CN102127168A

CN102127168A - 一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN102127168A
Application number: CN2010100229559A
Authority: CN
Inventors: 路筝; 李兆申; 刘岩
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-01-19
Filing date: 2010-01-19
Publication date: 2011-07-20

Abstract

本发明公开了一种髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白及其在制备治疗感染性炎症疾病药物中的应用，利用分子克隆和基因重组技术，从重症感染性休克患者和重症感染小鼠的外周血中，分别克隆人TREM-1胞外区域和小鼠TREM-1胞外区域，再分别采用酶切和PCR方法将人IgG Fc段基因插入TREM-1胞外区域基因的下游位点，然后将融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建了重组原核表达质粒。小鼠和人的TREM-1重组融合蛋白的基因序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。本发明公开的蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、疗效显著，对感染性炎症疾病具有很高的预防和治疗作用。

Description

一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用

【技术领域】

本发明涉及一种预防和治疗感染性炎症的药物，更具体地讲，涉及一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白。

【背景技术】

髓样细胞表达的激发受体(TREM)是免疫球蛋白超家族中的一个受体家族。TREM-1于2001年在NATURE上首次报道，加深了人们对炎症反应的启动和发展过程的认识。TREM-1能识别细菌、真菌这些病原体的表面受体，主要分布在外周血中性粒细胞和单核细胞亚群，还选择性地表达在肺泡、肠液及其它体液的吞噬细胞上。TREM-1属跨膜糖蛋白，具有胞外单链免疫球蛋白可变区(IgV)，含阳离子化赖氨酸残基的跨膜区和较短胞浆内尾段的保守结构。TREM-1IgV能特异性与其配体或单克隆抗体结合，产生活化效应，跨膜区的赖氨酸残基，可与接头蛋白DAP12跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸相耦联，并通过DAP12胞浆区中的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)来传递活化信号，转录编码促炎因子和细胞表面分子的基因，最终导致细胞大量分泌促炎因子。

文献报道，当革兰阳性菌、阴性菌或真菌所致的急性炎症和肉芽肿性炎症中，以及内毒素(LPS)或其他微生物导致的感染性休克中，感染组织中渗出的中性粒细胞和单核细胞表面的TREM-1表达明显升高。相反，对于那些非感染引起的免疫复合物炎症反应，如鳞癣、溃疡性结肠炎和脉管炎等，则不会出现TREM-1的表达增加。在体外，用活细菌或其胞壁成分与中性粒细胞和单核细胞共同培养，可诱导免疫细胞表面的TREM-1表达上调。生物学实验证实，假手术组外周血中单核细胞和中性粒细胞、腹膜和脾脏的巨嗜细胞的TREM-1表达没有明显改变。而脓毒血症组，所有效应细胞的TREM-1均出现特征性高表达(升高3到4倍)。在脓毒性休克的病人，也证实了单核细胞TREM-1表达的不断增高。THE NEW ENGLAND医学杂志上报道了148例接受了机械通气或可疑社区获得性肺炎的病人，通过Western的方法，快速检测患者支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-1(sTREM-1)，有助于确诊或排除细菌性或真菌性肺炎，支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-1可作为独立诊断肺炎的金标准。

小鼠体内TREM-1作用机制的研究证明，TREM-1扩大了细菌及真菌所致感染的炎症反应效应，与下游细胞因子之间形成一个正反馈的自分泌调节回路，影响机体的天然免疫，促使炎症反应增强放大。TREM-1介导的信号转导通路在炎症反应的级联放大和脓毒症的发生中起着关键性的作用。

国外学者们的大量基础研究，使TREM-1在炎症反应中的表达和诊断价值日益得到重视，成为炎症反应的分子治疗靶点。小鼠脓毒性休克模型的实验表明，阻断TREM-1的信号转导通路，可以明显降低小鼠的死亡率。根据TREM属于IgSF，TREM-1与IgG具有一定的同源性，有构想TREM-1与IgG融合蛋白综合具有此两种免疫球蛋白的特性，这种融合蛋白能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体，从而起到抑制活化信号的诱骗受体的作用，是目前TREM研究的热点。

美国专利US 6420526“186个分泌蛋白质”要求保护未指明而且未加例证的分离的TREM-1片段，其包含人TREM-1至少30个连续的氨基酸，没有提供与这些片段相关的生物学数据。申请号200510104693.X公布了一种“治疗性肽和方法”，提供了一种多肽，其序列为天然TREM-1蛋白序列中的一个或多个部分序列，该肽段在生物化学研究所定购并人工合成。没有提供TREM-1重组融合蛋白的序列和制备工艺，没有提供TREM-1重组融合蛋白治疗感染性炎症疾病的实施例。

感染性疾病是医学和兽医界最常见的疾病之一，各种革兰阳性菌、阴性菌或真菌所致病种不胜枚举，现多采用以抗生素治疗为主的综合治疗方案。天然免疫应答是机体抗感染的第一道防线，切断病原体和受体的识别，阻断炎症反应的信号转导通路，在解决感染性炎症疾病方面有巨大潜力。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种小鼠或人的髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白。

本发明的第二个目的在于提供一种髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗动物或人感染性炎症疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明公开以下技术方案：

一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，具有与天然TREM-1相似的结构，通过酶切位点连接TREM-1胞外区段和IgGFc段，所述融合蛋白具备两种免疫球蛋白的特性，能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体。

小鼠髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

人髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

此重组融合蛋白的基因序列包括TREM-1胞外区段和人IgGFc段的功能区段，并由酶切位点连接。此酶切位点可为任意一种或多种酶切位点或保护性碱基。在TREM-1胞外区段或人IgGFc区段中增加或删减序列，能实现该区段功能，能实现本发明的目的，得到与本发明公开的序列大致相似的基因序列的，都应视为本发明的保护范围。

髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白的制备方法，包括：(1)克隆小鼠TREM-1胞外区域和人IgG Fc段，将IgG Fc段基因插入TREM-1胞外区域基因的下游位点得到融合片段；(2)将所述融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建重组原核表达质粒；(3)构建的重组原核表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导表达，对蛋白表达产物进行纯化，应用SUMO蛋白酶，其特征在于：步骤(2)中所述表达载体为pet-28a-His-sumo；

步骤(3)中所述蛋白表达时，IPTG 37℃诱导4-6小时，优选4小时。

步骤(3)中所述蛋白表达的条件为：(1)将新抽的质粒转入BL21(DE3)中，37℃培养过夜；(2)挑取单克隆，37℃LB培养10小时；(3)转入到500ml LB培养基中，22℃培养3-4小时，菌体浓度达到0.6后加入IPTG，终浓度为10μM，培养4小时；

步骤(3)中所述蛋白产物纯化，酶切去除SUMO蛋白酶的条件为：温度4-10℃，时间12-16小时；优选4℃酶切12小时。

髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗动物感染性炎症疾病药物中的应用。

髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗人感染性炎症疾病药物中的应用。

本发明的积极效果：

本发明人提供的利用基因工程技术构建表达的TREM-1重组融合蛋白，相对于人工合成肽段，具有可增加蛋白质分子在血液中半衰期，便于纯化检测，兼具TREM-1与IgG融合蛋白两种免疫球蛋白的特性，生物功能多样等特点。可溶性TREM-1/IgG结构与天然TREM-1结构相似，能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体，从而起到抑制活化信号的诱骗受体的作用，阻断TREM-1介导的炎症信号转导通路。

本发明公开的蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、制备简单、疗效显著，对感染性炎症疾病具有很高的预防和治疗作用。

【附图说明】

图1为小鼠TREM-1/IgG重组质粒的构建策略图；

图2为人TREM-1/IgG重组质粒的构建策略图；

图3为目的片段基因克隆质粒酶切鉴定图：其中M为标准参照物，图3-1，-2，-3分别为质粒pMD18-T/人TREM，pMD18-T/小鼠TREM，pMD18-T/人IgGFc酶切鉴定图；图3-1中M为DNA分子量标准，1为质粒pMD18-T/人TREM，2为EcoRV/BamH I双酶切质粒；图3-2中M为DNA分子量标准，1为EcoR I/BamH I双酶切质粒；图3-3中M为DNA分子量标准，1为质粒pMD18-T/人IgG Fc，2为BamH I/Xho I双酶切质粒；

图4中，图4-1为重组质粒pet28a/人TREM-IgG酶切鉴定图；图4-2为重组质粒pet28a/小鼠TREM-IgG酶切鉴定图；其中M为DNA分子量标准，1为BglII/Xho I双酶切质粒；

图5为表达产物小鼠TREM-1/IgG融合蛋白的SDS-PAGE分析：M为蛋白质分子量标准，1为空载体pet-28a-His-sumo表达的蛋白，2为可溶部分纯化后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白(含载体上sumo)，3为将sumo tag酶切后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白；

图6为表达产物人TREM-1/IgG融合蛋白的SDS-PAGE分析：M为蛋白质分子量标准；图6-1中1，2，3分别为对照菌液上清，未诱导菌液上清，IPTG37度诱导4小时菌液上清；图6-2中1，2，3分别为诱导菌液上清，穿柱液和纯化洗脱后的人TREM-1/IgG融合蛋白；

图7为表达产物小鼠TREM-1/IgG融合蛋白的Western Blot检测：1为可溶部分纯化后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白(含载体上sumo)，2为空载体pet-28a-His-sumo表达的蛋白，3为将sumo tag酶切后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白；

图8为肺脏组织病理改变；

图9为胰腺组织病理改变。

【具体实施方式】

以下结合附图对本发明的技术方案做详细说明。

一、制备方法实施例

1、小鼠髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白制备方法：

利用分子克隆和基因重组技术，从重症感染性小鼠的外周血中，克隆小鼠TREM-1胞外区域，从健康志愿者的外周血中，克隆人IgG Fc段，再分别采用酶切和PCR方法将IgG Fc段基因插入TREM-1胞外区域基因的下游位点，然后将融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建重组原核表达质粒。将上述构建的重组表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导表达，对表达产物进行纯化，SDS-PAGE分析表达产物，并对其进行体外活性测定和模型动物感染性炎症治疗。

(1)基因克隆：健康雄性昆明种小鼠，清洁级，体重20～22g，由第二军医大学动物中心提供。造模前禁食12h，自由饮水。按照4g/kg的剂量，腹腔注射20％L-精氨酸，间隔一小时，重复注射一次。造模后24h经心脏采血，抽取新鲜抗凝血1ml；取健康志愿者的外周新鲜抗凝血各5ml；上述两个新鲜抗凝血，均在室温4小时内抽提总mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR分别扩增，获得小鼠TREM-1胞外区和人IgG-Fc段，并经这两个基因分别克隆入pMD-18T载体，经酶切鉴定阳性克隆，并经测序鉴定重组T载体质粒(pMD-18T/小鼠TREM和pMD-18T/人IgG-Fc)。

(2)表达载体构建：利用限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，双酶切原核表达载体pGEX4T-1；pMD-18T/小鼠TREM胞外区质粒经EcoRI/BamHI双酶切；pMD-18T/人IgG-Fc质粒经BamHI/XhoI双酶切；酶切后的三片段由T4DNAligase酶连接，连接产物应用CaCl2法转化感受态细胞，抽提鉴定重组质粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG。选择自构建载体pet-28a-His-sumo为表达载体，选择同尾酶BglII(AGATCT)，使用上游引物：BglII+：tcagagatcatggaagtcaaagctgccatt，其序列表如SEQ ID NO：5所示；下游引物T7-：tgctagttattgctcagcgg，其序列表如SEQ ID NO：6所示。从pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG质粒上PCR扩增目的片段，BglII+XhoI双酶切以后接入到pet28a-His-sumo，构建表达重组蛋白的原核表达质粒pet28a/小鼠TREM-IgG。经测序鉴定无误。

(3)蛋白表达纯化：该克隆转入BL21以后，IPTG 37℃诱导4-6小时，尤其是诱导4小时，可以很好地表达，40％左右为包涵体部分，经优化表达条件，可溶部分超过20mg/L LB培养基。通过以下方法优化表达条件：将新抽的质粒转入BL21(DE3)中，37℃培养过夜；挑取单克隆，37℃LB培养10小时；转入到500ml LB培养基中，22℃培养3-4小时，菌体浓度达到0.6后加入IPTG(终浓度10μM)培养4小时；收菌，超声破菌，电泳比较全细胞以及上清的目标蛋白的含量。

纯化方法如下：1L培养菌体，超声破菌于40ml PBS中以后，离心取上清，使用His-affinity-resin 1ml层析柱纯化；上样完全以后，使用上样缓冲液充分冲洗上样柱(40倍柱体积)，再使用20mM咪唑洗柱(20倍柱体积)，40mM咪唑洗柱(10倍柱体积)；使用200mM咪唑洗脱样品，收集洗脱峰，电泳观察纯度；集中纯度符合要求的样品，使用Millipore超滤管浓缩样品，切换缓冲液到PBS中；使用Bradford方法测定蛋白浓度；初步纯化后的融合蛋白为小鼠TREM1-IgG(含载体上SUMO蛋白)，应用SUMO蛋白酶，4℃-10℃酶切12-16小时可以特异性地去除SUMO，尤其是在4℃酶切12小时，从而得到不含任何标签的重组蛋白。包涵体部分，可使用以下方法纯化：菌体沉淀使用8M尿素溶解，高速离心，取上清，用PBS稀释4倍，将稀释后的上清高速离心，去除沉淀，然后使用His-affinity-Resin纯化，所有纯化Buffer中均包含2M尿素。纯化后的样品经复性，浓缩PBS透析过夜，离心弃取沉淀，上清部分超滤管浓缩定蛋白浓度。

(4)蛋白表达鉴定：SDS-PAGE分析表达产物，对纯化后的表达产物行Western Blot和ELISA检测，证实为目的蛋白。

2、人髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白制备方法：

人髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白制备方法的步骤，同小鼠样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白制备方法。

二、在制备治疗感染性炎症疾病药物中的应用实施例

60只昆明种小鼠，每只经腹腔注射精氨酸构建重症急性胰腺炎(SAP)模型后，随机将其分为6组，一组和二组为TREM-1治疗组，造模后6小时经尾静脉注射TREM-1重组融合蛋白，给药浓度为8mg/Kg，三组和四组为阳性对照组，采用目前临床上治疗SAP的药物乌司他丁，给药浓度为10万U/Kg，五组和六组为SAP对照组，以生理盐水静脉注射。一、三、五组分别在造模后24小时处死，二、四、六组分别在造模后72小时处死。检测外周血中炎症因子的表达，病理分析胰腺和肺脏的损伤情况(见图8、图9)，评估TREM-1重组融合蛋白的治疗效果。结果显示，TREM-1治疗组和乌司他丁治疗组的总体死亡率显著低于SAP对照组(P＜0.05)；炎症因子(MIP-1和超敏CRP)显著低于SAP对照组(P＜0.05)。

病理分析提示SAP对照组肺泡腔出血水肿，间质明显增宽，大量炎性细胞浸润，TREM-1治疗组和乌司他丁治疗组出血水肿好转，炎症细胞浸润明显减轻；SAP对照组胰腺组织大片坏死，胰腺组织小叶结构不清，出血坏死明显，大量中性粒细胞细胞浸润，TREM-1治疗组和乌司他丁治疗组出血坏死程度明显减轻，小叶结构清楚，少量炎性细胞浸润。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用

<130>、

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1059

<212>DNA

<213>小鼠和人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1059)

<400>1

atg gaa gtc aaa gct gcc att gtt cta gag gaa gaa agg tat gac cta 48

Met Glu Val Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu

1 5 10 15

gtg gag ggc cag act ttg aca gtg aag tgt ccc ttc aac atc atg aag 96

Val Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn Ile Met Lys

20 25 30

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Tyr Ala Asn Ser Gln Lys Ala Trp Gln Arg Leu Pro Asp Gly Lys Glu

35 40 45

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Pro Leu Thr Leu Val Val Thr Gln Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu

50 55 60

gtc cac atg ggg aag ttc acc ctg aaa cat gac cct agt gag gcc atg 240

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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Gly Ser Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

130 135 140

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

210 215 220

tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa 720

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

275 280 285

agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg 912

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

290 295 300

gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aaa ctc acc gtg gac aag 960

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

305 310 315 320

agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag 1008

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

325 330 335

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345 350

aaa 1059

Lys

<210>2

<211>353

<212>PRT

<213>小鼠和人

<400>2

Met Glu Val Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu

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Val Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn Ile Met Lys

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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<210>3

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<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1053)

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<400>3

atg tca gaa ctc cga gct gca act aaa tta act gag gaa aag tat gaa 48

Met Ser Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu

1 5 10 15

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100 105 110

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145 150 155 160

cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag 528

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

165 170 175

gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 576

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

180 185 190

aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc 624

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

195 200 205

gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 672

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

210 215 220

tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc 720

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225 230 235 240

tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 768

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

245 250 255

cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 816

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

260 265 270

gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 864

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

275 280 285

ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 912

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

Untitled3.ST25.txt

290 295 300

gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aaa ctc acc gtg gac aag agc agg 960

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305 310 315 320

tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1008

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

325 330 335

cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1053

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210>4

<211>351

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Ser Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu

1 5 10 15

Leu Lys Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu

20 25 30

Lys Phe Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu

35 40 45

Met Pro Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His

50 55 60

Pro Val Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly

65 70 75 80

Leu Leu Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu

85 90 95

Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe

100 105 110

Asp Arg Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Arg Gly Ser

115 120 125

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130 135 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

tcagagatca tggaagtcaa agctgccatt 30

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

tgctagttat tgctcagcgg 20

Claims

1.一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，具有与天然TREM-1相似的结构，其特征在于：通过酶切位点连接TREM-1胞外区段和IgGFc段，所述融合蛋白具备两种免疫球蛋白的特性，能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体。

2.根据权利要求1所述髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，其特征在于：小鼠髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ IDNO：1所示。

3.根据权利要求1所述髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，其特征在于：人髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白的制备方法，包括：(1)克隆小鼠TREM-1胞外区域和人IgG Fc段，将IgG Fc段基因插入TREM-1胞外区域基因的下游位点得到融合片段；(2)将所述融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建重组原核表达质粒；(3)构建的重组原核表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导表达，对蛋白表达产物进行纯化，应用SUMO蛋白酶，其特征在于：步骤(2)中所述表达载体为pet-28a-His-sumo。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述蛋白表达时，IPTG 37度诱导4-6小时，优选4小时。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述蛋白表达的条件为：(1)将新抽的质粒转入BL21中，37℃培养过夜；(2)挑取单克隆，37℃LB培养10小时；(3)转入到500ml LB培养基中，22℃培养3-4小时，菌体浓度达到0.6后加入IPTG，终浓度为10μM，培养4小时。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述蛋白产物纯化，酶切去除SUMO蛋白酶的条件为：温度4-10℃，时间12-16小时。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：酶切去除SUMO蛋白酶的条件为：温度4℃，时间12小时。

9.权利要求1或2所述的髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗动物感染性炎症疾病药物中的应用。

10.权利要求1或3所述的髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗人感染性炎症疾病药物中的应用。