CN109628451A - 一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。所述shRNA为pSicoR‑shRNA‑508，由siRNA正义链、loop环、siRNA反义链和终止信号组成。所述shRNA能有效稳定地抑制兔Deptor基因的表达，可通过抑制Deptor基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理，进一步验证Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响，为兔胚胎干细胞稳定建系奠定基础。

Description

一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构 建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
Deptor是一个来源于DEPDC6基因(NCBI gene ID 64798)的48kDa蛋白质。Peterson 等人在mTOR的免疫沉淀中鉴定出了此蛋白，因此蛋白N末端串联了两个DEP结构域，又与mTOR有相互作用，于是将其蛋白命名为Deptor。Deptor的C末端含有PDZ结构域，调节Deptor与mTOR蛋白质的C端区域的互作作用。Deptor是mTOR复合物mTORC1/2 的组成成分，并对这两个复合物起负调控作用。干扰Deptor的表达，mTORC1/2下游信号传导底物的磷酸化增加，相反，Deptor的过表达抑制mTORC1/2下游的信号传导。在缺乏生长因子或存在mTOR抑制剂的情况下，mTOR-Deptor的结合被强化，从而降低mTOR 活性。另外，Deptor也是一种磷酸化蛋白，可以进行翻译后修饰，从而影响其与mTOR 的结合。在生长因子的刺激下，激活的RSK1和S6K1会使Deptor磷酸化，磷酸化的Deptor 会被泛素蛋白酶体系统迅速降解，从而提高mTOR的活性。
在生物体内，Deptor主要在内分泌腺表达。在癌症上，Deptor在不同的组织或细胞中，可以表现为致癌基因或抑癌基因。在大多数癌症中Deptor表达量低，但在多发性骨髓瘤亚群中表达量高，在这些细胞中，Deptor的高表达对维持PI3K和AKT活化是必要的， Deptor表达水平降低将导致细胞凋亡。Deptor作为天然的mTOR抑制剂，通过调节细胞自噬相关通路调节细胞生长、凋亡、自噬和内质网应激。近年，有报道称Deptor能作为一个核蛋白与DNA结合，调控基因的转录。Deptor能调节内质网内稳态相关基因转录，其下调则会促进内质网应激的发生，诱导凋亡产生。
近年有报道，mTOR复合物中的Deptor不仅仅定义为mTOR的抑制剂。Deptor可能作为一个干细胞因子，与其他多能因子组成干细胞调控自噬网络，直接参与多能干细胞的干性。对Deptor基因启动子进行预测，发现启动子区含有Oct4结合的区域，也含Sox2 结合区域，推测Deptor可能受Oct4、Sox2调控。依据前人的报道，mTOR通路对干细胞多能性的维持有重要作用，而mTOR复合物中Deptor是mTOR天然抑制因子，同时也被报道为潜在的干细胞因子。由此，推测Deptor对干细胞的多能性具有调节作用。因此，有必要进一步研究Deptor基因对兔胚胎干细胞(Rabbit Embryonic Stem Cells，rbESCs) 多能性的影响，为rbESCs建系和丰富多能性调控网络奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能有效稳定地抑制兔Deptor基因表达的shRNA，可通过抑制Deptor基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理。
本发明的目的在于提供一种shRNA。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述shRNA的重组慢病毒表达载体。
本发明的另一目的在于提供上述重组慢病毒表达载体的构建方法。
本发明的另一目的在于提供一种慢病毒颗粒。
本发明的另一目的在于提供一种基因工程化的兔胚胎干细胞。
本发明的另一目的在于提供上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在抑制兔Deptor基因表达中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在维持rbESCs多能性中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在调控自噬通路相关基因表达中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明人利用分子和细胞生物学技术，首先克隆得到兔Deptor基因全长序列，构建了兔Deptor基因融合蛋白表达载体，设计合成了兔Deptor基因shRNA片段并构建其慢病毒表达载体。然后，采用脂质体转染方式将兔Deptor基因融合蛋白表达质粒和其shRNA 慢病毒表达载体共转入HEK 293T细胞，收集细胞检测兔Deptor基因在293T细胞中的表达，快速筛选获得高效抑制兔Deptor基因的shRNA干扰序列，通过慢病毒感染法将其导入rbESCs，观察细胞形态变化并收集细胞检测与多能性及自噬通路相关基因的表达情况。
因此，本发明请求保护一种shRNA，所述shRNA为pSicoR-shRNA-508，由19nt的siRNA正义链、9nt的loop环、19nt的siRNA反义链和终止信号组成；所述siRNA正义链的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；所述siRNA反义链的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；所述终止信号的碱基序列为TTTTTT。
siRNA正义链(SEQ ID NO:1)：
AACGCGTCTGAATTCCTTGATTGGTTCAAGAGACCAATCAAGGAATTCAGACGC TTTTTTC
siRNA反义链(SEQ ID NO:2)：
TCGAGAAAAAAGCGTCTGAATTCCTTGATTGGTCTCTTGAACCAATCAAGGAAT TCAGACGCGTT
本发明还请求保护一种含有上述shRNA的重组慢病毒表达载体。
所述重组慢病毒表达载体的构建方法是将上述shRNA插入慢病毒表达载体的酶切位点HpaI和XhoI之间得到。
优选地，所述慢病毒表达载体为pSicoR-Ef1a-mCh质粒。
本发明还请求保护一种慢病毒颗粒，是将上述重组慢病毒表达载体与包装质粒NRF、包膜质粒pCMV-VSV-G共转染宿主细胞HEK 293T后得到，其病毒滴度为8×106。
本发明还请求保护一种基因工程化的兔胚胎干细胞，是将上述慢病毒颗粒转染兔胚胎干细胞后得到。
本发明进行了以下具体研究工作，以探究抑制Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响：
(1)兔Deptor基因的克隆、融合表达载体的构建及其检测
克隆得到兔Deptor基因mRNA的全长序列，经过测序验证序列正确后，将其定向插入pEGFP-N1载体中，构建兔Deptor基因的融合表达载体，酶切验证阳性重组质粒 pEGFP-Deptor。重组质粒经脂质体转染方式导入HEK 293T细胞，细胞培养72h后，荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，鉴定其能够在HEK 293T细胞中表达。
(2)shRNA片段设计及其慢病毒表达载体的构建、细胞检测
针对兔Deptor基因CDs序列，参照siRNA设计原理，选择3个siRNA序列作为靶位点，BLAST比对确认以上序列与其他基因序列无同源性。将其设计为shRNA结构，shRNA 结构包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环(TTCAAGAGA)，19nt的siRNA反义链和终止信号(TTTTTT)，shRNA两端引入酶切位点Hpal、Xhol。分别命名为 pSicoR-shRNA-477或pSicoR-shRNA-508或pSicoR-shRNA-585，同时选择一个无关序列 (NC)作为阴性对照。合成shRNA序列并克隆到慢病毒表达载体pSicoR-Ef1a-mCh中，酶切和测序验证获得shRNA慢病毒表达载体(pSicoR-shRNA)，使用脂质体转染方法将上述shRNA慢病毒表达载体导入HEK 293T细胞中，转染后72h，荧光显微镜下观察细胞水平上shRNA片段表达情况。
(3)shRNA干扰兔Deptor基因表达的效率
采用多质粒共同转染法，将目的基因兔Deptor基因表达载体(靶质粒pEGFP-Deptor) 分别与shRNA表达载体(干扰质粒pSicoR-shRNA)按1:1的量进行共转。转染后12h换新鲜培养液，72h观察细胞的荧光表达，通过实时定量PCR方法在mRNA水平检测Deptor 基因的表达，计算shRNA对Deptor基因表达的干扰效率。
(4)Deptor对rbESCs多能性和自噬相关基因表达的影响
将rbESCs接种到12孔板中培养，接种后24h通过慢病毒感染法分别将 pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1载体(Deptor基因过表达组)、pLVX-IRES-ZsGreen1载体(阴性对照)、pSicoR-shRNA-508载体(Deptor基因干扰组)包装出的病毒液导入rbESCs中。感染时在培养基中补充6μg/mL的Polybrene促进病毒感染，病毒感染12h后重新加入病毒液二次感染，病毒感染24h时，细胞培养液更换为正常的干细胞培养基。病毒感染72h 后，观察细胞荧光表达情况，通过实时定量PCR方法在mRNA水平检测与多能性及自噬通路相关基因的表达情况。
通过上述步骤，本发明人快速获得了本发明的高效稳定抑制兔Deptor基因表达的shRNA序列pSicoR-shRNA-508。实验结果表明，当把质粒pEGFP-Deptor与干扰质粒 pSicoR-shRNA-508以1:1比例转染时，pSicoR-shRNA-508对Deptor基因的抑制效率为 80％。如前所述，结合本发明，在基因功能研究和转基因动物制备过程中，可通过抑制 Deptor基因表达探讨其对外源转目的基因表达效率的影响及其作用机理，并可进一步验证 Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响，为rbESCs稳定建系奠定基础。
因此，上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在抑制兔Deptor基因表达中的应用亦在本发明保护范围之内。
上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在维持rbESCs多能性中的应用亦在本发明保护范围之内。
上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在调控自噬通路相关基因表达中的应用亦在本发明保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的shRNA能有效稳定地抑制兔Deptor基因的表达，可通过抑制Deptor 基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理，进一步验证Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响，为兔胚胎干细胞稳定建系奠定基础。
附图说明
图1为兔各组织总RNA的电泳。其中，泳道从左至右分别为：心、肝、脾、肺、卵巢、胃、大肠、肌肉、肾、小肠。
图2为Deptor基因序列扩增的电泳图与连接载体后的电泳图。其中，A为Deptor基因PCR扩增电泳图，泳道M1为DL2000Plus DNA Marker，泳道1为F+R引物扩增的Deptor 基因，泳道2为F+Rr引物扩增的Deptor基因；B为Deptor基因连接载体后的电泳图，泳道M2为Supercolid DNA Ladder Marker，泳道3为来自F+R引物扩增的pEASY-Deptor，泳道4为来自F+Rr引物扩增的pEASY-Deptor。
图3为Deptor基因进化树分析结果。
图4为pEASY-Deptor双酶切和重组质粒pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1凝胶电泳结果。其中，A为pEASY-Deptor双酶切凝胶电泳结果，泳道M1为DL5000DNA Marker，泳道 M2为Supercolid DNA Ladder Marker，泳道1为pEASY-Deptor酶切，泳道2为 pEASY-Deptor；B为重组质粒pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1凝胶电泳结果，泳道M3为 Supercolid DNA LadderMarker，泳道3为pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1。
图5为融合表达载体pEGFP-Deptor的构建。其中，泳道M1为Supercolid DNALadder Marker，泳道M2为DL5000DNA Marker，泳道1为pEGFP-N1酶切，泳道2为pEGFP-N1，泳道M3为Supercolid DNA Ladder Marker，泳道3为pEGFP-Deptor。
图6为pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1转染HEK 293T细胞情况。
图7为融合表达载体pEGFP-Deptor转染HEK 293T细胞情况。
图8为pSicoR-Ef1a-mCh双酶切和重组质粒pSicoR-shRNA凝胶电泳结果。其中，A为pSicoR-Ef1a-mCh双酶切凝胶电泳结果，泳道M1为Supercolid DNA Ladder Marker，泳道M2为λDNA/Hind III，泳道1为pSicoR-Ef1a-mCh，泳道2为pSicoR-Ef1a-mCh酶切； B为重组质粒pSicoR-shRNA凝胶电泳结果，泳道M3为Supercolid DNA Ladder Marker，泳道3为重组载体pSicoR-shRNA。
图9为重组载体pSicoR-shRNA转染HEK 293T细胞情况。其中，A为pEGFP-Deptor+pSicoR-shRNA-NC，B为pEGFP-Deptor+pSicoR-shRNA-508，C为pEGFP-Deptor，D为 black。
图10为定量检测pSicoR-shRNA-508干扰Deptor基因表达的效率。
图11为pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1病毒感染细胞72h时绿色荧光蛋白表达情况。
图12为PCR检测Deptor mRNA水平上病毒感染情况。其中，泳道M为Marker I；感染组：泳道1为pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1，泳道2为β-Actin；对照组：泳道3为 pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1，泳道4为β-Actin。
图13为病毒感染rbESCs情况。其中，A为克隆感染过表达Deptor基因的病毒，B 为克隆感染干扰Deptor基因表达的病毒。
图14为过表达Deptor时rbESCs克隆各基因的表达情况。
图15为干扰Deptor表达时rbESCs克隆各基因的表达情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1兔Deptor基因表达载体的构建
根据NCBI GeneBank公布的兔(Oryctolagus cuniculus)Deptor基因预测序列(XM_002710752)，用OLigo7.0软件设计扩增Deptor基因CDs全长的引物F、R、Rr。其中F、R扩增出的Deptor基因，后续与pLVX-IRES-ZsGreen1载体进行连接。而F、Rr 扩增出Deptor基因，后续与用于检测干扰载体干扰效率的pEGFP-N1载体进行连接。 pEGFP-N1为融合表达载体，构建重组质粒时必须保证新插入的序列不影响后续荧光蛋白的表达，因此多设计一条下游引物Rr(比R引物多两个碱基)，引物序列见下表1，表1 中下划线为酶切位点(F：Xho I，R：BamH I)。
表1扩增引物
取三只母兔，注射过量麻醉处死，迅速采集机体各部分组织，放入液氮中。研磨组织至粉末状后放入预先加有1mL预冷Trizol溶液的EP管中。用Trizol裂解法提取总的RNA(如图1所示)，反转录成cDNA。以兔组织cDNA为模板，扩增得到兔Deptor基因的 ORF全长序列，长度约为1239bp(如图2A所示)。将PCR产物回收后插入pEASY-Blunt Simple载体，命名为pEASY–Deptor，转化至E.coli DH5α，用PCR方法鉴定，经凝胶电泳可看到目的条带(如图2B所示)。将阳性克隆菌液送上海生工公司测序验证，测序结果经Blast比对(如表2所示)和进化树分析(如图3所示)。Blast比对结果显示兔Deptor 基因与其它哺乳动物的Deptor基因有一定相似性，进化树分析结果显示兔的Deptor基因与同是哺乳动物的黑猩猩、人、野猪的遗传距离相对较近。
表2Deptor基因的脱氧核苷酸序列比对结果
物种 相似度
驴(Equus asinus_XM_014867696.1) 93％
黑猩猩(Pan troglodytes_XM_519926.5) 93％
马(Equus caballus_XM_001496931.5) 93％
人(Homo sapiens_NM_022783.3) 92％
野猪(Sus scrofa_XM_021090554.1) 92％
猫(Felis catus_XM_004000086.4) 91％
抹香鲸(Physeter catodon_XM_007127703.1) 91％
非洲象(Loxodonta africana_XM_003408166.2) 90％
骆驼(Camelus bactrianus_XM_010972597.1) 89％
用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切pEASY-Deptor、pLVX-IRES-ZsGreen1、pEGFP-N1，酶切产物经1％凝胶电泳跑胶后，分别胶回收酶切后线性化的Deptor基因、线性化载体质粒pLVX-IRES-ZsGreen1、pEGFP-N1。取胶回收产物进行连接，线性化的 pLVX-IRES-ZsGreen1、pEGFP-N1载体与相应的酶切后的Deptor基因分别连接。连接产物进行转化、挑菌、鉴定、测序验证。成功连接的重组质粒分别命名 pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1、pEGFP-Deptor。
结果如图4和图5所示，结果表明成功获得了携带Deptor基因的融合表达载体pEGFP-Deptor和pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1。
实施例2重组质粒pEGFP-Deptor/pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1的细胞表达检测
将构建好的pEGFP-Deptor/pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1重组质粒用无内毒素质粒提取试剂盒提取，依照Viafect转染试剂说明书，取与培养皿大小相对应量的质粒与转染试剂，加入对应量的opti-MEM中，质粒与转染试剂的质量/体积比为1：3(即转染1μg质粒需加入3μL转染试剂)混匀后静置20min。将转染复合物均匀滴加到HEK 293T细胞培养液中，12h后换新鲜的培养液，72h荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况。
结果如图6和图7所示，图6显示大量的HEK 293T细胞在 pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1转染72h后表达GFP。图7表明HEK 293T在pEGFP-Deptor 转染后72h表达GFP。
综上，重组质粒pEGFP-Deptor/pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1均能够在HEK 293T细胞中表达。
实施例3 shRNA慢病毒表达载体的构建
根据THEROMO FISHER公司的siRNA在线设计网站(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)，针对扩增出的兔子Deptor基因的CDs序列筛选干扰序列，由于该网站没有兔的基因库进行序列比对，于是比对了人、鼠的基因库，最后挑选出3条保守性较好、分值较高的目标序列进行shRNA设计，BLAST比对确认以上序列与其他基因序列无同源性，将其设计为shRNA结构。shRNA结构包含19nt的siRNA正义链，9nt 的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号，shRNA两端引入酶切位点Hpal、Xhol。分别命名为pSicoR-shRNA-477或pSicoR-shRNA-508或pSicoR-shRNA-585。具体见下表3， F链5’→3’按照酶切位点(HpaI)、干扰序列、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列、终止信号(TTTTTT)、酶切位点(XhoI)的顺序。R链5’→3’按照酶切位点(XhoI)、终止序列的互补序列(AAAAAA)、干扰序列、loop环的反向互补序列 (TCTCTTGAA)、干扰序列的反向互补序列、酶切位点(HpaI)的顺序。对照组无关序列(NC)参照前人报道，序列最后由上海生工公司合成。
将合成的shRNA克隆入慢病毒表达载体pSicoR-Ef1a-mCh中，酶切和测序验证获得shRNA慢病毒表达载体。本载体使用的启动子为Ef1a，Ef1a启动子可以实现目的基因在干细胞中稳定表达，使用pSicoR-Ef1a-mCh载体骨架构建的干涉载体，干涉效率不但可以达到80％，在转入兔胚胎后可以显著降低Deptor的表达。此外，本发明人还构建了 pSicoR-CMV-GFP shRNA，但在转入兔胚胎干细胞后，其对deptor的干涉效果不显著。因此，后续选择pSicoR-Ef1a-mCh作为干涉载体。
参照实施例1对pSicoR-Ef1a-mCh进行双酶切，重组质粒pSicoR-shRNA进行凝胶电泳。结果如图8所示，成功得到阳性重组质粒pSicoR-shRNA。
表3 shRNA序列设计
参照实施例2的方法对重组质粒pSicoR-shRNA的细胞表达进行检测，结果如图9所示，pEGFP-Deptor与pSicoR-shRNA-NC、pSicoR-shRNA-508分别共转HEK 293T细胞， 72h后观察均有GFP表达。
实施例4 shRNA干扰兔Deptor基因表达的效率
使用多质粒共同转染法，将目的基因兔Deptor基因表达载体(靶质粒pEGFP-Deptor) 分别与shRNA表达载体(干扰质粒pSicoR-shRNA)按1：1的量进行共转。转染后12h换新鲜培养液，72h荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，如图9所示。
进一步收集细胞，利用Trizol法分别提取共转后的HEK 293T细胞和未转染的HEK293T细胞的RNA，通过实时定量PCR方法在mRNA水平检测Deptor基因的表达，计算 shRNA对Deptor基因表达的干扰效率。结果如图10所示，结果表明，与pSicoR-shRNA-NC 组相比，pSicoR-shRNA-508的Deptor基因表达显著下降(P<0.05)，表明pSicoR-shRNA-508 能有效的降低Deptor基因的表达，pSicoR-shRNA-508对Deptor基因的抑制效率为80％。
实施例5 Deptor对rbESCs多能性和自噬相关基因表达的影响
1、病毒包装与收集
慢病毒重组质粒(pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1或pSicoR-shRNA)、包装质粒NRF、包膜质粒pCMV-VSV-G按5：3：2的量混匀构成总的转染质粒，与相应量的转染试剂加入opti-MEM中，混匀后静置20min。将转染复合物均匀滴加到HEK 293T细胞培养液中， 12h后换新鲜的培养液，培养过程中适当补加培养基。病毒包装60h后收集病毒，经0.45μm 针式滤器过滤病毒液，取适量病毒液感染HEK 293T细胞，72h观察细胞荧光表达情况，如图11所示。进一步收集细胞，利用Trizol法分别提取感染后的HEK 293T细胞和正常的HEK 293T细胞中的RNA，反转、PCR、电泳检测细胞水平上载体基因的表达，结果如图12所示。
2、病毒超滤浓缩、滴度测定
将收集到的病毒液平均分装到超滤管中，于21000rpm、4℃，进行超滤2h。超滤结束后，加入新鲜的rbESCs培养基重悬病毒。滴度测定时取10μL病毒液与990μL DMEM混匀，再从中取100μL液体加入1.4mL普通细胞培养基中，混匀。最后将6孔板中生长汇合度为30～40％的HEK 293T细胞的培养基，每孔置换为1.5mL的病毒混合液，实验重复 3个孔，期间不换液，可适当补充培养基。感染48h时在100倍镜下观察多个视野中荧光情况，记录每个视野中荧光细胞的数量，相邻得非常近的两个荧光细胞认为是感染上一个细胞分裂出的，计算为一个荧光细胞。病毒滴度计算公式为：病毒滴度＝各个视野中荧光细胞数目平均值×1.5×105。病毒滴度为8×106。
3、病毒感染
将rbESCs接种到12孔板中培养，并在接种后第24h通过慢病毒感染法分别将pLVX-Deptor-IRES-ZsGreen1载体(Deptor基因过表达组)、pLVX-IRES-ZsGreen1载体(阴性对照)、pSicoR-shRNA-508载体(Deptor基因干扰组)包装出的病毒液导入rbESCs中进行感染，病毒感染12h时重新加入病毒液二次感染，感染时在培养基中补充6μg/mL的 Polybrene促进病毒感染。病毒感染24h时，细胞培养基改为正常的干细胞培养基。病毒感染72h后，观察细胞荧光表达情况，收集病毒感染的克隆细胞与正常的克隆细胞，通过实时定量PCR方法在mRNA水平检测与多能性及自噬通路相关基因的表达情况。结果如图13～15所示。
如图13所示，通过慢病毒感染法能成功感染rbESCs，各实验组和阴性对照中的克隆细胞，能表达相应载体上的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白。与空白组和阴性对照组相比，Deptor基因过表达组的克隆形态变得松散，Deptor基因干扰组的克隆形态变化不明显，克隆仍维持紧密的状态。
如图14所示，Deptor基因过表达组与对照组相比，rbESCs中Deptor基因上调，mTOR基因表达下调，ULK1基因表达上调，多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表达显著降低(p<0.05)。导致rbESCs多能性降低可能的原因是Deptor过表达导致了mTOR被抑制，促进细胞分化。此外，检测到ULK1基因表达升高，这暗示着自噬蛋白质的积累、细胞自噬水平的提高，过高的自噬水平促进多能蛋白的降解，促进了细胞分化。从克隆形态上来看，克隆变得疏松(图12A)，证实了rbESCs多能性的降低。
如图15所示，干扰Deptor基因组与对照组相比，rbESCs的Deptor基因、ULK1基因表达下调，mTOR基因表达上调，多能基因OCT4、SOX2、NANOG的表达下调，与Deptor 作为多能因子的作用相符，但多能基因下调幅度不明显。此时rbESCs多能基因表达下调，却依然能保持紧凑的克隆形态，推测是由于Deptor表达降低导致的mTOR表达升高、ULK1 表达降低，抑制了细胞自噬。自噬抑制后多能蛋白在一段时间内能继续积累，使克隆维持紧凑的形态。
因此，在rbESCs中，mTOR自噬通路对多能性的维持、调控能力大于Deptor基因是多能因子对干细胞多能性的维持。Deptor基因可能通过细胞自噬调控rbESCs的多能性，而作为潜在的干细胞多能因子对多能性的维持作用不明显。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种shRNA，其特征在于，所述shRNA为pSicoR-shRNA-508，由siRNA正义链、loop环、siRNA反义链和终止信号组成；
所述siRNA正义链的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
所述siRNA反义链的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；
所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；
所述终止信号的碱基序列为TTTTTT。
2.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述shRNA。
3.权利要求2所述重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体是将权利要求1所述shRNA插入慢病毒表达载体的酶切位点HpaI和XhoI之间得到。
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pSicoR-Ef1a-mCh质粒。
5.一种慢病毒颗粒，其特征在于，是将权利要求2所述重组慢病毒表达载体与包装质粒NRF、包膜质粒pCMV-VSV-G共转染宿主细胞HEK 293T后得到。
6.一种基因工程化的兔胚胎干细胞，其特征在于，是将权利要求5所述慢病毒颗粒转染兔胚胎干细胞后得到。
7.权利要求1所述shRNA、权利要求2所述重组慢病毒表达载体、权利要求5所述慢病毒颗粒和/或权利要求6所述兔胚胎干细胞在抑制兔Deptor基因表达中的应用。
8.权利要求1所述shRNA、权利要求2所述重组慢病毒表达载体、权利要求5所述慢病毒颗粒和/或权利要求6所述兔胚胎干细胞在维持rbESCs多能性中的应用。
9.权利要求1所述shRNA、权利要求2所述重组慢病毒表达载体、权利要求5所述慢病毒颗粒和/或权利要求6所述兔胚胎干细胞在调控自噬通路相关基因表达中的应用。
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