WO2019000146A1

WO2019000146A1 - 一种人程序性死亡受体1基因的siRNA及其应用

Info

Publication number: WO2019000146A1
Application number: PCT/CN2017/089926
Authority: WO
Inventors: 毛吉炎
Original assignee: 深圳市博奥康生物科技有限公司
Priority date: 2017-06-26
Filing date: 2017-06-26
Publication date: 2019-01-03

Abstract

提供一种高效特异性地抑制PD-1基因的mRNA表达水平的siRNA，其可用于制备治疗PD-1基因表达异常相关疾病的药物。

Description

发明名称：一种人程序性死亡受体 1基因的 siRNA及其应用技术领域

[0001] 本发明属于分子遗传学领域，尤其涉及一种能抑制人程序性死亡受体 1的 siRN

A及其应用。

背景技术

[0002] 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在我国，肺癌的发病率、死亡率均高居恶性肿瘤之首，分别为 53.57/10万、 45.57/10万，严重威胁着国民的健康。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC) 约占肺癌的 84%，大部分患者就诊吋已属晚期，其治疗手段比较局限， 5年生存率仅为 2%。近年来肿瘤免疫治疗研究突飞猛进：机体免疫系统除了有免疫监视清除肿瘤细胞作用，在某些阶段还促进肿瘤免疫逃逸，在肿瘤发生、发展过程中扮演极其重要的角色。

技术问题

[0003] 研究显示程序性死亡分子 1 (programmed death 1， PD-l) /PD-1配体（PD-1 ligand, PD-L1) 信号通路的激活可导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤，而阻断 PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，增强内源性抗肿瘤免疫效应。因此，对 PD-1在肺癌治疗中所起的作用及其机制的研究非常重要，需要进一步深入研究。

[0004] RNA干扰（RNA interference, RNAi)现象最早是由 Jorgensen等在发现的，它是一种高效、特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具，可高效、特异地抑制人 PD-1基因表达，进而为其功能研究打下基础。

问题的解决方案

技术解决方案

[0005] 本发明的目的在于提供一种基于 RNAi技术的针对人 PD-1基因 mRNA的小分子干扰 RNA (siRNA) 。

[0006] 从 GenBank获得人 PD-1基因的 cDNA序列，根据 siRNA靶序列的基本原则，针对其设计了一条 19 nt的 siRNA: siPDl序列如下：

[0007] 正义链： 5，- GGCCAGGAUGGUUCUUAGA -3，（SEQ ID NO: 1)

[0008] 反义链： 5，- UCUAAGAACCAUCCUGGCC-3' (SEQ ID NO: 2) 。

发明的有益效果

有益效果

[0009] 本发明提供的 siPDl具有干扰效率高，可高效、特异地抑制 PD-1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗 PD-1基因表达异常相关疾病的药物。

对附图的简要说明

附图说明

[0010] 图 1为 Jurkat细胞转染 siPDl后定量 PCR检测 PD-1基因表达水平的结果示意图。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0011] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中所使用的技术，包括 PCR扩增与检测、细胞转染、 RNA提取等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

[0012] 实施例一靶向 PD-1基因的 siRNA寡核苷酸序列的设计

[0013] 在 GenBank査找到 PD-1的 mRNA全序列，从 PD-1基因起始密码子 AUG下游幵始，搜索 AA序列，其 3'端相邻 19 nt序列作为候选靶点，从中选择 GC含量在 40-50%的 siRNA序列，经 BLAST同源性比对证实特异性后应用 RNA structure 4.4 软件对靶 mRNA序列的二级结构进行评估，最后获得靶核苷酸序列 siPDl , 其正义链序列如 SEQ ID NO: 1，反义链序列如 SEQ ID NO: 2所示。

[0014] 实施例二 siRNA转染 Jurkat细胞。

[0015] Jurkat细胞（购自 ATCC) ，用 DMEM完全培养基（含 10%胎牛血清）培养，按照 15万个 /孔的比例铺 6孔板，于 37°C、 5% C02培养 18 h。用 Lipofectamine 3000转染试剂盒（Invitrogen)进行细胞转染，方法按照产品说明。转染吋，用 lOO pmol siPDl转染 A375细胞， siRNA与脂质体比例为 100 pmol: 10 μ 。

[0016] 实施例三定量 PCR检测平 PD-1基因表达水平

[0017] 提取总 RNA: 使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit提取正常和转染 siPDl的 PD-1细胞的总 RNA。

[0018] 逆转录：使用 FastQuant RT Super Mix (天根生化）进行逆转录。

[0019] 定量 PCR: 使用 SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (大连宝生物）

进行定量 PCR，检测，反应体系为 20 μί，每个反应加入 1 L cDNA作为模板。反应程序为： (1)95 °C 30 s, (2)95 °C 5s, (3)60°C 30s, (2)-(3)， 40个循环。同吋以 GAPDH为内参，结果如图 1所示，使用的定量 PCR引物如表 1所示：

[0020] 如图 1所示，转染 siPDl后的 Jurkat细胞， PD-1基因的 mRNA表达水平与正常 Jurk at细胞相比显著下降，说明本发明的 siPDl能够高效特异性抑制 PD-1基因的表达

[0021] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

工业实用性

[0022] 本发明提供的 siPDl具有干扰效率高，可高效、特异地抑制 PD-1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗 PD-1基因表达异常相关疾病的药物。

Claims

权利要求书

[权利要求 1] 一种 RNA干扰片段，其特征在于，所述 RNA干扰片段的序列如下:

正义链： 5，- GGCCAGGAUGGUUCUUAGA -3，（SEQ ID NO: 1) 反义链： 5，- UCUAAGAACCAUCCUGGCC -3，（SEQ ID NO: 2)

[权利要求 2] 权利要求 1中所述的 RNA干扰片段的应用，

其特征在于制备治疗 PD-1基因表达异常相关疾病的药物。