JP5911923B2 - 細菌によって媒介される遺伝子サイレンシングのための組成物およびその使用方法 - Google Patents

細菌によって媒介される遺伝子サイレンシングのための組成物およびその使用方法 Download PDF

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Description

背景
短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用によるＲＮＡｉ（ＲＮＡ−干渉）を通じての遺伝子サイレンシングは分子生物学のための強力なツールとして出現し、治療的遺伝子サイレンシングに用いられる潜在能力を保有する。標的細胞内で小さなＤＮＡプラスミドから転写された短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、化学的に合成されたｓｉＲＮＡでのトランスフェクションによって得られたものに匹敵するレベルで、安定な遺伝子サイレンシングを媒介し、遺伝子ノックダウンを達成することも示されている（非特許文献１、非特許文献２）。
治療目的でのＲＮＡｉの可能な適用は高価であって、癌遺伝子またはウイルス遺伝子のような病気遺伝子のサイレンシングおよびノックダウンを含む。ＲＮＡｉの治療的使用のための１つの主な障害は、標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達である（非特許文献３）。事実、送達は、ＲＮＡｉについての現在の主要な困難として説明されてきた（非特許文献４のｎｅｗｓ ｆｅａｔｕｒｅに引用されるＰｈｉｌｌｉｐ Ｓｈａｒｐ）。
マウスモデルで用いることができる２つの方法が説明されている：
（１）ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ−コーディングプラスミドの直接的流体力学的静脈内注射（ｄｉｒｅｃｔ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）：この方法を用い、幾人かの著者は、種々の疾患、例えば、Ｂ型肝炎（非特許文献５）、劇症肝炎（非特許文献６）、腫瘍異種移植片（非特許文献７）、肝臓導入遺伝子発現（非特許文献８、非特許文献９）に対するＲＮＡｉの適用を説明してきた。この方法は、マウス尾静脈への高圧および高容量注射（２．５ｍｌ）を用いる。細胞へのｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ取り込みのメカニズムは明らかでないが、恐らくは、血管内皮細胞層への機械的損傷が関連する。この方法の明らかな欠点は、これはかなりの容量を負荷することおよび完全に知られていない作用メカニズムを含むので、ヒト適用への開発ができるような方法ではない点である。
（２）ｓｉＲＮＡをコードするアデノウイルスベクターの標的組織（脳）への直接的注射（非特許文献１０）。この方法は、アデノウイルスベクターによって到達された脳組織における導入遺伝子（ＧＦＰ）発現のサイレンシングを示した。しかしながら、サイレンシングの領域は信頼性を持って予測できなかった。この方法はさらに開発され、局所的な、例えば、腫瘍内注射に適用できるようになろう。ウイルスベクターは遺伝子治療目的で広く用いられてきたが、遺伝子治療実験から学んだ１つの知識は、ウイルス拡大が時々予測できず、望まない副作用を導きかねないことである（非特許文献１１）。干渉性ＲＮＡの哺乳動物への安全かつ予測可能な投与のための新しい方法が必要とされる。
Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．Ａｇａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９６巻，ｐ．５５０ Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ａ．Ａ．Ｃａｕｄｉｙ，Ｇ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎ．，ＰＮＡＳ，２００２年，第９９巻，ｐ．１４４３ ＺａｍｏｒｅＰＤ，Ａｒｏｎｉｎ，Ｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００３年，第９巻，第３号，ｐ．２６６−８ Ｎａｔｕｒｅ，２００３年，第４２５号，ｐ．１０−１２ Ａ．Ｐ．ＭｃＣａｆｆｒｅｙら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌ．，２００３年６月，第２１巻，第６号，ｐ．６３９−４４ Ｅ．Ｓｏｎｇ Ｓ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗａｎｇ Ｎ．Ｉｎｃｅ，Ｊ．Ｍｉｎ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｓｈａｎｋａｒ，Ｊ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｅｃｉｎｅ，２００３年，第９巻，ｐ．３４７ Ｓｐａｅｎｋｕｃｈ Ｂ，ら，ＪＮＣＩ，２００４年，第９６巻，第１号，ｐ．８６２−７２ Ｄ．Ｌ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｅ．Ｈａｇｓｔｒｏｍ，Ａ．Ｇ．Ｌｏｏｍｉｓ，Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ．Ｈ．Ｈｅｒｅｉｊｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２００２年，第３２巻，ｐ．１０７ Ｄ．Ｒ．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＤＲ，Ｍ．Ｌｅｉｒｄａｌ，Ｍ．Ｓｉｏｕｄ，ＪＭＢ，２００３年，第３２７巻，ｐ．７６１ Ｈ．Ｘｉａ，Ｑ．Ｍａｏ，Ｈ．Ｌ．Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２年，第２０巻，ｐ．１００６ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第２８６巻，第５４４８号，ｐ．２２４４−５
発明の概要
本発明は、一般には、細菌を細胞に導入することによって１以上のｓｉＲＮＡを真核生物細胞に送達する方法、ここで、細菌は１以上のｓｉＲＮＡまたは１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子を含有する、に関する。
この方法の１つの具体例において、真核生物細胞はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）である。本発明のもう１つの具体例において、真核生物細胞はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）である。
また、本発明は、細菌を細胞に導入することによって、真核生物細胞における遺伝子発現を調節する方法、ここで、細菌は１以上のｓｉＲＮＡまたは１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子を含有し、発現されたｓｉＲＮＡは調節すべき遺伝子のｍＲＮＡと干渉し、それにより、遺伝子の発現を調節する、に関する。
この方法の１つの具体例において、発現されたｓｉＲＮＡは細胞の多酵素複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−誘導サイレンシング複合体）に指令して、調節すべきｍＲＮＡと相互作用させる。この複合体はｍＲＮＡを分解する。これは遺伝子の発現を減少させるか、または阻害する。この方法のもう１つの具体例において、遺伝子はｒａｓまたはβ−カテニンである。この具体例の１つの態様において、ｒａｓはｋ−Ｒａｓである。
本発明の前記方法の１つの具体例において、真核生物細胞は哺乳動物細胞である。この具体例の１つの態様において、該哺乳動物細胞はヒト細胞である。
また、本発明は、細菌を細胞に導入することにより、細胞増殖を増加させることが知られている細胞において遺伝子またはいくつかの遺伝子の発現を調節することによって、哺乳動物において癌または細胞増殖障害を治療または予防する方法に関する。細菌は１以上のｓｉＲＮＡまたは１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子を含有する。
本発明のこの方法の１つの具体例において、哺乳動物はヒトである。この方法のもう１つの具体例において、発現されたｓｉＲＮＡは調節すべき遺伝子のｍＲＮＡと干渉する。この具体例の１つの態様において、発現されたｓｉＲＮＡは、細胞の多酵素複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−誘導サイレンシング複合体）が、調節すべきｍＲＮＡと相互作用するよう指令する。この複合体はｍＲＮＡを分解する。これは遺伝子の発現を減少させるか、または阻害する。
この方法のもう１つの具体例において、遺伝子はｒａｓまたはβ−カテニンである。この具体例の１つの態様において、ｒａｓはｋ−Ｒａｓである。
本発明のこの方法のもう１つの具体例において、細胞は結腸癌細胞または膵臓癌細胞である。この具体例の１つの態様において、結腸癌細胞はＳＷ４８０細胞である。この具体例のもう１つの態様において、膵臓癌細胞はＣＡＰＡＮ−１細胞である。
本発明の前記方法の１つの具体例において、細菌は非病原性（ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）または非毒性（ｎｏｎ−ｖｉｒｕｌｅｎｔ）である。この具体例のもう１つの態様において、細菌は治療用である。この具体例のもう１つの態様において、細菌はリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）よりなる群から選択される減弱化株である。所望により、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株はサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）種の減弱化株である。所望により、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株はＳＬ ７２０７またはＶＮＰ２０００９である。所望により、Ｅ．ｃｏｌｉ株はＢＭ ２７１０である。
本発明の前記方法のもう１つの具体例において、１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子は真核生物細胞内で転写される。この具体例の１つの態様において、１以上のｓｉＲＮＡはｓｈＲＮＡとして真核生物細胞内で転写される。この具体例のもう１つの態様において、１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子はＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有する。所望により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターである。
本発明の前記方法のもう１つの具体例において、１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子は細菌内で転写される。この具体例の１つの態様において、１以上のＤＮＡ分子は原核生物プロモーターを含有する。所望により、原核生物プロモーターはＴ７プロモーターである。
本発明の前記方法のもう１つの具体例において、１以上のＤＮＡ分子は、タイプＩＩＩ輸出または細菌溶解を通じて真核生物細胞に導入される。この具体例の１つの態様において、細菌溶解は、細胞内活性抗生物質の添加によってトリガーされる。所望により、抗生物質はテトラサイクリンである。この具体例のもう１つの態様において、細菌溶解は細菌代謝の減弱を介してトリガーされる。所望により、代謝減弱は栄養要求性である。
また、本発明は、１以上のｓｉＲＮＡまたは１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子を含有する細菌に関する。
本発明の１つの具体例において、細菌は非病原性または非毒性細菌である。この具体例の１つの態様において、細菌は治療用細菌である。
本発明のもう１つの具体例において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅよりなる群のメンバーから選択される減弱化株である。所望により、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ種の減弱化株である。所望により、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株はＳＬ ７２０７またはＶＮＰ２０００９である。所望により、Ｅ．ｃｏｌｉ株はＢＭ ２７１０である。
また、本発明は、１以上のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩＩ適合性プロモーター（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）または原核生物プロモーターを含有する原核生物ベクターに関する。
本発明のこのベクターの１つの具体例において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターである。本発明のこのベクターのもう１つの具体例において、原核生物プロモーターはＴ７プロモーターである。
他に定義されない限り、本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたのと同様なまたは同等な方法および材料を本発明の実施または試験で用いることができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及する全ての刊行物、特許出願、特許および他の文献は本明細書に引用して援用する。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が支配する。加えて、材料、方法および実施例は説明のためだけのものであり、限定的であることを意図しない。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１Ａは、ＳＬ７２０７のＳＷ４８０細胞への侵入の顕微鏡写真を示す。 図１Ｂは、ＣＲＬ２５８３細胞における緑色蛍光蛋白質発現のノックダウンのＦＡＣＳ分析を示す。 図１Ｃは、ＣＲＬ２５８３細胞における蛍光の喪失を示す顕微鏡写真を示す。 図２ＡはＳＷ４８０細胞におけるｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンのウエスタンブロットを示す。 図２Ｂは、種々の処理方法下でのＳＷ４８０細胞の生存性を示す一連の棒グラフである。 図２Ｃは、種々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞を注射したヌードマウスにおける腫瘍形成性の写真を示す。 図３Ａは、トランスジェニックマウス肝臓セクションの顕微鏡写真を示す。 図３Ｂは、肝細胞および脾臓細胞懸濁液のフローサイトメトリー測定を示す。 図４は、サイレンサープラスミドでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞からのｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンのウエスタンブロットを示す。 図５は、ＧＦＰ発現レベルの変化を示すマウスの肝臓セクションの組織化学染色の顕微鏡写真を示す。 図６Ａは、Ｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｌａｓｍｉｄ （ＴＲＩＰ）を示す模式図である。 図６Ｂは、ＴＲＩＰでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞からのβ−カテニンのイムノブロットを示す写真である。図６Ｃは、３０ないし１２０分間の曝露時間に対する、ＴＲＩＰでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞からのβ−カテニンのイムノブロットを示す写真である。図６Ｄは、ＴＲＩＰでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞からのβ−カテニンおよびｋ−Ｒａｓ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ写真を示す。図６Ｅは、突然変異体ｋ−Ｒａｓ（コドン１２においてＧＧＴ→ＧＴＴ）または突然変異体ｋ−Ｒａｓ（コドン１３においてＧＧＣ→ＧＡＣ）に対するＴＲＩＰでのトランスフェクションに続いてのＳＷ４８０およびＤＬＤ１細胞におけるｋ−Ｒａｓのイムノブロットを示す写真である。図６Ｆは、野生型ｋ−Ｒａｓに対するＴＲＩＰでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞のイムノブロットを示す写真である。 図７Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ｓｈＲＮＡでの処理に続いてのβ−カテニンのサイレンシングを示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。図７Ｂは、β−カテニンにおける特異的切断部位を示す模式図である。図７Ｃは、特異的切断産物を示す５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの写真である。図７Ｄは、種々の遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すブロットの写真である。 図８Ａは、ＩｎｖおよびＨｌｙの双方が細菌進入に必要であることを示す細胞染色の写真である。図８Ｂは、Ｈｌｙを欠くＴＲＩＰが標的遺伝子のノックダウンを誘導できないことを示すＲＮＡブロットの写真である。図８Ｃは、効果的なトランスキングダムｉＲＮＡを促進するのにＩｎｖおよびＨｌｙ双方が必要なことを示すＲＮＡブロットの写真である。図８Ｄは、遺伝子サイレンシングに対するテトラサイクリンの遅延された添加の効果を示すＲＮＡブロットの写真である。図８Ｅは、２時間のインキュベーションを超えて抗生物質の不存在下における有意な細菌複製の欠如を示す細胞染色の写真である。 図９Ａは、マウスにおけるβ−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉの経口投与が、腸上皮におけるβ−カテニン発現の有意な低下に導くことを示すグラフである。図９Ｂは、処理の有りまたは無しでの、腸上皮の免疫組織化学染色の写真である。図９Ｃは、処理後の、β−カテニンｍＲＮＡ発現の減少を示すグラフである。図９Ｄは、処理後の、β−カテニン蛋白質発現の減少を示すグラフである。図９Ｅは、処理後の、β−カテニン蛋白質発現の減少を示す免疫組織化学染色の写真である。 図１０は、ＧＡＰＤＨ発現が、マウスにおける経口投与後のβ−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉによって変化されないことを示す免疫組織化学染色の写真である。
発明の詳細な説明
本発明は、細菌の非病原性株または治療用株を用いて、小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を真核生物細胞に送達する方法に関する。細菌は、ＲＮＡをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ自体を送達して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を行う。本発明の干渉性ＲＮＡは真核生物細胞において遺伝子発現を調節する。それは、標的細胞内部の注目する遺伝子をサイレントとし、またはそれをノックダウンする。干渉性ＲＮＡは、細胞が所有する多酵素−複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−誘導サイレンシング複合体）に指令して、遺伝子のｍＲＮＡをサイレントとさせる。ＲＩＳＣおよびｍＲＮＡの相互作用は、ｍＲＮＡの分解をもたらす。これは、注目する遺伝子の効果的な翻訳後サイレンシングを導く。この方法を細菌媒介遺伝子サイレンシング（ＢＭＧＳ）という。
細菌送達は、抗生物質、および増殖することができない減弱化細菌株の使用によって制御することができるので、それはウイルス送達よりも魅力的である。また、細菌はずっと遺伝子操作しやすく、これは、ある種の適用に対して特別に仕立てたベクター株の生産を可能とする。本発明の１つの具体例において、本発明の方法を用いて、ＲＮＡｉを組織特異的に引き起こす細菌を作り出す。
ｓｉＲＮＡは直接的にまたはトランスフェクションによって標的細胞に導入されるか、あるいはＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩＩ適合性プロモーター（Ｕ６，Ｈ１）を持つ特異的プラスミドからのヘアピン−構造ｄｓＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として標的細胞内で転写することができる（Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ａ．Ａ．Ｃａｕｄｉｙ，Ｇ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎ，ＰＮＡＳ ９９，１４４３（２００２），Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．Ａｇａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，５５０（２００２））。
細胞内細菌からのｓｉＲＮＡコーディングプラスミドの遊離は、活性なメカニズムを通じて起こる。１つのメカニズムは、細胞の外側への毒性因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ）の分泌により標的細胞に対するシグナリングを可能とする機能を含むが、細菌溶解および細菌内容物の細胞質への遊離を通じて標的細胞へ抗原を送達するためにも用いることができる、細菌細胞膜にわたる特殊な多蛋白質複合体である、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるタイプＩＩＩ輸出系を含む（Ｒｕｓｓｍａｎｎ Ｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２９３：１０７−１２（２００３））。細胞内細菌の溶解は、細胞内で活性な抗生物質（テトラサイクリン）の付加を通じてトリガーされるか、あるいは細菌代謝減弱（栄養要求性）を通じて天然で起こる。真核生物転写プラスミドの遊離の後、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは標的細胞内で生産され、ｍＲＮＡ分解の高度に特異的なプロセスをトリガーし、その結果、標的化遺伝子がサイレンシングされる。
本発明の非毒性細菌は侵入特性を有し、種々のメカニズムを介して哺乳動物宿主細胞に進入することができる。特殊化されたリソソーム内での細菌の破壊を通常はもたらす専門的なファゴサイトによる細菌の取込みとは対照的に、侵入的細菌株は、非ファゴサイトーシス的に宿主細胞に侵入する能力を有する。そのような細菌の天然に存在する例はＬｉｓｔｅｒｉａ、ＳｈｉｇｅｌｌａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような細胞内病原体であるが、この特性は、侵入−関連遺伝子の導入を通じてのプロバイオティックを含め、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅのような他の細菌に移動させることもできる（Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ３１８，１２０７（１９９５））。本発明の他の具体例において、干渉性ＲＮＡを宿主細胞に送達するために用いられる細菌はシゲラ・フレキシネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｄ．Ｒ．Ｓｉｚｅｍｏｒｅ，Ａ．Ａ．Ｂｒａｎｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｃ．Ｓａｄｏｆｆ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，２９９（１９９５））、侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒａｖａｌｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ３１８，１２０７（１９９５）Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｆ．Ｈｕｅｔｚ，Ｄ．Ｍ．Ｏｊｃｉｕｓ，Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，８６２（１９９８））、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（Ａ．Ａｌ−Ｍａｒｉｒｉ Ａ，Ａ．Ｔｉｂｏｒ，Ｐ．Ｌｅｓｔｒａｔｅ，Ｐ．Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｘ．Ｄｅ Ｂｅｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．Ｌｅｔｅｓｓｏｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０，１９１５（２００２））、およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｍ．Ｈｅｎｓｅ，Ｅ．Ｄｏｍａｎｎ，Ｓ．Ｋｒｕｓｃｈ，Ｐ．Ｗａｃｈｈｏｌｚ，Ｋ．Ｅ．Ｄｉｔｔｍｅｒ，Ｍ．Ｒｏｈｄｅ，Ｊ．Ｗｅｈｌａｎｄ，Ｔ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３，５９９（２００１），Ｓ．Ｐｉｌｇｒｉｍ，Ｊ．Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｏｅｎ，Ａ．Ｋｏｌｂ−Ｍａｕｒｅｒ，Ｇ．Ｇｅｇｉｎａｔ，Ｍ．Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｉ．Ｇｅｎｔｓｈｃｅｖ，Ｗ．Ｇｏｅｂｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１０，２０３６（２００３））を含む。いずれの侵入性細菌も真核生物細胞へのＤＮＡ導入で有用である（Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，Ｔ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ １２，４６７（２００１））。
ＢＭＧＳは、天然で侵入的な病原体Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて行われる。この具体例の１つの態様において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株はＳＬ ７２０７およびＶＮＰ２０００９を含む（Ｓ．Ｋ．Ｈｏｉｓｅｔｈ，Ｂ．Ａ．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２９１．２３８（１９８１）；Ｐａｗｅｌｅｋ，ＪＭ，Ｌｏｗ ＫＢ，Ｂｅｒｍｕｄｅｓ Ｄ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５３７−４４（Ｏｃｔ．１５ １９９７））。本発明のもう１つの具体例において、ＢＭＧＳは減弱化されたＥ．ｃｏｌｉを用いて行われる。この具体例の１つの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉの株はＢＭ ２７１０である（Ｃ．Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｓ．Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｆ．Ｈｕｅｔｚ，Ｄ．Ｍ．Ｏｊｃｉｕｓ，Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，８６２（１９９８））。この具体例のもう１つの態様において、ＢＭ２７１０株は、侵入プラスミドを介して細胞−侵入特性を保有するように作製される。本発明の１つの態様において、このプラスミドはｐＧＢ２ｉｎｖ−ｈｌｙである。
また、二重「トロイの木馬」技術を真核生物転写プラスミドを保有する侵入性かつ栄養要求性細菌で用いる。このプラスミドは、今度は、標的細胞によって転写されて、ＲＮＡｉの細胞内プロセスをトリガーするヘアピンＲＮＡ構造を形成する。本発明のこの方法は、種々の遺伝子の有意な遺伝子サイレンシングを誘導する。この具体例のある態様において、遺伝子は導入遺伝子（ＧＦＰ）、突然変異した癌遺伝子（ｋ−Ｒａｓ）および癌関連遺伝子（β−カテニン）をイン・ビトロで含む。
また、本発明は、記載された方法、細菌転写遺伝子サイレンシング（ＢＴＧＳ）と称される、の変形に関する。本発明のこの態様において、ｓｉＲＮＡは、標的細胞とは反対に侵入性細菌によって直接的に生産される。原核生物プロモーター（例えば、Ｔ７）によって制御される転写プラスミドを、標準的な形質転換プロトコルを通じてキャリアー細菌に挿入する。ｓｉＲＮＡは該細菌内で生産され、栄養要求性によって、また抗生物質の適時の添加によってのいずれかでトリガーされた細菌溶解の後に哺乳動物標的細胞内で放出される。
ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを含めた本発明のＲＮＡｉ方法は、癌療法として、または癌を予防するために用いられる。この方法は、細胞増殖または他の癌表現型に関連するサイレンシングまたはノックダウン遺伝子によって行われる。これらの遺伝子の例はｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンである。具体的には、ｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンは結腸癌のＲＮＡｉベースの療法に対する標的である。これらの癌遺伝子は、臨床的症例の大部分において活性であり、関連する。ＢＭＧＳは、結腸癌の治療および予防のために適用されて腸管に到達する。これらの方法は、異種移植片腫瘍を保有する動物を治療し、腸腫瘍形成のｋ−Ｒａｓ Ｖ１２モデルにおいて癌を治療および予防するために、および腺腫結腸ポリポーシスｍｉｎマウスモデル（ＡＰＣ−ｍｉｎモデル）において腫瘍を予防および治療するためにも用いられる。このモデルにおいて、マウスは、ヒト家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）についての腸腫瘍形成の動物モデルとして用いられる多数の腸および結腸ポリープの形成をもたらす欠陥ＡＰＣ遺伝子を有する。
また、本発明は、細菌−転写遺伝子サイレンシング（ＢＴＧＳ）を行うために侵入性細菌で用いられる原核生物ｓｈＲＮＡ−コーディング転写プラスミドも含む。これらのプラスミドは、治療実験用のトランスジェニックならびに野生型動物において異なる癌−関連標的をスクリーニングするために用いられる。
ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを含めた本発明のＲＮＡｉ方法は、ウイルス病（例えば、肝炎）および遺伝的障害を治療または予防するためにも用いられる。
ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを含めた本発明のＲＮＡｉ方法は、特に、ＧＩ管または肝臓の標的に関して用いられる癌−予防「プロバイオティック細菌」を作り出すためにも用いられる。
ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを含めた本発明のＲＮＡｉ方法は、炎症性疾患、例えば、肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または結腸炎に対する療法として用いられる。これらの方法は、非癌遺伝子標的（Ｂ、Ｃ型肝炎の治療および予防ではウイルス遺伝子；炎症性腸疾患の治療および予防では炎症性遺伝子）およびその他をサイレントとし、またはノックダウンするのに用いられる。
ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを含めた本発明のＲＮＡｉ方法は、遺伝子機能を発見するための遺伝子工学により作製されたノックアウトマウスとは反対に、一過性「ノックダウン」遺伝的動物モデルを作製するために用いられる。方法は、研究および薬物開発のためのイン・ビトロトランスフェクションツールとしても用いられる。
これらの方法は、所望の特性（侵入性、減弱、操縦性）を持つ細菌を用い、例えば、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＬｉｓｔｅｒｉａを用いて、ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを行う。侵入性ならびに１つまたは数個のｓｈＲＮＡの真核生物または原核生物転写が、プラスミドを用いる細菌に付与される。
ＢＭＧＳおよびＢＴＧＳを含めた本発明のＲＮＡｉ方法は、遺伝子サイレンシングを腸および結腸に送達するために、および種々の病気の治療での経口適用のために、すなわち、結腸癌の治療および予防のために用いられる。この具体例のもう１つの態様において、遺伝子サイレンシングの送達は腸外である。
１．ＲＮＡを真核生物細胞に送達する細菌
本発明によると、膜を横断し、細胞の細胞質に進入する等して、分子、例えば、ＲＮＡ分子を標的細胞の細胞質に送達することができるいずれかの微生物を用いて、ＲＮＡをそのような細胞に送達することもできる。好ましい具体例において、微生物は原核生物である。なおより好ましい具体例において、原核生物は細菌である。また、ＲＮＡを細胞に送達するために用いることができる細菌以外の微生物も本発明の範囲内のものである。例えば、微生物は真菌、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、原生動物、例えば、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、およびプラスモディウム（ｐｌａｓｍｏｄｉａ）であり得る。
本明細書中で用いられる、用語「侵入性」とは、微生物、例えば、細菌に言及する場合、少なくとも１つの分子、例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡ分子を標的細胞に送達することができる微生物をいう。侵入性微生物は、細胞膜を通過し、それにより、該細胞の細胞質に進入し、その内容物の少なくともいくらか、例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡを標的細胞に送達することができる微生物であり得る。少なくとも１つの分子の標的細胞への送達のプロセスは、好ましくは、侵入装置を有意には修飾しない。
好ましい具体例において、微生物は細菌である。好ましい侵入性細菌は、真核生物細胞の細胞質に進入する等して少なくとも１つの分子、例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡ分子を標的細胞に送達することができる細菌である。好ましい侵入性細菌は生きた細菌、例えば、生きた侵入性細菌である。
侵入性微生物は、細胞膜、例えば、真核生物細胞膜を通過し、細胞膜に進入する等して、少なくとも１つの分子を標的細胞に天然で送達することができる微生物、ならびに天然では侵入性でないが、修飾され、例えば、侵入性となるように遺伝的に修飾された微生物を含む。もう１つの好ましい具体例において、天然では侵入性でない微生物は、細菌を「侵入因子」または「細胞質−標的化因子」ともいわれる「侵入因子」に連結（ｌｉｎｋ）させることによって侵入性となるように修飾することができる。本明細書中で用いるように、「侵入因子」は、非侵入性細菌によって発現されると、当該細菌を侵入性とする因子、例えば、蛋白質または蛋白質の群である。本明細書中で用いるように、「侵入因子」は、「細胞質−標的化遺伝子」によってコードされる。
天然で侵入性の微生物、例えば細菌、はある種の向性、すなわち、好ましい標的細胞、を有することができる。あるいは、微生物、例えば細菌、を例えば、遺伝的に修飾して、第二の微生物の向性を模倣することができる。
少なくとも１つの分子の標的細胞への送達は、当分野で公知の方法に従って決定することができる。例えば、それによりサイレントとされたＲＮＡまたは蛋白質の発現の減少による分子の存在は、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ方法によって、あるいは抗体の使用を含み得る免疫学的方法によって検出することができる。
微生物が本発明で用いるために充分な侵入性であるか否かの判断は、宿主細胞と接触した微生物の数に対して、充分なＲＮＡが宿主細胞に送達された否かの判断を含むことができる。もしＲＮＡの量が用いた微生物の数に対して低いならば、微生物をさらに修飾して、その侵入性能力を増大させるのが望ましいであろう。
細胞への細菌の進入は種々の方法によって測定することができる。細胞内細菌はアミノグリコシド抗生物質による処理に対して生き残り、他方、細胞外細菌は迅速に死滅する。細菌取り込みの定量的な見積もりは、細胞単層を抗生物質ゲンタマイシンで処理して、細胞外細菌を不活化し、次いで、温和な洗剤で、生き残る細胞内生物を放出する前に該抗生物質を除去し、標準的な細菌学的培地で生存カウントを決定することによって達成することができる。さらに、例えば、細胞層の薄切片作製による透過型電子顕微鏡（ｔｈｉｎ−ｓｅｃｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって、または免疫蛍光技術によって、細胞への細菌進入を直接的に観察することができる（Ｆａｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３３３）。かくして、種々の技術を用いて、特定の細菌が特定の細胞型に侵入することができるか否かを判断することができ、または第二の細菌のそれを模倣するための細菌の向性の修飾のような細菌の修飾に続いて細菌の侵入を確認することができる。
本発明の方法に従ってＲＮＡを送達するのに用いることができる細菌は好ましくは非病原性である。しかしながら、それらの病原性が減弱化され、それが投与される対象に対して細菌が無害とされているならば、病原性細菌を用いることもできる。本明細書中で用いるように、用語「減弱化された細菌」は、対象に対するその有害性を有意に低下させ、または排除するように修飾された細菌を言う。病原性細菌は後に記載する種々の方法によって減弱化することができる。
特定の作用メカニズムに制限されるつもりはないが、ＲＮＡを真核生物細胞に送達する細菌は、細菌のタイプに応じて細胞の種々の区画に進入することができる。例えば、細菌は小胞、例えば、ファゴサイトーシス小胞中に存在できる。一旦細胞の内部に入れば、細菌は破壊され、または溶解され、その内容物は真核生物細胞に送達され得る。細菌は、ファゴソーム分解酵素を発現して、ファゴソームからのＲＮＡの漏出を可能とするように作製することもできる。いくつかの具体例において、細菌は真核生物細胞において種々の時間生きて留まることができ、継続してＲＮＡを生産することができる。次いで、例えば、漏出によって、ＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡを細菌から細胞へ放出することができる。本発明のある具体例において、細菌は真核生物細胞において複製することもできる。好ましい具体例において、細菌複製は宿主細胞を死滅させない。本発明は特定のメカニズムによるＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡの送達に限定されず、送達のメカニズムとは独立した細菌によるＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡの送達を許容する方法および組成物を含むことを意図する。
天然で侵入性であると文献に記載されている細菌（セクション１．１）、ならびに天然で非侵入性細菌であると文献に記載されている細菌（セクション１．２）、ならびに天然で非病原性であり、あるいは減弱化された細菌の例は後に記載する。いくつかの細菌は非侵入性であると記載されているが（セクション１．２）、これらは本発明での使用では依然として十分に侵入性であり得る。天然で侵入性または非侵入性であると伝統的に記載されているか否かを問わず、（例えば、セクション１．３に記載されているように）いずれの細菌株も、その侵入性特徴を変調し、特に、増大させるように修飾することができる。
１．１ 天然に侵入性の細菌
本発明で使用された特定の天然に侵入性の細菌は本発明にとって絶対不可欠ではない。そのような天然に生じる侵入性細菌の例は、限定されるものではないが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、および腸侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む。
使用された特定のＳｈｉｇｅｌｌａ株は本発明で絶対不可欠でない。本発明で使用することができるＳｈｉｇｅｌｌａ株の例はＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９９０３）、シゲラ・ゾンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９９３０）、およびシゲラ・ディゼンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（ＡＴＣＣ ＮＯ．１３３１３）を含む。Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ２４５７Ｔ ａｒｏＡ ｖｉｒＧ突然変異体ＣＶＤ１２０３（Ｎｏｒｉｅｇａ ｅｔ ａｌ． ｓｕｐｒａ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｍ９０Ｔ ｉｃｓＡ突然変異体（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：５６６４−５６６８（１９９４））、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｙ ＳＦＬ１１４ ａｒｏＤ突然変異体（Ｋａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃ．，１０：１６７−１７４（１９９２））、およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ａｒｏＡ ａｒｏＤ突然変異体（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃ．，９：６−９（１９９１））のような減弱化Ｓｈｉｇｅｌｌａ株を、好ましくは、本発明で使用する。別法として、減弱突然変異を単独で、または１以上のさらなる減弱突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｓｈｉｇｅｌｌａ種下部を構築することができる。
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＲＮＡワクチンベクターに対する少なくとも１つの利点は、結腸粘膜表面におけるリンパ系組織に対するそれらの向性である。加えて、Ｓｈｉｇｅｌｌａ複製の一次的部位は樹状細胞およびマクロファージ内にあると考えられ、それらは、通常は、粘膜リンパ系組織におけるＭ細胞の基底側方表面で見出される。ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：３６９；Ｐａｓｃｕａｌ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ５：５６によってレビューされている）。このように、Ｓｈｉｇｅｌｌａベクターは、これらの専門的抗原提示細胞において抗原を発現する手段を提供することができる。Ｓｈｉｇｅｌｌａベクターのもう１つの利点は、減弱化Ｓｈｉｇｅｌｌａ株がイン・ビトロおよびイン・ビボにおいて核酸レポーター遺伝子を送達することである（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９；Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅ １ Ａｃａｄｅｍｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅ ＩＩＩ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ｄｅ ｌａ Ｖｉｅ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１８：１２０７；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆ．Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｎｏｒｒｂｙ，Ｄ．Ｂｕｒｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ９７ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅ）。実施的な見地では、Ｓｈｉｇｅｌｌａのかなり制限された宿主特異性は、中間宿主を介したＳｈｉｇｅｌｌａベクターの食物連鎖における拡大を防止する。さらに、げっ歯類、霊長類およびボランティアにおいて高度に減弱化された減弱化株が開発されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ｓｕｐｒａ；Ｌｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：３９５；Ｌｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１８０；Ｋａｒｎｅｌｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：８８；Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｊ．Ａｒｏｎｄｅｌ（１９８９）Ｖａｃｃｉｎｅ ７：４４３；Ｆｏａｎｔａｉｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙ１４１：９０７；Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４１６；Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２：５１６８；Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：３０５５；Ｋｏｔｌｏｆｆ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：４５４２）。この後者の知識は、ヒトで用いるための良く仕立てられたＳｈｉｇｅｌｌａべクターの開発を可能とするであろう。
非特異的突然変異誘発を化学的に用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような剤を用い、または組換えＤＮＡ技術；Ｔｎ１０突然変異誘発、Ｐ２２−媒介形質導入、λファージ媒介クロスオーバー、および結合導入のような古典的遺伝的技術；または組換えＤＮＡ技術を用いる部位特異的突然変異誘発を用い、減弱突然変異を細菌病原体に導入することができる。組換えＤＮＡ技術は好ましい。というのは、組換えＤＮＡ技術によって構築された株はかなり規定されているからである。そのような減弱突然変異の例は限定されるものではないが、以下のものを含む：
（ｉ）ａｒｏ（Ｈｏｉｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２９１：２３８−２３９（１９８１））、ｇｕａ（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈ．，３：１２９−１４１（１９８７））、ｎａｄ（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７０：３７２５−３７３０（１９８８））、ｔｈｙ（Ｎｎａｌｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：９５５−９６２（１９８７））、およびａｓｄ（Ｃｕｒｔｉｓｓ，ｓｕｐｒａ）突然変異のような栄養要求性突然変異；
（ｉｉ）ｃｙａ（Ｃｕｒｔｉｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：３０３５−３０４３（１９８７））、ｃｒｐ（Ｃｕｒｔｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７），ｓｕｐｒａ）、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ（Ｇｒｏｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６：７０７７−７０８１（１９８９）；ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：５０５４−５０５８（１９８９））、ｐｈｏｐｃ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ ．，１７２：２４８５−２４９０（１９９０））またはｏｍｐＲ（Ｄｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，．５７：２１３６−２１４０（１９８９））突然変異のような全体的調節機能を不活化する突然変異；
（ｉｉｉ）ｒｅｃＡ（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，７：９３３−）９３６（１９９３））、ｈｔｒＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，５：４０１−４０７（１９９１））、ｈｔｐＲ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１００：８９４−９００（１９８１））、ｈｓｐ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：２９５−３２９（１９８４））およびｇｒｏＥＬ（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．，２４８：７３０：７３２（１９９０））突然変異のようなストレス応答を修飾する突然変異；
（ｉｖ）ＩｓｙＡ（Ｌｉｂｂｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，．ＵＳＡ，９１：４８９−４９３（１９９４））、ｐａｇまたはｐｒｇ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０），ｓｕｐｒａ；ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８９），ｓｕｐｒａ）、ｉｓｃＡまたはｖｉｒＧ（ｄ’Ｈａｕｔｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，６：８３３−８４１（１９９２））、ｐｌｃＡ（Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：３６７−７２（１９９１）；Ｃａｍｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１７３：７５１−７５４（１９９１））およびａｃｔ（Ｂｒｕｎｄａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１８９０−１１８９４（１９９３））突然変異のような特異的毒性因子における突然変異；
（ｖ）ｔｏｐＡ（Ｇａｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１８７９−１８８５（１９９０））のようなＤＮＡのトポロジーに影響する突然変異；
（ｖｉ）ｍｉｎ（ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，５６：６４１−６４９（１９８９））のような細胞周期を破壊するまたは修飾する突然変異；
（ｖｉｉ）ｓａｃＢ（Ｒｅｃｏｒｂｅｔ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，５９：１３６１−１３６６（１９９３）：Ｑｕａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，１２７：１５−２１（１９９３））、ｎｕｃ（Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，６０：３７４６−３７５１（１９９４））、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌ、またはｐｈｌＡ（Ｍｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：１３９−１６６（１９９３））のような自殺システムをコードする遺伝子の導入；
（ｖｉｉｉ）ｒＦｂ（Ｒａｅｔｚ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．ｐｐ１０３５−１０６３（１９９６））、ｇａｌＥ（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．，１５６：１６４−１６７（１９８７））およびｈｔｒＢ（Ｒａｅｔｚ，ｓｕｐｒａ）、ｍｓｂＢ（Ｒｅａｔｚ，ｓｕｐｒａ）のような、リポ多糖および／または脂質Ａの生合成を改変する突然変異；
（ｉｘ）Ｐ２２によってコードされる溶原菌（Ｒｅｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ，１４３：２８０−２８９（１９８５））、λムレイントランスグリコシラーゼ（Ｂｉｅｎｋｏｗｓｋａ−Ｓｚｅｗｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１８４：１１１−１１４（１９８１））、またはＳ−遺伝子（Ｒｅａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ，４３：６２３−６２８（１９７１））のような、バクテリオファージ溶解システムの導入。
減弱化突然変異は、構成的に、あるいはプロモーターの温度感受性ヒートショックファミリー（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）のような誘導性プロモーター、または嫌気的に誘導されたｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，６：２８０５−２８１３（１９９２））、またはｕａｐＡ（Ｇｏｒｆｉｎｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２３３７６−２３３８１（１９９３））またはｇｃｖ（Ｓｔａｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７６：６１５９−６１６４（１９９４））のような抑制可能なプロモーターの制御下で発現させることができる。
使用された特定のＬｉｓｔｅｒｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＬｉｓｔｅｒｉａ株の例はＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＴＣ Ｎｏ．１５３１３）を含む。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ａｃｔＡ突然変異体（Ｂｒｕｎｄａｇｅ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）またはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７５１−７５４（１９９１））のような減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が好ましくは本発明で用いられる。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を構築することができる。
使用された特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の例はサルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７２５１）およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３３１１）を含む。減弱化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株が好ましくは本発明で用いられ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ−ａｒｏＣ−ａｒｏＤ（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃ．９：８１０（１９９１））およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ−ａｒｏＡ突然変異体（Ｍａｓｔｒｏｅｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ Ｐａｔｈｏｌ．１３：４７７（１９９２））を含む。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を構築することができる。
使用された特定のＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ株の例はリケッチア・リケッチィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏｓ．ＶＲ１４９ ａｎｄ ＶＲ８９１）、リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｓｉａ ｐｒｏｗａｓｅｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ２３３）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏｓ．ＶＲ３１２，ＶＲ１５０ ａｎｄ ＶＲ６０９）、リケッチア・ムーザー（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１４４）、リケッチア・シビリカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１５１）、およびロカリメア・キンタナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｔａｎａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ３５８）を含む。減弱化Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載されたように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定の腸侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができる腸侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株４６０８−５８、１１８４−６８、５３６３８−Ｃ−１７、１３−８０、および６−８１（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ），１３２Ａ：３５１−３５５（１９８２））を含む。減弱化腸侵入性Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載されたように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
さらに、細菌以外のある種の微生物も細胞取り込みのために（ある種の侵入因子についての受容体である）インテグリン分子とやはり相互作用できるので、そのような微生物もＲＮＡを標的細胞に導入するのに用いることができる。例えば、ウイルス、例えば、口蹄疫ウイルス、エコウイルス、およびアデノウイルス、ならびに真核生物病原体、例えば、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）および大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）はインテグリン分子と相互作用する。
１．２ より侵入性でない細菌
本発明で用いることができ、非侵入性であって、または前記セクション（１．１）にリストした細菌よりも少なくとも侵入性が低いとして文献で記載されている細菌の例は、限定されるものではないが、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、エスチェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、サイトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、およびエリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種を含む。これらの細菌を修飾して、それらの侵入能力を増大させる必要があろう。
使用された特定のＹｅｒｓｉｎｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用できるＹｅｒｓｉｎｉａ株の例は、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．９６１０）またはエルシニア・ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２８）を含む。Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ Ｙｅ０３−Ｒ２（ａｌ−Ｈｅｎｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．，６０：８７０−８７５（１９９２））またはＹ．ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ ａｒｏＡ（Ｏ’Ｇａｏｒａ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，９：１０５−１１６（１９９０））のような減弱化Ｙｅｒｓｉｎｉａ株は本発明で好ましく用いられる。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載されたように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｙｅｒｓｉｎｉａ株を構築することができる。
使用された特定のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株の例はＥ．ｃｏｌｉ Ｈ１０４０７（Ｅｌｉｎｇｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：２４０９−２４１７（１９９２））、およびＥ．ｃｏｌｉ ＥＦＣ４、ＣＦＴ３２５およびＣＰＺ００５（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：８３１−８３８（１９９４））を含む。減弱化シチメンチョウ病原体Ｅ．ｃｏｌｉ ０２ ｃａｒＡＢ突然変異体（Ｋｗａｇａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６２：３７７６−３７７２（１９９４））のような減弱化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株は本発明で好ましく用いられる。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異体を導入することによって新しい減弱化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株を構築することができる。
使用された特定のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株の例はクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３８８４）を含む。減弱化Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ株の例はボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９３９５）を含む。減弱化Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＮｅｉｓｓｅｒｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＮｅｉｓｓｅｒｉａ株の例はナイセリア・メニンジタイディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ１３０７７）およびナイセリア・ゴノレー（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）を含む。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＭＳ１１ ａｒｏ突然変異体（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１５：５１−６３（１９９３））のような減弱化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ株は本発明で好ましく用いられる。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ株を構築することができる。
使用された特定のＡｅｒｏｍｏｎａｓ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＡｅｒｏｍｏｎａｓ株の例はアエロモナス・オイクレノフィラ（Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３３０９）を含む。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ａｅｒｏｍｏｎａｓ株を構築することができる。
使用された特定のＦｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＦｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ株の例はフランシセラ・ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５４８２）を含む。減弱化Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株はコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４１０）を含む。減弱化Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株の例はシトロバクター・フロインディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８０９０）を含む。減弱化Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＣｈｌａｍｙｄｉａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＣｈｌａｍｙｄｉａ株の例はクラミジア・ニューモニア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ１３１０）を含む。減弱化Ｃｈｌａｍｙｄｉａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株の例はヘモフィルス・ソムナス（Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３６２５）を含む。減弱化Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＢｒｕｃｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＢｒｕｃｅｌｌａ株の例はブルセラ・アボルタス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３４４８）を含む。減弱化Ｂｒｕｃｅｌｌａ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の例はマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３９５０）およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７２９４）を含む。減弱化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株の例はレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３１５６）を含む。Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｍｉｐ変異体（Ｏｔｔ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．，１４：１６１−１７６（１９９４））のような減弱化Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ株は本発明で好ましく用いられる。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ株を構築することができる。
使用された特定のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ株の例はロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９３９）を含む。減弱化Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株の例はシュードモーナス・エールジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２６７）を含む。減弱化Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ株の例はヘリコバクター・ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３７７２）を含む。減弱化Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ株は本発明で好ましく用いられ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の例はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７２５１）およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３３１１）を含む。減弱化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株は本発明で好ましく用いられ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ ａｒｏＣ ａｒｏＤ（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃ．，９：８１０−８１６（１９９１））およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ突然変異体（Ｍａｓｔｒｏｅｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ，１３：４７７−４９１（１９９２））を含む。別法として、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって、新しい減弱化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を構築することができる。
使用された特定のＶｉｂｒｉｏ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＶｉｂｒｉｏ株の例はビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１４０３５）およびビブリオ・シンシナティエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３５９１２）を含む。減弱化Ｖｉｂｒｉｏ株は本発明で好ましく用いられ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＲＳＩビルレンス突然変異体（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：１５１８−１５２３（１９９４））およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ｃｔｘＡ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｅｐ突然変異体（Ｗａｌｄｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：２７８−２８３（１９９４））を含む。別法として、新しい減弱化Ｖｉｂｒｉｏ株は、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＢａｃｉｌｌｕｓ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＢａｃｉｌｌｕｓ株の例はバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６０５１）を含む。減弱化Ｂａｃｉｌｌｕｓ株は本発明で好ましく用いられ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ突然変異体ｐＸ０１（Ｗｅｌｋｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ，１４：３８１−３８８（１９９３））および減弱化ＢＣＧ株（Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．，３５１：４５６−４６０（１９９１））を含む。別法として、新しい減弱化Ｂａｃｉｌｌｕｓ株は、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
使用された特定のＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ株は本発明にとって絶対不可欠ではない。本発明で使用することができるＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ株の例はエリジペロトリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４１４）およびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３３３９）を含む。減弱化Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ株は本発明で好ましく用いられ、Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ Ｋｇ−１ａおよびＫｇ−２（Ｗａｔａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５５：５９５−６００（１９９３））およびＥ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ ＯＲＶＡＣ突然変異体（Ｍａｒｋｏｗｓｋａ−Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｖｉｒｏｌ．Ｐａｒｉｓｉｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２７７：５４７−５５３（１９９２））を含む。別法として、新しい減弱化Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ株は、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ種について記載したように、群（ｉ）ないし（ｖｉｉ）における１以上の減弱化突然変異を導入することによって構築することができる。
１．３ 細菌株の侵入特性を増大させる方法
生物が伝統的に侵入性または非侵入性として記載されてきたかに拘らず、これらの生物は、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ種、または腸侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ種の侵入特性を模倣することによって、それらの侵入特性を増大させるように作製することができる。例えば、微生物を細胞、例えば、該非侵入性細菌の天然宿主における細胞の細胞質にアクセスするのを可能とする１以上の遺伝子を微生物に導入することができる。
本明細書において「細胞質−標的化遺伝子」と言及されるそのような遺伝子の例は、Ｓｈｉｇｅｌｌａによる侵入を可能とする蛋白質をコードする遺伝子、または腸−侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、またはＬｉｓｔｅｒｉａのリステリオリシンＯのような侵入遺伝子を含み、そのような技術は広範な侵入性細菌を動物細胞の細胞質に侵入しかつ進入できるようにすることが知られている（Ｆｏｒｍａｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４６：４６５（１９８４）；Ｂｉｅｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４５：１７５−１７６（１９９０）；Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８６，ｐａｇｅｓ １２１−１２４，Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８６）；Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏ．，１１：６１９−６２７（１９９４）；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３：４２０２；Ｉｓｂｅｒｇ， Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２６２；ａｎｄ Ｉｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５０：７６９）。前記細胞質−標的化遺伝子を細菌株に導入する方法は当分野でよく知られている。それらの侵入特性を増大させるために細菌に導入することができるもう１つの好ましい遺伝子は、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１９７９（１９９０））からの侵入蛋白質をコードする。侵入は、リステリオリシンと組み合わせて導入することもでき、それにより、これらの遺伝子のいずれかの導入に対して細菌の侵入特徴を増大させることもできる。前記遺伝子は説明目的で記載されるが、しかしながら、微生物からの分子、特にＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡ分子の送達に参加する、１以上の源からのいずれかの遺伝子または遺伝子の組合せは十分であることは当業者に明白であろう。かくして、そのような遺伝子は細菌遺伝子に限定されず、エンドスモリシスを促進するインフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２のようなウイルス遺伝子を含む（Ｐｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））。
前記細胞質−標的化遺伝子は、例えば、所望の細胞質−標的化遺伝子を運ぶ侵入性細菌から単離されたＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって得ることができる。ＰＣＲのためのプライマーは、例えば、前記リスト文献において、および／またはＧｅｎＢａｎｋにおいてインターネット（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公に入手可能な、当該分野で入手可能なヌクレオチド配列から設計することができる。ＰＣＲプライマーは、細胞質−標的化遺伝子、細胞質−標的化オペロン、細胞質−標的化遺伝子のクラスター、または細胞質−標的化遺伝子のレグロンを増幅するように設計することができる。使用されるＰＣＲ戦略は、標的侵入性細菌における細胞質−標的化遺伝子または複数遺伝子の遺伝子構成に依存するであろう。ＰＣＲプライマーは、標的ＤＮＡ配列の始まりおよび終わりにおいてＤＮＡ配列に相同な配列を含有するように設計される。次いで、細胞質−標的化遺伝子は、例えば、Ｈｆｒ導入またはプラスミドモビライゼーション（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）、バクテリオファージ−媒介形質導入（ｄｅ Ｂｏｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｍｉｌｌｅｒ，ｓｕｐｒａ；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）、化学的転換（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）、エレクトロポレーション（Ｂｏｔｈｗｅｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ：ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｈｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）および物理的転換技術（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；ａｎｄ Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，ｓｕｐｒａ）を用いることによって、標的細菌株に導入することができる。細胞質−標的化遺伝子は、溶原性バクテリオファージ（ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，５６：６４１−６４９（１９８９））、プラスミドベクター（Ｃｕｒｔｉｓｓ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）に取り込むことができ、あるいは標的株の染色体にスプライスすることができる（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）。
それらの侵入特性を増大させるように細菌を遺伝子操作することに加え、前記したように、細菌は、侵入因子を細菌に連結させることによって修飾することもできる。従って、１つの具体例において、細菌は、侵入因子、例えば、蛋白質インバシン、インバシン誘導体、または侵入性に十分なその断片で共有結合によりまたは非共有結合的に細菌をコーティングすることによってより侵入性とされる。事実、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの精製されたインバシン、またはインバシンのカルボキシル−末端１９２アミノ酸でコーティングされた非侵入性細菌は哺乳動物細胞に進入することができることが示されている（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：１９７９）。さらに、インバシンのカルボキシル末端領域でコーティングされたラテックスビースは、抗体−固定化インバシンでコーティングされたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の株のように、哺乳動物細胞によって十分に内部化されるＩｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｔｒａｎ ｖａｎ Ｎｈｉｅｒ（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：３９５でレビューされている。）別法として、細菌は、抗体、その変種、または細菌侵入因子によって認識される表面分子に特異的に結合するその断片でコーティングすることもできる。例えば、もし細菌をインテグリン分子、例えば、それと細菌インバシン蛋白質が相互作用する表面分子であることが知られているα５β１に対して向けられたモノクローナル抗体でコーティングすれば、それらが取り込まれることが示されている（Ｉｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｔｒａｎ ｖａｎ Ｎｈｉｅｕ，ｓｕｐｒａ）。そのような抗体は当該分野で知られた方法に従って調製することができる。抗体は、例えば、細菌を抗体でコーティングし、細菌を抗体によって認識される表面受容体を有する真核生物細胞と接触させ、次いで、前記した方法に従って細胞内細菌の存在をモニターすることによって、細菌侵入性を媒介することにおける効果について試験することができる。侵入因子を細菌の表面に連結させる方法は当該分野で知られており、架橋を含む。
２．標的細胞
本発明は、ＲＮＡをいずれかのタイプの標的細胞に送達する方法を提供する。本明細書中で用いられる、用語「標的細胞」とは、細菌によって侵入され得る細胞、すなわち、細菌による認識のために必要な表面受容体を有する細胞をいう。
好ましい標的細胞は真核生物細胞である。なおより好ましい標的細胞は動物細胞である。「動物細胞」は、その系統学的位置が動物界内に存在する多細胞生物に由来するか、またはそれに存在する有核非クロロプラスト含有細胞と定義される。該細胞は無傷動物、初代細胞培養、外植体培養または形質転換した細胞系に存在し得る。細胞の特定の組織源は本発明にとって絶対不可欠ではない。
本発明で使用された受容体動物細胞は本発明にとって絶対不可欠ではなく、哺乳動物、魚、鳥類、爬虫類の科のような動物界内の全ての生物に存在するか、またはそれに由来する細胞を含む。
好ましい動物細胞はヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、および霊長動物細胞のような哺乳動物細胞である。最も好ましい動物細胞はヒト細胞である。
好ましい具体例において、標的細胞は粘膜表面にある。ある種の腸病原体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａはこの適用に天然で適合する。というのは、これらの生物は宿主粘膜表面に付着し、それに侵入する能力を保有するからである。（Ｋｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）。従って、本発明においては、そのような細菌は、宿主粘膜区画における細胞へ、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ−コーディングＤＮＡを送達することができる。
あるタイプの細菌はある向性を有することができるが、すなわち、好ましい標的細胞であるが、ＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡのあるタイプの細胞への送達は、所望の細胞タイプに対する向性を有する、または所望の細胞タイプに侵入することができるように修飾された細菌を選択することによって達成することができる。かくして、例えば、細菌は、前記したように、粘膜組織向性および侵入特性を模倣し、それにより、該細胞が粘膜組織に侵入することができるようにし、ＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡをそれらの部位における細胞に送達するように遺伝的に作製することができる。
細菌は、他のタイプの細胞に標的化することもできる。例えば、細菌は、ヒトおよび霊長類における赤血球に特異的に結合するプラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）網状赤血球結合蛋白質−１および−２のいずれか、または双方をそれらの表面に細菌が発現するように修飾することによって、ヒトおよび霊長類の赤血球に標的化することができる（Ｇａｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，６９：１２１３−１２２６（１９９２））。もう１つの具体例において、細菌は肝細胞上のアシロ糖蛋白質受容体に対するリガンドであるアシアロオロソムコイドをそれらの表面に有するように修飾される（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４（１９９８））。なおもう１つの具体例において、細菌は、プラスミド取り込みをインスリン受容体を持つ細胞に標的化することが示されているインスリン−ポリ−Ｌ−リシンでコーティングされる（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｔ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９９：３２３−３２９（１９９２））。また、肝細胞に対する向性を可能とするＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｐ６０（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３：２０４７−２０５３（１９９５））、またはヘパリン、ヘパリン硫酸およびコラーゲンに結合することによって、哺乳動物細胞外マトリックスへの特異的結合を引き起こすＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉからの６０ｋＤ表面蛋白質（Ｏｒｔｅｇａ−Ｂａｒｒｉａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，６７：４１１−４２１（１９９１））をそれらの表面に有するように修飾された細菌は本発明の範囲内のものである。
なおもう１つの具体例において、細胞は、ＲＮＡの送達のために細菌の標的細胞となるように修飾することができる。従って、細胞は、細胞へのその進入のために細菌によって認識される表面抗原、例えば、侵入因子の受容体を発現するように修飾することができる。細胞は、表面抗原が所望の条件で発現されるように、侵入因子の受容体をコーディングする核酸を細胞に導入することによって修飾することができる。別法として、細胞は侵入因子の受容体でコーティングすることができる。侵入因子の受容体は、インテグリン受容体スーパーファミリーに属する蛋白質を含む。種々の細菌および他の微生物によって認識されるインテグリン受容体のタイプのリストは、例えば、Ｉｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｔｒａｎ Ｖａｎ Ｎｈｉｅｕ（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：３９５に見出すことができる。インテグリンサブユニットについてのヌクレオチド配列は、例えば、インターネットで公に入手可能なＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる。
前記したように、なお他の標的細胞は魚類、鳥類および爬虫類細胞を含む。天然で魚類、鳥類、および爬虫類細胞に対して侵入性である細菌の例を以下に記載する。
魚類細胞の細胞質に天然で接近可能な細菌の例は、限定されるものではないが、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｉｎｏｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３６５８）およびアエロモナス・シュベリ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｃｈｕｂｅｒｉｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３７００）を含む。減弱化細菌は本発明で好ましく用いられ、Ａ．ｓａｏｍｏｎｉｃｉｄｉａ ｖａｐＡ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．ＢＩｏｌ．，２３７：４５２−４６３（１９９４））またはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄｉａ芳香族−依存性突然変異体（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：２１７２−２１８１（１９９３））を含む。
天然で鳥類細胞の細胞質に接近可能な細菌の例は、限定されるものではないが、サルモネラ・ガリナラム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．９１８４）、サルモネラ・エンテリディティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４９３１）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９４）を含む。減弱化細菌は本発明にとって好ましく、Ｓ．ｇａｌｉｎａｒｕｍ ｃｙａ ｃｒｐ突然変異体（Ｃｕｒｔｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ｓｕｐｒａ）またはＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ａｒｏＡ芳香族−依存性突然変異体ＣＶＬ３０（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：４７３９−４７４６（１９９４））のような減弱化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を含む。
爬虫類細胞の細胞質に天然で接近可能な細菌の例は、限定されるものではないが、Ｓａｏｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９４）を含む。減弱化細菌は本発明にとって好ましく、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ芳香族−依存性突然変異体（Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）のような減弱化株を含む。
また、本発明は、天然で、あるいは侵入性となるように修飾された後に、当該細胞に侵入できる微生物が存在する限り、他の真核生物細胞、例えば、植物細胞へのＲＮＡの送達を提供する。植物細胞に侵入できる微生物の例はアグロバクテリウム・ツメルファシウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）が挙げられ、この微生物は、特異的受容体を介して植物細胞と結合する線毛様構造を用い、次いで、細菌接合に似たプロセスを介してその内容物の少なくとも一部を植物細胞に送達する。
以下の記載は、本発明の方法に従ってＲＮＡを送達することができる細胞株の例である。
ヒト細胞株の例は、限定されるものではないが、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６２、ＣＣＬ１５９、ＨＴＢ１５１、ＨＴＢ２２、ＣＣＬ２、ＣＲＬ１６３４、ＣＲＬ８１５５、ＨＴＢ６１、およびＨＴＢ１０４を含む。
ウシ細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６０２１、ＣＲＬ１７３３、ＣＲＬ６０３３、ＣＲＬ６０２３、ＣＣＬ４４、およびＣＲＴ１３９０を含む。
ヒツジ細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６５４０、ＣＲＬ６５３８、ＣＲＬ６５４８およびＣＲＬ６５４６を含む。
ブタ細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＬ１８４、ＣＲＬ６４９２、およびＣＲＬ１７４６を含む。
ネコ細胞株の例はＣＲＬ６０７７、ＣＲＬ６１１３、ＣＲＬ６１４０、ＣＲＬ６１６４、ＣＣＬ９４、ＣＣＬ１５０、ＣＲＬ６０７５およびＣＲＬ６１２３を含む。
バッファロー細胞株の例はＣＣＬ４０およびＣＲＬ６０７２を含む。
イヌ細胞の例はＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２１３、ＣＣＬ３４、ＣＲＬ６２０２、ＣＲＬ６２２５、ＣＲＬ６２１５、ＣＲＬ６２０３およびＣＲＬ６５７５を含む。
ヤギ由来細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７３およびＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ６２７０を含む。
ウマ由来細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＣＬ５７およびＣＲＬ６５８３を含む。
シカ細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６１９３−６１９６を含む。
霊長類由来細胞株の例はＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３１２、ＣＲＬ６３０４、およびＣＲＬ１８６８のようなチンパンジー細胞株；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７６、ＣＣＬ２６、およびＣＣＬ１６１のようなサル細胞株；オランウータン細胞株ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１８５０；およびゴリラ細胞株ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１８５４を含む。
４．医薬組成物
本発明の好ましい具体例において、ＲＮＡ分子、および／またはそれをコードするＤＮＡを含有する侵入性細菌は静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、経口、鼻腔内、眼内、直腸内、膣内、骨内、口腔、浸漬および尿道内接種経路によって動物に導入される。
対象に投与される本発明の侵入性細菌の量は、対象の種、ならびに治療すべき病気または疾患に依存して変化するであろう。一般に、使用される容量は対象当たり約１０３〜１０１１の生きた生物、好ましくは約１０５〜１０９の生きた生物であろう。
本発明の侵入性細菌は、一般には、医薬上許容される担体および／または希釈剤と共に投与される。使用された特定の医薬上許容される担体および／または希釈剤は本発明にとって絶対不可欠ではない。希釈剤の例はリン酸緩衝化生理食塩水、スクロースを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ７．０）単独（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：８８８−９０２（１９８７）；ａｎｄ Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：１２６０−１２６５（１９８７））、またはアスコルビン酸、ラクトース、および所望によりアスパルテーム（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ， ＩＩ：４６７−４７０（１９８８））を含有する炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ７．０）のような、胃における胃酸に対して緩衝化するための緩衝液を含む。担体の例は、例えば、スキムミルクで見出される蛋白質、糖類、例えば、スクロース、またはポリビニルピロリドンを含む。典型的には、これらの担体は約０．１ないし３０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１ないし１０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で用いられるであろう。
以下に記載するのは、送達特異的経路で用いることができる他の医薬上許容される担体または希釈剤である。細菌が依然として標的細胞に侵入することができる限り、いずれのそのような担体または希釈剤も本発明の細菌の投与で用いることができる。侵入性についてのイン・ビトロまたはイン・ビボ試験を行って、適当な希釈剤および担体を決定することができる。本発明の組成物は、全身および局所または局所化投与を含めた、種々のタイプの投与用に処方することができる。細菌が標的細胞との接触に際して、または対象への投与に際して侵入性である限り、凍結乾燥形態も含まれる。技術および処方は、一般には、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐａｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出すことができる。全身投与では、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下を含めた注射が好ましい。注射では、本発明の組成物、例えば、細菌は液体溶液、好ましくは、ハンクス溶液またはリンゲル溶液のような生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。
経口投与では、医薬組成物は、結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、マイクロクリスタリンセルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはナトリウム澱粉グリコレート）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような医薬上許容される賦形剤にて、慣用的な手段によって調製することができる錠剤またはカプセル剤の形態を取ることができる。錠剤は当該分野でよく知られた方法によってコーティングすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を取ることができ、あるいはそれらは使用前に水または他の適当なビヒクルでの復元のための乾燥製品として呈することができる。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）のような医薬上許容される添加剤にて、慣用的手段によって調製することができる。製剤は適切には、緩衝塩、フレーバー、着色および甘味剤を含有することができる。
経口投与用の製剤は、活性化合物の制御された放出を実現するように適切に処方することができる。バッカル投与では、組成物は、慣用的に処方された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
吸入による投与では、本発明に従って使用される医薬組成物は、便宜には、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当なガスを用い、圧縮されたパックまたはネビュライザーからのエアロゾルスプレーの形態で投与される。圧縮エアロゾルの場合には、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを供することによって決定することができる。例えば、吸入器またはインスフレーターで用いられるゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、組成物の粉末ミックス、例えば、細菌、およびラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤を含有するように処方することができる。
医薬組成物は注射による、例えば、ボーラス注射または継続的注入による非経口投与用に処方することができきる。注射のための処方は、保存剤を加えた、例えば、アンプルまたは多用量容器中にて単位投与形態で供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含有することができる。別法として、有効成分は、使用前の、適当なビヒクル、例えば、滅菌されたパイロジェン−フリー水での復元のために粉末形態とすることができる。
医薬組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような慣用的坐薬基剤を含有する坐薬または停留浣腸のような直腸、膣内または尿道内組成物に処方することもできる。
全身投与は経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与では、浸透させるべきバリアーに適切な浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は当該分野で一般的に知られており、例えば、経皮投与では、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。加えて、洗浄剤を用いて浸透を促進することができる。経粘膜投与は鼻スプレーを介し、または坐薬を用いることができる。局所投与では、本発明の細菌は、細菌が標的細胞との接触に際して依然として侵入性である限り、当該分野で一般的に知られている軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに処方される。
組成物は、所望であれば、有効成分を含有する１以上の単位投与形態を含有することができるパックまたはディスペンサーデバイスおよび／またはキットにて供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのような金属またはプラスティックホイルを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスは投与のための指示書を伴わせることができる。
導入すべきＲＮＡまたはＲＮＡ−コーディングＤＮＡを含有する侵入性細菌を用いて、対象から得られた細胞のような、イン・ビトロで培養される動物細胞を感染させることができる。次いで、これらのイン・ビトロ感染細胞は動物、例えば、それから細胞が最初に得られた対象に、静脈内、筋肉内、皮内、または腹腔内、あるいは細胞が宿主組織に進入するのを可能とするいずれかの接種経路によって導入することができる。ＲＮＡを個々の細胞に到達させる場合、投与すべき生きた細胞の用量は、細胞当たり約０．１〜１０６、好ましくは約１０２〜１０４細菌の範囲の多重度におけるものであろう。
本発明のなおもう１つの具体例において、細菌は、それから蛋白質が後に回収され、または精製することができる細胞、例えば、動物細胞に蛋白質をコードするＲＮＡ分子を送達することもできる。例えば、蛋白質は組織培養細胞で生産することができる。
本発明をその詳細な記載と共に説明してきが、これまでの記載は、添付の請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものでないことが意図される。他の態様、利点、および修飾は以下の請求の範囲の範囲内のものである。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、断じて限定的であると解釈されるべきではない。本出願を通じて引用された文献、発行された特許、公開された特許出願を含めたすべての引用された文献の内容は、ここに、明示的に引用して援用する。本発明の実施は、他に示されない限り、生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用的技術を使用するが、それらは当該分野の技量内のものである。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｅｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照。
方法
ｓｉＲＮＡを生じるプラスミドの構築：
オリゴヌクレオチドはＰＡＧＥ精製にてＱＩＡＧＥＮから０．２μモルで得られた。アニーリングの後に、製造業者の指示に従って、オリゴヌクレオチドをｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）内のＢａｍｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ結合部位に挿入した。
以下の配列を用いた：
ｋ−ＲＡＳ−１および−２ ６４−塩基（ｍｅｒ）は、Ｖ１２の特異的突然変異にわたるｋ−Ｒａｓ蛋白質のアミノ酸９〜１５をコードするヌクレオチドを標的とする。
ｋ−Ｒａｓ−１（６４−塩基）：
５’ｇＡＴＣＣＣｇＴＴｇｇＡｇＣＴｇＴＴｇｇＣｇＴＡｇＴＴＣＡＡｇＡｇＡＣＴＡＣｇＣＣＡＡＣＡｇＣＴＣＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴｇｇＡＡＡ３’（配列番号：１）
ｋ−Ｒａｓ−２（６４−塩基）：
５’ＡｇＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡｇＴＴｇｇＡｇＣＴｇＴＴｇｇＣｇＴＡｇＴＣＴＣＴＴｇＡＡＣＴＡＣｇＣＣＡＡＣＡｇＣＴＣＣＡＡＣｇｇ３’（配列番号：２）
β−カテニン−１および−２ ６４−塩基は、カテニン蛋白質内のアミノ酸７９〜８５をコードするヌクレオチドを標的とする。
β−カテニン−１（６４−塩基）：
５’ｇＡＴＣＣＣＡｇＣＴｇＡＴＡＴＴｇＡＴｇｇＡＣＡｇＴＴＣＡＡｇＡｇＡＣＴｇＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡｇＣＴＴＴＴＴＴＴｇｇＡＡＡ３’（配列番号：３）
β−カテニン−２（６４−塩基）：
５’ＡｇＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡｇＣＴｇＡＴＡＴＴｇＡＴｇｇＡＣＡｇＴＣＴＣＴＴｇＡＡＣＴｇＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡｇＣＴｇｇ３’（配列番号：４）
ＥＧＦＰ−１および−２ ６４−塩基は、ＥＧＦＰのアミノ酸２２〜２８についてコードするヌクレオチドを標的とする。
ＥＧＦＰ−１（６４−塩基）：
５’ｇＡＴＣＣＣｇＡＣｇＴＡＡＡＣｇｇＣＣＡＣＡＡｇＴＴＴＣＡＡｇＡｇＡＡＣＴＴｇＴｇｇＣＣｇＴＴＴＡＣｇＴＣＴＴＴＴＴＴｇｇＡＡＡ３’（配列番号：５）
ＥＧＦＰ−２（６４−塩基）：
５’ＡｇＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡｇＡＣｇＴＡＡＡＣｇｇＣＣＡＣＡＡｇＴＴＣＴＣＴＴｇＡＡＡＣＴＴｇＴｇｇＣＣｇＴＴＴＡＣｇＴＣｇｇ３’（配列番号：６）
トランスキングダムＲＮＡ干渉プラスミドの構築：
作製されたプラスミドｐＴ７ＲＮＡｉ−Ｈｌｙ−Ｉｎｖ，ＴＲＩＰはｐＧＢ２Ωｉｎｖ−ｈｌｙ（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５，８７８３（１９８７））およびｐＢｌｅｕＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）から構築した。多重クローニング部位（ＭＣＳ）、Ｔ７プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター（Ｑｉａｇｅｎから合成）を含有するオリゴヌクレオチドはＫＳＩＩ（＋）の平滑末端ＢｓｓＨＩＩ部位に連結し、β−カテニンヘアピンオリゴをＭＣＳのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位に挿入して、プラスミドｐＴ７ＲＮＡｉを得た。ｐＧＢ２Ωｉｎｖ−ｈｌｙのｉｎｖ遺伝子座を含有するＰｓｔＩ断片をＫＳＩＩ（＋）のＰｓｉＩ部位に挿入した。ｐＧＢ２Ωｉｎｖ−ｈｌｙを鋳型として用い、プライマー、ｈｌｙ−１：５’−ＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＡ−３’（配列番号：７）およびｈｌｙ−２：５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：８）でのＰＣＲ（Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）によって増幅し、ＫＳＩＩ（＋）／ＩｎｖのＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。Ｈｌｙ−Ｉｎｖ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出した。平滑末端とした後、それを、ｐＴ７ＲＮＡｉのＴ７ターミネーター内に取り込まれたＥｃｏＲＶ部位に連結した。
細菌：
この実験においてプラスミドのキャリアーとして用いた栄養要求性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ ７２０７（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ２３３７−６５誘導体ｈｉｓＧ４６、ＤＥＬ４０７［ａｒｏＡ５４４：：Ｔｎ１０（Ｔｃ−ｓ）］）は、Ｐｒｏｆ．ＢＡＤ Ｓｔｏｃｋｅｒ教授，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣＡから親切にも贈られた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを用いて、プラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を維持した。
適合させたエレクトロポレーションプロトコル（１）を用いて、ＳＬ ７２０７の形質転換を達成した。コンピテントなＳＬ７２０７および１μｇのプラスミドを、冷却された０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット中にて氷上で５分間インキュベートした。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒを用い、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωインパルスを適用した。１ｍＬの予め温めたＳＯＣ培地を加え、２２５ＲＰＭ振盪しつつ細菌を３７℃にて１時間回収し、その後、選択寒天プレート上で平板培養した。プラスミドの存在は、アルカリ性溶解および０．７％アガロースゲルでの分離の後にミニ調製を用いて確認した。
イン・ビトロ実験では、振盪することなく、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（ＳＬ−ｓｉＲＡＳ、ＳＬ−ｓｉＧＦＰおよびＳＬ−ｓｉＣＡＴ用）を補足したルリアブロス（ＬＢ）中でＳＬ７２０２を３７℃にて一晩増殖させた。翌朝、０．４ないし０．６のＯＤ６００に到達するまで、一晩の培養からの１％接種の後に、細菌を新鮮な培地中で増殖させた。細菌を遠心し（３５００ＲＰＭ，４℃）、リン酸−緩衝化生食塩水（ＰＢＳ）中で一回洗浄し、ＰＢＳ中に所望の濃度で再度懸濁させた。細菌の数および濃度の全ての決定のために、細菌の密度を分光学的に測定し、式ｃ＝ＯＤ６００＊８×１０８／ｍＬに従って計算した。
動物実験では、必要な場合、ＳＬ７２０７を適当な抗生物質を補足した安定な一晩の培養にてブレインハードインフージョンブロス（Ｓｉｇｍａ）中で増殖させた。細菌を洗浄し、２．５×１０１０／ｍＬの濃度にてＰＢＳ中に再度懸濁させた。系列希釈を行い、投与した細菌の現実の数を確認するための実験の間に、数回、選択寒天上で平板培養した。
また、製造業者の指示に従って、プラスミドをＢＬ２１ＤＥ３株（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に形質転換した。細菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを加えたブレイン−ハート−インフュージョン−ブロス中で３７℃で増殖させた。細菌の数はＯＤ６００測定を用いて計算した。細胞感染のために、一晩培養を他の２時間の増殖のために新鮮な培地に接種した。
細胞培養：
ヒト結腸癌細胞株（ＳＷ４８０）をここでは用いた。それは、β−カテニンの増大した基礎レベルをもたらすＡＰＣ蛋白質の突然変異を有する。黄身包上皮に由来する安定にＧＦＰを発現する細胞株、ＣＲＬ２５８３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＧＦＰ−ノックダウン実験で用いた。細菌感染前３０分まで、ＣＲＬ２５８３を２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８中で維持した。１０％胎児ウシ血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０中でＳＷ４８０を増殖させた。供給業者によって推奨されているように、１５％ＦＢＳを補足した高グルコース、高ＮａＨＣＯ３ ＤＭＥＭ中でＣＲＬ２５８３を増殖させた。全ての増殖培地は抗生物質：１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍＬアンフォテリシンをルーチン的に補足した（全ての培地添加剤はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから購入した）。
プラスミドの直接的トランスフェクションのために、５００，０００細胞を６ｃｍのペトリ皿に播き、一晩増殖させ、その後、標準的なＣａＰ−共沈殿プロトコルを用いてそれらをトランスフェクトした。
簡単に述べれば、１５μｇのプラスミド−ＤＮＡを５００μＬ反応ミックス（２×ＨＥＰＥＳ緩衝液，６０μＬ ＣａＰ）中で混合し、ＦＢＳを含まない新鮮な培地中の細胞に滴下した。沈殿を９時間継続させ、その後、沈殿を洗浄した。細胞を異なる時点（３６、４８、６０、７２、および９６時間）において収穫した。
標準的な細菌感染アッセイのために、５００，０００細胞を６ｃｍのペトリ皿に播き、一晩付着させた。細菌の添加に３０分先立って、増殖培地を抗生物質および胎児ウシ血清を含まない新鮮な培地で交換した。ＳＬ ７２０７−ｓｉＲＡＳ、−ｓｉＣＡＴ、−ｓｉＧＦＰを５００μＬ ＰＢＳに加えて、１００、５００または１０００の示された感染多重度（ＭＯＩ）に到達させ、感染を３７℃、５％ＣＯ２での標準インキュベータ中で行った。示された感染期間の細部までに、プレートを４ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地で１回、４ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する５ｍｌの新鮮な完全ＲＰＭＩ培地を加えた。２４時間後に、テトラサイクリンを１５μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。細菌侵入後の示された異なる時点（２４ないし９６時間）において、ウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーのために細胞を収穫した。
細胞内細菌の染色のために、細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｎａｌｇａｎｅ Ｎｕｎｃ，ＵＳＡ）で増幅させた。前記した細菌侵入後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。アクリジンオレンジ（Ｓｉｇｍａ）溶液（０．０１％）を４５秒間で加え、次いで、ＰＢＳで洗浄した。クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）染色（Ｓｉｇｍａ）を４５秒間適用し、次いで、ＰＢＳで洗浄した。カバーグラスを、ＰＥＲＭＯＵＮＴ（登録商標）設置培地を用いて設置し、供焦点顕微鏡を用いて侵入を評価した。
ＭＴＴアッセイ：
ＳＬ７２０７−ｓｉＲＡＳおよび／またはＳＬ７２０７−ｓｉＣＡＴでの処理の後に、細胞をトリプシン処理し（２４時間または４８時間後）、希釈し、５０００細胞／ウェルの濃度にて９６−ウェルプレートに播いた。次いで、細胞を４日間まで増殖させた。所望のインキュベーション時点において、細胞を取り出し、１００μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。４時間のインキュベーション時間の後、ＭＴＴ溶液を排出し、１００μＬの可溶化試薬（イソプロパノール：１Ｎ ＨＣｌ：１０％ＳＤＳ ４３：２：５）を各ウェルに加えることによって細胞を溶解させた。暗い青色のホルマザン−生成物の得られたシグナルを５７０ｎｍ波長において分光学的に測定した。色形成の量はウェル当たりの生存する細胞の数に依存する。
コロニー形成テスト：
ＳＬ７２０７−ｓｉＲＡＳおよび／またはＳＬ７２０７−ｓｉＣＡＴでの処理の後、細胞をトリプシン処理し（トランスフェクション後２４時間）、希釈し、７５０細胞／ウェルの濃度で６−ウェルＭＴＰに播いた。細胞をさらに２週間増殖を維持して、生きたコロニーを形成させた。２週間後、培地を取り出し、１ｍｌのギムザ染色（７．４１５ｇ／Ｌ）を各ウェルに加えた。３７℃における１０分間のインキュベートの後、ギムザ染色を排出し、細胞をＰＢＳで洗浄した。８を超える細胞の群を陽性コロニーとしてカウントした。
ウエスタンブロット：
細胞を冷却したＰＢＳで洗浄し、掻き落とし、０．１％プロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解干渉液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２．５ｍＭ ＥＧＴＡ， １％ＮＰ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ）中で溶解させた。１１％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルを用いて２０μｇの蛋白質を分離し、０．４μｍのＰＶＤＦ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。５％ミルクを用いて膜をブロックし、示された濃度の特異的抗生物質：Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｏｌｏｒｓ（登録商標）抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）−１：５００，β−カテニン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）−１：５００（ｋ−ＲＡＳ抗体）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）−１：３００およびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）１：５００と共に１時間インキュベートした。各々に続いて、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼコンジュゲーテッド抗−ウサギまたは抗−ヤギ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）−１：１０００−１：２０００と共にインキュベートした。ＥＣＬ（登録商標）ケミルミネッセンス検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてバンドを検出した。
フローサイトメトリー：
フローサイトメトリーでは、細胞を３分間トリプシン処理し、新鮮な培地に再度懸濁させ、ＰＢＳ中で洗浄した。遠心の後、細胞を４℃にて１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で１０分間固定した。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーを行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてデータ分析を行った。
動物技術：
６ないし８週齢雌ＧＦＰ＋トランスジェニックマウス（ＣｇＴｇ５Ｎａｇｙ）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。それらをＢＩＤＭＣ動物研究施設に収容して、標準的なげっ歯類食餌および飲料水に自由に接近させた。処理は１０週齢で開始した。ｉｖ処理プロトコルでは、５０μＬのＰＢＳ中に溶解させた４用量の１０６ｃｆｕ ＳＬ−ｓｉＲＡＳまたはＳＬ−ｓｉＧＦＰを各日に尾静脈に注射した。毎日マウスの体重を測定し、病気の兆候についてモニターした。
最終処理から１日後にマウスを犠牲にし、その時点で、組織化学およびフローサイトメトリー分析のために組織試料を採取した。組織をパラフィン包埋し、組織化学および蛍光顕微鏡測定工程のために６μｍで切片化した。フローサイトメトリーでは、細胞ストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ）の使用を介して、肝臓細胞および脾臓細胞懸濁液を調製した。器官懸濁液を４％ホルマリン中で固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーを行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてデータ解析を行った。
異種移植片癌モデルでは、雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を２つの群（ｎ＝６）にランダム化した。処理の３週間前に、１×１０７のＳＷ４８０細胞を皮下移植した。腫瘍が直径約１０ｍｍに到達すると、処理を開始した。処理群には、ＰＢＳ中のβ−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現する１×１０８ｃｆｕのＥ．ｃｏｌｉで尾静脈を介して注射した。Ｅ．ｃｏｌｉがｓｈＲＮＡインサートを含まないＴＲＩＰベクターを含有する以外は、対照群を同様に処理した。合計３回の処理について５日毎に処理を行った。最後の処理から５日後にマウスを犠牲にした。組織を凍結し、リアル−タイムＰＣＲによるβ−カテニンｍＲＮＡレベル、および免疫組織化学によるβ−カテニン蛋白質の分析のために固定化した。
イン・ビボサイレンシング実験のため、雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を２つの群にランダムに分割した。処理群には、２００μＬのリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の、β−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現する５×１０１０ｃｆｕ Ｅ．ｃｏｌｉを経口投与した。Ｅ．ｃｏｌｉがｓｈＲＮＡインサートを含まないＴＲＩＰベクターを含有する以外は、対照群を同様に処理した。２つの独立した実験を各々、用いる群当たり６および５匹のマウスで行った。処理は合計して４週間の間、１週間当たり５日間毎日行った。最後の処理から２日後にマウスを犠牲にし、組織をパラフィン−包埋した。
免疫組織化学
製造業者による指示に従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣアビジン−ビオチン染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、免疫染色を６μｍの組織切片で行った。標準的なプロトコルを用い、スライドを脱パラフィン化し、再度水和させた。抗原の回復のために、５％尿素中でスライドをマイクロ波によって５分間加熱した。非特異的結合部位を１％ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックし、内因性ペルオキシダーセ活性を、メタノール中の３％Ｈ２Ｏ２での処理によって１０分間抑制した。切片を、１：５００希釈にて、一次抗体ＬＩＶＩＮＧ ＣＯＬＯＲＳＴＭウサギポリクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対して４℃にて曝露した。用いた発色団は３，３’ジアミノ−エンジジン（ＤＡＢ）Ｖｅｃｔｏｒ）であって、逆染色はヘマトキシリンで行った。
インターフェロン応答検出：
１：１０００のＭＯＩにて、ヒトβ−カテニンまたは突然変異体ｋ−Ｒａｓに対するｓｈＲＮＡをコードするＴＲＩＰで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉでＳＷ４８０細胞を２時間処理した。未処理細胞を対照として用いた。細胞を２４、４８および７２時間に回収した。ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＭＸ１、ＩＳＧＦ３γおよびＩＦＩＴＭ１遺伝子の発現レベルは、インターフェロン応答検出キット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
実施例１：イン・ビトロおよびイン・ビボで細菌媒介遺伝子サイレンシングを用いる緑色蛍光蛋白質のノックダウン
以下の実験において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＳＬ７２０７，ＢＡＤ Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）の減弱化株を用いた。概念が一般的なアプローチとして有用であることを証明するために、我々は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＶＮＰ７０００９，ＶＩＯＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎから入手）のもう１つの減弱化株、およびＥ．ｃｏｉｌ（ＢＭ２７１０，Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓから入手）の侵入性かつ減弱化された株でも確認試験を行った。
サイレンシングプラスミドは、標的遺伝子ＧＦＰ、β−カテニンおよび癌遺伝子ｋ−ＲＡＳ（Ｖ１２Ｇ）をノックダウンするように、商業的に入手可能なプラスミド（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ，Ａｍｂｉｏｎ）に基づいて設計した。これらのプラスミドはエレクトロポレーションによってＳＬ７２０７に形質転換し、選択寒天上での増殖およびＤＮＡ調製によって陽性クローンを確認した。
イン・ビトロで用いるために、安定なＧＦＰ＋細胞系ＣＲＬ２５９８（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｖａ）を用い、ＧＦＰ発現のノックダウンを証明した。癌遺伝子ｋ−Ｒａｓ（Ｖ１２Ｇ）およびβ−カテニンのノックダウンは、結腸癌細胞系ＳＷ４８０および膵臓癌細胞系ＣＡＰＡＮ−１を用いて証明した。
侵入性細菌株、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いる細菌送達のシステムは、商業的に入手可能な真核生物転写プラスミド、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で開発した。（Ｂ．Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから親切にも贈られた）Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＬ７２０７は、芳香族アミノ酸についての合成経路における栄養要求性を介して減弱化させ、栄養の欠如による標的細胞への侵入後に迅速に死滅した。この株は、主として、ＤＮＡワクチン接種の目的で、イン・ビトロでのＤＮＡの送達のために、およびマウスモデルにおいて首尾よく用いられてきた。
上皮細胞への細菌の進入を証明するために、侵入アッセイを行った。ＳＷ４８０細胞をＳＬ−ｓｉＲＡＳで２時間感染させ、続いて、ゲンタマイシンで２時間処理した。アクリジンオレンジ／クリスタルバイオレット染色は良好な侵入効率を明らかにした。ＳＷ４８０細胞の９０％は生きているＳＬ７２０７細菌を保有した。細胞内細菌の平均数は６（範囲，２ないし８）であった。（図１）。（顕微鏡写真Ａ１は透過イメージである。顕微鏡写真Ａ２は蛍光イメージである。顕微鏡写真Ａ３は合わせたイメージである）。生きた細胞内細菌の数は経時的に迅速に減少した。２４時間および４８時間後に、細胞の１０％および３％のみが依然として細菌を含有することが判明した。
次の実験において、ＧＦＰ＋細胞系におけるＧＦＰ発現の効果的な低下が示された。癌遺伝子ｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンの成功したノックダウンは、ウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。癌遺伝子ノックダウンの結果、成長の遅延がもたらされ、異種移植片動物モデルにおいて腫瘍形成を減少させた。
ＧＦＰを安定に発現する細胞（ＣＲＬ２５８３）を、ＧＦＰ ｍＲＮＡをサイレントとする配列を含めたｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．０を運ぶＳＬ７２０７で感染させた（ＳＬ−ｓｉＧＦＰ）（前記参照）。４８時間後、ＳＬ−ｓｉＧＦＰで処理した細胞は、ＳＬ−ｓｉＲＡＳで処理した細胞および未処理対照と比較して、ＧＦＰ発現の顕著な減少を示した（図１Ｂおよび１Ｃ）。ＳＬ−ｓｉＧＦＰでの処理は、適用した感染多重度（ＭＯＩ）に依存して、ＧＦＰシグナルの喪失に導いた。未処理細胞において、４．３％のみが低い蛍光を呈するかまたは蛍光を呈しない。ＳＬ−ｓｉＧＦＰ処理細胞においては、この画分は７８．１％（ＭＯＩ １：５００で処理）および９２．３％（ＭＯＩ １：１０００）まで増加した。ＳＬ−ｓｉＲＡＳでの対照処理は、蛍光のわずかな喪失に導いた（ＭＯＩ １：５００において７・５％およびＭＯＩ １：１０００において８・４％）。これは、図１Ｃにおいて蛍光顕微鏡写真においても示されている。頂部写真はＳＬ−ｓｉＲＡＳおよびＳＬ−ｓｉＧＦＰ（下記）処理ＣＲＬ ２５８３細胞の底部のものである（２００×）。この知見は、フローサイトメトリーを用いて確認された。
安定にＧＦＰを発現するマウスでの一連の動物実験では、我々は、ＧＦＰ−サイレンシングプラスミドを有するＬ７２０７の経口および静脈内適用後に、肝臓および結腸におけるＧＦＰ発現のノックダウンを示すことができた（双方の器官において、ＧＦＰ発現のほぼ５０％低下）。
動物実験においては、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて、トランスジェニックマウスモデル（ＧＦＰ＋）において遺伝子サイレンシングを達成した。この方法を用い、動物実験における制限された毒性での導入遺伝子のサイレンシングをｍＲＮＡレベルにおいて、ならびに蛋白質レベルおよび種々の器官（肝臓、胃腸管）の組織切片において示した。
実施例２ 細菌媒介遺伝子サイレンシングを用いるｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンのノックダウン
次に、ＢＭＧＳを適用して、特異的病気−関連遺伝子をノックダウンした。ヒト結腸癌腫細胞系、ＳＷ４８０に存在するｋ−Ｒａｓ遺伝子、ｋ−ＲａｓＶ１２Ｇにおける特異的癌遺伝子点突然変異を標的化した。
サイレンシングプラスミドの構築の後、それらを減弱化ＳＬ７２０７にエレクトロポレーションする前に、ＣａＰ共沈殿を用いてそれらをＳＷ４８０細胞にトランスフェクトすることによってそれらの活性をテストした。
ウェスタンブロット（図４Ａ）は、３６時間および４８時間ポストトランスフェクションにおいて、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ｋ−Ｒａｓ（Ｖ１２Ｇ）インサートを用いるｋ−Ｒａｓの効果的なノックダウンを示す。後の時点において、蛋白質発現は回復し、これは、増殖に不利益を有するトランスフェクトされたクローンの増殖−対−癌遺伝子ｋ−Ｒａｓが依然として複製を駆動するトランスフェクトされていないクローンの増殖に起因する。キャリアーとしてのＳＬ７２０７と共にＢＭＧＳを用いてノックダウンを媒介した場合、１：５００および１：１０００のＭＯＩにおいて、ｋ−Ｒａｓレベルを減少させた。ＰＭＧＳを用い、ｋ−Ｒａｓ蛋白質のノックダウンは、リン酸カルシウム共沈殿を用いるサイレンサープラスミドの直接的トランスフェクションと比較して同様な効率で観察されたが、ノックダウンの開始は１２時間だけわずかに遅れた（図４Ａ）。１：１０００のＭＯＩでは、結果がより長い時間（７２時間まで）観察された（図２Ａ）。
β−カテニンについてのウェスタンブロット（図４Ｂ）は、トランスフェクション後における遅延されたノックダウンを示し、最大の効果はトランスフェクションから９６時間後に見られた。この遅延は、プラスミドが遊離される前の細胞内でＳＬ７２０７の生存時間によって引き起こされると推定される（図２Ａ）。
ＳＬ−ｓｉＲＡＳでの処理、および癌遺伝子ｋ−Ｒａｓの得られたノックダウン（Ｖ１２Ｇ）の後、ＳＷ４８０細胞は、有意に低下した生存率およびコロニー形成能力を呈した（図２Ｂ）。細胞は、等量（２．５×１０８）のＳＬ−ｓｉＲＡＳおよびＳＬ−ｓｉＣＡＴ細菌と共インキュベートした。対照細胞は形質転換されていないＳＬ２０７で処理した。トランスフェクションから４８時間後に、細胞をＭＴＴテストのために９６ウェルプレートに、およびコロニー形成アッセイのために６ウェルプレートに播いた。処理から１２０時間後に、ＭＴＴアッセイによって評価された生存率は、ＳＬ−ｓｉＲＡＳ処理後には６２．５％まで、ＳＬ−ｓｉＣＡＴ処理後には５１％まで低下した。合わせた処理は、生存率を対照細胞の２９％までさらに低下させた。ＳＬ−ｓｉＲＡＳ処理およびＳＬ−ｓｉＣＡＴ処理は、各々、３７．７％および５０％だけコロニーを形成するＳＷ４８０の能力を低下させた。合わせた処理は６３．３％低下に導いた。
さらに、ＳＬ−ＲＡＳでの処理は、ヌードマウスに皮下注射した場合に、ＳＷ４８０細胞の腫瘍形成能力を完全に阻害し、他方、空のＳＬ−７２０７での処理は腫瘍を形成するそれらの能力に影響しなかった。（図２Ｃ）。（ＳＬ７２０７またはＳＬ−ｓｉＲＡＳで処理されていない、または処理された）ＳＷ４８０細胞をヌードマウスに皮下注射した（４×１０６細胞，群当たりｎ＝４動物）。ＳＬ−ｓｉＲＡＳでの処理は、腫瘍を形成する能力を完全にはなくさなかった（４匹の動物のいずれにおいても腫瘍は見えなかった，４０日）（図２Ｃ）。
このアプローチを普遍的に使用できるか否かを試験するために、もう１つの癌−関連遺伝子、β−カテニンを標的化した（図２Ａ）。β−カテニンの基礎レベルは、突然変異したＡＰＣ−遺伝子のためＳＷ４８０細胞では高いが、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（ｓｉＣＡＴ）トランスフィクション後にヘアピンｓｉＲＮＡでの処理を通じて低下させることができる（図２Ａ）。β−カテニン構築体を持つｐＳｉｌｅｎｃｅｒを有するＳＬ７２０７（ＳＬ−ｓｉＣＡＴ）での処理の後、β−カテニン発現の有意なノックダウンが達成され、その結果、低下した生存率およびコロニー形成能力がもたらされた（図２Ａ）。β−カテニンは９６時間からノックダウンされたが、１４４時間から回復した。
実施例３：イン・ビボ細菌媒介遺伝子サイレンシング
ＲＮＡｉの細菌媒介の方法は、１を超える遺伝子を一度に選択的に標的化する可能性を提供し、将来の適用、例えば、複数の癌遺伝子経路との干渉を通じての抗癌処理についての効率の増大を可能とする。そのようなアプローチの使用可能性をテストするために、突然変異したｋ−Ｒａｓ癌遺伝子およびβカテニン双方を同時に標的化した。ＳＬ−ｓｉＲａｓおよびＳＬ−ｓｉＣＡＴでの同時処理の後、双方の遺伝子のノックダウンが蛋白質レベルで観察され、さらに減少した生存性およびコロニー形成能力がもたらされた（図２）。これらの知見は、細菌媒介遺伝子サイレンシングの提案された概念が、異なる標的遺伝子に対してイン・ビトロにおいておよび異なる細胞株において首尾よく用いることができることを示す。
このアプローチを用いてイン・ビボで標的遺伝子をサイレントとすることができるか否かを試験するためにマウスモデルを選択した。ＣｇＴｇ５−Ｎａｇｙマウスは全ての組織において高レベルのＧＦＰを発現する。別の日にＳＬ−ｓｉＧＦＰまたはＳＬ−ｓｉＲＡＳいずれかの１０６ｃｆｕの４回の用量を静脈内で受け取るように、１４匹のマウスをランダムに割り当てた（群当たり７匹の動物）。この処理はよく許容され、体重の喪失や病気の臨床的に明らかな兆候は伴わなかった。最後の処理から１日後に全てのマウスを犠牲にした。
肝臓組織スライドは、蛍光顕微鏡測定およびＧＦＰ抗体での免疫組織化学によって評価した（図３Ａ）。ＳＬ−ｓｉＧＦＰでの静脈内処理は、ＳＬ−ｓｉＲＡＳ処理対照動物と比較して、処理された動物の肝臓切片における蛍光の減少を導いた。抗−ＧＦＰ抗体での組織化学染色は、蛍光の変化がＧＦＰの低下によって引き起こされ、バックグラウンド蛍光レベルの変化によっては引き起こされないことを証明した（図５）。処理したマウスの肝臓切片における蛍光の低下が現実にはバックグラウンド蛍光の変化によるものではなく、ＧＦＰ発現レベルの変化によって、引き起こされることを確認するために、組織スライドをＧＦＰ特異的抗体で染色した。
免疫組織化学染色パターンは蛍光顕微鏡測定イメージとよく相関し、蛍光の変化が低下したＧＦＰ発現によって引き起こされることが確認される。対照（上側列）および静脈内処理した（下側列）動物からの肝臓切片の蛍光顕微鏡測定（５０×）および対応する免疫組織化学イメージ（５０×）。
染色パターンは蛍光イメージとよく相関した。引き続いてのイメージ分析は、ＳＬ−ｓｉＧＦＰ処理後における９ないし２５％の間のＧＦＰ発現細胞の数の低下を明らかにした。これらの知見は、肝臓細胞の単細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析によって確認され、これは、ＳＬ−ｓｉＧＦＰ処理−対−ＳＬ−ｓｉＲＡＳ処理動物におけるＧＦＰ−陽性肝細胞の数の有意な減少を示した（図３Ｂ）。肝細胞および脾臓細胞懸濁液のフローサイトメトリー測定を行った。ＳＬ−ｓｉＧＦＰでの静脈内処理の後に、ＧＦＰ＋肝細胞の数は、対照処理（ＳＬ−ｓｉＲＡＳ）動物と比較して有意に低下した（ＳＬ−ｓｉＲＡＳ：５０．０％［４５．４−５３．２％］，ＳＬ−ｓｉＧＦＰ：３９．９％［２６．１−５３．２％］，ｐ＜０．０５）。
これらの結果は、有意な遺伝子サイレンシングはこのアプローチを用いてイン・ビボで達成することができることを示す。減弱化Ｓ．ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍの静脈内適用を用い、我々は、イン・ビトロでの知見をマウスモデルまで拡大し、肝臓における有意な遺伝子サイレンシングを達成することができた。他の器官は、異なる侵入性細菌株の使用または異なる適用経路を介して接近可能となるであろう。特に専門的な食細胞は、細菌−媒介遺伝子サイレンシングについての有望な標的であろう。というのは、トランスフェクション効率は、上皮系列の細胞と比較してこれらの細胞でより高いことが報告されているからである。
実施例４：トランスキングダムＲＮＡ干渉
高等生物における細菌−媒介ＲＮＡｉの使用は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで既に証明されているように哺乳動物系における機能的ゲノミックスに対する可能性を示し、およびＲＮＡｉの他のイン・ビボ適用に対する可能性を示す。この可能性を調べるために、ＴＲＩＰ（トランスキングダムＲＮＡ干渉プラスミド）と命名された細菌プラスミドｐＴ７ＲＮＡｉ−Ｈｌｙ−Ｉｎｖを構築した（図６Ａ）。この新規なプラスミド構築体においては、ｓｈＲＮＡの発現は、哺乳動物プロモーターまたはエンハンサーよりはむしろバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１−６２ １９８９）Ｍｉｌｉｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５，８７８３−８７９８（１９８７））下で指令された。ｓｈＲＮＡは細菌システムによってのみ生産され得る。ＴＲＩＰベクターは、侵入をコードするＩｎｖ遺伝子座を含有し（Ｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ５０，７６９−７７８（１９８７））、これは非侵入性Ｅ．ｃｏｌｉがβ１−インテグリン−陽性哺乳動物細胞に入るのを可能とする（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６，１９７−２０７（１９９２））。 ＴＲＩＰベクターは、また、遺伝物質を進入小胞から逃がすディステリオリシンＯをコードするＨｌｙ Ａ遺伝子を含有する（Ｍａｔｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０．１１０５−１１１５（２００３）およびＧｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，８６２−８６６（１９９８））。ＴＲＩＰ構築体を、ｓｈＲＮＡを発現するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する非病原性Ｅ．ｃｏｌｉのコンピテント株ＢＬ２１ＤＥ３に導入した。癌遺伝子β−カテニンに対するＴＲＩＰは例として構築した。β−カテニンの過剰発現または腫瘍形成遺伝子突然変異によるβ−カテニン経路の活性化は、結腸癌の大部分の開始を担い、これは、種々の他の癌タイプに関与する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４，５９７−６０４（２００５））。癌治療標的としてのβ−カテニンの能力にも拘らず、β−カテニン経路は小分子による阻害に従順でなかった。β−カテニンは、新しいＲＮＡｉアプローチの能力をテストするための概念的実験の証明では好ましい選択である。なぜならば、それは普通には癌細胞中で安定化されているからである。ＴＲＩＰは、細菌が、注目する種々の遺伝子に対する干渉性ＲＮＡを発現するのを可能とするように修飾することができる。
遺伝子サイレンシングをこのトランスキングダムシステムを介して達成できるかを判断するために、ヒト結腸癌細胞（ＳＷ４８０）を、Ｅ．ｃｏｌｉと共に２時間（図６Ｂおよび６Ｄ）または異なる時点に（図６Ｃ）イン・ビトロで培養し、次いで、抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。遺伝子サイレンシングの分析のための収穫前に、細胞をさらに４８時間培養した。図６Ｂないし６Ｄに示すようにβ−カテニンは蛋白質およびｍＲＮＡレベルにおいて強くかつ特異的にサイレントとされ、他方、β−アクチン、ｋ−Ｒａｓ，およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は影響されなかった。キングダムＲＮＡｉの特異性をさらにテストするために、突然変異体ｋ−Ｒａｓ（コドン１２においてＧＧＴ→ＧＴＴ）に対するＴＲＩＰを含有するＥ．ｃｏｌｉは、同一コドン１２突然変異を持つＳＷ４８０細胞におけるｋ−Ｒａｓ発現をサイレントとしたが、ｋ−Ｒａｓの異なるコドンでの突然変異（コドン１３におけるＧＧＣ→ＧＡＣ，、図６Ｅ）を持つＤＬＤ１細胞ではそうはならなかった。ｓｈＲＮＡ対照として、野生型ｋ−Ｒａｓに対するＴＲＩＰを含有するＥ．ｃｏｌｉは、ＳＷ４８細胞において突然変異したｋ−Ｒａｓに対して遺伝子−サイレンシング効果を発揮しなかった（図６Ｆ）。この結果は、トランスキングダムＲＮＡ干渉が点突然変異を区別するのに十分なくらい高度に遺伝子−特異的であることを示す。
トランスキングダムシステムによる遺伝子サイレンシングの能力に影響する変数を調べるために、異なる感染多重度（ＭＯＩ）においてＥ．ｃｏｌｉと共に２時間インキュベートした。図６Ｂに示すように、遺伝子サイレンシングの能力は、ＭＯＩに依存し、１：１，０００のＭＯＩにおいてほとんど完全な遺伝子サイレンシングであった。遺伝子サイレンシングに対する供培養時間の効果を決定するために、細胞を、１：５００ＭＯＩにてＥ．ｃｏｌｉと共に異なる時間インキュベートした。図６Ｃに示すように、遺伝子−サイレンシング能力は、２時間までのインキュベーション時間と共に増大した。ＭＯＩおよび供培養時間に対する遺伝子サイレンシングの依存性は、種々の適用における遺伝子サイレンシングについての制御可能な柔軟性を提供する。
β−カテニン遺伝子サイレンシングがｓｈＲＮＡによって特異的に媒介されることをさらに確認するために、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）ＰＣＲ技術を用いることによって、β−カテニンｍＲＮＡの特異的切断断片同定を試みた。ＲＮＡｉ−媒介遺伝子サイレンシングの特異的ホールマークは、ｓｈＲＮＡ配列から予測されるように、ｍＲＮＡの特異的部位におけるβ−カテニンｍＲＮＡの切断である。β−カテニンサイレンシングの時間経過に基づいて（図７Ａ）、β−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉでの処理から８時間および１６時間後にＳＷ４８０細胞から全ＲＮＡを単離して、ｍＲＮＡの切断された断片を同定した。切断されたβ−カテニンｍＲＮＡは、ｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉでの処理から８時間後に早く見出された：対照において断片は検出されなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。β−カテニンｍＲＮＡの切断された中間体の配列分析により、切断部位は標的化配列内に位置することが確認された。この結果は、細菌によって生産されたｓｈＲＮＡが、ＲＮＡｉ−媒介遺伝子サイレンシングを介するβ−カテニンｍＲＮＡの特異的切断をトリガーすることを示す。
インターフェロン応答の誘導は、いくつかのＲＮＡｉアプローチの特異性に対する潜在的挑戦として報告されている（Ｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，２６３−２６４（２００３）およびＨｏｒｎｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，２６３−２７０（２００５））。トランスキングダムＲＮＡｉによって誘導される遺伝子サイレンシングはインターフェロン応答誘導に関連するかをテストするために、鍵となるインターフェロン応答遺伝子を測定した。２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ１およびＯＡＳ２）は、ウイルス感染後の細胞蛋白質合成の阻害についての重要なインターフェロン−誘導遺伝子である。ＭＸ１遺伝子、インターフェロン−誘導ミクソウイルス耐性蛋白質ファミリー（ＭＸ蛋白質）のメンバーは、ＲＮＡウイルスに対する先天的宿主防御に参加する。ＩＦＩＴＭ１、インターフェロン−誘導性膜貫通蛋白質のメンバーは、インターフェロンの抗−増殖活性を媒介する。ＩＳＧＦ３γは、インターフェロン−誘導転写調節および刺激に関与する細胞インターフェロン受容体の一部である。これらの遺伝子は、干渉性ＲＮＡによるインターフェロン応答誘導を分析するための標準的なパネルとして用いられてきた（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）。５つのインターフェロン応答遺伝子のｍＲＮＡを、半定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。図７Ｄに示すように、β−カテニンに対するｓｈＲＮＡをコードするＥ．ｃｏｌｉでの処理に続いて、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＭＸ１、ＩＳＧＦ３γおよびＩＦＩＴＭ１の誘導は検出されなかった。これらのデータは、トランスキングダムＲＮＡｉによって誘導された遺伝子サイレンシングが、非特異的インターフェロン応答誘導に関連しないことを示す。
トランスキングダムＲＮＡｉ導入のメカニズムを調べた。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞進入がＲＮＡｉを誘導するのに必要であるかを判断するために、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子−サイレンシング活性をＩｎｖ遺伝子座の有りまたは無しで比較した。Ｉｎｖは、β１−インテグリンと相互作用して、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞への進入を容易とするインバシンをコードする。予測されるように、Ｉｎｖ無しのＥ．ｃｏｌｉは細胞に進入しなかった（図８Ａ）。驚くべきことにＩｎｖ単独は、Ｅ．ｃｏｌｉが結腸癌細胞に進入するのを可能とするのに十分ではなく（図８Ａ）、検出可能な遺伝子サイレンシングは細胞内細菌の不存在下で観察されなかった（図８Ｂ）。Ｈｌｙ Ａ遺伝子は導入され、これは、送達された遺伝物質が進入小胞から逃げるのを容易にすると考えられる（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｌｏｌ．１６，８６２−８６６（１９９８）。予測されるように、Ｈｌｙは単独ではＥ．ｃｏｌｉの細胞進入を可能としなかったが、ＩｎｖおよびＨｌｙ双方を持つプロバイオティックＥ．ｃｏｌｉは高い効率でもって結腸癌に進入した（図８Ａ）。これらの条件下で、β−カテニンは潜在的に９６時間までサイレントとされた（図８Ｃ）。これらの結果は、細胞に進入して、トランスキングダムＲＮＡｉを誘導するのにＥ．ｃｏｌｉはＩｎｖおよびＨｌｙの双方を必要とすることを示す。
遺伝子サイレンシングが標的細胞内部で細菌複製を必要とするか否かを判断するために、テトラサイクリングを使用して、細胞内細菌複製をブロックし、ゲンタマイシンを使用して、細胞外細菌を除去した。ＳＷ４８０細胞をＥ．ｃｏｌｉと共に２時間インキュベートし、続いて、異なる時間においてテトラサイクリング処理を開始した。図８Ｄに示すように、最初の２時間の感染時間に続いて、テトラサイクリングを含まないさらに２時間のインキュベーション時間はほとんど最大の遺伝子サイレンシングを誘導し；テトラサイクリング処理のさらなる遅延は、遺伝子サイレンシングの程度に対するさらなる増強効果を有しなかった。驚くべきことには、６時間および４８時間におけるテトラサイクリングの不存在下での有意な細胞内細菌複製の証拠はなく（図８Ｅ）、これはリソソームおよび他の細胞内抗−細菌メカニズムの機能によるものらしい（Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４，１５１５−１５１８（２００４）およびＢａｔｔｉｓｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８，３０−３７（２０００））。これらの結果は、最初の感染（２時間）およびインキュベーション時間（２時間）の後に、トランスキングダムＲＮＡｉが標的細胞内の持続的な細菌複製に依存しないことを示す。
次に、トランスキングダムＲＮＡｉアプローチがイン・ビボで働くかを判断した。β−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉをマウスに経口投与した。５×１０１０の接種物を１週間当たり５回経口投与し、これは、プロバイオティックＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７のヒト用量に匹敵する。接種物のほとんどは、上方ＧＩ管における殺菌環境の通過の間に排除される。マウスβ−カテニンに対するｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉで、または対応するプラスミドベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉでマウスを処理した。処理は、免疫組織化学による遺伝子サイレンシングの分析前に４週間継続した。図９Ａおよび９Ｂに示されるように、β−カテニン発現は、β−カテニンｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉによって腸上皮においてサイレントとされ（Ｐ＜０．０１）、対照Ｅ．ｃｏｌｉによってはそうはならなかった。対照として、ＧＡＰＤＨ発現は低下しなかった（図１０）。遺伝子サイレンシング効果は、ペイヤーパッチの領域において、またはそれに隣接する領域においてより顕著であった（図９Ｂ）。処理はよく許容され、上皮損傷または潰瘍形成の目に見えるまたは顕微鏡的兆候は伴わなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、哺乳動物が、イン・ビボにおいて、強力な局所的ＲＮＡｉを持つ特異的ｓｈＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉに応答することを示す。
トランスキングダムＲＮＡｉアプローチを調べて、それを用いて全身投与後に病気遺伝子をサイレントとすることができるかを判断した。治療的細菌の静脈内投与は、癌患者における証明された安全性でもって臨床試験でテストされた（Ｔｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０，１４２−５２（２００２））。異種移植片を移植したヒト結腸癌を持つヌードマウスを、ヒトβ−カテニンに対するｓｈＲＮＡをコードする１０８ｃｆｕのＥ．ｃｏｌｉで静脈内で処理した、５日間隔で３つの用量を与えた。処理は有害な効果なくしてよく許容された。図９に示すように、β−カテニンに対するｓｈＲＮＡをコードするＥ．ｃｏｌｉでの処理の結果、腫瘍組織におけるβ−カテニンｍＲＮＡの有意な減少（ｐ＜０．００５，図９Ｃ）および蛋白質の有意な減少（ｐ＜０．０１，図９Ｄおよび９Ｅ）がもたらされた。これらのデータは、細菌−媒介トランスキングダムＲＮＡｉが、全身投与の後に身体の末端部分における病気遺伝子をサイレントとすることができるのを示す。
これらの結果は、トランスキングダムシステムを通じて遺伝子サイレンシングを達成することができるのを示す。重要なことには、ＲＮＡｉの能力および特異性は維持される。非病原性Ｅ．ｃｏｌｉは証明された安全性でもってプロバイオティックとして臨床的に用いられてきた（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５４，６３５（１９９９））。従って、このトランスキングダムシステムは、医学的症例についてＲＮＡ干渉を送達する現実的かつ臨床的に適合する方法を提供する。このＥ．ｃｏｌｉベースのＲＮＡｉ技術は、遺伝子のＲＮＡｉ−ベースの機能的研究を行うための便利なベクターシステムを提供する。最後に、該結果は、干渉性ＲＮＡのそのような変化が共棲的、感染性または共生的条件化で天然で起こり得るという魅力的な確率を導く。

Claims (22)

  1. １以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子、原核生物プロモーター、少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子、および少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子を含む原核生物型ベクターを含む侵入性細菌であって、該侵入性細菌がリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）よりなる群から選択される、侵入性細菌。
  2. 医療用途のための、請求項１に記載の侵入性細菌。
  3. 細胞において、細胞増殖を増加させることが知られている少なくとも１つの遺伝子の発現が、該侵入性細菌の導入により調節される、哺乳動物において癌または細胞増殖障害を治療または予防するための、請求項１に記載の侵入性細菌。
  4. 該侵入性細菌が非病原性細菌、非毒性細菌または弱毒化細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の侵入性細菌。
  5. 該侵入性細菌が治療用細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の侵入性細菌。
  6. 原核生物プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１に記載の侵入性細菌。
  7. 少なくとも１つの、請求項１〜６のいずれか１項に記載の侵入性細菌の、哺乳動物において癌または細胞増殖障害を治療または予防するための医薬の製造における使用であって、細胞において細胞増殖を増加させることが知られている少なくとも１つの遺伝子の発現が、該侵入性細菌の導入により調節される、使用。
  8. 該哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の使用。
  9. 該細胞が結腸細胞または膵臓細胞である、請求項７に記載の使用。
  10. 結腸細胞がＳＷ４８０細胞であるか、または膵臓細胞がＣＡＰＡＮ−１細胞である、請求項９に記載の使用。
  11. 癌が結腸癌である、請求項７に記載の使用。
  12. 増殖障害が家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）である、請求項７に記載の使用。
  13. １以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子、少なくとも１つの原核生物プロモーターを含み、さらに少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子、および少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子を含む原核生物型ベクター。
  14. 原核生物プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１３に記載の原核生物型ベクター。
  15. １以上のｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞に送達する方法であって、１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子、原核生物プロモーター、少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子、および少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子を含む原核生物型ベクターを含む、１以上の侵入性細菌を該哺乳動物細胞に導入することを含み、該侵入性細菌がリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）よりなる群から選択される、イン・ビボでの治療方法を除く、方法。
  16. 哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する方法であって、１以上のｓｉＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ分子、原核生物プロモーター、少なくとも１つのＨｌｙＡ遺伝子、および少なくとも１つのＩｎｖ遺伝子を含む原核生物型ベクターを含む、１以上の侵入性細菌を該哺乳動物細胞に導入することを含み、発現されたｓｉＲＮＡが調節すべき遺伝子のｍＲＮＡに干渉し、それにより、該遺伝子の発現を調節する、該侵入性細菌がリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）よりなる群から選択される、イン・ビボでの治療方法を除く、方法。
  17. 該哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 原核生物プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１５または１６に記載の方法。
  19. 遺伝子がｒａｓまたはβ−カテニンである、請求項１６に記載の方法。
  20. ｒａｓがｋ−Ｒａｓである、請求項１９に記載の方法。
  21. 請求項１に記載の細菌および医薬上許容される担体を含む組成物。
  22. 請求項１に記載の細菌および医薬上許容される担体を含む真核生物宿主細胞。
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