KR100967868B1 - 박테리아 매개 유전자 침묵을 위한 조성물 및 이것을이용하는 방법 - Google Patents

박테리아 매개 유전자 침묵을 위한 조성물 및 이것을이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리아를 사용하여 하나 이상의 소형 간섭 RNA(siRNA)를 원핵생물 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 RNA 간섭을 이용하여 진핵 세포에서의 유전자 발현을 조절하기 위한 이 박테리아의 사용 방법과, 암 또는 세포 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 박테리아는 하나 이상의 siRNA 또는 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자를 포함한다. 본 발명은 진핵 세포에서 RNA 간섭을 유발하기 위해 본 발명의 박테리아와 함께 사용되는 벡터도 포함한다.

Description

박테리아 매개 유전자 침묵을 위한 조성물 및 이것을 이용하는 방법{COMPOSITIONS FOR BACTERIAL MEDIATED GENE SILENCING AND METHODS OF USING SAME}
짧은 간섭 RNA(siRNA)의 이용에 의한 RNAi(RNA-간섭)을 통한 유전자 침묵은 분자 생물학에 있어서 강력한 도구로서 부상하였고 치료적 유전자 침묵에 사용될 수 있는 잠재력을 보유한다. 표적 세포 내에서 소형 DNA 플라스미드로부터 전사된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 역시 안정한 유전자 침묵을 매개하며, 화학적으로 합성된 siRNA로 형질감염시켜 얻은 것과 유사한 수준으로 유전자 넉다운(gene knockdown)을 달성할 수 있는 것으로 확인되었다(T. R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296, 550 (2002), P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99, 1443 (2002)).
치료 목적을 위한 RNAi의 가능한 응용 분야는 광범위하며, 발암 유전자 또는 바이러스 유전자와 같은 질병 유전자의 침묵과 넉다운을 포함한다. RNAi의 치료적 사용에 있어서 주요 장애 중 하나는 siRNA의 표적 세포로의 전달이다(Zamore PD, Aronin N. Nature Medicine 9,(3): 266-8 (2003)). 실제로, 전달이 현재 RNAi에 있어서 주요 장애 요인으로 언급되고 있다(Phillip Sharp, Nature news feature, Vol 425, 2003, 10-12).
마우스 모델에서 이용될 수 있는 두 가지 방법이 보고된 바 있다:
(1) siRNA 또는 shRNA 코딩 플라스미드의 직접적인 수력학적 정맥내 주사: 몇몇 저자들은 이 방법을 이용하여, 각종 병태, 예를 들어 B형 간염(A. P. McCaffrey et al., Nat Biotechnol. 2003 Jun; 21(6): 639-44), 전격성 간염(E. Song, S. K. Lee, J. Wang, N. Ince, J. Min, J. Chen, P. Shankar, J. Lieberman. Nature Medicine 9, 347 (2003)), 종양 이종 이식(SpaenkuchB, et al., JNCI, 96(1): 862-72 (2004)), 간 이종 유전자 발현(D. L. Lewis, J. E. Hagstrom, A. G. Loomis, J. A. Wolff, H. Hereijer, Nature Genetics, 32, 107 (2002), D. R. Sorensen DR, M. Leirdal, M. Sioud, JMB, 327, 761 (2003))에 대해 RNAi를 적용하는 방법을 기술한 바 있다. 이 방법은 마우스 꼬리 정맥으로의 고압 및 고용량 주사(2.5 ml)를 이용한다. 세포로 siRNA/DNA가 흡수되는 메카니즘은 확실치는 않지만, 아마도 혈관 내피층의 기계적 손상이 연루되는 것으로 생각된다. 이 방법의 명백한 단점은 다량의 투입과, 완벽하게 알려지지 않은 작용 메카니즘이 연루되어 있어서 인간용으로 개발할 수 있는 방법이 아니라는 점이다.
(2) siRNA 코딩 아데노바이러스 벡터를 표적 조직(뇌)으로 직접 주사하는 방법(H. Xia, Q. Mao, H. L. Paulson, B. L. Davidson, Nat Biotechnol, 20, 1006 (2002)). 이 방법은 아데노바이러스 벡터에 의해 이루어진, 뇌 조직에서의 이종 유전자(GFP) 발현의 침묵을 보여주었다. 그러나, 침묵 부위를 신뢰할 만하게 예측할 수 없었다. 이 방법을 추가로 개발하여 국소 주사, 예를 들어 종양내 주사에 활용할 수 있을지도 모른다. 바이러스 벡터는 유전자 치료 목적으로 널리 사용되어 왔 지만, 유전자 치료 실험으로부터 습득하게 된 한 가지 교훈은 바이러스 확산을 때때로 예측할 수 없으며, 원치 않는 부작용을 초래할 수 있다는 것이다(Marshall E. Science 286(5448): 2244-5 (1999)). 간섭 RNA를 포유동물에 안전하고 예측 가능하게 투여할 수 있는 새로운 방법이 요구되는 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 진핵 세포에 박테리아를 도입함으로써 진핵 세포에 하나 이상의 siRNA를 전달하는 방법으로서, 상기 박테리아는 하나 이상의 siRNA 또는 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자를 함유하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 일 실시형태에서, 상기 진핵 세포는 생체내 세포이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 진핵 세포는 시험관내 세포이다.
본 발명은 또한 진핵 세포에 박테리아를 도입함으로써 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 박테리아는 하나 이상의 siRNA 또는 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자를 함유하며, 발현된 siRNA는 조절하고자 하는 유전자의 mRNA에 간섭함으로써 그 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
이 방법의 일 실시형태에서, 발현된 siRNA는 세포의 다중 효소 복합체 RISC (RNA 유도 침묵 복합체)가 조절하고자 하는 mRNA와 상호작용하도록 유도한다. 상기 복합체는 상기 mRNA를 분해한다. 이로 인하여 유전자 발현이 감소 또는 억제된다. 이 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 유전자는 ras 또는 β-카테닌이다. 이 실시 형태의 일 양태에서, ras는 k-Ras이다.
본 발명의 상기 방법의 일 실시형태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 이 실시형태의 일 양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
본 발명은 또한 세포에 박테리아를 도입함으로써 세포 증식을 증가시키는 것으로 알려진 세포 내의 1개의 유전자 또는 여러 개의 유전자의 발현을 조절함으로써, 포유동물의 암 또는 세포 증식 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 박테리아는 하나 이상의 siRNA 또는 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자를 함유한다.
본 발명의 상기 방법의 일 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 이 방법의 또 다른 실시형태에서, 발현된 siRNA는 조절하고자 하는 유전자의 mRNA에 간섭한다. 이 실시형태의 일 양태에서, 발현된 siRNA는 세포의 다중 효소 복합체 RISC(RNA 유도 침묵 복합체)가 조절하고자 하는 mRNA와 상호작용하도록 유도한다. 상기 복합체는 상기 mRNA를 분해한다. 이로 인하여 유전자의 발현이 감소되거나 억제된다.
이 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 유전자는 ras 또는 β-카테닌이다. 이 실시형태의 일 양태에서, ras는 k-Ras이다.
본 발명의 이러한 방법의 또 다른 실시형태에서, 세포는 결장암 세포 또는 췌장암 세포이다. 이 실시형태의 일 양태에서, 결장암 세포는 SW 480 세포이다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 췌장암 세포는 CAPAN-1 세포이다.
본 발명의 상기 방법의 일 실시형태에서, 박테리아는 비병원성 또는 비독성 이다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 박테리아는 치료성이다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 박테리아는 리스테리아(Listeria), 쉬겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), E. 콜라이(E. coli) 및 비피도박테리아(Bifidobacteriae)로 구성된 군에서 선택되는 약독화 균주이다. 경우에 따라, 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 종의 약독화 균주이다. 경우에 따라, 살모넬라 티피뮤리움 균주는 SL 7207 또는 VNP20009이다. 경우에 따라, E. 콜라이 균주는 BM 2710이다.
본 발명의 상기 방법의 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 진핵 세포 내에서 전사된다. 이 실시형태의 일 양태에서, 하나 이상의 siRNA는 진핵 세포 내에서 shRNA로서 전사된다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 RNA-폴리머라제 III 프로모터를 포함한다. 경우에 따라, RNA 폴리머라제 III 프로모터는 U6 프로모터 또는 H1 프로모터이다.
본 발명의 상기 방법의 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 박테리아 내에서 전사된다. 이 실시형태의 일 양태에서, 하나 이상의 DNA 분자는 원핵 프로모터를 포함한다. 경우에 따라, 원핵 프로모터는 T7 프로모터이다.
본 발명의 상기 방법의 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 DNA 분자는 III형 방출 또는 박테리아 세포용해를 통해 진핵 세포에 도입한다. 이 실시형태의 일 양태에서, 박테리아 세포용해는 세포내 활성 항생제 첨가로 유발한다. 경우에 따 라, 항생제는 테트라사이클린이다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 박테리아 세포용해는 박테리아 대사 약화로 유발한다. 경우에 따라, 대사 약화는 영양 요구성이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 siRNA 또는 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자를 함유하는 박테리아에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 박테리아는 비병원성 또는 비독성 박테리아이다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 박테리아는 치료성 박테리아이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 박테리아는 리스테리아, 쉬겔라, 살모넬라, E. 콜라이 및 비피도박테리아로 구성된 군의 일원으로부터 선택되는 약독화 균주이다. 경우에 따라, 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움 종의 약독화 균주이다. 경우에 따라, 살모넬라 티피뮤리움 균주는 SL 7207 또는 VNP20009이다. 경우에 따라, E. 콜라이 균주는 BM 2710이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 DNA 및 RNA-폴리머라제 III 양립성 프로모터 또는 원핵 프로모터를 포함하는 원핵 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 상기 벡터의 일 실시형태에서, RNA 폴리머라제 III 프로모터는 U6 프로모터 또는 H1 프로모터이다. 본 발명의 상기 벡터의 또 다른 실시형태에서, 원핵 프로모터는 T7 프로모터이다.
달리 정의하지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 이용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 하기에 기술한다. 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 문헌은 참고 문헌으로 인용한다. 상충이 있는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서는 조정될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시를 위한 것으로 한정을 의도한 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 후술하는 상세한 설명 및 특허 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 SW 480 세포로의 SL 7207의 침입을 보여주는 현미경 사진을 도시한다. 도 1b는 CRL 2583 세포에서의 녹색 형광 단백질 발현의 넉다운을 보여주는 FACS 분석을 도시한다. 도 1c는 CRL 2583 세포 내의 형광 손실을 보여주는 현미경 사진을 도시한다.
도 2a는 SW 480 세포에서의 k-Ras 및 β-카테닌의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 2b는 다양한 처리법 하에서의 SW 480 세포의 생존능을 보여주는 일련의 막대 차트이다. 도 2c는 다양한 siRNA로 형질감염시킨 SW 480 세포를 주사한 누드 마우스에서의 종양 형성을 보여주는 사진을 도시한다.
도 3a는 형질전환 마우스 간 절편의 현미경 사진을 도시한다. 도 3b는 간 세포 및 비장 세포 현탁액의 유세포 측정 결과를 도시한다.
도 4는 침묵자(silencer) 플라스미드로 형질감염시킨 SW 480 유래의 k-Ras 및 β-카테닌의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 5는 GFP 발현 수준의 변화를 보여주는 마우스 간 절편의 조직화학적 염색의 현미경 사진을 도시한다.
도 6a는 트랜스킹덤 RNA 간섭 플라스미드(TRIP)를 보여주는 모식도이다. 도 6b는 TRIP로 형질감염시킨 SW 480 세포 유래의 β-카테닌의 면역 블롯을 보여주는 사진이다. 도 6c는 30∼120 분의 노출 시간에 대한, TRIP로 형질감염시킨 SW 480 세포 유래의 β-카테닌의 면역 블롯을 보여주는 사진이다. 도 6d는 TRIP로 형질감염시킨 SW 480 유래의 β-카테닌 및 k-Ras mRNA의 RT-PCR 사진을 도시한다. 도 6e는 돌연변이 k-Ras(코돈 12에서 GGT→GTT), 돌연변이 k-Ras(코돈 13에서 GGC→GAC)에 대한, TRIP로 형질감염시킨 후의 SW 480 세포 및 DLD1 세포에서의 k-Ras의 면역 블롯을 보여주는 사진이다. 도 6f는 야생형 k-Ras에 대한, TRIP로 형질감염시킨 SW 480 세포의 면역 블롯을 보여주는 사진이다.
도 7a는 E. 콜라이 발현 shRNA로 처리한 후의 β-카테닌 침묵을 보여주는 RT-PCR의 사진이다. 도 7b는 β-카테닌의 특이적 절단 부위를 보여주는 모식도이다. 도 7c는 특이적 절단 생성물을 보여주는 5'-RACE-PCR의 사진이다. 도 7d는 다양한 유전자의 mRNA의 발현을 보여주는 블롯의 사진이다.
도 8a는 Inv 및 Hly 둘 다 박테리아 진입에 필요함을 보여주는 세포 염색의 사진이다. 도 8b는 Hly 결여 TRIP가 표적 유전자의 넉다운을 유도할 수 없음을 보여주는 RNA 블롯의 사진이다. 도 8c는 Inv 및 Hly 둘 다 효율적 트랜스킹덤(transkingdom) iRNA를 촉진하는 데 필요함을 보여주는 RNA 블롯의 사진이다. 도 8d는 테트라사이클린의 지연 첨가가 유전자 침묵에 미치는 효과를 보여주는 RNA 블 롯의 사진이다. 도 8e는 항생제 부재 하에 2 시간 이상 배양시 유의적인 박테리아 복제가 일어나지 않음을 보여주는 세포 염색의 사진이다.
도 9a는 마우스에서 β-카테닌에 대한 shRNA 발현 E. 콜라이의 경구 투여가 장내 상피에서의 β-카테닌 발현을 유의적으로 감소시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 9b는 처리 유무 하의 장내 상피의 면역조직화학 염색의 사진이다. 도 9c는 처리 후의 β-카테닌 mRNA 발현의 감소를 보여주는 그래프이다. 도 9d는 처리 후의 β-카테닌 단백질 발현의 감소를 보여주는 그래프이다. 도 9e는 처리 후의 β-카테닌 단백질 발현의 감소를 보여주는 면역조직화학 염색의 사진이다.
도 10은 GAPDH 발현이 마우스에서 경구 투여 후 β-카테닌에 대한 shRNA 발현 E. 콜라이에 의해 변화되지 않는다는 것을 보여주는 면역조직화학 염색의 사진이다.
본 발명은 비병원성 또는 치료성 박테리아 균주를 사용하여 진핵 세포에 소형 간섭 RNA(siRNA)를 전달하는 방법에 관한 것이다. 박테리아는 RNA 코딩 DNA 또는 RNA 자체를 전달하여 RNA 간섭(RNAi)이 일어나도록 한다. 본 발명의 간섭 RNA는 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 이것은 표적 세포 내에서 관심있는 유전자를 침묵시키거나 넉다운시킨다. 간섭 RNA는 세포가 보유한 다중 효소-복합체 RISC (RNA 유도 침묵 복합체)가 유전자의 mRNA가 침묵하도록 유도한다. RISC와 mRNA의 상호작용은 mRNA의 분해를 초래한다. 이것은 관심있는 유전자의 효과적인 전사후 침묵으로 이어진다. 이 방법은 박테리아 매개 유전자 침묵(BMGS)이라 칭한다.
박테리아 전달은, 항생제의 사용에 의해 제어할 수 있고 증폭 불가능한 약독화 박테리아 균주의 사용에 의해 제어할 수 있기 때문에, 바이러스 전달보다 더 매력적인 방법이다. 또한, 박테리아는 벡터 균주의 생산을 특정 용도에 특수하게 맞출 수 있도록 하는 유전자 조작이 훨씬 더 용이하다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 RNAi가 조직 특이적이 되도록 하는 박테리아를 생성하는 데 이용된다.
siRNA는 표적 세포에 직접 또는 형질감염에 의해 도입하거나 또는 RNA-폴리머라제 III 양립성 프로모터(U6, H1)를 갖는 특정 플라스미드로부터 헤어핀 구조의 dsRNA(shRNA)로서 표적 세포 내에서 전사시킬 수 있다(P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99, 1443 (2002), T. R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296, 550 (2002)).
세포내 박테리아로부터의 siRNA 코딩 플라스미드의 방출은 능동적 메카니즘에 의해 일어난다. 한 가지 메카니즘은 에스 티피뮤리움에서의 III형 외부 수송 시스템, 즉, 독성 인자를 세포 외부로 분비시켜 표적 세포를 향해 신호 전달을 가능하는 기능을 포함하나, 표적 세포로 항원을 전달하는 데에도 이용될 수 있는 박테리아 세포막에 걸쳐 있는 특수화된 다중 단백질 복합체(Ruessmann H. Int J Med Microbiol, 293: 107-12 (2003)) 또는 박테리아 세포용해 및 박테리아 내용물의 세포질로의 방출을 포함한다. 세포내 박테리아의 세포용해는 세포내 활성 항생제(테트라사이클린)의 첨가에 의해 유발되거나 박테리아 대사 약화를 통해 자연적으로 발생한다(영양 요구성). 진핵 전사 플라스미드의 방출 후, shRNA 또는 siRNA가 표적 세포 내에서 생성되어 매우 특이적인 mRNA 분해 과정을 유발하며, 이것은 표적 유전자의 침묵으로 이어진다.
본 발명의 비독성 박테리아는 침입성을 보유하며, 다양한 메카니즘을 통해 포유동물 숙주 세포로 진입할 수 있다. 일반적으로 특수화된 라이소좀 내에서의 박테리아의 파괴를 초래하는, 전문 식세포에 의한 박테리아의 흡수와는 대조적으로, 침입성 박테리아 균주는 비식작용성 숙주 세포에 침입할 수 있는 능력을 보유한다. 그러한 박테리아의 자연 발생 유형의 예로는 세포내 병원균, 예컨대 리스테리아, 쉬겔라 및 살모넬라가 있으나, 이 특성은 침입 관련 유전자의 전달을 통해 프로바이오틱(probiotics)을 비롯한 E. 콜라이 및 비피도박테리아 등의 다른 박테리아에 이전할 수 있다(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci. Paris 318, 1207 (1995)). 본 발명의 다른 실시형태에서, 간섭 RNA를 숙주 세포로 전달하는 데 사용되는 박테리아로는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)(D. R. Sizemore, A. A. Branstrom, J. C. Sadoff, Science 270, 299 (1995)), 침입성 E. 콜라이(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C.R. Acad. Sci. Paris 318, 1207 (1995), C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. M. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16, 862 (1998)), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)(A. Al-Mariri A, A. Tibor, P. Lestrate, P. Mertens, X. De Bolle, J. J. Letesson Infect Immim 70, 1915 (2002)) 및 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes)(M. Hense, E. Domann, S. Krusch, P. Wachholz, K. E. Dittmar, M. Rohde, J. Wehland, T. Chakraborty, S. Weiss, Cell Microbiol 3, 599 (2001), S. Pilgrim, J. Stritzker, C. Schoen, A. Kolb-Maeurer, G. Geginat, M. J. Loessner, I. Gentschev, W. Goebel, Gene Therapy 10, 2036 (2003))를 들 수 있다. 임의의 침입성 박테리아가 진핵 세포로의 DNA 전달에 유용하다(S. Weiss, T. Chakraborty, Curr Opinion Biotechnol 12, 467 (2001)).
BMGS는 본래 침입성인 병원균 살모넬라 티피뮤리움을 사용하여 수행한다. 이 실시형태의 일 양태에서, 살모넬라 티피뮤리움 균주는 SL 7207 및 VNP20009를 포함한다(S. K. Hoiseth, B. A. D. Stacker, Nature 291, 238 (1981); Pawelek JM, Low KB, Bermudes D. Cancer Res. 57(20): 4537-44 (Oct. 15 1997)). 본 발명의 또 다른 실시형태에서, BMGS는 약독화 E. 콜라이를 사용하여 수행한다. 이 실시형태의 일 양태에서, E. 콜라이 균주는 BM 2710이다(C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. M. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16, 862 (1998)). 이 실시형태의 또 다른 양태에서, BM 2710 균주는 침입 플라스미드를 통해 세포 침입성을 보유하도록 조작된다. 본 발명의 일 양태에서, 이 플라스미드는 pGB2inv-hly이다.
이중 "트로이 목마" 기법 역시 진핵 전사 플라스미드를 보유하는 침입성 및 영양 요구성 박테리아와 함께 이용된다. 상기 플라스미드는 표적 세포에 의해 전사되어 헤어핀 RNA 구조를 형성하며, 이것은 RNAi의 세포내 프로세스를 개시시킨다. 본 발명의 이 방법은 다양한 유전자의 유의적인 유전자 침묵을 유도한다. 이 실시형태의 특정 양태에서, 상기 유전자는 시험관내에서의 이종 유전자(GFP), 돌연변이된 발암 유전자(k-Ras) 및 암 관련 유전자(β-카테닌)를 포함한다.
본 발명은 또한 박테리아 전사 유전자 침묵(BTGS)이라 불리는, 전술한 방법의 변형법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태에서, siRNA는 표적 세포에 대립하는 것으로서 침입성 박테리아에 의해 직접 생산된다. 원핵 프로모터(예를 들어, T7)에 의해 제어되는 전사 플라스미드는 표준 형질전환 프로토콜에 의해 캐리어 박테리아로 삽입된다. siRNA는 박테리아 내에서 생산되며 영양 요구성 또는 항생제의 시한 첨가에 의해 유발되는 박테리아 세포용해 후에 포유동물 표적 세포 내에서 방출된다.
BMGS 및 BTGS를 비롯한 본 발명의 RNAi 방법은 암 치료법으로서 또는 암을 예방하기 위해 사용된다. 이 방법은 세포 증폭과 관련된 유전자 또는 다른 암 표현형을 침묵 또는 넉다운시킴으로써 수행된다. 이러한 유전의 예로는 k-Ras 및 β-카테닌이 있다. 구체적으로, k-Ras 및 β-카테닌은 RNAi에 기초한 결장암 치료법에 대한 표적이다. 이러한 발암 유전자는 대부분의 임상 사례에서 활성을 보이며 연관성이 있다. BMGS는 결장암 치료 및 예방을 위해 장관에 영향을 주도록 적용된다. 이 방법은 또한 이종 이식편 종양을 보유하는 동물의 치료를 위해, 장내 종양 형성의 k-Ras V12 모델에서 암을 치료 및 예방하기 위해, 선종성 용종증 min 마우스 모델(APC-min 모델)에서 종양을 예방 및 치료하기 위해 이용된다. 이 모델에서, 마우스는 다수의 장내 및 결장내 용종의 형성을 초래하는 결함성 APC 유전자를 보유하고 있어, 장내 종양 형성의 인간 가족성 선종성 용종증(FAP)에 대한 동물 모델로서 이용된다.
본 발명은 또한 박테리아 전사 유전자 침묵(BTGS)을 수행하기 위해 침입성 박테리아와 함께 사용하기 위한 원핵 shRNA 코딩 전사 플라스미드를 포함한다. 이 플라스미드는 치료적 실험을 위해 형질전환 동물뿐 아니라 야생형 동물에서 여러 암 관련 표적을 스크리닝하는 데 이용된다.
BMGS 및 BTGS를 비롯한 본 발명의 RNAi 방법은 또한 바이러스 질환(예를 들어, 간염) 및 유전 질환의 치료 또는 예방에 이용된다.
BMGS 및 BTGS를 비롯한 본 발명의 RNAi 방법은 또한, 특히 위장관 또는 간의 표적과 함께 사용하기 위한, 암 예방 "프로바이오틱 박테리아"를 생성하는 데 이용된다.
BMGS 및 BTGS를 비롯한 본 발명의 RNAi 방법은 항염증성 질환, 예를 들어 간염, 염증성 장 질환(IBD) 또는 대장염에 대한 치료법으로서 이용된다. 이러한 방법은 비-암 유전자 표적(B형, C형 간염의 치료 및 예방을 위해서는 바이러스 유전자; 염증성 장 질환의 치료 및 예방을 위해서는 염증성 유전자) 등을 침묵 또는 넉다운시키는 데 이용된다.
BMGS 및 BTGS를 비롯한 본 발명의 RNAi 방법은 유전자 기능을 발견하기 위한 유전자 조작된 넉아웃 모델과는 달리 일시적 "넉다운" 유전자 동물 모델을 제조하는 데 이용된다. 이 방법은 또한 연구 및 약물 개발을 위한 시험관내 형질감염 도구로서 이용된다.
이 방법은 BMGS 및 BTGS를 수행하기 위해 바람직한 특성(침입성, 약독성, 조정성)을 갖는 박테리아, 예를 들어 비피도박테리아 및 리스테리아를 사용한다. 침입성뿐 아니라 하나 또는 여러 개의 shRNA의 진핵 또는 원핵 전사를, 플라스미드를 이용하여 박테리아에 부여한다.
BMGS 및 BTGS를 비롯한 본 발명의 RNAi 방법은 장 및 결장에 유전자 침묵을 전달하기 위해, 각종 질환의 치료에 있어서, 즉 결장암 치료 및 예방에 있어서 경구 투여를 위해 이용된다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 유전자 침묵의 전달은 장관 이외에서 이루어진다.
1. 진핵 세포로 RNA를 전달하는 박테리아
본 발명에 따르면, 예를 들어 세포막을 관통하여 세포질로 진입함으로써 표적 세포의 세포질로, 분자, 예를 들어 RNA 분자를 전달할 수 있는 임의의 미생물을 이용하여 RNA를 상기 세포로 전달할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 미생물은 원핵 생물이다. 더욱 더 바람직한 실시형태에서, 원핵 생물은 박테리아이다. 본 발명의 범위에는 RNA를 세포로 전달하는 데 이용될 수 있는 박테리아 이외의 미생물도 포함된다. 예를 들어, 미생물은 진균류, 예를 들어 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 원생동물, 예를 들어 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 레이쉬마니아 도노바니(Leishmania donovani) 및 플라스모디아(Plasmodia)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 미생물(예를 들어, 박테리아)과 관련하여 사용될 때 "침입성"이란 용어는 하나 이상의 분자, 예를 들어 RNA 또는 RNA 코딩 DNA 분자를 표적 세포로 전달할 수 있는 미생물을 의미한다. 침입성 미생물은 세포막을 관통하여 상기 세포의 세포질로 진입하여, 그 내용물, 예를 들어 RNA 또는 RNA 코딩 DNA의 적어도 일부를 표적 세포로 전달할 수 있는 미생물일 수 있다. 하나 이상의 분자를 표적 세포로 전달하는 과정은 침입 기관을 유의적으로 변형시키지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 실시형태에서, 미생물은 박테리아이다. 바람직한 침입성 박테리아는, 예컨대 진핵 세포의 세포질로 진입함으로써, 하나 이상의 분자, 예를 들어 RNA 또는 RNA 코딩 DNA 분자를 표적 세포로 전달할 수 있는 박테리아이다. 바람직한 침입성 박테리아는 생박테리아, 예를 들어 침입성 생박테리아이다.
침입성 미생물은 본래, 세포막, 예를 들어 진핵 세포의 세포막을 관통하고 세포질에 진입함으로써 표적 세포에 하나 이상의 분자를 전달할 수 있는 미생물뿐만 아니라, 본래 침입성은 아니나 침입성이 되도록 변형된, 예를 들어 유전자 변형된 미생물을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본래 침입성이 아닌 미생물을, 박테리아를 "진입 인자" 또는 "세포질 표적화 인자"로도 불리는 "침입 인자"에 결합시킴으로써 침입성이 되도록 변형시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "침입 인자"는 비침입성 박테리아에 의해 발현될 때 박테리아가 침입성이 되게 하는 인자, 예를 들어 단백질 또는 단백질 군이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "침입 인자"는 "세포질 표적화 유전자"에 의해 코딩된다.
본래 침입성인 미생물, 예를 들어 박테리아는 특성 향성, 즉 바람직한 표적 세포를 가질 수 있다. 대안으로, 미생물, 예를 들어 박테리아는 제2의 미생물의 향성을 모방하도록, 예를 들어 유전적으로 변형시킬 수 있다.
표적 세포로의 하나 이상의 분자의 전달은 당 분야에 공지된 방법에 따라 확인할 수 있다. 예를 들어, 분자의 존재는, 그로 인해 침묵된 RNA 또는 단백질 발현의 감소에 의해, 하이브리드화 또는 PCR 방법에 의해 검출하거나 또는 항체의 사용을 포함할 수 있는 면역학적 방법에 의해 검출할 수 있다.
미생물이 본 발명에 사용할 수 있을 정도로 충분히 침입성인지를 확인하는 것은, 숙주 세포와 접촉한 미생물의 수를 기준으로, 충분한 RNA가 숙주 세포로 전달되는지를 확인하는 것을 포함할 수 있다. RNA의 양이 사용된 미생물의 수에 비해 적다면, 침입 포텐셜을 증가시키기 위해 미생물을 추가로 변형시키는 것이 바람직할 수 있다.
세포로의 박테리아의 진입은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 세포내 박테리아는 아미노글리코시드 항생제 처리를 견딜 수 있는 반면, 세포외 박테리아는 신속하게 사멸한다. 박테리아 흡수의 정량적 추정치는 항생제 젠타마이신으로 세포 단층을 처리하여 세포외 박테리아를 불활성화시킨 후 상기 항생제를 제거한 다음, 생존한 세포내 유기체를 약한 계면활성제를 사용하여 방출시키고 표준 박테리아용 배지 상에서 생존 세포수를 계측함으로써 얻을 수 있다. 또한, 세포로의 박테리아의 진입은, 예를 들어 세포층의 박편 투과 전자 현미경 관찰에 의해 또는 면역형광 기법에 의해 직접 관찰할 수 있다(Falkow et al. (1992) Annual Rev. Cell Biol. 8: 333). 따라서, 다양한 기법을 이용하여, 특정 박테리아가 특정 유형의 세포에 침입할 수 있는지를 확인하거나 또는 박테리아를 변형시킨 후, 예컨대 제2의 박테리아의 향성을 모방하도록 박테리아 향성을 변형시킨 후의 박테리아 침입을 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 RNA 전달에 이용될 수 있는 박테리아는 비병원성인 것이 바람직하다. 그러나, 병원성 박테리아 역시, 그 병원성을 약독화시킴으로써 이 박테리아가 이것이 투여되는 피험체에 비유해성이 되도록 하는 한 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약독화 박테리아"라는 용어는 피험체에 대한 유해성을 현저히 감소시키거나 제거하도록 변형된 박테리아를 의미한다. 병원성 박테리아는 후술하는 다양한 방법으로 약독화할 수 있다.
특정 작용 메카니즘에 한정되기를 원하는 것은 아니지만, 진핵 세포로 RNA를 전달하는 박테리아는 박테리아의 유형에 따라 세포의 다양한 구획으로 진입할 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 소낭, 예를 들어 식작용 소낭 내에 존재할 수 있다. 박테리아가 세포 내에 진입하게 되면 파괴 또는 용해되어 그 내용물이 진핵 세포에 전달될 수 있다. 박테리아는 또한 파고좀 분해 효소를 발현시켜 파고좀으로부터의 RNA의 누출을 가능하게 하도록 조작할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 박테리아는 진핵 세포에서 다양한 시간 동안 생존한 상태로 존재할 수 있으며 연속적으로 RNA를 생산할 수 있다. 그 후, RNA 또는 RNA 코딩 DNA는, 예를 들어 누출에 의해 박테리아로부터 세포로 방출될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 박테리아는 진핵 세포에서 복제할 수도 있다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아 복제는 숙주 세포를 사멸시키지 않는다. 본 발명은 특정 메카니즘에 의해 RNA 또는 RNA 코딩 DNA를 전달하는 것에 국한되지 않으며, 전달 메카니즘과는 무관하게 박테리아에 의해 RNA 또는 RNA 코딩 DNA의 전달을 가능하게 하는 방법 및 조성물을 포함하고자 한다.
문헌에 본래 침입성인 것(섹션 1.1)으로 기재된 박테리아의 예, 문헌에 본래 비침입성인 것으로 기재된 박테리아의 예(섹션 1.2)와, 본래 비병원성이거나 약독화된 것인 박테리아의 예가 하기에 기술되어 있다. 일부 박테리아는 비침입성인 것으로 기재되어 있지만(섹션 1.2), 이들 역시 본 발명에 따라 사용하기에 충분히 침입성일 수 있다. 종래에 본래 침입성인 것으로 기재되어 있든지 비침입성인 것으로 기재되어 있든지 간에, 임의의 박테리아 균주를, 침입성을 조절하기 위해, 특히 증가시키기 위해 변형시킬 수 있다(예를 들어, 섹션 1.3에 기재된 바와 같음).
1.1 본래 침입성인 박테리아
본 발명에 이용되는 본래 침입성인 특정 박테리아가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 그러한 자연 발생적 침입성 박테리아의 예로는 쉬겔라 종, 살모넬라 종, 리스테리아 종, 리케치아 종 및 장 침입성 에스케리치아 콜라이를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이용되는 특정 쉬겔라 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 쉬겔라 균주의 예로는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 2a(ATCC 번호 29903), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)(ATCC 번호 29930) 및 쉬겔라 디센테리아(Shigella disenteriae)(ATCC 번호 13313)를 들 수 있다. 약독화 쉬겔라 균주, 예컨대 쉬겔라 플렉스네리 2a 2457T aroA virG 돌연변이 CVD 1203(Noriega et al. supra), 쉬겔라 플렉스네리 M90T icsA 돌연변이(Goldberg et al., Infect Immun., 62: 5664-5668 (1994)), 쉬겔라 플렉스네리 Y SFL114 aroD 돌연변이(Karnell et al., Vacc, 10: 167-174 (1992)) 및 쉬겔라 플렉스네리 aroA aroD 돌연변이(Verma et al., Vacc, 9:6-9 (1991))가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 대안으로, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 약독화 돌연변이와 함께 약독화 돌연변이를 도입함으로써 새로운 약독화 쉬겔라 종 균주를 구축할 수 있다.
쉬겔라 RNA 백신 벡터의 적어도 한 가지 장점은 결장 점막 표면에서의 림프 조직에 대한 향성이다. 또한, 쉬겔라의 주요 복제 부위는 점막 림프 조직의 M 세포의 기저 측면에서 흔히 관찰되는 수지상 세포 및 대식 세포 내에 있는 것으로 생각된다(재고찰 문헌: McGhee, J. R. et al. (1994) Reproduction, Fertility, & Development 6: 369; Pascual, D. W. et al. (1994) Immunomethods 5: 56). 이와 같이, 쉬겔라 벡터는 이러한 전문 항원 제시 세포에서 항원을 발현시키기 위한 수단을 제공할 수 있다. 쉬겔라 벡터의 또 다른 장점은 약독화 쉬겔라 균주가 핵산 리포터 유전자를 시험관내와 생체내에서 전달한다는 것이다(Sizemore, D. R. et al. (1995) Science 270: 299; Courvalin, P. et al. (1995) Comptes Rendus de l Academie des Sciences Serie III-Sciences de la Vie-Life Sciences 318: 1207; Powell, R. J. et al. (1996) In: Molecular approaches to control of infectious diseases. F. Brown, E. Norrby, D. Burton and J. Mekalanos, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 183; Anderson, R. J. et al. (1997) Abstracts for 97th General Meeting of American Society for Microbiology:E.). 실제적 측면에서, 쉬겔라의 엄격하게 제한된 숙주 특이성은 중간 숙주를 통해 먹이 사슬로 쉬겔라 벡터가 전파되는 것을 방지할 수 있게 한다. 또한, 설치류, 영장류 및 지원자에서 고도로 약독화된 약독화 균주가 개발되었다(Anderson et al. (1997) supra; Li, A. et al. (1992) Vaccine 10: 395; Li, A. et al. (1993) Vaccine 11: 180; Karnell, A. et al. (1995) Vaccine 13: 88; Sansonetti, P. J. and J. Arondel (1989) Vaccine 7: 443; Fontaine, A. et al. (1990) Research in Microbiology 141: 907; Sansonetti, P. J. et al. (1991) Vaccine 9: 416; Noriega, F. R. et al. (1994) Infection & Immunity 62: 5168; Noriega, F. R. et al. (1996) Infection & Immunity 64: 3055; Noriega, F. R. et al. (1996) Infection & Immunity 64: 23; Noriega, F. R. et al. (1996) Infection & Immunity 64: 3055; Kotloff, K. L. et al. (1996) Infection & Immunity 64: 4542). 이러한 후자의 지식은 인간에게 사용하기 위한 내성이 우수한 쉬겔라 벡터의 개발을 가능하게 할 것이다.
약독화 돌연변이는, 화학적으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 제제를 이용하거나, 또는 재조합 DNA 기법; 전통적 유전자 기법, 예컨대 Tn1O 돌연변이 유발법, P22-매개 형질도입, λ 파지 매개 크로스오버 및 접합에 의한 전달을 이용하는 비특이적 돌연변이 유발법을 이용하거나; 또는 재조합 DNA 기법을 이용하는 위치 지정 돌연변이 유발법을 이용하여 박테리아 병원균으로 도입할 수 있다. 재조합 DNA 기법에 의해 구축된 균주가 훨씬 더 명확하게 정의되기 때문에 재조합 DNA 기법이 바람직하다. 그러한 약독화 돌연변이의 예로는 하기 (i)∼(ix)의 것들을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다:
(i) 영양 요구성 돌연변이, 예컨대 aro(Hoiseth et al., Nature, 291: 238-239 (1981)), gua(McFarland et al., Microbiol. Path., 3: 129-141 (1987)), nad (Park et al., J. Bact, 170: 3725-3730 (1988)), thy(Nnalue et al., Infect. Immun., 55: 955-962 (1987)) 및 asd(Curtiss, supra) 돌연변이;
(ii) 전체적인 조절 기능을 불활성화시키는 돌연변이, 예컨대 cya(Curtiss et al., Infect. Immun., 55: 3035-3043 (1987)), crp(Curtiss et al. (1987), supra), phoP/phoQ(Groisman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 7077-7081 (1989); and Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 5054-5058 (1989)), phopc(Miller et al., J. Bact, 172: 2485-2490 (1990)) 또는 ompR (Dorman et al., Infect. Immun., 57: 2136-2140 (1989)) 돌연변이;
(iii) 스트레스 반응을 변화시키는 돌연변이, 예컨대 recA(Buchmeier et al., Mol. Micro., 7: 933-936 (1993)), htrA(Johnson et al., Mol. Micro., 5: 401-407 (1991)), htpR(Neidhardt et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 100: 894-900 (1981)), hsp(Neidhardt et al., Ann. Rev. Genet, 18: 295-329 (1984)) 및 groEL (Buchmeier et al., Sci., 248: 730-732 (1990)) 돌연변이;
(iv) 특정 독성 인자 내 돌연변이, 예컨대 IsyA(Libby et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 489-493 (1994)), pag 또는 prg(Miller et al. (1990), supra; and Miller et al. (1989), supra), iscA 또는 virG (d'Hauteville et al., Mol. Micro., 6: 833-841 (1992)), plcA(Mengaud et al., Mol. Microbiol., 5: 367-72 (1991); Camilli et al., J. Exp. Med, 173: 751-754 (1991)) 및 act(Brundage et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11890-11894 (1993)) 돌연변이;
(v) DNA 향성에 영향을 미치는 돌연변이, 예컨대 top A(Galan et al., Infect. Immun., 58: 1879-1885 (1990)) 돌연변이;
(vi) 세포 주기를 파괴 또는 변경하는 돌연변이, 예컨대 min(de Boer et al., Cell, 56: 641-649 (1989)) 돌연변이;
(vii) 자살 시스템을 코딩하는 유전자의 도입, 예컨대 sacB(Recorbet et al., App. Environ. Micro., 59: 1361-1366 (1993); Quandt et al., Gene, 127: 15-21 (1993)), nuc(Ahrenholtz et al., App. Environ. Micro., 60: 3746-3751 (1994)), hok, gef, kil 또는 phlA(Molin et al., Ann. Rev. Microbiol., 47: 139-166 (1993))의 도입;
(viii) 리포폴리사카라이드 및/또는 지질 A의 생합성에 변화를 주는 돌연변이, 예컨대 rFb(Raetz in Esherishia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt et al., Ed., ASM Press, Washington D.C. pp 1035-1063 (1996)), galE(Hone et al., J. Infect. Dis., 156: 164-167 (1987)) 및 htrB(Raetz, supra), msbB (Reatz, supra) 돌연변이;
(ix) 박테리오파지 세포용해 시스템의 도입, 예컨대 P22에 의해 코딩되는 라이소젠(Rennell et al., Virol, 143: 280-289 (1985)), λ 뮤레인 트랜스글리코실라제(Bienkowska-Szewczyk et al., Mol. Gen. Genet., 184: 111-114(1981)) 또는 S-유전자(Reader et al. Virol, 43:623-628 (1971))의 도입.
약독화 돌연변이는, 구성적으로(constitutively) 발현시킬 수 있거나 유도성 프로모터, 예컨대 온도 민감성 열 충격 프로모터 패밀리(Neidhardt et al. supra), 또는 혐기성 유도 nirB 프로모터(Harbome et al., Mol. Micro., 6: 2805-2813 (1992)) 또는 억제 가능 프로모터, 예컨대 uapA(Gorfinkiel et al., J. Biol. Chem., 268: 23376-23381 (1993)) 또는 gcv(Stauffer et al., J. Bact, 176: 6159-6164 (1994)) 하에 발현시킬 수 있다.
이용되는 특정 리스테리아 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 리스테리아 균주의 예로는 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes)(ATCC 번호 15313)를 들 수 있다. 약독화 리스테리아 균주, 예컨대 리스테리아 모노사이토진스 actA 돌연변이체(Brundage et al. supra) 또는 리스테라아 모노사이토진스 plcA(Camilli et al., J. Exp. Med., 173: 751-754 (1991))가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 대안으로, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 새로운 약독화 리스테리아 균주를 구축할 수 있다.
이용되는 특정 살모넬라 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 살모넬라 균주의 예로는 살모넬라 티피(Salmonella typhi)(ATCC 번호 7251) 및 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 번호 13311)을 들 수 있다. 약독화 살모넬라 균주를 본 발명에 사용하는 것이 바람직하며, 살모넬라 티피-aroC-aroD(Hone et al., Vacc. 9: 810 (1991)) 및 살모넬라 티피뮤리움-axoA 돌연변이체(Mastroeni et al., Micro. Pathol. 13: 477 (1992))를 들 수 있다. 대안으로, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 바와 같은 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 새로운 약독화 살모넬라 균주를 구축할 수 있다.
이용되는 특정 리케치아 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 리케치아 균주의 예로는 리케치아 리케치아(Rickettsia Rickettsiae)(ATCC 번호 VR149 및 VR891), 리케치아 프로와세키(Rickettsia prowaseckii)(ATCC 번호 VR233), 리케치아 츠츠가무시(Rickettsia tsutsugamuchi)(ATCC 번호 VR312, VR150 및 VR609), 리케치아 무세리(Rickettsia mooseri)(ATCC 번호 VR144), 리케치아 시비리카(Rickettsia sibirica)(ATCC 번호 VR151) 및 로칼리마에 퀴타나(Rochalimaea quitana)(ATCC 번호 VR358)를 들 수 있다. 약독화 리케치아 균주를 본 발명에 사용하는 것이 바람직하며, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 구축할 수 있다.
이용되는 특정 장내 침입성 에스케리치아 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 장내 침입성 에스케리치아 균주의 예로는 에스케리치아 콜라이 균주 4608-58, 1184-68, 53638-C-17, 13-80 및 6-81을 들 수 있다(Sansonetti et al., Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 132A: 351-355 (1982)). 약독화 장내 침입성 에스케리치아 균주를 본 발명에 사용하는 것이 바람직하며, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 구축할 수 있다.
또한, 박테리아 이외의 특정 미생물 역시 세포내 흡수를 위해 인테그린 분자(이것은 특정 침입 인자에 대한 수용체임)와 상호작용할 수 있기 때문에, 그러한 미생물 역시 RNA를 표적 세포로 도입하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 구제역 바이러스, 에코바이러스 및 아데노바이러스와, 원핵 병원균, 예를 들어 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum) 및 리슈마니아 메이저(Leishmania major)는 인테그린 분자와 상호작용한다.
1.2 침입성이 적은 박테리아
본 발명에 이용될 수 있고 문헌에 비침입성 또는 상기 섹션 (1.1)에 기재된 박테리아보다 적어도 침입성이 적은 것으로 기재된 박테리아의 예로는 여시니아 종(Yersinia spp.), 에스케리치아 종(Escherichia spp.), 크렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 보르데텔라 종(Bordetella spp.), 나이세리아 종(Neisseria spp.), 에어로모나스 종(Aeromonas spp.), 프란시셀라 종(Franciesella spp.), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 시트로박터 종(Citrobacter spp.), 클라미디아 종(Chlamydia spp.), 헤모필러스 종(Hemophilus spp.), 브루셀라 종(Brucella spp.), 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.), 레지오넬라 종(Legionella spp.), 로도코커스 종(Rhodococcus spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 헬리코박터 종(Helicobacter spp.), 비브리오 종(Vibrio spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.) 및 에리시펠로트릭스 종(Erysipelothrix spp.)을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 그 침입 포텐셜을 증가시키기 위해 상기 박테리아를 변형시킬 필요가 있을 수 있다.
이용되는 특정 여시니아 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 여시니아 균주의 예로는 여시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)(ATCC 번호 9610) 또는 여시니아 페스티스(Y. pestis)(ATCC 번호 19428)를 들 수 있다. 약독화 여시니아 균주, 예컨대 여시니아 엔테로콜리티카 YeO3-R2(al-Hendy et al., Infect. Immun., 60: 870-875 (1992)) 또는 여시니아 엔테로콜리티카 aroA(O'Gaora et al., Micro. Path., 9: 105-116 (1990))가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 대안으로, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 새로운 약독화 여시니아 균주를 구축할 수 있다.
이용되는 특정 에스케리치아 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 에스케리치아 균주의 예로는 에스케리치아 콜라이 H10407(Elinghorst et al., Infect. Immun., 60: 2409-2417 (1992)) 및 에스케리치아 콜라이 EFC4, CFT325 및 CPZ005(Donnenberg et al., J. Infect. Dis., 169: 831-838 (1994))를 들 수 있다. 약독화 에스케리치아 균주, 예컨대 약독화 터키 병원균 E. 콜라이 02 carAB 돌연변이체(Kwaga et al., Infect. Immun., 62: 3766-3772 (1994))가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 대안으로, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 새로운 약독화 에스케리치아 균주를 구축할 수 있다.
이용되는 특정 크렙시엘라 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 크렙시엘라 균주의 예로는 크렙시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae)(ATCC 번호 13884)를 들 수 있다. 약독화 크렙시엘라 균주를 본 발명에 사용하는 것이 바람직하며, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 구축할 수 있다.
이용되는 특정 보르데텔라 균주가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 본 발명에 이용될 수 있는 보르데텔라 균주의 예로는 보르데텔라 브론치셉티카(B. bronchiseptica)(ATCC 번호 19395)를 들 수 있다. 약독화 보르데텔라 균주를 본 발명에 사용하는 것이 바람직하며, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 구축할 수 있다.
이용되는 특정 나이세리아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 이용될 수 있는 나이세리아 균주의 예로는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)(ATCC 번호 13077) 및 나이세리아 고노르헤(N. gonorrhoeae)(ATCC 번호 19424)를 들 수 있다. 약독화 나이세리아 균주, 예컨대 나이세리아 고노르헤 MS11 aro 돌연변이체(Chamberlain et al., Micro. Path., 15: 51-63 (1993))를 본 발명에 사용하는 것이 바람직하다. 대안으로, 쉬겔라 종과 관련하여 앞서 기재한 그룹 (i) 내지 (vii)의 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 새로운 약독화 나이세리아 균주를 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 에어로모나스 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 본 발명에서 사용할 수 있는 에어로모나스 균주의 예로는 A. 유크레노필라(ATCC No. 23309) 등이 포함된다. 다르게는, 상기에서 쉬겔라 종에 대해 기술한 바와 같이 (i) 내지 (vii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 새로운 약독화 에어로모나스 균주를 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 프란시셀라 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 본 발명에서 사용할 수 있는 프란시셀라 균주의 예로는 F.튜라렌시스(ATCC No. 15482) 등을 포함한다. 약독화 프란시셀라 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대해 기술한 바와 같이 (i) 내지 (vii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 코리네박테리움 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 본 발명에서 사용할 수 있는 코리네박테리움 균주의 예로는 C. 슈도튜머큘로시스(ATCC No. 19410)을 포함할 수 있다. 약독화 코리네박테리움 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 시트로박터 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 시트로박터 균주의 예로는 C. 프룬디(ATCC No. 8090) 등을 포함할 수 있다. 약독화 시트로박터 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 클라미디아 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 클라미디아 균주의 예로는 C. 뉴모니아(ATCC No. VR1310) 등을 포함할 수 있다. 약독화 클라미디아 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 헤모필러스 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 헤모필러스 균주의 예로는 H. 소르너스(ATCC No. 43625) 등을 포함할 수 있다. 약독화 헤모필러스 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 브루셀라 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 브루셀라 균주의 예로는 B. 아보르투스(ATCC No. 23448) 등을 포함할 수 있다. 약독화 브루셀라 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 마이코박테리움 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 마이코박테리움 균주의 예로는 M. 인트라셀룰라레(ATCC No. 13950) 및 M. 튜버큘로시스(ATCC No. 27294)등을 포함할 수 있다. 약독화 마이코박테리움 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 레지오넬라 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 레지오넬라 균주의 예로는 L. 뉴모필라(ATCC No. 33156) 등을 포함할 수 있다. 약독화 레지오넬라 균주, 예컨대 L. 뉴모필라 mip 돌연변이체(Ott, FEMS Micro.Rev., 14:161-176(1994))를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하다. 다르게는, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 새로운 약독화 레지오넬라 균주를 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 로도코커스 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 로도코커스 균주의 예로는 R. 에쿠이(ATCC No. 6939) 등을 포함할 수 있다. 약독화 로도코커스 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 슈도모나스 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 슈도모나스 균주의 예로는 P. 에루지노사(ATCC No. 23267) 등을 포함할 수 있다. 약독화 슈도모나스 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 헬리코박터 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 헬리코박터 균주의 예로는 H. 무스텔라(ATCC No. 43772) 등을 포함할 수 있다. 약독화 헬리코박터 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 살모넬라 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 살모넬라 균주의 예로는 살모넬라 타이피(ATCC No. 7251) 및 S. 티피뮤리움(ATCC No. 13311) 등을 포함할 수 있다. 약독화 살모넬라 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, S. 티피 aroC, aroD(Hone 등, Vacc., (:810-816(1991)) 및 S. 티피뮤리움 aroA 돌연변이체(Mastroeni 등, Micro.Pathol, 13:477-491(1992)) 등을 포함하는 것이 바람직하다. 다르게는, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 새로운 약독화 살모넬라 균주를 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 비브리오 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 비브리오 균주의 예로는 비브리오 콜레라(ATCC No. 14035) 및비브리오 신시나디엔시스(ATCC No. 35912) 등을 포함할 수 있다. 약독화 비브리오균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, V. 콜레라 RSI 독성 돌연변이체(Taylor 등, j.Infect.Dis., 170:1518-1523(1994)) 및 V. 콜레라 ctxA, ace, zot, cep 돌연변이체(Waldor 등, J.Infect.Dis., 170:278-283(1994)) 등을 포함하는 것이 바람직하다. 다르게는, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 새로운 약독화 비브리오 균주를 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 바실러스 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 바실러스 균주의 예로는 바실러스 서브틸리스(ATCC No. 6051) 등을 포함할 수 있다. 약독화 바실러스 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, B. 안트라시스 돌연변이체 pX01(Welkos 등, Micro.Pathol, 14:381-388 (1993)) 및 약독화 BCG 균주(Stover 등, Nat., 351:456-460(1991)) 등을 포함하는 것이 바람직하다. 다르게는, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 새로운 약독화 바실러스 균주를 구축할 수 있다.
본 발명에서는 특정 에리시펠로트릭스 균주를 사용하는 것이 중요하지 않다. 에리시펠로트릭스 균주의 예로는 에리시펠로트릭스 루시오파티아(ATCC No. 19414) 및 에리시펠로트릭스 톤실라럼(ATCC No. 4339) 등을 포함할 수 있다. 약독화 에리시펠로트릭스 균주를 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하며, E. 루시오파티아 Kg-1a 및 Kg-2(Watarai 등, J.Vet.Med.Sci., 55:595-600(1993)) 및 E. 루시오파티아 ORVAC 돌연변이체(Markowska-Daniel 등, Int. J. Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis., 277:547-553(1992)) 등을 포함하는 것이 바람직하다. 다르게는, 상기 쉬겔라 종에 대하여 기술한 바와 같이 (i) 내지 (ii)군 중 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입시켜서 새로운 약독화 에리시펠로트릭스 균주를 구축할 수 있다.
1.3. 박테리아 균주의 침입성을 증가시키기 위한 방법
통상적으로 유기체를 침입성 또는 비침입성으로 기술하여 왔었지만, 이들 유기체들을 유전자 조작하여서 침입성을 증가시킬 수 있는데, 예를 들어서, 쉬겔라 종, 리스테리아 종, 리케치아 종, 또는 장내 침입성대장균 종 등의 침입성을 모방하여 이룰 수 있다. 예를 들어서, 미생물이 세포, 예를 들어 상기 비침입성 박테리아의 천연 숙주 내 세포의 세포질에 접근할 수 있게 만드는 하나 이상의 유전자를 상기 미생물 내로 도입시킬 수 있다.
이러한 유전자들을 본 발명에서는 "세포질-표적화 유전자"라고 하며 이들의 예로는 쉬겔라에 의해 침윤이 가능한 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 장내침입성 에스케리치아의 유사 침윤 유전자, 또는 리스테리아이 리스테리오리신 O의 유전자를 포함하며, 이러한 기술들은 동물 세포의 세포질을 침입하여 들어갈 수 있는 침입성 박테리아를 광대한 군집으로 야기시키는 것으로 알려져 있다(Formal 등, Infect. Immun., 46:465(1984); Bielecke 등, Nature, 345:175-176(1990); Small 등, In: Microbiology(1986), page 121-124; Levine 등, Eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C.(1986); Zychlinsky 등, Molec. Micro., 11:619-627(1994); Gentschev 등, (1995), Infection&Immunity, 63:4202; Isberg, R.R. and S.Falkow(1985), Nature 317:262; 및 Isberg, R.R. 등, (1987), Cell 50:769). 상기 세포질-표적화 유전자를 박테리아 균주에 운반하는 방법은 당 분야에서 공지이다. 박테리아의 침입성을 증가시키기 위해서 박테리아 내부에 도입할 수 있는 다른 바람직한 유전자는 여시니아 슈도튜버큘로시스 유래의 침입성 단백질을 코딩하는 것이다(Leong 등, EMBO J., 9:1979(1990)). 또한 침입성은 리스테리오리신과 조합하여 도입할 수 있는데, 이 경우 이러한 유전자들의 도입에 비하여 박테리아의 침입 특성을 더 증가시키게 된다. 상기 유전자들은 예시적인 목적으로 기술한 것이지만, 미생물로부터 세포, 예를 들어, 동물 세포의 세포질로 분자, 구체적으로 RNA 또는 RNA-코딩 DNA 분자 등의 분자를 전달하는데 관여하며, 하나 이상의 공급원으로부터 유래하는 임의의 유전자 또는 유전자들의 조합이 충분할 수 있음은 당 분야의 당업자에게는 자명하다. 따라서, 이러한 유전자들은 박테리아 유전자에만 한정되지 않으며, 바이러스 유전자, 예컨대 내삼투분해(endosmolysis)를 촉진하는 플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 HA-2 등의 유전자를 포함한다(Plank 등, J.Biol.Chem., 269:12918-12924(1994)).
상기의 세포질-표적화 유전자는 예를 들어서, 바람직한 세포질-표적화 유전자를 보유하는 침입성 박테리아에서 분리한 DNA를 PCR 증폭시켜서 얻을 수 있다. PCR용 프라이머는 당 분야에서 이용가능한 뉴클레오티드 서열을 통해 설계할 수 있는데, 예를 들어서, 인터넷상에서 대중적으로 이용할 수 있는, 상기 열거한 참조 문헌 및/또는 유전자은행(GeneBank)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)등을 이용한다. PCR 프라이머는 세포질-표적화 유전자, 세포질-표적화 오페론, 세포질-표적화 유전자 집단, 또는 세포질-표적화 유전자의 레귤론(regulon)을 증폭하도록 설계할 수 있다. 사용하는 PCR 전략은 세포질-표적화 유전자 또는 표적 침입성 박테리아 내 유전자들의 유전적 구성도에 따라 좌우된다. PCR 프라이머는 표적 DNA 서열의 시작 및 종결부의 DNA 서열과 상동성을 갖는 서열을 함유하도록 설계한다. 이후 세포질-표적 유전자를 표적 박테리아 균주 내부로 도입시킬 수 있는데, 예를 들어서, Hfr 전이 또는 플라스미드 이용법(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1992); Bothwell 등, 상동; 및 Ausubel 등, 상동), 박테리오파지-매개 형질감염법(Bothwell 등, 상동; Miller, 상동; 및 Ausubel 등, 상동), 화학적 형질전환법(Bothwell 등, 상동; Ausubel 전기 천공법(Bothwel 등, 상동; Ausubel 등, 상동; 및 Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 물리적 형절전환법(John 등, 상동; 및 Bothwell, 상동) 등을 이용한다. 세포질-표적 유전자를 용원성 박테리오파지(de Boer 등, Cell, 56:641-649(1989)), 플라스미드 벡터(Curtiss 등, 상동)에 도입하거나 또는 표적 균주의 염색체(Hone 등, 상동) 내로 삽입시킬 수 있다.
침입성을 증가시기기 위해서 박테리아를 유전적으로 조작하는 것뿐만 아니라, 상기 설명한 바와 같이, 침입성 인자를 박테리아와 연결시켜서 박테리아를 변형시킬 수도 있다. 따라서, 일 구체예에서 침입 인자, 예를 들어, 단백질 인베이신(invasin), 인베이신 유도체, 또는 침입성에 충분한 이들의 단편 등을 공유적으로 또는 비공유적으로 박테리아에 코팅시켜서 보다 침입적인 박테리아를 만들게 된다. 사실, 비침입성 박테리아 세포를 여시니아 슈도튜버큘로시스 유래의 정제한 인베이신 또는 인베이신의 카르복시-말단 192 아미노산으로 코팅하여서 포유 동물 세포 내부로 들어가게 할 수 있다는 것이 이미 알려져 있다(Leong 등(1990) EMBO J. 9:1979). 또한, 항체-고정 인베이신으로 코팅된 스타필로코커스 아우레우스 균주처럼, 인베이신의 카르복시 말단 영역으로 코팅된 라텍스 비드는 효율적으로 포유 동물 세포 내로 흡수된다(Isberg 및 Trans van Nhie(1994) Ann.Rev.Genet. 27:395를 참조한다). 다르게 박테리아 유입(entry) 인자에 의해 인식되는 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 변형체, 또는 이의 단편으로 박테리아를 코팅할 수도 있다. 예를 들어서, 인테그린 분자, 예를 들어 α5β1 등의 박테리아 인베이신 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 표면 분자를 인지하는 단일클론 항체로 코팅하면 이러한 박테리아를 흡수한다는 것은 알려져 있다(Isberg 및 Tran van Nhiu, 상동). 이러한 항체들은 당 분야의 공지된 방법들을 통해서 제조할 수 있다. 제조된 항체를 박테리아 침입성에 대한 효율성에 대해 시험할 수 있는데, 예를 들어서, 이러한 항체로 박테리아를 코팅하고, 상기 항체에 의해 인식되는 표면 수용기를 갖는 진핵 세포와 상기 박테리아를 접촉시킨 후, 상기 언급한 방법에 따라서 세포 내부에 박테리아의 존재를 모니터링한다. 박테리아의 표면에 침입 인자를 연결시키는 방법은 당 분야에서 공지이며, 가교결합 등을 포함한다.
2. 표적 세포
본 발명은 임의 유형의 표적 세포에 RNA를 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "표적 세포"는 박테리아에 의해서 침입될 수 있는 세포, 즉, 박테리아에 의해 인지되는데 필수적인 표면 수용기를 갖는 세포를 의미한다.
바람직한 표적 세포는 진핵 세포이다. 보다 바람직한 표적 세포로는 동물 세포이다. "동물 세포"는 분류학상 동물계(animalia)에 속하는 다세포 유기체에 존재하거나 다세포 유기체로부터 유래한 핵이 있으며, 엽록체를 함유하지 않는 세포로 정의된다. 이러한 세포들은 완전한 동물, 1차 세포 배양물, 외식(explant) 배양물 또는 형질전환 세포주로 존재할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 수용체 동물 세포는 본 발명에서 중요하지 않으며 동물계, 예컨대 포유류, 어류, 조류, 파충류 등의 과에 속하는 것들 중의 모든 유기체로부터 유래하거나 이들에 존재하는 세포를 포함한다.
바람직한 동물 세포로는 포유 동물 세포, 예컨대 인간, 소과, 양, 돼지과, 고양이과, 개과, 염소, 말과, 및 영장류 세포이다. 가장 바람직한 동물 세포는 인간 세포이다.
바람직한 구체예에서, 표적 세포는 점막 세포이다. 특정 장내 병원체, 예를 들어, E. 콜라이, 쉬겔라, 리스테리아, 및 살모넬라 등은 이러한 용도에 천연적으로 적합한데, 이들 유기체들이 숙주의 점막 표면에 부착하여 침입할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문이다(Kreig 등, 상동). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 박테리아들이 RNA 분자 또는 RNA-코딩 DNA를 숙주 점막 구획 내 세포로 전달할 수 있다.
비록 특정 유형의 박테리아가 특정 향성, 즉 바람직한 표적 세포를 가질 수 있지만, 특정 유형의 세포에 RNA 또는 RNA-코딩 DNA를 전달하는 것은 바람직한 세포 유형에 향성을 가지거나 바람직한 세포 유형을 침입할 수 있도록 변형된 박테리아를 선택하여 수행할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 기술한 바와 같이, 점막 조직 향성 및 침입성을 의태하도록 박테리아를 유전적으로 조작하여서 이 박테리아가 점막 조직을 침입하여, RNA 또는 RNA-코딩 DNA를 세포 내 이들 부위로 전달하도록 할 수 있다.
박테리아는 또한 기타 유형의 세포를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 인간 및 영장류의 적혈구를 표적화할 수 있는데, 인간 및 영장류의 적혈구에 특이적으로 결합하는 플라스모디움 비바스의 망상 적혈구 결합 단백질-1 및 망상 적혈구 결합 단백질-2 둘다 또는 이 중 하나를 표면상에 발현하도록 박테리아를 변형시켜서 이룰 수 있다(Galinski 등, Cell, 69:1213-1226(1992)). 다른 실시예에서는, 박테리아의 표면상에 간세포의 아실로글리코단백질 수용기에 대한 리간드인 아실로오로소뮤코이드를 갖도록 박테리아를 변형시킨다(Wu 등, J. Biol. Chem., 263:14621-14624(1988)). 또 다른 구체예에서, 박테리아를 인슐린-폴리-L-리신으로 코팅하는데, 이 경우 인슐린 수용기를 사용하여 세포내로 표적 플라스미드가 흡입되는 것으로 알려져 있다(Resenkranz 등, Expt. Cell Res., 199:323-329(1992)). 또한, 본 발명의 범주 내에서 박테리아의 표면 상에 리스테리아 모노사이토게네스의 p60을 갖도록 변형시켜서 간세포에 대한 향성을 생성시키거나, 헤파린, 헤파린 황산염 및 콜라겐에 결합하여서 포유 동물의 세포외 매트릭스에 특이적으로 결합하게 만드는 트리파노소마 크루지 유래의 60 kD 표면 단백질을 박테리아의 표면상에 갖도록 변형시킬 수 있다(Ortega-Barria 등, Cell, 67:411-421(1991)).
또 다른 구체예에서, RNA 전달용 박테리아의 표적 세포가 되도록 세포를 변형시킬 수 있다. 즉, 박테리아가 세포 내로 들어가기 위해서 박테리아에 의해 인식되는 표면 항원, 즉 침입 인자의 수용기 등이 세포 표면에 발현되도록 세포를 변형시킬 수 있다. 다르게는 침입 인자의 수용기로 세포를 코팅할 수 있다. 침입 인자의 수용기는 인테그린 수용기 수퍼패밀리에 속하는 단백질을 포함한다. 다양한 박테리아 및 기타 미생물에 의해 인식되는 인테그린 수용기 유형을 열거한 목록은 예를 들어 문헌 [Isberg 및 Tran Van Nhieu, (1994), Ann. Rev. Genet. 27:395]에서 확인할 수 있다. 인테그린 서브유니트에 대한 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 인터넷에서 공개적으로 이용가능한 유전자 은행에서 확인할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 기타 표적 세포는, 어류, 조류, 및 파충류 세포를 포함한다. 어류, 조류, 및 파충류 세포를 천연적으로 침입하는 박테리아의 예는 이하에 기술하였다.
어류 세포의 세포질에 천연적으로 접근할 수 있는 박테리아의 예로는 에어로모나스 살미노시다(ATCC No. 33658) 및 에어로모나스 스큐베리(ATCC No. 43700) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 약독화 박테리아를 사용하는 것이 바람직하며, A. 살모니시디아 vapA(Gustafson 등, J. Mol. Biol., 237:452-463(1994)) 또는 A. 살모니시디아 방향성-의존적 돌연변이체(Vaughan 등, Infect. Immun., 61:2172-2181(1993))를 포함한다.
조류 세포의 세포질에 천연적으로 접근할 수 있는 박테리아의 예로는 살모넬라 갈리나럼(ATCC No. 9184), 살모넬라 엔테리디티스(ATCC No. 4931) 및 살모넬라 티피뮤리움(ATCC No. 6994) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 약독화 박테리아가 바람직한데 약독화 살모넬라 균주 예컨대 S. 갈리나럼 cya crp 돌연변이체(Curtiss 등, (1987), 상동) 또는 S. 엔테리티디스 aro A 방향성-의존적 돌연변이체 CVL30(Cooper 등, (1987), 상동) 등을 포함한다.
파충류 세포의 세포질에 천연적으로 접근할 수 있는 박테리아의 예로는 살모넬라 티피뮤리움(ATCC No. 6994) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 약독화 박테리아가 본 발명에서는 바람직하며, 약독화 균주 예컨대 S. 티피뮤리움 방향성-의존적 돌연변이체(Hormaeche 등, 상동)를 포함한다.
본 발명은 또한 기타 진핵 세포, 예를 들어 식물 세포에 대해서, 침입성이 되도록 변형시키거나 천연적으로 이들 세포를 침입할 수 있는 미생물이 존재하는 한, 상기 기타 진핵 세포, 예컨대 식물 세포에 RNA를 전달하는 방법을 제공한다. 식물 세포를 침입할 수 있는 미생물의 예로는 아그로박테리움 튜머르파시움을 포함하며, 이는 특정 수용기를 통해서 식물 세포에 결합하는 필러스-유사 구조를 사용하여서, 박테리아 접합법과 유사한 과정을 통해 식물 세포에 적어도 그 자신의 내용물의 일부를 전달한다.
이하 본 발명의 방법을 통해서 RNA를 전달할 수 있는 세포주의 예를 나타내었다.
인간 세포주의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나 ATCC No. CCL 62, CCl 159, HTB 151, HTB 22, CCL 2, CRL 1634, CRL 8155, HTB 61, 및 HTB 104를 포함한다.
소과의 세포주의 예로는 ATCC No. CRL 6021, CRL 1733, CRL 6033, CRL 6023, CCL 44 및 CRL 1390 등을 포함한다.
양과 세포주의 예로는 ATCC No. CRL 6540, CRL 6538, CRL 6548 및 CRL 6546 등을 포함한다.
돼지과 세포주의 예로는 ATCC No. CL 184, CRL 6492, 및 CRL 1746 등을 포함한다.
고양이과 세포주의 예로는 ATCC No. CRL 6077, CRL 6113, CRL 6140, CRL 6164, CCL 94, CCL 150, CRL 6075, 및 CRL 6123 등을 포함한다.
물소 세포주의 예로는 ATCC No. CCL 40, 및 CRL 6072 등을 포함한다.
개과 세포주의 예로는 ATCC No. CRL 6213, CCL 34, CRL 6202, CRL 6225, CRL 6215, CRL 6203, 및 CRL 6576 등을 포함한다.
염소 유래 세포주의 예로는 ATCC No. CCL 73 및 ATCC No. CRL 6270 등을 포함한다.
말 유래 세포주의 예로는 ATCC No. CCL 57 및CRL 6583 등을 포함한다.
사슴 세포주의 예로는 ATCC No. CRL 6193-6196 등을 포함한다.
영장류 유래의 세포주의 예로는 침팬지 유래의 세포주, 예컨대 ATCC No. CRL 6312, CRL 6304, 및CRL 1868; 원숭이 세포주, 예컨대 ATCC No. CRL 1576, CCL 26, 및 CCL 161; 오랑우탄 세포주 ATCC No. CRL 1850; 및 고릴라 세포주 ATCC No. CRL 1854 등을 포함한다.
4. 약학 조성물
본 발명의 바람직한 구체예에서, RNA 분자, 및/또는 이를 코딩하는 DNA를 함유하는 침입성 박테리아를 정맥내, 근육내, 피부내, 복막내, 구강내, 비강내, 안구내, 직장내, 질내, 골내, 경구, 액침 및 요도내 접종 경로 등을 통해서 동물 내로 도입시킨다.
개체에 투여되는 본 발명의 침입성 생박테리아의 양은 치료할 질병 또는 병태를 비롯하여 피검체의 종에 따라 다양할 수 있다. 대체로 사용하는 용량은 피검체당 약 103∼1011의 생유기체, 바람직하게는 피검체당 약 105∼109의 생유기체가 된다.
본 발명의 침입성 박테리아는 일반적으로 약학적 허용 담체 및/또는 희석제와 함께 투여된다. 본 발명에서는 특정한 약학적 허용 담체 및/또는 희석제를 사용하는 것이 중요하지 않다. 희석제의 예로는 인산염 완충 염수, 위 내 위산을 완충하는 완충제, 예컨대 수크로스를 함유한 구연산염 완충제(pH 7.0), 중탄산염 완충제(pH 7.0) 단독(Levine 등, J. Clin. Invest., 79:888-902 (1987); 및 Black 등, J. Infect. Dis., 155:1260-1265(1987)), 또는 아스코르브산, 락토스, 및 선택적으로 아스파탐을 함유하는 중탄산 완충제(pH 7.0)(Levine 등, Lancet, II:467-470(1988)) 등을 포함한다. 담체의 예로는 단백질, 예컨대 탈지 우유 내에 존재하는 단백질, 당류, 예를 들어, 수크로스, 또는 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다. 통상적으로 이들 담체는 약 0.1∼30%(w/v)의 농도, 바람직하게는 1∼10%(w/v) 범위의 농도로 사용된다.
이하 특이적 전달 경로를 위해 사용할 수 있는 기타 약학적 허용 담체 또는 희석제를 설명한다. 박테리아가 여전히 표적 세포를 침입할 수 있는 한, 임의의 이러한 담체 또는 희석제를 본 발명의 박테리아 투여용으로 사용할 수 있다. 침입성에 대한 시험관 내 또는 생체내 시험을 수행하여서 적절한 희석제 및 담체를 결정할 수 있다. 본 발명의 조성물은 다양한 투여 유형으로 제제화할 수 있는데, 전신 및 국소 또는 국부 투여용등을 포함한다. 박테리아를 표적 세포와 접촉시 또는 피검체에 투여시 이 박테리아가 침입성을 유지한다면, 동결 건조 형태도 또한 포함시킬 수 있다. 일반적인 제형화 및 기술등은 문헌 [Remmington's Pharmacetical Sciences, Meade publishing Co., Easton, Pa.]를 참조할 수 잇다. 전신 투여용으로, 주입법이 바람직한데, 예컨대, 근육내, 정맥내, 복막내, 및 피하주사를 포함한다. 주입용으로, 본 발명의 조성물, 예를 들어 박테리아를 액상 용액, 바람직하게는 생리적으로 호환가능한 완충제 예컨대 행크액 또는 링거액 중에 제제화할 수 있다.
경구 투여용으로, 상기 약학 조성물은 예를 들어, 약학적 허용 부형제 예컨대 결합제(예를 들어, 젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충진제(예를 들어, 락토스, 미정질 셀룰로스 또는 칼슘 수소 인산염 등); 윤활제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탈크 또는 실리카 등); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 전분 글리콜산 나트륨); 또는 습윤제(예를 들어, 황산 라우릴 나트륨 등) 등을 이용한 통상의 방식으로 제조된 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 정제는 당 분야의 공지의 방법으로 코팅시킬 수 있다. 경구 투여용 액상 조제물은 예를 들어서, 액제, 시럽 또는 현탁물 등의 형태일 수 있거나, 사용하기 전에 물이나 기타 적절한 운반체(vehecle) 등을 사용하는 구성의 건조 제품으로 존재할 수 있다. 이러한 액상 조제물은 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가한 식용 지방류 등); 유화제(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아 등); 비수성 운반체(예를 들어, 알몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 식물성 분별유 등); 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산 등) 등의 약학적 허용 첨가제를 사용하는 통상의 방식으로 제조할 수 있다. 상기 조제물은 또한 완충염, 향미제, 착색제 및 감미제 등을 적절하게 함유할 수 있다.
경구용 조제물은 활성 화합물의 방출을 제어하도록 적절하게 제제화할 수 있다. 구강 투여용 조성물은 통상의 방식으로 제제화한 정제 또는 로젠지 형태일 수 있다.
흡입 투여용으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 적절한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리플로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 가스를 사용하는 가압 팩 또는 흡입기로부터 발포되는 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에 개량된 양을 전달하도록 밸브를 제공하여 단위 용량을 결정할 수 있다. 흡입기 또는 통기기에서 사용하기 위한 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 상기 조성물, 예를 들어 박테리아, 및 적절한 분말 베이스 예컨대 락토스나 전분등의 분말 믹스를 함유시켜서 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물은 주입법, 예컨대 볼러스 주입법 또는 연속 주입법을 통한 비경구 투여용으로 제제화할 수 있다. 주입용 제제는 단위 제형, 예를 들어 보존제를 첨가하여서, 앰플이나 다복용량 용기 등의 형태로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 예컨대 유성 또는 수성 운반체 중의 에멀션, 액제 또는 현탁제의 형태일 수 있으며, 제제화용 제제 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 다르게는 활성 성분을 적절한 운반체, 예를 들어 발열원 무함유의 멸균수 등을 사용전에 이용하는 구성의 분말 형태일 수 있다.
상기 약학 조성물은 또한 직장, 질내 또는 요도내에서 사용하는 조성물로 제제화할 수 있는데, 예를 들어 통상의 좌제 베이스인 코코아 버터 또는 기타 글리세리드류를 함유하는 예컨대 좌제 또는 관장제일 수 있다.
전신 투여는 또한 점막 투과성이거나 경피 투과성일 수 있다. 점막 투과성 또는 경피 투과성 투여용으로, 투과하는 장벽에 적절한 침투제를 제제에 사용한다. 이러한 침투제는 당 분야에서 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어서, 점막 투과성 투여를 위해서는 담즙산염 및 푸시드산 유도체 등을 포함한다. 점막 투과성 투여는 비강 스프레이를 통해거나 좌제를 사용할 수 있다. 국소 투여용으로, 박테리아가 표적 세포와 접촉시 지속적으로 침입성을 유지하는 한, 본 발명의 박테리아를 당 분야에서 일반적으로 알려져 있는 연고, 고약, 겔, 또는 크림 등으로 제제화할 수 있다.
필요하다면, 상기 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 포함하는 팩이나 디스펜서 디바이스 및/또는 키트로 존재할 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속이나 플라스틱 호일, 예컨데 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 디바이스는 투여 지시서가 함께 동봉될 수 있다.
도입시킬 RNA 또는 RNA-코딩 DNA를 함유하는 침입성 박테리아는 예를 들어, 피검체에서 수득한 세포 등을 시험관 내에서 배양한 동물 세포를 감염시키는데 사용할 수 있다. 이러한 시험관 내-감염 세포들을 이어서 동물, 예컨대 초기에 세포를 수득했던 개체에게 정맥내, 근육내, 피부내, 또는 복강내로 도입시키거나, 상기 세포가 숙주 조직으로 들어갈수 있게 하는 임의의 접종 경로를 통해서 도입시킬 수 있다. RNA를 개별 세포들에 전달한 경우, 투여된 생유기체의 용량은 세포당 약 0.1∼106의 박테리아, 바람직하게는 약 102∼104의 박테리아 범위의 감염다중도(multiplicity of infection)가 될 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 박테리아는 단백질을 코딩하는 RNA를 상기 단백질을 이후에 회수하거나 정제할 수 있는 세포, 예를 들어 동물 세포로 전달할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 조직 배양 세포에서 생산할 수 있다.
본 발명을 이의 구체적인 설명과 함께 기술하였으나, 전술한 설명은 단지 예를 들어 설명하고자 하는 의도이며 첨부된 청구항의 범주로 한정되는, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 의도가 아니다. 기타 측면, 장점 및 변형 등은 이하 청구항의 범주내에 속한다.
본 발명은 이하 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하지만 이에 한정하고자 하는 의도가 아니다. 본 출원 명세서 전반에 걸쳐서 인용하는 참고 문헌, 등록 특허, 공개 특허 출원 등을 비롯한 모든 인용 문헌들의 내용은 본 발명에서 특히 참조 문헌으로 포함시킨다. 본 발명의 실시는 달리 언급하지 않으면, 당 분야의 당업자에게는 잘 알려진세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자 도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학 등의 통상적인 기술을 사용하여 수행한다. 이러한 기술들은 문헌으로 완전하게 설명된 것들이다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed., 1984); Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155(Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)] 등을 참조한다.
방법
siRNA-생성 플라스미드의 구축:
PAGE 정제법을 사용하여 QIAGEN으로부터 올리고뉴클레오티드를 0.2 umol 수득하였다. 어닐링 후, 제조사의 설명서에 따라서 올리고뉴클레오티드를 pSilencer 2.0-U6(Ambion, Inc.) 내의 BamHI 및 HindIII 결합 부위에 삽입하였다.
이하의 서열들을 사용하였다.
k-Ras-1 및 k-Ras-2의 각 64-머는 V12의 특이적 돌연변이가 있는 k-Ras 단백질의 아미노산 9∼15를 코딩하는 뉴클레오티드를 표적으로 한다.
k-Ras-l(64-머):
5'gATCCCgTTggAgCTgTTggCgTAgTTCAAgAgACTACgCCAACAgCTCCAACTTTTTTggAAA3'(서열 번호 1)
k-Ras-2(64-머):
5'AgCTTTTCCAAAAAAgTTggAgCTgTTggCgTAgTCTCTTgAACTACgCCAACAgCTCCAACgg3'(서열 번호 2)
β-카테닌-1 및 β-카테닌-2의 각 64머는는 카테닌 단백질 내의 아미노산 79∼85를 코딩하는 뉴클레오티드를 표적으로 한다.
β-카테닌-l(64머):
5 'gATCCCAgCTgATATTgATggACAgTTCAAgAgACTgTCCATCAATATCAgCTTTTTTTggAAA3'
(서열 번호 3)
β-카테닌-2(64머):
5'AgCTTTTCCAAAAAAAgCTgATATTgATggACAgTCTCTTgAACTgTCCATCAATATCAgCTgg3'(서열 번호 4)
EGFP-1 및 EGFP-2의 각 64-머는 EGFP의 아미노산 22∼28을 코딩하는 뉴클레오티드를 표적으로 한다.
EGFP-1(64머):
5'gATCCCgACgTAAACggCCACAAgTTTCAAgAgAACTTgTggCCgTTTACgTCTTTTTTggAAA3'(서열 번호 5)
EGFP-2(64머):
5'AgCTTTTCCAAAAAAgACgTAAACggCCACAAgTTCTCTTgAAACTTgTggCCgTTTACgTCgg3'(서열 번호 6)
트랜스킹덤 RNA 간섭 플라스미드 구축:
유전자 조작한 플라스미드 pT7RNAi-Hly-Inv, TRIP를 pGB2Ωinv-hly (Milligan 등, Nucleic Acids Res. 15, 8783 (1987)) 및 pBlueSciptII KS(+)로부터 구축하였다. 멀티클로닝부위(MCS), T7 프로모터, 인핸서 및 종결인자를 함유하는 올리고뉴클레오티드(Qiagen으로부터 합성함)를 KSII(+)의 블런티드(blunted) BssHII 부위로 결찰하였으며, β-카테닌 헤어핀 올리고머를 MCS의 BamHI 및 SalI 부위에 삽입시켜서 pT7RNAi를 생성시켰다. pGB2Ωinv-hly의 inv 좌위를 함유하는 PstI 단편을 KSII(+)의 PstI 부위로 삽입시켰다. pGB2Ωinv-hly를 주형으로 사용하였으며, 프라이머로는 hly-1: 5'-CCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTA-3'(서열 번호 7) 및 hly-2: 5'-AAGCTTTTAAATCAGCAGGGGTCTTTTTGG-S'(서열 번호 8)을 이용하여 PCR(Pfx DNA 중합 효소, Invitrogen Inc.)을 통해서 HlyA 유전자를 증폭하였으며, KSII(+)/Inv의 EcoRV 부위에 클로닝하였다. Hly-Inv 단편을 BamHI 및 SalI으로 절단하였다. 블런팅(blunting)시킨후, 이를 pT7RNAi의 T7 종결인자 내에 도입된 EcoRV 부위로 결찰시켰다.
박테리아:
본 실험에서 플라스미드 담체로 사용하는 영양 요구성 살모넬라 티피뮤리움 aroA 7207(S. 티피뮤리움 2337-65의 유도체 hisG46, DEL407 [aroA544::TnlO(Tc-s)]를 BAD Stacker 박사(Stanford University, CA)로부터 제공받았다. 에스케리치아 콜라이 XL-1 블루(Strategene)는 상기 플라스미드를 유지시키는데 사용하였다.
개정된 전기천공 프로토콜(1)을 사용하여 SL 7207을 형질전환시켰다. 컴피턴트(competent) SL7207 및 1㎍의 플라스미드를 냉각한 0.2㎝ 전기천공 큐벳내 중에서 얼음사에서 5분간 항온반응시켰다. BioRad Genepulser를 사용하여서 2.5 kV, 25 uF, 200Ω의 임펄스를 가하였다. 예온시킨 SOC 배지 1 ㎖을 첨가하고 박테리아를 37℃에서 225 RPM의 진탕 배양으로 1 시간 동안 회복시키고 선택 한천 평판에 플레이팅하였다. 플라스미드의 존재는 알칼리 용해후 미니프렙 및 0.7% 아가로스 겔 분리를 사용하여 확인하였다.
시험관 내 실험을 위해서, SL7202를 100㎍/㎖의 암피실린이 보충된 루리아 액체 배지(LB)에서 진탕없이 37℃에서 밤새 성장시켰다(SL-siRAS, SL-siGFP 및 SL-siCAT를 위한 것임). 다음날 아침에, 밤새 배양물 중 1%를 새로운 배지에 접종하고 이 박테리아를 새 배지에서 OD600이 0.4∼0.6에 도달할 때까지 성장시켰다. 박테리아를 원심분리(3500 RPM, 4℃)하고, 인산염 완충 염수(PBS)로 한번 세척하였으며 목적하는 농도가 되도록 PBS로 재현탁하였다. 모든 박테리아의 수 및 농도 결정을 위해서, 박테리아 밀도는 분광계로 측정하고 수학식 c = OD6OO * 8×108/㎖에 따라서 산출하였다.
동물 실험을 위해서, 요구되는 경우에 적절한 항생물질을 보충한 BHI(Brain Heart Infusion) 액체 배지(Sigma)에서 밤새 안정하게 SL 7207을 성장시켰다. 박테리아를 세척하고 2.5×l010/㎖의 농도로 PBS로 재현탁하였다. 투여하려는 박테리아의 실제수를 검증하기 위하여 실험 동안 여러번에 걸쳐서 연속 희석을 수행하고 선택 한천에 플레이팅하였다.
제조사의 지침서에 따라서 또한 플라스미드로 BL21DE3 균주(Gene Therapy Systems)를 형질전환시켰다. 100㎍/㎖의 암피실린이 첨가된 BHI 액체 배지에서 37℃에서 박테리아를 성장시켰다. 박테리아의 수는 OD60O 측정법을 사용하여 산출하였다. 세포 감염을 위해서, 밤샘 배양물을 새로운 배지에 접종하고 추가 2 시간 동안 성장시켰다.
세포 배양:
인간 결장암 세포주(SW 480)를 여기서 사용하였다. 이 세포주는 APC 단백질에 돌연변이를 보유하여서 β-카테닌의 기본 농도가 증가되어 있다. 요크색 상피 유래의 안정한 GFP-발현 세포인 CRL 2583(ATCC, Rockville, MD)를 GFP-넉다운 실험에 사용하였다. CRL 2583을 박테리아 감염전 30분까지 200 ㎍/㎖ G418에서 유지시켰다. SW 480 를 10% 태아소 혈청이 보충된 RPMI-1640에서 성장시켰다. 공급자가 추천한 바와 같이, CRL 2583를 15% FBS이 보충된 고농도의 글루코스 및 고농도의 NaHCO3 DMEM에서 성장시켰다. 모든 성장 배지는 통상 항생제로 100 U/㎖ 페니실린 G, lO ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 2.5 ㎍/㎖ 암포테리신이 보강되어 있는 것이다(모든 배지 및 첨가물은 Sigma(St.Louis)에서 구입함).
플라스미드의 직접 형질 감염을 위하여, 500,000 세포를 6 cm 페트리 디쉬에 파종하였으며 밤새 성장시키고 이들을 표준 CaP-공침전 프로토콜을 사용하여 형질감염시켰다.
간단히, 15 ㎍의 플라스미드-DNA를 500 ㎕ 반응 믹스(2×HEPES 완충액, 60 ㎕ CaP)에 혼합하고 FBS가 없는 신선한 배지내 세포에 떨어뜨렸다. 침전물이 세척되어버리기전 9 시간 동안 침전이 계속되도록 하였다. 각각 다른 시간점(36, 48, 60, 72, 및 96 시간)에 세포를 회수하였다.
표준 박테리아 감염 분석법을 위해서, 500,000 세포를 6 cm 페트리 디쉬에 파종하고 밤새 부착하도록 하였다. 박테리아를 첨가하기 전 30분에, 성장 배지를 항생 물질 및 태아 소혈청이 없는 새로운 배지로 교체하였다. 100,500 또는 1000의 지정된 감염다중도(MOI)에 도달하도록 SL 7207-siRAS, -siCAT, -siGFP를 500 ㎕ PBS에 첨가하거나 37℃, 5% CO2의 기본 배양기에서 감염을 수행하였다. 상기 나타낸 감염 기간의 종결까지, 4 ㎖의 무혈청 RPMI 배지로 플레이트를 한번 세척하고 4 ㎖ PBS로 3회 세척하고서, 이후 100 ㎍/㎖의 암피실린 및 150 ㎍/㎖의 젠타마이신을 함유하는 신선한 완전 RPMI 배지 5 ㎖을 첨가하였다. 24시간 후, 최종 농도가 15 ㎍/㎖이 되도록 테트라사이클린을 첨가하였다. 박테리아의 침입 후 상기에서 표시한 각각의 상이한 시간점(24∼96 시간)에, 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석법을 위하여 회수하였다.
세포내 박테리아를 염색하기 위해서 세포를 Lab-Tek II 챔버 슬라이드(Nalgene Nunc, USA) 상에서 성장시켰다. 상기 설명한 바와 같이 박테리아의 침입 후, 세포들을 PBS로 세척하고 1% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정시켰다. 아크리딘 오렌지(Sigma) 용액(0.01%)를 45초간 첨가하고, 이어서 PBS로 세척하였다. 크리스탈 바이올렛 염료(Sigma)를 45초간 가하고, 이어서 PBS로 세척하였다. PERMOUNT™ 고정 배지를 사용하여 커버슬립을 고정시키고 공초점 현미경을 이용하여 침입을 평가하였다.
MTT 분석:
SL 7207-siRAS 및/또는 SL 7207-siCAT로 처리한 후, 세포를 트립신처리하였으며(24 시간 또는 48 시간 후), 희석하여서 5000 세포/웰의 농도로 96-웰 평판에 파종하였다. 세포를 이후 최대 4일간 성장시켰다. 바람직한 배양 시간점에, 배지를 제거하고 100 ㎕의 MTT 용액(5 mg/㎖)을 각 웰에 첨가하였다. 4 시간의 항온반응 기간 후, MTT 용액을 제거하고 100 ㎕의 용해 시약((IsopropanoklN HCl: 10% SDS 43:2:5)을 각 웰에 첨가하여서 세포들을 용해시켰다. 검푸른 포르마잔-산물의 최종 신호를 570 nm 파장에서 광도측정법으로 측정하였다. 색상 형성 양은 웰당 생존한 세포의 수에 좌우되는 것이다.
콜로니 형성 시험:
SL 7207-siRAS 및/또는 SL 7207-siCAT로 처리한 후, 세포를 트립신으로 처리하였으며(24 시간 감염후), 희석하여서 750 세포/웰의 농도로 6-웰 평판에 파종하였다.
이어서 세포를 2주 이상 동안 성장시켜서 가시적인 콜로니가 형성되도록 하였다. 2주 후, 배지를 제거하고 1 ㎖의 지엠사 염료(7.415 g/L)를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 10분간 항온반응 후, 지엠사 염료를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 8 세포 이상의 군을 양성 콜로니로 계산하였다.
웨스턴 블롯:
세포를 냉장 PBS로 세척하고, 긁어 모아서 0.1% 프로테아제 억제제 믹스(Sigma)가 함유된 용해 완충액(5O mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM EGTA, 1% NP-40, 1 mM DTT)내에서 용해시켰다. 20 ㎍의 단백질을 11% SDS-PAGE 겔에서 분리하고 0.4 ㎛ PVDF 멤브레인(Schleicher and Schuell)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 5% 밀크로 블록킹하고 이하 나타낸 농도의 특이적 항체와 1 시간 동안 항온 반응시켰다: Living Colors® 항체(Clontech)-1:500, β-카테닌 항 체(Santa Cruz)-1:500, k-Ras 항체(Santa Cruz)-1:300 및 β-액틴(Santa Cruz)- 1:500. 각각을 홀스래디쉬-퍼옥시다제 접합된 항-토끼 또는 항-염소 2차 항체(Santa Cruz)-1:1000∼1:2000와 항온반응시켰다. ECL® 화학발광 검출 시약(Amersham)을 사용하여 밴드를 검출하였다.
유세포 분석법:
유세포 분석법을 위해서 세포를 3분간 트립신으로 처리하고, 신선한 배지에 재현탁하였으며 PBS로 세척하였다. 원심분리한 후, 세포를 4℃에서 10분간 1% 파라포름알데히드/PBS에 고정시켰다. 유세포 분석법은 FACScan(Becton Dickinson)을 사용하여 수행하였고, 데이타 분석은 CellQuest® 소프트웨어로 수행하였다.
동물 실험:
6 내지 8주령 암컷 GFP+ 트랜스제닉 마우스(CgTg5Nagy)를 Jackson laboratories로부터 얻었다.이들을 표준 설치류 규정식 및 식용수에 자유롭게 접근되는 BIDMC 동물 연구 시설에서 사육하였다. 10주령에 처리를 시작하였다. iv 처리 프로토콜로 50 ㎕ PBS에 용해한 106 cfu의 SL-siRAS 또는 SL-siGFP의 4 용량을 격일로 꼬리 정맥에 주입하였다. 날마다 마우스의 체중을 측정하였으며 질병의 징후를 모니터하였다.
최종 처리 후에 마우스들을 희생시켜서 조직화학용 및 유세포 분석법용 조직 샘플을 취하였다. 조직들을 파라핀에 삽입시키고 조직화학 및 형광 현미경용의 6 ㎛ 스텝으로 절개하였다. 유세포 분석을 위해서, 간세포 및 비장세포 현탁물을 세 포 스트레이너(Falcon)를 사용하여 준비하였다. 장기(organ) 현탁물을 4% 포르마린에 고정시키고 유세포 분석법은 FACScan(Becton Dickinson)을 사용하여 수행하고, 데이타 분석은 CellQuest® 소프트웨어로 수행하였다.
이종이식 암 모델을 위해서, 암컷 BALB/c 누드 마우스(Charles River Laboratories)를 2군(n=6)으로 무작위 분류하였다. 처리 전 3주에, 1×107의 SW480 세포를 피하로 이식하였다. 종양 직경이 약 10 mm에 도달하면 처리를 개시하였다. 처리군의 꼬리 정맥을 통해서 β-카테닌에 대한 shRNA를 발현하는 PBS 중의 1×108 cfu의 E. 콜라이를 주입하였다. 대조군은 E. 콜라이가 shRNA 삽입이 없는 TRIP 벡터를 함유한다는 것을 제외하고는 유사하게 처리하였다. 상기와 같은 처리를 총 3번의 처리에 대해서 5일 마다 수행하였다. 마우스를 마지막 처리 후 5일에 희생시켰다. 실시간 PCR을 통한 β-카테닌 mRNA 분석 및 면역조직화학법을 통한 β-카테닌 단백질 분석을 위해서 조직을 동결 및 고정시켰다.
생체 내 침묵 실험을 위해서, 암컷 C57/BL6 마우스(Charles River Laboratories)를 무작위로 2군으로 나누었다. 처리군에게 β-카테닌에 대한 shRNA를 발현하는 200 ㎕ 인산염-완충 염수(PBS) 중의 5×1010 cfu E. 콜라이를 경구 투여하였다. 대조군은 E. 콜라이가 shRNA 삽입물이 없는 TRIP 벡터를 함유한다는 것을 제외하고는 동일하게 처리하였다. 2번의 독립적인 실험을 사용하는 군당 각각 5 및 6 마우스를 사용하여 수행하였다. 처리는 총 4주간 주당 5 일 동안 날마다 수행하였다. 마지막 처리후 2일에 마우스를 희생시켰고, 조직을 파라핀에 삽입시켰 다.
면역조직화학법:
제조사의 설명서에 따라서 벡타스타인 엘리트 ABC 아미딘-비오틴 염색 키트(Vector laboratories, Burlingame, CA)을 사용하여 6 ㎛ 조직 섹션에 대하여 면역염색법을 수행하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 탈파라핀화시키고 재수화시켰다. 항원 회복을 위해서, 슬라이드를 5 % 우레아 내에서 5분간 마이크로웨이브로 가열하였다. 비특이적 결합 부위를 1% 소혈청 알부민으로 10분간 블록킹시키고 내재성 퍼옥시다제 활성은 10분간 메탄올 중의 3% H2O2를 처리하여 억제하였다. 1:500의 희석비율로 1차 항체인 LIVING COLORS™ 토끼 다클론 항체(Clontech)에 상기 섹션들을 밤새 4℃에서 노출시켰다. 사용한 크로모겐은 3,3'디아미노-엔지딘(DAB)(Vector)이었으며, 헤마톡실린으로 대조염색을 수행하였다.
인터페론 반응 검출법:
1:1000의 MOI로 2시간 동안 인간 β-카테닌 또는 돌연변이 k-Ras에 대한 shRNA를 코딩하는 TRIP로 형질전환된 E. 콜라이로 SW480 세포를 처리하였다. 비처리처리를 대조군으로 사용하였다. 세포들은 24, 48, 및 72시에 회수하였다. OASl, OAS2, MXl , ISGF3γ 및 IFITM1 유전자의 발현 수준은 인터페론 반응 검출 키트 (SBI System Biosciences, CA)를 사용하는 RT-PCR을 통해서 확인하였다.
실시예 1: 시험관 내 및 생체 내의 박테리아 매개 유전자 침묵을 이용한 녹색 형광 단백질의 넉다운
이하 실험들에서, 살모넬라 티피뮤리움 약독화 균주(SL 7207, BAD Stocker(Stanford University)로부터 얻음)를 사용하였다. 일반적인 접근법으로 상기 개념이 유용함을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 다른 살모넬라 티피뮤리움 약독화 균주(VNP 70009, VION Pharmaceuticals(New Haven)로부터 얻음) 및 침입성이며 약독화된 E. 콜라이 균주(BM 2710, P.Courvalin(Institut Pasteur, Paris)으로부터 얻음)를 사용하여 확인 실험을 수행하였다.
침묵자 플라스미드는 시판중인 플라스미드(pSilencer, Ambion)를 기초로 표적 유전자인 GFP, β-카테닌 및 종양성 k-Ras(V12G)이 넉다운되도록 설계하였다. 전기천공을 통해서 이들 플라스미드로 SL 7207을 형질전환시키고 양성 클론은 선택 한천에서의 성장 및 DNA 프렙으로 검증하였다.
시험관 내 사용을 위해서, GFP 발현의 넉다운은 안정한 GFP+ 세포주인 CRL 2598(ATCC, Rockland, Va)을 사용하여 증명하였다. 종양성 k-Ras(V12G) 및 β-카테닌의 넉다운은 결장암 세포주 SW 480 및 췌장암 세포주 CAPAN-1을 사용하여 증명하였다.
침입성 박테리아 균주인 S. 티피뮤리움을 사용하는 박테리아 전달 시스템을 시판중인 진핵세포 전사 플라스미드인 pSilencer(Ambion)를 사용하여 개발하였다. 에스. 티피뮤리움 균주 SL 7207(B. Stacker(Stanford University)로부터 제공받음)를 방향족 아미노산의 합성 경로내 영양 요구성을 통해서 약독화시켰으며, 이는 영양분 결핍으로 인해서 표적 세포에 침입한 후 빠르게 죽게 된다. 이러한 균주는 주로 DNA 백신의 목적으로 시험관 내 및 마우스 모델에서 DNA 전달에 성공적으로 이 용되어 왔었다.
박테리아가 상피 세포로 들어갔음을 확인하기 위해서, 침입 분석법을 수행하였다. SW 480 세포를 2시간 동안 SL-siRAS로 감염시키고 2시간 후 젠타마이신을 처리하였다. 아크리딘 오렌지/크리스탈 바이올렛 염색법으로 침입 효율이 우수함이 확인되었다. SW 480 세포의 90%에서 살아있는 SL 7207 박테리아를 회수하였다. 세포내 박테리아의 평균 수는 6(범위, 2-8)이었다(도 1).(현미경 사진 Al은 전송 이미지이다. 현미경 사진 A2는 형광 이미지이다. 현미경 사진 A3는 병합 이미지이다). 세포내에서 살아있는 박테리아의 수는 시간에 걸쳐서 빠르게 감소하였다. 24 시간 및 48 시간 후, 단지 10% 및 3%의 세포만이 박테리아를 여전히 함유하고 있는 것으로 확인되었다.
다음 실험에서는, GFP+ 세포주에서 GFP 발현의 유효한 감소를 증명하였다. 종양성 유전자 k-Ras 및 β-카테닌의 성공적인 넉다운은 웨스턴 블롯 및 RT-PCR을 사용하여 확인하였다. 종양성 유전자 넉다운으로 성장이 지연되었으며 이종이식 동물 모델에서 종양 형성이 감소되었다.
GFP를 안정하게 발현하는 세포(CRL 2583)는 GFP mRNA를 침묵시키는 서열(SL-siGFP)을 포함하는 pSilencer2.0을 보유한 SL 7207로 감염시켰다(상기 참조). 48 시간 후, SL-siGFP를 처리한 세포들은 SL-siRAS를 처리한 세포 및 비처리 대조군과 비교하여 GFP 발현이 두드러지게 감소하는 것으로 나타났다(도 1b 및 1c). SL-siGFp 처리로 사용된 감염다중도(MOI)에 의존적인 방식으로 GFP 신호가 손실되었다. 비처리 세포에서, 단지 4.3%가 낮게 나타나거나 형광도가 없었다. SL-siGFP 처 리 세포에서, 이 분획은 78.1%(MOI 1:500으로 처리한 경우) 및 92.3%(MOI 1:1000으로 처리함)로 증가하였다. SL-siRAS로 처리한 대조군은 형광도의 약한 손실이 야기되었다(MOI 1:500에서 7.5% 및 MOI 1:1000에서 8.4%). 이는 또한 도 1c의 형광 현미경 사진으로 나타내었다. 상부 현미경 사진은 SL-siRAS의 200배 확대한 사진이고 하부는 SL-siGFP 처리된 CRL 2583 세포(아래)이다. 이러한 발견은 유세포 분석법으로 확인하였다.
GFP를 안정하게 발현하는 마우스를 사용한 일련의 동물 실험에서, 본 발명자들은 GFP-침묵자 플라스미드를 보유한 SL 7207을 경구 및 정맥 투여한 후 간 및 대장에서 GFP 발현이 넉다운되었음을 증명할 수 있었다(상기 두 기관에서 대략 50%의 GFP 발현이 감소함).
동물 실험에서, S. 티피뮤리움을 트랜스제닉 마우스 모델(GFP+)에서 유전자 침묵을 이루는데 사용하였다. 이러한 방법을 사용하여서, 동물 실험에서 트랜스유전자의 침묵은 제한된 독성을 갖는 다양한 기관(간, 위장관 등)의 조직 섹션 및 단백질 농도를 비롯하여 mRNA 농도로 증명하였다.
실시예 2: 박테리아 매개 유전자 침묵을 이용한 k-Ras 및 β-카테닌 의 넉다운
이어서, 특정 질병 관련 유전자를 넉다운시키기 위해서 BMGS를 적용하였다. 인간 결장암 세포주인 SW 480에 존재하는 k-Ras 유전자인 k-Ras V12G에서의 특정 종양유전자 점 돌연변이를 표적으로 하였다.
침묵 플라스미드를 구성한 후 약독화된 SL7207로 일렉트로포레이션하기 전에, CaP 공침전을 이용하여 SW 480 세포로 형질감염시켜 활성을 테스트하였다.
웨스턴 블롯(도 4a)은, 형질감염후 36 시간 및 48 시간에 pSilencer-kras(V12G) 삽입체를 이용한 효과적인 k-Ras의 넉다운을 보여준다. 더욱 후기 시점에서, 단백질 발현이 회복되는데, 이것은 종양유전자 k-Ras가 복제를 유도하는 비형질감염된 클론에 비해 불리한 성장을 나타내는 형질감염된 클론의 성장에 기인하는 것이다. 캐리어로서 SL7207을 사용한 BMGS를 이용하여 넉다운을 매개하는 경우, MOI 1:500 및 1:1000에서 k-Ras 수준이 감소되었다. BMGS를 이용한 k-Ras 단백질의 넉다운은 칼슘-인산염 공침전을 사용한 침묵 플라스미드의 직접 형질감염과 비교하여 유사한 효율로 관찰되었지만, 넉다운의 개시는 12시간 정도 약간 지연되었다. (도 4a). 1:1000의 MOI에서는 이 결과를 더 장시간(최대 72 시간) 동안 관찰할 수 있다(도 2a).
β-카테닌에 대한 웨스턴 블롯 결과 (도 4b)는 형질감염 후 넉다운 지연을 보여주며, 최대 효과는 형질감염 96 시간 후에 관찰된다. 이러한 지연은 플라스미드가 유리되기 전에 세포 내에서 SL7207의 생존 시간에 의해 유발되는 것으로 추정된다(도 2a).
SL-siRAS의 처리 및 생성되는 종양유전자 k-Ras(V12G)의 넉다운 후에, SW 480 세포의 생존력과 콜로니 형성 능력이 유의적으로 감소하였다(도 2a). SL-siRAS 및 SL-siCAT 박테리아 동량(2.5 x 108)과 함께 세포를 동시배양하였다. 대조군 세포 를 형질감염된 SL 207로 처리하였다. 형질감염 48 시간 후에, MTT 테스트를 위해 96 웰 평판, 콜로니 형성 분석을 위해 6 웰 평판에 세포를 접종하였다. 처리 120 시간 후에, MTT 분석에 의해 평가되는 생존력은 SL-siRAS 처리 후 62.5%로, SL-siCAT 처리 후 51%로 감소하였다. 병용 처리하면 생존력이 대조군 처리 세포의 29%로 추가 감소되었다. SL-siRAS 처리 및 SL-siCAT 처리는 콜로니를 형성하는 SW 480의 능력을 각각 37.7% 및 50% 감소시켰다. 병용 처리하면 63.3% 감소되었다.
또한, SL-RAS 처리는 누드 마우스로 피하 주사한 경우 SW 480 세포의 종양 형성 능력을 완전히 억제한 반면, 빈(empty) SL 7207의 처리는 종양 형성 능력에 영향을 미치지 않았다(도 2c). SW 480 세포(미처리, SL 7207 또는 SL-siRAS로 처리)를 누드 마우스에 피하 주사하였다(4 x 106 세포, n = 1군당 4마리). SL-siRAS 전처리는 종양을 형성하는 능력을 완전히 제거하였다(4마리 동물 중 어떤 동물에서도 종양이 관찰되지 않았다, 40일)(도 2c).
이 방법이 보편적으로 사용될 수 있는지를 테스트하기 위해서, 또 다른 암 관련 유전자인 β-카테닌을 표적으로 하였다(도 2a). β-카테닌의 기본 농도는 돌연변이된 APC-유전자 때문에 SW 480 세포에서 높지만, pSilencer(siCAT) 형질감염후에 헤어핀 siRNA로 처리하면 감소시킬 수 있다(도 2a). β-카테닌 구성체와 pSilencer를 보유하는 SL 7207(SL-siCAT)로 처리한 후에, β-카테닌 발현의 유의적인 넉다운이 실현되었으며, 그 결과 생존력과 콜로니 형성 능력이 감소되었다(도 2a). β-카테닌은 96 시간부터 넉다운되었으며, 144 시간 이후 회복되었다.
실시예 3: 생체내 박테리아 매개 유전자 침묵
RNAi의 박테리아 매개법으로 인해 일정 시점에서 하나보다 많은 유전자를 선택적으로 표적화할 수 있는 가능성이 생겼으며, 이는 미래의 적용, 예컨대 복수 종양유전자 경로 간섭을 통한 항암 치료에 대한 효율을 증가시킨다. 그러한 접근법의 실현 가능성을 테스트하기 위해서, 돌연변이된 k-Ras 종양유전자 및 β-카테닌을 동시에 표적화하였다. SL-siRAS 및 SL-siCAT로 동시 처리한 후에, 단백질 수준에서 양 유전자의 넉다운이 관찰되었으며, 그 결과 생존력 및 콜로니 형성 능력이 추가로 감소되었다(도 2). 이러한 발견은 제안한 박테리아 매개 유전자 침묵의 구상을 상이한 세포주 내에서 상이한 표적 유전자에 대해 시험관내에서 성공적으로 이용할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
이 접근법을 생체 내 표적 유전자를 침묵시키는 데 사용할 수 있는지를 테스트하기 위해서 마우스 모델을 선택하였다. CgTg5-Nagy 마우스는 모든 조직에서 GFP를 높은 수준으로 발현한다. 14 마리의 마우스(1군당 7 마리)를 무작위로 선정하여 격일로 SL-siGFP 또는 SL-siRAS 106 cfu를 4회 정맥내 주사하였다. 체중 감량이나 임상적으로 명백한 질병 징후 없이 상기 처리를 잘 용인하였다. 모든 마우스를 최종 처리 1일 후에 사망시켰다.
형광 현미경 및 GFP 항체를 이용한 면역조직화학으로 간 조직 슬라이드를 평가하였다. (도 3a). SL-siGFP의 정맥내 처리 결과 SL-siRAS 처리된 대조군 동물과 비교하여 처리 동물의 간 절편에서의 형광이 감소되었다. 항-GFP 항체를 이용한 조 직화학 염색으로, 형광성 변화는 GFP 감소에 의해 일어나는 것이며 배경 형광 수준 변화에 의해 일어나는 것이 아님을 입증하였다. (도 5). 처리 마우스의 간 절편에서의 형광 감소가 배경 형광 변화에 기인하는 것이 아니라 실제로 GFP 발현 수준 변화에 기인하는 것임을 입증하기 위해서, 조직 슬라이드를 GFP 특이적 항체로 염색하였다.
면역조직화학 염색 패턴은 형광 현미경 이미지와 상관관계가 높으며, GFP 발현 감소에 의해 형광 변화가 일어나는 것임을 입증한다. 대조군 동물(상열) 및 iv 처리 동물(하열)로부터 얻은 간 절편의 형광 현미경(50x) 및 상응하는 면역조직화학 이미지(50x).
염색 패턴은 형광 이미지와 상관관계가 높았다. 후속 이미지 분석 결과, SL-siGFP 처리 후에 9∼25%의 GFP 발현 세포 수 감소가 확인되었다. 이들 발견은 간세포의 단세포 현탁액의 유세포 분석법으로 확인되었으며, SL-siRAS 처리 동물에 비하여 SL-siGFP 처리 동물에서 GFP-양성 간세포 수가 유의적으로 감소한다는 것을 보여주었다. (도 3b). 간세포 및 비장세포 현탁액의 유세포 측정법을 실시하였다. SL-siGFP의 정맥내 처리 후에, GFP + 간세포 수는 대조군 처리 동물(SL-siRAS)과 비교하여 유의적으로 감소하였다(SL-siRAS: 50.0% [45.4-53.2%], SL-siGFP: 39.9% [26.1-53.2%], p<0.05).
이러한 결과는, 상기 방법을 사용하여 유의적인 유전자 침묵을 생체 내에서 실현할 수 있다는 것을 제시한다. 약독화된 S. 티피뮤리움을 정맥 내 투여하면, 시험관 내 발견을 마우스 모델로 확장할 수 있으며, 간에서 유의적인 유전자 침묵을 실현할 수 있다. 상이한 침입성 박테리아 균주 또는 상이한 투여 경로를 이용하여 다른 장기에도 적용할 수 있다. 상피 계통 세포와 비교하여 전문 식세포에 대한 형질감염 효율이 더 높은 것으로 보고된 바 있기 때문에, 특히 전문 식세포가 박테리아 매개 유전자 침묵에 대한 유망한 표적이 될 것이다.
실시예 4: 트랜스킹덤 RNA 간섭
고등 유기체에서의 박테리아 매개의 RNAi의 사용은 C. 엘레간스에서 이전에 입증된 바와 같이 포유동물계의 기능성 게놈 및 다른 생체내 RNAi 적용 가능성을 가진다. 이러한 가능성을 조사하기 위해서, TRIP(트랜스킹덤 RNA 간섭 플라스미드)라고 명명된 박테리아 플라스미드 pT7RNAi-Hly-Inv를 구성하였다(도 6a). 신규한 플라스미드 구성체에서, 포유류 프로모터 또는 인헨서보다는 박테리오파지 T7 프로모터 하에 shRNA를 발현시켰다(Milligan 및 Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989) 및 Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8783-8798 (1987)). shRNA는 오직 박테리아계에서 생산될 수 있다. TRIP 벡터는 침입성을 코딩하는 Inv 유전자좌를 포함하여(Isberg et al., Cell 50, 769-778 (1987)), 비칩입성 E. 콜라이를 β1-인테그린-양성 포유동물 세포로 진입시킨다(Young et al., J. Cell Biol. 116, 197-207 (1992)). TRIP 벡터는 또한 리스테리오리신 O를 코딩하는 Hly A 유전자를 포함하여 유전자 물질을 진입 소낭으로부터 빠져나오게 한다(Mathew et al., Gene Ther. 10, 1105-1115 (2003) 및 Grillot-Courvalin et al., Nat. Biotechnol. 16, 862-866 (1998)). shRNA를 발현하는 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 비병원성 E. 콜라이 BL21DE3의 컴피턴트 균주로 TRIP 구성체를 도입하였다. 예로서 암 유전자 β- 카테닌에 대한 TRIP를 구성하였다. 과발현으로부터 유래하는 β-카테닌 경로 활성화 또는 β-카테닌의 종양유전자 돌연변이는 대부분의 결장암의 개시의 원인이 되며, 각종 다른 종류의 암과 연관되어 있다(Kim et al., Oncogene 24, 597-604 (2005)). 암 치료제로서 β-카테닌의 가능성에도 불구하고, β-카테닌 경로는 소분자에 의한 억제에 대해서는 저항성이 있다. β-카테닌은 보통 암세포에서 안정화되기 때문에 신규한 RANi 방법의 유효성을 테스트하기 위한 구상 실험 증거로서 β-카테닌이 바람직한 선택이다. 박테리아가 각종 관심 유전자에 대해 간섭 RNA를 발현하도록 TRIP를 변형시킬 수 있다.
상기한 트랜스킹덤 시스템을 통해 유전자 침묵을 실현할 수 있는지를 결정하기 위해서, 인간 결장암 세포(SW 480)를 2 시간 동안(도 6b 및 6d) 또는 상이한 시간 동안(도 6c) 시험관 내에서 E. 콜라이와 함께 공배양한 후, 항생제로 처리하여 세포외 박테리아를 제거하였다. 유전자 침묵 분석을 위해 수거하기 전에 48 시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 도 6b 내지 6d에 도시된 바와 같이, β-카테닌은 단백질 및 mRNA 수준에서 유효하게 특이적으로 침묵된 반면에, β-액틴, k-Ras, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)는 영향을 받지 않았다. 트랜스킹덤 RNAi의 특이성을 추가로 테스트하기 위해서, 돌연변이 k-Ras (코돈 12에서 GGT → GTT)에 대한 TRIP를 함유하는 E. 콜라이는 동일한 코돈 12 돌연변이를 가지는 SW 480 세포에서 k-Ras 발현을 침묵시켰지만, 상이한 코돈에서 돌연변이된 k-Ras (코돈 13에서 GGC → GAC, 도 6e)를 가지는 DLD1 세포에서는 침묵시키지 못하였다. shRNA 대조군으로서, 야생형 k-Ras에 대한 TRIP를 함유하는 E. 콜라이는 SW 480 세포에서 돌연변이된 k-Ras에 대한 유전자 침묵 효과를 발휘하지 못하였다(도 6f). 이들 결과는 트랜스킹덤 RNA 간섭이 고도로 유전자 특이적이며, 점 돌연변이를 구별하는 데 충분하다는 것을 보여준다.
트랜스킹덤 시스템에 의한 유전자 침묵 효과에 영향을 주는 변수를 조사하기 위해서, 상이한 감염다중도(MOI)로 이.콜라이와 세포를 2 시간 동안 배양하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 유전자 침묵 효과는 MOI에 따라 달라지며, 1:1,000의 MOI에서 거의 완전한 유전자 침묵이 일어났다. 유전자 침묵에 대한 공배양 시간의 효과를 결정하기 위해서, 시간을 달리하여 MOI 1:500으로 E. 콜라이와 세포를 배양하였다. 도 6c에 도시된 바와 같이, 유전자 침묵 효과는 최대 2 시간까지 배양 시간에 따라 증가하였다. MOI 및 공배양 시간에 대한 유전자 침묵의 의존성은 각종 적용예에서 유전자 침묵에 대해 제어가능한 유연성을 제공한다.
β-카테닌 유전자가 shRNA에 의해 특이적으로 매개되는지를 추가로 확인하기 위해서, 5'-RACE(cDNA 말단 급속 증폭) PCR 방법을 사용하여 β-카테닌 mRNA의 특이적 분해 단편의 동정을 시도하였다. RNAi 매개 유전자 침묵의 구체적인 특징은 shRNA 서열로부터 추정되는 바와 같이 mRNA의 특정 부위에서의 β-카테닌 mRNA의 분해이다. 시간 경과에 따른 β-카테닌 침묵 과정에 기초하여(도 7a), 분해된 mRNA 단편을 동정하기 위해 β-카테닌에 대한 shRNA를 발현하는 E. 콜라이로 처리한 지 8 시간 및 16 시간 후에 전체 RNA를 SW 480 세포로부터 분리하였다. shRNA를 발현하는 E. 콜라이 세포로 처리한 지 8 시간 정도로 이른 시기에 분해된 β-카테닌 mRNA를 발견하였다: 대조군에서는 어떤 단편도 검출되지 않았다(도 7b 및 7c). β- 카테닌 mRNA의 분해된 중간체의 서열 분석 결과 표적 서열 내에 위치한 분해 부위가 확인된다. 이 결과는 박테리아가 생산한 shRNA가 RNAi 매개 유전자 침묵을 통한 β-카테닌 mRNA의 특이적 분해를 촉발한다는 것을 보여준다.
인터페론 반응의 유도는 일부 RNAi 접근법의 특이성에 대한 유효한 도전인 것으로 보고된 바 있다(Bridge et al., Nat. Genet. 34, 263-264 (2003) 및 Hornung et al., Nat. Med. 11, 263-270 (2005)). 트랜스킹덤 RNAi가 유도한 유전자 침묵이 인터페론 반응 유도와 관련된 것인지를 테스트하기 위해서, 주요 인터페론 반응 유전자를 선정하였다. 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OASl 및 OAS2)는 바이러스 감염 후에 세포 단백질 합성을 억제하는 중요한 인터페론 매개 유전자이다. 인터페론 유도 믹소바이러스 내성 단백질 패밀리(MX 단백질)의 구성원인 MX1 유전자는 RNA 바이러스에 대한 선천적인 숙주 방어에 관여한다. 인터페론 유도성 경막 단백질의 구성원인 IFITM1은 인터페론의 항증식 활성을 매개한다. ISGF3γ는 인터페론 유도 전사 조절 및 자극에 관여하는 세포 인터페론 수용체의 일부이다. 이들 유전자는 간섭 RNA에 의한 인터페론 반응 유도를 분석하기 위한 표준 패널로서 사용되어 왔다(Interferon Response Detection Kit, 미국 캘리포니아주의 SBI Systems Biosciences). 5개의 인터페론 반응 유전자의 mRNA를 반정량적 RT-PCR로 분석하였다. 도 7d에 도시된 바와 같이, β-카테닌에 대한 shRNA를 코딩하는 E. 콜라이로 처리한 후에 OASl, OAS2, MXl, ISGF3γ 및 IFITM1의 유도는 전혀 관찰되지 않았다. 이들 데이타는, 트랜스킹덤 RNAi에 의해 유도된 유전자 침묵이 비특이적 인터페론 반응 유도와 무관하다는 것을 제시한다.
트랜스킹덤 RNAi 전달 기전을 조사하였다. E. 콜라이의 세포 진입이 RNAi 유도에 필요한 지를 결정하기 위해서, Inv 유전자좌의 존재 또는 부재 하에서 E. 콜라이의 유전자 침묵 활성을 비교하였다. Inv는 E. 콜라이의 세포 내로의 진입을 용이하게 하는 β1-인테그린과 상호작용하는 인베이신(invasin)을 코딩한다. 예상한 대로, Inv를 포함하지 않는 E. 콜라이는 세포로 진입하지 못하였다(도 8a). 놀랍게도, E. 콜라이가 결장암 세포로 진입하는 데 Inv만으로는 불충분하며(도 8a), 세포내 박테리아의 부재 하에서는 검출가능한 유전자 침묵이 관찰되지 않았다(도 8b). 전달된 유전자 물질이 진입 소낭으로부터 빠져나오는 것을 촉진하는 것으로 생각되는 Hly A 유전자를 도입하였다(Grillot-Courvalin et al., Nat. Biotechnol. 16, 862-866 (1998)). 예상한 바와 같이, Hly만으로는 E. 콜라이의 세포 진입이 가능하지 않았으나, Inv 및 Hly를 포함하는 공생 E. 콜라이는 고 효율로 결장암 세포로 진입하였다(도 8a). 이들 조건 하에서 β-카테닌은 최대 96 시간 동안 강력하게 침묵되었다(도 8c). 이들 결과는 E. 콜라이가 세포로 진입하여 트랜스킹덤 RNAi를 유도하기 위해서는 Inv 및 Hly 둘다 필요로 한다는 것을 제시한다.
유전자 침묵이 표적 세포 내에서 계속적인 박테리아 복제를 필요로 하는지를 결정하기 위해서, 테트라사이클린을 사용하여 세포내 박테리아 복제를 차단하고 젠타마이신을 이용하여 세포외 박테리아를 제거하였다. SW 480 세포를 2 시간 동안 E. 콜라이와 함께 배양한 후 상이한 시점에서 테트라사이클린 처리를 개시하였다. 도 8d에 도시된 바와 같이, 초기 2 시간의 감염 기간 후에, 테트라사이클린 없이 추가로 2 시간 배양하여 거의 최대의 유전자 침묵을 유도하였으며; 테트라사이클린 처리의 추가 지연은 유전자 침묵도에 대한 추가의 증가 효과를 나타내지 않았다. 놀랍게도, 6 시간 및 48 시간 째에 테트라사이클린의 부재 하에 유의적인 세포내 박테리아 복제가 일어난다는 증거는 없었으며(도 8e), 이것은 리소솜과 다른 세포내 항박테리아 기전의 영향에 기인하는 것으로 보인다(Roy et al., Science 304, 1515-1518 (2004) 및 Battistoni et al., Infect. Imnmn. 68, 30-37 (2000)). 이들 결과는 트랜스킹덤 RNAi가 초기 감염(2 시간) 및 배양 시간(2 시간) 후 표적 세포 내에서의 지속적인 박테리아 복제에 의존하지 않는다는 것을 보여준다.
이어서, 트랜스킹덤 RNAi 접근법이 생체 내에서도 작용하는 지를 결정하였다. β-카테닌에 대한 shRNA를 발현하는 E. 콜라이를 마우스에게 경구 투여하였다. 5 x 1010 접종원을 1주 5회 경구 투여하였는데, 이 양은 프로바이오틱 E. 콜라이 Nissle 1917의 인간 투여량과 유사한 양이다. 접종원의 대부분은 상부 GI관의 박테리아 환경을 통과하는 과정에서 제거된다. 마우스 β-카테닌에 대한 shRNA를 발현하는 E. 콜라이 또는 상응하는 플라스미드 벡터를 포함하는 E. 콜라이로 마우스를 처리하였다. 이 처리를 4 주간 계속한 후 면역조직화학으로 유전자 침묵을 분석하였다. 도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이, β-카테닌 발현은 β-카테닌 shRNA를 발현하는 E. 콜라이에 의한 장 상피에서는 침묵하였으나(P < 0.01), 대조군 E. 콜라이에서는 그렇지 않았다. 대조군으로서, GAPDH 발현은 감소되지 않았다(도 10). 유전자 침묵 효과는 페이어판 부분 또는 그 인접 부분에서 더욱 현저하였다(도 9b). 전반적인 또는 현미경적인 상피 손상 또는 궤양 징후 없이 상기 처리가 잘 관용되었 다(도 9b). 이들 결과는 포유동물이 생체 내에서 강력한 국소 RNAi로 특정 shRNA를 발현하는 E. 콜라이에 반응한다는 것을 제시한다.
트랜스킹덤 RNAi 접근법을 조사하여 이 접근법을 전신 투여 후에 질병 유전자를 침묵시키는 데 사용할 수 있는 지를 결정하였다. 치료 박테리아를 정맥내 투여하여 암 환자에서 안전성이 입증된 임상 시험으로 테스트하였다(Toso et al., J. Clin. Oncol. 20, 142-52 (2002)). 이종이식된 인간 결장암을 보유한 누드 마우스에게 인간 β-카테닌에 대한 shRNA를 코딩하는 E. 콜라이 108 cfu를 정맥내 주사하였다. 5일 간격으로 3회 투여하였다. 이 처리는 부작용 없이 잘 관용되었다. 도 9에 도시한 바와 같이, β-카테닌에 대한 shRNA를 코딩하는 E. 콜라이로 처리하면 종양 조직에서 β-카테닌 mRNA (p<0.005, 도 9d) 및 단백질 (p<0.01, 도 9d 및 9e)이 유의적으로 감소되었다. 이들 데이타는 박테리아 매개 트랜스킹덤 RNAi가 전신 투여 후 체내 원부위의 질병 유전자를 침묵시킬 수 있다는 것을 제시한다.
이들 결과는 트랜스킹덤 시스템을 통해 유전자 침묵을 실현할 수 있다는 것을 보여준다. 중요한 것은, RNAi의 효능 및 특이성이 보존된다는 것이다. 비병원성 E. 콜라이는 안전성이 입증된 프로바이오틱스로서 임상에 사용하여 왔다. (Rembacken et al., Lancet 354, 635 (1999)). 따라서, 트랜스킹덤 시스템은 의학 적응증을 위해 RNA 간섭을 전달하는 실질적이고 임상적으로 적합한 방식을 제공한다. E. 콜라이를 기반으로 하는 RNAi 기법은 RNAi 기반의 유전자 작용 연구를 수행하기 위한 편리한 벡터계를 또한 제공한다. 마지막으로, 이들 결과는 공동 서식, 감염 또는 공생 조건 하에서 간섭 RNA의 교환이 자연적으로 일어날 수 있다는 흥미로운 가능성을 불러일으킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Beth Israel Deaconess Medical Center <120> Compositions For Bacterial Mediated Gene Silencing And Methods Of Using Same <130> 25627-502-061 <140> PCT/US05/045513 <141> 2005-12-16 <150> US 60/637,277 <151> 2004-12-17 <150> US 60/651,238 <151> 2005-02-08 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 1 gatcccgttg gagctgttgg cgtagttcaa gagactacgc caacagctcc aacttttttg 60 gaaa 64 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 2 agcttttcca aaaaagttgg agctgttggc gtagtctctt gaactacgcc aacagctcca 60 acgg 64 <210> 3 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 3 gatcccagct gatattgatg gacagttcaa gagactgtcc atcaatatca gctttttttg 60 gaaa 64 <210> 4 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 4 agcttttcca aaaaaagctg atattgatgg acagtctctt gaactgtcca tcaatatcag 60 ctgg 64 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 5 gatcccgacg taaacggcca caagtttcaa gagaacttgt ggccgtttac gtcttttttg 60 gaaa 64 <210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 6 agcttttcca aaaaagacgt aaacggccac aagttctctt gaaacttgtg gccgtttacg 60 tcgg 64 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 7 ccctcctttg attagtatat tcctatctta 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized primer <400> 8 aagcttttaa atcagcaggg gtctttttgg 30

Claims (52)

  1. 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자, 원핵생물 프로모터, 하나 이상의 HlyA 유전자 및 하나 이상의 Inv 좌(locus)를 포함하는 원핵생물 벡터를 포함하고, 이. 콜라이인 침입성 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 포유동물에서 암 또는 세포 증식성 질환의 치료 또는 예방용인 침입성 박테리아로서, 세포 증식을 증가시키는 것으로 공지된 세포 내에서 하나 이상의 유전자는 상기 침입성 박테리아의 도입에 의해 조절되는 것인 침입성 박테리아.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 침입성 박테리아는 비병원성 또는 비독성 박테리아인 침입성 박테리아.
  4. 제1항에 있어서, 상기 원핵생물 프로모터는 T7 프로모터인 침입성 박테리아.
  5. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항의 하나 이상의 침입성 박테리아 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 포유동물에서 암 또는 세포 증식성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물로서, 세포 증식을 증가시키는 것으로 공지된 세포 내에서 하나 이상의 유전자는 상기 세포 내에 상기 침입성 박테리아의 도입에 의해 조절되는 것인 약학 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 침입성 박테리아.
  7. 제2항에 있어서, 상기 세포는 결장암 세포 또는 췌장암 세포인 침입성 박테리아.
  8. 제7항에 있어서, 상기 결장암 세포는 SW 480 세포이거나, 또는 상기 췌장암 세포는 CAPAN-1 세포인 침입성 박테리아.
  9. 제2항에 있어서, 상기 암은 결장암인 침입성 박테리아.
  10. 제2항에 있어서, 상기 세포 증식성 질환은 가족성 선종성 용종증(FAP)인 침입성 박테리아.
  11. 하나 이상의 siRNA를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자, 하나 이상의 원핵생물 프로모터, 하나 이상의 HlyA 유전자 및 하나 이상의 Inv 좌(locus)를 포함하는 원핵생물 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 원핵생물 프로모터는 T7 프로모터인 원핵생물 벡터.
  13. 청구항 13은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제5항에 있어서, 상기 원핵생물 프로모터는 T7 프로모터인 약학 조성물.
  14. 제5항에 있어서, 상기 유전자는 ras 또는 β-카테닌인 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 ras는 k-Ras인 약학 조성물.
  16. 제5항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 약학 조성물.
  17. 제5항에 있어서, 상기 세포는 결장암 세포 또는 췌장암 세포인 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 결장암 세포는 SW 480 세포이거나, 또는 상기 췌장암 세포는 CAPAN-1 세포인 약학 조성물.
  19. 제5항에 있어서, 상기 암은 결장암인 약학 조성물.
  20. 제5항에 있어서, 상기 세포 증식성 질환은 가족성 선종성 용종증(FAP)인 약학 조성물.
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WO (1) WO2006066048A2 (ko)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7611885B2 (en) 2003-06-24 2009-11-03 Engeneic Molecular Delivery Pty, Ltd. Pharmaceutically compatible method for purifying intact bacterial minicells
DE602004031870D1 (de) 2003-12-09 2011-04-28 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Gezielte genabgabe an nicht-phagozytische säugetierzellen über bakteriell erhaltene intakte minizellen
EP2992901B1 (en) 2004-02-02 2019-10-23 EnGeneIC Molecular Delivery Pty Ltd Compositions and methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells
US8772013B2 (en) 2004-02-02 2014-07-08 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells
EP1773303A2 (en) 2004-05-25 2007-04-18 Chimeracore, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
PT2386640E (pt) 2004-08-26 2015-05-18 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Distribuição de ácidos nucleicos funcionais a células de mamífero através de minicélulas intactas, bacterialmente derivadas
EP1838838B1 (en) 2004-12-17 2010-09-01 Beth Israel Deaconess Medical Center Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using same
EP2018156B1 (en) 2006-04-07 2010-03-17 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
EP2712618B1 (en) * 2006-06-23 2016-10-19 EnGeneIC Molecular Delivery Pty Ltd. Targeted delivery of drugs, therapeutic nucleic acids and functional nucleic acids to mammalian cells via intact killed bacterial cells
CN1974759B (zh) * 2006-07-26 2010-06-09 吉林大学 运载重组质粒的减毒沙门氏菌及其在抗肿瘤中的应用
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US20080311081A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Johannes Fruehauf Bacteria mediated gene silencing
CN102149826A (zh) * 2007-06-29 2011-08-10 波士顿生物医药公司 通过微小rna装置进行细菌介导的基因调节
CA2704737A1 (en) * 2007-09-18 2009-09-03 Intradigm Corporation Compositions comprising k-ras sirna and methods of use
US9730968B2 (en) 2008-04-17 2017-08-15 Anaeropharma Science, Inc. Therapeutic agent for ischemic diseases
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
WO2010039536A2 (en) 2008-09-23 2010-04-08 President And Fellows Of Harvard College Sirt4 and uses thereof
WO2010057009A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Cequent Pharmaceuticals, Inc. E. coli mediated gene silencing of beta-catenin
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US20110097329A1 (en) 2009-06-26 2011-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for treating cancer and modulating stress granule formation
US8268550B2 (en) 2009-06-26 2012-09-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for identification of PARP function, inhibitors, and activators
US20120009153A1 (en) * 2009-08-13 2012-01-12 Hongnian Guo Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using the same
EP2483407A2 (en) 2009-09-30 2012-08-08 President and Fellows of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-enhancing gene products
KR101850162B1 (ko) 2010-01-29 2018-04-18 가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스 형질전환용 플라스미드
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9248176B2 (en) 2010-10-07 2016-02-02 The Texas A&M University System Controlled release vaccines and methods for treating Brucella diseases and disorders
WO2012096960A2 (en) 2011-01-10 2012-07-19 The Regents Of The University Of Michigan Stem cell factor inhibitor
US20150018408A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
WO2013001372A2 (en) 2011-06-30 2013-01-03 University Of Oslo Methods and compositions for inhibition of activation of regulatory t cells
WO2013005108A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Sykehuset Sorlandet Hf Egfr targeted therapy
WO2013036973A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
EP2935333A1 (en) 2012-12-21 2015-10-28 Sykehuset Sorlandet HF Egfr targeted therapy of neurological disorders and pain
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
JP2015022042A (ja) * 2013-07-17 2015-02-02 国立大学法人 東京大学 単一細胞を解析するための顕微鏡システム、単一細胞の解析方法及び解析用キット
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US9834768B2 (en) 2014-12-31 2017-12-05 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Effective method for specific gene silencing using artificial small RNA
US10988765B2 (en) 2015-08-27 2021-04-27 The General Hospital Corporation Methods and compositions for inhibiting detoxification response
GB201519734D0 (en) 2015-11-09 2015-12-23 Univ Swansea Cancer therapy
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CA3058474A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Sivec Biotechnologies, Llc A transkingdom platform for therapeutic nucleic acid delivery
CA3069523A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
KR20210030973A (ko) 2018-07-11 2021-03-18 액팀 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드 조작된 면역자극성 박테리아 균주 및 이의 용도
EP3844276A2 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
JP6993693B2 (ja) * 2018-10-01 2022-02-21 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株とその利用
JP7441534B2 (ja) * 2019-01-09 2024-03-01 エムディー ヘルスケア インコーポレイテッド ロドコッカス属細菌由来ナノ小胞およびその用途
CA3131017A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
IL292836A (en) 2019-11-12 2022-07-01 Actym Therapeutics Inc Platforms for administering bacteria that stimulate the immune system and their use for administering therapeutic products
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
CA3191433A1 (en) 2020-08-12 2022-02-17 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria-based vaccines, therapeutics, and rna delivery platforms
WO2023086796A2 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
JP2000500734A (ja) * 1995-09-06 2000-01-25 アメリカ合衆国 細菌送達系
AU750106B2 (en) * 1997-10-07 2002-07-11 University Of Maryland Biotechnology Institute Method for introducing and expressing RNA in animal cells
US6143551A (en) * 1997-12-29 2000-11-07 Schering Aktiengesellschaft Delivery of polypeptide-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated listeria suicide bacteria
US6066500A (en) * 1999-06-25 2000-05-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Beta catenin expression
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US20030124513A1 (en) * 2001-05-29 2003-07-03 Mcswiggen James Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of HIV
US20060051789A1 (en) 2004-07-01 2006-03-09 Somagenics, Inc. Methods of preparation of gene-specific oligonucleotide libraries and uses thereof
PT2386640E (pt) 2004-08-26 2015-05-18 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Distribuição de ácidos nucleicos funcionais a células de mamífero através de minicélulas intactas, bacterialmente derivadas
EP1838838B1 (en) 2004-12-17 2010-09-01 Beth Israel Deaconess Medical Center Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using same
EP2712618B1 (en) 2006-06-23 2016-10-19 EnGeneIC Molecular Delivery Pty Ltd. Targeted delivery of drugs, therapeutic nucleic acids and functional nucleic acids to mammalian cells via intact killed bacterial cells
US20080311081A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Johannes Fruehauf Bacteria mediated gene silencing

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Int J Oncol. 2004 Mar;24(3):615-21.

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016138108A (ja) 2016-08-04
AU2005316458B2 (en) 2011-04-07
KR20070091199A (ko) 2007-09-07
JP2008092956A (ja) 2008-04-24
JP5601756B2 (ja) 2014-10-08
DE602005023345D1 (de) 2010-10-14
US9181546B2 (en) 2015-11-10
EP1838838B1 (en) 2010-09-01
WO2006066048A3 (en) 2006-09-14
CA2591565C (en) 2014-06-10
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CA2591565A1 (en) 2006-06-22
WO2006066048A2 (en) 2006-06-22
US20090123426A1 (en) 2009-05-14
US20120093773A1 (en) 2012-04-19
US20160369282A1 (en) 2016-12-22
ATE479740T1 (de) 2010-09-15
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JP2008523812A (ja) 2008-07-10
JP2014221067A (ja) 2014-11-27

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