ES2351416T3 - Composiciones para el silenciamiento génico mediado por una bacteria y procedimientos para la utilización de las mismas. - Google Patents

Abstract

Bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariótico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en el que dicha bacteria invasiva es E. coli.

Description

ANTECEDENTES [0001] El silenciamiento génico mediante ARNip (interferencia del ARN) mediante la utilización de ARNs interfirientes pequeños (ARNip) se ha convertido en una potente herramienta para la biología molecular y presenta el potencial de ser utilizado para el silenciamiento génico terapéutico. También se ha demostrado que horquillas cortas de ARN (ARNhc) transcrito a partir de plásmidos pequeños de ADN dentro de la célula diana median en el silenciamiento génico estable y consiguen la inactivación génica a niveles comparables a los obtenidos mediante transfección con ARNip sintetizado químicamente (T.R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296:550, 2002; P.J. Paddison, A.A. Caudiy, G.J. Hannon, PNAS 99:1443, 2002). [0002] Las posibles aplicaciones para el ARNi con fines terapéuticos son amplias y entre ellas se incluye el silenciamiento e inactivación de genes de enfermedad, tales como oncogenes o genes víricos. Un obstáculo importante para el uso terapéutico del ARNi es la administración del ARNip en la célula diana (Zamore P.D., Aronin N., Nature Medicine 9(3):266-8, 2003). De hecho, se ha descrito la administración como el principal obstáculo actual del ARNi (Phillips Sharp, citado por Nature news feature, vol. nº 425, páginas 10 a 12, 2003). [0003] Se han descrito dos métodos que pueden utilizarse en modelos de ratón:

(1)

La inyección intravenosa hidrodinámica directa de ARNip o de plásmidos codificantes de ARNhc: utilizando este método varios autores han descrito la aplicación de ARNi contra diversas condiciones, por ejemplo la hepatitis B (A.P. McCaffrey et al., Nat. Biotechnol. 21(6):639-44, junio de 2003), la hepatitis fulminante (E. Song, S.K. Lee, J. Wang, N. Ince, J. Min, J. Chen, P. Shankar, J. Lieberman, Nature Medicine 9:347, 2003), xenoinjerto tumoral (Spaenkuch B. et al., JNCl 96(1):862-872, 2004), expresión transgénica hepática (D.L. Lewis, J.E. Hagstrom, A.G. Loomis, J.A. Wolff, H. Hereijer, Nature Genetics 32:107, 2002; D.R. Sorensen DR, M. Leirdal, M. Sioud, JMB 327:761, 2003). Este método utiliza una inyección a alta presión y de volumen elevado (2,5 ml) en la vena de la cola del ratón. El mecanismo de incorporación de ARNip/ADN en las células no está claro pero probablemente se encuentra implicado el daño mecánico a la capa endotelial vascular. Una clara desventaja de este método no es un método que pueda desarrollarse en una aplicación humana debido a que implica una carga de volumen masiva y un mecanismo de acción completamente desconocido.

(2)

La inyección directa en el tejido diana (cerebro) de un vector adenovírico codificante de ARNip (H. Xia, Q. Mao, H.L. Paulson, B.L. Davidson, Nat. Biotechnol. 20:1006, 2002). Este método demostró el silenciamiento de la expresión transgénica (GFP) en

los tejidos cerebrales alcanzados por el vector adenovírico. Sin embargo, el área de silenciamiento no pudo predecirse de manera fiable. Este método podría ser desarrollado adicionalmente y podría resultar aplicable a la inyección local, por ejemplo intratumoral. Los vectores víricos han sido utilizados ampliamente con fines de terapia génica, pero una lección aprendida de los experimentos de terapia génica es que la extensión vírica puede resultar impredecible en ocasiones y conducir a efectos secundarios no deseados (Marshall E., Science 286(5448):2244-5, 1999). Resulta necesario un método nuevo para la administración segura y predecible de ARNs interfirientes en mamíferos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0004] La invención se refiere de manera general a métodos de administración de uno o más ARNip en una célula de mamífero mediante la introducción de una bacteria invasiva en la célula, en los que la bacteria contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv, en los que dicha bacteria invasiva es E. coli. [0005] Asimismo, la invención se refiere a un método para regular la expresión génica en una célula de mamífero, mediante la introducción de una bacteria invasiva en la célula, en el que la bacteria contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv, en el que los ARNip expresados interfieren con el ARNm del gen que debe regularse, regulando de esta manera la expresión del gen, en el que dicha bacteria invasiva es E. coli. [0006] En una realización del presente método, el gen es ras o β-catenina. En un aspecto de la presente realización, el gen ras es k-Ras. [0007] En una realización de los métodos anteriormente indicados de la invención, la célula de mamífero es una célula humana. [0008] Asimismo, la invención se refiere a la utilización de la bacteria invasiva según la invención para el tratamiento o prevención del cáncer o de un trastorno de la proliferación celular en un mamífero, mediante la regulación de la expresión de un gen o de varios genes en una célula que es conocido que incrementan la proliferación celular, mediante la introducción de una bacteria en la célula. La bacteria contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv. [0009] En una realización de dicho uso de la invención, el mamífero es un ser humano. En otra realización de dicho uso, los ARNip expresados interfieren con el ARNm del gen que debe regularse. [0010] En una realización de dicho uso, el gen es ras o β-catenina. En un aspecto de la presente realización, el gen ras es k-Ras. [0011] En otra realización de dicho uso de la invención, la célula es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer pancreático. En un aspecto de la presente realización, la célula de cáncer de colon es una célula SW 480. En otro aspecto de la presente realización, la célula de cáncer pancreático es una célula CAPAN-1. [0012] En una realización de los métodos o usos anteriormente indicados de la invención, la bacteria es no patogénica o no virulenta. En otro aspecto de la presente realización, la bacteria es terapéutica. [0013] En otra realización de los métodos o usos anteriormente indicados de la invención, la molécula o moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip se transcriben dentro de la célula de mamífero. En un aspecto de la presente realización, la molécula o moléculas de AR-Nip se transcriben dentro de las células de mamífero en forma de ARNhc. [0014] En otra realización de los métodos y usos anteriormente indicados de la invención, la molécula o moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip se transcriben dentro de la bacteria. En un aspecto de la presente realización, la molécula o moléculas de ADN contienen un promotor procariótico. Opcionalmente, el promotor procariótico es un promotor de T7. [0015] Asimismo, la invención se refiere a una bacteria invasiva que contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv, en donde dicha bacteria invasiva es E. coli. [0016] En una realización de la presente invención, la bacteria es una bacteria no patogénica o no virulenta. En otro aspecto de la presente realización, la bacteria es una bacteria terapéutica. [0017] Asimismo, la invención se refiere a un vector procariótico que contiene un ADN codificante de uno o más ARNip y a un promotor procariótico. [0018] En una realización de dicho vector de la invención, el promotor procariótico es un promotor de T7. [0019] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado entendido comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente invención durante la práctica o en ensayo de la misma, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria, incluyendo definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. [0020] Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0021]

La figura 1A muestra micrografías de la invasión de SL 7207 en células SW 480. La fi

gura 1B muestra el análisis FACS de la inactivación de la expresión de la proteína fluo

rescente verde en células CRL 2583. La figura 1C muestra micrografías que muestran

la pérdida de fluorescencia en células CRL 2583.

La figura 2A muestra transferencias western de k-Ras y β-catenina en células SW 480.

La figura 2B es una serie de gráficos de columnas que muestra la viabilidad de las célu

las SW 480 bajo diversos regímenes de tratamiento. La figura 2C muestra fotografías

de la tumorigenicidad en ratones desnudos inyectados con células SW 480 transfecta

das con diversos ARNip.

La figura 3A muestra micrografías de secciones de hígado de ratón transgénico. La fi

gura 3B muestra mediciones de citometría de flujo de suspensiones de hepatocitos y de

esplenocitos.

La figura 4 muestra transferencias western de k-Ras y β-catenina de células SW 480

transfectadas con plásmido silenciador.

La figura 5 muestra micrografías de la tinción histoquímica de secciones hepáticas de

ratones que mostraban cambios en los niveles de expresión de GFP.

La figura 6A es un esquema que muestra el plásmido de interferencia de ARN trans-

Reino (TRIP). La figura 6B es una fotografía que muestra una inmunotransferencia de

β-catenina de células SW 480 transfectadas con TRIP. La figura 6C es una fotografía

que muestra una inmunotransferencia de β-catenina de células SW 480 transfectadas

con TRIP para un tiempo de exposición de entre 30 y 120 minutos. La figura 6D mues

tra una fotografía de una RT-PCR de ARNm de β-catenina y de k-Ras de células SW

480 transfectadas con TRIP. La figura 6E es una fotografía que muestra una inmuno

transferencia de k-Ras en células SW 480 y DLD1 tras la transfección con un TRIP co

ntra k-Ras mutante (GUT-->GTT en el codón 12) y contra k-Ras mutante (GGC-->GAC

en el codón 13). La figura 6F es una fotografía que muestra una inmunotransferencia de

células SW 480 transfectadas con un TRIP contra k-Ras de tipo salvaje.

La figura 7A es una fotografía de una RT-PCR que muestra el silenciamiento de β

catenina tras el tratamiento con ARNhc expresadas en E. coli. La figura 7B es un es

quema que muestra los sitios de corte específico en β-catenina. La figura 7C es una fo

tografía de una 5'-RACE-PCR que muestra los productos de corte específico. La figura

7D es una fotografía de un filtro que muestra la expresión de ARNm de diversos genes.

La figura 8A es una fotografía de la tinción celular que muestra que tanto Inv como Hly resultan necesarios para la entrada en la bacteria. La figura 8B es una fotografía de un filtro con ARN que muestra que TRIP sin Hly es incapaz de inducir la desactivación de un gen diana. La figura 8C es una fotografía de un filtro con ARN que muestra que tanto Inv como Hly resultan necesarios para facilitar el ARNi trans-reino eficiente. La figura 8 D es una fotografía de un filtro con ARN que muestra el efecto de la adición retrasada de tetraciclina sobre el silenciamiento génico. La figura 8E es una fotografía de la tinción celular que muestra la falta de replicación bacteriana significativa en ausencia de antibióticos más allá de las 2 horas posteriores al inicio de la incubación. La figura 9A es un gráfico que muestra que la administración oral de E. coli que expresan ARNhc contra β-catenina en ratones conduce a una reducción significativa de la expresión de la β-catenina en el epitelio intestinal. La figura 9B es una fotografía de la tinción inmunohistoquímica del epitelio intestinal con o sin tratamiento. La figura 9C es un gráfico que muestra una reducción de la expresión del ARNm de β-catenina tras el tratamiento. La figura 9D es un gráfico que muestra una reducción de la expresión de la proteína β-catenina tras el tratamiento. La figura 9E es una fotografía de la tinción inmunohistoquímica que muestra la reducción de la expresión de proteína β-catenina tras el tratamiento. La figura 10 es una fotografía de la tinción inmunohistoquímica que muestra que la expresión de GAPDH no resulta alterada por E. coli que expresa ARNhc contra β-catenina tras la dosificación oral en ratones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [0022] La invención se refiere a métodos para administrar ARNs de interferencia pequeños (ARNip) en células de mamífero utilizando cepas no patogénicas o terapéuticas de bacterias. La bacteria puede transportar ARN codificante de ADN o el ARN mismo, para producir la interferencia de ARN (ARNi). El ARN de interferencia de la invención regula la expresión génica en células de mamífero. Silencia o inactiva genes de interés en el interior de las células diana. El ARN de interferencia puede dirigir el complejo multienzimático propio de la célula RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) al ARNm del gen que debe silenciarse. La interacción de RISC con el ARNm resulta en la degradación del ARN. Esto conduce a un silencia-miento post-transcripcional efectivo del gen de interés. Este método se denomina silenciamiento génico mediado por bacterias (BMGS). [0023] El transporte bacteriano resulta más atractivo que el transporte vírico debido a que puede controlarse mediante la utilización de antibióticos y cepas bacterianas atenuadas que sean incapaces de multiplicarse. Además, las bacterias resultan mucho más accesibles a la manipulación genética, permitiendo la producción de cepas de vector específicamente adaptadas a determinadas aplicaciones. Los métodos de la invención pueden utilizarse para crear bacterias que provoquen la ARNi de una manera específica de tejido. [0024] El ARNip puede introducirse en la célula diana directamente o mediante transfección, o puede transcribirse dentro de la célula diana en forma de ARNdc con estructura de horquilla (ARNhc) a partir de plásmidos específicos utilizando promotores compatibles con ARN polimerasa III (U6, H1) (P.J. Paddison, A.A. Caudiy, G.J. Hannon, PNAS 99:1443, 2002; T.R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296:550, 2002). [0025] La liberación del plásmido codificante de ARNip de la bacteria intracelular se produce mediante mecanismos activos. Un mecanismo implica el sistema de exportación de tipo III en

S. typhimurium, un complejo multiproteína especializado que se encuentra situado atravesando la totalidad de la membrana celular bacteriana, cuyas funciones incluyen la secreción de factores de virulencia al exterior del a célula para permitir la señalización hacia la célula diana, pero que también puede utilizarse para transportar antígenos hacia el interior de células diana (Rüssmann H., Int. J. Med. Microbiol. 293:107-12, 2003), o mediante lisis bacteriana y la liberación del contenido bacteriano en el interior del citoplasma. La lisis de las bacterias intracelulares resulta desencadenada por la adición de un antibiótico activo intracelularmente (la tetraciclina)

o se produce naturalmente mediante atenuación metabólica bacteriana (auxotrofia). Tras la liberación del plásmido eucariótico de transcripción, se producen ARNhc o ARNip dentro de la célula diana y desencadenan el altamente específico proceso de degradación del ARNm, que resulta en el silenciamiento del gen diana. [0026] Las bacterias no virulentas presentan propiedades invasivas y pueden entrar en una célula huésped de mamífero mediante diversos mecanismos. En contraste con la incorporación de bacterias por fagocitos profesionales, que normalmente resulta en la destrucción de la bacteria dentro de un lisosoma especializado, las cepas invasivas de bacterias presentan la capacidad de invadir células huésped no fagocíticas. Son ejemplos presentes naturalmente de dichas bacterias patógenos intracelulares tales como Listeria, Shigella y Salmonella, aunque esta propiedad también puede transferirse a otras bacterias, tales como E. coli y Bifidobacteriae, incluyendo probióticos a través de la transferencia de genes relacionados con la invasividad (P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvaln, C.R.Acad. Sci. Paris 318:1207, 1995). Entre las bacterias utilizadas para transportar ARNs de interferencia a células huésped pueden incluirse Shigella flexneri (D.R. Sizemore, A. Branstrom, J.C. Sadoff, Science 270:299, 1995), E. coli invasivas (P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C.R.Acad. Sci. Paris 318:1207, 1995;

C.

Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D.M. Ojcius, P. Courvalin, Nat. Biotechnol. 16:862, 1998), Yersinia enterocolitica (A. Al-Mariri A, A. Tibor, P. Lestrate, P. Mertens, X. De Bolle, J. J.

Letesson Infect. Immun. 70:1915, 2002) y Listeria monocytogenes (M. Hense, E. Domann, S. Krusch, P. Wachholz, K.E. Dittmar, M. Rohde, J. Wehland, T. Chakraborty, S. Weiss, Cell Microbiol. 3:599, 2001; S. Pilgrim, J. STrizker, C. Schoen, A. Kolb-Maurer, G. Geginat, M.J. Loessner, I. Gentschev, W. Goebel, Gene Therapy 10:2036, 2003). Cualquier bacteria invasiva resulta útil para la transferencia de ADN al interior de células eucarióticas (S. Weiss, T. Chakraborty, Curr. Opinion Biotechnol. 12:467, 2001), o para introducir ARN antisentido o un ARN catalítico (patente WO nº 99/18221). [0027] Se lleva a cabo BUGS utilizando el patógeno naturalmente invasivo Salmonella typhimurium. Entre las cepas de Salmonella typhimurium pueden incluirse SL 7207 y VNP20009 (S.K. Hoiseth, B.A.D. Stocker, Nature 291:238, 1981; Pawelek J.M., Low K.B., Bermudes D., Cancer Res. 57(20):4537-44 (15 de octubre de 1997)). En una realización de la invención, se lleva a cabo BMGS utilizando E. coli atenuadas. En un aspecto de dicha realización, la cepa de E. coli es BM 2710 (C. Griltot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D.M. Ojcius, P. Courvalin, Nat. Biotechnol. 16:862, 1998). En otro aspecto de dicha realización, la cepa BM 2710 se manipula para que presente propiedades de invasividad celular utilizando un plásmido invasivo. En un aspecto de la invención este plásmido es pGB2inv-hly. [0028] También se utiliza una técnica de doble "caballo de Troya" con una bacteria invasiva y auxotrófica que porta un plásmido eucariótico de transcripción. Este plásmido resulta transcrito, a su vez, por la célula diana, formando una estructura de horquilla de ARN que desencadena el proceso intracelular de ARNi. Este método de la invención induce un silenciamiento génico significativo de una diversidad de genes. En determinados aspectos de dicha realización, entre los genes se incluyen un transgén (GFP), un oncogén mutado (k-Ras) y un gen relacionado con el cáncer (β-catenina) in vitro. [0029] Asimismo, la invención se refiere a una variación del método descrito, denominada silenciamiento de un gen transcrito por una bacteria (BTGS). En este aspecto de la invención, ARNip es directamente producido por la bacteria invasiva, y no por la célula diana. Se inserta un plásmido de transcripción controlado por un promotor procariótico (por ejemplo de T7) en la bacteria portadora mediante protocolos de transformación estándares. Se produce ARNip dentro de la bacteria y se libera dentro de la célula diana de mamífero tras la lisis bacteriana desencadenada por auxotrofia o mediante la adición temporizada de antibióticos. [0030] Los métodos de ARNi de la invención, incluyendo BMGS y BTGS, se utilizan como terapia para el cáncer o para prevenir el cáncer. Este método se lleva a cabo mediante silencia-miento o inactivación de genes implicados en la proliferación celular o en otros fenotipos de cáncer. Son ejemplos de estos genes, k-Ras y β-catenina. Específicamente, k-Ras y β-catenina son dianas para la terapia basada en ARNi del cáncer de colon. Estos oncogenes son activos y relevantes en la mayoría de casos clínicos. Se aplica BMGS para alcanzar el tracto intestinal en el tratamiento y prevención del cáncer de colon. Estos métodos también se utilizan para tratar animales que portan tumores xenoinjertados, para tratar y prevenir el cáncer en el modelo kRasV12 de la tumorigénesis intestinal, y para prevenir y tratar tumores en el modelo de ratón de poliposis adenomatosa coli min (modelo APC-min). En este modelo, el ratón presenta un gen APC defectuoso que resulta en la formación de numerosos polipos intestinales y colónicos, que se utiliza como modelo animal para la poliposis adenomatosa coli familiar humana (FAP) de la tumorigénesis intestinal. [0031] La invención también comprende un plásmido de transcripción procariótico codificante de ARNhc para la utilización con bacterias invasivas para llevar a cabo el silenciamiento de un gen transcrito por bacterias (BTGS). Estos plásmidos se utilizan para cribar diferentes dianas relacionadas con cáncer en animales transgénicos así como de tipo salvaje para experimentos terapéuticos. [0032] Los métodos de ARNi de la invención, incluyendo BMGS y BTGS, también se utilizan para tratar o prevenir enfermedades víricas (por ejemplo hepatitis) y trastornos genéticos. [0033] Los métodos de ARNi de la invención, incluyendo BMGS y BTGS, también se utilizan para crear "bacterias probióticas" preventivas del cáncer, para la utilización especialmente con la diana del tracto GI o el hígado. [0034] Los métodos de ARNi de la invención, incluyendo BMGS y BTGS, se utilizan como terapia contra condiciones inflamatorias, por ejemplo hepatitis, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) o colitis. Estos métodos se utilizan para silenciar o inactivar dianas génicas no de cáncer (genes víricos, para el tratamiento y prevención de la hepatitis B y C; genes inflamatorios, para el tratamiento y prevención de enfermedades intestinales inflamatorias) y otras. [0035] Los métodos de ARNi de la invención, incluyendo BMGS y BTGS, se utilizan para crear modelos animales genéticos "de inactivación génica" transitoria, y no modelos de inactivación génica construidos genéticamente, para el descubrimiento de las funciones de los genes. Los métodos también se utilizan como herramienta de transfección in vitro para la investigación y el desarrollo de fármacos. [0036] Dichos métodos utilizan bacterias que presentan propiedades deseables (invasividad, atenuación, manipulabilidad), por ejemplo Bifidobacteria y Listeria, se utilizan para llevar a cabo BMGS y BTGS. La invasividad, así como la transcripción eucariótica o procariótica de uno o varios ARNhc, se proporciona a una bacteria utilizando plásmidos. [0037] Los métodos de ARNi de la invención, incluyendo BMGS y BTGS, se utilizan para la provisión de silenciamiento génico al tracto GI y al colon, y para la aplicación oral en el tratamiento de diversas enfermedades, es decir para el tratamiento y prevención del cáncer de colon. En otro aspecto de la presente realización, la provisión de silenciamiento génico es extraintestinal.

1. Transporte bacterianos de ARN a células eucarióticas

[0038] Según la invención, cualquier microorganismo que es capaz de transportar una molécula, por ejemplo una molécula de ARN, al interior del citoplasma de una célula diana, tal como atravesando la membrana y entrando en el citoplasma de la célula, puede utilizarse para transportar ARN a dichas células. En una realización preferente, el microorganismo es un procariota. En una realización todavía más preferente, el procariota es una bacteria. También se encuentra comprendido dentro del alcance de la invención los microorganismos aparte de bacterias que pueden utilizarse para transportar ARN a una célula. Por ejemplo, el microorganismo puede ser un hongo, por ejemplo Cryptococcus neoformans; un protozoo, por ejemplo Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Leishmania donovani y Plasmodia. [0039] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "invasivo", en referencia a un microorganismo, por ejemplo una bacteria, se refiere a un microorganismo que es capaz de transportar por lo menos una molécula, por ejemplo un ARN o una molécula de ADN codifican-te de ARN, a una célula diana. Un microorganismo invasivo puede ser un microorganismo que sea capaz de atravesar una membrana celular, entrando de esta manera en el citoplasma de dicha célula, y transportando por lo menos parte de su contenido, por ejemplo ARN o ADN codificante de ARN, a la célula diana. El procedimiento de transporte de la molécula o moléculas a la célula diana preferente no modifica significativamente el aparato invasivo. [0040] Una bacteria invasiva preferente es una bacteria que es capaz de transportar por lo menos una molécula, por ejemplo un ARN o una molécula de ADN codificante de ARN, en una célula diana, tal como entrando en el citoplasma de una célula eucariótica. Las bacterias invasivas preferentes son bacterias vivas, pro ejemplo las bacterias invasivas vivas. [0041] Entre los microorganismos invasivos se incluyen microorganismos que son capaces naturalmente de transportar por lo menos una molécula a una célula diana, tal como atravesando la membrana celular, por ejemplo una membrana celular eucariótica, y entrando en el citoplasma, así como microorganismos que no son naturalmente invasivos y que han sido modificados, por ejemplo modificados genéticamente, para que sean invasivos. Un microorganismo que no es naturalmente invasivo puede modificarse para que sea invasivo uniendo la bacteria a un "factor invasivo", también denominado "factor de entrada" o "factor de dirección al citoplasma". Tal como se utiliza en la presente memoria, un "factor invasivo" es un factor, por ejemplo una proteína o un grupo de proteínas que, al expresarse en una bacteria no invasiva, convierten a la bacteria en invasiva. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "factor invasivo" se encuentra codificado por un "gen de dirección al citoplasma". [0042] Los microorganismos naturalmente invasivos, por ejemplo las bacterias, pueden presentar un determinado tropismo, es decir, células diana preferentes. Alternativamente, los microorganismos, por ejemplo bacterias, pueden modificarse, por ejemplo genéticamente, para imitar el tropismo de un segundo microorganismo. [0043] El transporte de por lo menos una molécula al interior de una célula diana puede determinarse según métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, la presencia de la molécula, a partir de la reducción de la expresión de un ARN o proteína silenciada por la misma, puede detectarse mediante hibridación o métodos de PCR, o mediante métodos inmunológicos, entre los que se incluye la utilización de un anticuerpo. [0044] La determinación de si un microorganismo resulta suficientemente invasivo para la utilización en la invención puede incluir determinar si se ha transportado suficiente ARN a las células huésped, respecto al número de microorganismos que se han puesto en contacto con las células huésped. En el caso de que la cantidad de ARN sea baja respecto al número de microorganismos utilizado, puede resultar deseable modificar adicionalmente el microorganismo para incrementar su potencial invasivo. [0045] La entrada bacteriana en las células puede medirse mediante diversos métodos. Las bacterias intracelulares sobreviven al tratamiento con antibióticos aminoglucósido, mientras que las bacterias extracelulares resultan rápidamente eliminadas. Puede conseguirse una estimación cuantitativa de la incorporación bacteriana mediante el tratamiento de monocapas celulares con el antibiótico gentamicina para inactivar las bacterias extracelular, retirando seguidamente dicho antibiótico antes de eliminar los organismos intracelulares supervivientes con un detergente suave y determinar el recuento viable en medio bacteriológico estándar. Además, la entrada bacteriana en las células puede observarse directamente, por ejemlo mediante microscopía electrónica de transmisión de capa fina de capas celulares o mediante técnicas inmunofluorescentes (Falkow et al., Annual Rev. Cell Biol. 8:333, 1992). De esta manera, pueden utilizarse diversas técnicas para determinar si una bacteria específica es capaz de invadir un tipo específico de célula o para confirmar la invasión bacteriana tras la modificación de las bacterias, realizando dicha modificación del tropismo de la bacteria para imitar la de una segunda bacteria. [0046] Las bacterias que pueden utilizarse para transportar ARN según el método de la invención preferentemente son no patogénicas. Sin embargo, también pueden utilizarse bacterias patogénicas, con la condición de que su patogenicidad haya sido atenuada, convirtiéndolas de esta manera en bacterias no perjudiciales para el sujeto en el que se administren. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "bacteria atenuada" se refiere a una bacteria que ha sido modificada para reducir o eliminar significativamente su nocividad para un sujeto. Una bacteria patogénica puede atenuarse mediante diversos métodos, proporcionados posteriormente. [0047] Sin pretender limitarse a un mecanismo de acción específico, la bacteria que transporta el ARN al interior de la célula eucariótica puede entrar en diversos compartimientos de la célula, dependiendo del tipo de bacteria. Por ejemplo, la bacteria puede encontrarse en una vesícula, por ejemplo una vesícula fagocítica. Tras introducirse en la célula, la bacteria puede destruirse o lisarse, proporcionando su contenido a la célula eucariótica. La bacteria también puede manipularse para expresar un enzima degradante de fagosoma, para permitir la fuga del ARN desde el fagosoma. En algunas realizaciones, la bacteria puede seguir viva durante diversos tiempos en la célula eucariótica y puede continuar produciendo ARN. El ARN o ADN codificante de ARN seguidamente puede liberarse de la bacteria en el interior de la célula mediante, por ejemplo, fuga. En determinadas realizaciones de la invención, la bacteria también puede replicarse en la célula eucariótica. En una realización preferente, la replicación bacteriana no elimina la célula huésped. La invención no se encuentra limitada al transporte de ARN o de ADN codificante de ARN mediante un mecanismo específico y pretende comprender métodos y composiciones que permiten el transporte de ARN o de ADN codificante de ARN mediante una bacteria de manera independiente del mecanismo de transporte. [0048] Posteriormente se proporcionan ejemplos de bacterias que han sido descritas en la literatura como naturalmente invasivas (sección 1.1), así como bacterias que han sido descritas en la literatura como bacterias naturalmente no invasivas (sección 1.2), así como bacterias que son naturalmente no patogénicas o que son atenuadas. Aunque algunas bacterias han sido descritas como no invasivas (sección 1.2), pueden resultar suficientemente invasivas para ser utilizadas según la invención. Se hayan descrito tradicionalmente como naturalmente invasivas

o no invasivas, cualquier cepa bacteriana puede modificarse para modular, en particular para incrementar, sus características invasivas (por ejemplo tal como se describe en la sección 1.3).

1.1 Bacterias naturalmente invasivas

[0049] Las bacterias naturalmente invasivas particulares utilizadas en los métodos dados a conocer no resultan críticas. Entre los ejemplos de dichas bacterias invasivas naturales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, Shigella spp., Salmonella spp., Listeria spp., Rickettsia spp., y Escherichia coli enteroinvasiva. [0050] La cepa de Shigella particular utilizada no resulta crítica. Entre los ejemplos de cepas de Shigella que pueden utilizarse en estos métodos se incluyen Shigella flexneri 2a (ATCC nº 29903), Shigella sonnei (ATCC nº 29930) y Shigella disenteriae (ATCC nº 13313). En estos métodos se utilizan preferentemente una cepa de Shigella atenuada, tal como Shigella flexneri 2a 2457T aroA virG mutante CVD 1203 (Noriega et al., supra), Shigella flexneri M90T icsA mutante (Goldberg et al., Infect. Immun. 62:5664-5668, 1994), Shigella flexneri y SFL114 aroD mutante (Kamell et al., Vacc. 10:167-174, 1992) y Shigella flexneri aroA aroD mutante (Verma et al., VAcc. 9:6-9, 1991). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Shigella spp. mediante la introducción de una mutación atenuante individualmente o conjuntamente con una o más mutaciones atenuantes adicionales. [0051] Por lo menos una ventaja de los vectores de vacuna de ARN de Shigella es su tropismo para el tejido linfoide en la superficie mucosal colónica. Además, el sitio principal de replicación de Shigella se cree que es el interior de las células dendríticas y de macrófagos, que se encuentran comúnmente en la superficie lateral basal de células M en tejidos linfoides mucosales (revisados por McGhee J.R. et al., Reproduction, Fertility & Development 6:369, 1994; Pascual

D.W. et al., Immunomethods 5:56, 1994). Como tales, los vectores Shigella pueden proporcionar un medio para expresar antígenos en dichas células presentadoras de antígenos profesionales. Otra ventaja de los vectores Shigella es que las cepas atenuadas de Shigella transportan genes informadores de ácidos nucleicos in vitro e in vivo (Sizemore D.R. et al., Science 270:299, 1995; Courvalin P. et al., Comptes Rendus de 1 Academie des Sciences Serie III-Sciences de la Vie-Life Sciences 318:1207, 1995; Powell R.J. et al., 1996; en: Molecular approaches to the control of infectious diseases. F. Brown, E. Norrby, D. Burton y J. Mekalanos, editores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 183; Anderson R.J. et al., Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society for Microbiology: E, 1997). En la práctica, la especificidad de huésped estrechamente restringida de Shigella permite evitar la extensión de los vectores Shigella a la cadena alimentaria a través de huéspedes intermedios. Además, se han desarrollado cepas atenuadas que se encuentran altamente atenuadas en roedores, primates y en voluntarios (Anderson et al., supra, 1997; Li A. et al., Vaccine 10:395, 1992; Li A. et al., Vaccine 11:180, 1993; Karnell A. et al., VAccine 13:88, 1995; Sansonetti P.J. y J. Arondel, Vaccine 7:443, 1989; Fonatine A. et al., Research in Microbiology 141:907, 1990; Sansonetti P.J. et al., Vaccine 9:416, 1991; Noriega F. R. et al., Infection & Immunity 62:5168, 1994; Noriega F.R. et al., Infection & Immunity 64:3055, 1996; Noriega F.R. et al., Infection & Immunity 64:23, 1996; Noriega F.R. et al., Infection & Immunity 64:3055, 1996; Kotloff K.L. et al., Infection & Immunity 64:4542, 1996). Estos últimos conocimientos permitirán el desarrollo de vectores Shigella bien tolerados para la utilización en el ser humano. [0052] Pueden introducirse mutaciones atenuantes en patógenos bacterianos utilizando muta-génesis no específica químicamente, utilizando agentes tales como N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina, o utilizando técnicas de ADN recombinante; técnicas genéticas clásicas, tales como la mutagénesis Tn10, la transducción mediada por P22, el entrecruzamiento mediado por el fago λ, y la transferencia por conjugación, o la mutagénesis sitio-dirigida utilizando técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de ADN recombinante resultan preferibles debido a que las cepas construidas mediante técnicas de ADN recombinante se encuentran muchos menos definidas. Entre los ejemplos de dichas mutaciones atenuantes se incluyen, aunque sin limitación:

(i)

mutaciones auxotróficas, tales como las mutaciones aro (Hoiseth et al., Nature 291:238-239, 1981), gua (McFarland et al., Microbiol. Path. 3:129-141, 1987), nad (Park et al., J. Bact. 170:3725-3730, 1988), thy (Nnalue et al., Infect. Immun. 55:955-962, 1987), y asd (Curtiss, supra),

(ii)

mutaciones que inactivan las funciones reguladoras globales, tales como las mutaciones cya (Curtiss et al., Infect. Immun. 55:3035-3043, 1987), crp (Curtiss et al., supra, 1987), phoP/phoQ (Groisman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7077-7081, 1989; y Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5054-5058, 1989), phopc (Miller et al., J. Bact. 172:2485-2490, 1990) u ompR (Dorman et al., Infect. Immun. 57:2136-2140, 1989).

(iii) mutaciones que modifican la respuesta frente al estrés, tales como las mutaciones recA (Buchmeier et al., Mol. Micro. 7:933-936, 1993), htrA (Johnson et al., Mol. Micro. 5:401-407, 1991), htpR (Neidhardt et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 100:894-900, 1981), hsp (Neidhardt et al., Ann. Rev. Genet. 18:295-329, 1984) y groEL (Buchmeier et al., Sci. 248:730-732, 1990).

(iv)

mutaciones en factores de virulencia específicos, tales como las mutaciones IsyA (Libby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:489-493, 1994), pag o prg (Miller et al., supra, 1990; y Miller et al., supra, 1989), iscA o virG (d'Hauteville et al., Mol. Micro. 6:833841, 1992), plcA (Mengaud et al., Mol. Microbiol. 5:367-72, 1991), Camilli et al., J. Exp. Med. 173:751-754, 1991) y act (Brundage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1189011894, 1993),

(v)

mutaciones que afectan a la topología del ADN, tales como topA (Galan et al., Infect. Immun. 58:1879-1885, 1990),

(vi)

mutaciones que alteran o modifican el ciclo celular, tales como min (de Boer et al., Cell 56:641-649, 1989),

(vii)

la introducción de un gen codificante de un sistema suicida, tal como sacB (Recorbet et al., App. Environ. Micro. 59:1361-1366, 1993; Qusndt et al., Gene 127:15-21, 1993), nuc (Ahrenholtz et al., App. Environ. Micro. 60:3746-3751, 1994), hok, gef, kil o ph1A (Molin et al., Ann. Rev. Microbiol. 47:137-166, 1993),

(vii)

mutaciones que alteran la biogénesis de lipopolisacárido y/o lípido A, tales como

rFb (Raetz en Escherichia coli y en Salmonella typhimurium, Neidhardt et al., editor, ASM Press, Washington D.C., páginas 1035-1063, 1996), ga1E (Hone et al., J. Infect. Dis. 156:164-167, 1987) y htrB (Raetz, supra), msbB (Raetz, supra),

(ix) introducción de un sistema de lisis bacteriofágico, tal como lisógenos codificados por P22 (Rennell et al., Virol. 143:280-289, 1985), la mureína λ transglucosilasa (Bienkowska-Szewczyk et al., Mol. Gen. Genet. 184:111-114, 1981) o el gen S (Reader et al., Virol. 43:623-628, 1971), y

[0053] Las mutaciones atenuantes pueden expresarse constitutivamente o encontrarse bajo el control de promotores inducibles, tales como la familia de promotores de choque térmico sensibles a la temperatura (Neidhardt et al., supra) o el promotor nirB inducido anaeróbicamente (Harborne et al., Mol. Micro. 6:2805-2813, 1992) o promotores reprimibles, tales como uapA (Gorfinkiel et al., J. Biol. Chem. 268:23376-23381, 1993) o gcv (Stauffer et al., J. Bact. 176:6159-6164, 1994). [0054] La cepa particular de Listeria utilizada no resulta crítica para los Ejemplos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Listeria que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Listeria monocytogenes (ATCC nº 15313). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Listeria, tales como L. monocytogenes actA mutante (Brundage et al., supra)o L. monocytogenes p1cA (Camilli et al., J. Exp. Med. 173:751-754, 1991). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Listeria mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0055] La cepa particular de Salmonella utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Salmonella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Salmonella typhi (ATCC nº 7251) y S. typhimurium (ATCC nº 13311). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Salmonella, y entre ellas se incluyen S. typhi-aroC-aroD (Hone et al., Vacc. 9:810, 1991) y S. typhimurium-aroA mutante (Mastroeni et al., Micro. Pathol. 13:477, 1992). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Salmonella mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes, tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0056] La cepa de Rickettsia particular utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Rickettsia que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Rickettsia rickettsiae (ATCC nº VR149 y nº VR891), Rickettsia prowaseckii (ATCC nº VR233), Rickettsia tsutsugamuchi (ATCC nº VR312, VR150 y VR609), Rickettsia mooseri (ATCC nº VR144), Rickettsia sibirica (ATCC nº VR151) y Rochalimaea quitana (ATCC nº VR358). Preferentemente se utilizan las cepas atenuadas de Rickettsia y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha indicado para Shigella spp., anteriormente. [0057] La cepa enteroinvasiva particular de Escherichia utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas enteroinvasivas de Escherichia que pueden utilizarse en estos métodos se incluyen Escherichia coli cepas 4608-58, 1184-68, 53638-C17, 13-80 y 6-81 (Sansonetti et al., Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 132A:351-355, 1982). Preferentemente se utilizan cepas enteroinvasivas atenuadas de Escherichia y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0058] Además, debido a que determinados microorganismos aparte de bacterias también pueden interactuar con moléculas de integrina (que son receptores para determinados factores de invasividad) para la incorporación celular, dichos microorganismos también pueden utilizarse para introducir ARN en las células diana. Por ejemplo, algunos virus, por ejemplo el virus de la fiebre aftosa, ecovirus y adenovirus, y patógenos eucarióticos, por ejemplo Histoplasma capsulatum y Leishmania major interactúan con las moléculas de integrina.

1.2 Bacterias menos invasivas

[0059] Entre los ejemplos de bacterias que pueden utilizarse en los métodos dados a conocer y que han sido descritos en la literatura como no invasivos o por lo menos menos invasivos que las bacterias indicadas en la sección anterior (1.1) se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, Yersinia spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Bordetella, spp., Neisseria spp., Aeromonas spp., Franciesella spp., Corynebacterium spp., Citrobacter spp., Chlamydia spp., Hemophilus spp., Brucella spp., Mycobacterium spp., Legionella spp., Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp., Vibrio spp., Bacillus spp. y Erysipelothrix spp. Puede resultar necesario modificar estas bacterias para incrementar su potencial invasivo. [0060] La cepa particular de Yersinia utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Yersinia que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Y. enterocolitica (ATCC nº 9610) o Y. pestis (ATCC nº 19428). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Yersinia, tales como Y. enterocolitica Ye03-R2 (al-Hendy et al., Infect. Immun. 60:870-875, 1992) o Y. enterocolitica aroA (O'Gaora et al., Micro. Path. 9:105116, 1990). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Yersinia mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0061] La cepa particular de Escherichia utilizada no resulta crítica para la presente invención. Entre los ejemplos de cepas de Escherichia que pueden utilizarse en la presente invención se incluyen E. coli H10407 (Elinghorst et al., Infect. Immun. 60:2409-2417, 1992) y E. coli EFC4, CFT325 y CPZ005 (Donnenberg et al., J. Infect. Dis. 169:831-838, 1994). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Escherichia, tales como el patógeno atenuado del pavo E. coli 02 carAB mutante (Kwaga et al., Infect. Immun. 62:3766-3772, 1994) en la presente invención. Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Escherichia mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0062] La cepa particular de Klebsiella utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Klebsiella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen K. pneumoniae (ATCC nº 13884). Preferentemente se utilizan cepa atenuadas de Klebsiella, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los gurpos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0063] La cepa particular de Bordetella utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Bordetella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen B. bronchiseptica (ATCC nº 19395). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Bordetella, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0064] La cepa particular de Neisseria no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Neisseria que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen

N. meningitidis (ATCC nº 13077) y N. gonorrhoeae (ATCC nº 19424). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Neisseria, tales como N. gonorrhoeae MS11 aro mutante (Chamberlain et al., Micro. Path. 15:51-63, 1993). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Neisseria mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0065] La cepa particular de Aeromonas no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Aeromonas que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen A. eucrenophila (ATCC nº 23309). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Aeromonas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0066] La cepa particular de Franciesella no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Franciesella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen F. tularensis (ATCC nº 15482). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Franciesella, y pueden construirse nuevas cepas atenuadas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente.

[0067] La cepa particular de Corynebacterium no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Corynebacterium que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen C. pseudotuberculosis (ATCC nº 19410). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Corynebacterium, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii), tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0068] La cepa particular de Citrobacter utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Citrobacter que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen C. freundii (ATCC nº 8090). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Citrobacter, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0069] La cepa particular de Chlamydia utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Chlamydia que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen C. pneumoniae (ATCC nº VR1310). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Chlamydia, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0070] La cepa particular de Hemophilus utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Hemophilus que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen H. sornnus (ATCC nº 43625). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Hemophilus, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0071] La cepa particular de Brucella utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Brucella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen B. abortus (ATCC nº 23448). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Brucella, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0072] La cepa particular de Mycobacterium utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Mycobacterium que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen M. intracellulare (ATCC nº 13950) y M. tuberculosis (ATCC nº 27294). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Mycobacterium, y pueden construirse mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0073] La cepa particular de Legionella utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Legionella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen L. pneumophila (ATCC nº 33156). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Legionella, tales como L. pneumophila mip mutante (Ott, FEMS Micro Rev. 14:161-176, 1994). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Legionella mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0074] La cepa particular de Rhodococcus utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Rhodococcus que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen R. equi (ATCC nº 6939). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Rhodococcus, y pueden construirse nuevas cepas atenuadas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0075] La cepa particular de Pseudomonas utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Pseudomonas que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen P. aeruginosa (ATCC nº 23267). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Pseudomonas, y pueden construirse nuevas cepas atenuadas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0076] La cepa particular de Helicobacter utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Helicobacter que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen H. mustelae (ATCC nº 43772). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Helicobacter, y pueden construirse nuevas cepas atenuadas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0077] La cepa particular de Salmonella utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Salmonella que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Salmonella typhi (ATCC nº 7251) y S. typhimurium (ATCC nº 13311). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Salmonella, y entre ellas se incluyen S. typhi aroC aroD (Hone et al., Vacc. 9:810-816, 1991) y S. typhimurium aroA mutante (Mastroeni et al., Micro. Pathol. 13:477-491, 1992). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0078] La cepa particular de Vibrio utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Vibrio que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Vibrio cholerae (ATCC nº 14035) y Vibrio cincinnatiensis (ATCC nº 35912). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Vibrio, y entre ellas se incluyen V. cholerae RSI mutante de virulencia (Taylor et al., J. Infect. Dis. 170:1518-1523, 1994) y V. cholerae ctxA, ace, zot, cep mutante (Waldor et al., J. Infect. Dis. 170:278-283, 1994). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Vibrio mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0079] La cepa particular de Bacillus utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Bacillus que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Bacillus subtilis (ATCC nº 6051). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Bacillus, y entre ellas se incluyen B. anthracis mutante pX01 (Welkos et al., Micro. Pathol. 14:381388, 1993) y cepas atenuadas de BCG (Stover et al., Nat. 351:456-460, 1991). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos (i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente. [0080] La cepa particular de Erysipelothrix utilizada no resulta crítica para los métodos dados a conocer. Entre los ejemplos de cepas de Erysipelothrix que pueden utilizarse en dichos métodos se incluyen Erysipelothrix rhusiopathiae (ATCC nº 19414) y Erysipelothrix tonsillarum (ATCC nº 43339). Preferentemente se utilizan cepas atenuadas de Erysipelothrix, y entre ellas se incluyen E. rhusiopathiae Kg-1a y Kg-2 (Watarai et al., J. Vet. Med. Sci. 55:595-600, 1993) y

E. rhusiopathiae ORVAC mutante (Markowska-Daniel et al., Int. J. Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis. 277:547-553, 1992). Alternativamente, pueden construirse nuevas cepas atenuadas de Erysipelothrix mediante la introducción de una o más mutaciones atenuantes en los grupos

(i) a (vii) tal como se ha descrito para Shigella spp., anteriormente.

1.3 Métodos para incrementar las propiedades de invasividad de una cepa bacteriana

[0081] Tanto si los organismos han sido descritos tradicionalmente como invasivos como no invasivos, pueden manipularse para incrementar sus propiedades de invasividad, por ejemplo mediante la imitación de las propiedades de invasividad de Shigella spp., Listeria spp., Rickettsia spp. o E. coli spp. enteroinvasiva. Por ejemplo, pueden introducirse en el microorganismo uno o más genes que permiten que el microorganismo acceda al citoplasma de una célula, por ejemplo una célula en el huésped natural de dicha bacteria no invasiva. [0082] Entre los ejemplos de dichos genes a los que se hace referencia en la presente memoria como "genes de direccionamiento al citoplasma" se incluyen genes codificantes de las proteínas que permiten la invasión por Shigella o los genes de invasividad análogos de Escherichia enteroinvasiva, o la listeriolisina O de Listeria, debido a que dichas técnicas es conocido que proporcionan a un amplio abanico de bacterias invasivas la capacidad de invadir y entrar en el citoplasma de células animales (Formal et al., Infect. Immun. 46:465, 1984; Bielecke et al., Nature 345:175-176, 1990; Small et al., en: Microbiology-1986, páginas 121 a 124; Levine et al., editores, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1986; Zychlinsky et al., Molec. Micro. 11:619-627, 1994; Gentschev et al., Infection & Immunity 63:4202, 1995; Isberg R.R. y S. Falkow, Nature 317:262, 1985; e Isberg R.R. et al., Cell 50:769, 1987). Los métodos para transferir los genes de direccionamiento al citoplasma anteriormente indicados al interior de una cepa bacteriana son bien conocidos de la técnica. Otro gen preferente que puede introducirse en bacterias para incrementar su carácter invasivo codifica la proteína invasina de Yersinia pseudotuberculosis (Leong et al., EMBO J. 9:1979, 1990). La invasina también puede introducirse en combinación con listeriolisina, incrementado adicionalmente de esta manera el carácter invasivo de la bacteria en comparación con la introducción de uno cualquiera de dichos genes. Los genes anteriormente indicados han sido indicados a fines ilustrativos; sin embargo, resultará evidente para el experto en la materia que resultará suficiente cualquier gen o combinación de genes, procedentes de una o más fuentes, que participen en el transporte de una molécula, en particular de una molécula de ARN o de ADN codificante de ARN, de un microorganismo hasta el citoplasma de una célula, por ejemplo una célula animal. De esta manera, dichos genes no se encuentran limitados a los genes bacterianos, e incluyen genes víricos, tales como hemaglutinina HA-2 del virus influenza, que estimula la endosmolisis (Plank et al., J. Biol. Chem. 269:12918-12924, 1994). [0083] Los genes de direccionamiento al citoplasma anteriormente indicados pueden obtenerse mediante, por ejemplo, amplificación por PCR de ADN aislado a partir de una bacteria invasiva que porta el gen de direccionamiento al citoplasma deseado. Pueden diseñarse cebadores de PCR a partir de las secuencias de nucleótidos disponibles de la técnica, por ejemplo, en las referencias anteriormente indicadas y/o en GenBank, que se encuentran públicamente disponibles en internet (www.ncbi-nlm.nih.gov/). Los cebadores de PCR pueden diseñarse para que amplifiquen un gen de direccionamiento al citoplasma, un operón de direccionamiento al citoplasma, una agrupación de genes de direccionamiento al citoplasma, o un regulón de genes de direccionamiento al citoplasma. La estrategia de PCR utilizada dependerá de la organización genética del gen o genes de direccionamiento al citoplasma en la bacteria invasiva diana. Los cebadores de PCR se diseñan para que contengan una secuencia que sea homóloga a las secuencias de ADN al inicio y final de la secuencia de ADN diana. Los genes de direccionamiento al citoplasma seguidamente pueden introducirse en la cepa bacteriana diana, por ejemplo mediante la utilización de transferencia Hfr o la movilización de plásmidos (Miller A., A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992; Bothwell et al., supra, y Ausubel et al., supra), la transducción mediante bacteriofagos (de Boer, supra; Miller, supra; y Ausubel et al.supra), la transformación química (Bothwell et al., supra; Ausubel et al., supra), la electroporación (Bothwell et al., supra; Ausubel et al., supra,y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y técnicas de transformación física (Johnson et al., supra; y Bothwell, supra). Los genes de direccionamiento al citoplasma pueden incorporarse en bacteriófagos lisogénicos (de Boer et al., Cell 56:641-649, 1989), vectores plásmidos (Curtiss et al., supra)o cortarse y empalmarse en el cromosoma (Hone et al., supra) de la cepa diana. [0084] Además de bacterias manipuladas genéticamente para incrementar sus propiedades de invasividad, tal como se ha indicado anteriormente, las bacterias también pueden modificarse mediante la unión de un factor de invasividad a la bacteria. De acuerdo con lo anterior, una bacteria se convierte en más invasiva mediante recubrimiento de la misma, covalente o no covalentemente, con un factor de invasividad, por ejemplo la proteína invasina, derivados de invasina, o un fragmento de los mismos suficiente para la invasividad. De hecho, se ha demostrado que las células bacterianas no invasivas recubiertas de invasina purificada procedente de Yersinia pseudotuberculosis o los 192 aminoácidos carboxilo-terminales de la invasina son capaces de entrar en células de mamífero (Leong et al., EMBO J. 9:1979, 1990). Además, las perlas de látex recubiertas con la región carboxilo-terminal de la invasina resultan eficientemente internalizadas por las células de mamífero, al igual que las cepas de Staphylococcus aureus recubiertas con invasina inmovilizada con anticuerpo (revisadas en Isberg y Tran van Nhieu, Ann. Rev. Genet. 27:395, 1994). Alternativamente, también puede recubrirse una bacteria con un anticuerpo, variante del mismo, o fragmento del mismo, que se una específicamente a una molécula de superficie reconocida por un factor de entrada bacteriana. Por ejemplo, se ha demostrado que las bacterias son internalizadas en el caso de que se encuentren recubiertas con un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula de integrina, por ejemplo α5β1, que es conocido que es una molécula de superficie con la que interactúa la proteína invasina bacteriana (Isberg y Tran van Nhieu, supra). Dichos anticuerpos pueden prepararse según métodos conocidos de la técnica. Los anticuerpos pueden someterse a ensayo para eficacia en la mediación de la invasividad bacteriana mediante, por ejemplo, recubrimiento de las bacterias con el anticuerpo, la puesta en contacto de las bacterias con células eucarióticas que presenten un receptor de superficie reconocido por el anticuerpo, y realizando un seguimiento de la presencia de bacterias intracelulares, según los métodos descritos anteriormente. Los métodos para unir un factor de invasividad a la superficie de una bacteria son conocidos de la técnica y entre ellos se incluye el entrecruzamiento.

2. Células diana

[0085] La invención proporciona un método para transportar ARN a cualquier tipo de célula diana. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula diana" se refiere a una célula que puede resultar invadida por una bacteria, es decir, una célula que presenta los receptores de superficie necesarios para el reconocimiento por parte de la bacteria. [0086] Las células diana preferentes son células eucarióticas. Resultan células diana todavía más preferentes las células animales. La expresión "células animales" se define como células nucleadas que no contienen cloroplastos, derivadas de organismos multicelulares o presentes en los mismos, cuya posición taxonómica se incluye dentro del reino animalia. Las células pueden encontrarse presentes en el animal intacto, un cultivo celular primario, un cultivo de un explante o una línea de células transformadas. La fuente de tejido particular de las células no resulta crítica para la presente invención. [0087] Las células animales receptores utilizadas en los métodos dados a conocer no resultan críticas para los mismos y entre ellas se incluyen células presentes o derivadas de todos los organismos dentro del reino animalia, tales como aquéllas de las familias mammalia, pisces, aves y reptilia. [0088] Son células animales preferentes las células de mamífero, tales como las células de seres humanos, bovinas, ovinas, porcinas, felinas, caninas, caprinas, equinas y de primate. Las células animales más preferentes son las células humanas. [0089] La célula diana puede encontrarse en una superficie mucosal. Determinados patógenos entéricos, por ejemplo E. coli, Shigella, Listeria y Salmonella, se encuentran naturalmente adaptados a dicha aplicación, debido a que dichos organismos presentan la capacidad de unirse e invadir superficies mucosales del huésped (Kreig et al., supra). Por lo tanto, dichas bacterias pueden transportar moléculas de ARN o de ADN codificante de ARN hasta células presentes en el compartimiento mucosal del huésped. [0090] Aunque determinados tipos de bacteria pueden presentar un determinado tropismo, es decir, pueden presentar preferencia para ciertas células diana, el transporte de un ARN o ADN codificante de ARN hasta un determinado tipo de célula puede conseguirse mediante la selección de una bacteria que presente un tropismo para el tipo celular deseado o que haya sido modificada de manera que presente la capacidad de invadir el tipo celular deseado. De esta manera, podría manipularse genéticamente una bacteria, por ejemplo, para que imitase el tropismo para el tejido mucosal y las propiedades de invasividad, tal como se ha comentado anteriormente, permitiendo de esta manera que dicha bacteria invada el tejido mucosal, y transporte ARN o ADN codificante de ARN a las células en dichos sitios. [0091] Las bacterias también pueden presentar como diana otros tipos de células. Por ejemplo, las bacterias pueden presentar como diana eritrocitos de seres humanos y de primates mediante la modificación de las bacterias para que expresen sobre su superficie una o ambas de entre las proteínas ligantes 1 y 2 de reticulocitos de Plasmodium vivax, que se unen específicamente a eritrocitos en seres humanos y primates (Galinski et al., Cell 69:1213-1226, 1992). En otra realización, se modifican bacterias para que presenten sobre su superficie asialorosomucoide, que es un ligando para el receptor asialoglicoproteína sobre hepatocitos (Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988). Alternativamente, pueden recubrirse bacterias con insulinapoli-L-lisina, que se ha demostrado que dirige la incorporación de plásmidos en células que presentan un receptor de insulina (Rosenkranz et al., Expt. Cell Res. 199:323-329, 1992). También se utilizan en los métodos dados a conocer bacterias modificados para que presenten sobre su superficie p60 de Listeria monocytogenes, proporcionando tropismo para hepatocitos (Hess et al., Infect. Immun. 63:2047-2053, 1995), o una proteína de superficie de 60 kD procedente de Trypanosoma cruzi que causa la unión específica a la matriz extracelular de mamífero mediante la unión a heparina, heparín sulfato y colágeno (Ortega-Barria et al., Cell 67:411-421, 1991). [0092] Una célula puede modificarse para convertirse en una célula diana de una bacteria para el transporte de ARN. De acuerdo con lo anterior, puede modificarse una célula para expresar un antígeno de superficie que resulta reconocido por una bacteria para su entrada en la célula, es decir, un receptor de un factor de invasividad. La célula puede modificarse mediante la introducción en la célula de un ácido nucleico codificante de un receptor de un factor de invasividad, de manera que el antígeno de superficie se expresa bajo las condiciones deseadas. Alternativamente, la célula puede recubrirse con un receptor de un factor de invasividad. Entre los receptores de factores de invasividad se incluyen las proteínas pertenecientes a la superfamilia de receptores de integrina. Puede encontrarse una lista del tipo de receptores de integrina reconocidos por diversas bacterias y otros microorganismos en, por ejemplo, Isberg y Tran Van Nhieu, Ann. Rev. Genet. 27:395, 1994. Pueden encontrarse secuencias de nucleótidos para las subunidades de integrina en, por ejemplo, GenBank, disponibles públicamente en internet. [0093] Tal como se ha indicado anteriormente, entre todavía otras células diana se incluyen células de peces, aves y reptiles. Se proporcionan posteriormente ejemplos de bacterias que son naturalmente invasivas de células de peces, aves y reptiles. [0094] Entre los ejemplos de bacterias que pueden acceder naturalmente el citoplasma de las células de peces se incluyen, aunque sin limitación, Aeromonas salminocida (ATCC nº 33658) y Aeromonas schuberii (ATCC nº 43700). Preferentemente se utilizan bacterias atenuadas, y entre ellas se incluyen A. salmonicidia vapA (Gustafson et al., J. Mol. Biol. 237:452-463, 1994)

o mutante dependiente de aromáticos de A. salmonicidia (Vaughan et al., Infect. Immun. 61:2172-2181, 1993). [0095] Entre los ejemplos de bacterias que pueden acceder naturalmente al citoplasma de células de aves se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Salmonella galinarum (ATCC nº

9184), Salmonella enteriditis (ATCC nº 4931) y Salmonella typhimurium (ATC nº 6994). Resultan preferentes las bacterias atenuadas y entre ellas se incluyen cepas atenuadas de Salmonella, tales como S. galinarum crp mutante (Curtiss et al., supra, 1987) o S. enteriditis aroA dependiente de aromáticos mutante CVL30 (Cooper et al., Infect. Immun. 62:4739-4746, 1994). [0096] Entre los ejemplos de bacterias que pueden acceder naturalmente al citoplasma de las células de reptil se incluyen, aunque sin limitación, Salmonella typhimurium (ATCC nº 6994). Resultan preferentes las bacterias atenuadas y entre ellas se incluyen cepas atenuadas tales como el mutante dependiente de aromáticos de S. typhimurium (Hormaeche et al., supra). [0097] Los métodos también proporcionan el transporte de ARN a otras células eucarióticas, por ejemplo células vegetales, con la condición de que existan microorganismos que sean capaces de invadir dichas células, naturalmente o tras haber sido modificadas para ser invasivas. Entre los ejemplos de microorganismos que pueden invadir las células vegetales se incluyen Agrobacterium tumefacium, que utiliza una estructura similar a un pelo, que se une a la célula vegetal mediante receptores específicos, y seguidamente mediante un proceso similar a la conjugación bacteriana transmite por lo menos parte de su contenido a la célula vegetal. [0098] A continuación se proporcionan ejemplos de líneas celulares a las que puede transportarse ARN según el método de la presente invención. [0099] Entre los ejemplos de líneas celulares humanas se incluyen, aunque sin limitación, ATCC nº CCL 62, CCL 159, HTB 151, HTB 22, CCL 2, CRL 1634, CRL 8155, HTB 61 y HTB104. [0100] Entre los ejemplos de líneas celulares bovinas se incluyen ATCC nº CRL 6021, CRL 1733, CRL 6033, CRL 6023, CCL 44 y CRL 1390. [0101] Entre los ejemplos de líneas celulares ovinas se incluyen ATCC nº CRL 6540, CRL 6538, CRL 6548 y CRL 6546. [0102] Entre los ejemplos de líneas celulares porcinas se incluyen ATCC nº CL 184, CRL 6492 y CRL 1746. [0103] Entre los ejemplos de líneas celulares felinas se incluyen CRL 6077, CRL 6113, CRL 6140, CRL 6164, CCL 94, CCL 150, CRL 6075 y CRL 6123. [0104] Entre los ejemplos de líneas celulares de búfalo se incluyen CCL 40 y CRL 6072. [0105] Entre los ejemplos de células caninas se incluyen ATCC nº CRL 6213, CCL 34, CRL 6202, CRL 6225, CRL 6215, CRL 6203 y CRL 6575. [0106] Entre los ejemplos de líneas celulares derivadas de cabra se incluyen ATCC nº CCL 73 y ATCC nº CRL 6270. [0107] Entre los ejemplos de líneas celulares derivadas de caballo se incluyen ATCC nº CCL 57 y CRL 6583.

[0108] Entre los ejemplos de líneas celulares de ciervo se incluyen ATCC nº CRL 6193-6196. [0109] Entre los ejemplos de líneas celulares derivadas de primate se incluyen aquéllas de chimpancé, tales como ATCC nº CRL 6312, CRL 6304 y CRL 1868; líneas celulares de mono, tales como ATCC nº CRL 1576, CCL 26 y CCL 161; la línea celular de orangután ATCC nº CRL 1850, y la línea celular de gorila ATCC nº CRL 1854.

4. Composiciones farmacéuticas

[0110] En una realización preferente de la invención, las bacterias invasivas que contienen las moléculas de ARN y/o de ADN codificante del mismo, se introducen en un animal por las vías de inoculación intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, peroral, intranasal, intraocular, intrarrectal, intravaginal, intraósea, oral, por inmersión e intrauretral. [0111] La cantidad de bacterias invasivas vivas de la presente invención que debe administrarse en un sujeto varía dependiendo de la especie del sujeto, así como de la enfermedad o condición bajo tratamiento. Generalmente, la dosis utilizada se encuentra comprendida entre aproximadamente 103 y 1011 organismos viables, preferentemente entre aproximadamente 105 y 109 organismos viables en cada sujeto. [0112] Las bacterias invasivas de la presente invención generalmente se administran conjuntamente con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable particular utilizado no resulta crítico para la presente invención. Entre los ejemplos de diluyentes se incluyen una solución salina tamponada con fosfato, tampón para el tamponado frente al ácido gástrico en el estómago, tal como tampón citrato (pH 7,0) que contiene sacarosa, el tampón bicarbonato (pH 7,0) solo (Levine et al., J. Clin. Invest. 79:888-902, 1987; y Black et al., J. Infect. Dis. 155:1260-1265, 1987), o el tampón bicarbonato (pH 7,0) que contiene ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo (Levine et al., Lancet II:467-470, 1988). Entre los ejemplos de portadores se incluyen proteínas, por ejemplo tales como las presentes en leche desnatada; azúcares, por ejemplo sacarosa, o polivinilpirrolidona. Típicamente, estos portadores se utilizan a una concentración de entre aproximadamente 0,1% y 30% (p/v), aunque preferentemente en un intervalo de entre 1% y 10% (p/v). [0113] Posteriormente se proporcionan otros portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para el transporte por vías específicas. Puede utilizarse cualquier de dichos portadores o diluyentes para la administración de las bacterias de la invención, con la condición de que las bacterias todavía sean capaces de invadir una célula diana. Pueden llevarse a cabo ensayos in vitro o in vivo de invasividad para determinar los diluyentes y portadores apropiados. Las composiciones de la invención pueden formulase para una diversidad de tipos de administración, incluyendo la administración sistémica y tópica, o localizada. Las formas liofilizadas también se encuentran incluidas, con la condición de que las bacterias sean invasivas tras entrar en contacto con una célula diana o tras la administración en el sujeto. Pueden encontrarse de manera general técnicas y formulaciones en Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para la administración sistémica, resulta preferente la inyección, incluyendo la intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, la composición, por ejemplo de bacterias, de la invención puede formularse en soluciones líquidas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank o solución de Ringer. [0114] Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ligantes (por ejemplo almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa), rellenos (por ejemplo lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo estearato de magnesio, tal como sílice); desintegrantes (por ejemplo almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo laurilsulfato sódico). Las tabletas pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos de la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse en forma de un producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (por ejemplo lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo metil-p-hidroxibenzoatos o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según resulte apropiado. [0115] Pueden formularse convenientemente preparaciones para la administración oral para proporcionar la liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de tabletas o pastillas formuladas de modo convencional. [0116] Para la administración mediante inhalación, las composiciones farmacéuticas para la utilización según la presente invención se administran convenientemente en forma de pulverizador de aerosol a partir de paquetes presurizados o de un nebulizador, con la utilización de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para la utilización en un inhalador o insuflador que contenga una mezcla de polvos de la composición, por ejemplo bacterias, y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón. [0117] Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, por ejemplo mediante la inyección de un bolo o la infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvos para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de la utilización. [0118] Las composiciones farmacéuticas también pueden formularse en composiciones recta-les, intravaginales o intrauretrales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo que contengan bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. [0119] La administración sistémica también puede realizarse por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se utilizan penetrantes apropiados a la barrera que debe permease. Dichos penetrantes son generalmente conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, pueden utilizarse detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosal puede realizarse a través de pulverizadores nasales o utilizando supositorios. Para la administración tópica, las bacterias de la invención se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas, tal como es conocido generalmente de la técnica, con la condición de que las bacterias todavía sean invasivas al entra en contacto con una célula diana. [0120] Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador y/o un kit que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contengan el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o plástica, tal como paquete blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede acompañarse de instrucciones para la administración. [0121] Las bacterias invasivas que contienen el ARN o ADN codificante de ARN que deben introducirse pueden utilizarse para infectar células animales que se cultiven in vitro, tal como células obtenidas de un sujeto. Estas células infectadas in vitro pueden introducirse seguidamente en animales, por ejemplo el sujeto del que se obtuvieron inicialmente las células, por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o intraperitoneal, o mediante cualquier vía de inoculación que permita que las células entren en el tejido del huésped. Al administrar ARN a células individuales, la dosis de organismos viables que debe administrarse presentará una multiplicidad de infección comprendida entre aproximadamente 0,1 y 106, preferentemente entre aproximadamente 102 y 104 bacterias por célula. [0122] Las bacterias también pueden transportar moléculas de ARN codificantes de proteínas hasta células, por ejemplo células animales, a partir de las que posteriormente pueden recolectarse o purificarse las proteínas. Por ejemplo, puede producirse una proteína en una célula de un cultivo de tejido. [0123] Aunque la invención ha sido descrita conjuntamente con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretender ser ilustrativa y no limitativa del alcance de la invención, que se encuentra definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones se encuentran comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas. [0124] La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como limitativos en modo alguno. La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia. Dichas técnicas se explican por completo en la literatura (ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, editado por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover, editor, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, editor, 1984); Mullis et al., patente US nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, editores, 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins, editores, 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; el tratado Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos, editores, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, vols. 154 y 155 (Wu et al., editores); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, editores, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, editores, 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

EJEMPLOS Métodos

Construcción de plásmido generador de ARNip: [0125] Se obtuvieron oligonucleótidos a una concentración de 0,2 µmoles de QIAGEN mediante purificación PAGE. Tras la hibridación, los oligonucleótidos se insertaron en los sitios de unión BamHI e HindIII dentro de pSilencer 2.0-U6 (Ambion, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. [0126] Se utilizaron las secuencias siguientes:

Los 64-meros k-Ras-1 y k-Ras-2 presentan como diana los nucleótidos codificantes de

los aminoácidos 9 a 15 de la proteína k-Ras, que comprende la mutación específica de

V12.

k-Ras-1 (64-mero):

5'gATCCCgTTggAgCTgTTggCgTAgTTC

AAgAgACTACgCCAACAgCTC-

CAACTTTTT TggAAA3' (SEC ID nº 1)

k-Ras-2 (64-mero):

5'AgCTTTTCCAAAAAAgTTggAgCTgTT

ggCgTAgTCTCTTgAACTACgCCAA

CAgCTCCAACgg3' (SEC ID nº 2)

Los 64-meros β-catenina-1 y β-catenina-2 presentan como diana los nucleótidos codifi

cantes de los aminoácidos 79 a 85 dentro de la proteína Catenina.

β-Catenina-1 (64-mero):

5'gATCCCAgCTgATATTgATggACAgT

TCAAgAgACTgTCCATCAATATCAgC

TTTTTTTggAAA3' (SEC ID nº 3)

β-Catenina-2 (64-mero):

5'AgCTTTTCCAAAAAAAgCTgATATT

gATggACAgTCTCTTgAACTgTCCATC

AATATCAgCTgg3' (SEC ID nº 4)

Los 64-meros EGFP-1 y EGFP-2 presentan como diana los nucleótidos codificantes de

los aminoácidos 22 a 28 de EGFP.

EGFP-1 (64-mero):

5'gATCCCgACgTAAACggCCACAAgTT

TCAAgAgAACTTgTggCCgTTTACgT

CTTTTTTggAAA3' (SEC ID nº 5)

EGFP-2 (64-mero): 5'AgCTTTTCCAAAAAAgACgTAAACggCCACAAgTTCTCTTgAAACTTgTgg CCgTTTACgTCgg3' (SEC ID nº 6)

Construcción de plásmido de interferencia de ARN trans-Reino [0127] El plásmido manipulado pT7RNAi-Hly-Inv, TRIP se construyó a partir de pGB2�inv-hly (Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15:8783, 1987) y pBlueScript II KS(+). Los oligonucleótidos que contenían un sitio de clonación múltiple (MCS), y promotor, intensificador y terminador de T7 (sintéticos de Qiagen) se ligaron en los sitios romos BssHII de oligos en horquilla KSII(+) y β-catenina en los sitios BamHI y SalI de MCS para generar el plásmido pT7RNAi. Los fragmentos PstI que contenían el locus inv de pGB2�inv-hly se insertaron en el sitio PstI de KSII(+). Mediante la utilización de pGB2�inv-hly como molde, se amplificó el gen HlyA mediante PCR (ADN polimerasa Pfx, Invitrogen Inc.) con los cebadores hly-1: 5'CCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTA-3' (SEC ID nº 7) y hly-2: 5'AAGCTTTTAAATCAGCAGGGGTCTTTTTGG-3' (SEC ID nº 8) y se clonaron en el sitio EcoRV de KSII(+)/Inv. Se extrajo el fragmento Hly-Inv con BamHI y SalI. Tras formar extremos romos, se ligó en el sitio EcoRV que había sido incorporado dentro del terminador de T7 en pT7RNAi.

Bacterias: [0128] La bacteria auxotrófica Salmonella typhimurium aroA 7207 (S. typhimurium 2337-65 derivado hisG46, DEL407[aroA544::Tn10(Tc-s)] utilizado como el plásmido portador en el presente estudio fue amablemente proporcionada por el profesor BAD Stocker, Stanford University, CA. Se utilizó Escherichia coli XL-1 Blue para el mantenimiento de los plásmidos (Stratagene). [0129] La transformación de SL 7207 se consiguió utilizando un protocolo de electroporación adaptado (1). Se incubaron SL7207 competente y 1 µg de plásmido en hielo en una cubeta de electroporación de 0,2 cm fría durante 5 minutos. Se aplicó un impulso de 2,5 kV, 25 µF, 200 � aplicado utilizando un BioRad Genepulser. Se añadió 1 ml de medio SOC precalentado y se dejó que se recuperasen las bacterias durante 1 hora a 37ºC bajo agitación de 225 rpm antes de la siembra en placas de ágar selectivo. La presencia de los plásmidos se confirmó utilizando la minipreparación tras la lisis alcalina y la separación en gel de agarosa al 0,7%. [0130] Para los experimentos in vitro, se cultivaron SL 7202 durante la noche a 37ºC en caldo Luria (LB) suplementado con 100 µg/ml de ampicilina (para SL-siRAS, SL-siGFP y SL-siCAT) sin agitación. A la mañana siguiente se cultivaron las bacterias en medio fresco tras la inoculación de 1% del cultivo de durante la noche hasta alcanzar una DO600 de 0,4 a 0,6. Se centrifugaron las bacterias (3.500 rpm, 4ºC) una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS a las concentraciones deseadas. Para todas las determinaciones de número y densidad de bacterias, se midió la densidad bacteriana espectrofotométricamente y se calculó según la fórmula c = DO600 * 8x108/ml. [0131] Para los experimentos animales, se cultivaron SL 7207 en caldo de infusión de cerebro-corazón (Sigma) en un cultivo estable durante la noche suplementado con los antibióticos apropiados en caso necesario. Las bacterias se levaron y se resuspendieron en PBS a una densidad de 2,5x1010/ml. Se realizaron diluciones en serie y se sembraron en placas de ágar selectivo en varios tiempos durante el experimento con el fin de verificar el número real de bacterias administrado. [0132] También se transformaron plásmidos en la cepa BL21DE3 (Gene Therapy Systems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bacterias se cultivaron a 37ºC en caldo de infusión de cerebro-corazón con la adición de 100 µg/ml de ampicilina. Se calcularon los números de bacterias utilizando mediciones de DO600. Para la infección celular, los cultivos durante la noche se inocularon en medio fresco para 2 horas adicionales de cultivo.

Cultivo celular: [0133] En la presente memoria se utilizó una línea celular humana de cáncer de colon (SW 480). Porta una mutación de la proteína APC que resulta en niveles basales incrementados de β-catenina. Se utilizó una línea celular que expresaba establemente GFP derivada de epitelio del saco vitelino, CRL 2583 (ATCC, Rockville, MD) para los experimentos de inactivación de GFP. Se mantuvieron CRL 2583 en 200 µg/ml de GR418 hasta 30 minutos antes de la infección bacteriana. Se cultivaron SW 480 en RPMI-1640 suplementado con suero de feto bovino al 10%. Se cultivaron CRL 2583 en DMEM rico en glucosa y en NaHCO3 suplementado con FBS al 15% según recomendación del proveedor. Todos los medios de cultivos se suplementaron rutinariamente con antibióticos: 100 U/ml de penicilina, estreptomicina 10 µg/ml, anfotericina 2,5 µg/ml (todos los medios y aditivos se obtuvieron de Sigma, St. Louis). [0134] Para la transfección directa de los plásmidos, se sembraron 500.000 células en placas Ptri de 6 cm y se dejaron crecer durante la noche antes de transfectarlas utilizando un protocolo estándar de coprecipitación con CaP. [0135] Brevemente, se mezclaron 15 µg de plásmido de ADN en 500 µl de mezcla de reacción (2x tampón HEPES, 60 µl de CaP) y se vertieron en las células en medio fresco sin FBS. Se dejó que continuase la precipitación durante 9 horas antes de eliminar mediante lavado los precipitados. Se recolectaron las células en diferentes puntos temporales (36, 48, 60, 72 y 96 horas). [0136] Para los ensayos estándares de infección bacteriana, se sembraron 500.000 células en placas Petri de 6 cm y se dejó que se uniesen durante la noche. Treinta minutos antes de la adición de las bacterias, se sustituyó el medio de cultivo con medio fresco sin antibióticos y suero de feto bovino. Se añadió SL 7207-siRAS, -siCAT, -siGFP en 500 µl de PBS para alcanzar la multiplicidad de infección (MOI) prevista, de 100, 500 ó 1.000, y la infección se llevó a cabo en un incubador estándar de 37ºC, 5% de CO2. Al final del periodo de infección indicado, se lavaron las palcas una vez con 4 ml de medio RMPI sin suero y 3 veces con 4 ml de PBS, después con 5 ml de medio RPMI completo fresco que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se añadieron 150 µg/ml de gentamicina. Veinticuatro horas después, se añadió tetraciclina a una concentración final de 15 µg/ml. En los puntos temporales diferentes indicados (24 a 96 horas) tras la invasión bacteriana, se recolectaron las células para la transferencia western o la citometría de flujo. [0137] Para la tinción de las bacterias intracelulares, las células se cultivaron en portaobjetos con cámara Lab-Tek II (Nalgene Nunc., USA). Tras la invasión bacteriana tal como se ha indicado anteriormente, las células se levaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 1% durante 10 minutos. Se añadió solución de naranja de acridina (Sigma) (al 0,01%) durante 45 segundos, lavando después con PBS. Se aplicó tinción de cristal violeta (Sigma) durante 45 segundos, lavando después con PBS. Los cubreobjetos se montaron utilizando medio de montaje PERMOUNTTM y se evaluó la invasión utilizando microscopía confocal.

Ensayo de MTT: [0138] Tras el tratamiento con SL7207-siRAS y/o SL7207-siCAT, las células se tripsinizaron (24 ó 48 horas después), se diluyeron y se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células/pocillo. A continuación, se dejó que las células creciesen durante 4 días. En el punto temporal de incubación deseado, se extrajo medio y se añadieron 100 µl de solución de MTT (5 mg/ml) a cada pocillo. Tras un periodo de incubación de 4 horas, se drenó la solución de MTT y se lisaron las células mediante la adición de 100 µl de reactivo de solubilización (isopropanol:HCl 1 N:SDS al 10%, 43:2:5) a cada pocillo. La señal resultante del producto formazán azul oscuro se determinó fotométricamente a una longitud de onda de 570 nm. La cantidad de formación de color depende del número de células supervivientes en cada pocillo.

Ensayo de formación de colonias: [0139] Tras el tratamiento con SL7207-siRAS y/o SL7207-siCAT, las células se tripsinizaron (24 horas después de la transfección), se diluyeron y se sembraron en MTP de 6 pocillos a una densidad de 750 células/pocillo. Se mantuvieron las células bajo cultivo durante dos semanas adicionales para dejar que se formasen colonias visibles. Dos semanas después, se extrajo el medio y se añadió 1 ml de tinción Giemsa (7,415 g/l) a cada pocillo. Tras una incubación de 10 minutos a 37ºC, se drenó la tinción Giemsa y se lavaron las células con PBS. Se contaron los grupos de más de ocho células como colonias positivas.

Transferencia western: [0140] Se lavaron las células con PBS frío, se desprendieron mediante raspado y se lisaron en tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 2,5 mM, NP-40 al 1%, DTT 1 mM) que contenía mezcla de inhibidor de proteasa al 0,1% (Sigma). Se separaron 20 µg de proteína utilizando gel SDS-Page al 11% y se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,4 µm (Schleicher y Schuel). La membrana se bloqueó utilizando leche al 5% y se incubó durante 1 hora con anticuerpos específicos a las concentraciones indicadas: anticuerpo Living Colors® (Clontech)-1:500, anticuerpo de β-catenina (Santa Cruz)-1:500, anticuerpo de k-Ras (Santa Cruz)-1:300 y de β-actina (Santa Cruz)-1:500. Tras cada incubación se realizó una incubación con anticuerpos secundarios anti-cabra o anticonejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz)-entre 1:1.000 y 1:2.000. Las bandas se detectaron utilizando detección de quimioluminiscencia ECL® (Amersham).

Citometría de flujo: [0141] Para la citometría de flujo, las células se tripsinizaron durante 3 minutos, se resuspendieron en medio fresco y se lavaron en PBS. Tras la centrifugación, las células se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 1%/PBS a 4ºC. Se llevó a cabo la citometría de flujo utilizando FACScan (Becton Dickinson); el análisis se realizó utilizando software CellQuest®.

Técnicas animales: [0142] Se obtuvieron ratones transgénicos GFP+ hembra de seis a ocho semanas de edad (CgTg5Nagy) de Jackson Laboratories. Se alojaron en las instalaciones de investigación animal BIDMC con acceso ad libitum a dieta estándar para roedores y agua potable. El tratamiento se inició a las diez semanas de edad. Para el protocolo de tratamiento i.v., se inyectaron cuatro dosis de 106 cfu de SL-siRAS o SL-siGFP disueltos en 50 µl de PBS en la vena de la cola en días alternativos. Los ratones se pesaron diariamente y se realizó un seguimiento para indicios de enfermedad. [0143] Se sacrificaron los ratones un día después del tratamiento final, cuando se extrajeron las muestras de tejido para histoquímica y análisis de citometría de flujo. Los tejidos se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 6 µm para la histoquímica y la microscopía de fluorescencia. Para la citometría de flujo, se prepararon suspensiones de hepatocitos y de esplenocitos mediante la utilización de filtros celulares (Falcon). Las suspensiones de órganos se fijaron en formalina al 4% y se llevó a cabo citometría de flujo utilizando FACScan (Becton Dickinson); el análisis de los datos se realizó utilizando software CeliQuest®. [0144] Para el modelo de xenoinjerto de cáncer, se asignaron aleatoriamente ratones BALB/c desnudos hembra a dos grupos (n=6). Tres semanas antes del tratamiento, se implantaron subcutáneamente 1x107 células SW480. Los tratamientos se iniciaron tras alcanzar los tumores un diámetro de aproximadamente 10 mm. El grupo de tratamiento recibió una inyección en la vena de la cola de 1x108 cfu de E. coli que expresaba ARNhc contra la β-catenina en PBS. El grupo de control se trató de manera similar, excepto en que E. coli contenía el vector TRIP sin inserción de ARNhc. El tratamiento se llevó a cabo cada 5 días durante un total de tres tratamientos. Los ratones se sacrificaron 5 días después del último tratamiento. Los tejidos se congelaron y se fijaron para el análisis del nivel de ARNm de β-catenina mediante PCR en tiempo real y del nivel de proteína β-catenina mediante inmunohistoquímica. [0145] Para los experimentos de silenciamiento in vivo, se dividieron aleatoriamente ratones C57/BL6 hembra (Charles River Laboratories) en dos grupos. El grupo de tratamiento recibió oralmente 5x1010 cfu de E. coli que expresaban ARNhc contra la β-catenina en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS). El grupo de control se trató de manera similar, excepto en que E. coli contenía el vector TRIP sin la inserción de ARNhc. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes con 6 y 5 ratones por grupo, respectivamente. El tratamiento se llevó a cabo diariamente durante 5 días a la semana durante un total de 4 semanas. Los ratones se sacrificaron 2 días después del último tratamiento y se incluyeron los tejidos en parafina.

Inmunohistoquímica: [0146] Se llevó a cabo la inmunotinción en secciones de tejido de 6 µm utilizando el kit de tinción de avidina-bitoina Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se desparafinaron los portaobjetos y se rehidrataron utilizando un protocolo estándar. Para la extracción de los antígenos, los portaobjetos se calentaron mediante microondas en urea al 5% durante 5 minutos. Los sitios de unión no específica se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% durante 10 minutos y se suprimió la actividad endógena de peroxidasa mediante tratamiento con H2O2 al 3% en metanol durante 10 minutos. Las secciones se expusieron al anticuerpo primario LIVING COLORSTM policlonal de conejo (Clontech) a una dilución de 1:500 durante la noche a 4ºC. El cromógeno utilizado fue 3,3'diamino-enzidina (DAB) (Vector); la contratinción se realizó con hematoxilina.

Detección de la respuesta al interferón: [0147] Se trataron células SW480 durante 2 horas con E. coli transformadas con TRIP codificante de ARNhc contra β-catenina humana o k-Ras mutante a una MOI de 1:1.000. Se utilizaron células no tratadas a modo de control. Las células se recolectaron a las 24, 48 y 72 horas. Se determinaron los niveles de expresión de los genes OAS1, OAS2, MX1, ISGF3γ e IFITM1 mediante RT-PCR utilizando el kit de detección de respuesta a interferón (SBI System Biosciences, CA).

Ejemplo 1: inactivación de la proteína fluorescente verde utilizando el silenciamiento génico in vitro e in vivo mediado por bacterias [0148] En los experimentos siguientes, se utilizó una cepa atenuada de Salmonella typhimurium (SL 7207, obtenido de BAD Stocker, Stanford University). Para demostrar que el concepto resultaba útil como enfoque general, los presentes inventores llevaron a cabo experimentos de confirmación también con otra cepa atenuada de Salmonella typhimurium (VNP 70009, obtenida de VION Pharmaceuticals, New Haven) y una cepa invasiva y atenuada de E. coli (BM 2710, obtenida de P. Courvalin, Institut Pasteur, París). [0149] Se diseñaron plásmidos de silenciamiento basados en un plásmido disponible comercialmente (pSilencer, Ambion) para inactivar los genes diana GFP, β-catenina y k-Ras oncogénico (V12G). Estos plásmidos se transformaron en SL 7207 mediante electroporación y los clones positivos se verificaron mediante cultivo en ágar selectivo y preparación del ADN. [0150] Para el uso in vitro, se demostró la inactivación de la expresión de GFP utilizando la línea celular GFP+ estable CRL 2598 (ATCC, Rockland, Va). La inactivación de k-Ras oncogénico (V12G) y de β-catenina se demostró utilizando la línea celular de cáncer de colon SW 480 y la línea celular de cáncer pancreático CAPAN-1. [0151] Se desarrolló un sistema bacteriano de transporte utilizando una cepa bacteriana invasiva, S. typhimurium, con un plásmido eucariótico de transcripción disponible comercialmente, pSilencer (Ambion). La cepa S. typhimurium SL 7207 (amablemente proporcionada por B. Stocker, Stanford University) se atenuó mediante una auxotrofia en la ruta de síntesis de aminoácidos aromáticos, y muere rápidamente tras la invasión de una célula diana debido a la falta de nutrientes. Esta cepa ha sido utilizada con éxito para el transporte de ADN in vitro y en modelos de ratón, principalmente con el fin de realizar una vacunación de ADN. [0152] Para verificar la entrada bacteriana en células epiteliales, se llevó a cabo un ensayo de invasión. Se infectaron células SW 480 durante 2 horas con SL-siRAS seguido de 2 horas de tratamiento con gentamicina. La tinción con naranja acridina/cristal violeta reveló una buena eficiencia de invasión. El 90% de las células SW 480 alojaba bacterias SL 7207 viables. El número medio de bacterias intracelulares era de 6 (intervalo de 2 a 8) (Fig. 1) (la micrografía A1 es la imagen de transmisión. La micrografía A2 es la imagen fluorescente. La micrografía A3 es la imagen fusionada). El número de bacterias intracelulares viables se redujo rápidamente con el tiempo. Tras 24 y 48 horas, únicamente se encontró que 10% y 3% de las células todavía contenía bacterias. [0153] En el experimento siguiente, se demostró una reducción efectiva de la expresión de GFP en la línea celular GFP+. La inactivación con éxito de los oncogenes k-Ras y β-catenina se confirmó utilizando transferencia western y RT-PCR. La inactivación del oncogén resultó en el retraso del crecimiento y en la reducción de la formación de tumor en un modelo de xenoinjerto animal. [0154] Se inyectaron células que expresaban establemente GFP (CRL 2583) con SL7207 que portaba pSilencer2.0, incluyendo una secuencia para silenciar el ARNm de GFP (SL-siGFP) (ver anteriormente). Tras 48 horas, las células tratadas con SL-siGFP mostraron una reducción marcada de la expresión de GFP en comparación con las células tratadas con SL-siRAS y el control no tratado (Figs. 1B y 1C). El tratamiento con SL-siGFP condujo a la pérdida de la señal de GFP de una manera dependiente de la multiplicidad de infección (MOI) aplicada. En las células no tratadas, únicamente 4,3% mostraban una fluorescencia baja o nula. En las células tratadas con SL-siGFP, esta fracción se incrementó a 78,1% (tratadas con MOI 1:500) y 92,3% (MOI 1:1.000). El tratamiento de control con SL-siRAS condujo a una ligera pérdida de fluorescencia (7,5% a una MOI de 1:500 y 8,4% a una MOI de 1:1.000). Lo anterior también se muestra en la fotografía del microscopio de fluorescencia en la Fig. 1C. La micrografía superior es (200x) de SL-siRAS y la inferior, de células CRL 2583 tratadas con SL-siGFP (parte inferior). Se confirmó este resultado mediante citometría de flujo. [0155] En una serie de experimentos animales con ratones que expresaban establemente GFP, los presentes inventores pudieron demostrar la inactivación de la expresión de GFP en el hígado y en el colon (en ambos órganos una reducción de aproximadamente 50% de la expresión de GFP) tras la aplicación oral e intravenosa de SL 7207 que portaba el plásmido silenciador de GFP. [0156] En experimentos animales, se utilizó S. typhimurium para conseguir el silenciamiento génico en un modelo de ratón transgénico (GFP+). Utilizando este método, se demostró el silenciamiento del transgén en el experimento animal a niveles de ARNm, así como de proteína, y en secciones de tejido de diversos órganos (hígado, tracto gastrointestinal) con una toxicidad limitada.

Ejemplo 2. Inactivación de k-Ras y de β-catenina utilizando el silenciamiento génico mediado por bacterias [0157] A continuación, se aplicó BMGS para inactivar un gen relacionado con una enfermedad específica. La diana era la mutación puntual oncogénica específica en el gen k-Ras, k-RasV12G , que se encuentra presente en la línea celular de carcinoma de colon humano, SW 480. [0158] Tras la construcción de los plásmidos de silenciamiento y antes de su electroporación en SL7207 atenuadas, se sometió a ensayo la actividad de los mismos medinate la transfección en células SW 480 utilizando la coprecipitación con CaP. [0159] La transferencia western (Fig. 4A) demostró una inactivación eficiente de k-Ras utilizando la inserción pSilencer-kRas (V12G) 36 y 48 horas después de la transfección. En puntos temporales posteriores, se recupera la expresión de proteína, debido al crecimiento de los clones transfectados, que presentan una desventaja de crecimiento frente a los clones no transfectados, en los que k-Ras oncogénico todavía regularía la transcripción. Al utilizar BMGS con SL7207 como portador para mediar en la inactivación, los niveles de k-Ras se redujeron a MOI de 1:500 y de 1:1.000. Utilizando BMGS se observó la inactivación de la proteína k-Ras a una eficiencia similar a la de la transfección directa del plásmido silenciador utilizando la coprecipitación con fosfato de calcio, aunque el inicio de la inactivación se retrasó ligeramente, en 12 horas (Fig. 4A). Con una MOI de 1:1.000 pudo observarse el resultado durante un tiempo más prolongado (hasta 72 horas) (Fig. 2A). [0160] La transferencia western para la β-catenina (Fig. 4B) muestra una inactivación retrasada tras la transfección, con un efecto máximo a las 96 horas de la transfección. Presumiblemente este retraso se debía al tiempo de supervivencia de SL 7207 intracelularmente antes de la liberación del plásmido (Fig. 2A). [0161] Tras el tratamiento con SL-siRAS y la inactivación resultante de k-Ras oncogénico (V12G), las células SW 480 mostraron una viabilidad y capacidad de formar colonias significativamente reducidas (Fig. 2B). Se coincubaron las células con cantidades iguales (2,5x108) de bacterias SL-siRAS y SL-siCAT. Las células de control se trataron con SL 207 no transformadas. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se sembraron células en placas de 96 pocillos para el ensayo de MTT y en placas de 6 pocillos, para los ensayos de formación de colonias. A las 120 horas del tratamiento, la viabilidad, según evaluación mediante ensayo de MTT, se había reducido en 62,5% tras el tratamiento con SL-siRAS y 51% tras el tratamiento con SL-siCAT. El tratamiento combinado redujo adicionalmente la viabilidad a 29% del nivel de las células tratadas de control. El tratamiento de SL-siRAS y el tratamiento de SL-siCAT redujeron la capacidad de SW 480 de formar colonias en 37,7% y 50%, respectivamente. El tratamiento combinado provocó una reducción de 63,3%.

[0162] Además, el tratamiento con SL-RAS inhibió por completo la capacidad de formación de tumor de las células SW 480 al inyectarla subcutáneamente en ratones desnudos, mientras que el tratamiento con SL 7207 vacías no influyó sobre la capacidad de las mismas de formar tumores (Fig. 2C). Las células SW 480 (no tratadas, tratadas con SL 7207 o con SL-siRAS) se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos (4x106 células, n = 4 animales por grupo). El pretratamiento con SL-siRAS eliminó por completo la capacidad de formar tumores (no se observaron tumores en ninguno de los cuatro animales, día 40) (Fig. 2C). [0163] Con el fin de someter a ensayo la posibilidad de que dicho enfoque pudiese utilizarse universalmente, se utilizó como diana otro gen relacionado con el cáncer, el gen β-catenina (Fig. 2A). Los niveles elementales de β-catenina son altos en las células SW 480 debido a la presencia de un gen APC mutado, pero pueden reducirse mediante tratamiento con ARNip en horquilla tras la transfección de pSilencer(siCAT) (Fig. 2A). Tras el tratamiento con SL 7207 que portaba pSilencer con el constructo de β-catenina (SL-siCAT), se consiguió una inactivación significativa de la expresión de β-catenina que resultó en una viabilidad y capacidad de formación de colonias reducidas (Fig. 2A). Se inactivó el gen β-catenina a partir de las 96 horas, pero se recuperó a partir de las 144 horas.

Ejemplo 3: silenciamiento génico in vivo mediado por bacterias [0164] El método de mediación bacteriana de ARNi ofrece la posibilidad de utilización selectiva de más de un gen diana simultáneamente, permitiendo una mayor eficiencia en aplicaciones futuras, por ejemplo en el tratamiento anticáncer mediante la interferencia con múltiples rutas oncogénicas. Para someter a ensayo la viabilidad de este tipo de enfoque, se utilizaron como dianas tanto el oncogén k-Ras mutado como el gen β-catenina. Tras el tratamiento simultáneo con SL-siRAS y SL-siCAT, se observó la inactivación de ambos genes a nivel de proteínas, resultando en una viabilidad y capacidad de formación de colonias adicionalmente reducidas (Fig. 2). Estos resultados demuestran que el silenciamiento génico puede utilizarse con éxito in vitro para diferentes genes diana y en diferentes líneas celulares. [0165] Se seleccionó un modelo de ratón para someter a ensayo si dicho enfoque podía utilizarse para silenciar genes diana in vivo. Los ratones CgTg5-Nagy expresan niveles elevados de GFP en todos los tejidos. Se asignaron aleatoriamente 14 ratones a la recepción de cuatro dosis de 106 cfu de SL-siGFP o de SL-siRAS i.v. en días alternativos (siete animales en cada grupo). Este tratamiento resultó bien tolerado, sin pérdidas de peso ni signos clínicamente evidentes de enfermedad. Se sacrificaron todos los ratones un día después del último tratamiento. [0166] Se evaluaron portaobjetos de tejido hepático mediante microscopía de fluorescencia e inmunohistoquímica con anticuerpo de GFP (Fig. 3A). El tratamiento intravenoso con SL-siGFP condujo a una reducción de la fluorescencia en las secciones de hígado de los animales tratados en comparación con los animales de control tratados con SL-siRAS. La tinción histoquímica, con anticuerpo anti-GFP, corroboró que los cambios de fluorescencia habían sido causados por una reducción de GFP y no por cambios de los niveles de fondo de fluorescencia (Fig. 5). Con el fin de verificar que las reducciones de fluorescencia en las secciones de hígado de los ratones tratados estaban realmente provocados por cambios de los niveles de expresión de GFp y no a cambios del nivel de fondo de la fluorescencia, se tiñeron secciones de tejido con anticuerpo específico para GFP. [0167] Los patrones de tinción inmunohistoquímica se correlacionan bien con las imágenes de microscopía de fluorescencia y confirman que los cambios de fluorescencia habían sido causados por una reducción de la expresión de GFP. La microscopía de fluorescencia (50x) y la imágenes inmunohistoquímica correspondiente (50x) de sección de hígado de animales de control (fila superior) y de animales tratados i.v. (fila inferior). [0168] Los patrones de tinción se correlacionaban bien con las imágenes de fluorescencia. El análisis posterior de las imágenes reveló reducciones del número de células que expresaban GFP de entre 9% y 25% tras el tratamiento con SL-siGFP. Estos resultas se confirmaron mediante análisis de citometría de flujo de suspensiones de hepatocitos individuales que demostraron una reducción significativa del número de hepatocitos GFP-positivos en animales tratados con SL-siGFP frente a los tratados con SL-siRAS (Fig. 3B). Se llevaron a cabo mediciones de citometría de flujo de suspensiones de hepatocitos y de esplenocitos. Tras el tratamiento intravenoso con SL-siGFP, el número de hepatocitos GFP+ se redujo significativamente en comparación con los animales de control tratados (SL-siRAS) (SL-siRAS: 50,0% [45,4%53,2%], SL-siGFP: 39,9% [26,1%-53,2%], p<0,05). [0169] Estos resultados indican que puede conseguirse un silenciamiento génico significativo in vivo utilizando dicho enfoque. Mediante la aplicación i.v. de S. typhimurium atenuado, los presentes inventores pudieron extender los resultados in vitro a un modelo de ratón, y conseguir un silenciamiento génico significativo en el hígado. Otros órganos podrían resultar accesibles mediante la utilización de diferentes cepas bacterianas invasivas o diferentes vías de aplicación. Una diana prometedora para el silenciamiento génico mediado por bacterias sería especialmente los fagocitos profesionales, ya que se ha informado de que las eficiencias de transfección son más altas para dichas células que para células del linaje epitelial.

Ejemplo 4: interferencia de ARN trans-Reino [0170] La utilización de ARNi mediada por bacterias en organismos superiores presenta un potencial para la genómica funcional en el sistema mamífero, tal como se ha demostrado anteriormente en C. elegans, y para otras aplicaciones in vivo del ARNi. Para investigar esta posibilidad, se construyó el plásmido bacteriano pT7RNAi-Hly-Inv, denominado TRIP (plásmido de interferencia de ARN trans-Reino) (Fig. 6A). En este nuevo constructo plásmido, se controló la expresión del ARNhc con el promotor del bacteriófago T7 (Milligan y Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989, y Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15:8783-8798, 1987) y no con un promotor o intensificador de mamífero. El ARNhc únicamente puede ser producido por el sistema bacteriano. El vector TRIP contiene el locus Inv que codifica invasión (Isberg et al., Cell 50:769-778, 1987), que permite que E. coli no invasivas entren en células de mamífero positivas para la integrina β1 (Young et al., J. Cell Biol. 116:197-207, 1992). El vector TRIP también contiene el gen Hly A, que codifica la listeriolisina O, que permite que materiales genéticos escapen de las vesículas de entrada (Mathew et al., Gene Ther. 10:1105-1115, 2003, y Grillot-Courvalin et al., Nat. Biotechnol. 16:862-866, 1998). Se introdujeron constructos TRIP en una cepa competente de E. coli no patogénica, BL21DE3, que contiene la ARN polimerasa de T7, para expresar ARNip. Se construyó un TRIP contra el gen de cáncer β-catenina a título de ejemplo. La activación de la ruta de la β-catenina, de sobreexpresión o mutación oncogénica de β-catenina, es responsable del inicio de la amplia mayoría de cánceres de colon y se encuentra implicada en una diversidad de otros tipos de cáncer (Kim et al., Oncogene 24:597-604, 2005). A pesar del potencial de la β-catenina como diana terapéutica de cáncer, la ruta de la βcatenina ha resultado ser recalcitrante a la inhibición por moléculas de tamaño pequeño. La βcatenina es una elección preferente en la demostración de experimentos conceptuales para el ensayo de la potencia de un nuevo enfoque de ARNi debido a que comúnmente se encuentra estabilizado en las células de cáncer. Podría modificarse TRIP para permitir que las bacterias expresasen ARN de interferencia contra diversos genes de interés. [0171] Para determinar si podía conseguirse el silenciamiento génico mediante dicho sistema trans-Reino, se cocultivaron in vitro células de cáncer de colon humano con E. coli durante 2 horas (Figs. 6B y 6D) o durante diferentes tiempos (Fig. 6C), y después se trataron con antibióticos para eliminar las bacterias extracelulares. Las células se cultivaron además durante 48 horas antes de la recolección para el análisis del silenciamiento génico. Tal como se muestra en las Figs. 6B-6D, la β-catenina fue silenciada potente y específicamente al nivel de las proteínas y del ARNm, mientras que k-Ras y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. [0172] (GAPDH) no resultaron afectados. Para someter a ensayo adicionalmente la especificidad del ARNi trans-Reino, E. coli que contenía el TRIP contra el k-Ras mutante (GGT-->GTT en el codón 12) silenciaron la expresión de k-Ras en células SW 480 con la misma mutación del codón 12, pero no en las células DLD1 con mutación en un codón diferente de k-Ras (GGC-->GAC en el codón 13, Fig. 6E). A modo de control de ARNhc, E. coli que contenía TRIP contra k-Ras de tipo salvaje no ejerció ningún efecto de silenciamiento génico sobre k-Ras mutado en células SW 480 (Fig. 6F). Estos resultados muestran que la interferencia de ARN trans-Reino es altamente específica de un gen, en grado suficiente para discriminar una mutación puntual. [0173] Para investigar las variables que afectan a la potencia del silenciamiento génico por el sistema trans-Reino, se incubaron células durante 2 horas con E. coli a diferentes multiplicidades de infección (MOI). Tal como se muestra en la Fig. 6B, la potencia del silenciamiento génico dependía de la MOI, con un silenciamiento génico prácticamente completo a una MOI de

1:1.000. Para determinar el efecto del tiempo de cocultivo sobre el silenciamiento génico, las células se incubaron con E. coli a una MOI de 1:500 durante diferentes tiempos. Tal como se muestra en la Fig. 6C, la potencia del silenciamiento génico se incrementa con el tiempo de incubación hasta las 2 horas. La dependencia del silenciamiento génico de la MOI y el tiempo de cocultivo proporcionan una flexibilidad controlable para el silenciamiento génico en diversas aplicaciones. [0174] Para confirmar adicionalmente que el silenciamiento del gen β-catenina se encuentra mediado específicamente por ARNhc, se intentó identificar el fragmento escindido específico de ARNm de β-catenina mediante la utilización de la técnica de PCR 5'-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Una característica distintiva específica del silenciamiento génico mediado por ARNi es el corte del ARNm de β-catenina en los sitios específicos del ARNm predichos a partir de la secuencia del ARNhc. Basándose en el curso temporal del silenciamiento de la β-catenina (Fig. 7A), se aisló el ARN total a partir de células SW 480 8 horas y 16 horas después del tratamiento con E. coli que expresaba ARNhc contra β-catenina para identificar los fragmentos cortados del ARNm. Se encontró el ARNm de β-catenina cortado incluso sólo 8 horas después del tratamiento con E. coli que expresaba ARNhc; no se detectaron fragmentos en el control (Figs. 7B y 7C). El análisis de la secuencia del intermediario cortado de ARNm de β-catenina confirmó que el sitio de corte se encontraba situado dentro de la secuencia diana. Este resultado demuestra que el ARNhc producido por las bacterias induce un corte específico del ARNm de β-catenina mediante silenciamiento génico mediado por ARNi. [0175] Se ha informado de que la inducción de la respuesta de interferón es un reto potencial para la especificidad de algunos enfoques de ARNi (Bridge et al., Nat. Genet. 34:263-264, 2003, y Hornung et al., Nat. Med. 11:263-270, 2005). Para someter a ensayo si el silenciamiento génico inducido por el ARNi trans-Reino se asocia a la inducción de la respuesta de interferón, se midieron genes claves de la misma. Las 2',5'-oligoadenilato sintetasas (OAS1 y OAS2) son genes inducidos por interferón que resultan importantes para la inhibición de la síntesis de proteínas celulares tras la infección vírica. El gen MX1, un miembro de la familia de proteínas de resistencia a mixovirus inducida por interferón (proteínas MX), participa en la defensa innata del huésped frente a los virus ARN. Un miembro de las proteínas transmembranales inducibles por interferón, IFITM1, media en la actividad antiproliferativa del interferón. ISGF3γ es parte de un receptor celular del interferón implicado en la regulación y estimulación de la transcripción inducidas por interferón. Estos genes han sido utilizados como panel estándar para el análisis de la inducción de la respuesta de interferón por el ARN de interferencia (kit de detección de la respuesta de interferón, SBI Systems Biosciences, CA). El ARNm de los cinco genes de respuesta a interferón se analizó mediante RT-PCR semicuantitativa. Tal como se muestra en la Fig. 7D, no se detectó la inducción de OAS1, OAS2, MX1, ISGF3γ e IFTTM1, tras el tratamiento con E. coli codificante de ARNhc contra la β-catenina. Estos datos demuestran que el silenciamiento génico inducido por el ARNi trans-Reino no se encuentra asociado a inducción no específica de respuesta de interferón. [0176] Se investigó el mecanismo de la transferencia de ARNi trans-Reino. Para determinar si resulta necesaria la entrada celular de E. coli para inducir el ARNi, se comparó la actividad de silenciamiento génico de E. coli con o sin el locus Inv. El gen Inv codifica la invasina, que interactúa con la β1-integrina, facilitando la entrada de E. coli en las células. Tal como se esperaba,

E. coli sin Inv no consiguió entrar en las células (Fig. 8A). Inesperadamente, Inv solo no resultó suficiente para permitir que E. coli entrase en células de cáncer de colon (Fig. 8A), y no se observó silenciamiento génico detectable en ausencia de bacterias intracelulares (Fig. 8B). Se introdujo el gen Hly A, que se cree facilita el escape de materiales genéticos transportados hacia el exterior de vesículas de entrada (Grillot-Courvalin et al., Nat. Biotechnol. 16:862-866, 1998). Tal como se esperaba, Hly solo no consiguió que E. coli entrasen en las células, pero E. coli comensales con tanto Inv como Hly entraron en las células de cáncer de colon con elevada eficiencia (Fig. 8A). Bajo estas condiciones, β-catenina fue potentemente silenciada hasta durante 96 horas (Fig. 8C). Estos resultados demuestran que E. coli requieren tanto Inv como Hly para entrar en las células e inducir el ARNi trans-Reino. [0177] Para determinar si el silenciamiento génico requiere la replicación bacteriana continuada dentro de las células diana, se utilizó tetraciclina para bloquear la replicación bacteriana intracelular y gentamicina para eliminar las bacterias extracelulares. Se incubaron células SW 480 con

E. coli durante 2 horas, seguido del tratamiento de tetraciclina iniciado en diferentes tiempos. Tal como se muestra en la Fig. 8D, tras las 2 horas iniciales de tiempo de infección, 2 horas adicionales de tiempo de incubación sin tetraciclina indujeron un silenciamiento génico prácticamente máximo; el retraso adicional del tratamiento de tetraciclina no presentó ningún efecto potenciador adicional sobre el grado de silenciamiento génico. Inesperadamente, no se obtuvo evidencia de la replicación bacteriana intracelular significativa en ausencia de tetraciclina a las 6 y a las 48 horas (Fig. 8E), probablemente debido a la función de los lisosomas y de otros mecanismos antibacterianos intracelulares (Roy et al., Science 304:1515-1518, 2004, y Battistoni et al., Infect. Immun. 68:30-37, 2000). Estos resultados demuestran que el ARNi trans-Reino no depende de la replicación bacteriana persistente en el interior de las células diana tras la infección inicial (2 horas) y tras el tiempo de incubación (2 horas). [0178] A continuación, se determinó si el enfoque de ARNi trans-Reino funcionaba in vivo. Se administraron E. coli que expresaban ARNhc contra β-catenina en ratones por vía oral. Se administró un inóculo de 5x1010 oralmente cinco veces por semana, que es comparable a una dosis humana de E. coli Nissle 1917 probiótico. La mayor parte del inóculo resultó eliminada durante el paso a través del ambiente bactericida del tracto GI superior. Se trataron los ratones con E. coli que expresaban ARNhc contra β-catenina de ratón o con E. coli que contenían el vector plásmido correspondiente. Se continuó el tratamiento durante cuatro semanas antes de analizar el silenciamiento génico mediante inmunohistoquímica. Tal como se muestra en las Figs. 9A y 9B, la expresión de β-catenina en el epitelio intestinal resultó silenciada por E. coli que expresaba ARNhc de β-catenina (P<0,01), no por las E. coli de control. A modo de control, no se redujo la expresión de GAPDH (Fig. 10). El efecto de silenciamiento génico fue más pronunciado en las regiones de las placas de Peyer o en zonas contiguas a las mismas (Fig. 9B). El tratamiento resultó bien tolerado, sin indicios macroscópicos ni microscópicos de daños epiteliales o de ulceraciones (Fig. 9B). Estos resultados demuestran que los mamíferos responden a E. coli que expresa ARNhc específico con una ARNi local potente in vivo. [0179] Se investigó el enfoque de ARNi trans-Reino para determinar si podía utilizarse para silenciar un gen de enfermedad tras la dosificación sistémica. Se ha sometido a ensayo la administración intravenosa de bacterias terapéuticas en ensayos clínicos con seguridad demostrada en pacientes de cáncer (Toso et al., J. Clin. Oncol. 20:142-52, 2002). Se trataron intravenosamente con 108 cfu de E. coli codificantes de ARNhc contra la β-catenina humana ratones desnudos con cáncer de colon humano xenoinjertado. Se administraron tres dosis a un intervalo de 5 días. Los tratamientos resultaron bien tolerados sin efectos adversos. Tal como se muestra en la Fig. 9, el tratamiento con E. coli codificante de ARNhc contra β-catenina resultó en una reducción significativa del ARNm (p<0,005, Fig. 9C) y de las proteínas (p<0,01, Figs. 9D y 9E) de β-catenina en los tejidos tumorales. Estos datos demuestran que el ARNi trans-Reino mediado por bacterias puede silenciar un gen de enfermedad en una parte distante del cuerpo tras la administración sistémica. [0180] Estos resultados demuestran que el silenciamiento génico puede conseguirse mediante un sistema trans-Reino. Resulta importante que la potencia y especificidad del ARNi se conserve. Se han utilizado E. coli no patogénicas clínicamente como probióticos con seguridad demostrada (Rembacken et al., Lancet 354:635, 1999). Por lo tanto, este sistema trans-Reino proporciona un modo práctico y clínicamente compatible de proporcionar interferencia de ARN para indicaciones médicas. Este tecnología de ARNi basada en E. coli también proporciona un sistema de vector conveniente para llevar a cabo estudios funcionales basados en ARNi de los genes. Finalmente, los resultados invitan a la intrigante posibilidad de que dicho intercambio de ARN de interferencia pueda producirse naturalmente bajo condiciones de cohabitación, infecciosas o simbióticas.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariótico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en el que dicha bacteria invasiva es E. coli.

2. 2.

   Bacteria invasiva según la reivindicación 1, para el uso médico.

3. 3.

   Bacteria invasiva según la reivindicación 1, para el tratamiento o prevención del cáncer

   o de un trastorno de proliferación celular en un mamífero, en la que la expresión de por lo menos un gen en una célula que es conocido que incrementa la proliferación celular se regula mediante la introducción de dicha bacteria invasiva.

4. 4.

   Bacteria invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha bacteria invasiva es una bacteria no patogénica, no virulenta o atenuada.

5. 5.

   Bacteria invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha bacteria invasiva es una bacteria terapéutica.

6. 6.

   Bacteria invasiva según la reivindicación 1, en la que el promotor procariótico es un promotor de T7.

7. 7.

   Uso de por lo menos una bacteria invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o prevención del cáncer o de un trastorno de proliferación celular en un mamífero, en el que la expresión de por lo menos un gen en una célula que es conocido que incrementa la proliferación celular se regula mediante la introducción de dicha bacteria invasiva en dicha célula.

8. 8.

   Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que dicho mamífero es un ser humano.

9. 9.

   Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que dicha célula es una célula de colon o una célula pancreática.

10. 10.

    Bacteria o uso según la reivindicación 9, en los que la célula de colon es una célula SW 480 o en los que la célula pancreática es una célula CAPAN-1.

11. 11.

    Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que el cáncer es cáncer de colon.

12. 12.

    Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que el trastorno de proliferación celular es la poliposis adenomatosa coli familiar (FAP).

13. 13.

    Vector procariótico que comprende por lo menos una molécula de ADN codificante de uno o más ARNip y por lo menos un promotor procariótico, y que comprende además

    por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv.

14. 14.

    Vector procariótico según la reivindicación 13, en el que el promotor procariótico es un promotor de T7.

15. 15.

    Método de administración de uno o más ARNip en células mamífero, comprendiendo el método introducir en dichas células de mamífero por lo menos una bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariótico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en los que dicha bacteria invasiva es E. coli, excluyendo los métodos in vivo de tratamiento.

16. 16.

    Método de regulación de la expresión génica en células de mamífero, comprendiendo el método introducir en dichas células de mamífero por lo menos una bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariotico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en los que los ARNip expresados interfieren con el ARNm del gen que debe regularse, regulando de esta manera la expresión de dicho gen, en los que dicha bacteria invasiva es E. coli, excluyendo los métodos in vivo de tratamiento.

17. 17.

    Métodos según la reivindicación 15 ó 16, en el que dicha célula de mamífero es una célula humana.

18. 18.

    Uso según la reivindicación 7 o método según la reivindicación 15 ó 16, en los que dicho promotor procariótico es un promotor de T7.

19. 19.

    Uso según la reivindicación 7 o método según la reivindicación 16, en los que dicho gen es ras o β-catenina.

20. 20.

    Uso o método según la reivindicación 19, en los que dicho gen ras es k-Ras.

21. 21.

    Composición que comprende la bacteria según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

22. 22.

    Célula huésped eucariótica que comprende la bacteria según la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable.