CN102517287A - 抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA，该shRNA为shRNA-TREM194、或shRNA-TREM294，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号。该shRNA能高效抑制水牛TREM1基因的表达。本发明还公开了上述shRNA的慢病毒表达载体及其构建方法。实验证实，应用本发明的shRNA可有效稳定地抑制水牛TREM1基因表达，展示了在布氏杆菌病防治中的一定的应用前景，也为进一步了解TREM1在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及水牛髓样触发受体1基因(TREM1)，尤其是一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
水牛是我国南方重要的农业生物资源，它具有适应性强、耐高温高湿、易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，如今已成为极具开发价值的家畜品种。然而，水牛的低繁殖力、较高的疾病发生率却严重制约了我国水牛产业的发展。其中，布氏杆菌病引起的母牛流产、不育在实际生产中极其常见，这不仅给畜牧业造成重大的经济损失，而且严重威胁人类健康。长期以来，对布氏杆菌病的治疗手段主要是使用抗菌素和疫苗，前者容易产生耐药性，后者免疫效果不稳定、持续时间短。因此，如何有效控制布氏杆菌病仍是一项重大挑战，亟需寻求一种新的防治途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：
抑制水牛TREM1基因表达的shRNA，该shRNA为shRNA-TREM194或shRNA-TREM294，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；
loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；
终止信号的碱基序列为TTTTTTT；
shRNA-TREM194的正义链具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.ID.No.4的碱基序列；
shRNA-TREM294的正义链具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，该载体是：
pSicoR-GFP-shTREM-194或pSicoR-GFP-shTREM-294。
上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，该慢病毒表达载体由合成的shRNA-TREM194或shRNA-TREM294分别克隆入慢病毒表达载体pSicoR-GFP中而得。
上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA在抑制水牛TREM1基因表达方面的应用。
上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛TREM1基因表达方面的应用。
上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
发明人通过了解布氏杆菌病发生的分子机制，研究其信号转导通路为其防治提供新的思路和方向。髓样触发受体1(TREM1)是专一表达于中性粒细胞、CD14单核/巨噬细胞等髓样细胞表面的跨膜糖蛋白，由其介导的信号通路在炎症反应和级联放大中起重要作用，它还与Toll样受体-4(TLR-4)在LPS所致炎症反应中存在协同效应。因此，作为革兰氏阴性菌脂多糖LPS诱导的免疫反应信号路径中一个重要的靶基因，抑制TREM1基因的表达有可能改变一些其他相关因子的表达。
为此，发明人利用分子和细胞生物学技术，首先克隆得到水牛髓样触发受体1(TREM1)全长编码区，构建了水牛TREM1基因融合蛋白表达载体，设计并构建水牛TREM1基因shRNA慢病毒表达载体；然后，采用脂质体转染方法将水牛TREM1基因融合蛋白表达质粒和其shRNA慢病毒表达载体共转入293细胞，收集细胞检测水牛TREM1基因在293细胞中的表达，快速筛选获得高效抑制水牛TREM1基因的shRNA干扰序列。本发明研究工作包括以下基本步骤：
<1>水牛TREM1基因的克隆、融合蛋白表达载体的构建及其表达检测
克隆得到水牛TREM1基因mRNA的ORF全长序列，经过测序验证序列正确后，将其定向插入pDsRed-N1载体中，构建水牛TREM1基因的融合蛋白表达载体，酶切验证阳性重组质粒pDsRed-N1-TREM1；重组质粒pDsRed-N1-TREM1经脂质体转染方法导入293细胞，细胞培养48h后，荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况；收集细胞，采用RT-PCR方法检测水牛TREM1基因在293细胞中的表达。
<2>shRNA的设计及其慢病毒表达载体的构建、细胞检测
针对黄牛TREM1基因[GenBank：NM_206970.1]CDs序列，参照siRNA设计原理，选择5个siRNA序列作为靶位点(96-104bp，194-213bp，294-312bp，578-596bp，643-661bp)，BLAST比对确认以上序列与其他基因序列无同源性。将其设计为shRNA结构，shRNA结构包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环(TTCAAGAGA)，19nt的siRNA反义链和终止信号(TTTTTTT)，shRNA两端引入酶切位点XhoI、NotI。分别命名为shTREM-96，shTREM-194，shTREM294，shTREM578，shTREM643。同时选择一个无关序列shTREM-1864(N.C)作为阴性对照。合成shRNA序列并克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中，酶切和测序验证。shRNA慢病毒表达载体(pSicoR-GFP-shTREM-96/194/294/578/643/N.C)经脂质体转染方法导入293细胞，转染48h后，荧光显微镜下观察细胞水平上各shRNA片段表达情况。
<3>抑制水牛TREM1基因表达shRNA序列的筛选
采用共转染的方法，将目的基因水牛TREM1基因表达载体(靶质粒)与shRNA表达载体(干扰质粒)分别以不同剂量比例经脂质体共转染入293细胞，转染48h后，荧光显微镜下观察细胞荧光情况。通过实时定量PCR(Real-Time RT-PCR)方法在mRNA水平检测TREM1基因的表达，计算各shRNA片段抑制效率。
通过上述步骤，发明人快速获得了本发明的高效稳定抑制水牛TREM1基因表达的shRNA序列shTREM-194和shTREM-294。实验显示，当靶质粒(pDsRed-N1-TREM1)与干扰质粒(shTR-96/194/294/578/643)以1∶3比例转染时，shTR-194和shTR-294对TREM1的抑制效率分别为36.93％和20.76％；以1∶1的比例共转染时，shTR-194和shTR-294的抑制效率分别为46.14％和50.73％。这展示了其在布氏杆菌病防治中的一定的应用前景，也为下一步在巨噬细胞系中，研究TREM1基因的抑制对脂多糖LPS诱导的免疫反应信号转导路径中其他相关因子的影响奠定了重要的实验基础。
附图说明
图1是水牛TREM1基因融合蛋白表达载体pDsRed-N1-TREM1结构示意图。
图2是抑制水牛TREM1基因表达的shRNA慢病毒表达载体结构示意图。
图3是靶质粒和干扰质粒共转染(剂量比1∶3)293细胞实时荧光定量PCR检测图。
图4是靶质粒和干扰质粒共转染(剂量比1∶1)293细胞实时荧光定量PCR检测图。
具体实施方式
一、相关表达载体的构建
1.水牛TREM1基因表达载体的构建
根据GenBank中收录的牛TREM1基因CDs序列[GenBank：NM_206970.1]设计引物，并在上下游引物的5’端(CTCGAG和GGTACC)分别引入XhoI、KpnI酶切位点，引物为：
TREM1-上游5’CTCGAGAGAACAGTTGGAGTCAGTGC-3’(序列表SEQ.ID.No.13)，
TREM1-下游5’GGTACCGACCTATGCGTGACAGCAAA-3’(序列表SEQ.ID.No.14)。
从屠宰场取水牛新鲜脾脏组织，放入预先加有1ml RNA保护剂的2ml EP管中。用Trizol裂解法提取总的RNA，反转录为cDNA。以水牛脾脏cDNA为模板，扩增得到水牛TREM1基因的ORF全长序列(序列表SEQ.ID.No.21)，扩增长度为715bp，将PCR产物回收后插入pMD18-T载体，命名为pMD18-T-TREM1，用XhoI和KpnI酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳可看到长度分别为2.7kp和715bp的条带，证明已成功插入。将重组质粒pMD18-T-TREM1送上海生工测序，测序结果经Blast比对，与NCBI中黄牛TREM1基因同源性为97.2％。
用XhoI和KpnI双酶切pMD18-T-TREM1，胶回收715bp的片段。用同样的酶线性化pDsRed-N1载体。将TREM1基因片段定向插入载体pDsRed-N1中，重组质粒用XhoI和KpnI进行酶切鉴定正确。水牛TREM1融合蛋白表达载体pDsRed-N1-TREM1结构如图1所示。
2.shRNA慢病毒表达载体的构建
采用siRNA设计软件，针对TREM1基因ORF序列，选择5个不同的靶位点作为靶序列(96-104bp，194-213bp，294-312bp，578-596bp，643-661bp)，并将其设计为包含19nt的siRNA正义链、9nt的loop环(TTCAAGAGA)和19nt的siRNA反义链的shRNA结构，分别命名为shTREM-96，shTREM-194，shTREM294，shTREM578，shTREM643；同时选择一个无关序列shTREM-1864(N.C)作为阴性对照(见表1)。合成5条shRNA序列和1条阴性对照序列，并克隆入慢病毒表达载体pSicoR-GFP中，测序验证，并用XhoI和NotI双酶切验证。构建的shRNA表达载体结构如图2所示。
表1shRNA序列结构
二、重组质粒表达的检测
1.重组质粒pDsRed-N1-TREM1的细胞表达检测
将构建的pDsRed-N1-TREM重组质粒用无内毒素质粒提取试剂盒提取并稀释至终浓度为1μg/μL，用LTX脂质体转染293细胞。转染质粒量为2.5μg，同时做未转染组和空载体(pDsRed-N1)转染组作为对照。转染48h后，荧光显微镜下观测，重组载体转染组和空载体转染组均可观测到红色荧光蛋白RPF的表达。收集细胞样品，用Trizol方法提取总RNA，RT-PCR方法检测TREM1基因在293细胞中的表达。重组质粒转染组扩增出715bp条带，而空载体转染组和未转染组均未扩增出任何条带。表明所构建的水牛TREM1基因融合蛋白表达载体(pDsRed-N1-TREM1)能够在293细胞瞬时表达。
2.重组质粒pSicoR-GFP-shTREM-96/194/294/578/643/N.C的表达检测
参照步骤(二、1)，shRNA慢病毒表达载体经脂质体方法转染入293细胞。48h后荧光显微镜下可观测到绿色荧光EGFP的表达。
三、靶质粒和干扰质粒共转染293细胞
将细胞以2×106密度接种于6孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到80％时进行转染。试验共分为8组，分别为：未转染组、目的基因转染组、靶质粒与干扰质粒共转染组(shTR-96，shTR-194，shTR-294，shTR578，shTR-643)、阴性对照组(shTR-N.C)。按照Lipofectamine 2000说明书混合质粒及Lipofectamine 2000，两者的比例为10μl∶4μg(1μg TREM和3μg shTREM)和10μl∶4μg(2μg TREM和2μg shTREM)。将质粒-Lipofectamine 2000复合物滴入待转染细胞孔，6h后更换为含有10％血清、1％双抗的DMEM培养液，48h后荧光显微镜下观测转染效果。共转染组可分别看到靶质粒报告基因红色荧光和干扰质粒报告基因绿色荧光的表达。
四、实时定量PCR检测shRNA对TREM1基因的抑制效率
步骤(二)中，靶质粒与干扰质粒分别以1∶3和1∶1的比例共转染293细胞48h后，收集细胞。每个样品中加入1ml Trizol提取细胞总RNA。DNaseI充分消化总RNA中残留的DNA后，用AMV逆转录酶将RNA反转录为cDNA。反应条件为：25℃5min，42℃60min，95℃5min。测定反转录产物cDNA的OD值，用RNase-Free ddH2O稀释模板终浓度为100ng/μL，用于Real-Time RT-PCR检测。QRT-PCR引物如下：
TREM1-Fr 5’-TCTGGATGTTCTTCATCG-3’(序列表SEQ.ID.No.15)，
TREM1-Rv 5’-GTTGGTATTGGTAGGACA-3’(序列表SEQ.ID.No.16)，
TREM1-Probe 5’-(FAM)CTGCCGCTCAAGTATTCGAGGA(Ecl ipse)-3’(序列表SEQ.ID.No.17)；
Hi ston-Fr 5’-AACAAGCTGCTGGGCAAAGT-3’(序列表SEQ.ID.No.18)，
Hi ston-Rv 5’-TTATGGTGGCTCTCCGTCTTCT-3’(序列表SEQ.ID.No.19)，
Histon-Probe 5’-(FAM)CCCAACATCCAGGCCGTGCTG(Eclipse)-3’(序列表SEQ.ID.No.20)。
QRT-PCR扩增条件为50℃2min，95℃10min，95℃15s 30个循环，60℃1min。按照2-ΔΔCt法计算水牛TREM1基因的相对表达量(见图3和图4)。当靶质粒与干扰质粒以1∶3比例共转染293细胞时，shTR-194、shTR-294对TREM1基因的抑制效率分别为36.93％、20.76％；以1∶1的比例共转染时，shTR-194、shTR-294的抑制效率分别为46.14％、50.73％。初步筛选得到有效干扰序列分别为：shTR-194、shTR-294，两者的抑制效果稳定。
Claims (7)
1.一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA，其特征在于：该shRNA为shRNA-TREM194或shRNA-TREM294，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；
所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；
所述终止信号的碱基序列为TTTTTTT；
所述shRNA-TREM194的正义链具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.ID.No.4的碱基序列；
所述shRNA-TREM294的正义链具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。
2.根据权利要求1所述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，其特征在于该载体是：
pSicoR-GFP-shTREM-194或pSicoR-GFP-shTREM-294。
3.根据权利要求2所述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述慢病毒表达载体由合成的所述shRNA-TREM194或shRNA-TREM294分别克隆入慢病毒表达载体pSicoR-GFP中而得。
4.根据权利要求1所述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA在抑制水牛TREM1基因表达方面的应用。
5.根据权利要求2所述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛TREM1基因表达方面的应用。
6.根据权利要求1所述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
7.根据权利要求2所述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
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