CN107760761A - 一种加强瘦素激发lepr信号转导的方法 - Google Patents

一种加强瘦素激发lepr信号转导的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种加强瘦素激发LEPR信号转导的方法：将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系、抗抗体和人leptin一起加入到DMEM培养基中培养四小时后，吸出培养基并加入Promega细胞裂解液，然后使用TD20e光度计测量荧光素酶活性，出现荧光素酶活性显著增加，实现加强瘦素激发LEPR信号转导，以方便对家禽血液中leptin的荧光检测。

Description

一种加强瘦素激发LEPR信号转导的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种抗LEPR抗体显著加强鸡瘦素激发LEPR的信号转导的方法。
背景技术
瘦素(leptin)是一种动物脂肪细胞分泌的多肽激素，肥胖基因的蛋白翻译产物。Leptin是反应体内脂肪和能量存储的信号，对中枢起慢性抑制食欲的作用，对外周则具有促进代谢的作用，并且对动物的生殖功能发育和维持也具有重要的作用。
瘦素受体(LEPR)蛋白属于I型细胞因子受体超家族，是一个单跨膜受体蛋白。瘦素受体有四种短型受体LEP-Ra、Rc、Rd、Rf，短型受体主要功能是转运受体，而长型受体LEP-Rb是功能型受体。瘦素就是通过与细胞膜上瘦素长型受体后才能发挥生物作用。瘦素与受体结合后激活JAK2磷酸化，继而进一步激活STAT3磷酸化启动信号转导。JAK2、STAT3在肝组织中磷酸化程度越高说明瘦素与受体结合启动信号转导的能力越强。2014年雷明明通过对产蛋鸡免疫瘦素受体蛋白发现免疫LEPR蛋白可以显著激活肝组织中JAK2、STAT3磷酸化水平(Leptin receptor signaling inhibits ovarian follicle development and egglaying in chicken hens，Lei等，Reproductive Biology and Endocrinology，2014)。2015年雷明明对生长鸡免疫瘦素受体蛋白，也发现免疫瘦素受体蛋白可以显著激活肝组织中JAK2、STAT3磷酸化水平，生长鸡采食量增加，但脂肪减少，体重降低(Creating leptin-like biofunctions by active immunization against chicken leptin receptor ingrowing chickens，Lei等，Domestic Animal Endocrinology，2015年)。这些研究证明免疫LEPR后产生的高浓度的抗LEPR抗体可以抑制产蛋鸡的卵泡发育和产蛋量，抑制生长鸡的脂肪增长但可以增加采食量。这说明免疫LEPR可以抑制动物的肥胖，还可以提高采食量。
家禽血液leptin浓度远远低于哺乳动物，现有检测哺乳动物leptin浓度的方法的灵敏度不够，难以检测禽类血液中的leptin；以色列科学家首次利用一个特异性的LEPR信号传导细胞系来检测鸡血液中leptin，结果几乎没有得到荧光信号；2016年，Seroussi等利用该LEPR信号传导系统在鸡的下丘脑和脑的其他组织中发现了鸡leptin基因，随后日本科学家Ohkubo等利用LEPR结合STAT3-GFP的信号传导细胞检测系统发现在细胞培养液中添加鸡血液后，在电镜下能够观察到细胞内的GFP信号有向细胞核内迁移集中的现象，证明鸡血液中存在leptin，但该检测所获得的荧光信号仍然较弱，不易检测，因此，如何增强LEPR荧光信号成为家禽血液leptin检测中亟待解决的难题。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种利用抗LEPR抗体显著加强瘦素激发LEPR的信号转导的方法，该方法可以放大动物机体内LEPR信号转导的荧光信号，易于检测。
本发明的目的是这样实现的：一种加强瘦素激发LEPR信号转导的方法，包括两种多克隆抗体和一种单克隆抗体的制备、纯化，添加抗体显著增强瘦素激发LEPR的信号转导，其具体步骤如下：
将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系、抗体和人leptin一起加入到DMEM培养基中，于37℃、5％(体积分数)CO2培养四小时后，吸出培养基Promega细胞裂解液溶解细胞，然后使用TD20e光度计测量荧光素酶活性，即出现荧光素酶活性显著增加，则说明抗体增强了LEPR的信号转导。
本发明中所涉及的锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系参见文献“Monitoringleptin activity using the chicken leptin receptor，Hen等，Journal ofEndocrinology，2008”所公开内容，实施例中涉及的该细胞系由以色列农业研究机构下属的动物研究所Friedman-Einat教授惠赠。
本发明中，所述抗体包括高效价、高特异性的抗LEPR1单克隆抗体、高效价、高特异性的抗LEPR1兔抗鸡多克隆抗体和高效价、高特异性的抗LEPR2兔抗鸡多克隆抗体中的至少一种，上述抗体是通过如下方法获得的：
1)分别克隆鸡基因组的LEPR CK-F3结构域中N端200个氨基酸多肽(101st to300th)编码序列LEPR1和鸡基因组F3-F3F3结构域中的215个氨基酸多肽(582nd to 796th)编码序列LEPR2，然后构建这两个多肽编码序列的原核表达载体，表达并纯化获得的两种多肽，即获得多肽融合蛋白LEPR1和多肽融合蛋白LEPR2，备用；
2)分别利用多肽融合蛋白LEPR1和多肽融合蛋白LEPR2免疫兔子，进而分别制备多克隆抗体并用亲合层析的方法纯化多克隆抗体，获得高效价、高特异性的抗LEPR1兔抗鸡多克隆抗体和高效价、高特异性的抗LEPR2兔抗鸡多克隆抗体；
3)用多肽融合蛋白LEPR1免疫小鼠制备杂交瘤细胞，进而制备单克隆抗体并用亲合层析的方法纯化单克隆抗体，获得高效价、高特异性的抗LEPR1单克隆抗体。
本发明中所述LEPR CK-F3结构域中N端200个氨基酸多肽(101st to 300th)编码序列LEPR1参见SEQ ID NO.1；LEPR F3-F3F3结构域中的215个氨基酸多肽(582nd to796th)编码序列LEPR2参见SEQ ID NO.2。
在本发明中，所述的多肽融合蛋白LEPR1是应用RT-PCR技术钓取鸡LEPR基因序列成熟太编码序列LEPR1基因CK-F3结构域中N端200个氨基酸多肽(101st to 300th)，构建原核表达载体，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌株中，IPTG诱导表达LEPR1融合蛋白，洗涤包含体后通过Ni柱亲和纯化获得目特异蛋白条带纯化LEPR1重组蛋白。
在本发明中，所述的多肽融合蛋白LEPR2是应用RT-PCR技术钓取鸡LEPR基因序列成熟太编码序列LEPR基因F3-F3F3结构域中的215个氨基酸多肽(582nd to 796th)编码序列，构建原核表达载体，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌株中，IPTG诱导表达LEPR2融合蛋白，洗涤包含体后通过Ni柱亲和纯化获得目特异蛋白条带纯化LEPR2重组蛋白。
进一步，本发明所述将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系、抗体和人leptin一起加入到DMEM培养基中是指：将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系接入到含有DMEM细胞培养基的24孔板中(约50万)，然后加入终浓度为200μg/ml的抗体和终浓度为50ng/ml的人leptin培养。
本发明检测原理为：瘦素与其受体LEPR结合后，激活受体胞内域末端JAK2，活化的JAK催化胞质内的STAT3的磷酸化，而磷酸化的STAT3形成二聚体然后转移至细胞核中并结合到其相关基因启动子区的STAT3结合序列上，然后启动该基因的表达。当加入抗体后，会放大leptin激活其受体的信号转导作用，当这种信号以荧光出现时，荧光就会放大或增强，以方便检测。
附图说明
图1为重组LEPR1多肽融合蛋白电泳图；
图中：泳道中标1为阴性对照(无重组蛋白表达)；泳道2和3为转化的大肠杆菌(有重组蛋白表达)；标M的为蛋白Marker；泳道中标4为纯化后LEPR1多肽融合蛋白。
图2为重组LEPR2多肽融合蛋白电泳图；
图中：泳道中标M的为蛋白Marker；泳道中标1和2为转化的大肠杆菌(有重组蛋白表达)；泳道中标3和4为纯化后LEPR2多肽融合蛋白。
图3为纯化后LEPR1和LEPR2的多克隆抗体蛋白电泳图；
图中：第1泳道为兔抗鸡LEPR1多克隆抗体；第2两个泳道为兔抗鸡LEPR2多克隆抗体；M为蛋白Marker。
图4为LEPR1单克隆Western Blot验证结果；
图中：第1和2泳道为LEPR1单克隆阳性血清Western Blot验证结果，第3和4第泳道为空白对照为，M为蛋白Marker。
图5为LEPR1重组蛋白包外域CK-F3结构域多肽融合蛋白5次免疫兔后抗血清效价图；
图中：星号表示免疫后抗体效价与免疫前抗体效价差异显著。
图6为LEPR2重组蛋白包外域F3-F3-F3结构域多肽融合蛋白5次免疫兔后的抗血清效价图；
图中；星号表示免疫后抗体效价与免疫前抗体效价差异显著。
图7在LEPR细胞系中添加抗体触发LEPR信号转导荧光图；
图中；Q1是抗LEPR1多克隆抗体、Q2是抗LEPR2多克隆抗体，Q3是抗LEPR1单克隆抗体；a,b相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中涉及的核苷酸序列：
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2：
SEQ ID NO.3:5＇-atcGGATCCagg atgcttattccttcaga-3＇；
SEQ ID NO.4:5＇-ctgAAGCTT Agcacctcacttgagcaaag-3＇；
SEQ ID NO.5:5＇-atcGGATCCAGCGTACCAACAAGATCAGC-3；
SEQ ID NO.6:5'-gctAAGCTT ACTCAATCAGAATAAAG TGGTCAT 3'；
实施例所涉及的试剂来源：
限制性内切酶BamH I、Hind III、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、IPTG、pRSET-A载体、克隆菌Ecoli.DH5α和BL21(DE3)表达菌均为TaKaRa产品，购自宝生物(大连)有限公司。
DEME细胞培养基购买自上海索莱宝生物科技有限公司；
TD20e光度计(Turner Design，Mountain View，CA，USA)；
实施例中使用的人leptin是Arieh Gertler教授赠送(The Hebrew University，Rehovot,Israel)。
实施例1鸡LEPR1和LEPR2多肽基因的成熟肽编码序列的获得
取鸡下丘脑组织，液氮研磨后，采用TRIZol法提取总RNA，反转录成cDNA。根据鸡LEPR序列(GenBank:AF169827.2)设计引物(引物交由南京锐真生物技术有限公司合成)，并在上下游引物的5′端引入BamHI(GGATCC)和HindIII酶切位点(AAGCTTA)。LEPR1序列上下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；LEPR2序列上下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
RT-PCR反应体系：TaKaRa高保真Taq(5U/μl)0.5μl，10×PCR Buffer II 5μl，dNTPMixture(各2.5mM)8μl，模板cDNA 2.5ng，上游引物(20μM)1μl，下游引物(20μM)1μl，加灭菌蒸馏水至50μl。
RT-PCR反应程序：第1步95℃3min，第2部95℃30s，第3部60℃30s，第4部72℃45s，第2部到第4部35个运行循环，72℃后延伸10min)，分别获得鸡LEPR基因两段不同的成熟肽编码序列SEQ LEPR1(600bp，如SEQ ID NO.1所示)和SEQ LEPR2(645bp，如SEQ ID NO.2所示)。
用BamHI和HindIII内切酶酶切所获得的鸡LEPR1多肽的编码序列(BamHI和HindIIII各1μl,SEQ LEPR240μl,10×buffer 5μl,双氧水3μl，混合后37℃反应3小时)，用T4DNA连接酶连接入同样经过上述两种酶酶切过的含有His标签序列的商业化表达载体pRSET-A中，构建成为pRSET-LEPR1原核表达载体。
用Bam HI和Hind III内切酶酶切所获得的鸡LEPR2多肽的编码序列，用T4DNA连接酶进行连接入pRSET-A载体中，构建成为pRSET-LEPR2原核表达载体。
实施例2鸡LEPR1和LEPR2多肽重组蛋白的原核表达
鸡LEPR1和LEPR2多肽重组蛋白的原核表达，是分别把实施例1中制备的pRSET-LEPR1和pRSET-LEPR2原核表达载体分别转化到BL21(DE3)表达菌(在南京百斯凯科技有限公司购买)中，并用IPTG诱导获得需要的目的蛋白，具体过程如下：
将所构建的pRSET-LEPR1原核表达载体分别热激转化到BL21(DE3)表达菌株，挑选阳性克隆种到1mL LB液体培养基中，继续培养至OD600至0.8左右，加入诱导剂IPTG至终浓度0.05mM，37℃诱导4h；5000r/min离心5min，去上清，加入100μL Buffer B溶液裂解菌泥5min后，加入10μL 5×Loading buffer，涡旋混匀后100℃,煮沸10min，进行SDS-PAGE检测，分析是否有重组蛋白表达(见附图1)。由附图1可见，相对于未转化表达载体的细菌，转化表达载体的细菌在26kD位置附近有一条浓重的蛋白条带，经过纯化后，可以得到分子量相同的纯蛋白，这说明所构建的表达载体成功表达目的蛋白。
将所构建的pRSET-LEPR2原核表达载体分别热激转化BL21(DE3)表达菌株中，挑选阳性克隆接种到1mL LB液体培养基中，继续培养至OD600至0.8左右，加入诱导剂IPTG至终浓度0.05mM，37℃诱导4h；5000r/min离心5min，去上清，加入100μL Buffer B溶液裂解菌泥5min后，加入10μL 5×Loading buffer，涡旋混匀后100℃,煮沸10min，进行SDS-PAGE检测，分析是否有重组蛋白表达(见附图2)。由附图2可见，转化表达载体的细菌在28kD位置附近有一条浓重的蛋白条带，经过纯化后，可以得到分子量相同的纯蛋白，这说明所构建的表达载体成功表达了目的蛋白。
pRSET-LEPR1和pRSET-LEPR2原核表达载体热激转化BL21(DE3)表达菌株鉴定结果显示有表达后，分别进行扩大培养：将表达菌液10000r/min，4℃，离心20min，弃上清；每克菌泥溶于20mL加少量溶菌酶的包涵体洗脱液(3M Tris-HCl，Ph值9.0)重悬。将悬浮细菌的离心管置于烧杯中冰浴，进行超声破碎；破碎时间2s，间隔时间9s，功率400w，破碎40次；在4℃条件下，12000r/min离心15min，弃上清，下层沉淀即为包涵体；用30mL 3M Tris-HCl(MTris-HCl)洗涤包涵体2次，离心弃上清；最后加入20mL 8M尿素充分溶解包含体沉淀，可用40％功率，破碎3s停5s，破碎10min，暂停10min，冰浴中超声20min。然后13000r/min，4℃离心20min，取上清，去除不溶沉淀，分别获得鸡LEPR1和LEPR2重组融合蛋白洗涤后的包涵体。
实施例3LEPR1和LEPR2多肽融合蛋白的Ni-柱纯化
1、用Buffer B(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph 8.0)分别重悬实施例2获得的LEPR1和LEPR2包涵体，使包涵体充分溶解于高浓度的尿素中，4℃，12000rpm离心15min，取上清(即LEPR1变性蛋白裂解上清和LEPR2变性蛋白裂解上清)备用。
2、在安装好的空层析柱(购自上海生工，10mL)中加入5-10ml磷酸缓冲液，然后将纯化树脂50％Ni-NTA摇匀，取5ml缓慢滴入柱中，尽量避免滴到壁上；4℃垂直静置过夜。待树脂沉淀平整后，用6倍于柱床体积的Buffer B(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph8.0)平衡柱子，调整流速(约1ml/min)；待液面距树脂面1-2mm时，缓慢加入25ml步骤1制备好的LEPR1变性蛋白裂解上清，让其缓慢过柱，待其全部进入柱床后用Buffer B过柱，并陆续用核酸蛋白检测仪测定洗脱液中protein浓度，直至protein浓度低于0.08mg/ml,换用Buffer C(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph 6.3)洗柱，同样用核酸蛋白检测仪测定洗脱液中protein浓度，直至protein浓度低于0.08mg/ml，换用Buffer E(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph 4.5)洗柱，加入buffer E后及时测定洗脱液中protein浓度，当浓度高于0.1mg/ml时，收集洗脱液，直至最后洗脱液的浓度低于0.1mg/ml时停止收集。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.10M NaCl，pH8.0进行透析过夜，然后再用PBS透析，进行浓度检测及SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。将纯度大于85％的目的LEPR1蛋白分装，即为纯化后的多肽融合蛋白LEPR1，于-20℃保存。
同样，在安装好的空层析柱中加入5-10ml磷酸缓冲液，然后将纯化树脂50％Ni-NTA摇匀，取5mL缓慢滴入柱中，尽量避免滴到壁上；4℃垂直静置过夜。待树脂沉淀平整后，用6倍于柱床体积的Buffer B(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph 8.0)平衡柱子，调整流速(约1mL/min)；待液面距树脂面1-2mm时，缓慢加入25mL制备好的LEPR2变性蛋白裂解上清，让其缓慢过柱，待其全部进入柱床后用Buffer B过柱，并陆续用核酸蛋白检测仪测定洗脱液中protein浓度，直至protein浓度低于0.08mg/ml,换用Buffer C(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph 6.3)洗柱，同样用核酸蛋白检测仪测定洗脱液中protein浓度，直至protein浓度低于0.08mg/ml，换用Buffer E(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、8M尿素，Ph4.5)洗柱，加入buffer E后及时测定洗脱液中protein浓度，当浓度高于0.1mg/mL时，收集洗脱液，直至最后洗脱液的浓度低于0.1mg/ml时停止收集。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.10M NaCl，pH8.0进行透析过夜，然后再用PBS透析，进行浓度检测及SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。将纯度大于85％的目的LEPR2蛋白分装，即获得纯化后的多肽融合蛋白LEPR2，于-20℃保存。
实施例4兔抗LEPR1多克隆抗体和兔抗LEPR2多克隆抗体的制备
兔抗LEPR1和抗LEPR2多克隆抗体，是分别利用实施例3中获得的纯化后的LEPR1和LEPR2融合蛋白为免疫原，免疫3月龄新西兰大白兔获得，具体制备过程是：
利用实施例3获得的纯化后的多肽融合蛋白LEPR1和多肽融合蛋白LEPR2，分别对新西兰大白兔进行免疫，免疫前采血作为阴性对照。免疫流程：取健康新西兰大白兔四只，两只免疫多肽融合蛋白LEPR1，另外两只免疫多肽融合蛋白LEPR2。第1天，进行首免，分别取1mL多肽融合蛋白LEPR1和LEPR2(1mg/mL)作为抗原，每个抗原加入1mL福氏完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)注射；第15天，进行第二次免疫，分别取多肽融合蛋白1mLLEPR1和LEPR2(1mg/mL)作为抗原，每个抗原加入1mL福氏不完全佐剂，乳化后在颈背部皮下多点(至少8点)注射；随后第29天、45天分别进行第三、第四次免疫，免疫方法同第二次免疫；第53天静脉取血。
图5为LEPR1重组蛋白包外域CK-F3结构域多肽融合蛋白5次免疫兔后抗血清效价图。图片说明：免疫前血清的抗体效价始终处于较低水平，免疫4次后，抗体效价达到1：1024000，图中星号表示免疫后抗体效价与免疫前抗体效价差异显著。
图6为LEPR2重组蛋白包外域F3-F3-F3结构域多肽融合蛋白5次免疫兔后的抗血清效价图。图片说明：免疫前血清的抗体效价始终处于较低水平，免疫4次后，抗体效价达到1：1024000，图中星号表示免疫后抗体效价与免疫前抗体效价差异显著。
血样在37℃生化箱中倾斜放置2h，使其完全凝固，再转至4℃过夜，使血凝块进一步收缩。第二天将析出的血清小心的吸出，2mL分装，即获得含兔抗LEPR1多克隆抗体的血清和含兔抗鸡LEPR2多克隆抗体的血清，-20℃保存备用(避免反复冻融)。
实施例5抗鸡LEPR1和抗鸡LEPR2多克隆抗体的纯化
鸡抗LEPR1和抗LEPR2多克隆抗体的纯化，具体操作步骤如下：多克隆抗体的纯化流程(protein G)：
1)在10ml体积的层析柱(购自上海生工，5mL)中加入2mL Protein A或G，静置5min，待填料完全沉于柱底，约有1ml填料，再用10mL结合缓冲液(300mM NaCl，50mM Tris，Ph8.0)平衡；
2)分别取5mL实施例4获得的兔抗LEPR1多克隆抗体和兔抗LEPR2多克隆抗体血清用结合缓冲液稀释5-8倍，加入纯化柱中，反复上样3次；
3)用结合缓冲液洗涤到流穿液蛋白280降至基线水平；
4)用10倍体积洗脱液(100Mm Glycine，Ph3.0)洗脱目的抗体，2mL/管收集，测浓度，分管收集洗脱液，每管1Ml并加入100Ml中和液中和(1M Tris，pH 9.0)；
5)收集的洗脱液检测280nm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，用PBS透析过夜；即获得纯化后的抗LEPR1多克隆抗体和抗LEPR2多克隆抗体；
6)收集完后立即用5～10个柱床体积平衡缓冲液(300mM NaCl，50mM Tris，Ph8.0)平衡柱子至中性；
7)透析后的抗体鉴定(紫外吸收法检测蛋白浓度，SDS-PAGE法检测纯度，ELISA确定抗体效价)，图3为纯化后的抗LEPR1多克隆抗体和抗LEPR2多克隆抗体的电泳图，由图3可见经过变性后，所获得的多克隆抗体分子的轻链(分子量约为25kD)和重链(分子量约为50kD)解开，经电泳分析可观察到在25kD和50kD处分别有一个条带。
实施例6抗LEPR1单克隆抗体的制备
选用2只(SPF级BALB/C)小鼠免疫LEPR1。抗原为实施例3获得的纯化后的多肽融合蛋白LEPR1，初次免疫取抗原30μg，加福氏完全佐剂至1ml，皮下多点注射或脾内注射；3周后第二次免疫，剂量(抗原30μg)同上，加福氏不完全佐剂至0.5ml，皮下或ip(腹腔内注射)；再过3周后第三次免疫剂量同初次免疫，第三次免疫结束后7天后采血测其效价，2～3周后，加强免疫抗原100μg,剂量1ml，3天后取脾脏脾细胞。将脾细胞与骨髓瘤细胞(购买自)按个数比10:1的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液(购买自维森生物公司)洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动；90s内加入37℃预温的1ml45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动；37℃水浴作用90s；加37℃预温的不完全培养液(购买维森特生物公司)以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；然后800rpm，离心6min；弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液(购买自维森特生物公司)重悬。
将上述细胞，加到已有饲养小鼠腹腔巨噬细胞(购买自赛齐(上海)生物工程有限公司)的96孔板内，每孔加100μl。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液(购买维森特生物公司)，再维持2周，改用一般培养液(购买自维森特生物公司)。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，进行WB验证检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，申请人自命名为6F71C8，用于腹水制备。液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。收集腹水，获得含有抗LEPR1单克隆抗体的腹水。
实施例7抗LEPR1单克隆抗体的纯化
1)将实施例6中的腹水预处理：新鲜采集的腹水(或冻存的腹水)，2000rpm/min 15分钟，除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质)等；取上层清亮的腹水，等量加入pH7.2巴比妥缓冲盐水(0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/LCa2+)稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，除去脂质等即可得澄清的腹水。
2)将1.5g Protein A-Sepharose CL-4B干粉(购自上海生工)用6～7ml三蒸水溶解,再用0.02MpH 7.4的磷酸盐缓冲液浸泡15min，然后装入层析柱(5mL体积，购自上海生工)中。用10倍柱床体积的磷酸盐缓冲液过柱，流速为1m l/min，pH试纸测试流出液体的pH为7.4。
3)取步骤1)预处理过的腹水5ml，用磷酸盐缓冲液稀释至50ml，用0.45m的滤膜过滤，流速为1ml/min。用磷酸盐缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min。随后用0.02M pH 4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用AKTA explorer 100进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的4ml离心管收集，分管收集。等收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡5～10倍柱床体积，流速调至1m l/min。测定单抗的浓度，即为纯化后的抗LEPR1单克隆抗体，-20℃保存。
对纯化后的抗LEPR1单克隆抗体进行Western Blot验证，结果如图4所示，在55KDa附近有一条清晰的条带，并且没有杂带这说明获得的抗体具有高度特异性。
实施例8抗体促进LEPR信号转导的荧光检测
将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系(Hen等，2008；该细胞系由以色列Friedman-Einat教授提供)接种到含有DMEM细胞培养基的24孔板中培养(接种量为50万)。
实验组：
1)实施例5获得的终浓度为200g/ml抗LEPR1多克隆抗体(Q1)+终浓度为50ng/ml人leptin；
2)实施例5获得的浓度为200g/ml抗LEPR2多克隆抗体(Q2)+50ng/ml人leptin；
3)实施例7获得的浓度为200g/ml抗LEPR1单克隆抗体(Q3)+50ng/ml人leptin；
将上述三组分别加入到上述24孔板(约50万)中培养，于37℃、5％(体积分数)CO2培养四小时后，吸出培养基并加入100ml Promega细胞裂解液溶解细胞；使用TD20e光度计(Turner Design，Mountain View，CA，USA)测量荧光素酶活性；
同时设置分别加入等量上述Q1、Q2、Q3和leptin的对照实验组，测量结果如图7所示。
图7中，Q1、Q2、Q3和leptin组为分别向细胞系中加入上述成分的对照实验组；control组为不加抗体和蛋白的培养基；实验组有7组，分别是在培养基中添加人leptin，Q1，Q2，Q3，Q1+leptin、Q2+leptin和Q3+leptin。
由图7可见，当加入人瘦素leptin时，出现荧光信号(leptin组)；当单独把抗LEPR1多克隆抗体、抗LEPR2多克隆抗体和抗LEPR1单克隆抗体加进培养基中时，基本没有荧光信号(Q1、Q2、Q3组)。但是，当把这3种抗体分别和人leptin一起加入到培养基中时，出现荧光信号，而且荧光信号明显高于单独加人瘦素(leptin组)时激发的荧光信号增强。尤其是单克隆抗体和人瘦素(Q3+leptin组)一起加到培养基中时，激发的荧光信号显著高于单独添加人瘦素时激发的荧光信号。
以上实施例从细胞水平证明抗体可以加强瘦素激发LEPR的信号转导。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据本发明说明书中公开的内容，结合本领域的基本常识或惯用手段，对本发明做出的非实质性的延伸，都没有超出本发明权利要求限定的范畴。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种加强瘦素激发LEPR信号转导的方法
<141> 2017-11-10
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggatgctta ttccttcaga aatgagcatc tctgcatctc aggaaagaga ttcaaattgg 60
aacattgaat gttgggttga aggcaagctg gatttgttag tttgtagcct gcagttcccg 120
aagtttcaca tgagacttga tatgaaggtt catcttttat atgctgtgtc agagctgtca 180
ctgggagaca catctacgag ctccctgaag aggactgccc tggctgctca gtgtaactgc 240
agtgagtatg gcaaatgtga gtgccatgtg ccttccccaa gactcaacca cacttacgtc 300
atgtggctga agactgtgat tggtgtaaca cctctttggt cacccttgat gtcagtcaag 360
cccatagaca tagtaaagcc tgaacctcct ttgaatgtgc gtctagaaat gacagagaga 420
ggtcaagtta agatctgctg gtctgagcct gtaccgatgc cgtacccgct ccggtgtgaa 480
gtgaacatct ctggaaattc agatcaaaat gactggcagg tggttcaagt tgctttaaat 540
acctcattag acatagacaa tatgctgctt gattcttcct cctttgctca agtgaggtgc 600
<210> 2
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcgtaccaa caagatcagc tgtgatagaa gtgcaacctt gtgttgaata tattgttcag 60
atccgctgca gagccctgga tggcttaggc tactggagca actggagcag atcagcctat 120
gcagcagtaa aagatatcca agctccctta catggccctg agttttggag aactgtcact 180
gaagatccag caacggggca gaagaacgtt acgctcctgt ggaagccact gatgaagaat 240
cactcactgt gcagtgtgag ccggtacgtt ataaagcatc agacgtcaga aaacacctcg 300
tggtcagagt atgtcgacaa tggcaccacc tgctcatttc catggactga aagcacacac 360
accattacaa ttctagccgt gaattcaatt ggagcttctt cagttaattt taatttaact 420
ctgtcacaac aaatgagcac agtgaatgct gtgcagtctc tcattgctta cccagtgaac 480
agcacgtgtg tgattttgac ttggacgctt tcgcctcaaa tatatgtgat aacatctttt 540
attattgagt ggagaaacct taacaaagaa gaggagatga agtgggtgca agttcctcca 600
aatattagta aacactatat ttatgaccac tttattctga ttgag 645
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcggatcca ggatgcttat tccttcaga 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgaagctta gcacctcact tgagcaaag 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcggatcca gcgtaccaac aagatcagc 29
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctaagctta ctcaatcaga ataaagtggt cat 33

Claims (4)

1.一种加强瘦素激发LEPR信号转导的方法，其特征在于，具体步骤如下：
将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系、抗体和人leptin一起加入到DMEM培养基中培养四小时后，吸出培养基并加入 Promega细胞裂解液，然后使用TD20e光度计测量荧光素酶活性，出现荧光素酶活性显著增加，实现加强瘦素激发LEPR信号转导。
2.根据权利要求1所述加强瘦素激发LEPR信号转导的方法，其特征在于，所述抗体包括抗LEPR1单克隆抗体、抗LEPR1兔抗鸡多克隆抗体和抗LEPR2兔抗鸡多克隆抗体中的至少一种。
3.根据权利要求2所述加强瘦素激发LEPR信号转导的方法，其特征在于，所述抗LEPR1单克隆抗体、抗LEPR1兔抗鸡多克隆抗体和抗LEPR2兔抗鸡多克隆抗体分别是通过如下方法获得的：
1)分别克隆如SEQ ID NO.1所示编码序列LEPR1和如SEQ ID NO.2所示编码序列LEPR2，然后分别构建原核表达载体、转化入大肠杆菌宿主菌株中，IPTG诱导表达融合蛋白，并纯化获得的多肽，即为多肽融合蛋白LEPR1和多肽融合蛋白LEPR2，备用；
2）分别利用多肽融合蛋白LEPR1和多肽融合蛋白LEPR2免疫兔子，获得多克隆抗体并用亲合层析的方法纯化多克隆抗体，获得抗LEPR1兔抗鸡多克隆抗体和抗LEPR2兔抗鸡多克隆抗体；
3）利用多肽融合蛋白LEPR1免疫小鼠制备杂交瘤细胞，获得单克隆抗体并用亲合层析的方法纯化单克隆抗体，即获得抗LEPR1单克隆抗体。
4.根据权利要求1-3之一所述加强瘦素激发LEPR信号转导的方法，其特征在于，
所述将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系、抗抗体和人leptin一起加入到DMEM/F12培养基中是指：将锚定有鸡LEPR和荧光信号的细胞系接入到含有DMEM细胞培养基的24孔板中，然后加入终浓度为200μg/ml的抗体和终浓度为50 ng/ml的人 leptin培养四小时。
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