CN114206351A

CN114206351A - 用于人中心肌病的aav心脏基因治疗

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Publication number: CN114206351A
Application number: CN202080052456.6A
Authority: CN
Inventors: 休·利·斯威尼
Original assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2022-03-18
Also published as: JP2022541793A; EP3999074A1; US20220265858A1; MX2022000767A; AR122289A1; WO2021016126A1; WO2021016126A8; TW202117017A; AU2020316339A1; CO2022001686A2; CL2022000115A1; BR112022000898A2; AU2020316339A2; IL289667A; KR20220034801A; EP3999074A4; CA3142534A1; SG11202112140SA

Abstract

本公开内容涉及可用于治疗心脏病症的组合物和方法。所公开的组合物和方法基于包含重组AAV载体的基因治疗，所述重组AAV载体用于将两个或更多个转基因递送到人对象的心脏中，其中所述转基因包含S100A1蛋白和心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)凋亡抑制因子。在多个实施方案中，本文中公开的组合物和方法包含含有经密码子优化以在人中表达的S100A1和/或cARC cDNA序列的载体。在一些方面中，对一种或更多种心脏病症的多个来源的靶向可以在治疗期间提供协同益处。

Description

用于人中心肌病的AAV心脏基因治疗

相关申请

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求于2019年7月19日提交的标题为“AAV CARDIACGENE THERAPY FOR CARDIOMYOPATHY IN HUMANS”的美国临时申请序列号62/876,540的申请日权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

心肌病是对象中心脏病的第二最常见原因，并且继发体征的医学管理是唯一的治疗选择。患病对象的预后取决于疾病的阶段和品种。心脏功能严重依赖于钙依赖性信号传导。在心脏病期间，心脏细胞内钙通道的功能失常促进钙循环异常，进一步抑制心脏功能。已显示降低钙循环异常的基因转移策略在小型和大型动物模型中以及在人临床试验中改善心脏病。

扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)是人心肌病的最常见类型，主要发生在20至60岁的成年人中。DCM影响心脏的心室和心房(分别为心脏的下腔和上腔)。DCM的大多数形式是来自多种原因的获得性形式，其包括使心肌发炎的冠心病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎和病毒性感染。酒精滥用和某些药物(例如可卡因(cocaine)和安非他明(amphetamine))以及至少两种用于治疗癌症的药物(多柔比星(doxorubicin)和柔红霉素(daunorubicin))也可导致DCM。另外，DCM有多种遗传形式，包括但不限于与迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)和贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)相关的DCM。在贝克肌营养不良的某些形式的情况下，以及在迪谢内肌营养不良的大多数情况下，心肌病最终可限制患者的存活。

发明概述

在人中，扩张型心肌病是心肌病的最常见类型，并且可来源于多种获得性以及遗传性病症。如在狗和其他动物模型中一样，虽然疾病起因的根源在于钙处理功能障碍，但疾病的最终进展是由线粒体功能障碍和/或牵张诱导的心肌细胞凋亡所驱动的。尽管在早期疾病阶段仅仅解决钙处理问题就可以是有效的，但解决钙处理、线粒体功能障碍和凋亡的组合对于治疗DCM的所有形式以及在疾病进展的所有阶段都是必要的。

本文中公开了用于治疗患有心肌病和充血性心力衰竭的人对象的基因递送方法。这些方法包括：表达S100A1以解决钙处理，以及表达ARC(胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(Apoptosis Repressor with Caspase Recruitment Domain))以阻断所有凋亡来源并使线粒体功能正常化。通过所公开的自互补AAV载体方法表达S100A1和ARC转基因是迅速的(即，在数小时内)，这对抵消终末期心力衰竭的影响是至关重要的并且限于心脏。因此，这些方法解决了DCM发作和进展的所有三个驱动因素，并且因此应适用于在疾病进展的任何阶段的任何DCM形式。

另外，本文中公开了一系列用于基因递送的转基因，其编码人来源的蛋白质ARC和S100A1。这些转基因可包含cDNA序列，并且可以使用重组腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体系统递送和表达这些序列。所公开的cDNA序列可以与任何类型的基因递送载体一起递送，包括但不限于所有形式的AAV、慢病毒、脂质体和外排体。

在一些具体实施方案中，这些序列可以使用AAV载体DNA的自互补形式表达，其包含i)编码人ARC的野生型或经优化的cDNA和ii)编码人S100A1的野生型或经优化的cDNA。ARC和s100A1cDNA序列可以这样放置，使得在5’至3’方向上ARC包含第一cDNA，以及S100A1包含第二cDNA，或反之亦然。在另一些实施方案中，这些cDNA序列可以使用两个启动子而不是一个启动子和IRES来表达。

这些cDNA序列的表达可以由位于第一cDNA的5’的心脏肌钙蛋白T启动子(cTnT)和/或位于第二cDNA的5’的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)可操作地控制。当AAV通过循环引入到心脏和其他组织中或通过直接注射引入时，cTnT启动子将两种转基因的表达限制在心肌细胞中。当在心肌细胞中表达时，所得的ARC表达阻止凋亡，并帮助使线粒体膜电位正常化，降低自由基产生并改善线粒体功能。S100A1表达导致提高的通过肌/内质网Ca²⁺-ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase，SERCA)泵(例如SERCA同种型2a泵或SERCA2a)泵入到心肌细胞肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)中的钙和减少的通过雷诺丁受体(ryanodine receptor)通道从SR漏出的钙。该组合允许心肌细胞钙处理的正常化和改善的心脏收缩和舒张功能。

凋亡作用不存在、改善的线粒体功能和改善的钙处理的组合作用减缓了心力衰竭的进展并改善了心脏功能。所公开的rAAV载体可对所有形式的人心肌病和心力衰竭有效。因此，所公开的rAAV载体可以递送至患有包括心脏功能差的疾病、障碍或病症(例如，人心肌病和心力衰竭)的对象(例如，人对象)。

因此，本公开内容的一些方面提供了用于将转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体。在一些实施方案中，这样的rAAV载体包含至少两个转基因，一个编码S100家族蛋白，并且一个编码凋亡抑制因子(apoptotic inhibitor)。这样的rAAV载体可从5’至3’依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)序列、可操作地连接至转基因的启动子和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，两个转基因可操作地连接至同一个单启动子。在另一些实施方案中，每个转基因可操作地连接至单独的启动子。在一些实施方案中，rAAV载体还包含至少一个多腺苷酸化信号(例如，位于从单启动子表达的两个转基因的3’，或从不同启动子表达的一个或两个转基因的3’)。本公开内容的一些方面提供了用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，其中所述载体从5’至3’包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、两个或更多个转基因和可操作地连接至所述两个或更多个转基因的启动子、多腺苷酸化信号以及第二AAV反向末端重复(ITR)序列，其中所述两个或更多个转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。

本公开内容的转基因可包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。例如，S100家族蛋白可包含心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体。在另一个实例中，凋亡抑制因子可包含心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cardiac Apoptosis Repressor with CaspaseRecruitment Domain，cARC)或其变体。

在一些实施方案中，本公开内容的转基因中的一个或更多个是天然存在的或野生型序列。在一些实施方案中，一个或更多个转基因(例如，cARC转基因)是经密码子优化的以在人中表达。

在多个实施方案中，本文中提供包含启动子、多腺苷酸化(polyA)信号和含有两个或更多个转基因的多核苷酸的rAAV载体。在一些实施方案中，第一转基因编码S100家族蛋白(例如cS100A1或其变体)并且第二转基因编码cARC。在一些具体实施方案中，S100家族蛋白和cARC转基因来源于人。

在一些实施方案中，多核苷酸的第一转基因(编码S100家族蛋白)包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。或者，第一转基因可包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，第一转基因(编码S100家族蛋白)可包含与SEQ ID NO：19至21中的任一个具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。第一转基因可包含SEQ ID NO：19至21中的任一个的核苷酸序列。在一些具体实施方案中，第一转基因可包含SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。

多核苷酸的第二转基因可包含与SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。或者，第二转基因可包含与SEQ ID NO：7具有至少90％，至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。第二转基因可包含SEQ ID NO：6和7的序列中的任一个。

在一些实施方案中，第二转基因(编码cARC蛋白)可包含与SEQ ID NO：15至18中的任一个具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。第一转基因可包含SEQID NO：15至18所示的核苷酸序列中的任一个。在一些具体实施方案中，第一转基因包含SEQID NO：16的序列。

在一些实施方案中，在两个或更多个转基因之间(例如，在cS100A1转基因和cARC转基因之间)存在内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，编码S100家族蛋白的转基因在编码凋亡抑制因子的转基因的5’。在另一些实施方案中，编码凋亡抑制因子的转基因在编码S100家族蛋白的转基因的5’。

本文中还提供了rAAV颗粒，其包含被衣壳化(encapsidated)在AAV衣壳中的本文中所公开的rAAV载体。本公开内容的另一些方面包括包含本文中所述的rAAV颗粒的组合物。可将这样的组合物施用于对象用于对心脏病进行基因治疗。在一些实施方案中，心脏病在对象中引起心力衰竭。在一些实施方案中，心脏病是心肌病。在另一些实施方案中，心脏病是肥厚型心肌病或扩张型心肌病。在另一些实施方案中，心脏病是急性缺血。

本公开内容的组合物可以通过不同的途径施用于对象。在一些实施方案中，组合物通过注射到对象的心脏中来施用。在一些实施方案中，组合物的施用导致转基因(例如，两个或更多个转基因)在对象的心脏中表达。在多个实施方案中，施用组合物的步骤导致对象的心脏功能改善，例如导致对象的心脏功能改善持续超过10个月。在一些实施方案中，施用导致心脏功能改善持续超过12个月、超过14个月、超过16个月、超过17个月、超过20个月、超过22个月或超过24个月。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分并且为了进一步示出本公开内容的某些方面而包括在内。通过结合附图参考以下描述可更好地理解本公开内容，其中相同的附图标记表示相同的要素：

图1描绘了示例性AAV构建体的图。在第一AAV反向末端重复(ITR)之后是心脏肌钙蛋白T启动子(cTnT)，然后是编码S100钙结合蛋白A1(cS100A1)的序列，随后是内部核糖体进入位点(IRES)，随后是编码胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)的序列，随后是多腺苷酸化(PA)序列，以及第二AAV ITR。

图2描绘了来自经处理的肌营养不良狗在基线和基因递送之后数周的舒张期MRI成像。数据支持了稳定或略微改善的心脏重构，伴有舒张期左心室容积轻度降低。

图3描绘了来自经处理的肌营养不良狗在基线和基因递送之后数周的收缩期MRI成像。数据支持了在处理之后稳定或略微改善的左心室收缩功能，伴有收缩期容积轻度降低，表明收缩性改善和左心室心输出量提高。

图4示出了在AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后D2.mdx小鼠的射血分数、峰值应变和心输出量。与假注射小鼠相比，在24周的时间内，注射了治疗性AAV的小鼠具有更好的维持射血分数、应变发展和心输出量。

图5示出了在用重组AAVrh.10-S100A1/ARC载体处理的小鼠和对照小鼠中S100A1和ARC的表达水平。蛋白质分析(Western印迹)证实了与对照(假注射)相比，在经处理组织中S100A1和ARC水平二者均升高。

图6示出了在10×和20×放大率下对照和经处理小鼠的心肌细胞。心脏组织学数据表明，与对照心脏相比，经处理小鼠表现出较低的DMD病理学。

图7显示在重组AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后，(两只中的)第一只抗肌萎缩蛋白缺陷型狗(GRMD狗)(名为Calvin)显示出改善的心脏功能(通过射血分数测量)。两只经注射的狗在处理之后均表现出射血分数和其他心脏参数的改善，其通过心脏MRI测量并通过echo数据确认。

图8示出了第二只GRMD狗(名为Sebastian)在AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后显示出改善的心脏功能的数据。

图9A至9C显示AAV-S100A1/ARC处理在GRMD狗中降低了血清肌酸激酶(creatinekinease，CK)水平并预防了肌肉萎缩，通过双腿的面积(图9A)、最大横截面积(cross-sectional area，CSA)(图9B)和双腿的体积(图9C)测量的肢体肌肉质量的MRI测量结果。结果表明，心脏处理之后骨骼肌质量提高或保持不变。

图10显示GRMD对象在注射AAVrh.10-S100A1/ARC之后骨骼肌中循环肌酸激酶水平(CK)的水平降低，表明正在进行的肌肉损伤降低。

图11示出了经密码子优化的犬ARC cDNA序列和经密码子优化的人ARC cDNA序列之间的序列比对。序列从上到下对应于SEQ ID NO：15、16和6。

图12示出了经密码子优化的和天然的人ARC cDNA序列之间的序列比对。序列从上到下对应于SEQ ID NO：17、18和6。

图13示出了经密码子优化的和天然的人S100A1 cDNA序列之间的序列比对。序列从上到下对应于SEQ ID NO：19、5和8。

图14示出了经密码子优化的犬S100A1 cDNA序列和经密码子优化的人S100A1cDNA序列之间的序列比对。序列从上到下对应于SEQ ID NO：20、8和21。

图15示出了D2.mdx小鼠(n＝12)在于1月龄时AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后，于10月龄时的分数缩短(fractional shortening)和射血分数。在经AAVrh.10-S100A1/ARC处理的小鼠中，分数缩短和射血分数二者与野生型D2小鼠没有显著差异，而未经处理的D2.mdx小鼠的功能显著降低。

图16示出了D2.mdx小鼠(n＝12)在于1月龄时AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后，于10月龄时的左心室容积和直径。舒张期和收缩期二者期间的体积和直径增加表明扩张型心肌病。在经AAVrh.10-S100A1/ARC处理的小鼠中，体积和直径二者与野生型D2小鼠没有显著差异，而未经处理的D2.mdx小鼠在这两个参数上都有显著提高。

图17示出了允许在6周龄时开始锻炼但直到6月龄时才接受处理的D2.mdx.sk_肌营养相关蛋白小鼠(研究开始时每组n＝12只)的50％存活的年龄。在未接受处理的对照组中，中位存活为10月龄。接受AAVrh.10-ARC的组的中位存活为14个月，接受AAVrh.10-S100A1的组的中位存活为16个月，以及接受AAVrh.10-S100A1/ARC的组的中位存活为20个月.

图18示出了群体未经处理的GRMD狗(n＝10)的射血分数随年龄的变化，以及在红色箭头指示的年龄(3至7月龄)接受AAVrh.10-S100A1/ARC载体处理的个体GRMD狗的射血分数变化。在所有四只接受处理的狗中，射血分数在处理之后都有所改善，并且此后一直稳定。

图19示出了正常1岁金毛寻回犬(golden retriever)(最左侧一栏)和在7月龄时接受AAVrh.10-S100A1/ARC载体处理的GRMD狗(WnM3/Calvin)(最右侧一栏)的左心室组织学(H&E染色)。经处理的狗在34月龄时死于吸入性肺炎，即使它的心脏功能仍在正常范围内(图18)。中间三栏示出了未经处理的GRMD狗在8、24和30月龄时的左心室组织学。存在明显且进行性的纤维化，其替代了肌肉组织(粉红色)。请注意，在最右侧的经处理的狗一栏中，组织学与正常狗的组织学没有明显不同，并且与未经处理的GRMD狗相比明显更少地纤维化且更完整。

发明详述

本公开内容涉及用于在人对象中对心脏病(例如心肌病)进行心脏基因治疗的组合物和方法。本公开内容的方法涉及使用重组AAV(rAAV)颗粒来同步递送和表达两个或更多个转基因。本公开内容的转基因包含至少两类蛋白质，其各自具有解决心脏病的不同方面的特定功能。一类转基因在心肌细胞中调节钙信号传导，例如S100家族蛋白。另一类转基因包含凋亡抑制因子。在一些实施方案中，转基因可以是心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体，以及心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)或其变体。

本公开内容的组合物和方法至少部分基于两个转基因(例如S100A1和ARC)在其在对象的心脏中同步递送和表达时的协同作用。S100A1蛋白改善了钙处理的一些方面，包括使肌质网钙瞬变正常化，从而导致收缩功能正常化。ARC蛋白阻断由线粒体机制引发的凋亡和由非线粒体机制引发的凋亡(例如牵张诱导的凋亡)，并改善线粒体功能。换言之，S100A1和ARC通过协同益处解决了心力衰竭的两个单独要素(钙处理功能障碍和凋亡)，从而导致更好的长期治疗结局。此外，本公开内容的组合物和方法在心力衰竭的任何疾病阶段均有效。

本文中还提供了制备适用于将转基因例如S100A1和ARC或其变体递送到对象的心脏中的rAAV颗粒的方法。这样的rAAV颗粒可包含重组AAV基因组，其包含编码转基因的核酸分子，其中所述核酸分子被AAV衣壳蛋白衣壳化。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体。重组AAV基因组是单链DNA，其还可包含促进AAV基因组整合到宿主基因组中和转基因表达的序列元件。例如，重组AAV基因组可包含组织特异性启动子以确保转基因在靶组织或器官中的表达。这样的rAAV颗粒可用于治疗心脏病症的组合物中。

因此，本公开内容还提供了用于将转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体包含至少两个转基因，一个编码S100家族蛋白，并且一个编码凋亡抑制因子。这些rAAV载体可从5’至3’依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、可操作地连接至转基因的启动子和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，两个转基因可操作地连接至同一个单启动子。在另一些实施方案中，每个转基因可操作地连接至单独的启动子。在一些实施方案中，rAAV载体还包含至少一个多腺苷酸化信号(例如，位于从单启动子表达的两个转基因的3’，或从不同启动子表达的一个或两个转基因的3’)。

本公开内容还提供了用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，在一些实施方案中，rAAV载体恰好包含两个转基因。在一些实施方案中，rAAV载体包含三个转基因。在一些实施方案中，所述载体从5’至3’包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、两个或更多个转基因和可操作地连接至所述两个或更多个转基因的启动子、多腺苷酸化信号以及第二AAV反向末端重复(ITR)序列，在一些具体实施方案中，所述两个或更多个转基因包含含有S100家族蛋白的第一转基因和含有凋亡抑制因子的第二转基因。

本文中使用的“转基因”是指已经天然地或通过众多基因工程技术中的任一种从一个生物体转移到另一个生物体的基因或遗传材料。转基因可以是目的蛋白或多肽(例如，S100A1、ARC)或目的RNA(例如，siRNA或微RNA)。在一些实施方案中，一个rAAV载体可包含一个或更多个转基因的编码序列。例如，一个rAAV载体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个转基因的编码序列。在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体包含S100A1和ARC或其变体二者的编码序列。在一些实施方案中，rAAV载体还包含编码Rep蛋白的区域。本公开内容的转基因包含两类蛋白质，其各自具有解决一种或更多种心脏病症的不同方面的特定功能。一类转基因可在心肌细胞中调节钙信号传导，例如S100家族蛋白。另一类转基因可包含凋亡抑制因子。

本文中使用的术语“变体”是指具有偏离天然存在的核酸的特征的核酸，例如，“变体”与野生型核酸具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。例如，转基因变体是与其野生型序列相比包含转基因的一个或更多个核苷酸替换的核酸。这些替换可以是沉默的，即它们不修饰任何编码蛋白质的氨基酸序列(或以其他方式产生变体氨基酸序列)。或者，这些替换可导致编码蛋白质的氨基酸序列的修饰，从而导致编码蛋白质相对于野生型蛋白质序列具有一个或更多个氨基酸替换(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10至15、或15至20个氨基酸替换)。这些替换包括化学修饰以及截短。该术语还涵盖野生型核酸序列的功能片段。参考序列的这些修饰可发生在参考序列的5’或3’端或这些位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或散布在参考序列中的一个或更多个连续组中。

实际上，任何特定的核酸分子是否与例如转基因的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性可以使用已知的计算机程序常规地确定。用于确定查询序列(例如，本公开内容的序列)和主题序列之间的最佳整体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)可以使用基于Brutlag et al.(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的算法的blastn计算机程序或FASTDB确定。在序列比对中，查询序列和主题序列要么都是核苷酸序列，要么都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果表示为百分比同一性。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝PAM 0，k-元组＝2，错配罚分＝1，加入罚分＝20，随机化组长度＝0，截止分数＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位尺寸罚分＝0.05，窗口大小＝500或主题氨基酸序列的长度，以较短者为准。核苷酸是否匹配/对齐由FASTDB序列比对的结果确定。然后从通过上述FASTDB程序使用指定参数计算的百分比同一性中减去该百分比，以获得最终的百分比同一性分数。该最终百分比同一性分数用于本公开内容的目的。对于相对于查询序列在5’和/或3’端截短的主题序列，通过计算位于查询序列5’或3’的查询序列的核苷酸数量来校正百分比同一性，其与相应的主题核苷酸不匹配/对齐的，作为查询序列总碱基的百分比。

可根据本公开内容使用的S100家族蛋白包括但不限于S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7(例如，牛皮癣素(psoriasin))、S100A8(例如，钙粒蛋白A)、S100A9(例如，钙粒蛋白B)、S100A10、S100A11、S100A12(例如，钙粒蛋白C)、S100A13、S100A14、S100A15(例如，koebnerisin)、S100A16、S100B、S100P和S100Z，或其变体。

在一些实施方案中，S100家族蛋白可以是S100钙结合蛋白A1(S100A1)。在一些实施方案中，S100A1是心脏S100A1(cS100A1)或其变体。cS100A1蛋白是心肌收缩性的调节因子。在肺动脉高压模型中，cS100A1蛋白水平在右心室肥大组织中降低。此外，S100A1是心脏肥大潜在的遗传程序的调节因子，因为S100A1抑制肥大基因(包括MYH7、ACTA1和S100B)的α1肾上腺素能刺激。

在心肌细胞中，S100A1通过调节雷诺丁受体2(ryanodine receptor 2，RyR2)、肌/内质网Ca²⁺-ATP酶(SERCA)、肌联蛋白(titin)和线粒体F1-ATP酶活性来调节钙控制的SR网络、肌节和线粒体功能。作为结果，具有提高的S100A1表达的心肌细胞和心脏显示出提高的收缩和舒张性能，这是由于增强的SR Ca²⁺负荷和随后的收缩期Ca²⁺释放以及舒张期SR Ca²⁺渗漏降低和Ca²⁺再螯合增强导致Ca²⁺瞬变振幅改善的结果。同步地，S100A1通过增强心肌细胞Ca²⁺周转而提高了线粒体高能磷酸的产生并且因此使能量供应与提高的腺苷5’-三磷酸(ATP)需求相协调。心肌细胞中S100A1表达降低与收缩功能降低相关，证实了该蛋白质的病理生理学意义。

在一些实施方案中，所公开的rAAV载体中任一种的多核苷酸的S100A1 cDNA(转基因)序列与天然存在的人来源的S100A1序列具有100％同一性。在另一些实施方案中，S100A1 cDNA序列与天然存在的S100A1序列具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。

在一些实施方案中，S100A1 cDNA序列是经密码子优化的以在人细胞中表达。在一些实施方案中，S100A1 cDNA(转基因)序列包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8具有100％同一性的序列。在另一些实施方案中，S 100A1cDNA序列与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。

在另一些实施方案中，S100A1 cDNA序列是经密码子优化的以在犬细胞中表达。在一些实施方案中，rAAV载体包含这样的S100A1 cDNA序列，其与SEQ ID NO：21具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。在一些实施方案中，rAAV载体包含SEQ ID NO：21。

S100A1 cDNA序列的一些非限制性实例描述如下。

天然S100A1(智人(homo sapiens))

经优化的S100A1(智人)

经密码子优化的人S100A1c DNA序列和天然人S100A1c DNA序列(分别为SEQ IDNO：8和5)之间的核苷酸序列比对示出在图13中。

作为参考，下文描述了动物来源的S100A1 cDNA序列的某些非限制性实例。经密码子优化的犬S100A1 cDNA序列和经密码子优化的人S100A1 cDNA序列(分别为SEQ ID NO：21和8)之间的核苷酸序列比对示出在图14中。

S100A1(家犬(canis lupus familiaris))

(NCBI参考序列：XM_005622816.2)

S100A1(家猫(felis catus))

(NCBI参考序列：XM_003999773.3)

本公开内容的一些方面提供了组合物和方法，其包括递送编码凋亡抑制因子(例如抗凋亡剂)的转基因。凋亡抑制因子的一些举例说明性实例包括fink、p35、crmA、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、来自腺病毒的E1B-19K、以及促凋亡剂的拮抗剂(例如反义物、核酶、抗体等)。在一些实施方案中，凋亡抑制因子是心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(ARC)或其变体。在另一些实施方案中，凋亡抑制因子是心脏ARC或其变体。在一些实施方案中，可期望分别递送S100家族蛋白和凋亡抑制因子。在某些实施方案中，将编码S100家族蛋白的转基因与一种或更多种小分子凋亡抑制因子同步或相继递送。其他示例性小分子凋亡抑制因子包括c-Myc抑制剂、Bax抑制剂、p53抑制剂、tBid抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂和促凋亡BCL-2家族成员的抑制剂。

cARC是几乎仅在肌源性细胞(myogenic cell)中表达的一种凋亡调节蛋白。其包含胱天蛋白酶募集域(caspase recruitment domain，CARD)，其通过胱天蛋白酶募集域来阻断一些引发剂胱天蛋白酶的激活。ARC还阻断与凋亡相关的胱天蛋白酶非依赖性事件。由急性缺血和随后的心室重构引起的凋亡被认为是心力衰竭的介质。尽管缺血后心力衰竭可具有多种原因，但最近的注意力已转向理解凋亡或程序性细胞死亡的作用。凋亡的特征在于：线粒体和肌膜下膜保持，核染色质浓缩以及不会触发炎性反应的巨噬细胞或邻近细胞吞噬。已知凋亡的激活是通过涉及胱天蛋白酶的机制发生的，胱天蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的一个家族，其作为无活性的前体合成并通过蛋白水解切割成其活性形式。ARC能够通过阻断胱天蛋白酶来阻断凋亡的激活。

因此，在一些方面中，本文中提供了包含这样的多核苷酸的rAAV载体(或rAAV核酸载体)，该多核苷酸包含与SEQ ID NO：6至8、16和21的核苷酸序列中的任一个具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列与SEQ IDNO：6至8、16和21中任一个的序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或超过12个核苷酸不同。在一些具体实施方案中，任何公开的rAAV载体包含含有SEQ ID NO：6至8、16和21中的任一个的多核苷酸。

在一些实施方案中，所公开的cARC和S100转基因序列相对于野生型序列包含在5’或3’端的截短。在一些实施方案中，所公开的转基因序列相对于SEQ ID NO：5至8和15至21包含在5’或3’端的截短。在一些实施方案中，转基因包含这样的核苷酸序列，其与SEQ IDNO：5至8和15至21中任一个的序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或超过12个核苷酸不同。

在一些实施方案中，所公开的rAAV载体的多核苷酸的心脏ARC cDNA(或转基因)序列与天然存在的人来源的cARC序列具有100％的同一性。在另一些实施方案中，cARC cDNA序列与天然存在的人来源的cARC序列具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。

在一些具体实施方案中，cARC cDNA序列是经密码子优化的以在人细胞中表达。在一些实施方案中，cARC cDNA(转基因)序列包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7具有100％同一性的序列。在另一些实施方案中，cARC cDNA序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。

在另一些实施方案中，cARC cDNA序列是经密码子优化的以在犬细胞中表达。在一些实施方案中，rAAV载体包含这样的cARC cDNA序列，其与SEQ ID NO：16具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。在一些实施方案中，rAAV载体包含SEQ ID NO：16。

cARC cDNA序列的一些非限制性实例描述如下。

经优化的ARC(智人)

经优化的ARC(智人)

经密码子优化的人ARC cDNA序列和天然人ARC cDNA序列(分别为SEQ ID NO：6和18)之间的核苷酸序列比对示出在图12中。

作为参考，下文描述了动物来源的ARC cDNA序列的某些非限制性实例。经密码子优化的犬ARC cDNA序列和经密码子优化的人ARC cDNA序列(分别为SEQ ID NO：16和6)之间的核苷酸序列比对示出在图11中。

ARC(家犬)

(NCBI参考序列：NM_001048121.1)

ARC(家猫)

(NCBI参考序列：XM_006941587.2)

在另一些方面中，所公开的rAAV载体中任一种的两个或更多个转基因包含含有显性阴性形式的受磷蛋白(或dn-PLN)的转基因。受磷蛋白(PLN)是肌/内质网Ca²⁺ATP酶2a(SERCA2a)泵的内源性抑制因子，其介导钙离子再摄取到心肌细胞的肌质网(SR)中。显性阴性形式是假磷酸化形式，其与天然受磷蛋白竞争结合SERCA2a，并从而降低其对SERCA2a的抑制作用(参见Bish，et al.Hum Gene Ther.2011；22(8)：969-977，通过引用并入本文中)。因此，在一些实施方案中，所公开的rAAV载体的第二转基因包含dn-PLN。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体可以包含任何所公开的S100A1转基因(例如，人经密码子优化的S100A1序列)和dn-PLN转基因。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体可以编码S100A1蛋白和dn-PLN蛋白并从而将S100A1蛋白和dn-PLN蛋白递送到细胞中。

在另一些方面中，任何公开的rAAV载体可以包含三个或更多个转基因。在一些实施方案中，rAAV载体编码三个转基因。在一些实施方案中，第三转基因是dn-PLN序列。所述三个转基因可包含编码S100A1的第一转基因(例如人经密码子优化的S100A1序列)、编码cARC的第二转基因(例如人经密码子优化的cARC序列)和编码dn-PLN的第三转基因。

在一些实施方案中，所公开的rAAV载体不编码来源于犬或猫的蛋白质。在一些实施方案中，任何公开的载体不包含天然的犬或猫S100A1编码核苷酸序列或ARC编码核苷酸序列。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体不包含SEQ ID NO：1或2。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体不包含SEQ ID NO：3或4，或SEQ ID NO：1至4中的任一个。

重组AAV(rAAV)载体

本公开内容的一些方面涉及可用于心脏病的基因治疗的重组AAV载体。本文中使用的术语“载体”可指核酸载体(例如，质粒或重组病毒基因组)、野生型AAV基因组或包含病毒基因组的病毒。在一些实施方案中，术语“载体”可以指病毒颗粒，例如AAV病毒颗粒。

野生型AAV基因组是正义或负义的单链脱氧核糖核酸(single-strandeddeoxyribonucleic acid，ssDNA)。基因组包含两个反向末端重复(ITR)(DNA链的每个末端各有一个)以及在ITR之间的两个开放阅读框(open reading frame，ORF)：rep和cap。repORF包含编码AAV生活周期所需的Rep蛋白的四个重叠基因。cap ORF包含编码衣壳蛋白的重叠基因，所述衣壳蛋白为：VP1、VP2和VP3，它们一起相互作用来形成病毒衣壳。VP1、VP2和VP3是由一种mRNA转录物翻译的，该mRNA转录物可以以两种不同的方式剪接。可切除较长或较短的内含子，导致形成两种mRNA同种型：约2.3kb-和约2.6kb-长的mRNA同种型。衣壳形成约60个单独衣壳蛋白亚基的超分子组装体，形成能够保护AAV基因组的无包膜T-1二十面体晶格。成熟的AAV衣壳由VP1、VP2和VP3(分子量分别为约87、73和62kDa)以约1∶1∶10的比例构成。

重组AAV(rAAV)颗粒可包含重组核酸载体(以下称为“rAAV载体”)，其可至少包含：(a)含有编码转基因的序列的一个或更多个异源核酸区域；和(b)含有促进异源核酸区域(任选地与含有促进表达的序列的一个或更多个核酸区域)整合到对象的基因组中的序列的一个或更多个区域。在一些实施方案中，促进异源核酸区域(任选地与含有促进表达的序列的一个或更多个核酸区域)整合到对象的基因组中的序列是在一个或更多个核酸区域(例如，异源核酸区域)侧翼的反向末端重复(ITR)序列(例如，野生型ITR序列或经改造的ITR序列)。

在一些实施方案中，rAAV核酸载体包含一个或更多个转基因，所述转基因包含与启动子可操作地连接的编码目的蛋白质或多肽的序列，其中所述一个或更多个转基因在每一侧以ITR序列为侧翼。在一些实施方案中，如本文中所述，核酸载体还包含编码Rep蛋白的区域，其包含在以ITR为侧翼的区域内或在该区域或核酸外)，与启动子可操作地连接。ITR序列可来源于任何AAV血清型(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或可来源于多于一种血清型。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAV2或AAV6血清型。在一些实施方案中，本文中提供的第一血清型不是AAV2或AAV8血清型。在一些实施方案中，第一血清型的ITR序列来源于AAV3、AAV5或AAV6。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAV2、AAV3、AAV5或AAV6。在一些实施方案中，ITR序列与衣壳具有相同的血清型(例如，AAV6 ITR序列和AAV6衣壳，等)。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAVrh.10血清型。

ITR序列和包含ITR序列的质粒是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如，可从以下获得的产品和服务：Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，San Diego，CA；Agilent Technologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA；以及Gene deliveryto skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of atherapeutic protein.Kessler PD，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1996 Nov 26；93(24)：14082-7；和Curtis A.Machida.Methods in Molecular Medicine^TM.Viral Vectorsfor Gene Therapy Methods and Protocols.10.1385/1-59259-304-6：201

HumanaPress Inc.2003.Chapter 10.Targeted Integration by Adeno-AssociatedVirus.Matthew D.Weitzman，Samuel M.YoungJr.，Toni Cathomen and Richard JudeSamulski；美国专利No.5,139,941和5,962,313，其所有均通过引用并入本文)。在一些实施方案中，rAAV包含pTR-UF-11质粒骨架，其是包含AAV2 ITR的质粒。该质粒可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC MBA-331)商购获得。

在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体包含cS100A1转基因和cARC转基因二者，用于它们在对象中的同时递送和表达。编码S100家族蛋白的转基因(例如cS100A1)可位于本文中所述的rAAV核酸载体内的编码凋亡抑制因子的转基因(例如cARC)的5’。或者，编码凋亡抑制因子的转基因可位于所述rAAV核酸载体内编码S100家族蛋白的转基因的5’。

因此，在一些实施方案中，rAAV载体包含含有促进转基因(例如异源核酸)表达的序列的一个或更多个区域，例如可操作地连接至核酸的表达控制序列。许多这样的序列是本领域已知的。表达控制序列的一些非限制性实例包括启动子、绝缘子、沉默子、响应元件、内含子、增强子、起始位点、内部核糖体进入位点(IRES)终止信号和poly(A)信号。本文中考虑了这样的控制序列的任意组合(例如，启动子和poly(A)信号)。在一些实施方案中，rAAV载体包含可操作地连接至转基因的编码序列并且促进该转基因表达的启动子。

本文中使用的“启动子”是指核酸的控制区域，在该区域处，核酸序列的其余部分的转录的起始和速率被控制。启动子驱动其调节的核酸序列的转录，因此，其通常位于基因转录起始位点处或附近。启动子可具有例如100至1000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至核酸或核酸序列(核苷酸序列)。当启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和取向以使得启动子调节该序列(例如以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达)时，认为该启动子是“可操作地连接”至该序列。

可根据本公开内容使用的启动子可包含可驱动转基因在对象的心脏中表达的任何启动子。在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。本文中使用的“组织特异性启动子”是指仅可在特定组织类型例如心脏中发挥作用的启动子。因此，“组织特异性启动子”不能够驱动转基因在其他组织类型中表达。在一些实施方案中，可根据本公开内容使用的启动子是心脏限制性启动子。例如，启动子是选自心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I和心脏肌钙蛋白T(cTnT)的心脏限制性启动子。

或者，启动子可以是但不限于来自以下基因之一的启动子：α-肌球蛋白重链基因、6-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白轻链2v(myosin light chain 2v，MLC-2v)基因、肌球蛋白轻链2a基因、CARP基因、心脏α-肌动蛋白基因、心脏m2毒蕈碱型乙酰胆碱基因、ANF、心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、心脏肌质网Ca-ATP酶基因、骨骼α-肌动蛋白；或来源于MLC-2v基因的人工心脏启动子。

在所公开的rAAV载体的一些实施方案中，两个或更多个转基因由单启动子可操作地控制。在另一些实施方案中，两个或更多个转基因各自由独特的启动子可操作地控制。

在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体还包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是允许在信使RNA(messenger RNA，mRNA)序列的中间进行翻译起始而作为蛋白质合成的更大过程的一部分的核苷酸序列。通常，在真核生物中，由于起始复合物的组装需要5’帽识别，翻译只能在mRNA分子的5’端起始。在一些实施方案中，IRES位于转基因之间。在一些这样的实施方案中，由不同转基因编码的蛋白质被单独翻译(即，相对于作为融合蛋白翻译)。

在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体还包含多腺苷酸化(pA)信号。真核mRNA通常被转录为前体mRNA。对前体mRNA进行加工以产生成熟mRNA，包括多腺苷酸化过程。多腺苷酸化过程在基因转录终止时开始。首先通过一组蛋白质将新生成的前体mRNA的最3’片段切割掉。然后这些蛋白质在RNA的3’端合成poly(A)尾。切割位点通常包含多腺苷酸化信号，例如AAUAAA。poly(A)尾对mRNA的核输出、翻译和稳定性是重要的。

在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体至少包含：从5’至3’依次是第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、可操作地连接至第一转基因的启动子、可操作地连接至第二转基因的IRES、多腺苷酸化信号和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。

在一些实施方案中，rAAV是环形的。在一些实施方案中，rAAV载体是线性的。在一些实施方案中，rAAV载体是单链的。在一些实施方案中，rAAV载体是双链的。在一些实施方案中，rAAV载体是自互补rAAV载体。本文中所述的任何rAAV载体可被例如AAV6衣壳或任何其他血清型(例如，与ITR序列具有相同血清型的血清型)的病毒衣壳衣壳化。

下面描述的是本公开内容的示例性rAAV载体。下面举例说明的载体包含SEQ IDNO：9至12所示的线性化质粒序列。本公开内容的载体可包含与SEQ ID NO：9至12所示的序列具有至少70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性的核苷酸序列。这些序列在后面的图例中进行了注释。

在一些实施方案中，任何公开的rAAV核酸载体序列相对于SEQ ID NO：9至12中的任一个的序列包含在5’或3’端的截短。在一些实施方案中，任何rAAV载体包含与SEQ IDNO：9至12中任一个的序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个或超过18个核苷酸不同的核苷酸序列。

pAAVsc.cTnT.Opt.hARC_Opt.hS100A1(SEQ ID NO：9)

图例：

cTnT启动子

hARC_Opt

hS100A1_Opt

信号

pAAVsc.cTnT.Opt.hS100A1_Opt.hARC(SEQ ID NO：10)

图例：

cTnT启动子

hS100A1_Opt

hARC_Opt

信号

pAAVsc.cTnT.hS100A1.hARC_opt(SEQ ID NO：11)

图例：

cTnT启动子

hS100A1

hARC_Opt

信号

pAAVsc.cTnT.hARC_Opt.hS100A1(SEQ ID NO：12)

图例：

cTnT启动子

hARC_Opt

hS100A1

信号

重组AAV(rAAV)颗粒

本文中还提供了rAAV病毒颗粒或包含这样的颗粒的rAAV制剂。rAAV颗粒包含本文中所述的病毒衣壳和rAAV载体，所述载体被病毒衣壳衣壳化。产生rAAV颗粒的方法是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如，Zolotukhin et al.Production and purificationof serotype 1，2，and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167；以及美国专利申请公布号US 2007/0015238和US 2012/0322861，其通过引用并入本文；以及质粒和试剂盒可从ATCC和Cell Biolabs，Inc.获得)。例如，包含rAAV载体的质粒可与一种或更多种辅助质粒例如包含rep基因(例如，编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和VP3，包括本文中所述的经修饰VP3区)的辅助质粒组合，并转染到生产细胞系中，使得rAAV颗粒可被包装并随后纯化。

本文中公开的rAAV颗粒或在rAAV制剂中的颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何衍生物或假型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、2/1、2/5、2/8、2/9、3/1、3/5、3/8或3/9)。如本文中所用，rAAV和rAAV颗粒的血清型是指重组病毒的衣壳蛋白的血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒是rAAV6或rAAV9。衍生物和假型的一些非限制性实例包括AAVrh.10、AAVrh.74、AAV2/1、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/8、AAV2/9、AAV2-AAV3杂合体、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV克隆32/83、AAVShH10、AAV2(Y-＞F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41和AAVr3.45。这样的AAV血清型和衍生物/假型，以及产生这样的衍生物/假型的方法是本领域已知的(参见，例如，Mol Ther.2012 Apr；20(4)：699-708.doi：10.1038/mt.2011.287.Epub 2012 Jan24.The AAV vector toolkit：poised at the clinical crossroads.Asokan A1，Schaffer DV，Samulski RJ.)。在一些具体实施方案中，本文中公开的任何rAAV颗粒的衣壳具有AAVrh.10血清型。在一些实施方案中，衣壳具有AAV2/6血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒是假型化rAAV颗粒，其包含：(a)含有来自一种血清型(例如，AAV2、AAV3)的ITR的rAAV载体，和(b)由来源于另一种血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10)的衣壳蛋白构成的衣壳。用于产生和使用假型化rAAV载体的方法是本领域已知的(参见，例如，Duan et al.，J.Virol.，75：7662-7671，2001；Halbert et al.，J.Virol.，74：1524-1532，2000；Zolotukhin et al.，Methods，28：158-167，2002；和Auricchio et al.，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001)。

用于心脏病的rAAV基因治疗

本公开内容还涉及包含一种或更多种所公开的rAAV颗粒或制剂的组合物。在一些实施方案中，rAAV制剂包含rAAV颗粒，其包含：含有第一血清型(例如，AAV3、AAV5、AAV6或AAV9)的ITR的rAAV载体和使rAAV载体衣壳化的衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白具有第一血清型(例如，AAV3、AAV5、AAV6或AAV9)。在一些实施方案中，制剂与使用包含AAV2ITR的rAAV载体制备的制剂相比具有至少四倍高的转导效率(例如，在人肝细胞癌细胞系、例如Huh7中)。

如本文中所述，这样的组合物还可包含药用赋形剂、缓冲剂或稀释剂，并且可被配制用于离体施用于宿主细胞或在动物且特别是人中原位施用。这样的组合物还可任选地包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米粒，或者可以以其他方式配制成用于施用于有此需要的人对象的细胞、组织、器官或机体。这样的组合物可配制成用于多种治疗中，例如如用于改善、预防和/或治疗病症，例如肽缺乏、多肽缺乏、肽过表达、多肽过表达，包括例如导致如本文中所述的疾病或障碍的状况。

本公开内容的rAAV载体、rAAV颗粒或包含rAAV颗粒的组合物可用于在有此需要的人对象中对心脏病进行基因治疗。可使用本公开内容的方法和组合物治疗的心脏病的一些实例包括但不限于心肌病和急性缺血。在一些实施方案中，心脏心肌病是肥厚型心肌病或扩张型心肌病。由心肌病或其他心脏病引起的心力衰竭包括两个要素：钙处理功能障碍和凋亡。rAAV载体、颗粒和包含rAAV颗粒的组合物当施用于有此需要的对象(例如通过血管递送到冠状动脉和/或直接注射至心脏)时可用于治疗这样的心力衰竭。rAAV载体、颗粒和包含rAAV颗粒的组合物驱动cS100A1蛋白和ARC蛋白在对象的心肌细胞中同步表达。S100A1改善钙处理的一些方面，包括使肌质网钙瞬变正常化，从而导致收缩功能正常化。ARC将阻断由线粒体机制引发的凋亡和由非线粒体机制引发的凋亡(例如牵张诱导的凋亡)，以及改善线粒体功能。因此，由本公开内容的转基因表达的两种蛋白质的协同益处可通过靶向心肌病的两个方面来导致更好的长期治疗结局。

人来源的S100A1和ARC蛋白的氨基酸序列如下所述。

人ARC：

人S100A1：

在一些方面中，所公开的rAAV载体编码包含与SEQ ID NO：13或14具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的氨基酸序列的蛋白质。在一些方面中，所公开的rAAV载体编码第一蛋白质和第二蛋白质，第一蛋白质包含与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的氨基酸序列，以及第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV载体编码包含SEQID NO：13的蛋白质。在一些实施方案中，rAAV载体编码包含SEQ ID NO：14的蛋白质。在一些具体实施方案中，rAAV载体编码包含SEQ ID NO：13的第一蛋白质和包含SEQ ID NO：14的第二蛋白质。

在一些实施方案中，任何公开的rAAV载体编码与SEQ ID NO：13或14的任一个的序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或超过12个氨基酸不同的第一蛋白质序列。在一些实施方案中，任何公开的rAAV载体编码相对于SEQ ID NO：13或14的序列的任一个在N端或C端被截短1、2、3或多于3个氨基酸的蛋白质。

因此，本公开内容的另一些方面涉及向有此需要的对象施用本公开内容的rAAV颗粒。在一些实施方案中，施用于对象的rAAV颗粒的数量可为以下数量级：约10⁶至约10¹⁴颗粒/mL或约10³至约10¹³颗粒/mL，或者在任一范围之间的任何值，例如如约10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、或10¹⁴颗粒/mL。在一些实施方案中，施用于对象的rAAV颗粒的数量可为以下数量级：约10⁶至约10¹⁴载体基因组(vg)/mL、或10³至10¹⁵vg/mL，或在任一范围之间的任何值，例如如约10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、或10¹⁴vg/mL。rAAV颗粒可作为单剂量施用，或者可根据需要分成两次或更多次施用，以实现对所治疗特定疾病或障碍的治疗。在一些实施方案中，将约0.0001mL至约10mL的剂量递送到对象。

如果期望的话，rAAV颗粒和rAAV载体也可与其他药剂(例如蛋白质或多肽或多种药物活性剂)组合施用，包括治疗性多肽、生物活性片段、或其变体的一次或更多次施用。事实上，对也可包含在内的其他组分几乎没有限制，只要另外的药剂在与靶细胞或宿主组织接触之后不引起显著的不利影响即可。因此，rAAV颗粒或制剂可根据特定情况的需要与多种其他可药用药剂一起递送。这样的组合物可从宿主细胞或其他生物来源中纯化，或者作为替代地可如本文中所述化学合成。

包含可药用赋形剂和/或载体溶液的制剂对于本领域技术人员来说是公知的，用于在多种治疗方案中使用本文中所述的特定组合物的合适给药和治疗方案的开发也如此，所述多种治疗方案包括例如经口、肠胃外、静脉内、鼻内、关节内和肌内施用和制剂。

通常来说，这些制剂可包含至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，rAAV颗粒或制剂，和/或rAAV载体)，但是活性成分的百分比当然可变化并且可方便地在总制剂的重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或更多之间。自然地，每种治疗上有用的组合物中一种或更多种治疗剂的量可以以这样的方式制备：在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。当制备这样的药物制剂时，本领域技术人员将考虑以下因素，例如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑因素。另外，可期望多种剂量和治疗方案。

在某些情况下，将期望如下递送在本文中所公开的适当配制的药物组合物中的rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体：皮下，血管内，心内，眼内，玻璃体内，肠胃外，皮下，静脉内，脑室内，肌内，鞘内，经口，腹膜内，通过经口或经鼻吸入，或通过直接注射至一种或更多种细胞(例如，心肌细胞和/或其他心脏细胞)、组织或器官。在一些实施方案中，将本公开内容的rAAV颗粒或包含rAAV颗粒的组合物血管内施用到冠状动脉中。在另一些实施方案中，将公开的rAAV颗粒或组合物通过直接注射施用至对象的心脏。直接注射至心脏可包括注射到一种或更多种心肌组织、心脏内衬(cardiac lining)或心脏周围的骨骼肌中，例如使用针导管进行。

适于可注射使用的组合物的药物制剂包括无菌水溶液或分散体。在一些实施方案中，所述制剂是无菌的并且在存在容易注射性的程度上是流体。在一些实施方案中，所述形式在制造和储存条件下是稳定的，并且被保护免受微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、植物油或其他可药用载体，例如由美国食品和药品管理局公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的那些。可维持适当的流动性，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来进行。

术语“载体”是指与rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括以下那些：石油，例如矿物油；植物油，例如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体。

对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要的话，可以将溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、玻璃体内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1mL等张NaCl溶液中，然后添加到1000mL皮下灌注流体中或注射在建议的输注部位(参见例如″Remington′s PharmaceuticalSciences″第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据所治疗对象的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员决定用于个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应符合例如FDA生物学标准所所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。

无菌可注射溶液通过将所需量的rAAV颗粒或制剂、Rep蛋白和/或rAAV载体与上文中列举的数种其他成分(如有需要的话)一起并入合适的溶剂中、然后过滤灭菌来制备。通常，通过将多种经灭菌的活性成分并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术由其经预先无菌过滤溶液产生活性成分加上任何另外期望成分的粉末。

rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体组合物的量和施用这样的组合物的时间将在受益于本教导的技术人员的范围内。然而，很可能可以通过单次施用实现治疗有效量的本公开内容组合物的施用，例如单次注射足够数量的感染性颗粒以为接受这种治疗的患者提供治疗益处。作为替代，在一些情况下，可期望在相对较短或相对延长的时间段内提供rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体组合物的多次或连续施用，这可以由监督这样的组合物的施用的医疗人员决定。

本公开内容的组合物可包含单独或者与一种或更多种另外的活性成分组合的rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体，所述另外活性成分可从天然或重组来源获得或者化学合成。在一些实施方案中，rAAV颗粒或制剂与蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米(Bortezomib)或羟基脲组合施用，在同一组合物中或作为同一治疗方案的一部分施用。

“治疗”疾病如该术语在本文所用，是指降低对象经历的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重程度。通常将上述组合物以有效量(即能够产生期望结果的量)施用于对象。期望结果将取决于所施用的活性剂。例如，rAAV颗粒的有效量可以是能够将异源核酸转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒量。

可以通过标准药学方法使用培养物中的细胞或实验动物确定LD₅₀(将该群体的50％致死的剂量)来确定本公开内容方法中使用的组合物的毒性和效力。毒性和效力之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比例LD₅₀/ED₅₀。表现出大治疗指数的那些组合物是优选的。虽然可以使用表现出毒性副作用的组合物，但应注意设计使这样的副作用的潜在损害最小化的递送系统。本文中所述的组合物的剂量通常在包括ED₅₀且具有很少或没有毒性的范围内。根据所采用的剂型和所使用的施用途径，剂量可以在此范围内变化。

本公开内容的另一些方面涉及用于对象例如人或非人对象、对象中的原位宿主细胞或来源于对象的宿主细胞的方法和制剂。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是伴侣动物。本文中使用的“伴侣动物”是指宠物和其他家养动物。伴侣动物的一些非限制性实例包括狗和猫；牲畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在一些实施方案中，对象是微型猪(miniature pig)或小型猪(mini-pig)。在一些实施方案中，对象是人对象。

在一些实施方案中，对象患有或怀疑患有可用基因治疗来治疗的心脏病。在一些实施方案中，对象处于心力衰竭的任何阶段。在一些实施方案中，心力衰竭由心肌病引起。在一些实施方案中，心力衰竭由肥厚型心肌病或扩张型心肌病引起。

以下实施例旨在举例说明本公开内容的某些实施方案，并且旨在是非限制性的。在本申请通篇引用的所有参考文献(包括文献参考、授权专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入。

实施例

实施例1：治疗性靶向心力衰竭的多个方面

在一些方面中，本公开内容提供了可用于治疗一种或更多种心脏病症(例如，心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭、心脏病等)的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开内容提供的组合物血管内施用到冠状动脉中。在一些实施方案中，组合物可通过多次直接注射到心脏中来提供给对象。图1中描绘了可提供给对象的一种示例性AAV构建体。在某些实施方案中，这样的示例性构建体被重组AAV(例如，AAVrh.10或AAV6)衣壳化，并且包含S100钙结合蛋白A1(S100A1)和胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(ARC)的编码序列以解决一种或更多种心脏病症(例如，心肌病)的两个单独方面。图1中的示例性构建体的两个转基因由心脏TnT启动子驱动，并且因此将仅在心肌细胞中表达。

S100A1改善钙处理的一些方面，包括使肌质网钙瞬变正常化，从而导致收缩功能正常化。ARC阻断由线粒体机制引发的凋亡和由非线粒体机制引发的凋亡(例如牵张诱导的凋亡)，以及改善线粒体功能。心力衰竭的这两个单独要素(钙处理功能障碍和凋亡)是分别解决的，但永远不会一起解决。因此，这样的方法的协同益处提供了可导致改善的长期结局的治疗选择。通过靶向心肌病的两个方面，本申请提供的组合物和方法可用于解决多种心脏病症(例如肥厚型或扩张型心肌病)，并且在心力衰竭的任何阶段都是有益的。

本文中在说明书中提及的所有出版物、专利和序列数据库条目均在此通过引用整体并入，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指明通过引用并入一样。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

实施例2：狗中扩张型心肌病的基因治疗

扩张型心肌病(DCM)是狗中获得性心脏病的第二最常见原因，最常见地影响大型犬，例如杜宾犬(Doberman pinscher)、大丹犬(great Dane)和爱尔兰猎狼犬(IrishWolfhound)。在患有该疾病的人中，有手术选择，例如心脏移植和左心室辅助装置。然而，在兽医学中，唯一的治疗选择是对与心力衰竭相关的体征进行医学管理。患病狗的预后取决于疾病的阶段和品种。例如，大多数杜宾犬在发生充血性心力衰竭(congestive heartfailure，CHF)之后存活少于6个月。相比之下，其他品种例如可卡犬(cocker spaniel)则倾向于存活更久。随着心脏病的进展，在心脏细胞内调节钙运动的通道的功能失常促进钙循环异常，进一步使心脏的收缩和舒张失调。值得注意的是，钙转运异常已在具有天然存在的DCM5的狗中被认识到，并且在继发于许多不同病因的心力衰竭中也发生。

设计为使钙循环异常正常化的基因转移策略在多种形式心脏病的小型和大型动物模型中改善心脏病。事实上，已经在人中进行临床试验以针对心肌病测试该治疗方法，并且初步结果是令人鼓舞的。初步研究正在评价设计为使患有DCM并表现出CHF的杜宾犬的钙处理正常化的基因递送的效力。使用杜宾犬是因为DCM在该品种中广泛存在，并且该疾病在该品种中一旦CHF发生则倾向于快速且一致地进展。解决DCM的新模式将对所有易患该特发性疾病的犬品种(包括杜宾犬、拳师犬(boxer)、大丹犬、德国牧羊犬(German shepherd)、金毛寻回犬等)具有重大影响。值得注意的是，在对来自患有自然发生心脏病的最常见形式(犬退行性瓣膜病和DCM)的狗的样品中心肌蛋白水平的先前研究发现多种蛋白质(包括S100A1)水平异常(S100A1降低)。

这些发现表明，靶向S100A1的基因递送可有效治疗DCM以及继发于退行性瓣膜病发生的心肌衰竭。另外，在病变心肌中凋亡(程序性细胞死亡)更为常见，并且ARC是强效且多功能的凋亡抑制因子。目前，兽医心力衰竭的护理标准是对流体超负荷和充血的医学管理。针对异常心肌调节分子的基因递送技术提供了机械靶标，其可使兽医临床医师在第一次就特别地解决心肌疾病进程。此外，与当前载体生产技术和载体的心肌内基因递送相关的成本使得该治疗的成本对于许多主人而言是可接受的，并且预期成本会随时间降低。

使用AAV 2/6载体的基因转移的微创方法导致在正常狗中心肌细胞转导＞75％(参见Bish LT，Sleeper MM，Brainard B，et al.Percutaneous transendocardialdelivery of self-complementary adeno-associated virus 6 achieves globalcardiac gene transfer in canines.Mol.Ther.16，1953-9(2008))。将六只正常的杂种狗用编码受磷蛋白(Phospholamban)的显性阴性形式(dn-PLN)(与天然受磷蛋白竞争因此降低其对SERCA2a的抑制作用的假磷酸化形式)的AAV2或AAV6载体来处理(n＝4)或者用AAV2/6 dn-PLN和S100A1来处理(n＝2)。所有狗在处理之后2年内都保持健康，具有正常的心血管功能，这表明该治疗不引起心肌炎或显著改变心脏功能，因此支持该治疗方法的安全性。心脏功能可以通过射血分数或任何本领域已知的方法测量。

实际上，已经注射了40多只正常和患病的狗(参见下文)，并且迄今为止的结果表明该注射技术具有良好的耐受性。另外，对宾夕法尼亚大学Matthew J.Ryan兽医院的20只随机犬病例进行采样用于针对rAAV2/6的抗体，并且发现在20只狗的19只中效价处于处理的可接受范围内，表明先前的免疫应答不会排除很大比例的治疗候选物。为了确定该治疗方法对于DCM的治疗是否有效，然后对患有严重形式的迅速进展幼年型DCM的葡萄牙水犬(Portuguese water dog)进行处理。值得注意的是，注射了AAV2/6 dn-PLN的狗表现出磷酸化PLN显著降低，这支持了该方法在该疾病模型中使钙循环正常化的潜在能力。此外，与仅包含dn-PLN的载体的递送相比，用包含dn-PLN和S100A1二者的载体进行的基因递送在更大程度上减慢继发于DCM的CHF的发生。与单独dn-PLN处理相比，组合载体将CHF的发作平均延迟了4周。出于该原因，在初步研究中使用组合载体方法确定基因治疗在延长患有成年型DCM和充血性心力衰竭的杜宾犬的寿命中是否有效。

研究具有盲法、安慰剂对照的设计。根据已经处理的DCM和CHF的最近12例杜宾犬病例，平均存活为148天(标准偏差为160天)。通过使用效能为0.8，alpha(双侧)为0.05，并且病例与对照之比为1，要求每组中样品量为13只狗以检测6个月存活的差异。使用参数样本量检验确定此计算。招募了26只患有DCM和对照CHF的杜宾犬。为了符合招募，狗必须具有小于1∶20的针对AAV2/6的循环中和抗体效价，并且没有心脏之外的疾病。另外，排除患有伴随性先天性心脏病或具有原发性二尖瓣疾病证据的狗。在基线(招募时)，使用抗体效价、CBC和化学检查用于筛选目的。对狗进行3-分钟心电图(ECG)和完整超声心动图(ECHO)，并且主人完成之前验证的生命质量问卷。针对间隔持续时间和心律不齐的存在评价ECG。ECHO包括2D、M模式和多普勒研究(包括组织多普勒)。胸部射线照片用于对疾病分期(狗在临床上补偿充血性心力衰竭的病史)。

满足招募要求的狗被随机分配到安慰剂分支(用盐水进行心脏注射)或基因治疗组(用AAV2/6-ARC-s100a1进行心脏注射)。在整个研究期间，在所有狗中对DCM和充血性心力衰竭的标准医学管理持续进行(匹莫苯丹(pimobendan)、血管紧张素抑制剂和利尿剂治疗)。使用盐水代替空衣壳作为假治疗，以使得如果与安慰剂组相比处理组显示出显著性改善，对照狗就可接受基因递送。在治疗之后2、4、6、9和12个月时，重复进行ECG、ECHO、生命质量问卷和实验室分析。以每两个月为间隔进行统计学分析。

图2和图3分别描绘了在经处理的肌营养不良狗中舒张期(舒张)和收缩期(收缩)数据。在每个图中都可观察到心内膜和心外膜的轮廓。如表1中观察到的，数据表明在处理之后在数周内稳定或略微改善的功能。下表1示出了在时间1(处理之前)和时间2(处理之后)获取的数据的左心室质量(left ventricular mass，LVM[g])、舒张末期容积(enddiastolic volume，EDV[ml])、收缩末期容积(end systolic volume，ESV[ml])、每搏量(stroke volume，SV[ml])、射血分数(ejection fraction，EF[％])和心输出量(cardiacoutput，CO[1/分钟])的结果。

表1

获取日期	LVM[g]	EDV[ml]	ESV[ml]	SV[ml]	EF[％]	CO[1/min]
							时间2	91.395035	54.22289	24.595001	29.627889	54.640926	3.940509
时间1	87.251524	57.471229	25.660014	31.811215	55.351548	3.117499

实施例3：在将载体递送到小鼠和狗中之后对营养不良表型的评估

在迪谢内肌营养不良(抗肌萎缩蛋白缺陷型)的小鼠和狗模型中评估了S100A1/ARC自互补载体的心脏AAV基因递送。早些时候，比较了AAV8(包括其多个变体)、AAV9和AAVrh.10血清型感染犬心脏的能力，并且发现AAVrh.10是最有效的。出于该原因，在本实施例中描述的所有实验都使用了AAVrh.10。

使在DBA/2J背景下的Mdx(抗肌萎缩蛋白缺型型)小鼠(“D2.mdx”)在4周龄时注射重组AAVrh.10-S100A1/ARC载体(以下称为“治疗性AAV”)并在24周之后处死。D2.mdx小鼠概括了迪谢内肌营养不良肌病的数种人特征，例如下后肢肌肉质量降低、肌纤维萎缩、纤维化和炎症提高、以及肌无力。在这24周的时间内，与假注射小鼠相比，注射了治疗性AAV的小鼠具有更好的维持射血分数、应变发展和心输出量(参见图4)，如通过心脏MRI测量的。蛋白质分析(Western印迹)证实，与对照(假注射)相比，在经处理的组织中S100A1和ARC水平二者均升高(参见图5)。此外，心脏组织学表明，与对照心脏相比，经处理的心脏表现出低得多的病理学(参见图6)。

两只GRMD(抗肌萎缩蛋白缺陷型)狗(人迪谢内肌营养不良的狗模型)在其心脏射血分数第一次降低时通过导管递送到冠状动脉中注射了治疗性载体。心脏射血分数代表组成表明心肌病发作的症状。来自狗对象的自然史研究的较早发现显示，射血分数一旦开始下降，则其在接下来的一年内继续进行性下降(图18)。在射血分数开始这种稳定降低之后，狗通常不能存活超过8至12个月。

如图7和图8中所示，两个对象在用AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后数月均显示出射血分数和其他心脏参数的改善，如通过心脏MRI测量并通过echo测量结果证实的。在处理之后近12个月，第一个对象表现出在正常范围内的稳定射血分数。同样，在处理之后近7个月，第二个对象表现出稳定、正常的射血分数。

不仅心脏功能得到改善，而且狗的运动能力也不断改善，如通过在运动期间对对象进行拍摄定性评价的。与这种改善的运动能力一致的是，对象肢体的MRI测量结果显示，在AAV处理之后骨骼肌质量提高或不变(图9A至9C)。另外，处理之后骨骼肌中循环肌酸激酶水平(CK)的水平降低(图10)，表明进行中的肌肉损伤降低。

实施例4：DCM狗对象的处理

在所有狗品种中，杜宾犬的DCM发病率最高。其遗传基础仅以狗的一个亚群闻名。这提供了DCM和心力衰竭而没有任何其他遗传并发症的大型动物模型。只有处于晚期心力衰竭的狗才用与被用于GRMD狗的相同的AAV.S100A1.ARC载体处理。处理的目标是改善心脏功能并延长寿命二者。

迄今为止，两只杜宾犬对象已通过导管递送到冠状动脉中用AAVrh.10-S100A1/ARC处理，其中两只狗在处理时都经历了心力衰竭。两只狗在处理之后都表现出快速改善。每只狗在处理之后通过两轮超声心动图进行评估，以评价心脏结构和功能参数，包括(但不限于)舒张期和收缩期的心室容积、壁厚和室直径，以及分数缩短和射血分数。

第一只狗在射血分数只有10％的情况下进行处理，并因此在处理时接近死亡。在处理之后24小时内，射血分数提高到25％。在处理之后4个月时狗的第一次随访时，射血分数已稳定在26％。在6个月时的第二次随访时，其射血分数为32％。所述狗在8月龄时死于充血性心力衰竭。因此，处理看起来延长了生命，但处理时心脏功能已经受损过于严重而无法长期存活。

第二只经处理的杜宾犬在处理之前具有32％的射血分数，该分数虽然低但没有立即死亡的危险。狗的射血分数在处理之后24小时内提高到49％，这在正常范围内。在处理之后4个月时的检查中，狗的射血分数为52％，并且在8个月时的检查中，射血分数为50％。在返回进行一年的检查之前，这只狗被诊断出患有肺癌并在两个月之后死亡。其死因与心力衰竭无关。

基于这些发现，AAVrh.10-S100A1/ARC处理能够将犬的心脏功能恢复到正常范围。

实施例5：评价包含人来源的cDNA序列的载体

构建了包含人来源的ARC(“hARC”)和S100A1(“hS100A1”)cDNA序列的质粒以在小鼠中进行评价。天然人cARC和S100A1基因经密码子优化以在人细胞中表达。

这些质粒包含SEQ ID NO：9至12的核苷酸序列。这些质粒中的每一个都包含受cTnT启动子可操作地控制的cARC和S100A1 cDNA序列，以及这两个序列之间的IRES。所有四种质粒都包含经密码子优化的人cARC(hARC)序列。SEQ ID NO：9和10所示的质粒还包含经密码子优化的hS100A1序列；并且SEQ ID NO：11和12所示的质粒还包含野生型hS100A1序列。

这四种质粒中的每一种都被克隆到自互补的AAVrh.10载体中，并随后被衣壳化到rAAV颗粒中。将包含这些载体的rAAVrh.10颗粒施用于小鼠。

评价小鼠中ARC和S100A1的表达水平。监测并评价营养不良表型和心脏功能，包括心脏射血分数。

实施例6：长期小鼠和狗研究

营养不良小鼠研究

S100A1和ARC的AAV心脏基因递送导致心脏功能的保护

除了先前提供的小鼠研究(图4至6)之外，还进行了两种类型的更长期研究，其结果总结在图15至17中。图15和16示出了来自严重纤维化背景下的抗肌萎缩蛋白缺陷型小鼠(即DBA/2J(也称为“D2”)小鼠，因此产生了被称为D2.mdx的小鼠)的数据。将这些小鼠在1月龄时用含有双转基因(S100A1和ARC)盒的AAV处理，该双转基因盒由心脏肌钙蛋白T(cTnT)启动子可操作地控制。将小鼠饲养在静坐环境(sedentary environment)中直至10月龄，此时评价它们的心脏状态。

与任一单独转基因相比，S100A1和ARC的AAV心脏基因递送的优势

在进行这些研究的同时，还在D2.mdx小鼠中进行了存活研究，在其中，通过在骨骼肌α-肌动蛋白启动子控制下表达肌营养相关蛋白仅对骨骼肌进行转基因挽救(参见RafaelJA，et al.Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescuesutrophin-dystrophin deficient mice.Nat Genet.19：79-82，1998)，它们被称为D2.mdx.sk_肌营养相关蛋白小鼠。重点是产生这样的小鼠：患有纯扩张型心肌病，导致心力衰竭和死亡，而一般没有肺肌肉组织或骨骼肌肉组织的任何疾病。这允许通过用滚轮单独饲养小鼠使小鼠运动。所述运动会给心脏带来额外的负荷和压力，导致心肌病和心力衰竭的发展加速。为了更好地模拟个体在可测量的心脏病发作之前不会接受治疗的临床情况，将小鼠在6月龄时进行处理，此时出现纤维化并且心脏功能异常开始出现。

为了评估在同一构建体中一起递送S100A1+ARC相对于单独递送ARC或S100A1的潜在优势，要么不递送转基因(对照)，要么递送含有与双转基因构建体中使用的相同心脏启动子的rAAV载体，但单独而不是组合驱动双盒中使用的相同的S100A1或ARC cDNA。因此，在这种心力衰竭模型中，比较了单独的ARC、单独的S100A1或者S100A1和ARC的组合延长寿命的能力。

如图17所示，任一个单独的转基因均能够显著延长寿命，ARC延长了4个月，以及S100A1延长了5个月。然而，转基因S100A1和ARC的组合将寿命延长了10个月，达到20月龄。野生型D2小鼠的寿命只有约23个月，因此这代表了非常强大的心脏挽救。将转基因组合到双rAAV构建体中提供了协同效力。由于施用载体将D2小鼠的寿命延长至近似野生型寿命，并且相对于单转基因载体将寿命延长了4至5个月，因此这些结果代表了相对于单载体治疗的统计学显著改善。

营养不良的狗的研究

接下来，进行了将小鼠治疗的结果扩展到GRMD狗的研究。当通过射血分数评估的心脏功能下降至低于未经处理的狗的自然病程的那些的水平时，在GRMD狗(迄今为止有四只狗)中进行的研究需要用AAVrh.10-S100A1/ARC(狗转基因序列)进行的处理。使用频繁的超声心动图和/或MRI来评估心脏结构和功能参数，以跟踪狗的心脏状态。随访接受处理的第一只狗(WnM3/Calvin)超过2年，在此期间其心功能改善并且是稳定的。这只狗在34月龄时死于与吸入性肺炎相关的并发症，但其心脏功能仍然是稳定的并处于那个年龄的正常范围内。另外三只狗在初始处理之后都得到了改善，并且心脏功能稳定超过一年。该数据在图18中描绘。Calvin死于肺炎，因此可以评估其心脏组织学，这示于图19中。值得注意的是，在8月龄时(WnM3接受处理之后一个月)在未经处理的情况下的左心室的组织学高度纤维化，与正常狗的组织学几乎没有区别(图19)。这是在DCM的大型动物模型中几乎完全心脏挽救的证据，该模型在1至2岁之间进展为心力衰竭并死亡。在这个群体中，从来没有未经处理的狗存活超过30月龄(图18)，并且典型的死亡原因是心力衰竭。

实施例7：免疫应答研究

用本公开内容的rAAV载体处理四只体重为45至70kg的微型猪。其中两只猪接受了2x 10¹⁴基因组拷贝的高剂量，并且另外两只猪接受了2x 10¹³基因组拷贝的较低剂量。在每种情况下，将三分之二的病毒递送至左心，并且将三分之一的剂量递送至右心。在参与研究之前，对猪进行抗AAV-rh10抗体的筛选。同步论为此目的提供血液。

将血液收集到红色盖管(top tube)中，使血液凝结约30分钟，并以1000xG离心15分钟，并将血清等分到200ul等分样品中并在筛选之前冷冻。将血清用于分析预先存在的抗体。

免疫抑制方案

从基因转移之前1天开始，使对象在输注之后60天内每天接受1mg/kg糖皮质激素(或强的松等同物)。在基因转移之后60天时，逐渐减少糖皮质激素的剂量，并监测肝酶的免疫应答。在免疫应答事件的情况下，根据医生的判断再次施用糖皮质激素剂量和方案。

在整个糖皮质激素施用期间，施用预防性抗生素作为预防。

将rAAV颗粒递送到猪心脏

·将导引器(introducer)置入颈动脉或股动脉

·使猪尾血管导管(pigtail angiocatheter)进入左心室进行冠状动脉造影，以在数字透视中绘制冠状动脉路线图

·将冠状导管(每根)用含1cc对象血液的肝素盐水冲洗，并使其进入主动脉根和左右冠状动脉口(Judkins R或L的大小取决于动物的大小)。

·静脉内地开始腺苷CRI(1mg/kg/分钟)。腺苷CRI的15秒之后，将载体递送到冠状动脉中。载体在5至10秒内施用，并且CRI在载体递送完成之后继续30秒。

·将2/3的载体施用于左冠状动脉，并将1/3的载体施用于右冠状动脉。

在AAV递送之后，通过每周抽血(血清化学、CBC、AAVrh10抗体(由赞助商完成)、Elis斑点反应)监测猪对象，持续2个月。递送之后两个月，处死猪并制备心脏和其他组织(参见下表)(取样品用于福尔马林固定和新鲜冷冻)并使组织可用。

抽血需要：

血清化学1个红色盖管

CBC组1个EDTA紫色盖管

抗AAVrh10 ELISA测定1个红色盖管

ELISPOT至少1个10mL EDTA紫色盖管

死后程序

特殊程序

新鲜冷冻组织收集和福尔马林固定石蜡包埋组织

等同方案

虽然本文中已对数个本发明实施方案进行了描述和举例说明，但是本领域普通技术人员将容易想到多种其他方法和/或结构来实现本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点，并且认为这样的变化和/或修改中的每一个均在本文中所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和构造均意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验就确定本文中所述的具体本发明实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为实例示出，并且在所附权利要求书及其等同文件的范围内，本发明实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本公开内容的多个实施方案涉及本文中所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并非互相不一致，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包含在本公开内容的本发明范围内。

本文中定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的一般含义。

本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其各自被引用的主题通过引用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的全部内容。

除非明确指出相反，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。

如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为意指这样连接的要素，即在一些情况下共同存在而在另一些情况下分别存在的要素中的“任一个或二者”。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即这样连接的要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体指明的要素之外，其他要素也可任选地存在，无论与具体指明的那些要素相关还是无关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言例如“包含/包括”结合使用时，对“A和/或B”的提及可在一个实施方案中仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B二者(任选地包括其他要素)；等等。

如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，“或/或者”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或/或者”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地包括另外的未列出项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅之一”或“恰好之一”，或者当用于权利要求书中时“由......组成”，是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时，本文中使用的术语“或/或者”应仅被解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而非二者”)。“基本上由......组成”当在权利要求书中使用时应具有其在专利法领域中所使用的一般含义。

如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“至少一个/种”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任意一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表内具体列举的各个和每个要素的至少一个，并且也不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可任选地存在要素列表中除短语“至少一个/种”所提及的具体指出的要素之外的要素，无论与具体指出的那些要素相关还是无关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个A，任选地包括多于一个A，但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个B，任选地包括多于一个B，但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。

还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或操作的任何方法中，该方法的步骤或操作的顺序不必限于记载该方法的步骤或操作的顺序。

在权利要求书中以及上述说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures)第2111.03节中所述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式的过渡性短语。应理解，在本文件中使用开放式过渡性短语(例如，“包含/包括”)描述的实施方案也在替代实施方案中被考虑为“由该开放式过渡性短语描述的特征组成”和“基本上由该开放式过渡性短语描述的特征组成”。例如，如果本公开内容描述“包含A和B的组合物”，则本公开内容还考虑替代实施方案：“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。

Claims

1.重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含含有与SEQ ID NO：6至8、16和21的核苷酸序列中的任一个具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的序列的多核苷酸。

2.权利要求1所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：6至8、16和21所示序列中的任一个。

3.用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的rAAV载体，其中所述载体包含含有两个或更多个转基因的多核苷酸，其中第一转基因编码S100家族蛋白，并且第二转基因编码心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)，

并且其中所述第一转基因包含与SEQ ID NO：5、8和19至21所示序列中的任一个具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列，并且所述第二转基因包含与SEQ IDNO：6、7和15至18所示序列中的任一个具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。

4.权利要求3所述的rAAV载体，其中所述第二转基因包含SEQ ID NO：6和7所示序列中的任一个。

5.权利要求3或4所述的rAAV载体，其中所述S100家族蛋白是心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体。

6.权利要求3至5中任一项所述的rAAV载体，其中所述第一转基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

7.权利要求3至5中任一项所述的rAAV载体，其中所述第一转基因包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

8.权利要求3至7中任一项所述的rAAV载体，其中在cS100A1转基因和cARC转基因之间存在内部核糖体进入位点(IRES)。

9.权利要求1至8中任一项所述的rAAV载体，其中所述转基因与启动子可操作地连接。

10.权利要求9所述的rAAV载体，其中所述启动子是选自心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I和心脏肌钙蛋白T(cTnT)的心脏限制性启动子。

11.权利要求9所述的rAAV载体，其中所述启动子是来源于选自以下的基因的心脏限制性启动子：α-肌球蛋白重链基因、6-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白轻链2v基因、肌球蛋白轻链2a基因、CARP基因、心脏α-肌动蛋白基因、心脏m2毒蕈碱型乙酰胆碱基因、ANF、心脏肌质网Ca-ATP酶基因和骨骼α-肌动蛋白；或者是来源于MLC-2v基因的人工心脏启动子。

12.权利要求9所述的rAAV载体，其中所述启动子是cTnT。

13.权利要求1至12中任一项所述的rAAV载体，其中所述rAAV载体是自互补的。

14.权利要求1至13中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO：9至12所示序列中的任一个具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。

15.权利要求14所述的rAAV载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

16.rAAV颗粒，其包含被衣壳化在AAV衣壳中的权利要求1至15中任一项所述的rAAV载体。

17.权利要求16所述的rAAV颗粒，其中所述AAV衣壳包含来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8、AAVrh.74、AAVrh.10、AAV2/6或AAV9血清型的衣壳蛋白。

18.权利要求16或17所述的rAAV颗粒，其中所述AAV衣壳包含来源于AAVrh.10血清型的衣壳蛋白。

19.组合物，其包含权利要求16至18中任一项所述的rAAV颗粒。

20.治疗患有心脏病的人对象的方法，其包括向所述对象施用权利要求19所述的组合物或权利要求16至18中任一项所述的rAAV颗粒。

21.权利要求20所述的方法，其中所述心脏病在所述对象中引起心力衰竭。

22.权利要求20或21所述的方法，其中所述心脏病是心肌病。

23.权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述心脏病是肥厚型心肌病或扩张型心肌病。

24.权利要求20或21所述的方法，其中所述心脏病是急性缺血。

25.权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述组合物通过注射到所述对象的心脏中或血管内注射到所述对象的冠状动脉中来施用。

26.权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述施用步骤导致所述两个或更多个转基因在所述对象的心脏中表达。

27.权利要求3至12中任一项所述的rAAV载体，其中包含S100家族蛋白的转基因位于包含cARC的转基因的5’。

28.权利要求3至15中任一项所述的rAAV载体，其中包含cARC的转基因位于包含S100家族蛋白的转基因的5’。

29.权利要求1至19或27至28中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体包含与SEQ IDNO：9至12所示序列中的任一个具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的核苷酸序列。

30.权利要求29所述的rAAV载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

31.权利要求29所述的rAAV载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：9、10和12所示核苷酸序列中的任一个。

32.权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述施用步骤导致所述对象的心脏功能改善。

33.权利要求30所述的方法，其中所述施用步骤导致所述对象的心脏功能改善持续超过10个月。

34.权利要求1至19或27至31中任一项所述的rAAV载体，其中所述rAAV载体编码包含与SEQ ID NO：13或14具有至少90％、至少95％或至少99.5％同一性的氨基酸序列的蛋白质。

35.权利要求1至19或27至31中任一项所述的rAAV载体，其中所述rAAV载体编码包含SEQ ID NO：13或14的氨基酸序列的蛋白质。