).
등록 요건을 충족시키는 개를 위약 부문 (염수를 사용한 심장 주사) 또는 유전자 요법 군 (AAV2/6-ARC-s100a1을 사용한 심장 주사)에 무작위로 할당한다. 모든 개에서 연구 전반에 걸쳐 DCM 및 울혈성 심부전에 대한 표준 의학적 관리가 계속된다 (피모벤단, 안지오텐신 억제제 및 이뇨 요법). 비어있는 캡시드 대신에 염수를 모의 요법으로서 사용하여, 처리군이 위약군과 비교하여 유의한 개선을 나타내는 경우에 대조군 개가 유전자 전달을 받을 수 있도록 한다. 요법 ECG, ECHO, 삶의 질 설문지 및 실험실 분석 후 2, 4, 6, 9 및 12개월에 반복한다. 통계적 분석을 격월 간격으로 수행한다.
도 2 및 3은 처리된 근육 이영양증 개에서의 확장기 (이완) 및 수축기 (수축) 데이터를 각각 도시한다. 심내막 및 심외막 윤곽은 각각의 도면에서 볼 수 있다. 데이터는 표 1에 나타난 바와 같이 수주에 걸쳐 처리후 안정한 또는 약간 개선된 기능을 나타낸다. 하기 표 1은 제1 시점 (처리전) 및 제2 시점 (처리후)에서 취한 데이터에 대한 좌심실 질량 (LVM [g]), 확장기말 부피 (EDV [ml]), 수축기말 부피 (ESV [ml]), 일회 박출량 (SV [ml]), 박출 계수 (EF [%]), 및 심박출량 (CO [l/min]) 결과를 보여준다.
표 1
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실시예 3: 마우스 및 개로의 벡터 전달 후 이영양증 표현형의 평가
S100A1/ARC 자기-상보적 벡터의 심장 AAV 유전자 전달을 뒤시엔느 근육 이영양증 (디스트로핀-결핍)의 마우스 및 개 모델에서 평가하였다. 초기에, AAV8 (그의 다중 변이체 포함), AAV9, 및 AAVrh.10 혈청형을 개 심장을 감염시키는 그의 능력에 있어서 비교하였고, AAVrh.10이 가장 효율적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 이유로, AAVrh.10을 본 실시예에 기재된 모든 실험에 사용하였다.
DBA/2J 배경의 Mdx (디스트로핀-결핍) 마우스 ("D2.mdx")에 4주령에 재조합 AAVrh.10-S100A1/ARC 벡터 (하기에서 "치료 AAV"로 지칭됨)를 주사하고, 24주 후에 희생시켰다. D2.mdx 마우스는 뒤시엔느 근육 이영양증 근병증의 여러 인간 특징, 예컨대 감소된 뒷다리 근육 질량, 위축된 근섬유, 증가된 섬유증 및 염증, 및 근육 약화를 재현한다. 상기 24주 기간에 걸쳐, 심장 MRI에 의해 측정시, 치료용 AAV가 주사된 마우스는 모의 주사된 마우스와 비교하여 박출 계수, 변형률 발생, 및 심장 박출량을 더 잘 유지하였다 (도 4 참조). 단백질 분석 (웨스턴 블롯)은 S100A1 및 ARC 수준 둘 다가 대조군 (모의 주사됨)과 비교하여 처리된 조직에서 상승되었음을 확인하였다 (도 5 참조). 또한, 심장 조직학은 처리된 심장이 대조군 심장과 비교하여 훨씬 더 적은 병리상태를 보였음을 입증하였다 (도 6 참조).
인간 뒤시엔느 근육 이영양증의 개 모델인 2마리의 GRMD (디스트로핀-결핍) 개에게 관상동맥 내로의 카테터 전달을 통해 그의 심장 박출 계수의 최초 감소 시점에 치료 벡터를 주사하였다. 심장 박출 계수는 심근병증의 발병을 나타내는 증상을 나타낸다. 개 대상체의 자연 병력 연구로부터의 초기 소견은, 박출 계수가 떨어지기 시작하자마자, 이들은 다음 해에 걸쳐 계속해서 점진적으로 떨어진다는 것을 나타냈다 (도 18). 개는 전형적으로 박출 계수가 이러한 꾸준한 감소를 시작한 후 8-12개월을 초과하여 생존하지 않는다.
도 7 및 8에 제시된 바와 같이, 두 대상체 모두는 심장 MRI에 의해 측정되고 에코 측정에 의해 확인된 바와 같이, AAVrh.10-S100A1/ARC를 사용한 처리로부터 수개월 후에 박출 계수 및 다른 심장 파라미터에서 개선을 나타냈다. 처리로부터 거의 12개월 후에, 제1 대상체는 정상 범위 내의 일정한 박출 계수를 나타냈다. 마찬가지로, 처리로부터 거의 7개월 후에, 제2 대상체는 일정한 정상 박출 계수를 나타냈다.
심장 기능이 개선되었을 뿐만 아니라, 운동 동안 대상체를 촬영함으로써 정성적으로 평가된 바와 같이 개의 운동 능력에서의 지속적인 개선도 있었다. 이러한 개선된 운동 능력과 일치하게, 대상체의 사지의 MRI 측정은 골격근 질량이 AAV 처리 후에 증대되거나 변화되지 않았음을 입증하였다 (도 9a 내지 9c). 또한, 골격근에서의 순환 크레아틴 키나제 (CK) 수준이 처리 후에 감소되었고 (도 10), 이는 진행 중인 근육 손상의 감소를 나타낸다.
실시예 4: DCM 개 대상체의 처리
도베르만 핀셔는 모든 개 품종 중에서 DCM의 발생률이 가장 높다. 이의 유전자 염기는 오직 개 중 하위세트에 대해서만 공지되어 있다. 이는 임의의 다른 유전적 합병증이 없는 DCM 및 심부전의 대형 동물 모델을 제공한다. 후기 심부전 상태의 개만이 GRMD 개에서 사용되는 것과 동일한 AAV.S100A1.ARC 벡터로 처리되고 있다. 처리의 목적은 심장 기능을 개선시키고 생명을 연장시키는 것 둘 다이다.
2마리의 도베르만 핀셔 대상체는 지금까지 관상동맥 내로의 카테터 전달을 통해 AAVrh.10-S100A1/ARC로 처리되었으며, 여기서 두 마리의 개 모두는 처리 시에 심부전을 경험하였다. 두 마리의 개 모두는 처리 후에 급속한 개선을 나타냈다. 각각의 개를 처리 후 2 라운드의 심장초음파검사에 의해 평가하여 심실 부피, 벽 두께 및 확장기 및 수축기에서의 챔버 직경, 뿐만 아니라 분획 단축률 및 박출 계수를 포함한 (그러나 이에 제한되지는 않음) 심장 구조적 및 기능적 파라미터를 평가하였다.
제1 개는 단지 10%의 박출 계수로 처리되었고, 따라서 처리 시에 사망에 근접하였다. 처리후 24시간 내에, 박출 계수는 25%로 개선되었다. 개의 처리후 4개월의 제1 추적 방문에서, 박출 계수는 26%로 일정하게 유지되었다. 6개월의 제2 추적에서, 그의 박출 계수는 32%였다. 개는 8개월령에 울혈성 심부전으로 사망하였다. 따라서, 처리는 생명을 연장시키는 것으로 보였지만, 심장 기능은 처리 시에 이미 너무 손상되어 장기간 생존을 허용하지 않았다.
제2 처리된 도베르만 핀셔는 처리 전에 32%의 박출 계수-낮은 분획을 가졌지만, 즉각적인 사망 위험은 없었다. 개의 박출 계수는 처리후 24시간 내에 49%로 개선되었으며, 이는 정상 범위 내에 속한다. 처리후 4개월의 검사에서 개의 박출 계수는 52%였고, 8개월 검사에서 박출 계수는 50%였다. 1년 검사로 돌아오기 전에, 개는 폐암으로 진단되었고, 2개월 후에 사망하였다. 그의 사망 원인은 심부전과 관련되지 않았다.
이들 발견에 기초하여, AAVrh.10-S100A1/ARC 처리는 개에서 심장 기능을 정상 범위로 회복시킬 수 있다.
실시예 5: 인간-유래 cDNA 서열을 포함하는 벡터의 평가
인간-유래 ARC ("hARC") 및 S100A1 ("hS100A1") cDNA 서열을 포함하는 플라스미드를 마우스에서의 평가를 위해 구축하였다. 천연 인간 cARC 및 S100A1 유전자를 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다.
이들 플라스미드는 서열식별번호: 9-12의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 각각의 이들 플라스미드는 cTnT 프로모터에 의해 작동가능하게 제어되는 cARC 및 S100A1 cDNA 서열, 뿐만 아니라 이들 2개의 서열 사이의 IRES를 포함한다. 모든 4개의 플라스미드는 코돈-최적화된 인간 cARC (hARC) 서열을 포함한다. 서열식별번호: 9 및 10에 기재된 플라스미드는 코돈 최적화된 hS100A1 서열을 추가로 포함하고; 서열식별번호: 11 및 12에 기재된 플라스미드는 야생형 hS100A1 서열을 추가로 포함한다.
이들 4개의 플라스미드 각각을 자기-상보적 AAVrh.10 벡터 내로 클로닝하고, 후속적으로 rAAV 입자 내로 캡시드화하였다. 이들 벡터를 포함하는 rAAVrh.10 입자를 마우스에 투여하였다.
마우스에서의 ARC 및 S100A1의 발현 수준을 평가하였다. 심장 박출 계수를 포함한 이영양증 표현형 및 심장 기능을 모니터링하고 평가하였다.
실시예 6: 장기 마우스 및 개 연구
이영양성 마우스 연구
S100A1 및 ARC의 AAV 심장 유전자 전달은 심장 기능의 보존으로 이어진다
이전에 제공된 마우스 연구 (도 4-6)에 추가로, 2가지 유형의 장기 연구를 수행하였고, 그 결과가 도 15-17에 요약된다. 도 15 및 16에는 중증 섬유화 배경, 즉 DBA/2J ("D2"로도 지칭됨) 마우스 중 디스트로핀-결핍 마우스로부터의 데이터가 제시되고, 따라서 D2.mdx 마우스로 지칭되는 것이 생성된다. 이들 마우스를 1개월령에서 심장 트로포닌 T (cTnT) 프로모터에 의해 작동가능하게 제어되는 이중 트랜스진 (S100A1 및 ARC) 카세트를 함유하는 AAV로 처리하였다. 마우스를 10개월령까지 정적 환경에 수용하고, 이 때 이들의 심장 상태를 평가하였다.
트랜스진 단독과 비교하여 S100A1 및 ARC의 AAV 심장 유전자 전달의 우월성
이들 연구와 병행하여, D2.mdx.sk_우트로핀 마우스로 지칭되는, 골격근 알파-액틴 프로모터의 제어 하에 유트로핀의 발현에 의한 골격근 단독의 트랜스제닉 구제가 존재하는 D2.mdx 마우스에서 생존 연구를 또한 수행하였다 (문헌 [Rafael JA, et al. Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues utrophin-dystrophin deficient mice. Nat Genet. 19:79-82, 1998] 참조). 핵심은 일반적으로 폐 근조직 또는 골격 근조직의 어떠한 질환도 없이, 심부전 및 사망으로 이어지는 순수 확장 심근병증을 갖는 마우스를 생성하는 것이었다. 이는 마우스를 러닝 휠로 개별적으로 수용함으로써 마우스가 운동하도록 하였다. 운동은 심장에 추가의 부하 및 스트레스를 생성하여, 심근병증 및 심부전의 발생의 가속화를 유도한다. 측정가능한 심장 질환의 발병 전에 개체가 처리를 받지 않을 임상 상황을 보다 잘 모델링하기 위해, 마우스를 섬유증이 존재하고 심장 기능 이상이 나타나기 시작하는 6개월령에 처리하였다.
ARC 또는 S100A1 단독의 전달에 비해, 동일한 구축물에서 S100A1 + ARC를 함께 전달하는 것의 잠재적 우월성을 평가하기 위해, 트랜스진 (대조군)을 전달하지 않았거나, 또는 이중 트랜스진 구축물에 사용된 동일한 심장 프로모터를 함유하지만 이중 카세트에 사용된 동일한 S100A1 또는 ARC cDNA를 단독으로 및 조합하지 않고 유도하는 rAAV 벡터를 전달하였다. 따라서, ARC 단독, S100A1 단독, 또는 S100A1 및 ARC의 조합의 능력을 비교하여 이 심부전 모델에서 수명을 연장시켰다.
도 17에 제시된 바와 같이, 어느 하나의 트랜스진 단독은 수명을, ARC는 4개월만큼 및 S100A1은 5개월만큼 유의하게 연장시킬 수 있었다. 그러나, 트랜스진 S100A1 및 ARC의 조합은 수명을 10개월만큼, 20개월령으로 연장시켰다. 야생형 D2 마우스는 단지 ~23개월의 수명을 가졌고, 따라서 이는 심장의 현저하게 강한 구제를 나타냈다. 트랜스진의 이중 rAAV 구축물로의 조합은 상승작용적 효능을 제공하였다. 벡터의 투여가 D2 마우스의 수명을 단일-트랜스진 벡터에 비해 대략 야생형 수명 및 연장된 수명으로 4 내지 5개월만큼 연장시켰기 때문에, 이들 결과는 단일-벡터 요법에 비해 통계적으로 유의한 개선을 나타낸다.
이영양성 개 연구
다음으로, 마우스 처리의 결과를 GRMD 개로 확장하기 위한 연구를 수행하였다. GRMD 개 (지금까지 4마리의 개)에서 진행 중인 연구는 박출 계수에 의해 평가된 바와 같은 심장 기능이 비처리 개의 자연 병력의 수준 미만으로 떨어지는 경우에 AAVrh.10-S100A1/ARC (개 트랜스진 서열)를 사용한 처리를 수반한다. 심장 구조 및 기능 파라미터를 평가하기 위한 빈번한 심장초음파검사 및/또는 MRI를 사용하여 개의 심장 상태를 추적한다. 처리된 최초의 개 (WnM3/캘빈)를 2년 초과 동안 추적하였고, 그 동안 그의 심장 기능이 개선되었고 안정하였다. 이 개는 34개월령에서 흡인성 폐렴과 연관된 합병증으로 인해 사망하였지만, 그의 심장 기능은 여전히 안정하였고, 상기 나이까지 정상 범위였다. 다른 3마리의 개는 모두 초기 처리 후에 개선되었고, 1년 초과 동안 안정한 심장 기능을 나타냈다. 이 데이터는 도 18에 도시된다. 폐렴으로 인한 캘빈의 사망은 그의 심장 조직학의 평가를 가능하게 하였으며, 이는 도 19에 제시된다. 놀랍게도, 처리 없이 8개월령 (WnM3이 처리를 받은지 1개월 후)에 고도로 섬유성인 좌심실의 조직학은 정상 개의 것과 거의 구별불가능한 것으로 보인다 (도 19). 이는 1세에서 2세 사이에 심부전 및 사망으로 진행되는 DCM의 대형 동물 모델에서 거의 전체 심장이 구제된다는 증거이다. 이 콜로니에서 30개월 초과의 연령에서 생존한 비처리 개는 전혀 없었고 (도 18), 전형적인 사망 원인은 심부전이다.
실시예 7: 면역 반응 연구
체중이 45-70kg인 소형 돼지 4마리를 본 개시내용의 rAAV 벡터로 처리한다. 돼지 중 2마리는 고용량의 2 x 1014 게놈 카피를 투여받고, 다른 2마리는 저용량의 2 x 1013 게놈 카피를 투여받는다. 각 경우에, 바이러스의 2/3가 좌심장에 전달되고, 용량의 1/3이 우심장에 전달된다. 돼지를 연구에 등록하기 전에 AAV-rh10에 대한 항체에 대해 스크리닝한다. 이와 같은 목적을 위해 동시에 혈액을 제공한다.
혈액을 적색 상단 튜브에 수집하여, 혈액이 대략 30분 동안 응고되도록 하고, 1000xG에서 15분 동안 회전 침강시키고, 혈청을 200 ul 분취물로 분취하고, 스크린 전에 동결시킨다. 혈청은 기존재하는 항체의 분석에 사용된다.
면역 억제 요법
유전자 전달 1일 전에 시작하여, 대상체는 주입 후 60일 동안 매일 1 mg/kg의 글루코코르티코이드 (또는 프레드니손 등가물)를 받는다. 유전자 전달 60일 후에, 점감 용량의 글루코코르티코이드를 구현하고, 간 효소를 면역 반응에 대해 모니터링한다. 면역 반응이 일어나는 경우에는, 글루코코르티코이드 용량 및 요법은 의사의 판단으로 다시 투여된다.
글루코코르티코이드 투여 전반에 걸쳐, 예방적 항생제가 예방조치로서 투여된다.
돼지 심장으로의 rAAV 입자의 전달
· 도입기를 경동맥 또는 대퇴 동맥에 위치시킴.
· 관상 혈관조영상을 위해 피그테일 혈관카테터를 좌심실로 전진시켜 디지털 형광투시법으로 관상동맥을 로드맵함.
· 관상동맥 카테터 (각각)를 대상체의 혈액 1cc를 포함하는 헤파린화 염수로 플러싱하고, 대동맥 근부 및 좌측 및 우측 관상동맥 오리피스 (동물 크기에 따라 크기가 주드킨스(Judkins) R 또는 L)로 전진시킴.
· 아데노신 CRI (1 mg/kg/분)를 정맥내로 시작함. 아데노신 CRI 15초 후에 관상동맥 내로 벡터를 전달함. 벡터를 5-10초에 걸쳐 투여하고, 벡터의 전달이 완료된지 30초 후에 CRI를 계속함.
· 2/3 벡터를 좌측 관상동맥 내로 투여하고, 1/3 벡터를 우측 관상동맥 내로 투여함.
돼지 대상체를 AAV 전달 후 2개월 동안 매주 혈액 채취 (혈청 화학, CBC, AAVrh10 항체 (스폰서에 의해 수행됨), 엘리스 스팟(Elis spot) 반응)에 의해 모니터링하였다. 전달 2개월 후에, 돼지를 희생시키고, 심장 및 다른 조직 (하기 목록 참조)을 준비하고 (샘플을 포르말린 고정용으로 채취하고 신선하게 동결시킴), 조직을 이용가능하게 하였다.
필요한 혈액 채취:
혈청 화학, 레드 탑 튜브 1개
CBC 패널, EDTA 자주색 상단 튜브 1개
항-AAVrh10 ELISA 검정, 레드 탑 튜브 1개
ELISPOT, 10 mL EDTA 자주색 탑 튜브 최소 1개
사후 절차
특별한 절차
신선 동결 조직 수집 및 포르말린 고정 파라핀 포매 조직
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Figure pct00022
등가물
여러 본 발명의 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 1개 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적 적용 또는 적용들에 따라 달라질 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시된 것이고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서, 본 발명의 실시양태는 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 다수의 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우에, 본 개시내용의 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용된 모든 정의는 사전적 정의, 참조로 포함된 문헌에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상의 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 대상과 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에 문헌의 전체를 포괄할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수형은, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉 일부 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 복수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 이와 같이 결합된 요소의 "1개 이상"으로 이해되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용되는 경우에, 한 실시양태에서, A 단독 (B 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, B 단독 (A 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함적(inclusive)인 것으로 해석되어야 하며, 즉 다수의 요소 또는 요소 목록 중 적어도 하나의 요소를 포함하는 것은 물론, 하나 초과의 요소, 및 임의로 추가의 열거되지 않은 항목들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때, "로 이루어진"과 같이 달리 명백하게 나타낸 용어만이 다수의 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "중 하나", "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배타성의 용어가 선행될 때 배타적 대안 (즉, "하나 또는 다른 하나이지만 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로만 해석될 것이다. "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위에 사용될 때 특허법의 분야에서 사용되는 바와 같은 그의 통상적인 의미를 가질 것이다.
1개 이상의 요소의 목록과 관련하여 본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
또한, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 1개 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 작용이 언급된 순서로 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다.
청구범위 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "로 구성된" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다만 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 각각 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 기재된 바와 같이 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다. 개방형 연결 어구 (예를 들어, "포함하는")를 사용하여 본원에 기재된 실시양태는 또한 대안적 실시양태에서 개방형 연결 어구에 의해 기재된 특색"으로 이루어진" 및 "으로 본질적으로 이루어진" 것으로 고려된다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어, 본 개시내용이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기재하는 경우에, 본 개시내용은 또한 대안적 실시양태 "A 및 B로 이루어진 조성물" 및 "A 및 B로 본질적으로 이루어진 조성물"을 고려한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Florida Research Foundation, Incorporated <120> AAV CARDIAC GENE THERAPY FOR CARDIOMYOPATHY IN HUMANS <130> U1197.70160WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/876,540 <151> 2019-07-19 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 285 <212> DNA <213> Canis lupus <400> 1 atgggctctg agctggagac agcgatggag actctcatca atgtgttcca tgcccactcg 60 ggcaaggagg gaaacaagta caagctgagc aagaaggagc taaaggagct gctgcagact 120 gagctctccg gcttcctgga cgcccagaag gatgcggatg ctgtggacaa ggtgatgaaa 180 gagctagatg agaatggaga tggggaggtg gacttccagg agtatgtggt gctggtggct 240 gccctcacag tggcctgtaa caacttcttc tgggaaaaca gttga 285 <210> 2 <211> 285 <212> DNA <213> Felis catus <400> 2 atgggctcag agctggagac ggcgatggag actctcatca acgtgttcca cgcccactcg 60 ggcaaggagg gagacaagta caagctgagc aagaaggagc taaaagagct gctgcagacc 120 gagctctctg gcttcctgga cgcccagaag gatgccgacg ctgtggacaa ggtgatgaaa 180 gagctagacg agaatggaga tggggaggtg gacttccaag agtatgtggt gctggtggct 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cacaacccca 1320 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 1380 caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 1440 tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg ccccccgaac 1500 cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataag cttgccacaa ccttgggcca 1560 ccatggggaa tgcccaagaa aggccttctg agactataga ccgcgagcgc aagaggcttg 1620 tagaaacctt gcaggcggac tctggtctct tgctggacgc tctgcttgcg cggggtgttc 1680 tgactggacc ggagtacgaa gcattggatg cccttcctga tgcagagaga cgagttagac 1740 gcctgttgct tcttgtgcaa ggcaagggtg aagccgcctg tcaagagctc ctgaggtgtg 1800 ctcaacgaac cgccggggcg ccagatccgg catgggattg gcaacatgtg gggcccggct 1860 atcgggaccg gagctacgat ccaccatgcc cgggtcattg gacgccggag gctccaggat 1920 ctggtacaac atgcccagga ctcccaagag ccagtgaccc cgatgaagct ggaggccccg 1980 agggcagtga agccgtacag agcggtaccc cagaagaacc agaaccggag ctggaggctg 2040 aagctagtaa agaggcggaa cctgaacccg aaccggagcc tgagctcgag ccagaggctg 2100 aggccgagcc agagcctgaa ctcgaacccg aacctgatcc agaaccagag cccgacttcg 2160 aggaacggga tgagtcagag gattcttgag cggccgcatc gataccgtcg actagagctc 2220 gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 2280 tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 2340 ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 2400 gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcgataagg atcttcctag agcatggcta 2460 cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt 2520 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 2580 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 2628 <210> 11 <211> 2628 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120 aagatcaatt caattcacgc gtggaattcg cccttaacgg gccccccctc gaggtcggga 180 taaaagcagt ctgggctttc acatgacagc atctggggct gcggcagagg gtcgggtccg 240 aagcgctgcc ttatcagcgt ccccagccct gggaggtgac agctggctgg cttgtgtcag 300 cccctcgggc actcacgtat ctccgtccga cgggtttaaa atagcaaaac tctgaggcca 360 cacaatagct tgggcttata tgggctcctg tgggggaagg gggagcacgg agggggccgg 420 ggccgctgct gccaaaatag cagctcacaa gtgttgcatt cctctctggg cgccgggcac 480 attcctgctg gctctgcccg ccccggggtg ggcgccgggg ggaccttaaa gcctctgccc 540 cccaaggagc ccttcccaga cagccgccgg cacccaccgc tccgtgggac gatccccgaa 600 gctctagagg atccagcctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcgc 660 caccatgggc tctgagctgg agacggcgat ggagaccctc atcaacgtgt tccacgccca 720 ctcgggcaaa gagggggaca agtacaagct gagcaagaag gagctgaaag agctgctgca 780 gacggagctc tctggcttcc tggatgccca gaaggatgtg gatgctgtgg acaaggtgat 840 gaaggagcta gacgagaatg gagacgggga ggtggacttc caggagtatg tggtgcttgt 900 ggctgctctc acagtggcct gtaacaattt cttctgggag aacagttgaa ctagtgcgta 960 ccaggtcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 1020 ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 1080 ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 1140 caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 1200 aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 1260 gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 1320 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 1380 caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 1440 tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg ccccccgaac 1500 cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataag cttgccacaa ccttgggcca 1560 ccatggggaa tgcccaagaa aggccttctg agactataga ccgcgagcgc aagaggcttg 1620 tagaaacctt gcaggcggac tctggtctct tgctggacgc tctgcttgcg cggggtgttc 1680 tgactggacc ggagtacgaa gcattggatg cccttcctga tgcagagaga cgagttagac 1740 gcctgttgct tcttgtgcaa ggcaagggtg aagccgcctg tcaagagctc ctgaggtgtg 1800 ctcaacgaac cgccggggcg ccagatccgg catgggattg gcaacatgtg gggcccggct 1860 atcgggaccg gagctacgat ccaccatgcc cgggtcattg gacgccggag gctccaggat 1920 ctggtacaac atgcccagga ctcccaagag ccagtgaccc cgatgaagct ggaggccccg 1980 agggcagtga agccgtacag agcggtaccc cagaagaacc agaaccggag ctggaggctg 2040 aagctagtaa agaggcggaa cctgaacccg aaccggagcc tgagctcgag ccagaggctg 2100 aggccgagcc agagcctgaa ctcgaacccg aacctgatcc agaaccagag cccgacttcg 2160 aggaacggga tgagtcagag gattcttgag cggccgcatc gataccgtcg actagagctc 2220 gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 2280 tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 2340 ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 2400 gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcgataagg atcttcctag agcatggcta 2460 cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt 2520 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 2580 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 2628 <210> 12 <211> 2628 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120 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(506)..(506) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (514)..(514) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (517)..(517) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (518)..(518) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (519)..(519) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (522)..(522) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (535)..(535) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (566)..(566) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (567)..(567) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (576)..(576) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (595)..(595) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (597)..(597) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (602)..(602) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (603)..(603) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (604)..(604) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (606)..(606) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 atgggcaacn nccaggagcg gcccagcgag accatcgacc gggagcggaa gcggctggtg 60 gagaccctgc aggccgacag cggcctgctg ctggacgccc tgctggcccg gggcgtgctg 120 nccggccccg agtacgaggc cctggacgcc ctgcccgacg ccgagcggcg ggtgcggcgg 180 ctgctgctgc tggtgcagng caagggcgag gccgcctgcc aggagctgct gcngtgcgcc 240 cagcggaccg ccngngcccc cgaccccgcc tgggactggc agcacgtggg cnccggctac 300 cgggancgga gctnngacnc cncctgcncc ggccactgga cccccgaggc ccccggcagc 360 ngcaccacct gccccgnnct gccccgggcc nncgacnncg ncgagnccgg cgnccccgnn 420 ggcagcgagg ccgnncagag cggcanccnn gaggagcccg ancccgagct ggaggccgnn 480 gccnnnnnnn nnnnngagcn ngagnncgag cccnagnnng anctggagcc cgagnccgag 540 gccgagcccg agcccgagct ggagcnngag cccgancccg agcccgagcc cgacntngag 600 gnnngngacg agagcgagga cagctga 627 <210> 16 <211> 615 <212> DNA <213> Canis lupus <400> 16 atgggcaaca gccaggagcg gcccagcgag accatcgacc gggagcggaa gcggctggtg 60 gagaccctgc aggccgacag cggcctgctg ctggacgccc tgctggcccg gggcgtgctg 120 gccggccccg agtacgaggc cctggacgcc ctgcccgacg ccgagcggcg ggtgcggcgg 180 ctgctgctgc tggtgcagag caagggcgag gccgcctgcc aggagctgct gctgtgcgcc 240 cagcggaccg cccgggcccc cgaccccgcc tgggactggc agcacgtggg caccggctac 300 cgggagcgga gctgggacgc cgcctgcgcc ggccactgga cccccgaggc ccccggcagc 360 agcaccacct gccccgagct gccccgggcc gccgactgcg gcgagcccgg cgcccccggc 420 ggcagcgagg ccgcccagag cggcagcctg gaggagcccg accccgagct ggaggccggc 480 gccgagctgg agagcgagcc ccagatggac ctggagcccg agcccgaggc cgagcccgag 540 cccgagctgg agcgggagcc cgagcccgag cccgagcccg acctggaggc cggcgacgag 600 agcgaggaca gctga 615 <210> 17 <211> 627 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (91)..(91) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (141)..(141) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (168)..(168) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (169)..(169) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (180)..(180) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (183)..(183) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (231)..(231) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (234)..(234) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (237)..(237) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (258)..(258) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (261)..(261) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (270)..(270) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (294)..(294) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (309)..(309) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (315)..(315) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (321)..(321) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (324)..(324) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (342)..(342) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (345)..(345) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (351)..(351) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (358)..(358) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (359)..(359) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (360)..(360) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (363)..(363) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (369)..(369) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (378)..(378) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (379)..(379) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (385)..(385) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (387)..(387) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (390)..(390) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (391)..(391) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (392)..(392) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (393)..(393) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (399)..(399) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (411)..(411) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (417)..(417) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (424)..(424) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (425)..(425) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (432)..(432) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (438)..(438) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (439)..(439) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (440)..(440) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (444)..(444) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (450)..(450) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (459)..(459) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (465)..(465) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (474)..(474) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (477)..(477) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (484)..(484) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (485)..(485) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (486)..(486) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (489)..(489) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (495)..(495) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (498)..(498) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (501)..(501) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (507)..(507) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (513)..(513) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (519)..(519) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (528)..(528) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (537)..(537) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (540)..(540) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (543)..(543) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (546)..(546) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (549)..(549) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (555)..(555) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (558)..(558) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (567)..(567) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (570)..(570) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (573)..(573) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (579)..(579) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (603)..(603) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (604)..(604) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (613)..(613) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (614)..(614) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (618)..(618) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (621)..(621) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (622)..(622) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (623)..(623) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 atgggcaacg cncaggagcg gccnnnngag acnatcgacc gngagcggaa ncgnctggtn 60 gagacnctgc aggcngacnn nggnctgctg ntggacgcnc tgctggcncg gggcgtgctn 120 accggnccng agtacgaggc nntggangcn ctgccngang ccgagcgnng ggtgcgncgn 180 ctnctgctgc tggtgcaggg caagggcgag gccgcctgcc aggagctgct ncgntgngcc 240 cagcgnaccg cnggcgcncc ngaccccgcn tgggactggc agcacgtggg nccnggctac 300 cgggaccgna gctangaccc nccntgcccn ggccactgga cnccngaggc ncccggcnnn 360 ggnaccacnt gccccggnnt gcccngngcn nnngacccng acgaggccgg nggcccngag 420 ggcnncgagg cngtgcannn cggnaccccn gaggagccng agccngagct ggangcngag 480 gccnnnaang aggcngancc ngagccngag ccngagccng agctggancc cgaggcngan 540 gcnganccng agccnganct ggagccngan ccngacccng agcccgagcc cgacttcgag 600 ganngggacg agnncganga nnnctga 627 <210> 18 <211> 627 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 atgggcaacg cgcaggagcg gccgtcagag actatcgacc gcgagcggaa acgcctggtc 60 gagacgctgc aggcggactc gggactgctg ttggacgcgc tgctggcgcg gggcgtgctc 120 accgggccag agtacgaggc attggatgca ctgcctgatg ccgagcgcag ggtgcgccgc 180 ctactgctgc tggtgcaggg caagggcgag gccgcctgcc aggagctgct acgctgtgcc 240 cagcgtaccg cgggcgcgcc ggaccccgct tgggactggc agcacgtggg tccgggctac 300 cgggaccgca gctatgaccc tccatgccca ggccactgga cgccggaggc acccggctcg 360 gggaccacat gccccgggtt gcccagagct tcagaccctg acgaggccgg gggccctgag 420 ggctccgagg cggtgcaatc cgggaccccg gaggagccag agccagagct ggaagctgag 480 gcctctaaag aggctgaacc ggagccggag ccagagccag agctggaacc cgaggctgaa 540 gcagaaccag agccggaact ggagccagaa ccggacccag agcccgagcc cgacttcgag 600 gaaagggacg agtccgaaga ttcctga 627 <210> 19 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (127)..(127) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (141)..(141) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (153)..(153) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (186)..(186) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (195)..(195) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (234)..(234) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (240)..(240) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (249)..(249) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (258)..(258) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(264) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (282)..(282) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 atgggcnnng agctggagac ngcnatggag accctnatca acgtgttcca cgcccacnnn 60 ggcaangagg gngacaagta caagctgagc aagaaggagc tgaangagct gctgcagacn 120 gagctnnnng gcttcctgga ngcccagaag gangtggang cngtggacaa ggtgatgaag 180 gagctngacg agaanggnga cggngaggtg gacttccagg agtangtggt gctngtggcn 240 gcnctnacng tggcctgnaa caanttcttc tgggagaaca gntga 285 <210> 20 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (155)..(155) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 atgggcagcg agctggagac cgccatggag accctgatca acgtgttcca cgcccacagc 60 ggcaaggagg gcnacaagta caagctgagc aagaaggagc tgaaggagct gctgcagacc 120 gagctgagcg gcttcctgga cgcccagaag gacgnngacg ccgtggacaa ggtgatgaag 180 gagctggacg agaacggcga cggcgaggtg gacttccagg agtacgtggt gctggtggcc 240 gccctgaccg tggcctgcaa caacttcttc tgggagaaca gctga 285 <210> 21 <211> 285 <212> DNA <213> Canis lupus <400> 21 atgggcagcg agctggagac cgccatggag accctgatca acgtgttcca cgcccacagc 60 ggcaaggagg gcaacaagta caagctgagc aagaaggagc tgaaggagct gctgcagacc 120 gagctgagcg gcttcctgga cgcccagaag gacgccgacg ccgtggacaa ggtgatgaag 180 gagctggacg agaacggcga cggcgaggtg gacttccagg agtacgtggt gctggtggcc 240 gccctgaccg tggcctgcaa caacttcttc tgggagaaca gctga 285

Claims (35)

  1. 서열식별번호(SEQ ID NO): 6-8, 16 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 6-8, 16 및 21로 기재된 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  3. 2개 이상의 트랜스진을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 제1 트랜스진은 S100 패밀리 단백질을 코딩하고, 제2 트랜스진은 카스파제 동원 도메인을 갖는 심장 아폽토시스 리프레서 (cARC)를 코딩하는 것인, 2개 이상의 트랜스진을 대상체의 심장 내로 전달하기 위한 rAAV 벡터이며,
    여기서 제1 트랜스진은 서열식별번호: 5, 8, 및 19-21로 기재된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 트랜스진은 서열식별번호: 6, 7, 및 15-18로 기재된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 제2 트랜스진이 서열식별번호: 6 및 7로 기재된 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, S100 패밀리 단백질이 심장 S100 칼슘-결합 단백질 A1 (cS100A1) 또는 그의 변이체인 rAAV 벡터.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 트랜스진이 서열식별번호: 5로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 트랜스진이 서열식별번호: 8로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)가 cS100A1 트랜스진과 cARC 트랜스진 사이에 존재하는 것인 rAAV 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 rAAV 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 프로모터가 심장 트로포닌 C, 심장 트로포닌 I, 및 심장 트로포닌 T (cTnT)로부터 선택되는 심장-국한 프로모터인 rAAV 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 프로모터가 α-미오신 중쇄 유전자, 6-미오신 중쇄 유전자, 미오신 경쇄 2v 유전자, 미오신 경쇄 2a 유전자, CARP 유전자, 심장 α-액틴 유전자, 심장 m2 무스카린성 아세틸콜린 유전자, ANF, 심장 근형질 세망 Ca-ATPase 유전자, 및 골격α-액틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 심장-국한 프로모터이거나; 또는 MLC-2v 유전자로부터 유래된 인공 심장 프로모터인 rAAV 벡터.
  12. 제9항에 있어서, 프로모터가 cTnT인 rAAV 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-상보적인 rAAV 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9-12에 기재된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 서열식별번호: 12로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터.
  16. AAV 캡시드에 캡시드화된 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자.
  17. 제16항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV8, AAVrh.74, AAVrh.10, AAV2/6 또는 AAV9 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 것인 rAAV 입자.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, AAV 캡시드가 AAVrh.10 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 것인 rAAV 입자.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
  20. 심장 질환을 앓고 있는 인간 대상체에게 제19항의 조성물 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 투여하는 것을 포함하는, 심장 질환을 앓고 있는 인간 대상체의 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 심장 질환이 대상체에서 심부전을 유발하는 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 심장 질환이 심근병증인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 심장 질환이 비대성 심근병증 또는 확장성 심근병증인 방법.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서, 심장 질환이 급성 허혈인 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체의 심장 내로의 주사 또는 대상체의 관상동맥으로의 혈관내 주사를 통해 투여되는 것인 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계가 대상체의 심장에서 2개 이상의 트랜스진의 발현을 발생시키는 것인 방법.
  27. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, S100 패밀리 단백질을 포함하는 트랜스진이 cARC를 포함하는 트랜스진에 대해 5'에 위치하는 것인 rAAV 벡터.
  28. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, cARC를 포함하는 트랜스진이 S100 패밀리 단백질을 포함하는 트랜스진에 대해 5'에 위치하는 것인 rAAV 벡터.
  29. 제1항 내지 제19항, 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9-12로 기재된 서열 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 서열식별번호: 11로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터.
  31. 제29항에 있어서, 서열식별번호: 9, 10, 및 12로 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 rAAV 벡터.
  32. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계가 대상체에서 개선된 심장 기능을 생성하는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 투여 단계가 대상체에서 10개월 초과 동안 개선된 심장 기능을 생성하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제19항 및 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 13 또는 14에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 rAAV 벡터.
  35. 제1항 내지 제19항 및 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 rAAV 벡터.
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