WO2005051425A1

WO2005051425A1 - プロカスパーゼ１活性化阻害剤

Info

Publication number: WO2005051425A1
Application number: PCT/JP2004/017586
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Doi; Shoichi Masuda; Yoshitaka Isumi
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2005-06-09
Also published as: JPWO2005051425A1; EP1693070A1; US20070111934A1

Abstract

　ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することを特徴とする、プロカスパーゼ１の多量体化の阻害方法および阻害剤、プロカスパーゼ１の活性化の阻害方法および阻害剤、カスパーゼ１の生成の阻害方法および阻害剤、炎症性疾患の防止方法および／または治療方法、炎症性疾患の防止剤および／または治療剤、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物の同定方法、並びに該同定方法に用いる試薬キットを提供した。

Description

明細書

プロカスパーゼ 1活性ィ匕阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase— 1)の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ 1の多量体ィヒ阻害方法、プロカスパーゼ 1の活性ィヒ阻害方法およびカスパーゼ l (caspase— 1)の生成阻害方法に関する。また、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。さらに、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物の同定方法に関する。また、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ 1の多量体ィヒ阻害剤、プロカスパーゼ 1の活性ィヒ阻害剤およびカスパーゼ 1の生成阻害剤、あるいは炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。さらに、 NOD2、 NOD2をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つと、プロカスパーゼ 1、プロカスパーゼ 1をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくとも、ずれか 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

背景技術

[0002] カスパーゼ 1は、インターロイキン 1 β転換酵素（interleukin— 1 β -converting e nzyme ;ICE)とも呼ばれ、炎症性サイト力インであるインターロイキン 1 (以下、 IL 1 βと略称する）やインターロイキン 18 (以下、 IL-18と略称する）をその前駆体力成熟型へと変換するシスティンプロテアーゼである（非特許文献 1 4)。カスパーゼ 1遺伝子は炎症性刺激、例えばリポポリサッカライド (以下、 LPSと略称する）で誘導され、カスパーゼ 1活性も同様の刺激で増加する（非特許文献 4 6)。また、種々の炎症性疾患、例えば、敗血症、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease)、リウマチ等にお 1、て、カスパーゼ 1活性の促進が報告されて、る。

[0003] カスパーゼ 1は、カスパーゼ 1前駆体として発現するプロカスパーゼ 1が多量体化を起こし、それに伴う自己切断により生成されると考えられている。この過程において、プロカスパーゼ 1の多量体化は、 RIP2または NODIがプロカスパーゼ 1と結合することで誘導されることが報告されてヽる（非特許文献 7および 8)。

以下に本明細書において引用した文献を列記する。

特許文献 1：国際公開第 WO01Z67299号パンフレット。

非特許文献 1：「ネイチヤー（Nature)」、 1992年、第 356卷、 p. 768—774。

非特許文献 2 :「サイエンス（Science)」、 1992年、第 256卷、 p. 97— 100。

非特許文献 3 :「ネイチヤー」、 1997年、第 386卷、 p. 619— 623。

非特許文献 4:「サイエンス」、 1997年、第 275卷、 p. 206—209。

非特許文献 5 :「ネイチヤー」、 1994年、第 370卷、 p. 270— 275。

非特許文献 6 :「ブラッド（Blood)」、 1998年、第 91卷、 p. 577— 584。

非特許文献 7 :「カレントバイオロジー（Current Biology)」、 1998年、第 8卷、 p.

885—888。

非特許文献 8 :「バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ (Biochemical ana Biophysical Research Communicationsノ」、 2002 年、第 299卷、 p. 652—658。

非特許文献 9 :「ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolog ical Chemistry)」、 2002年、第 277卷、 p. 41701—41705。

非特許文献 10 :「ガット（Gut)」、 2003年、第 52卷、 p. 840—846。

非特許文献 11 :「ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー」、 2001年、第 276 卷、 p. 4812—4818。

非特許文献 12 :ウルマー（K. M. Ulmer)、「サイエンス（Science )」、 1983年、第 219卷、 p. 666—671。

非特許文献 13 :「ペプチド合成」、丸善株式会社、 1975年。

非特許文献 14：「ペプチドシンテシス (Peptide Synthesis)」、インターサイエンス

(Interscience)、ニューヨーク (New York；)、 1996年。

非特許文献 15 :「セル（Cell)」、 1995年、第 80卷、 p. 401—411。

非特許文献 16 :「サイエンス」、 1995年、第 267卷、 p. 2000—2003。

非特許文献 17 :「プロシーディンダスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブアメリカ（Proceedings of The National Academy of Sciences of l he United states of America )」、 2001年、第 98卷、 p l 3249— 13254。

非特許文献 18 :「ネイチヤー」、 2003年、第 423卷、 p. 356— 361。

非特許文献 19 :「バイオケミカルファーマコロジー（Biochemical Pharmacology)

」、 2002年、第 64卷、 p. 1—8。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明の課題は、プロカスパーゼ 1と結合してこれの多量体ィ匕を促進し、これを活性ィ匕する新たな蛋白質を見出し、該蛋白質とプロカスパーゼ 1の結合を阻害することにより、プロカスパーゼ 1の多量体化阻害、プロカスパーゼ 1の活性ィヒ阻害および力スパーゼ 1の生成阻害、ひいては炎症性疾患の防止および Zまたは治療を可能にする手段を提供することである。

課題を解決するための手段

[0006] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、プロカスパーゼ 1が NOD2と相互作用することをインシリコ（in silico)で予測し、そして NOD2とプロカスパーゼ 1が結合することにより、プロカスパーゼ 1の多量体ィヒが促進され、その結果プロカスパーゼ 1からカスパーゼ 1への活性ィ匕およびカスパーゼ 1の生成が引き起こされることを実験的に証明して本発明を完成した。

[0007] すなわち本発明は、以下の群より選ばれる阻害方法に関する；

(i) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase— 1)の結合を阻害することを特徴とするプ口カスパーゼ 1の多量体化阻害方法、

(ii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase— 1)の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ 1の活性ィヒ阻害方法、

および

(iii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase— 1)の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ 1 (caspase— 1)の生成阻害方法。

[0008] また本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および zまたは治療方法に関する。

[0009] さらに本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ用いることを特徴とする炎症性疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0010] さらにまた本発明は、炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである前記防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0011] また本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を可能にする条件下、 NO D2および Zまたはプロカスパーゼ 1を化合物と接触させ、 NOD2とプロカスパーゼ 1 の結合を検出することができるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用 V、て、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在および Zまたは変化を検出することにより、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する力否かを決定する方法に関する。

[0012] さらに本発明は、以下の群より選ばれる阻害剤に関する；

(i) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とするプ口カスパーゼ 1の多量体化阻害剤、

(ii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ 1の活性ィ匕阻害剤、

および

(iii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ 1 (caspase— 1)の生成阻害剤。

[0013] さらにまた本発明は、以下の群より選ばれる阻害剤に関する；

(i) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含有するプロカスパーゼ 1の多量体ィヒ阻害剤、

(ii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含有するプロカスパーゼ 1の活性ィ匕阻害剤、

および

(iii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含有するカスパーゼ 1 (caspase— 1)の生成阻害剤。

[0014] また本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0015] さらに本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含有する炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する

[0016] さらにまた本発明は、前記阻害剤を含有する炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0017] また本発明は、炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである前記いずれかの防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0018] さらに本発明は、 NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合阻害によるプ口カスパーゼ 1の多量体ィ匕阻害を特徴とする、炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0019] また本発明は、炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである前記防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0020] さらに本発明は、前記同定方法に用いることを特徴とする試薬キットであって、 NO D2、 NOD2をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つと、プロカスバーゼ 1 (procaspase—l)、プロカスパーゼ 1をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレォチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

発明の効果

[0021] 本発明では NOD2がプロカスパーゼ 1と結合することを見出した。すなわち、 NOD 2とプロカスパーゼ 1が結合することにより、プロカスパーゼ 1の多量体ィヒが促進され、その結果プロカスパーゼ 1からカスパーゼ 1への活性化およびカスパーゼ 1の生成が引き起こされることを初めて明らかにした。カスパーゼ 1は炎症性反応に関与する因子であり、炎症性疾患においてその活性の促進が報告されている。これらから、 NO D2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害することを特徴とする本発明は、炎症性疾患の防止および zまたは治療のために非常に有用である。

図面の簡単な説明

[図 1-A]FLAG— procaspase— 1 (C285A)発現用プラスミドのみ、 NOD2— myc— Hi s発現用プラスミドのみ、または両方を組み合わせてトランスフエクシヨンした細胞から作製した細胞溶解液における各蛋白質の発現量を示す図である。蛋白質の検出はウェスタンブロッテイング (WB)により行った。（実施例 2)

[図 1— B]左図は、 NOD2— myc— Hisと FLAG— procaspase— 1 (C285A)を共発現させた細胞カゝら作製した細胞溶解液にっヽて抗 FLAG M2抗体を用いて免疫沈降 (I P)した結果、 NOD2— myc— Hisのバンドが検出されたことを示す図である。右図は、上記細胞溶解液にっ、て抗 myc抗体で免疫沈降した結果、 NOD2— myc— Hisと F LAG— procaspase— 1 (C285A)を共発現させた細胞溶解液でのみ、 FLAG— proc aspase-1 (C285A)のバンドが検出されたことを示す図である。蛋白質の検出はゥエスタンブロッテイング (WB)により行った。（実施例 2)

[図 2- A]FLAG— procaspase— 1 (C285A)発現用プラスミドおよび Myc— procaspas e-1 (C285A)発現用プラスミドと図示した濃度の NOD2-myc発現用プラスミドとをトランスフエクシヨンした細胞カゝら作製した細胞溶解液を抗 FLAG抗体で処理して得た画分にお!、て、抗 myc抗体で検出されるバンドの量が NOD2— myc発現用プラスミド量依存的に増カロしたことを説明する図である。（実施例 3)

[図 2- B]FLAG— procaspase— 1 (C285A)発現用プラスミドおよび Myc— procaspas e-1 (C285A)発現用プラスミドと図示した濃度の NOD2-myc発現用プラスミドとをトランスフエクシヨンした細胞力作製した細胞溶解液における各蛋白質の発現量を示す図である。（実施例 3)

[図 3]FLAG— procaspase— 1発現プラスミドと NOD2— myc発現プラスミドとを共発現させた細胞において、 NOD2— mycの発現量依存的に細胞内 IL 1 β量の増加が認められたことを説明する図である。（実施例 4)

[図 4]FLAG— procaspase— 1発現プラスミド（0. 5 g)と NOD2発現プラスミドとを共発現させた細胞において、 NOD2発現プラスミド量依存的に、細胞外への IL 1 分泌量が増加したことを説明する図である。図中、ベクターとは、各細胞に導入する DN A量を一定にするために加えた空ベクターを意味する。（実施例 4)

発明を実施するための最良の形態

[0023] 以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。

本明細書にぉヽては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたぺプチド結合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むものである。以降、ァミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

[0024] 本発明においては、 NOD2がプロカスパーゼ 1と相互作用することを、国際公開 W 001/67299号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。そして実験的に、 NOD2がプロカスパーゼ 1と結合することを明らかにした。さらに、 NOD2とプ口カスパーゼ 1が結合することにより、プロカスパーゼ 1の多量体ィヒが促進され、その結果プロカスパーゼ 1からカスパーゼ 1への活性化およびカスパーゼ 1の生成が引き起こされ、細胞内で IL - 1 β前駆体 (proIL - 1 β )のカスパーゼ依存的な切断が誘導されて成熟型 IL 1 βの分泌が促進されることを初めて明らかにした。

[0025] NOD2は、 CARD15とも呼ばれ、単球 (非特許文献 9)、好中球 (非特許文献 9)、白血球 (非特許文献 9)、顆粒球 (非特許文献 9)、榭状細胞 (非特許文献 9)、腸上皮細胞 (非特許文献 9および 10)、およびマクロファージ (非特許文献 10)で発現してヽること、急性前骨髄球性白血病細胞株 HL— 60や正常大腸細胞株 FHCでは LPSや腫瘍壊死因子 α (以下、 TNF - αと略称する）等の炎症刺激で NOD2遺伝子が増加することが報告されている（非特許文献 9)。 NOD2の機能としては、 NOD2遺伝子を HL— 60細胞に一過性発現させることにより NF— κ Βが活性ィ匕されることが報告されている（非特許文献 11)。し力しながら、 NOD2がプロカスパーゼー 1と結合して機能するという報告はない。

[0026] これらから、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害することにより、プロカスパーゼ 1の多量体化、プロカスパーゼ 1の活性化およびカスパーゼ 1の生成を阻害でき、その結果、カスパーゼ 1の増加により発症 ·進展する炎症性疾患の防止および Ζまたは治療が可能になる。

[0027] これら知見に基づ!/、て、本発明にお、ては、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害することを特徴とする、プロカスパーゼ 1の多量体ィ匕阻害方法、プロカスパーゼ 1の活性化阻害方法およびカスパーゼ 1の生成阻害方法、並びにカスパーゼ 1の増加に基づく疾患、具体的には炎症性疾患の防止方法および Zまたは治療方法を提供する。

[0028] NOD2遺伝子および該遺伝子がコードするポリペプチドは、それぞれ配列表の配列番号 1および配列番号 2に記載の各配列からなる。プロカスパーゼ 1遺伝子および該遺伝子がコードするポリペプチドは、それぞれ配列表の配列番号 3および配列番号 4に記載の各配列からなる。 NOD2、プロカスパーゼ 1およびこれらの遺伝子は上記各配列からなるものに限らず、一般に知られている NOD2およびプロカスパーゼ 1 の機能を有する限りにお、て、上記各配列にぉ、て 1乃至数個の変異を有するポリペプチドおよびポリヌクレオチドであることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために、上記各配列に 1乃至数個の変異を導入した変異体であることもできる。

[0029] 「NOD2とプロカスパーゼ 1の結合」とは、 NOD2とプロカスパーゼ 1が複合体を形成するように、水素結合、疎水結合および静電的相互作用等の非共有結合により、 NOD2とプロカスパーゼ 1が相互作用することを意味する。ここでの結合とは、 NOD 2とプロカスパーゼ 1がそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、 N OD2またはプロカスパーゼ 1を構成するアミノ酸の中に、 NOD2とプロカスパーゼ 1 の結合に関与しな、アミノ酸が含まれて、てもよ、。

[0030] NOD2とプロカスパーゼ 1の結合は、免疫沈降法による共沈物の確認、ツーハイブリツド法、ウェスタンブロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより検出され得る。

[0031] 例えば、実施例 2に示すように、 C末に myc-His-tagが付加された NOD2と N末に FLAG— tagが付カ卩されたプロカスパーゼ 1との結合を、両ポリペプチドの共存下において、抗 myc抗体または抗 FLAG M2抗体を用いて免疫沈降した共沈物を抗 F LAG M2抗体または抗 myc抗体を用いてウェスタンブロッテイングすることにより検出され得る。

[0032] 「プロカスパーゼ 1の多量体化」とは、プロカスパーゼ 1同士が結合し、該結合により複合体を形成することを意味する。多量体化は、 NOD2とプロカスパーゼ 1とが結合することにより促進される。また、プロカスパーゼ 1が有するカスパーゼリクルートメントドメイン（Caspase recruitment domain; CARD)力多量体化に重要な役割を果たしていることが知られている。該複合体を構成するプロカスパーゼ 1の分子数は特に制限されず、プロカスパーゼ 1が自己を切断し、その結果、カスパーゼ 1が生成される程度に、プロカスパーゼ 1同士が結合し、複合体を形成すればよい。

[0033] 「プロカスパーゼ 1の活性ィ匕」とは、プロカスパーゼ 1の多量体化に伴い、プロカスバーゼ 1が自己切断され、カスパーゼ 1が生成されることを意味する。 NOD2とプロカスパーゼ 1とが結合することによりプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕が促進され、それに伴う自己切断が起こり、その結果、カスパーゼ 1が生成される。

[0034] 「カスパーゼ 1の生成」とは、プロカスパーゼ 1が活性化された結果、カスパーゼ 1が生成されることを意味する。

[0035] プロカスパーゼ 1の多量体化阻害、プロカスパーゼ 1の活性化阻害およびカスパーゼ 1の生成阻害は、例えば、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ここでは、このような阻害効果を有する化合物（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる)を阻害剤と称する。

[0036] NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量ィ匕合物が挙げられる。 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。

[0037] NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物として、例えば、 NOD2とプロカスパーゼ 1が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示できる。かかるポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害し、ひいてはプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕およびプロカスパーゼ 1の自己切断を阻害することができる。かかるポリべプチドは、 NOD2またはプロカスパーゼ 1のアミノ酸配列から設計し、自体公知のぺプチド合成法により合成したものから、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害するものを選択することにより得ることができる。このように特定されたポリペプチドに、 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、 NOD2とプロカスバーゼ 1の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよぐまた変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー (Ulmer)の技術（非特許文献 12)を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質 (物性、機能または免疫学的活性等)を変化させな、と、う観点から、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミドィ匕修飾する等、機能の著しい変更を伴わな、程度に改変が可能である。

[0038] 上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。

例えば、成書 (非特許文献 13および 14)に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えば Fmoc法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え DNA (発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフエクシヨンして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次ヽで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造可能である。

[0039] NOD2とプロカスパーゼ 1の結合の阻害は、 NOD2またはプロカスパーゼ 1を認識する抗体であって、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する抗体を用いることによっても実施可能である。かかる抗体は、 NOD2またはプロカスパーゼ 1自体、またはこれらの断片ポリペプチド、好ましくは NOD2とプロカスパーゼ 1が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。

NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物は、自体公知の医薬品スクリーユングシステムを利用して当該化合物の同定方法を構築し、これを使用して取得可能である。例えば、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を可能にする条件を選択し、当該条件下で、調べようとする化合物 (被検化合物）と NOD2および Zまたはプロカスパーゼ 1とを接触させ、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を検出することができるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物を同定できる。例えば NOD2とプロカスパーゼ 1の結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカー力被検化合物を NOD2および Zまたはプロカスパーゼ 1と接触させたときに消失する、あるいは低減する等の変化を示した場合、当該被検化合物は NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害するものであると判定できる。力かる同定方法において、被検化合物を NOD2および Zまたはプロカスパーゼ 1と予め接触させ、その後に NOD2とプロカスパーゼ 1を結合させることも可能であり、または被検化合物をこれらの結合の過程に共存させることも可能である。 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を可能にする条件は、インビトロのものであつてよぐインビボのものであってもよい。例えば、 NOD2とプロカスパーゼ 1とを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における共発現は、 NOD2をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとプロカスパーゼ 1をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクシヨンすることにより達成できる。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼゃ放射性同位体等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のェピトープタグ、例えば 6 X His— tag等、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマ一力一の検出方法は当業者には周知のものである。 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合は、簡便には、これら蛋白質の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により判定可能である。蛋白質の検出あるいは蛋白質量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッテイング法等を用いて実施できる。

[0041] 具体的には、例えば NOD2またはプロカスパーゼ 1の一方を固相化し、他方をシグナルで標識ィ匕して用いて結合反応を行、、標識シグナルを定量的に測定すると、つた当業者に知られた一般的なインビトロ (in vitro)における結合実験系に、被検化合物を加えて評価することにより、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物を得ることができる。

[0042] あるいは、実施例 2に示したように、 NOD2遺伝子およびプロカスパーゼ 1遺伝子を共発現させた細胞を用ヽて細胞内における結合反応を検出する試験系に、被検化合物を作用させ、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を免疫沈降法やウェスタンブロッティング等の公知方法で検出することによって、インビボ（in vivo)において NOD2 とプロカスパーゼ 1の結合を阻害する化合物を得ることができる。

[0043] また、公知のツーハイブリッド (two— hybrid)法を用いることも可能である。例えば、 NOD2と DNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、プロカスパーゼ 1 と転写活性ィ匕蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続した lacZ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより達成できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合には、該被検化合物には NOD2とプロカスパーゼ 1との結合を阻害する作用があると判定できる。

[0044] ビアコアシステム（BIACORE system)等の表面プラズモン共鳴センサー、シンチレーシヨンプロキシミティアツセィ法（Scintillation proximity assay、SPA)、あるいは光共鳴エネノレ³ r ~~ 移、 Fluorescence resonance energy transfer ^ FRET)を応用した方法を用いて、 NOD2とプロカスパーゼ 1との結合を阻害する化合物を同定することも可能である。 [0045] また、 NOD2によるプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕を可能にする条件を選択し、該条件下で NOD2および Zまたはプロカスパーゼ 1と被検化合物を接触させ、次いで、 N OD2によるプロカスパーゼ 1の多量体化を検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在、不存在、またはその変化を検出することにより、 NOD2によるプロカスパーゼ 1の多量体化を阻害する化合物を同定可能である。例えば、実施例 3に示したように、 NO D2遺伝子またはプロカスパーゼ 1遺伝子を共発現させた細胞を用いて細胞内におけるカスパーゼ 1の多量体化を測定する実験系を用いて、 NOD2によるプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕を阻害する化合物を同定可能である。

[0046] また、 NOD2によるプロカスパーゼ 1の活性ィ匕を可能にする条件を選択し、該条件下で NOD2および Zまたはプロカスパーゼ 1と被検化合物を接触させ、次いで、 NO D2によるプロカスパーゼ 1の活性ィ匕を検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび/またはマーカーの存在、不存在、またはその変化を検出することにより、 NOD2によるプロカスパーゼ 1の活性ィ匕を阻害する化合物を同定可能である。例えば、実施例 4に示したように、 NOD2遺伝子およびプロカスパーゼ 1遺伝子が共発現する IL 1 β安定発現細胞外に分泌される IL—1 β量を低減させる、または消滅させる化合物を選択することにより、 NOD2によるプロカスパーゼ 1の活性ィ匕を阻害する化合物を同定可能である。 NOD2によるプ口カスパーゼ 1の活性ィ匕を阻害することにより、プロカスパーゼ 1の自己切断による力スパーゼ 1の生成が阻害されるため、該化合物はカスパーゼ 1の生成を阻害する化合物としても用い得る。

[0047] NOD2およびプロカスパーゼ 1は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料カゝら調製したものであつてよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、 NOD2とプロカスバーゼ 1の結合、およびこれら蛋白質の機能、さらにプロカスパーゼ 1からその活性ィ匕により生成されるカスパーゼ 1の性質等に影響がなければ、 Ν末側や C末側に別の蛋白質やポリペプチド、例えば j8—ガラクトシダーゼ、 IgG等の免疫グロブリン Fc断片、 His— tag、 Mvc— tag、 HA— tag、 FLAG— tag、または Xpress— tag等の tagペプチド類を、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付カ卩したものであってもよ、。

[0048] NOD2とプロカスパーゼ 1の結合または NOD2によるプロカスパーゼ 1の多量体化を阻害する化合物の同定においては、該結合によるプロカスパーゼ 1の多量体化に伴うプロカスパーゼ 1の自己切断により、該結合または該多量体ィ匕の検出が困難になる場合がある。かかる場合は、結合または多量体ィ匕を容易に検出するために、 NO D2と結合して多量体ィ匕するが自己切断されないプロカスパーゼ 1変異体、例えばそのアミノ酸配列 285番目のシスティンをァラニンに置換した変異体を作製して用いることちでさる。

[0049] 被検化合物としては、例えばィ匕学ライブラリーや天然物由来の化合物、または NO D2またはプロカスパーゼ 1の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られたィ匕合物等も被検化合物として好適である。

[0050] 上記同定方法で得られた化合物は、プロカスパーゼ 1の多量体ィヒ阻害剤、プロカスパーゼ 1の活性ィ匕阻害剤およびカスパーゼ 1の生成阻害剤として利用可能である。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、複数を組み合わせて使用することも可能である。

[0051] 上記化合物および上記阻害剤はさらに、カスパーゼ 1の作用やその増加に基づく疾患の防止剤および Zまたは治療剤、並びに当該疾患の防止方法および Zまたは治療方法に利用可能である。かかる疾患としては、例えば敗血症、炎症性腸疾患、クローン病およびリウマチ等を挙げることができる。

[0052] 敗血症は、細菌や毒素（エンドトキシンやェキソトキシン等)等の刺激によって遊離された炎症性サイト力インによって惹起される生体の過剰な反応、すなわち感染に起因した全身'性炎正反心'症 (systemic inflammatory response syndrome )である。カスパーゼ 1遺伝子欠損マウスでは、エンドトキシンショックに対する抵抗性が増すことが報告されている（非特許文献 15)。また、カスパーゼ 1遺伝子欠損マウス力も調製されたマクロファージゃ単球で、 LPSで誘導される IL— 1 βおよび IL 18の産生がほぼ完全に抑制されることが報告されている（非特許文献 4、 15および 16)。これらから、カスパーゼ 1の活性を阻害することにより、マクロファージゃ単球力分泌される IL— 1 βおよび IL— 18の産生増加を介して起こるエンドトキシンショックを抑制し得ると考えられる。一方、 NOD2遺伝子も単球やマクロファージで発現が確認されている（非特許文献 9および 10)。したがって、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害し、ひいてはプロカスパーゼ 1の多量体化阻害、プロカスパーゼ 1の活性化阻害およびカスパーゼ 1の生成阻害により敗血症の防止および Zまたは治療が可能になると考える。

[0053] 炎症性腸疾患は、多くは慢性に経過し、難治性の種々の病因（クローン病等）によつて生じる大腸や小腸の炎症性疾患を指す。正常マウスにデキストラン硫酸 (以下、 DSSと略称する）を慢性投与した場合には大腸炎を発症するが、カスパーゼ 1遺伝子欠損マウスに DSSを慢性投与した場合には大腸炎を発症しないこと、 DSS投与したカスパーゼ 1遺伝子欠損マウス力も調製した大腸組織培養の IL 1 βおよび IL 1 8分泌量は、 DSS投与した正常マウスに比して有意に減少していることが報告されている（非特許文献 17)。これらの結果は、大腸炎の発症 '進展にカスパーゼ 1活性の増加とそれに伴う IL 1 βおよび IL 18分泌の増加が重要である可能性を示すものである。一方、 NOD2遺伝子も腸上皮細胞やマクロファージで発現が確認されている（非特許文献 10)。したがって、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害し、ひいてはプロカスパーゼ 1の多量体化阻害、プロカスパーゼ 1の活性化阻害およびカスパーゼ 1の生成阻害により炎症性腸疾患の防止および Zまたは治療が可能になると考える。

[0054] リウマチは、関節の滑膜に存在するマクロファージ力分泌されるサイト力インによつて進行し、 IL-1 βや IL 18もリウマチの進行に寄与していることが報告されている（非特許文献 18)。また、コラーゲンで誘導される関節炎モデルマウスにカスパーゼ 1 阻害剤を投与すると炎症が抑制されることが報告されている (非特許文献 19)。これらの事実は、滑膜のマクロファージにおけるカスパーゼ 1活性の増加とそれに伴う IL -1 βおよび IL 18分泌の増加がリウマチの進行に寄与している可能性を示すものである。実際、リウマチ治療薬としてカスパーゼ 1阻害剤（Pralnacasan、 Vertex社）が臨床試験第 2相の進行中である。 NOD2が滑膜に存在するマクロファージに発現しているという報告はない。し力しながら、大腸に存在するマクロファージに発現しているという報告がある（非特許文献 10)。したがって、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害し、ひいてはプロカスパーゼ 1の多量体化阻害、プロカスパーゼ 1の活性化阻害およびカスパーゼ 1の生成阻害によりリウマチの防止および Zまたは治療が可會こなると考える。

[0055] 本発明に係る疾患の防止剤および Zまたは治療剤として、 NOD2とプロカスパーゼ 1との結合阻害によるプロカスパーゼ 1の多量体化阻害、 NOD2とプロカスパーゼ 1との結合阻害によるプロカスパーゼ 1の活性化阻害、および NOD2とプロカスパーゼ 1との結合阻害によるカスパーゼ 1生成阻害のうち少なくともいずれか 1つの阻害を特徴とする、防止剤および Zまたは治療剤を例示できる。好ましくは、 NOD2とプロカスパーゼ 1との結合阻害によるプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕阻害を特徴とする、防止剤および Zまたは治療剤を挙げられる。かかる疾患として、炎症性疾患、好ましくは、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病、リウマチを例示できる。このような防止剤および/または治療剤として、例えば上記プロカスパーゼ 1の多量体化阻害剤、上記プ口カスパーゼ 1の活性ィヒ阻害剤、および上記カスパーゼ 1の生成阻害剤のうち少なくともいずれか 1つを有効成分としてその有効量含む、炎症性疾患の防止剤および Z または治療剤を例示することができる。

[0056] 本発明に係る疾患の防止剤および Zまたは治療剤は、上記化合物、上記プロカスパーゼ 1の多量体化阻害剤、上記プロカスパーゼ 1の活性化阻害剤および上記カスパーゼ 1の生成阻害剤のうち少なくともいずれか 1つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、 1種または 2種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ま、。

[0057] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される力通常約 0. 00001— 70重量％、好ましくは 0. 0001— 5重量％程度の範囲とするのが適当である。

[0058] 医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。

[0059] 例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、力ゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヮセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。

[0060] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 pH調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することちでさる。

[0061] 安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記 L アミノ酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなぐイオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシェチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

[0062] 緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸および zまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、力ルシゥム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等を例示できる。

[0063] 等張化剤としては、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。

[0064] キレート剤としては、例えばェデト酸ナトリウム、クェン酸等を例示できる。

[0065] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥ィ匕し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。

[0066] 医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g乃至 lOOmg程度、好ましくは約 0. l ^ g 一 lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は 1日 1一数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。

[0067] 本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよぐあるいは目的の疾患の防止および Zまたは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。

[0068] 投与経路は、全身投与または局所投与の、ずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。

[0069] 投与形態としては、各種の形態が目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

[0070] さらに本発明は、 NOD2、 NOD2をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともヽずれか 1つと、プロカスパーゼ 1、プロカスパーゼ 1をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つとを含んでなるキットを提供する。当該キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。

[0071] ポリヌクレオチドは、例えばヒト cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを適当な発現 DNAベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより、また得られたベクターを周知の方法で適当な細胞にトランスフエクシヨンすることにより得られる。

[0072] 上記キットは、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を検出するためのシグナルおよび Zまたはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および/または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたつては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればょヽ。

[0073] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

[0074] (プロカスパーゼ 1と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）

プロカスパーゼ 1と相互作用する機能を有する蛋白質を、特許文献 1に記載の予測方法に従って予測した。すなわち、プロカスパーゼ 1のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列ある、はそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とプロカスパーゼ 1との間でローカルァライメントを行い、ローカルァライメントのスコアの高いものをプロカスパーゼ 1と相互作用すると予測した。

解析の結果、プロカスパーゼ 1と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、 NOD2を見出した。

実施例 2

[0075] (NOD2とプロカスパーゼ 1の結合解析）

NOD2とプロカスパーゼ 1が結合するか否かを、インビボバインディングアツセィにより検討した。

[0076] <材料およびその調製 >

本実施例においては、プロカスパーゼ 1として、プロカスパーゼ 1のアミノ酸配列 28 5番目のシスティンをァラニンに変換した変異体 (C285A)を用いた。プロカスパーゼ 1 (C285A)は、この 1アミノ酸置換により、自己切断が起きない。プロカスパーゼ 1 (C 285 A)のオープンリーディングフレーム（以下、 ORFと略称する）を pCMV— Tag2 ( STRATAGENE社）に挿入し、 N末に FLAG— tagが付カ卩されたプロカスパーゼ 1 ( C285A)〔FLAG— procaspase— 1 (C285A)〕発現用プラスミドを得た。また、 NOD 2の ORFを pcDNA3. lZmyc— His (INVITROGEN社）に挿入し、 C末に myc— H is— tagが付カ卩された NOD2 (NOD2— myc— His)発現用プラスミドを得た。

[0077] <方法 >

HEK293T細胞に、 FLAG— procaspase— 1 (C285A)発現用プラスミドのみ、 NO D2— myc— His発現用プラスミドのみ、または両方を組み合わせて、 FuGene6 (Roc he社)を用いてトランスフエクシヨンした。各発現用プラスミドは、それぞれ 2. ずつ用いた。また、 DNAの総量は 5 gとなるように pCMV— Tag2または pcDNA3. 1 (一) Zmyc— Hisにて調整した。 48時間培養後、 0. 5mlのリシスバッファー 1〔lysis buffer 1： 50mM Tris— HCl(pH7. 6) /150mM NaCl/0. 1% ノ-デット P— 40 (NP— 40)〕にて細胞溶解液を作製した。各細胞溶解液にマウス IgG結合ァガロ ~~ス (mouse IgG— conjugated agarose^ Sigma社）またはゥサギ IgG結合ァガロース（Sigma社)を添加し、 4°Cで 1時間転倒混和した後、上清を回収した。各上清に抗 FLAG M2抗体結合ァガロース（Santa Cruz社)または抗 myc抗体結合ァガロース（Santa Cruz社)を添加し、 4°Cで一晩転倒混和した後、上清を除去して結合画分を回収した。結合画分を SDS— PAGEで展開後、抗 myc抗体（Santa Cruz社 )および抗 FLAG M2抗体を用いたウェスタンブロッテイングにて各蛋白質を検出した。また、各細胞溶解液についてもウェスタンブロッテイングにて各蛋白質を検出した

[0078] <結果 >

図 1 Aに示すように、それぞれの細胞溶解液に目的とする蛋白質が発現していることが確認できた。また、図 1 Bの左図に示すように、 NOD2— myc— Hisと FLAG— p rocaspase-1 (C285A)を共発現させた細胞から作製した細胞溶解液について抗 F LAG M2抗体を用いて免疫沈降した結果、 NOD2— myc— Hisのバンドが検出された。そのバンド強度は、 NOD2— myc— Hisを単発現させて作製した細胞溶解液を免疫沈降した時に検出されたバンド強度に比して強力つたことから、 NOD2がプロカスパーゼ 1と共沈すると考えられた。また同様に、図 1-Bの右図に示すように抗 myc抗体で免疫沈降した結果、 NOD2— myc— Hisと FLAG— procaspase— 1 (C285A)を共発現させた細胞溶解液でのみ、 FLAG— procaspase— 1 (C285A)のバンドが検出されたことから、プロカスパーゼ 1が NOD2と共沈すると考えられた。以上の結果から、 NOD2はプロカスパーゼ 1と結合すると結論づけた。

実施例 3

[0079] (NOD2によるプロカスパーゼ 1の多量体化の促進の検討）

プロカスパーゼ 1からカスパーゼ 1への活性化は、プロカスパーゼ 1の多量体化とそれに伴う自己切断により引き起こされると考えられている。そこで、 NOD2がプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕にどのような効果を示すか検討を行った

[0080] <材料およびその調製 >

各発現用プラスミド

プロカスパーゼ 1 (C285A) ORFを pCMV— Tag3 (STRATAGENE社）に挿入し、 N末に myc— tagが付カ卩されたプロカスパーゼ 1 (C285A)〔Myc— procaspase— 1 ( C285A)〕発現用プラスミドを得た。また、 NOD2 ORFを pCMV— Tag5 (STRAT AGENE社）に挿入し、 C末に myc— tagが付カ卩された NOD2 (NOD2— mvc)発現用プラスミドを得た。さら〖こ、実施例 2と同様の方法で調製した FLAG— procaspase— 1 (C285A)を用いた。

[0081] <方法 >

HEK293T細胞に、 FLAG—procaspase— 1 (C285A)発現用プラスミド 0. 5 ^ g および Myc— procaspase— 1 (C285A)発現用プラスミド 0. 5 μ gと NOD2— myc発現用プラスミド 0— 1. 0 μ gとを FuGene6 (Roche社）を用いてトランスフエクシヨンした。 DNAの総量は 2 gとなるように pCMV— Tag5にて調整した。 24時間培養後、 0 . 25mlZwellのリシスバッファー 2〔20mM Tris— HCl (pH7. 5) /150mM NaC l/2mM エチレンジァミン四酢酸（EDTA)ZO. 5% NP— 40〕にて細胞溶解液を作製した。各細胞溶解液 0. 2mlに抗 FLAG M2抗体結合ァガロース 15 1を添カロし、 4°Cで一晩転倒混和した後、上清を除去してァガロースを回収した。リシスバッファー 2を 0. 5ml用いてァガロースを 2回洗浄後、 2 X SDSサンプルバッファーを 15 1加え、 100°Cで 5分間熱処理した。 SDS— PAGEで展開し、抗 myc抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、 FLAG— procaspase— 1 (C285A)と結合して共沈する Myc— procaspase— 1 (C285A)の量を測定することでプロカスパーゼ 1の多量体化の度合いを評価した。また、各細胞溶解液についてウェスタンブロッテイングにて各蛋白質の発現量をチックした。

[0082] <結果 >

図 2— Aに示すように、細胞溶解液から抗 FLAG M2抗体により回収された試料にぉ、て、 NOD2— myc発現用プラスミド量依存的に抗 myc抗体で検出されるバンドの量が増加した。このことは、 FLAG— procaspase— 1 (C285A)と結合する Myc— pr ocaspase-1 (C285A)量力 NOD2— myc発現用プラスミド量依存的に増加したことを意味する。また図 2— Bに示すように、各発現用プラスミドをトランスフエクシヨンした細胞のいずれにおいても、 Myc—procaspase—l (C285A)および FLAG— procasp ase-1 (C285A)がほぼ同量発現していることが確認できた。これらから、 NOD2がプロカスパーゼ 1の多量体ィ匕を促進することが明らかになった。実施例 4

[0083] (細胞内でのカスパーゼ 1依存的な proIL— 1 β力 IL 1 βへの切断と IL 1 β分泌に及ぼす NOD2の効果）

proIL-1 β安定発現細胞に、プロカスパーゼ 1発現用プラスミドおよび Ζまたは Ν OD2発現用プラスミドを導入し、 NOD2存在下でプロカスパーゼ 1からカスパーゼ 1 への活性化が引き起こされ、細胞内での proIL— 1 β力 IL 1 βへの切断および細胞外への IL 1 β分泌量に変化が観察されるカゝ否カゝ検討を行った。

[0084] <材料およびその調製 >

1.各発現プラスミドの作成

プロカスパーゼ 1 ORFを pCMV— Tag2に挿入し、 N末に FLAG— tagが付カ卩されたプロカスパーゼ 1 (FLAG— procaspase—l)発現用プラスミドを得た。また、 NOD2 myc発現用プラスミドは、実施例 3と同様の方法で作製した用いた。 ProIL— 1 β ORFを pcDNA3. 1 /myc— Hisに挿入し、 C末に myc— Hisが付カ卩された proIL— 1 ι8発現用プラスミドを得た。

[0085] 2. proIL-1 β安定発現細胞の作成

ΗΕΚ293細胞に、 proIL— 1 β発現用プラスミドを FuGene6 (Roche社）を用いてトランスフエクシヨンした。その後、 lmg/mlのジエネティシン（geneticin)含有培地で増殖してくるクローンを選択した。選択したクローンのうち、 proIL— 1 βの発現が認められたクローンを実験に用いた〔ProIL— 1 β安定発現細胞 (ΗΕΚ293)〕。

[0086] <方法 >

1.細胞内での proIL— 1 β力 IL 1 βへの切断に及ぼす NOD2の効果

6ゥエルプレートに、 IL—1 β安定発現細胞（ΗΕΚ293)を 5 X 10⁵/well播種してー晚培養後、 FLAG procaspase—l発現用プラスミド 0. 5 gおよび Zまたは NO D2— myc発現用プラスミド 0. 1— 2. gを FuGene6 (Roche社）を用いてトランスフエクシヨンした。 DNAの総量は 2. 5 ₈となるょぅにじ1^¥—丁&₈2またはじ1^¥— Tag5にて調整した。 24時間培養後、細胞に 0. 25mlZwellのリシスバッファー 2を加え、細胞溶解液を作製した。

[0087] 各ゥエルから調製した細胞溶解液 40 μ 1〖こ 5 X SDSサンプルバッファー 10 μ 1を加え、 100°Cで 5分間熱処理した。その後、 SDS— PAGEで展開し、抗 myc抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、 proIL-1 β、 IL—1 βそれぞれの量および NO D2量を測定した。また、抗 FLAG抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、プロカスパーゼー 1量を測定した。

[0088] 2.カスパーゼー 1依存的な IL 1 β分泌に及ぼす NOD2の効果

6ゥエルプレートに、 IL—1 β安定発現細胞（ΗΕΚ293)を 5 X 10⁵/well播種してー晚培養後、 FLAG— procaspase—l発現用プラスミド 0. 5 gおよび Zまたは NO D2— myc発現用プラスミド 0. 1—2. gを FuGene6を用いてトランスフエクシヨンした。 DNAの総量は 2. 5 ₈となるょぅにじ1^¥—丁&₈2またはじ1^¥—丁&₈5にて調整した。 24時間培養後、培養上清を回収した。回収した各ゥエルの培養上清を 10% 牛胎児血清（FCS)含有 DMEMで 2倍希釈し、 human IL—Ι β ELISA kit (Bio

Source社）を用いて付属のプロトコールに従い、培養上清中の IL 1 β量を測定した。

[0089] <結果 >

図 3に示すように、 FLAG— procaspase—l発現プラスミドと NOD2— myc発現プラスミドとを共発現させた細胞にぉ、て、 NOD2— mycの発現量依存的に細胞内 IL 1 β量の増加が認められた。すなわち、細胞内でのカスパーゼー 1依存的な proIL— 1 βから IL—1 βへの切断が、 NOD2により促進されることが判明した。

[0090] 図 4に示すように、 FLAG— procaspase—l発現プラスミドと NOD2— myc発現プラスミドとを共発現させた細胞において、 NOD2— myc発現プラスミド量依存的に、細胞外への IL 1 β分泌量の増加が認められた。すなわち、カスパーゼー 1依存的な IL -1 βの細胞外への分泌力 NOD2により促進されることが判明した。

産業上の利用可能性

[0091] 本発明は、炎症性疾患、例えば敗血症、炎症性腸疾患、クローン病およびリウマチ等の重篤なあるいは難治性の疾患の防止および Ζまたは治療のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の群より選ばれる阻害方法；

(i) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とするプ口カスパーゼ 1の多量体化阻害方法、

(ii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ 1の活'性ィ匕阻害方法、

および

(iii) NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ 1 (caspase— 1)の生成阻害方法。

[2] NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

[3] NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1 つ用いることを特徴とする炎症性疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

[4] 炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項 2または 3に記載の防止方法およびまたは治療方法。

[5] NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を可能にする条件下、 NOD2および Zまたはプロカスパーゼ 1をィ匕合物と接触させ、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を検出することができるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよびまたはマーカーの存在若しくは不存在およびまたは変化を検出すること〖こより、 NOD2とプロカスパーゼ 1の結合を阻害するか否かを決定する方法。

[6] 以下の群より選ばれる阻害剤；

および

[7] 以下の群より選ばれる阻害剤；

および

[8] NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[9] NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1 つ含有する炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[10] 請求項 6または 7に記載の阻害剤を含有する炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[11] 炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項 8から 10のいずれか 1項に記載の防止剤および Zまたは治療剤。

[12] NOD2とプロカスパーゼ 1 (procaspase—l)の結合阻害によるプロカスパーゼ 1の多量体化阻害を特徴とする、炎症性疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[13] 炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項 12 に記載の防止剤および Zまたは治療剤。

[14] 請求項 5に記載の同定方法に用いることを特徴とする試薬キットであって、 NOD2、

NOD2をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つと、プロカスパーゼ 1 ( procaspase— 1)、プロカスパーゼ 1をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれカ 1つとを含んでなる試薬キット。