CN104877971B - 一种可以缓解小鼠心衰症状的携带mg53基因的腺相关病毒载体 - Google Patents
一种可以缓解小鼠心衰症状的携带mg53基因的腺相关病毒载体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可以缓解小鼠心衰症状的携带MG53基因的腺相关病毒载体,经过发明人深入的研究,意外地发现,通过腺相关病毒携带MG53基因,并在心衰的小鼠体内注射携带有该基因的腺相关病毒,能够有效缓解小鼠的心力衰竭的症状。小鼠各项心功能以及其他指标均得到有效改善,说明本发明的技术方案适用于心衰疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及治疗心衰疾病的腺相关病毒载体的构建和对治疗效果的评估。
背景技术
1、AAV病毒的生活周期:
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20~26nm之间,含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类(Dependovirus),最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分,顾而得名。
AAV的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时,AAV病毒颗粒进入细胞,脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达,并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染,往往在有辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒(Ad)和单纯疱疹病毒(HSV)中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a,E1b,E2a,E4和VA RNA,但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物(DNA聚合酶和末端酶)。
2、AAV病毒的基因组结构和功能:
人2型腺病毒伴随病毒(AAV-2)的基因组为4681个核苷酸的单链DNA,全部序列已测定。正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)。ITR序列之间为AAV病毒的编码区,左侧的ORF编码4种Rep蛋白;右侧的ORF编码3种Cap蛋白。Cap基因编码衣壳蛋白,其转录从p40启动子开始,形成约2.6kb和2.3kb mRNA,拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3,分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有VP1时,VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低,提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个一起,完成核定位任务。
3、AAV的临床应用:
近年来,AAV载体在临床试验上的安全性和良好治疗效果使人们对AAV载体的研究和开发充满了信心。随着AAV载体的研究和开发不断深入,其在基因治疗中存在的免疫原性、靶向性不强和转导效率不高等问题,通过改造AAV外壳蛋白,利用药物制剂、生物材料等方法也得到了一定的解决。日前欧洲监管机构建议批准由荷兰uniQure公司研制和申报的基因治疗药物Glyber上市。该药以AAV为载体,向患者体内注入脂蛋白脂酶(l ipoproteinlipase,LPL)基因,适应症是严格限制脂肪饮食却仍然发生严重或反复胰腺炎发作的脂蛋白脂酶缺乏症(lipoprotein l ipase deficiency,LPLD)。西方世界第一个基因治疗药物有望不久之后在欧洲获准上市。研究表明,AAV作为颇具前景的基因治疗载体在癌症、维化、糖尿病、癫痫等众多疾病中具有良好应用前景。
心力衰竭(心衰)又称"心肌衰竭",是指心脏当时不能搏出同静脉回流及身体组织代谢所需相称的血液供应。往往由各种疾病引起心肌收缩能力减弱,从而使心脏的血液输出量减少,不足以满足机体的需要,并由此产生一系列症状和体征。心衰是一种严重影响人们健康和寿命的疾病,本领域技术人员一直致力于开发能够有效治疗或预防心衰的技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以显著改善心衰的腺相关病毒载体。
本发明的第一方面,提供了一种分离的重组腺相关病毒,所述重组腺相关病毒基因组中具有表达MG53蛋白的多核苷酸。
进一步地,所述表达MG53蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,其编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
进一步地,所述重组腺相关病毒为2型血清型腺相关病毒。
进一步地,所述重组腺相关病毒的外壳蛋白为9型腺相关病毒血清型的外壳蛋白。
进一步地,所述重组腺相关病毒的基因组中具有如SEQ ID NO.:8所示的多核苷酸序列。
本发明的第二方面,提供了一种制备本发明第一方面所述的重组腺相关病毒的方法,包括步骤:
a)构建重组腺相关病毒载体;
b)腺相关病毒包装;
其中,所述重组腺相关病毒载体中具有表达MG53蛋白的多核苷酸。
优选地,步骤a)中使用pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen质粒构建所述重组腺相关病毒载体(pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53),所述pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen质粒序列如SEQID NO.:3所示。
优选地,使用构建载体过程中扩增MG53基因所使用的引物序列为:
ACACTCGAGatgtcggctgcgcccggc(SEQ ID NO.:4);和
ACATCTAGAtcaggcctcgg(SEQ ID NO.:5)。
优选地,步骤b)中,病毒包装系统包括质粒RC、pHelper和所述重组腺相关病毒病毒载体pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53,其中,RC质粒序列如SEQ ID NO.:6所示,pHelper质粒序列如SEQ ID NO.:7所示。
优选地,所述pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53重组腺相关病毒病毒载体的序列如SEQ ID NO.:8所示。
优选地,步骤b)中,腺相关病毒包装过程中的包装细胞为AAV-293细胞。
优选地,步骤b)中,腺相关病毒包装过程为:
培养AAV-293细胞,加入RC、pHelper和pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53组成脂转体系,转染48后收集病毒。
本发明的第三方面,提供了一种治疗心衰的方法,包括步骤:
(1)制备本发明第一方面所述的重组腺相关病毒;
(2)给心衰患者施用步骤(1)制得的重组腺相关病毒。
进一步地,步骤(2)中施用量为每千克体重,施用1011v.g的重组腺相关病毒。
技术效果
使用本发明的技术方案所包装的腺相关病毒,可以有效降低心衰造成的心肌细胞体积增大约50%,降低心衰造成的心肌纤维化约70%,说明本发明的技术方案特别适用于生产可治疗心衰的腺相关病毒。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1显示了pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen载体图谱。
图2显示了MG53基因的PCR扩增结果。
图3A显示了MG53腺相关病毒载体构建后的PCR电泳结果;图3B显示了MG53腺相关病毒载体酶切鉴定的结果。
图4显示了使用pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53腺相关病毒载体在体注射心衰小鼠后改善心肌肥大。
图5显示了使用pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53腺相关病毒载体在体注射心衰小鼠后改善心肌成纤维化。
具体实施方式
腺相关病毒载体在临床试验上展现出了很高的安全性和良好治疗效果。9型血清型腺相关病毒对心脏的高亲和性使其成为了潜在的治疗心衰优质工具。那么腺病毒载体所携带的基因对于该病毒是否能治疗心衰起到了非常关键关键的作用。经过发明人深入的研究,意外地发现,通过腺相关病毒携带MG53基因,并在心衰的小鼠体内注射携带有该基因的腺相关病毒,能够有效缓解小鼠的心力衰竭的症状。小鼠各项心功能以及其他指标均得到有效改善,说明本发明的技术方案适用于心衰疾病的治疗。
MG53蛋白
MG53是最近发现的一种在心肌和骨骼肌中特异性表达的蛋白,其氨基酸序列如下:
本发明中优选的MG53编码多核苷酸序列如下:
atgtcggctgcgcccggcctcctgcaccaggagctgtcctgcccgctgtgcctgcagctgttcgacgcgcccgtgacagccgagtgcggccacagtttctgccgcgcctgcctaggccgcgtggccggggagccggcggcggatggcaccgttctctgcccctgctgccaggcccccacgcggccgcaggcactcagcaccaacctgcagctggcgcgcctggtggaggggctggcccaggtgccgcagggccactgcgaggagcacctggacccgctgagcatctactgcgagcaggaccgcgcgctggtgtgcggagtgtgcgcctcactcggctcgcaccgcggtcatcgcctcctgcctgccgccgaggcccacgcacgcctcaagacacagctgccacagcagaaactgcagctgcaggaggcatgcatgcgcaaggagaagagtgtggctgtgctggagcatcagctggtggaggtggaggagacagtgcgtcagttccggggggccgtgggggagcagctgggcaagatgcgggtgttcctggctgcactggagggctccttggaccgcgaggcagagcgtgtacggggtgaggcaggggtcgccttgcgccgggagctggggagcctgaactcttacctggagcagctgcggcagatggagaaggtcctggaggaggtggcggacaagccgcagactgagttcctcatgaaatactgcctggtgaccagcaggctgcagaagatcctggcagagtctcccccacccgcccgtctggacatccagctgccaattatctcagatgacttcaaattccaggtgtggaggaagatgttccgggctctgatgccagcgctggaggagctgacctttgacccgagctctgcgcacccgagcctggtggtgtcttcctctggccgccgcgtggagtgctcggagcagaaggcgccgccggccggggaggacccgcgccagttcgacaaggcggtggcggtggtggcgcaccagcagctctccgagggcgagcactactgggaggtggatgttggcgacaagccgcgctgggcgctgggcgtgatcgcggccgaggccccccgccgcgggcgcctgcacgcggtgccctcgcagggcctgtggctgctggggctgcgcgagggcaagatcctggaggcacacgtggaggccaaggagccgcgcgctctgcgcagccccgagaggcggcccacgcgcattggcctttacctgagcttcggcgacggcgtcctctccttctacgatgccagcgacgccgacgcgctcgtgccgctttttgccttccacgagcgcctgcccaggcccgtgtaccccttcttcgacgtgtgctggcacgacaagggcaagaatgcccagccgctgctgctcgtgggtcccgaaggcgccgaggcctga(SEQ ID NO.:1)
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所使用的生物材料(如质粒、细胞、酶等)和试剂,如无特别说明,均可从市售渠道获得。
实施例1稳定高表达MG53基因的293细胞系构建
通过腺相关病毒载体构建稳定高表达MG53基因的293细胞系。
1实验材料
试剂名称 | 生产厂家 |
大肠杆菌菌株DH5α | Tiangen |
限制性内切酶 | Fermentas |
T4连接酶 | Fermentas |
质粒DNA小,大量抽提试剂盒 | 康为世纪 |
凝胶回收试剂盒 | Axygen |
琼脂糖 | Biowest |
DNA ladder | GeneRay |
载体及目的基因信息
1)pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen载体图谱如图1所示,其中EcoRI和BamHI为插入位点,其序列如SEQ ID NO.:3所示。
pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen载体有CMV启动子启动目的基因的表达,并含有Zsgreen基因作为标记。
2)MG53目的片段多核苷酸信息如SEQ ID NO.:1所示。
经过大量筛选验证,本发明人获得的扩增引物如下:
MG53-XhoI-F: | ACACTCGAGatgtcggctgcgcccggc(SEQ ID NO.:4) |
MG53-XbaI-R: | ACATCTAGAtcaggcctcgg(SEQ ID NO.:5) |
2实验流程
MG53腺相关病毒病毒载体的构建
1、PCR引物由上海桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo序列,分别稀释至10uM。50ulPCR体系:5ul,10×buffer;5ul,dNTP;3ul,MgSO4;1ul,上游引物;1ul,下游引物;1ul,KOD Plus Neo酶;0.5ul,模板;34ul,H2O。
PCR电泳结果如图2所示,图中泳道1为MG53PCR产物,泳道2为DNA分子量标记(注:分子量标记从上至下依次为:12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。
PCR产物回收后,用EcoRI,BamHI双酶切,酶切体系如下:4ul,PCR产物;1ul,EcoRI;1ul,BamHI;2ul,10×buffer;12ul,H2O。
酶切完成后再次胶回收。
2、载体pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen双酶切,酶切体系如下。20ul酶切体系37℃3小时:4ul,pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen载体(500ng/ul);1ul,EcoRI;1ul BamHI;2ul,10×buffer;12ul,H2O。电泳检测,结果如图3A所示,图中泳道1为:pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen酶切回收;泳道2为MG53 PCR产物酶切回收;泳道3为DNA分子量标记(注:从上至下依次为:12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。
处理好的目的片段与载体连接反应体系:6ul,PCR酶切回收片段(约50ng/ul);1ul,酶切好的载体(约50ng/ul);2ul,ligase buffer;1ul,T4ligase;10ul,H2O。以上连接液在16℃过夜。
3、转化(感受态细胞:DH5a),抗性:Amp;37℃,培养过夜。
4、转化后MG53分别平板挑菌,37℃250转/分钟摇菌14小时,PCR鉴定后,将阳性菌液送上海桑尼生物技术有限公司测序,测序结果与预期相符,克隆成功的质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定的结果如图3B所示,图中泳道1为MG53-IRES-puro SpeI/NotI双酶切;泳道2为DNA分子量标记(注:分子量标记从上至下依次为:12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。
本实施例中成功的构建了pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53腺相关病毒载体。
实施例2腺相关病毒包装
1、实验流程
制备腺相关病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染AAV-293细胞,转染后8h更换为完全培养基,培养48h后,收集富含腺相关病毒颗粒的细胞上清液,0.45um滤器(Millpore公司)过滤病毒上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。对其浓缩后得到高滴度的腺相关病毒浓缩液。
2、实验材料
2.1腺相关病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统,组成为RC(该质粒序列如SEQ ID NO.:6所示),pHelper(该质粒序列如SEQ ID NO.:7所示),pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53。
细胞株 AAV-293,腺相关病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株 大肠杆菌菌株DH5-α。用于扩增腺相关病毒载体和辅助包装载体质粒。
2.2主要试剂
2.3主要仪器
仪器名称 | 生产厂家 |
PCR仪 | Applied Biosystems公司 |
电泳仪 | Bio-rad公司 |
荧光倒置显微镜 | 奥林帕斯 |
冷冻超速离心机 | Hitachi |
细胞培养箱 | healforce |
凝胶成像仪稳压DNA电泳仪 | BioRad |
移液器 | Gilson |
电热恒温水浴锅 | 上海一恒实验设备有限公司 |
数码凝胶处理系统 | 天能科学仪器 |
一次性平皿,Flask,移液管 | BD Falcon |
耗材(EP管,PCR管,枪头等) | Axygen |
流式细胞仪 | BD FaCSAria |
0.45um过滤器 | Millpore公司 |
烧瓶 | 西巴斯公司 |
3.腺相关病毒生产实验步骤
3.1传AAV-293细胞,将T75用明胶包被,每瓶T75加1.5-2mL明胶,置于37℃培养箱10min即可使用,铺细胞前,将明胶再次将瓶底完全覆盖一次,完全吸净,即可将细胞铺上。传代当天记为第一天,若第二天进行转染,铺900-1000万/T75;若第三天转染,铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL 10%DMEM培养基。
3.2传AAV-293细胞
将培养AAV-293细胞T75瓶中的培养基吸净,加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶,使其均匀覆盖瓶底,置于37℃培养箱中3-5min,取出,摇晃可发现细胞于底部脱离,将其全部晃下,加入3mL 37℃水浴中预热的10%DMEM,移液枪用10mL移液管进行吹打,较大力吹打6-8次即可,不留死角,瓶口处较难吹打可将移液管对准培口,小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后,将所有细胞吸出,置于15mL离心管中,取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中,加入450ul 10%DMEM,即为10倍稀释,混匀,取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格,每大格16小格。计数时,4大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10倍稀释),即为实际n万/mL细胞浓度。
3.3.转染当天观察细胞密度,80-90%满即可进行转染。转染前无需换培养基。
3.4.做脂转complex:Opti MEM需在37℃水浴中预热,Fugene HD试剂需恢复至室温方可使用,使用前需摇匀。
转染每瓶T75的complex成分如下:
RC 20μg,
pHelpr 10μg,
pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53 20μg,
转染后12-24h,将T75瓶中的培养基弃去,加入10%DMEM 10mL,即开始收集病毒。
3.5收集24-48h病毒上清,收集后以0.45μm滤器过滤,于40mL超速离心管中,4℃,72000g/min离心120分钟;
3.6 500ul PBS重悬病毒沉淀,置于4度冰箱保存。
4、实验结果
pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53腺相关病毒滴度测定为2x1012v.g/ml,达到动物实验要求。
实施例3高表达MG53的腺相关病毒注射心衰模型鼠改善小鼠心衰症状
1、实验材料
C57BL/6小鼠(该质粒可购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)。
2、实验方法
2.1小鼠心衰造模
取右胸前外切口开胸,暴露升主动脉,在主动脉上方1cm处,用缩窄环对升主动脉进行缩窄,4周后即可造成小鼠心衰。
2.2尾静脉注射pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53和对照腺相关病毒
采用5号针头注射器,每只小鼠注射1x1011v.g的腺相关病毒,对照腺相关病毒为AAV-GFP(具有绿色荧光蛋白的腺相关病毒)。
2、实验结果
pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53腺相关病毒可以显著改善心衰造成的心肌肥大和心肌纤维化。
图4中,Sham实验组为假手术组,TAC实验组为主动脉弓狭窄组。从图中可以看出,在Sham实验组中,心肌肥大症状改善不明显。而在TAC实验组中,与对照组相比,施用本发明的重组腺相关病毒的实验组,心肌细胞横截面积降低了约50%,显示了心肌肥大症状有了及其显著的改善。
图5中,Sham实验组为假手术组,TAC实验组为主动脉弓狭窄组。从图中可以看出,在Sham实验组中,心肌纤维化症状改善不明显。而在TAC实验组中,与对照组相比,施用本发明的重组腺相关病毒的实验组,心肌纤维化程度降低了约70%,显示了心肌纤维化症状有了及其显著的改善。
本实施例比较了正常对照心衰小鼠和pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53注射的心衰小鼠(高表达MG53基因的小鼠)的心衰指标。实验表明通过腺相关病毒高表达MG53能够有效缓解小鼠的心力衰竭的症状。小鼠各项心功能以及其他指标均得到有效改善,说明本发明的技术方案适用于心衰疾病的治疗。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种制备重组腺相关病毒的方法,其特征在于,包括步骤:
a)构建重组腺相关病毒载体;
b)腺相关病毒包装;
其中,所述重组腺相关病毒载体中具有表达MG53蛋白的多核苷酸;
步骤a)中使用pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen质粒构建所述重组腺相关病毒载体pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53,其中,所述pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen质粒序列如SEQ ID NO.:3所示;
步骤b)中,病毒包装系统包括质粒RC、pHelper和所述重组腺相关病毒病毒载体pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53,其中,RC质粒序列如SEQ ID NO.:6所示,pHelper质粒序列如SEQ ID NO.:7所示。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤a)中构建载体过程中扩增MG53基因所使用的引物序列为:
ACACTCGAGatgtcggctgcgcccggc(SEQ ID NO.:4);和
ACATCTAGAtcaggcctcgg(SEQ ID NO.:5)。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述重组腺相关病毒载体的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤b)中,腺相关病毒包装过程中的包装细胞为AAV-293细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤b)中,腺相关病毒包装过程为:
培养AAV-293细胞,加入RC、pHelper和pHBAAV-CMV-IRES-Zsgreen-MG53组成脂转体系,转染48h后收集病毒。
6.一种分离的重组腺相关病毒,其特征在于,所述重组腺相关病毒基因组中具有表达MG53蛋白的多核苷酸;并且,所述重组腺相关病毒为权利要求1-5中任一项所述的方法制备的。
7.权利要求6所述的重组腺相关病毒在制备治疗心衰的药物中的应用。
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2015
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