CN110283766B - 一种重组卡介苗及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药卫生领域，更具体地，涉及一种重组卡介苗及其构建与应用。其通过将敲除卡介苗中抑制自噬基因后的敲除型BCG菌株作为一种重组卡介苗，与野生型BCG比较，本发明构建的重组卡介苗能够显著诱导巨噬细胞发生自噬，降低其在感染的巨噬细胞内的存活率；并能经自噬途径增强抗原递呈并活化CD4+Th1型反应，由此解决现有的BCG疫苗由于其自身的抑制自噬基因而导致的保护性弱、不能有效预防青少年和成人结核病的技术问题。

Description

一种重组卡介苗及其构建与应用
技术领域
本发明属于医药卫生领域，更具体地，涉及一种重组卡介苗及其构建与应用。
背景技术
尽管直接观察下的短程联合化疗和目前唯一的预防疫苗卡介苗(BCG),已分别用于治疗和预防结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染引起的结核病(TB)，2018年，全球仍有上千万的TB新发病例并造成160万人死亡，是所有传染病中的头号杀手。因此，仍需大力发展新型的治疗和预防技术，以更有效地防治TB。新生儿免疫接种BCG，已经被全球150多个国家和地区纳入计划免疫策略，用于TB的预防。目前的研究普遍认为，尽管BCG免疫可保护婴幼儿童预防重症TB如粟粒性结核病和结核性脑膜炎，减少了儿童TB(0-14岁)的发病率和死亡率，但是，BCG提供的保护性会随着免疫时间的增加而逐步减弱，通常认为其保护期仅10-15年。这与TB的临床流行病学的数据一致。在全球每年一千万的新发TB病例中，90％属于青少年和成人(≥15岁)的TB；仅10％属于儿童TB病例。而且，依据最新的T.spot TB诊断潜伏结核病感染(latent tuberculosis infection,LTBI)，WHO报道全球约25％的总人口属于LTBI。因此，普遍认为BCG对青少年和成年的潜伏结核病感染和结核病均缺乏有效的预防能力。
BCG是在1908年到1921年间，将从奶牛体内分离到的一株牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)毒株，经过13年、230代的体外传代培养获得的减毒活疫苗。经过减毒，BCG对人类无致病性，但是这种从毒株减毒的方法是随机的、不定向的。BCG经皮下或皮内注射免疫机体后，首先被肺泡巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞吞噬，经吞噬体-溶酶体途径，将新吞噬的BCG降解，其产物可经MHC-II类分子途径，活化CD4+T淋巴细胞，并主要经Th1型反应发挥抗感染作用。与此相吻合的是，目前也有研究发现，BCG在正常生理条件下，与M.tb或牛分枝杆菌一致，均能够抑制其感染的巨噬细胞自噬，并逃避自噬介导的杀伤和抗原递呈。然而，在使用自噬诱导剂雷帕霉素、IFN-γ、LPS或TNF-α等预处理巨噬细胞后，能显著增强BCG感染的巨噬细胞自噬和抗原递呈增加，并增强其抗M.tb感染的免疫保护性。但是，这些自噬诱导剂因其毒性或致病性，或对人体免疫系统的广泛调节作用，是不能用于人体免疫的，否定了采用这些因素诱导经自噬途径用于增强和改善BCG诱导的抗结核免疫保护性的应用。
BCG在全球范围内广泛接种新生儿并能有效预防婴幼儿童TB，然而由于BCG是减毒株，可从亲代毒株M.bovis继承其残留的毒性如抑制自噬的能力。BCG继承的这种能力，很可能是导致BCG缺乏对青少年和成人的LTBI和TB的预防能力的因素。因此，如能发现BCG存在的抑制自噬基因，并将其从BCG的基因组中敲除以合理改造BCG，从而增强BCG的免疫原性和免疫保护性，增强其预防青少年和成人的LTBI和TB的能力，这对有效防控TB具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种重组卡介苗及其构建和应用，其通过将敲除BCG中抑制自噬基因后的敲除型BCG菌株作为一种重组卡介苗，与野生型BCG比较，本发明构建的重组卡介苗能够显著诱导巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞发生自噬，降低其在感染的巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞内的存活率；并能经自噬途径增强抗原递呈并活化CD4+T淋巴细胞，由此解决现有的BCG由于其自身的抑制自噬缺陷而导致的保护性弱，不能有效预防青少年和成人结核病的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种重组卡介苗，其为敲除卡介苗中抑制自噬基因后的敲除型BCG菌株。
优选地，所述抑制自噬基因的基因为BCG_2432c；所述BCG_2432c具有如SEQ IDNO：1所示的基因序列。
按照本发明的另一个方面，提供了一种构建所述重组卡介苗的方法，是将卡介苗中抑制自噬基因的BCG_2432c基因进行敲除。
优选地，采用分子生物克隆技术从BCG基因组中敲除BCG_2432c基因，制备得到基因敲除菌株ΔBCG_2432c。
优选地，所述的方法，包括如下步骤：
(1)设计BCG_2432c的左臂引物和右臂引物，其左臂引物包括BCG_2432c开放阅读框前端184bp，右臂引物包括BCG_2432c开放阅读框后端40bp，且其左臂和右臂均含有VN91I酶切序列；PCR扩增左臂和右臂，得到PCR产物；将PCR产物和质粒p0004s使用VN91I酶切并构建重组质粒p0004s-BCG_2432c；
(2)将重组质粒p0004s-BCG_2432c和phAE159质粒使用PacI酶切，并使用包装试剂盒将两个酶切后的片段连接后转化进入E.coli HB101宿主细胞，在含有潮霉素的抗性平板上培养并挑选阳性克隆；将阳性克隆接种到含有潮霉素的LB液体培养基中增菌培养并抽提质粒；将抽提到的质粒电转化进入耻垢感受态中筛选空斑；挑取空斑制备噬菌体并感染BCG菌株；
(3)将感染的菌株接种在7H11含有潮霉素的抗性平板上筛选得到ΔBCG_2432c菌株。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的重组卡介苗在诱导抗原递呈细胞发生自噬中的应用，所述抗原递呈细胞包括巨噬细胞和树突状细胞。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的重组卡介苗在制备结核病疫苗中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提出了一种重组卡介苗，其为敲除卡介苗中抑制自噬基因后的敲除型BCG菌株。实验证明本发明新建立的抑制自噬基因敲除型BCG菌株，可经传统的吞噬体溶酶体途径，活化CD4+T淋巴细胞，并经Th1型反应发挥抗感染作用，继承了BCG免疫新生儿后可有效预防儿童TB的优势，不影响各个国家现行的BCG的计划免疫策略；特别是，由于敲除了卡介苗中抑制自噬基因，还可经自噬小体-溶酶体途径，将BCG经自噬途径降解，其产物可经MHC II类分子途径，进一步活化CD4+T淋巴细胞，强化Th1型反应并增强了BCG的免疫原性和免疫保护性。
(2)本发明提供的重组卡介苗ΔBCG_2432c的免疫原性和免疫保护性均较野生型BCG显著增强。通过免疫小鼠，与野生型BCG比较，本发明构建的ΔBCG_2432c免疫小鼠能诱导更早和更强的效应T细胞归巢到肺脏、并更早地建立免疫记忆，从而增强小鼠对M.tb急性感染的清除能力，从而具备阻止青少年和成人的潜伏结核病感染的建立，以及后续的青少年和成人结核病的发生的能力。
(3)与具有毒性或严重副作用、且对人体免疫系统的广泛调节作用的自噬诱导剂相比，本发明提供的重组卡介苗为抑制自噬基因敲除型BCG，其可直接取代卡介苗在人体免疫接种应用，无需另外使用这些自噬诱导剂，并经动物试验证实其安全性与传统卡介苗相当。
(4)本发明提供的重组卡介苗可通过采用常规基因敲除方法从BCG基因组中敲除BCG_2432c基因，获得方法简单。
附图说明
图1PCR检测证实BCG_2432c基因在12株BCG亚株和牛分枝杆菌(M.bovis)及M.tb中存在。
图2从基因测序证实BCG_2432c的氨基酸序列在12株BCG亚株和M.bovis及M.tb中高度保守。
图3基因敲除BCG_2432c的ΔBCG_2432c BCG构建原理的构建模式图。
图4为PCR验证ΔBCG_2432c BCG的成功构建。
图5为证实BCG_2432c是BCG的抑制自噬基因。将ΔBCG_2432c和野生型BCG分别感染巨噬细胞，比较两种细菌诱导巨噬细胞自噬的能力及后果。(A)利用携带双标GFP-RFP-LC3慢病毒转染THP-1细胞后利用激光共聚焦检测自噬标记LC3斑点，以及正在与溶酶体融合的自噬小体；(B)产生LC3斑点的细胞中LC3斑点的数量；(C)产生LC3斑点的细胞；(D)正在与溶酶体融合的自噬小体的百分比；(E)Western Blotting检测THP-1细胞中LC3-I向LC3-II转变；(F)ΔBCG_2432c在巨噬细胞THP-1内存活率相对于野生型BCG显著降低。
图6为ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著增加小鼠来源的树突状细胞和巨噬细胞抗原递呈。(A)实验流程和方案；(B-D)ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著增加小鼠来源的树突状细胞经自噬-溶酶体途径的抗原递呈活化CD4+T细胞；(E-G)ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著增加小鼠来源的巨噬细胞经自噬-溶酶体途径的抗原递呈，活化CD4+T细胞。
图7为ΔBCG_2432c和野生型BCG免疫小鼠抗结核分枝杆菌的保护性比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了尝试解决BCG从亲代毒株M.bovis继承其残留的毒性如抑制自噬的能力，而导致BCG不能长期有效的预防青少年和成人结核病的技术问题，本发明试图找到BCG自身的抑制自噬基因，并将该基因从BCG的基因组中特异性敲除。
为此，本发明提供了一种重组卡介苗，其为敲除卡介苗中抑制自噬基因后的敲除型BCG菌株。
本发明通过收集包括BCG中国株在内的12株BCG菌株，以及M.tbH37Rv和BCG的亲代毒株牛分枝杆菌M.bovis。发现BCG_2432c在12株BCG以及M.tb H37Rv和M.bovis中均存在，且高度保守。
实际上，在上述收集、比对过程中，除了BCG_2432c，在12株BCG以及M.tb H37Rv和M.bovis中均存在且高度保守的基因还有多个，甚至多个抑制自噬基因如BCG_3174和BCG_1782，然而并非每一个都具有如BCG_2432c所显示的，在敲除后可经自噬途径加强抗原递呈和改善BCG抗感染保护性的能力。本发明通过首先构建敲除BCG基因组中的BCG_2432c的基因敲除突变株ΔBCG_2432c。与野生型BCG比较，本发明构建的ΔBCG_2432c能够显著诱导巨噬细胞发生自噬；降低其在感染的巨噬细胞内的存活率；并能经自噬途径增强抗原递呈并活化CD4+T淋巴细胞。不仅证实了BCG_2432c是全球各国临床上免疫的BCG各种亚株普遍存在的抑制自噬基因，而且其存在BCG的基因组中会抑制BCG经自噬途径的抗原递呈。所述BCG_2432c具有如SEQ ID NO：1所示的基因序列。
本发明还提供了所述重组卡介苗的构建方法，是将卡介苗中抑制自噬基因的BCG_2432c基因进行敲除，可采用常规的敲除基因的方法。
一些实施例中，采用经典分子生物克隆技术从BCG基因组中敲除BCG_2432c基因，制备基因敲除菌株ΔBCG_2432c。
比如，采用经典分子生物克隆技术基于p0004s和phAE519系统从BCG基因组中敲除BCG_2432c基因，制备基因敲除菌株ΔBCG_2432c。
一些实施例中，所述的构建方法，包括如下步骤：
(1)设计BCG_2432c左臂引物和右臂引物分别包括BCG_2432c开放阅读框前端184bp和后端40bp，左臂和右臂均含有VN91I酶切序列；将左臂后，右臂片段和质粒p0004s使用VN91I酶切并构建重组质粒p0004s-BCG_2432c；
(2)将重组质粒p0004s-BCG_2432c和phAE159质粒使用PacI酶切，并使用包装试剂盒将两个酶切后的片段连接后转化进入E.coli HB101宿主细胞，在含有潮霉素的抗性平板上培养并挑选阳性克隆；将阳性克隆接种到含有潮霉素的LB液体培养基中增菌培养并抽提质粒；将抽提到的质粒电转化进入耻垢感受态中筛选空斑；挑取空斑制备高纯度的噬菌体并感染BCG菌株；
(3)将感染的菌株接种在7H11含有潮霉素的抗性平板上筛选得到ΔBCG_2432c菌株。
本发明采用经典分子生物克隆技术，从GenBank中查找到BCG Pasteur 1173P2基因组的BCG_2432c序列。设计引物从BCG中国株基因组中扩增包括BCG_2432c开放阅读框1209bp,上游447bp以及下游893bp。另外用同样的引物从12株BCG亚株的基因组(包括Tice，Pastrur，Japan，Birkhaug，Sweden，Moreau，Russia，Dasish，Phipps，Frappier，Prague，Glaxo)得到目的片段并将目的片段插入到测序载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A中测序。然后将从BCG基因组中扩增到的序列与从M.tb H37Rv和牛分枝杆菌中扩增到的序列进行比对。发现12株BCG亚株和M.tb H37Rv和牛分枝杆菌中均存在BCG_2432c，而且序列高度保守。
采用经典分子生物克隆技术基于p0004s和phAE519系统从BCG基因组中敲除BCG_2432c基因，制备基因敲除菌株ΔBCG_2432c。除了本技术外，尚可采用其它技术予以基因敲除。本技术中BCG菌株选用的BCG中国株，但也适用于BCG Tice，Pastrur，Japan，Birkhaug，Sweden，Moreau，Russia，Dasish，Phipps，Frappier，Prague，Glaxo等临床上使用的BCG的不同亚株。
首先设计BCG_2432c左臂引物和右臂引物分别包括BCG_2432c开放阅读框前端184bp和后端40bp，左臂和右臂均含有VN91I酶切序列；将左臂后，右臂片段和质粒p0004s使用VN91I酶切并构建重组质粒p0004s-BCG_2432c；然后将重组质粒p0004s-BCG_2432c和phAE159质粒使用PacI酶切，并使用包装试剂盒将两个酶切后的片段连接后转化进入E.coli HB101宿主细胞，在含有潮霉素的抗性平板上培养并挑选阳性克隆；将阳性克隆接种到含有潮霉素的LB液体培养基中增菌培养并抽提质粒；将抽提到的质粒电转化进入耻垢感受态中筛选空斑；挑取空斑制备高纯度的噬菌体并感染BCG菌株；最后将感染的菌株接种在7H11含有潮霉素的抗性平板上筛选的到ΔBCG_2432c菌株。
本发明构建的ΔBCG_2432c感染巨噬细胞THP-1后相对于野生型BCG显著增强THP-I细胞自噬流；ΔBCG_2432c在巨噬细胞THP-1细胞中的存活率相对于野生型BCG显著下降；而且，ΔBCG_2432c感染小鼠骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞后，抗原递呈细胞不仅经传统的吞噬溶酶体途径，还可经自噬溶酶体途径等两条途径进行抗原加工和抗原递呈，因此，抗原递呈能力显著增加。
本发明还评价了ΔBCG_2432c的免疫保护性均较野生型BCG显著增强。实验中发现ΔBCG_2432c免疫C57BL/6小鼠14d，28d和60d后，分别用使用M.tb H37Rv毒株经气溶胶感染免疫小鼠，4周后处死小鼠进行脾脏和肺脏菌落计数和肺组织病理分析，结果表明ΔBCG_2432c能相对于野生型BCG显著降低小鼠肺脏荷菌量并改善肺脏病理。因此本发明构建的ΔBCG_2432c相对于野生型BCG具有更好的免疫原性和免疫保护性。从而具备阻止青少年和成人的潜伏结核病感染的建立，以及后续的青少年和成人结核病的发生的能力。
本发明的目的是发现并鉴定BCG自身的抑制自噬基因，并将其从BCG的基因组中特异性敲除。新建立的抑制自噬基因敲除型BCG菌株，既可经吞噬体溶酶体途径，活化CD4+T淋巴细胞，并经Th1型反应发挥抗感染作用，继承了BCG免疫新生儿有效预防儿童结核病的优势，不影响现有的BCG的计划免疫策略，还可经自噬小体-溶酶体途径，将BCG经自噬途径降解，其产物可经MHC II类分子途径，进一步活化CD4+T淋巴细胞，强化Th1型反应并增强BCG的保护性。特别是，这种抑制自噬基因敲除型BCG可在人体免疫接种应用。
本发明还提供了所述重组卡介苗的多种应用。比如，本发明的重组卡介苗在诱导巨噬细胞发生自噬中的应用以及在制备结核病疫苗中的应用。
以下为实施例：
实施例1
检测世界范围内的13株BCG中均存在BCG_2432c：
(1)引物设计：F：5'-TGCTCTAGACGCTCAAGCCGCTGCTGTCAGTC-3'，含有Xba I酶切位点，涵盖开放阅读框上游385bp；R-5'-CCCAAGCTTAGCTGCCGAGCCATGTTCAGTCC-3'含有HindIII酶切位点；涵盖开放阅读框下游893bp；
(2)PCR扩增目的条带，体系为50μl体系：
Figure BDA0002064224340000091
PCR条件为：95℃5分钟；98℃5秒，60℃5秒，72℃2分45秒，循环29次；72℃10分钟，4℃forever。
(3)将PCR产物用clean up试剂盒清洗，并使用Xba I和HindIII 37℃双酶切30分钟，体系为30μl
Figure BDA0002064224340000101
(4)将pcDNATM3.1/myc-His(-)A质粒用Xba I和HindIII 37℃双酶切30分钟，体系为30μl
Figure BDA0002064224340000102
利用T4连接酶将酶切后的PCR片段和载体连接，连接体系为20μl：
Figure BDA0002064224340000103
(5)将配置好的连接体系置于16℃，连接过夜后将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α感受态，并涂在氨苄抗性的LB平板上挑选出单克隆。
(6)挑选单克隆接种到氨苄抗性的LB液体培养基中增菌，收集菌体并提取质粒进行酶切验证。验证正确的单克隆送到公司测序。
结果分析：如图1所示，图1左图为BCG_2432c基因在不同分枝杆菌中的分布，图1右图为鉴定不同分枝杆菌来源的BCG_2432c基因的克隆，证实克隆成功。可以看出在世界各国临床上使用的BCG亚株菌株共12株中均存在与结核分枝杆菌H37Rv eis同源的BCG_2432c基因序列，而且在BCG的亲代牛分枝杆菌(M.bovis)中也存在同源的BCG_2432c基因序列。这一工作，证明了BCG_2432c在12株BCG亚株和牛分枝杆菌中均存在。进一步将图1右图获得的克隆经测序，证实除BCG Prague开放阅读框641bp处为碱基T而其他菌株均为C，上游调控序列和开放阅读框完全一致。所有的12株BCG在下游329bp处为碱基A而H37Rv eis为碱基G。但从氨基酸水平分析，如图2所示，BCG_2432c的氨基酸序列在12株BCG亚株、牛分枝杆菌及M.tb均存在(图2为12株BCG亚株、牛分枝杆菌及M.tb共14个菌株的氨基酸序列，自上而下三幅图(A、B和C)连起来即为这14个菌株的完整的氨基酸序列)，且高度保守。
实施例2
用于敲除BCG_2432c的引物设计
左臂引物为：LFP5'-TTTTTTTTCCATAAATTGGCGCTCAAGCCGCTGCTGTCA-3'、LRP5'-TTTTTTTTCCATTTCTTGGCCATCCCGACCACCTCAGAACC-3'；涵盖BCG_2432c开放阅读框184bp；引物设计Van91I酶切位点。
右臂引物为：RFP5'-TTTTTTTTCCATAGATTGGTGCCAGTGATGTTCCCGTCCA-3'、LRP5'-TTTTTTTTCCATCTTTTGGAGCTGCCGAGCCATG TTCA-3'；涵盖BCG_2432c开放阅读框40bp；引物设计Van91I酶切位点。
实施例3
PCR扩增左臂和右臂，PCR体系为50μl体系：
Figure BDA0002064224340000111
PCR条件为：
95℃5分钟；95℃45秒，58℃45秒，72℃1分钟，循环29次；72℃1分钟，4℃forever。
PCR反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳，观察并用DNA胶回收试剂盒(AXYGEN)回收PCR产物备用。
实施例4
Van91I酶切质粒p0004s和PCR产物
酶切体系为40μl：
Figure BDA0002064224340000121
体系配置完毕后37℃酶切30分钟。
实施例5
连接Van91I质粒p0004s和PCR酶切产物：将酶切回收的左右臂和酶切质粒p0004s后回收的两条大片段进行连接，转化E.coli DH5a，在含潮霉素B(150μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆子。(酶切电泳验证或PCR验证)
连接体系为30μl：
Figure BDA0002064224340000122
室温连接过夜。
转化方法：
连接产物和DH5a感受态掌心迅速融化后冰浴；将前者加入到后者混匀，冰浴45min；42℃热击90s；立即冰浴10min；加适量液体LB(1L：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g；高温蒸汽灭菌15min)至终体积1ml，37℃ 175rpm振荡45min；离心浓缩菌液，涂布潮霉素抗性固体LB(1L：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，潮霉素150mg；高温蒸汽灭菌15min)，倒置，37℃培养16h。
从潮霉素抗性固体LB挑选单克隆接种于5ml潮霉素抗性液体LB(1L：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，潮霉素150mg)，37℃ 175rpm振荡16h。保菌并提取质粒，-20℃保存。
酶切鉴定：
Figure BDA0002064224340000131
鉴定出来的阳性克隆子命名为：p0004s-BCG_2432c。
实施例6
用PacI酶切鉴定好的阳性克隆子p0004s-BCG_2432c以及phAE159质粒
Figure BDA0002064224340000132
Figure BDA0002064224340000141
热敏碱性磷酸酶磷酸化体系(20μl)
Figure BDA0002064224340000142
连接体系(20μl)
Figure BDA0002064224340000143
室温连接过夜。
实施例7
连接和包装p0004s-BCG_2432c以及phAE159质粒
将上述步骤中准备好的两个片段进行连接。连接体系准备好后备用。由于连接后的质粒将会有50kb，不能够使用传统的方法钙转或电转，需要使用包装试剂盒(EPICENTREBiotechnologies:MaxPlax Lambda Packaging Extracts，货号：MP5110)进行包装。
包装步骤：
将包装试剂盒中的包装试剂在冰上解冻，加5μl连接好的体系。并用手指轻轻敲打混匀。室温放置1小时30分钟。
添加400μl的MP buffer，室温放置30分钟。
然后加入1mL的E.coli HB101宿主细胞，混匀，37℃保温1小时。
离心收集细胞，重悬在1ml新鲜的LB培养基。
涂板(LB+Hyg150ug/ml)，37℃培养。挑取上述步骤中长出的单菌落至LB+Hyg150ug/ml液体培养基中，37℃培养。抽提质粒，用PacI酶切鉴定。
实施例8
电转化筛选出的阳性克隆子phasmid DNA到耻垢分枝杆菌mc2155中，筛选空斑。
(1)感受态mc2155的制备：
取10μl涂布7H11获取单克隆；挑单克隆接种于5ml 7H9。37℃，175rpm振荡培养2-3天。
使用5ml培养液接种到250-1000ml7H9。37℃，175rpm振荡培养；OD600达到0.4时，将培养物置冰浴中1.5h；4℃，5000g/min离心10min，用等体积的冰预冷的10％甘油清洗菌体；4℃，5000g/min离心10min，用1/10体积的冰预冷的10％甘油重悬菌体；4℃，2000g/min离心10min，用1/20体积的冰预冷的10％甘油重悬菌体；4℃，2000g/min离心15min，用1/500体积的冰预冷的10％甘油重悬菌体。分装，每只100μl，置-100℃保存备用。
(2)电转化：
取构建好的phasmid DNA 5-10μl加到400ul电转感受态mc2155中，然后吸取菌放入电转杯中并将电转杯在冰上放置10分钟，擦干电转杯外壁的水，进行电击(程序：电压2.5kV,电阻1000Ω，电容25μF)，电击后，迅速加入1ml 7H9培养基(不能含有Tween 80)，吸取出培养基到15ml管子中在37℃放置4小时(或过夜)。取37℃放置的电转的mc2155 400μl加到新鲜培养的400μl mc2155中并混匀，然后将这800μl菌液加到含有3mltop agar(TopAgar 100ml：Middlebrook 7H9broth 0.47g；Agar 0.75g)的5ml EP管中混匀并铺板。同时将剩下的电转的mc2155加到另一个含有3mltop agar的5ml EP管中混匀并铺板。
铺板方法：预先准备好7H11固体平板(一定不能加Tween 80，加0.5％甘油)，将混有菌液和Top Agar的液体迅速倾倒在7H11平板上并迅速晃动平板使菌液体铺满整个平板薄薄一层，待凝固后倒置平板于30℃培养2-3天，即可看到噬菌斑的形成。
注意：菌液加到Top Agar中时要注意Top Agar的温度，不能太高也不能太低，保持在50℃即可，不能让菌烫死或Top Agar提前凝固。
(3)制备高滴度的噬菌体phage裂解液
挑取空斑(可直接用1ml蓝色枪头细口端，垂直对准空斑直接戳进培养基中，然后用手指封住枪头广口端，取出枪头，含有空斑的培养基就会吸附在枪头细口端)，到200μlMP buffer中，4℃放置过夜。过夜后取5-50μlMP buffer(或适当量)加到300μl新鲜培养的mc2155菌中，混匀后和温热的3ml Top Agar混匀，铺板。平板置30℃培养2-3天后，可见噬菌斑形成。加5ml MP buffer到长有噬菌斑的平板上，放置4℃过夜或在室温慢摇4-6小时。过夜后用注射器吸取液体(噬菌体裂解液)，然后用0.22μm无菌滤器过滤至5ml无菌EP管中，放置4℃冰箱保存。
扩增高滴度的噬菌体:将制备好的噬菌体裂解液取50μl原液，以及从10-1到10-4梯度稀释的裂解液分别进行铺板来判断噬菌体裂解液的滴度。分别回收各个梯度的噬菌体裂解液，用于后续的实验。
(4)噬菌体裂解液转化待敲除菌株
待敲除菌株培养至OD 0.7-0.8，即菌数达到109左右。高滴度的噬菌体裂解液应该能够达到1010PFU(multiplicity of infection)，即待敲除菌株与噬菌体比例应该达到1:10以上。根据经验高滴度的噬菌体裂解液选择原液和稀释10倍的噬菌体裂解液扩增的噬菌体裂解液。所以在转化时建议选择这两个高滴度的噬菌体裂解液转化待敲除菌株以达到一次转化实验就能够敲除目的基因。
转化步骤：首先收集10ml培养的待敲除菌株，用MP buffer洗涤2次，然后用1ml MPbuffer重悬，将噬菌体裂解液与1ml MP buffer重悬的菌株混匀置37℃过夜后，离心(4000rpm)弃上清，然后加入10ml7H9+OADC+glycerol+Tween培养基，37℃复苏24小时，离心,涂平板(7H10+OADC+Hyg75ug/ml)，37℃培养。
实施例9
验证敲除阳性单克隆即为本发明：ΔBCG_2432c
PCR验证。验证PCR的上下游引物(LYZ/RYZ)设计是在LFP的上游处设计验证上游引物和RRP的下游处设计验证下游引物(如图2)。
Figure BDA0002064224340000171
PCR条件为：
98℃5分钟；95℃5秒，58℃5秒，72℃2分50秒，循环29次；72℃10分钟，4℃forever。
PCR反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳，观察。
图3是本发明基因敲除BCG_2432c的ΔBCG_2432c BCG构建原理图；图4的PCR验证了ΔBCG_2432c BCG成功构建。
实施例10
验证ΔBCG_2432c具有诱导巨噬细胞THP-1自噬流的功能。
(1)THP-1细胞用含有10％胎牛血清的1640培养基培养传代。
(2)THP-1细胞转染带有GFP-RFP-LC3标签的慢病毒，构建稳转细胞系。
(3)制备细胞爬片：将预先浸泡在75％酒精里面的盖玻片用纱布擦干，并放在超净台内，紫外线照射30min，将晾干的盖玻片放进24孔板中；将105细胞加入含盖玻片的24孔板培养；在培养基中加入佛波酯10ng/ml刺激48小时后更换新的培养基。
(4)药物处理：为了更好的观察和评价ΔBCG_2432c对自噬流的影响，实验组中设置自噬诱导剂雷帕霉素处理组(Rap 100μM处理2h)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理组(3-MA,10mM处理1.5h)。
(5)细菌感染细胞：细菌需要处于对数生长期，接种后10-14d。将匀浆器封口称量；使用枪头刮取平板上的细菌与已灭菌的匀浆器中并封口称量，计算细菌干重(初步定量参考1mg干重＝107CFU)；加入1ml完全培养基，充研磨分浆；去掉细胞培养基，无血清培养基洗一遍。将ΔBCG_2432c和野生型BCG(BCG WT)MOI＝5感染THP-1细胞；37℃感染1h后PBS洗涤细胞，去除未感染细菌；加入新的培养基继续培养12h。
(6)激光共聚焦观察：LC3斑点代表的自噬小体形成可作为自噬发生时的marker。当自噬小体与溶酶体融合时，显示绿色的GFP标签遇到溶酶体酸性环境时会淬灭，所以merge后会只显示RFP的红色。因此可以基于这种方式检测自噬流的改变。
(7)结果分析：如图5所示，野生型BCG不能诱导THP-1细胞自噬，然而ΔBCG_2432c显著诱导THP-1细胞自噬小体的形成并促使自噬小体与溶酶体融合，即ΔBCG_2432c促进巨噬细胞自噬流。
图5(A)利用携带双标GFP-RFP-LC3慢病毒转染THP-1细胞后利用激光共聚焦检测自噬标记LC3斑点，以及正在与溶酶体融合的自噬小体；(B)反映了产生LC3斑点的细胞中LC3斑点的数量；(C)为产生LC3斑点的细胞；(D)为正在与溶酶体融合的自噬小体的百分比；(E)为western-bloting检测THP-1细胞中LC3-I向LC3-II转变；(F)为ΔBCG_2432c在巨噬细胞包括THP-1内存活率相对于野生型BCG显著降低。
实施例11
western-bloting检测LC3蛋白转变
(1)铺板：THP-1细胞用含有10％胎牛血清的1640培养基培养传代，使用6孔板，106细胞/孔。
(2)感染：细菌悬液制备、感染方法和药物处理方法同实例10所示。
(3)western blotting鉴定自噬小体标记物LC3II的表达水平使用RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白并进行BCA蛋白定量。20μg/样品进行12％SDS-PAGE，转膜和封闭后，分别以LC3II抗体(1：2000稀释)和γ-tubulin抗体(1：2000稀释)为一抗，4℃孵育过夜；洗膜后孵育对应二抗；ECL显色后用Bio-rad凝胶成像系统成像。Western blot结果经Image lab软件(Bio-rad)进行灰度分析，计算各处理组LC3II/tubulin、LC3II/LC3I的比值。
(4)结果分析：如图5E所示，相对于野生型BCG，ΔBCG_2432c感染的THP-1细胞中LC3I向LC3II转变显著增加，这表明ΔBCG_2432c显著诱导THP-1发生自噬。
实施例12
检测野生型BCG和ΔBCG_2432c在巨噬细胞细胞内的存活率
(1)常规方法培养THP-1细胞
(2)铺板：使用六孔板，106/孔
(3)药物刺激和细菌感染方法同实例10所示
(4)在细菌感染12h后，弃掉培养基，使用PBS洗涤细胞三次，每孔加入1ml无菌去离子水裂解细胞。
(5)梯度(1:10)稀释涂于7H11加OADC培养基配置的三格皿中，37℃培养三周。
(6)计数每格的菌落数量并计算各组相对于野生型BCG感染组的存活率。
(7)结果分析，如图5F所示，ΔBCG_2432c在THP-1细胞中的存活率显著降低；雷帕霉素处理诱导自噬能进一步降低ΔBCG_2432c在在巨噬细胞内的存活，当用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬后ΔBCG_2432c在巨噬细胞内的存活率增加。这表明巨噬细胞自噬显著降低本发明构建的ΔBCG_2432c在巨噬细胞内的存活。
实施例13
检测野生型BCG和ΔBCG_2432c对APCs抗原递呈能力的改变
(1)常规分子生物学方法纯化抗原Ag85B
(2)Ag85B免疫小鼠，使小鼠体内产生被85B致敏的T细胞。
1)Ag85B-DMT配置(膜法)：参考Teng’paper，配置DMT佐剂(100μl/250μg/dose)。具体做法为：称取DMT置于无菌培养皿中，用氯仿和甲醇(9:1)溶解，然后在通风橱中晾干。向培养皿中加入已经水浴至60℃的无菌PBS，然后将培养皿置于60℃水浴锅中，水浴1h，此间不断吹打，使得DMT溶解均匀。1h后根据需要配置的用量稀释至(100μl/250μg/dose)。
2)根据纯化的85B的浓度，用PBS稀释，使得100μl中含有20μg 85B。将稀释后的佐剂和稀释后的蛋白混合均匀并剧烈震荡，使得佐剂充分包裹蛋白。
3)购买6-8周龄，SPF级，雌性BALB/c(H-2d)小鼠10只；适应性饲养1周后，按照下图所示实验方案隔在实验开始时采用背部两点法皮下接种Ag85B-DMT 200μl(含有250μgDMT，20μg85B)，在第3周再接种一次。同时，设置PBS对照组(10只)，处理方法同实验组。
4)首次免疫9周后即可择机处死小鼠，无菌游离脾脏，在BD滤网上研磨，获得单细胞悬液。然后使用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，最后进行磁珠分选出CD4+T和CD8+T细胞备用。
(3)分离诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞(Φ)和树突状细胞(DCs)
1)处死6-8周BALB/c小鼠，冲洗出骨髓细胞，离心400g×5min；
2)弃上清，加入3ml红细胞裂解液，室温裂解5min；
3)10ml1％FBS-PBS中和，400g×5min；
4)1％FBS-PBS洗两遍；
5)用预热的RPMI1640+10％FBS完全培养基重悬骨髓细胞，调整浓度为1×106/ml；
6)3ml/孔种于六孔板中，预诱导成为DCs的孔加入20ng/ml rmGM-CSF和20ng/mlrmIL-4(预诱导成为Φ的孔加入20ng/ml rmGM-CSF)，置于37℃，5％CO2条件下培养，记做Day0；
7)Day3：吸出1.5ml培养基，加入2ml新鲜的RPMI1640+10％FBS完全培养，并补加20ng/ml rmGM-CSF和或20ng/ml rmIL-4；
8)Day5：吸出1.5ml培养基，加入2ml新鲜的RPMI1640+10％FBS完全培养，并补加20ng/ml rmGM-CSF和或20ng/ml rmIL-4；
9)Day6：收集使用，此即未成熟的BMDCs或BMDMs。
(4)使用野生型BCG或本发明构建的ΔBCG_2432c，MOI＝5感染BMDCs或BMDMs(设置3MA处理组，方法同实例9所示)，1h后弃掉培养基，使用PBS洗涤细胞，加入新的培养基。
(5)将分离得到的CD4+T或CD8+T覆盖在(4)中小鼠骨髓来源的BMDCs或BMDMs表面(5:1)，置于37℃，5％CO2条件下共孵育24h。
(6)收集上清液，利用ELISA试剂盒检测上清液中IL-2的水平。
(7)结果分析：因为抗原递呈细胞(APCs)在将抗原肽递呈给T细胞的时候会释放IL-2，通过检测IL-2的水平可以间接反映抗原递呈能力；结果如图6显示，图6(A)为实验流程和方案；(B-D)为ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著增加小鼠来源的树突状细胞经自噬-溶酶体途径的抗原递呈活化CD4+T细胞；(E-G)为ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著增加小鼠来源的巨噬细胞经自噬-溶酶体途径的抗原递呈,活化CD4+T细胞；可以看出，相对于野生型BCG，本发明构建的ΔBCG_2432c感染APCs与Ag85B特异性的CD4+T共孵育释放更多的IL-2细胞，这表明ΔBCG_2432c增强了APCs的抗原递呈能力(P＜0.05)；另外使用3MA抑制自噬，ΔBCG_2432c感染APCs抗原递呈降低(P＜0.05)，这表明ΔBCG_2432c对APCs抗原递呈能力的改变与其诱导的自噬有关。
实施例14
检测相对于野生型BCG，ΔBCG_2432c对小鼠免疫保护性的改变
(1)选用6-8周龄，雌性，C57B/6小鼠。适应性饲养一周后，随机分为三组：PBS对照组，BCG免疫组和ΔBCG_2432c免疫组。
(2)培养BCG和ΔBCG_2432c与对数生长期，制备细菌悬液(方法同实例10)，皮下免疫BCG或者ΔBCG_2432c 106(100μl)，对照组使用同等体积的PBS。
(3)分别在免疫后的14d，28d，60d，分别使用100CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv感染小鼠，感染四周后处死小鼠，无菌游离出小鼠脾脏和肺脏进行菌落计数和肺脏病理评估。
(4)结果分析：如图7所示，ΔBCG_2432c和野生型BCG免疫小鼠抗结核分枝杆菌的保护性比较。图7(A)为野生型BCG和本发明构建的ΔBCG_2432c在免疫小鼠14天时诱导的小鼠抵抗H37Rv感染的能力相似。(B)免疫28d后，ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著降低小鼠肺脏和脾脏荷菌量并显著改善肺脏病理。(C)免疫60d后，ΔBCG_2432c相对于野生型BCG显著降低小鼠肺脏和脾脏荷菌量并显著改善肺脏病理。因此，ΔBCG_2432c相对于野生型BCG免疫后，抵抗M.tb感染的能力显著增强。
实施例15
利用SCID小鼠检测相对于野生型BCG，ΔBCG_2432c的安全性
(1)实验动物选用SPF级SCID小鼠，雄性，6-8周龄，18-20g，随机分3组：PBS对照组，BCG感染组和ΔBCG_2432c感染组。
(2)细菌悬液制备方法同实例10所示，尾静脉感染SCID小鼠(106CFU/200μl，200μl/只)。
(3)尾静脉感染后四个时间点(2W，4W，8W，12W)，各时间点处死3只小鼠；各组5只小鼠饲养至小鼠全部死亡，观察小鼠幸存情况。
(4)结果分析：野生型BCG组和本发明构建的ΔBCG_2432c组肝脏、脾脏和肺脏的荷菌量以及小鼠的生存情况相似，因此，本发明构建的ΔBCG_2432c相对于野生型BCG的安全性无变化。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种重组卡介苗及其构建与应用
<141> 2019-05-09
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1209
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtgactgtga ccctgtgtag cccgaccgag gacgactggc cggggatgtt cctactggcc 60
gcggccagtt tcaccgattt catcggccct gaatcagcga ccgcctggcg gaccctggtg 120
cccaccgacg gagcggtggt ggtccgcgat ggtgccggcc cgggttctga ggtggtcggg 180
atggcgctgt acatggatct gcggttgacg gtgcctggtg aagtggtgct cccgaccgcc 240
ggtctcagtt tcgtcgcggt ggcgccgacg catcgccggc gcggcttgct gcgcgcgatg 300
tgcgccgaac tgcaccgccg catagccgat tccggctatc cggtcgcggc actgcatgct 360
agcgagggcg gcatctacgg ccggttcggc tacgggcccg ctaccacctt gcatgagctg 420
acggtcgacc gacgcttcgc gcgctttcac gccgacgcac cgggcggcgg cctaggtggc 480
agcagcgtcc ggttggtcag acccaccgag catcgcggcg agtttgaggc gatctacgag 540
cgatggcgcc agcaggtgcc gggcgggctg ctacgcccgc aggtgctctg ggacgagctg 600
ctggcagaat gcaaagccgc gcccggtgga gaccgtgaat cgttcgcgtt actgcatccc 660
gacgggtacg cgctgtaccg ggtggatcgc accgatctca agctagcgcg cgtcagcgaa 720
ctcagggcgg taaccgcaga tgcgcattgt gcgttgtggc gggccctgat tggcctcgac 780
tccatggagc gaatcagcat catcacccat ccacaggacc cgttacccca cctgctcacc 840
gatacccgac tggcccgcac tacctggcgc caggacggcc tgtggttgcg catcatgaac 900
gtaccggccg cactcgaggc gcgtggttac gctcacgaag ttggcgagtt ttccacggtc 960
ctcgaggtat ccgatggcgg ccggttcgcg ctcaagatcg gtgacggccg tgcgcggtgt 1020
accccgaccg atgcggcagc cgagatcgaa atggatcggg acgtactggg cagcctttac 1080
cttggagcgc accgcgcttc gacgttagcc gccgctaacc ggttgcgcac caaagattcc 1140
cagctgcttc gtcgactcga cgcggcgttt gccagtgatg ttcccgtcca gaccgcgttc 1200
gagttctga 1209

Claims (5)

1.一种重组卡介苗，其特征在于，其为敲除卡介苗中抑制自噬基因后的敲除型BCG菌株；
所述抑制自噬基因为BCG_2432c ；所述BCG_2432c的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种构建权利要求1所述重组卡介苗的方法，其特征在于，是将卡介苗中抑制自噬基因的BCG_2432c基因进行敲除。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，采用分子生物克隆技术从BCG基因组中敲除BCG_2432c基因，制备得到基因敲除菌株ΔBCG_2432c。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）设计BCG_2432c的左臂引物和右臂引物，分别PCR扩增得到含有VAN91I酶切位点的左臂序列和右臂序列，所述左臂序列包括BCG_2432c开放阅读框前端184bp，所述右臂序列包括BCG_2432c开放阅读框后端40bp；将PCR产物和质粒p0004s使用VAN91I酶切并构建重组质粒p0004s-BCG_2432c；
（2）将重组质粒p0004s-BCG_2432c和phAE159质粒使用PacI酶切，并将酶切后的片段连接后转化进入E.coliHB101宿主细胞，在含有潮霉素抗性的平板上培养并挑选阳性克隆；将阳性克隆接种到含有潮霉素的LB液体培养基中增菌培养并抽提质粒；将抽提后的质粒电转化进入耻垢分枝杆菌感受态中筛选空斑；挑取空斑制备噬菌体并感染BCG菌株，在含有潮霉素抗性的7H11平板上筛选得到目的基因敲除的菌株ΔBCG_2432c。
5.如权利要求1所述的重组卡介苗在制备结核病疫苗中的应用。
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