CN104762322A - 一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对现有泛嗜性逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性的改进方法。内容涉及对虾白斑病毒的两种囊膜蛋白VP28和VP19及其真核表达载体，通过将其与囊膜蛋白VSV-G共转染包装细胞，将其引入所包装病毒的囊膜中，从而提高其嗜对虾细胞性。内容还涉及在病毒载体中插入对虾翻译控制肿瘤蛋白启动子，以促进外源基因在对虾细胞中的转录与表达。改进后的逆转录病毒表达系统，具有更好的嗜对虾细胞性，侵染和表达效率明显提高，可用于对虾及其细胞的基因转移研究，从而弥补现有技术的不足。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统。
背景技术
逆转录病毒基因转移系统是利用逆转录病毒的侵染、复制、整合和包装相关元件，将外源基因高效导入并整合到靶细胞基因组中，因此，该系统一般由独立的可携带靶基因的病毒载体、包装细胞、包装载体(含衣壳蛋白gag、逆转录酶和整合酶pol)和囊膜蛋白载体(env或VSV-G)组成。病毒载体含有包装信号ψ、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)启动子和多克隆酶切位点，负责携带外源基因。包装细胞不含有包装信号ψ，只负责病毒的包装。只有将逆转录病毒载体、包装载体(gag和pol)以及囊膜蛋白载体质粒共转染包装细胞后，逆转录病毒载体才能在包装细胞内被包装成具有感染能力的病毒粒子，二者功能互补，缺一不可。该系统的缺点是只能感染分裂活跃的细胞。
成熟的逆转录病毒粒子均具有囊膜，囊膜上的囊膜蛋白(envelope，env)决定病毒侵染的宿主专一性。病毒依靠其囊膜蛋白识别并结合宿主细胞膜上的蛋白受体，并通过受体介导的内吞作用，跨越质膜而侵染进入细胞质中。单嗜性env只能侵染鼠类细胞，双嗜性env则可以同时侵染鼠和人类细胞。后来，人们发现，将水泡性口炎病毒(VSV)和鼠白血病病毒(MMLV)同时感染鼠细胞时，可形成带有VSV-G囊膜蛋白的MMLV逆转录病毒成熟粒子，即假型包装病毒：含有一种病毒的核酸和衣壳(capsid)，另一种病毒的囊膜蛋白(Emi等，1991)。泛嗜性逆转录病毒基因转移系统就是通过采用VSV-G囊膜蛋白替代env囊膜蛋白，形成VSV-G假型逆转录病毒粒子，从而大大提高了该系统的宿主范围，可侵染哺乳动物、鱼类和贝类等多种动物细胞。
但是，已有的研究中发现，泛嗜性逆转录病毒基因表达系统在对虾细胞中的侵染性很差，将病毒报告质粒pMCs-GFP所包装病毒感染原代培养对虾类淋巴组织(又称Oka器官)细胞后，观察不到绿色荧光的表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种在对虾细胞中有效表达的病毒表达载体，该载体中在病毒LTR启动子之后插有一段核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:1子，以保证外源基因在对虾细胞中的有效表达。
本发明另一个方面提供一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统，该系统的为携带有pVSV-G、pVP19和pVP28三个基因的上述病毒表达载体，因而所包装形成的病毒粒子的囊膜中，不仅含有哺乳动物来源的囊膜蛋白VSV-G，还含有对虾白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的两种囊膜蛋白VP19和VP28。囊膜蛋白VP19和VP28的引入，明显提高了该基因转移系统的嗜对虾细胞性。
其中，囊膜蛋白VSV-G、VP19和VP28的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2-4。
为了获得更好的效果，本发明对启动子(SEQ ID NO:1)的序列进行了改造，改造后的序列为SEQ ID NO:5。
本发明还提供一种使外源基因在对虾细胞中表达的方法，是将外源基因通过上述的转移系统转入对虾细胞中。
本发明具有以下优点：(1)相对于市场上已有的逆转录病毒基因转移系统，本系统的对虾细胞侵染能力得到明显提高，能够有效介导外源基因导入到对虾细胞中。(2)本系统能够克服体外培养对虾细胞难转染的问题，外源基因可在对虾细胞中得到有效表达。
附图说明
图1：本发明中克隆vp19和vp28开放阅读框的电泳结果以及pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的质粒图谱；其中，M为DNA分子量2000Marker，A为vp19的扩增产物，B为vp28的扩增产物；
图2：日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因5’侧翼的启动区序列(Mj-TCTP Promoter)及其可能的转录因子结合位点；
图3：五种逆转录病毒表达载体的质粒图谱：pMCs-GFP、pMCs-eGFP、pMCs-PMj-TCTP-GFP、pMCs-PMj-TCTP-eGFP和pMCs-PMj-muTCTP-GFP。
其中，pMCs-GFP为试剂盒本身自带的病毒表达载体，GFP为绿色荧光蛋白基因，eGFP为增强型绿色荧光蛋白基因，PMj-TCTP为日本囊对虾TCTP基因启动子,PMj-muTCTP为改造后的日本囊对虾TCTP基因启动子；
图4：采用脂质体转染方法，五种逆转录病毒表达载体在plat-GP包装细胞系中的表达情况。在所有转染的样品中均能检测到明显的阳性信号；
图5：采用脂质体转染方法，五种逆转录病毒表达载体在对虾类淋巴组织原代培养细胞中的表达情况。
其中，A、B、C、D和E为明视野下对虾原代细胞的单层以及组织块，A1、B1、C1、D1和E1为荧光视野下报告基因表达的情况。A1和B1中未能检测明显的荧光信号，C1、D1和E1中可观察到明显的荧光信号，以C1的荧光信号最强最多。
图6：利用PCR检测五种逆转录病毒表达载体在对虾原代细胞中的表达情况。
其中，A为基因组水平上的GFP基因扩增结果的凝胶电泳图。B为mRNA水平上的GFP基因扩增结果的凝胶电泳图。泳道1、2、3和4分别表示转染了pMCs-eGFP、pMCs-PMj-TCTP-GFP、pMCs-CMV-PMj-muTCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP的样品在基因组以及mRNA水平上报告基因扩增的结果。β-actin片段扩增结果作为内参；
图7：不同的表达载体组合包装形成的逆转录病毒介导eGFP基因在对虾原代细胞中的表达情况。
其中，A、B、C、D和E为明视野下对虾原代细胞的单层以及组织块。A1、B1、C1、D1和E1为荧光视野下的报告基因表达的情况。只有E1中观察到明显荧光；A和A1为对照，用病毒浓缩时的不含病毒的流出液感染对虾原代细胞的结果。B和B1为通过转染pMCs-GFP：pCMV-VSV-G(1:1)所包装形成的病毒感染对虾原代细胞的结果。C和C1为通过转染pMCs-PMj-muTCTP-GFP:pCMV-VSV-G(1:1)所包装形成的病毒感染对虾原代细胞的结果。D和D1为通过转染pMCs-GFP：pCMV-VSV-G：pcDNA-VP19：pcDNA-VP28(3:1:1:1)所包装形成的病毒感染对虾原代细胞的结果。E和E1为通过转染pMCs-PMj-muTCTP-GFP：pCMV-VSV-G：pcDNA-VP19：pcDNA-VP28(3:1:1:1)包装形成的病毒感染对虾原代细胞的结果。
具体实施方式
本发明对现有泛嗜性逆转录病毒基因转移系统进行改进，涉及对虾白斑病毒(WSSV)的两种囊膜蛋白VP19和VP28的编码区序列(SEQ ID NO:3、4)及其真核表达载体(图1)，通过将其与囊膜蛋白VSV-G共转染包装细胞，将其引入所包装病毒的囊膜中，从而提高其嗜对虾细胞性。
为确保外源基因在对虾细胞中有效转录和表达，本发明内容还涉及将对虾翻译控制肿瘤蛋白基因启动子(PMj-TCTP)基因插入病毒载体中。为进一步提高启动子PMj-TCTP在对虾细胞中的活性，本发明还对PMj-TCTP启动子(SEQ ID NO:1)的序列进行了改造，改造后的启动子为PMj-muTCTP，其核酸序列为SEQ ID NO:5。
改进后的泛嗜性逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性提高，侵染和表达效率提高，可应用于对虾及其细胞的基因转移研究中，从而弥补现有技术的不足。
具体实施方式以Cell Biolabs公司的泛嗜性逆转录病毒基因表达系统试剂盒(Platinum ES/EC Retrovirus Expression System,Pantropic，Cat.No.VPK-305)为例进行阐述如下：将GFP报告基因病毒表达载体pMCs-GFP经过改造后，与囊膜蛋白表达载体pVSV-G以及对虾白斑病毒囊膜蛋白表达载体pVP19和pVP28，同时共转染包装细胞plat-GP，包装得到的假型逆转录病毒，可有效感染对虾原代培养细胞(图7)。
本发明中所涉及的pMCs-GFP的改造涉及在其病毒启动子LTR之后插入一段日本囊对虾TCTP基因启动子PMj-TCTP或其人工突变体PMj-muTCTP，以促进外源基因在对虾细胞中的有效表达。插入启动子PMj-TCTP后的质粒命名为pMCs-PMj-tctp-GFP，插入启动子PMj-muTCTP后的质粒命名为pMCs-PMj-muTCTP-GFP。
本发明中所涉及的包装细胞plat-GP，已经稳定转染有包装相关蛋白基因(衣壳蛋白gag、逆转录酶和整合酶pol)。
本发明中所涉及的逆转录病毒的包装和纯化方法如下：通过阳离子脂质体转染试剂Lipofectamin LTX(Invitrogen公司)，将病毒表达载体pMCs-PMj-muTCTP-GFP与三种囊膜蛋白表达载体pVSV-G、pVP19和pVP28，共转染到plat-GP细胞中，进行病毒的包装，并收集48h和72h后的培养基上清，经过0.45μm的滤膜过滤后，转移到超滤离心管中(Millipore)，在4℃下6000转/分钟，离心半小时，获得病毒的浓缩液，分装储存在-80冰箱中。
本发明中所涉及的包装病毒滴度的测定方法如下：将病毒浓缩液感染plat-GP细胞(未转染pVSV-G)，统计表达绿色荧光蛋白的细胞数目，计算病毒浓缩液的滴度。
本发明中所涉及的对虾细胞的逆转录病毒感染方法如下：将病毒浓缩液感染对虾活体和原代培养细胞，荧光显微镜下观察GFP报告基因的表达情况。
实施例1：VP19、VP28和eGFP基因以及PMj-tctp启动子片段的克隆。
利用全式金公司的DNA提取试剂盒(Easypure Marine Animal Genomic DNAkit，Cat.No.EE151-01)感染对虾WSSV的鳌虾的基因组，利用Trizol试剂提取日本囊对虾肌肉的总RNA，并反转录成总cDNA，具体操作方法根据试剂盒说明书来进行。分别设计含有酶切位点的特异性引物，如表1，通过PCR技术扩增得到目的片段。PCR反应的体系以及程序如下：50μl的体系组成为：5.0μl10×PCR buffer(含Mg2+),4.0μl 2.5mmol l-1dNTPs,2.5μl 10μmol l-1上游和下游引物，0.5μl 5IUμl-1Taq DNA聚合酶,2μl基因组DNA和33.5μl ddH2O。PCR反应程序为：94℃预变性10分钟，按照以下方式循环33次：94℃变性45秒，退火45秒，72℃延伸50秒。最后72℃10分钟。基因VP19、VP28和eGFP以及启动子PMj-tctp片段的退火温度分别为62℃、60℃、58℃和57.5℃。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，并送去华大公司(BGI)测序。结果见图1-2。
表1：VP19、VP28和eGFP基因以及PMj-tctp启动子片段克隆所用引物序列
实施例2：三种报告基因病毒表达载体pMCs-eGFP、pMCs-PMj-TCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP的构建。
克隆得到的日本囊对虾TCTP基因启动区，命名为P Mj-tctp(图2)。同时，将pMCs-GFP载体中的GFP基因替换成eGFP基因，共构建了3个不同的表达载体，即pMCs-eGFP、pMCs-PMj-TCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP(图3)。利用SacII和Not I核酸内切酶酶切pMCs-GFP，将含有相同粘性末端(SacII/NotI)的eGFP基因片段插入到酶切后的pMCs-GFP得到pMCs-eGFP。利用EcoR I和Sac II核酸内切酶酶切pMCs-GFP，将含有相同粘性末端(EcoR I/Sac II)的PMj-TCTP启动子插入其中，从而获得pMCs-PMj-TCTP-GFP。利用EcoR I和SacII核酸内切酶酶切pMCs-eGFP，将含有相同粘性末端(EcoR I/Sac II)的PMj-TCTP启动子插入其中，从而获得pMCs-PMj-TCTP-eGFP，具体操作步骤根据说明书来进行。
实施例3：pcDNA-VP19和pcDNA-VP28两种囊膜蛋白表达载体的构建。
利用BamHI和EcoRI核酸内切酶酶切质粒pcDNA3.1V5/HisA(invitrogen公司)，将带有相同粘性末端(BamHI/EcoRI)的VP19以及VP28序列插入其中从而获得pcDNA-VP19和pcDNA-VP28。
实施例4：病毒表达质粒在Plat-GP和对虾原代细胞中的转染方法和表达结果。
在Plat-GP中：在12孔细胞培养板中，接种培养Plat-GP细胞，待细胞铺板率达到60％-80％，利用Lipofectamine LTX转染剂(Invitrogen公司产品)进行转染。其中，脂质体-DNA复合物的制备步骤如说明书所述：DNA(μg)：lipofectamine LTX(μl)的值为1：2；12孔板中DNA用量为1.5μg/孔，LTX用量为3μl；转染4小时后，移除孔中的培养基，换成含10％FBS的新鲜DMEM培养基；转染后24小时，在倒置荧光显微镜下观察。结果如图4所示，采用脂质体转染方法，四种逆转录病毒表达载体在plat-GP包装细胞系中都能高效表达，在所有转染的样品中均能检测到明显的阳性信号。这四种逆转录病毒表达载体分别为pMCs-GFP、pMCs-eGFP、pMCs-PMj-TCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP。
在对虾原代细胞中：在组织块接种培养板后的5h以及16h，先后进行两轮转染。脂质体复合物制备步骤如说明书所述：DNA(μg)：lipofectamine LTX(μl)的比值为1：3；12孔板中DNA用量为3μg/孔，LTX用量为9μl；每次转染4小时后，移除孔中的培养基，换成含10％FBS的新鲜1.5×L-15培养基；转染后24小时在倒置荧光显微镜下观察。结果如图5所示，不含对虾PMj-TCTP启动子的2个病毒表达质粒pMCs-GFP和pMCs-eGFP均不能在对虾细胞中有效表达，未观察到明显绿色荧光(图5-A1和B1)；而含有PMj-TCTP启动子的2个病毒表达质粒pMCs-PMj-TCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP均能够在对虾细胞中有效表达，可观察到明显绿色荧光(图5-C1和D1)。
实施例5：PCR检测目的基因的转移与表达结果。
在转染后第四天，用PBS缓冲液清洗对虾原代细胞三遍，然后将细胞收集到1.5ml的离心管中，用10μl 10×DnaseI buffer以及88μl ddH2O重悬管底的细胞，加入2μl DnaseI在37℃孵育1小时；
分别提取DnaseI处理过的对虾细胞的基因组和总RNA，提取基因组所用试剂盒和操作步骤同上所述。利用Trizol法提取细胞的总RNA，利用试剂盒(Toyobo，ReverTra Ace qPCR RT Kit，)进行反转录合成cDNA。操作步骤参照说明书进行；利用提取的DNA以及cDNA作为模板，通过PCR反应检测目的基因的表达。
PCR反应体系以及程序如下：20μl的体系组成为：2.0μl 10×PCR buffer(Mg2+),1.6μl 2.5mmol l-1dNTPs,1.0μl 10μmol l-1上下游引物，0.4μl 5IUμl-1Taq DNA聚合酶,0.8μl基因组DNA，13.4μl ddH2O。PCR程序为：94℃预变性10分钟，按照以下方式循环35次：94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸50秒。最后72℃10分钟。GFP以及eGFP片段的退火温度分别为57℃和60℃。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图6所示，DNA水平上3种病毒表达质粒pMCs-eGFP、pMCs-PMj-TCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP均可以在对虾细胞中检测到，表明脂质体法可以将它们导入对虾细胞中；在mRNA水平上，也可以检测到以上3种表达质粒的表达，但是pMCs-eGFP的表达水平极弱，表明不含对虾PMj-TCTP启动子的病毒表达质粒pMCs-eGFP不能在对虾细胞中被有效转录，这与其未观察到明显绿色荧光相一致(图6，泳道1)；而含有PMj-TCTP启动子的2个病毒表达质粒pMCs-PMj-TCTP-GFP和pMCs-PMj-TCTP-eGFP均能够在对虾细胞中被有效转录，这与其可观察到明显绿色荧光相一致(图6，泳道2和4)。
实施例6：PMj-TCTP启动子的改造及效果检测
尽管本发明所分离的对虾基因启动子PMj-TCTP优于哺乳动物来源启动子如病毒LTR，可有效启动外源基因在对虾细胞中的表达。但是，由于对虾细胞不分裂，难转染，导致阳性细胞克隆少，荧光弱。因此，申请人对该启动子进行改造，以提高其在对虾细胞中的转染和表达效率。
改造方法：首先设计合成含KpnI酶切位点的正向突变引物：5′-GGGGTACCGGGAATTTCCGATATGCAAATATACTTAC-3′，并与含BamHI酶切位点的反向引物(5′-CGGGATCCAATCGTCGCTAAAC-3′)组成引物对，以质粒pMCs-PMj-TCTP-GFP为模板，扩增得到突变启动子Pmu-tctp片段(SEQ ID NO:5)。该突变启动子PMj-muTCTP片段比突变前启动子PMj-TCTP(SEQ ID NO:1)的序列多出12个碱基，分别是在PMj-TCTP片段的5’端增加10个碱基(GGGAATTTCC)，在PMj-TCTP片段的第7位碱基后插入了2个碱基(AA)。改造后的启动子的核酸序列为SEQ ID NO:5。
病毒表达质粒pMCs-PMj-muTCTP-GFP的构建方法：用双核酸内切酶(KpnI和BamHI)分别酶切质粒pMCs-PMj-TCTP-GFP和PCR扩增得到的突变启动子PMj-muTCTP片段，回收纯化酶切后的载体质粒和PMj-muTCTP片段，连接转化，从而将表达质粒pMCs-PMj-TCTP-GFP中的PMj-TCTP片段替换成PMj-muTCTP片段，构建得到表达质粒pMCs-PMj-muTCTP-GFP(图3)。
将病毒表达质粒pMCs‐PMj‐muTCTP‐GFP转染到哺乳动物细胞Plat‐GP中，可观察到强的绿色荧光表达(图4)。将其转染到体外培养对虾类淋巴细胞中，可观察到明显的绿色荧光表达(图5)，而且每个视野中的阳性细胞克隆数明显比未突变启动子病毒表达质粒更多，荧光强度也更亮。可见，突变后对虾启动子PMj‐muTCTP在对虾细胞中的转染和表达效率明显得到提高。
实施例7：嗜对虾细胞的逆转录病毒的包装、收集浓缩与对虾细胞感染结果。
以pMCs-GFP作为对照质粒，以不同的包装组合对改造过的病毒表达质粒pMCs-PMj-muTCTP-GFP进行包装，通过lipofectamine LTX转染试剂，将其与不同囊膜蛋白表达载体共转染到plat-GP中，转染方法按照说明书进行。
病毒表达载体与囊膜蛋白表达载体的组合有以下几种：①pMCs-GFP：pCMV-VSV-G(1:1)；②pMCs-PMj-muTCTP-GFP：pCMV-VSV-G(1:1)；③pMCs-GFP：pCMV-VSV-G：pcDNA-VP19：pcDNA-VP28(3:1:1:1)；④pMCs-PMj-muTCTP-GFP：pCMV-VSV-G：pcDNA-VP19：pcDNA-VP28(3:1:1:1)。
分别于转染后的48h、72h收集含有病毒的细胞培养液，经过0.45μm的滤膜过滤出去培养液中的细胞残渣。将过滤后得到的病毒粗提液转入超滤离心管中(Millipore)，在4℃下，6000转/分，离心半小时，取病毒的截流液，获得病毒浓缩液，分装于1.5ml的离心管中，储藏在-80℃备用。
病毒浓缩液侵染对虾原代细胞的方法如下：在对虾Oka器官组织块接种到12孔板12小时时，每孔中加入300μl的病毒浓缩液，病毒的滴度为(5.4～7.2)×106/ml。同时加入终浓度为8ug/ml的聚凝胺，在28℃下孵育3h后，加入新鲜的L-15完全培养基，培养基配方参考韩倩等发表的文章(Han et al.,Aquaculture 2013 410,101-113)；12小时后再次进行包装病毒的感染，操作方法如上；感染48小时后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，统计该发明所涉及的逆转录病毒介导外源基因表达的效率。结果如图7所示，病毒表达质粒pMCs-GFP和pMCs-PMj-muTCTP-GFP经过常规包装方法包装，即只共转染哺乳动物来源的囊膜蛋白表达质粒pCMV-VSV-G，所包装病毒不能有效感染对虾原代培养细胞，观察不到绿色荧光(图7，B1和C1)；而改进后的包装方法，即共转染3种囊膜蛋白：pCMV-VSV-G以及对虾WSSV病毒来源的囊膜蛋白表达质粒pcDNA-VP19和pcDNA-VP28，则所包装病毒能购有效感染对虾原代培养细胞，观察到明显的绿色荧光(图7，E1)；D1的包装方法与E1相同，但是由于pMCs-GFP不能在对虾细胞中有效表达，故不能观察到绿色荧光。
Claims (6)
1.一种在对虾细胞中有效表达的病毒表达载体，其特征在于，该载体中在病毒LTR启动子之后插有一个使外源基因在对虾细胞中高效表达的启动子。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的启动子的序列为SEQID NO:1。
3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的启动子的序列为SEQID NO:5。
4.一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统，其特征在于，所述的转移系统为携带有pVSV-G、pVP19和pVP28基因的如权利要求1所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的转移系统，其特征在于，所述的囊膜蛋白VSV-G、VP19和VP28的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2-4。
6.一种使外源基因在对虾细胞中表达的方法，其特征在于，所述的方法是将外源基因通过权利要求5所述的转移系统转入对虾细胞中。
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| CN105219775A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-01-06 | 中国海洋大学 | 一种用于对虾细胞的病毒启动子 |
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| CN114292879A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 中国海洋大学 | 一种用于在对虾中递送和表达外源基因的对虾病毒表达系统 |
| CN114292879B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-01-26 | 中国海洋大学 | 一种用于在对虾中递送和表达外源基因的对虾病毒表达系统 |
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| CN104762322B (zh) | 2016-01-06 |
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