CN105802987A - 一种基于jak-stat5信号传导通路检测家禽prl的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于JAK‑STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法，具体为：A）提取家禽PRL受体的CDS区序列并插入真核表达载体中,构成信号接收载体；B）将信号应答序列STAT5插入含有报告基因的真核表达载体中；构成信号应答载体;C）将人胚肾293T细胞中加入改良的DMEM培养基中培养，转染信号表达载体和信号应答载体，再分别依次加入不同终浓度的PRL；D)检测报告基因活性，获得报告基因活性随PRL变化曲线；E)重复上述步骤A)‑C），检测样品中报告基因活性，根据报告基因活性随PRL变化曲线，计算得到样品中PRL浓度；本发明方法操作性强、使用成本低、灵敏度高、稳定性和重复性好，可满足科研及家禽养殖检测的需求。

Description

一种基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一种基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法。
背景技术
催乳素（Prolactin, PRL）又名促乳素、促黄体生成素，因能促进鸽子嗉囊上皮增生、生成嗉囊乳而得名。催乳素在哺乳动物体内主要起刺激和维持黄体功能、刺激引导黏膜分泌黏液、刺激乳腺发育和泌乳等作用，在禽类生殖调控中具有抑制垂体促性腺激素的分泌、促进和维持就巢行为以及感受光周期调节禽类的季节性、调节卵泡发育、抑制繁殖活动使家禽进入季节性非繁殖状态的作用。研究发现高浓度的PRL促进和维持就巢，抑制垂体促性腺激素的分泌， 抑制卵泡发育和产蛋性能；而中低浓度的PRL促进卵泡发育，促进产蛋性能。因此，快速准确测定家禽体内PRL水平对于研究其繁殖活动有重要意义。
目前PRL的检测方法主要包括生物学测定和免疫测定法，后者又包括放射免疫法（RIA）、放射受体法（RRA）、酶联免疫法（ELISA）、化学免疫发光法（CIA）等。生物学测定能检测有生物学活性的PRL含量，但是生物学测定检测限高、重复性差、耗时长；免疫测定法利用抗原抗体的特异反应性，放射免疫法、酶联免疫法、化学免疫发光法分别以放射标记物、酶、发光剂为指示剂，目前多数禽类相关文献检测PRL采用的是放免法，但其缺点十分明显，同位素标记有效期短、损害实验人员健康和危害环境，故目前应用有下降的趋势；化学免疫发光法灵敏度高于放免法，但目前仅少数医院和科研院所在测定人PRL时采用，然而由于蛋白质激素的种属差异，用测定人类PRL的方法测定禽类PRL会使测定样品的结果偏低，导致数据失真。因此，如何快速、准确检测家禽体内PRL含量，一直是本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法，该方法操作简便灵活，灵敏度高，本发明是这样实现的：
一种基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法，步骤如下：A）提取家禽PRL受体的CDS区序列并插入真核表达载体中,构成信号接收载体；
B）将信号应答序列STAT5插入含有报告基因的真核表达载体中；构成信号应答载体;
C）将人胚肾 293T细胞中加入改良的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下培养2d，然后接种于96孔板中，继续培养至细胞汇合率为 60%-70%时，转染信号表达载体和信号应答载体；转染6h后换液，继续培养18h后，分别依次加入终浓度为0、30、60、90ng/ml的PRL，继续培养24h；
D)收集细胞，检测报告基因活性，获得报告基因活性随PRL变化曲线；
E)重复上述步骤A)-C），检测样品中报告基因活性，根据步骤D）获得的报告基因活性随PRL变化曲线，计算得到样品中PRL浓度。
进一步，本发明所述基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法中，步骤A）所述的真核表达载体为pCMV6-Entry载体，步骤B)所述的真核表达载体为pGL3-Enchancer载体。
进一步，本发明所述基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法中，步骤B）所述报告基因为绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因，步骤D）所述报告基因活性随PRL变化曲线的方程为y = 0.6847x + 5.967。
本发明检测原理为：PRL与其受体结合后，激活受体胞内域末端JAK（JanusKinase），活化的JAK催化胞质内的STAT5的磷酸化，而磷酸化的STAT5形成二聚体然后转移至细胞核中并结合到其相关基因启动子区的STAT5结合序列上，然后启动该基因的表达。
本发明建立检测鹅PRL的方法可以弥补现有国内外检测禽类PRL方法的不足，该检测方法操作性强、使用成本低、灵敏度高、稳定性和重复性好，可满足科研及家禽养殖检测的需求。
说明书附图
附图1为构建的鹅PRL受体表达载体示意图；
附图2为构建的STAT5信号应答载体示意图；
附图3为荧光素酶表达量随PRL浓度变化图；
附图4为荧光素酶相对活性随PRL浓度变化的标准曲线示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所涉及的DNA序列：
SEQ ID No.1：
CCCAAGCTTATGAAGCAGAAATTGATGTC；
SEQ ID No.2：
CCGCTCGAGTTATTTAAAAGAGGGCATAAAGG；
SEQ ID No.3：
AGA TTT CTA GGA ATT CAA TCCAGA TTT CTA GGA ATT CAA TCCAGA TTT CTA GGA ATTCAA TCCAGA TTT CTA GGA ATT CAA TCCAGA TTT CTA GGA ATT CAA TCC ；
SEQ ID No.4：ACACCCGAGGGGGATGATAA；
SEQ ID No.5：CTCACACACAGTTCGCCTC；
SEQ ID No.6：TGACGTGGACATCCGCAAAG；
SEQ ID No.7：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG；
SEQ ID No.8：GTGTGGATCATCGTGGGTGT；
SEQ ID No.9：AGGGAAACCATGGCAACCAA。
实施例中涉及的试剂：
Hind Ⅲ、Xho Ⅰ、Kpn I 内切酶及T4 DNA连接酶均购自大连TaKaRa 公司；
真核表达载体pCMV6-Entry购自美国amsibo公司；
真核表达载体pGL3-Enchancer、双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；
人胚肾 293T细胞、脂质体 Lipofectamine LTX以及DMEM 培养基购自Life公司；
PRL购自美国农业部；
PRL放免检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所，货号:B07PZB；
实施例涉及的培养基：
改良的DMEM培养基：向DMEM培养基中加入终浓度为100 U/mL 的青霉素、终浓度为100µg/mL 的链霉素以及10%（V/V）的胎牛血清。
实施例1 鹅PRLR CDS区序列的获得
首先取鹅垂体组织，液氮研磨后，采用TRIZol法提取总RNA，反转录成cDNA；根据鹅PRLR序列，以常规方法设计上游引物PRLR f如SEQ ID No.1所示，下游引物PRLR r序列如SEQ IDNo.2所示；
接着扩增鹅PRLR的CDS区, 并在上下游引物的5′端引入Hind Ⅲ和 XhoⅠ酶切位点，用RT-PCR的方法，获得鹅PRLR基因的CDS区序列全长2496bp，并于genebank进行比对（GeneID：DQ209271.2）。
最后用Hind Ⅲ和 XhoⅠ内切酶酶切所获得的鹅PRL受体 CDS区序列，（依照内切酶说明书进行操作）用T4 DNA连接酶进行连接入同样经过上述两种酶酶切过的真核表达载体pCMV6-Entry中（连接方法严格依照连接酶说明书进行），构建成为pCMV6-PRLR表达载体，其序列结构如图1所示。
实施例2 获得STAT5结合区序列
根据现有文献中所公开的STAT5结合序列，采用人工合成的方式合成，重复5次，并引入Kpn I 和Xho I两酶切位点，获得STAT5结合区序列如SEQ ID No.3所示。
用Kpn I 和Xho I内切酶酶切所合成的STAT5结合区序列，用T4 DNA连接酶进行连接入同样经过上述两种酶酶切过的真核表达载体pGL3-Enchancer（该载体所含报告基因为荧光素酶基因）中，构建成序列结构为如图2所示的pGL3-STAT5应答载体。
实施例3转基因载体的细胞转染及标准品PRL刺激
具体操作步骤如下：
（1）将人胚肾 293T细胞中加入改良DMEM培养基中培养，于37 ℃、5% CO2条件下，每 2-3 天传代1次，培养2天之后，接种 293T细胞于 96 孔板，当细胞生长至汇合率为 60%-70%时，将实施例1、2构建的pCMV6-PRLR表达载体 和pGL3-STAT5应答载体采用脂质体Lipofectamine LTX转染到细胞内（具体操作步骤依据Lipofectamine LTX 试剂盒说明书进行），作为实验组；阴性对照组转染真核表达载体pCMV6-PRLR 和pGL3-Enhancer；以pRL-TK为内参质粒，每组设置3个重复孔。
（2）转染6小时后换液（改良的 DMEM 培养基 ），继续培养18小时，然后分别依次加入终浓度为0、30、60、90ng/ml的PRL，继续培养24小时。
实施例4 荧光素酶在不同浓度PRL刺激下的表达量变化检测
以Trizol法提取实施例3培养后的细胞总RNA。1%的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，并用Nanodrop2000（Thermo）紫外可见光分光光度计测定总RNA纯度和浓度，取OD在1.8-2.0的总RNA后续使用。
以提取的总RNA为模板，用全式金TransScript One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix反转录得到cDNA，反转录条件按照全式金TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书。
以反转录cDNA为模板用Luc引物（上游引物如SEQ ID No.4 所示，下游引物如SEQID No.5所示）、β-actin (上游引物如SEQ ID No.6 所示，下游引物如SEQ ID No.7所示)和鹅PRL受体引物(上游引物如SEQ ID No.8 所示，下游引物如SEQ ID No.9所示)分别进行普通PCR验证表达；然后用荧光素酶引物进行实时荧光定量PCR测定相对表达量，其结果如图3所示，由图3可见在培养液中添加不同浓度的PRL，可显著促进荧光素酶基因的表达。
实施例5荧光素酶在不同浓度PRL刺激下的活性变化检测
荧光素酶的活性变化采用双荧光素酶检测试剂盒进行检测，即按实施例3步骤（2）所述，继续培养24小时后收集细胞，每孔加入 20µl细胞裂解缓冲液（双荧光素酶检测试剂盒中标配），室温摇晃 15 min 后，吹打细胞，收集裂解液至 96 孔白板，加入 100µL 荧光素酶分析剂（LARⅡ），放置发光检测仪 Glomax（Promega）中，测定萤火虫（firefly） 荧光素酶活性；同时以pGL3-Enhancer做为阴性对照检测。
加入100 µl Stop & Glo Reagent，测定内参质粒中海肾（Renilla） 荧光素酶活性，并计算荧光素酶相对活性。发光仪程设置：延迟 2 s，测定时间 5 s；制定荧光素酶相对活性随PRL浓度变化的标准曲线如图4所示，图4中，pGL3-Enhancer为阴性对照曲线；pGL3-STAT5为实验组检测曲线，其曲线方程为y = 0.6847x + 5.967。
实施例6 鹅血清中PRL含量检测对照试验
试验使用抱窝鹅三只，分别编号抱窝鹅1-3；产蛋鹅两只，分别编号产蛋鹅1-2，鹅品种均为扬州白鹅。
根据实施例1-3和实施例5中所记载的方法，对抱窝鹅和产蛋鹅血清中PRL的含量进行实际检测，具体试验步骤为：
实验组分别采集抱窝鹅和产蛋鹅静脉血，无抗凝处理后于室温放置2小时或4℃ 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即为待测血清；
按照实施例1-3所述方法（除以待测血清代替实施例3步骤（2）中不同终浓度的PRL外，其他步骤法均相同），将继续培养24小时的细胞按实施例5所述的方法检测荧光素酶活性，并换算成PRL的浓度。
同时采用PRL放免检测试剂盒测定作为对照试验，检测结果如表1所示：
表1 PRL检测结果
待测样品 荧光素酶活性 实验组检测的浓度(ng/mL) 对照组检测的浓度（mIU/mL） 对照组检测结果换算为m/V 浓度（ng/mL）
抱窝鹅1 21.4 22.5 449.5 21.2
抱窝鹅2 20 20.4 430.3 20.3
抱窝鹅3 18.7 18.6 391.2 18.4
产蛋鹅1 7.54 2.3 47.4 2.2
产蛋鹅2 7.27 1.9 33.5 1.6
由于商品化PRL放免检测试剂盒针对人PRL所设计（目前尚未有针对鹅PRL设计的检测试剂盒），蛋白序列的差异在检测过程中可能存在着物种差异性，因此表1检测结果存在着一定误差。 而现有的PRL放免试剂盒，由于使用放射性同位素标记，存在着对操作人员健康潜在危害及放射标记物半衰期短等不利因素，而本发明所设计的特异性针对鹅PRL的检测方法突破了上述的两种缺陷，具有较高的可靠性和安全性。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据本发明说明书中公开的内容，结合本领域的基本常识或惯用手段，对本发明做出的非实质性的延伸，都没有超出本发明权利要求限定的范畴。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法
<130> 9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cccaagctta tgaagcagaa attgatgtc 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccgctcgagt tatttaaaag agggcataaa gg 32
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agatttctag gaattcaatc cagatttcta ggaattcaat ccagatttct aggaattcaa 60
tccagatttc taggaattca atccagattt ctaggaattc aatcc 105
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
acacccgagg gggatgataa 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctcacacaca gttcgcctc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tgacgtggac atccgcaaag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ctggaaggtg gacagcgagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gtgtggatca tcgtgggtgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
agggaaacca tggcaaccaa 20

Claims (3)

1.一种基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法，其特征在于，步骤如下：
A）提取家禽PRL受体的CDS区序列并插入真核表达载体中,构成信号接收载体；
B）将信号应答序列STAT5插入含有报告基因的真核表达载体中；构成信号应答载体;
C）将人胚肾 293T细胞中加入改良的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下培养2d，然后接种于96孔板中，继续培养至细胞汇合率为 60%-70%时，转染信号表达载体和信号应答载体；转染6h后换液，继续培养18h后，分别依次加入终浓度为0、30、60、90ng/ml的PRL，继续培养24h；
D)收集细胞，检测报告基因活性，获得报告基因活性随PRL变化曲线；
E)重复上述步骤A)-C），检测样品中报告基因活性，根据步骤D）获得的报告基因活性随PRL变化曲线，计算得到样品中PRL浓度。
2.根据权利要求1所述的基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法，其特征在于，步骤A）所述的真核表达载体为pCMV6-Entry载体，步骤B)所述的真核表达载体为pGL3-Enchancer载体。
3.根据权利要求1或2所述的基于JAK-STAT5信号传导通路检测家禽PRL的方法，其特征在于，步骤B）所述报告基因为绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因，步骤D）所述报告基因活性随PRL变化曲线的方程为y=0.6847x+5.967。
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