JP2013506687A - オートファジー促進遺伝子産物の変調によりオートファジーを変調する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明をより容易に理解するために、特定の用語および語句を以下、明細書に亘り定義する。
本発明のオートファジー関連遺伝子は、その産物がオートファジーを阻害する遺伝子(すなわち、表1に列記されたオートファジー阻害遺伝子)およびその産物がオートファジーを促進させる遺伝子(すなわち、表2に列記されたオートファジー促進遺伝子)に分類できる。
本発明のある実施の形態は、オートファジーを変調するまたはオートファジー関連疾病(例えば、神経変性疾患、肝疾患、心臓病、癌、膵炎)を治療する方法に関する。これらの方法は、本発明の1種類以上のオートファジー関連遺伝子産物の活性を変調する作用物質を投与する工程を含む。ある実施の形態において、本発明の方法は、対象に、表1〜4に列記された遺伝子の1種類以上の産物の活性を減少させる作用物質を投与することによる、オートファジー関連疾病の治療を含む。他の実施の形態において、本発明の方法は、対象に、表1〜4に列記された遺伝子の1種類以上の産物の活性を増加させる作用物質を投与することによる、オートファジー関連疾病の治療を含む。表1〜4に列記された遺伝子産物の活性を変調し、それにより、オートファジー関連疾病を治療するまたは予防するのに使用してよい作用物質としては、抗体(例えば、結合(conjugated)抗体)、タンパク質、ペプチド、小分子、RNA干渉剤、例えば、siRNA分子、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明のある実施の形態において、オートファジー関連RNA遺伝子産物のオリゴヌクレオチド阻害剤が、オートファジーを変調し、オートファジー関連疾病を治療するために使用される。オリゴヌクレオチド阻害剤としては、以下に限られないが、アンチセンス分子、siRNA分子、shRNA分子、リボザイムおよび三重分子(triplex molecules)が挙げられる。そのような分子が当該技術分野において公知であり、当業者は、所定の方法を使用して、本発明のオートファジー関連遺伝子のいずれについてのオリゴヌクレオチド阻害剤も作製することができるであろう。
高い特異性で特定の標的に結合する能力のために、ポリペプチドオートファジー関連遺伝子産物に特異的な抗体は、そのような遺伝子産物の活性を阻害するかまたは促進し、それによって、オートファジーを阻害するかまたは促進することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、受容体に特異的な抗体は、活性化リガンドとの相互作用を遮断することによって、その受容体の活性を阻害することができる。同様に、可溶性リガンド(例えば、サイトカインまたは成長因子)または膜結合リガンドに特異的な抗体は、リガンドの受容体への結合を阻害することによって、リガンドに結合できる受容体の活性を阻害することができる。他の実施の形態において、受容体に特異的な抗体を使用して、架橋させ、それによって、受容体を活性化させることもできる。抗体は、細胞外タンパク質(例えば、受容体および/またはリガンド)の活性を阻害または促進するのに特に有用であるが、細胞中のタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用も、当該技術分野において公知である(例えば、Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Marasco et al.による国際公開第94/02610号パンフレッ; および Duan et al.による国際公開第95/03832号パンフレットを参照のこと)。したがって、オートファジー関連遺伝子のペプチド産物に特異的な抗体は、本発明の方法のための生物学的作用物質として有用である。
本発明は、オートファジー関連遺伝子産物の変調物質を含む薬剤組成物を提供する。ある態様において、本発明は、1種類以上の薬学的に許容される担体(添加剤)および/または希釈剤が共に配合された、上述した作用物質を1種類以上、治療に効果的な量で含む薬学的に許容される組成物を提供する。別の態様において、本発明の作用物質は、そのままで投与しても、または薬学的に許容される担体との混合物で投与しても差し支えなく、他の作用物質と共に投与しても差し支えない。それゆえ、併合療法は、本発明の1種類以上の作用物質の連続、同時および別々の投与または同時投与を含み、ここで、最初に投与されたものの治療効果は、その後の化合物が投与されたときに、完全には消えていない。
スタン;葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えば、フロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラキセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルシン(demecolcine);ジアジコン(diaziquone);エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム(elliptinium);エポチロン(epothilone);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;メイタンシノイド(maytansinoid)、例えば、メイタンシン(maytansine)およびアンサミトシン(ansamitocine);ミトグアゾン(mitoguazone);ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantrone);ポドフィリン酸(podophyllinic acid);2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK多糖類複合体);ラゾキサン(razoxane);リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム(spirogermanium);テニュアゾン酸(tenuazonic acid);トリアジコン(triaziquone);2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2毒素、ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridine)Aおよびアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール;ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(pipobroman);ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル;クロランブシル;ゲムシタビン(gemcitabine);6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン(novantrone);テニポシド;エダトレキセート(edatrexate);ダウノマイシン;アミノプテリン;キセローダ(xeloda);イバンドロナート(ibandronate);イリノテカン(例えば、CPT−11);トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチロールニチン(DMFO);レチノイン酸などのレチノイド;カペシタビン(capecitabine);および上述したものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
本発明はさらに、癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含むオートファジー関連疾病を治療する新規の治療方法であって、対象(例えば、その必要がある対象)に、本発明のオートファジー関連遺伝子産物の変調物質を効果的な量、投与する工程を含む方法を提供する。
auridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine);アンドロゲン、例えば、カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone);抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えば、フロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラキセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルシン(demecolcine);ジアジコン(diaziquone);エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム(elliptinium);エポチロン(epothilone);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;メイタンシノイド(maytansinoid)、例えば、メイタンシン(maytansine)およびアンサミトシン(ansamitocine);ミトグアゾン(mitoguazone);ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantrone);ポドフィリン酸(podophyllinic acid);2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK多糖類複合体);ラゾキサン(razoxane);リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム(spirogermanium);テニュアゾン酸(tenuazonic acid);トリアジコン(triaziquone);2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2毒素、ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridine)Aおよびアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール;ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(pipobroman);ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル;クロランブシル;ゲムシタビン(gemcitabine);6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン(novantrone);テニポシド;エダトレキセート(edatrexate);ダウノマイシン;アミノプテリン;キセローダ(xeloda);イバンドロナート(ibandronate);イリノテカン(例えば、CPT−11);トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチロールニチン(DMFO);レチノイン酸などのレチノイド;カペシタビン(capecitabine);および上述したものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
細胞株および培養条件
H4ヒト神経芽細胞腫細胞を、10%の正常子牛血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)および適切であれば、0.4〜1.2mg/mLのG418を補給したDMEM培地中において標準組織培養条件下で培養した。LC3−GFPおよびFYVE−dsRedH4細胞を、Zhang et al., PNAS, 102, 15545-15550 (2007)に記載されたように生成した。Lamp1を発現する安定株を生成するために、TransIT LT1試薬(Mirus)を使用して、H4細胞にLamp1−RFPをトランスフェクションし、その後、0.4mg/mLのG418で選択した。LC3−GFPおよびFYVE−dsRedH4細胞をpBabe−Bcl−2レトロウイルスに感染させることによりBcl−2発現細胞株を生成し、その後、1μg/mLのピューロマイシンにより選択した。
一次スクリーニングについて、ヒトゲノムの大半を網羅する21,121のsiRNAプールのアレイ・ライブラリを使用した(Dharmacon siARRAYsiRNAライブラリ(ヒトゲノム、G−005000−05)、コロラド州、ラフィーエット、Thermo Fisher Scientific)。各プールは、同じ遺伝子からの異なる配列を標的とする4つの特有のオリゴヌクレオチドを含んでいた。各アッセイプレートは、以下の対照も含んだ:非標的siRNA、mTORsiRNA、ATG5siRNAおよびPLK1siRNA(トランスフェクション効率の対照)。siRNAを、HiPerfect試薬(Qiagen)によるリバーストランスフェクションを使用して、40nMの最終濃度でLC3−GFPレポーターを安定に発現するH4細胞中に三重で一時的にトランスフェクションした。HiPerfectをDMEM中で1:20に希釈し、この混合物8μlを384ウェルプレートのウェルに加えた。これらのプレートを1,000rpmで遠心分離し、その後、1μMのアレイsiRNAプール2μlを各ウェルに加えた。30分間のインキュベーション後、ウェルに40μlの培地中の500の細胞を加えた。細胞を、標準培養条件下で72時間に亘りインキュベーションし、1時間に亘り0.5μMのHoechst33342(Invitrogen)で対比染色し、30μlの8%パラホルムアルデヒドの添加により固定化した。30分後、解析前に、細胞をPBSで3回洗浄した。
高スループットスクリーニングについて、一次スクリーニングについては2つの波長(Hoechstを検出するために350nm、LC3−GFPを検出するために488nm)を、二次スクリーニングについては3つの波長(Lamp1−RFPまたはFYVE−dsRedを検出するために350nm、488nmおよび550nm)を使用して、10倍の倍率で自動化CellWoRx顕微鏡(Applied Precision)により細胞をイメージングした。全ての画像を、VHSscanおよびVHSview画像解析ソフトウェア(Cellomics)を使用して数量化した。合計細胞数、合計LC3−GFP強度/細胞並びにLC3−GFP陽性オートファゴソーム/細胞の数、面積および強度を記録した。核発色強度に基づく解析から、死細胞および分裂細胞の全ては排除した。各ウェルについての最終的なオートファジースコアは、合計オートファゴソーム強度/細胞をオートファゴソーム/細胞の数で乗じ、平均細胞強度で割ることによって、得た。この式は、mTORおよびAtg5対照に対してsiRNAを使用したときの一貫して有意であるz−スコアおよびp−値により反映されるように、サイトゾルからオートファゴソームへのLC3−GFP転座を正確に測定するために、経験的に決定した。転座よりむしろ、レポーターの合計累積を測定する、Lamp1−RFPについて、平均細胞強度による除算を除外したことを除いて、FYVE−dsRedおよびLamp1−RFPスコアは、LC3−GFPと類似の様式で得た。
mTORC1信号伝達および小胞体ストレスの誘発の定量分析について、それぞれ、rpS6リン酸化反応およびKDEL(GRP78/GRP94)発現の「in−cell western」分析を行った。H4細胞を、LC3−GFPアッセイについて記載したように、384ウェルプレート内で培養し、固定化し、対比染色した。イメージング後、細胞を、0.2%のTx−100を含有するPBS中で透過性にし、15分間に亘り20ng/mLで、相対的細胞数を測定するために使用される非特異的リジン反応性プローブである、Alexa−680 NHS−エステルで染色した。その後、細胞を、0.2%のTx−100を含有するPBSで洗浄し、ブロッキング緩衝液(PBS+0.2.%のTx−100で1:1に希釈されたLiCORブロッキング緩衝液)中で30分間に亘りインキュベーションした。次いで、細胞を、ブロッキング緩衝液中で1:1000に希釈されたウサギ−抗−rpS6ホスホ−235/236(Cell Signaling Technologies)、またはマウス−抗−KDEL(Stressgen)抗体と共にインキュベーションした。一次抗体の染色後、細胞を、PBS+0.2%のTx−100中で洗浄し、ブロッキング緩衝液中で1:1000に希釈されたIRDye−800−結合二次抗体(LiCOR)で染色した。プレートをAerium赤外イメージングシステム(LiCOR)で走査した。rpS6ホスホ−235/236またはKDEL染色と、NHS−エステル染色の両方の強度を積算し、ホスホ−rpS6またはKDEL強度をNHS−エステル強度で割ることによって、正規化ホスホ−S6またはKDELスコアを計算した。
全てのスクリーニングデータを、対数目盛(log10)への変換によって正規化した。一次スクリーニングについて、z−スコアは、プレート中央値(対照は除外した)および中央絶対的偏差(MAD)に基づいて計算した。ここで、z−スコア=(細胞スコア−中央プレートスコア)/(プレートMAD×1.4826)。次いで、z−スコア>1.7または<−1.9にカットオフを設定して、スクリーニングヒットを3つのレプリカ・プレートの中央z−スコアに基づいて選択し、これにより、0.02のp値が得られる。アッセイを二重に行ったことを除いて、rpS6およびKDEL二次スクリーニングについても同じ方法を使用した。LC3−GFP、FYVE−dsRedおよびLamp1−RFP二次スクリーニングについて、z−スコアは、非標的siRNA対照平均および標準偏差に基づいて計算した。LC3−GFPアッセイにおけるヒットの二次確認について、各遺伝子について、4つの個別のsiRNAオリゴヌクレオチドの内の少なくとも2つが、5つのレプリカ・プレートに基づいて中央z−スコア>1.5または<−1.5を有し、一次スクリーニングのz−スコアと一貫していることが要求される。これにより、p<0.01が得られた。全ての他の二次アッセイにおいて、z−スコア>1.5または<−1.5も有意であると考えられた。確認された遺伝子に関する最終的なz−スコアは、二次LC3−GFPアッセイにおいて陽性であると考えられたオリゴヌクレオチドについて、全てのウェルの平均z−スコアに基づいて計算した。
ウェスタンブロットについて、細胞を、Lammeliサンプル緩衝液中で溶解させ、10〜12%のSDS−PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移した。以下の抗体を使用した:全て1:1000での、LC3(Novus)、p62(Pharmigen)、ホスホ−S6K(Thr389)、ホスホ−Akt(Ser473)、ホスホ−Stat3(Thr705)、RelA、Sod1、ホスホ−PTEN(Ser380/Thr382/383)(全てCell Signaling)、Bcl−2(Santa Cruz)、1:2000でのホスホ−S6(Ser235/236)(Cell Signaling)およびホスホ−ERK1/2(Sigma)、1:5000でのチューブリン(Sigma)。表示されている場合、ブロットは、NIH ImageJ64ソフトウェアを使用して数量化した。
全RNAは、製造業者の使用説明書にしたがって、RNeasyミニキット(Qiagen)を使用して調製した。cDNA合成について、オリゴdTプライマーによるRT−PCRのためのSuperScript First−Strand Synthesis System(Invitrogen)に1.25μgのRNAを使用した。RT−PCR反応に、以下のプライマーを使用した:RelA AGCGCATCCAGACCAACAACAACC および CCGCCGCAGCTGCATGGAGACC, AMPKα2 CACCTCGCCTGGGCAGTCACACC および ATTGGGGGCATAAACACAGCATAA, Sod1 GGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTC および ACCAGTGTGCGGCCAATGATG, βアクチン GACCTGACAGACTACCTCAT および AGACAGCACTGTGTTGGCTA。PCR産物は、2%のアガロースゲル上で分離し、NIH ImageJ64ソフトウェアを使用して数量化した。
ROSレベルを、siRNAトランスフェクションの72時間後に、製造業者の使用説明書にしたがってImage−iT LIVE Green ROS Detection Kitを使用して、数量化した。画像を、40倍の倍率でNikon Eclipse E800顕微鏡で得て、Metamorphソフトウェアを使用して数量化した。あるいは、ROSレベルは、HBSSにおける4時間の飢餓後に数量化した。細胞を、37℃で20分間に亘り10μMのジヒドロエチジウムにより染色し、PBS中で2回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
解析(enrichment analyses)について、siRNAスクリーニングヒット遺伝子を、生物学的プロセス、分子機能(PANTHER分類システム)、細胞成分(遺伝子オントロジー(GO)分類システム)、古典的(canonical)経路(MSigDB)および転写調節因子結合部位(MSigDBおよびTRANSFACv7.4)などの機能別カテゴリーに分類した。siRNAスクリーニングにおいて調査される遺伝子の広域なセットにおけるそれらの表示に対するヒット遺伝子に関するこれらのカテゴリーの統計的集積または過剰な表示を評価するために、超幾何学的確率分布を使用してp−値を計算し、これは、R原語で実行した。
老化分析中の遺伝子発現は、若年(40才以下)および老年(70才以上)のヒトの脳のサンプルのAffymetrix HG−U133_Plus_2マイクロアレイデータに基づいた。アレイ正規化、発現値計算およびクラスター分析は、dChipソフトウェアを使用して行った。階層的クラスター分析を使用して、同様の発現パターンを有する遺伝子またはサンプルを分類した。最も近い距離の2つの遺伝子またはサンプルを、最初に超遺伝子または超サンプルにマージさせ、その距離を表す長さを有する枝により接続し、将来のマージから削除した。次いで、最小の距離を有する遺伝子またはサンプルの次の対(超遺伝子または超サンプル)を、マージさせるものとして選択した。全ての遺伝子およびサンプルが1つのクラスターにマージされるまで、このプロセスを繰り返した。
哺乳類におけるオートファジーの調節に関与する遺伝子を特定するために、LC3−GFPレポーターを安定に発現するヒト神経芽細胞腫H4細胞を使用した。通常の増殖条件下で、これらの細胞中のLC3−GFPは拡散したサイトゾル局在化を示す。これらの細胞においてオートファジーが誘発された場合、LC3−GFPは、サイトゾルから動員され、オートファゴソームに対応する点状パターンで視覚化できる。このシステムを検証するために、必須オートファジー媒介物質のATG5または飢餓誘発オートファジーのサプレッサであるmTORいずれかに対するsiRNAでトランスフェクションした。通常の栄養条件下での72時間のインキュベーション後、細胞をATG5 siRNAでトランスフェクションした。これにより、LC3−GFP陽性オートファゴソームの数および強度の減少(図1A)、並びにウェスタンブロットでのLC3II対LC3Iの比の減少(図1B)により評価されるような、オートファジーの著しいダウンレギュレーションがもたらされた。反対に、mTORC1の触媒サブユニットであるmTORに対するsiRNAの発現により、LC3−GFP陽性オートファゴソームの数および強度の増加(図1A)、並びにLC3II対LC3Iの比の増加(図1B)がもたらされた。高スループット自動化蛍光顕微鏡で得られた384ウェル形式のLC3−GFP画像の数量化により、ATG5またはmTOR siRNAトランスフェクション後のオートファジーのレベルにおける変化は、非標的の対照siRNAと比べて、統計的に有意であることが示された(図2)。
新たに特定された遺伝子によるオートファジーの調節に関与する分子経路を解明するために、追加の高スループットアッセイを開発し、実施して、ヒットを特徴付けた(図4)。これらのアッセイの内の1つにおいて、飢餓誘発オートファジーの必須媒介物質であるmTORC1の機能を調査した。候補遺伝子の内のどれが、mTORC1活性を変えることによってオートファジーを調節するかを決定するために、「in−cell western」アッセイを使用して、mTORC1シグナル伝達の下流標的であるリボソームS6タンパク質(rpS6)のリン酸化反応状態を評価した。このシステムを検証するために、H4細胞をmTOR siRNAでトランスフェクションした。非標的siRNAと比べて、mTOR siRNAトランスフェクション済み細胞においてrpS6リン酸化反応のレベルの著しい減少が観察された(図5)。「in−cell western」アッセイを使用して、そのノックダウンによりオートファジーの誘発がもたらされた219の確認された遺伝子の内の14(6%)のみが、mTORC1活性のダウンレギュレーションと強力に相関したのに対し、そのノックダウンによりオートファジーとmTORC1活性のアップレギュレーションがもたらされた9の遺伝子(4%)が特定された(図6)。
siRNAのスクリーニング中に観察されたオートファジーの誘発が、必須遺伝子のノックダウン後の細胞ストレスに対する一般的な応答を、オートファジーの調節におけるその遺伝子の特異的な機能よりも、反映したか否かを調査した。Bcl−2の発現により、siRNAトランスフェクション後の平均細胞生存率が著しく改善された(図13〜15)。Kif11およびインテグリンα5を除いて、Bcl−2を発現する細胞中でオートファジーを誘発できる91の遺伝子のノックダウンでは、これらの細胞中の生存率の実質的な損失を生じなかった。このことは、これらの遺伝子の阻害後のオートファジーのアップレギュレーションは、細胞死応答の誘発に依存しなかったことを示唆している。そのノックダウンにより、Bcl−2を発現する細胞においてオートファジーをアップレギュレーションできなかった遺伝子の内、81の遺伝子が、野生型細胞において高い(85%超の)生存率を有した。したがって、129の特定したオートファジー阻害剤遺伝子の170の活性の阻害が、細胞死に無関係の機構によるオートファジーの誘発をもたらす。
最初に、III型PI3キナーゼの調節オートファジー特異的成分であるbeclin 1が、抗アポトーシスタンパク質Bcl−2の結合パートナーとして特定された。アポトーシス細胞死の調節におけるその突出した機能に加え、Bcl−2は、beclin 1との相互作用および結果として生じるIII型PI3キナーゼの活性の阻害により、オートファジーをマイナスに調節すると示唆されてきた。Bcl−2の機能を評価するために、三次特徴付けスクリーニングを行って、野生型H4細胞およびBcl−2を安定に発現する細胞におけるオートファジーの誘発およびIII型PI3キナーゼの活性を比較した(図18)。対照として、mTORのノックダウンが、Bcl−2発現細胞においてLC3−GFPおよびFYVE−dsRed小胞動員の両方を著しく誘発できたことが示された(図19AおよびB)。Bcl−2によるIII型PI3キナーゼの提案されたマイナスの調節と一致して、野生型対照と比べて、Bcl−2を発現するH4細胞におけるヒット遺伝子のノックダウン後の平均FYVE−dsRed誘発の著しい減少が生じた(図19C)。215の試験した遺伝子の内の91(42%)のノックダウンが、Bcl−2の存在下でLC3−GFPのオートファゴソームへの転座を誘発できた(図14および20)。これらの91の遺伝子の内の17(19%)において、オートファジーの誘発は、FYVE−dsRedの小胞動員により評価されるIII型PI3キナーゼの活性における増加と相関し、これらの遺伝子がBcl−2の下流のPtdIns3Pの産生を調節する追加の機構に関与することを示した。他方で、残りの74の遺伝子のノックダウンが、III型PI3キナーゼを追加に起動させずに、オートファジーを誘発することができた。これらの遺伝子の31のノックダウンが、野生型H4細胞中のLamp1−RFPの蓄積を引き起こし、これらの場合、リソソーム分解の遮断が、Bcl−2発現細胞におけるオートファジーの増加に寄与するであろうことを示した。残りの43の遺伝子について、リソソーム機能における変化は観察されなかった。それゆえ、III型PI3キナーゼへのBcl−2の阻害効果は、オートファジーの誘発と常に相容れないわけではなく、その起動は、PtdIns3Pレベルを上昇させずに行うことができる。最後に、残りの124(58%)の遺伝子のノックダウンは、Bcl−2を過剰発現する細胞中の小胞LC3−GFPの蓄積を誘発できなかった(図15)。
オートファジーの調節に関与する生物学的ネットワークをさらに解明するために、ヒット遺伝子間の相互作用を、哺乳類および酵母データの両方に基づくその直接的な物理的相互作用をマッピングすることによって、調査した。ヒットの中には、NF−κBの2つのサブユニット(NFκB1およびRelA)、pre−mRNAプロセシングに関与する3つのリボ核タンパク質(HNRPK、HNRPMおよびHNRPNU)、3つのコートマー成分(CopB2、CopEおよびArcn1)および2つのAMPKサブユニット(AMPKα2およびAMPKγ3)を含むいくつかの公知のタンパク質複合体の多数の構成員が含まれた(図21A)。さらに、p300HATおよびNFκBに集中するクロマチン修飾酵素および相互作用する転写調節因子の大きなネットワークを特定した(図21B)。後者は、転写調節がオートファジーの調節において重大な役割を果たすであろうことを示す。
遺伝子オントロジー(GO)を使用した236の確認したヒットの分子機能解析により、キナーゼコード化遺伝子(p=0.0006)、受容体活性を有するタンパク質(p=7.7×10-5)および細胞外基質タンパク質(p=0.03)における非常に著しい増加を示した(図25および26)。後者のカテゴリーは、成長因子、ホルモンおよびサイトカインの存在を含む細胞外環境が、通常の栄養条件下でオートファジーの調節に役割を果たすことを示す。GO生物学的プロセス解析の結果も、シグナル伝達分子の著しい増加(p=2.8×10-7)を示した(図27A)。オートファジーの調節における細胞外因子の提案された機能に一致して、これらのシグナル伝達分子のさらなる細分により、最大のサブグループ(49%)が細胞表面受容体シグナル伝達に関与したことが判明した(図27B)。
上述した標準経路は、NF−κB(p=8.7×10-6)およびRelA(p=1.2×10-6)経路におけるオートファジーヒットの増加を示した。スクリーニングの確認として、RelAに対してsiRNAでトランスフェクションしたH4 LC3−GFP細胞を個々にイメージングした。蛍光顕微鏡検査法によるLC3−GFPの転座を数量化することによるオートファジーのレベルを、代わりの低スループット法を使用して評価した。我々のスクリーニングの結果に一致して、RelAに対する4つのオリゴヌクレオチド全てによる処理が、オートファゴソームの数と強度の強力なダウンレギュレーションをもたらした(図32および33)。オートファジーのレベルにおいて観察した差が、標的遺伝子のノックダウンのためであったことを確認して、mRNA(図34A)およびタンパク質レベル(図34B)の両方でRelAの強力なダウンレギュレーションが観察された。オートファジーの陽性媒介物質としてのNF−κBの機能に関する発見はH4細胞に限られないことを確認するために、野生型でダブルノックアウトRelA-/-;NF−κB-/-(DKO)MEFおよびいずれかのsiRNAでトランスフェクションされたヒト乳癌MCF7細胞におけるオートファジーのレベルを、RelAまたは対照非標的siRNAに対して比較した。RelA/NFκBの不在またはダウンレギュレーションは、LC3IIの減少およびp62の蓄積により評価されるようにオートファジーの抑制をもたらした(図35)。これらのデータにより、NFκBが基礎オートファジーの陽性調節因子として確認される。
ノックダウンされたときにオートファジーを誘発する遺伝子は、ROS無害化経路の主成分であるSOD1およびGPx2、並びにその多くが酸化呼吸と電子伝達に関与するいくつかのミトコンドリアタンパク質を含んだ(図38)。これらの遺伝子のいずれの活性の阻害も、それらの産生を増加させるか、またはそれらの分解を遮断することによって、ROSのレベルのアップレギュレーションをもたらすと予測されるであろう。さらに、多くの追加のスクリーニングのヒットが、調節に関与する、またはROSにより調節されると報告されてきた(図39)。オートファジーの一般的な媒介因子としてのROSの潜在的な役割を評価するために、最初に、SOD1 siRNAのトランスフェクションが、オートファジーの誘発並びにROSの上昇したレベルの両方をもたらしたことを確認した(図40)。ROSの因果関係の役割を確認して、酸化防止剤NACによる処理によって、Sod1のノックダウンにより生じたオートファジーの誘発が著しく弱まった(図41)。したがって、正常な細胞ROSホメオスタシスの干渉が、オートファジーの誘発にとって十分である。
オートファジースクリーニングのヒットのバイオインフォマティクス解析は、細胞表面受容体からのシグナル伝達を媒介することが知られているいくつかの標準経路について著しい増加を示した(図45)。これらの経路は、スクリーニングにおいて特定したサイトカインにより調節されるMAPK(p=0.039)、Stat3(p=0.008)およびCXCR4(p=1.1×10-5)経路を含んだ。FGF2は、MAPK経路を活性化させことが知られており、ホスホ−ERK1/2およびホスホ−RSKの増加レベルが、FGF2による処理後に観察された(図46)。MAPK経路の必須機能を確認して、MEKの阻害因子であるUO126による前処理で、FGF2の添加後にオートファジーの阻害が弱まった(図46)。さらに、ヒット遺伝子の全ての促進因子部分の解析により、RSRFC4の3つの強化部位、血清応答因子(SRF)ファミリーの一員およびMAPKシグナル伝達の下流標的を含むいくつかの転写調節因子のコンセンサス部位の著しい増加が示され(図47)、通常の増殖条件下でのオートファジーの制御においてMAPK経路による転写調節の追加の関与を示唆している。
老化に関連する神経変性におけるオートファジー関連遺伝子の潜在的機能に特異的に対処するために、オートファジーヒット遺伝子のmRNA発現を一連の若年対老年のヒトの脳のサンプルにおいて解析した。年齢と共に、著しく(p<0.05)アップレギュレーションされた32の遺伝子および著しくダウンレギュレーションされた46の遺伝子のグループ(図53〜55)を含む遺伝子の大きいサブセット(図51および52)の発現差異が観察された。興味深いことに、遺伝子オントロジー(GO)生物学的プロセス解析により、年齢のアップレギュレーションされたグループは、MAPK経路の媒介および調節に関与した遺伝子が非常に豊富である(p=1.6×10-4)ことが判明し、その増加した活性は、オートファジーの抑制をもたらすと我々の分析により予測される。逆に、鍵となるオートファジー遺伝子、Atg5およびAtg7の発現は、老化中にダウンレギュレーションされた(図55)。これらのデータは、遺伝子発現差異により、老化中に脳におけるオートファジーのダウンレギュレーションがもたらされることを示唆しており、このことは、慢性神経変性疾患の発症に寄与するであろう。この仮説と一致して、中年の個人からのサンプルを含む、サンプルのより広範囲に及ぶセットのさらなる解析により、Atg5およびAtg7は、その発現が60歳代前半で始まる年齢依存様式で徐々にダウンレギュレーションされた哺乳類細胞におけるオートファジーの媒介にとって必要な遺伝子のグループの中にあったことが判明し(図56)、この年齢は、しばしば、アルツハイマー病(AD)などの散発性神経変性疾患に関する兆候の最も早い年齢である。したがって、我々のスクリーニングにおいて特定された遺伝子の年齢依存性調節は、正常なヒトの老化中のオートファジーのダウンレギュレーションに寄与しそうであり、それゆえ、年齢関連神経変性疾患を予防し、治療するための治療標的として有用である。
ROSおよびオートファジー小胞(AV)の両方の蓄積が、ADにおける初期の特徴である。この疾患におけるオートファジーの調節に関与する遺伝子の発現の変化を検出できるか否かを決定するために、14才の適合した正常な対照およびADを有する34の場合の6つの脳領域からのオートファジースクリーニングヒット遺伝子の発現を分析した。特に、この疾患により最も影響した脳領域である海馬状隆起および嗅内皮質において対照に匹敵するAD患者のサンプルにおいてヒット遺伝子の全体的な著しい低発現が観察された(図57A)。ADにより影響を受けた他の脳領域(上前頭回、後帯状皮質、および大脳側頭葉の外面)において、一貫した傾向が観察された。特に、AD病状に対して比較的抵抗性である視覚皮質において、これらの変化がなかった。さらに、ヒット遺伝子のさらなる細分により、嗅内皮質において、オートファジーの流れの負の調節因子が特異的に負に強化されたことが判明した(図57B)。ADの影響を受けた他の脳領域においても、同様の傾向が観察された。逆に、オートファジーのプラスの調節因子は、嗅内皮質において、プラスに強化された(図57C)。オートファジー調節因子のそのような発現差異パターンは、AD脳におけるオートファジーのアップレギュレーションを示唆している。
アミロイドβ(Aβ)は、ADにおける主要な病原因子である。Aβによるオートファジーの誘発がROSにより媒介されたか否かを調査した。H4細胞のAβによる処理後、増加したレベルのオートファジーが観察された(図58)。これが、オートファジーの開始の増加によるものか、またはリソソームの分解の遮断によるものかを決定するために、リソソームプロテアーゼ阻害因子E64dの不在下と存在下で、Aβ処理後のLC3−IIの蓄積を観察した(図58)。処理してから8時間後まで、CL3−IIの蓄積はE64dの存在下のみで観察できた。Aβを添加してから48時間後で、E64dの不在下でさえ、増加したレベルのLC3−IIが観察されたが、E64dの存在下では、さらに増加していた。その上、Aβ処理の4時間後から始まるAtg12−Atg5の増加した結合(conjugation)が観察された。これらのデータは共に、Aβに応答したオートファジーの増加した開始を示す。
本発明は、オートファジーを変調する方法およびオートファジー関連疾患の治療法を提供する。本発明の特定の実施の形態を論じてきたが、先の明細書は、説明であって、制限的ではない。本発明の多くの変種が、この明細書を検討した際に当業者には明白となるであろう。添付の特許請求の範囲は、そのような実施の形態および変種の全てをクレームすることが意図されており、本発明の全範囲は、同等範囲と共に請求項を、変種と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
Claims (50)
- 細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、前記細胞を、表2に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質と接触させる工程を有してなる方法。
- 前記遺伝子が、表4に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記遺伝子が、表6に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記作用物質が、siRNA、shRNAまたはアンチセンスRNA分子であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 細胞においてオートファジーを誘発する方法であって、前記細胞を、表2に列記された遺伝子(オートファジーを減少させるヒット)からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質と接触させる工程を有してなる方法。
- 前記遺伝子が、表4に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 前記遺伝子が、表6に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項12記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項14記載の方法。
- 対象における神経変性疾患を治療する方法であって、前記対象に、表2に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を有してなる方法。
- 前記遺伝子が、表4に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項16記載の方法。
- 前記遺伝子が、表6に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項16記載の方法。
- 前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項18記載の方法。
- 前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項19記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項16記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項21記載の方法。
- 前記神経変性疾患が、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、および中毒性脳症からなる群より選択されることを特徴とする請求項16記載の方法。
- 前記神経変性疾患がタンパク質症であることを特徴とする請求項16記載の方法。
- 前記タンパク質症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ALS、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項24記載の方法。
- 対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に、表2に列記された遺伝子(オートファジーを減少させるヒット)からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を有してなり、前記疾患が癌または膵炎であることを特徴とする方法。
- 前記遺伝子が、表4に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 前記遺伝子が、表6に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 前記作用物質が、siRNA、shRNAまたはアンチセンスRNA分子であることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項28記載の方法。
- 前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項30記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項32記載の方法。
- 前記疾患が癌であることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 化学療法薬の投与をさらに含むことを特徴とする請求項34記載の方法。
- 前記化学療法薬が、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、BCG、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、2−クロロデオキシアデノシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、イミダゾールカルボキサミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン−ダウノマイシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルダラビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロンα、インターフェロンα2a、インターフェロンα2b、インターフェロンαn3、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メゲストロール、メルファラン、L−サルコシリン、メルファラン塩酸塩、MESNA、メクロレタミン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、メルカプトプリン、パクリタキセル、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、6−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビレノルビンからなる群より選択されることを特徴とする請求項35記載の方法。
- 放射線療法の実施をさらに含むことを特徴とする請求項34記載の方法。
- 前記疾患が膵炎であることを特徴とする請求項26記載の方法。
- 対象におけるタンパク質症を治療する方法であって、前記対象に、表2に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を有してなる方法。
- 前記遺伝子が、表4に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項39記載の方法。
- 前記遺伝子が、表6に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項39記載の方法。
- 前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項41記載の方法。
- 前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項42記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項39記載の方法。
- 前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項44記載の方法。
- 前記タンパク質症が、α1−アンチトリプシン欠乏症、孤発性封入体筋炎、2B型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ALS、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項39記載の方法。
- 作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を前記作用物質に接触させる工程を有してなり、前記細胞が異種オートファジー促進遺伝子を発現し、該オートファジー促進遺伝子が、表2に列記された遺伝子からなる群より選択され、それによって、前記細胞におけるオートファジーの低減が、前記作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法。
- 前記作用物質が小分子であることを特徴とする請求項47記載の方法。
- 前記作用物質が抗体であることを特徴とする請求項47記載の方法。
- 前記作用物質が阻害性RNA分子であることを特徴とする請求項47記載の方法。
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