CN116368384A - 用于巨噬细胞调节的化合物、靶标和途径 - Google Patents

Abstract

公开了调节巨噬细胞激活以治疗各种疾病的方法，所述疾病诸如癌症、纤维化、感染性疾病、炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病。还公开了鉴定可用于调节巨噬细胞激活的化合物作为治疗癌症、纤维化、感染性疾病、炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病的手段的方法。

Description

用于巨噬细胞调节的化合物、靶标和途径

相关申请

本申请要求2020年9月21日提交的美国临时专利申请序列号63/080,988的优先权权益；所述申请的内容特此通过引用整体并入本文。

政府支持

本发明是在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号R35CA197605下借助政府支持完成的。政府对本发明具有一定的权利。

背景技术

巨噬细胞在发育、组织稳态和修复以及免疫方面发挥重要作用。大多数巨噬细胞表现出多维表型谱以响应各种生理和病理信号。因为它们在维持组织稳态和修复方面的关键功能，所以巨噬细胞极化失调涉及导致许多人类疾病，包括癌症、纤维化、肥胖、糖尿病以及感染性疾病、心血管疾病、炎性疾病和神经退行性疾病。因此，非常需要鉴定用于疾病干预的巨噬细胞激活调节剂。

发明内容

在一个方面，本文描述了一种鉴定巨噬细胞激活调节剂的方法。所述方法包括使原代巨噬细胞与候选剂接触；监测或拍摄与候选剂接触的细胞的形态；以及任选地将在候选剂存在的情况下的细胞形态与在候选剂不存在的情况下的细胞形态进行比较；其中在候选剂存在的情况下的形态变化指示巨噬细胞激活的调节。还提供了许多实施方案，所述实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施方案中，原代巨噬细胞是骨髓衍生的巨噬细胞或单核细胞衍生的巨噬细胞。在一些实施方案中，通过显微镜(诸如荧光显微镜)来监测或拍摄细胞的形态。在一些实施方案中，通过Opera Phenix高内涵筛选系统或CellProfiler来监测或拍摄细胞的形态。在一些实施方案中，细胞的形态从细长形变成圆形。在一些实施方案中，调节剂激活M1样巨噬细胞，使M2样巨噬细胞失活，将肿瘤相关巨噬细胞(TAM)改变成M1样巨噬细胞，将M2样巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，将M-CSF巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，将GM-CSF巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，将原代巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，诱导LPS、IFNγ或TNFα，或激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。在一些实施方案中，调节剂是M1激活化合物。在一些实施方案中，调节剂是细胞松弛素-B、芬苯达唑(fenbendazole)、帕苯达唑(parbendazole)、甲巯咪唑(methiazole)、前列地尔(alprostadil)、FTY720、五氟利多(penfluridol)、紫杉醇、smer-3、斑蝥素、SCH79797、米托蒽醌(mitoxantrone)、氯硝柳胺(niclosamide)、MS275、HMN-214、DPI、硫链丝菌素(thiostrepton)、吴茱萸碱(evodiamine)、葫芦素-I、NVP 231、洗必泰(Chlorhexidine)、二亚苯基碘鎓(Diphenyleneiodonium)、LE135、氟伏沙明(Fluvoxamine)、莫西诺司他(Mocetinostat)、匹莫齐特(Pimozide)、NP-010176、雷公藤红素(Celastrol)、FTY720、WP1130、普卢利沙星(Prulifloxacin)、二氢鲸蜡醇二乙酸酯(dihydrocelastryldiacetate)或喹啉鎓(Quinolinium)。在一些实施方案中，M1样巨噬细胞介导促炎反应、抗微生物反应和/或抗肿瘤反应。在一些实施方案中，调节剂治疗癌症、纤维化和/或感染性疾病。在一些实施方案中，癌症是血液系统恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病(Gross'leukemia)、里德尔细胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling'sleukemia)、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前骨髓细胞性白血病、腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cellcarcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌(bronchiolar carcinoma)、支气管癌(bronchogeniccarcinoma)、脑状癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma、gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giantcell carcinoma)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum、carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum\tuberouscarcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤(Krompecher's carcinoma)、库尔契茨基氏细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、扁豆状癌(lenticularcarcinoma、carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏蛋白性腺癌(mucinous carcinoma)、黏液癌(carcinoma muciparum)、黏液细胞癌、黏液表皮样癌、黏液癌(carcinoma mucosum、mucous carcinoma)、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、未侵袭癌、棘细胞癌、糜烂性癌(pultaceous carcinoma)、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤(Hodgkin's sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)、霍奇金病(Hodgkin'sDisease)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、哈-巴二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤或浅表扩展性黑色素瘤。在一些实施方案中，感染性疾病是病毒感染或细菌感染。感染可能与COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感、巨细胞病毒、天花和A组链球菌或败血症有关。

在一些实施方案中，细胞的形态从圆形变成细长形。在一些实施方案中，调节剂激活M2样巨噬细胞，使M1样巨噬细胞失活，将M1样巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，将M-CSF巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，将GM-CSF巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，将原代巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，调节剂诱导选自IL4、IL13和IL10的M2激活刺激，或抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。在一些实施方案中，调节剂是M2激活化合物。在一些实施方案中，调节剂是博舒替尼(Bostunib)、Su11274、阿特波龙(Alsterpaullone)、阿司他丁(Alrestatin)、比生群(Bisantrene)、雷公藤内酯(triptolide)、洛伐他汀(lovastatin)、QS 11、瑞戈非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、MLN2238、GW-843682X、KW 2449、阿昔替尼(Axitinib)、JTE 013、嘌吗啡胺(Purmorphamine)、阿奇黄素A(Arcyriaflavin A)、达沙替尼(Dasatinib)、NVP-LDE225、1-萘基PP1、西拉菌素(Selamectin)、MGCD-265、普达非洛(podofilox)、秋水仙碱或硫酸长春碱。在一些实施方案中，M2样巨噬细胞介导抗炎或组织修复反应。在一些实施方案中，调节剂治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病。在一些实施方案中，炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍(cardioplegia-induced coronary endothelial dysfunction)、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy)、视神经炎、贝切特视网膜病变(Behcet’s retinopathy)、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变(Purtscher retinopathy)、肖格伦干眼病(Sjogren’sdry eye disease)、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。在一些实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(Guillain-Barre′syndrome，GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮(Bullous Pemphigoid)、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症(Down syndrome)、帕金森病或亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease)。

在一个方面，本文描述了一种治疗癌症、纤维化或感染性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂将巨噬细胞的形态从细长形改变成圆形。还提供了许多实施方案，所述实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施方案中，调节剂激活M1样巨噬细胞，使M2样巨噬细胞失活，将肿瘤相关巨噬细胞(TAM)改变成M1样巨噬细胞，将M2样巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，将M-CSF巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，将GM-CSF巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，将原代巨噬细胞改变成M1样巨噬细胞，诱导选自LPS、IFNγ和TNFα的M1激活刺激，或激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。在一些实施方案中，调节剂是M1激活化合物。在一些实施方案中，调节剂是细胞松弛素-B、芬苯达唑、帕苯达唑、甲巯咪唑、前列地尔、FTY720、五氟利多、紫杉醇、smer-3、斑蝥素、SCH79797、米托蒽醌、氯硝柳胺、MS275、HMN-214、DPI、硫链丝菌素、吴茱萸碱、葫芦素-I、NVP231、洗必泰、二亚苯基碘鎓、LE135、氟伏沙明、莫西诺司他、匹莫齐特、NP-010176、雷公藤红素、FTY720、WP1130、普卢利沙星、二氢鲸蜡醇二乙酸酯或喹啉鎓。在一些实施方案中，M1样巨噬细胞介导促炎反应、抗微生物反应和/或抗肿瘤反应。在一些实施方案中，癌症是血液系统恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblasticleukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前骨髓细胞性白血病、腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cellcarcinoma)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrixcarcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤、库尔契茨基氏细胞癌、大细胞癌、扁豆状癌(lenticular carcinoma)、扁豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏蛋白性腺癌、黏液癌(melanotic carcinoma)、黏液癌(carcinoma molle)、黏液细胞癌、黏液表皮样癌、黏液癌、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、未侵袭癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、哈-巴二氏黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤或浅表扩展性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的第二癌症疗法。在一些实施方案中，第二癌症疗法包括癌症免疫疗法。在一些实施方案中，癌症免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂，诸如特异性结合免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段。免疫检查点蛋白可以是CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。免疫检查点抑制剂可以是阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、BGB-A317、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012或STI-A1010。在一些实施方案中，第二癌症疗法包括施用化疗剂，诸如利妥昔单抗(rituxumab)、噻替派(thiotepa)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)、苯并霍烷(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)、六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、泡番荔枝辛(bullatacin)、布拉他辛酮(bullatacinone)、喜树碱(camptothecin)、拓扑替康(topotecan)、苔藓抑素(bryostatin)、卡利他汀(callystatin)、CC-1065、念珠藻素1(cryptophycin 1)、念珠藻素8(cryptophycin 8)、尾海兔素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、五加素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯膦酸二钠(clodronate)、埃斯佩拉霉素(esperamicin)；新制癌菌素载色体、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、多柔比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、派来霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链酶黑素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、脱氧氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯(aceglatone)、醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、地磷酰胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、亚丝醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elformithine)、依利醋铵(elliptinium acetate)、埃博霉素(epothilone)、乙环氧啶(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocins)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、喷司他丁(pentostatin)、非那西汀(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-乙肼、甲基苄肼(procarbazine)、PSK多糖复合物、雷佐生(razoxane)、根霉素(rhizoxin)、西佐喃(sizofuran)、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺、单端孢霉烯(trichothecene)、T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)、蛇行菌素(anguidine)、尿烷、长春地辛(vindesine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、瓜西托辛(gacytosine)、阿拉伯糖苷(arabinoside)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、噻替派、紫杉醇、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、疏基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、长春碱(vinblastine)、铂(platinum)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨(vinorelbine)、诺万托(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、依达曲沙、道诺霉素(daunomycin)、氨喋呤(aminopterin)、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康(irinotecan)、RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸或卡培他滨(capecitabine)。在一些实施方案中，感染性疾病是病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，感染与COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感、巨细胞病毒、天花和A组链球菌或败血症有关。

在一个方面，本文描述了一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂将巨噬细胞的形态从圆形改变成细长形。还提供了许多实施方案，所述实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施方案中，调节剂激活M2样巨噬细胞，使M1样巨噬细胞失活，将M1样巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，将M-CSF巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，将GM-CSF巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，将原代巨噬细胞改变成M2样巨噬细胞，诱导选自IL4、IL13和IL10的M2激活刺激，或抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。在一些实施方案中，调节剂是M2激活化合物。在一些实施方案中，调节剂是博舒替尼、Su11274、阿特波龙、阿司他丁、比生群、雷公藤内酯、洛伐他汀、QS 11、瑞戈非尼、索拉非尼、MLN2238、GW-843682X、KW 2449、阿昔替尼、JTE 013、嘌吗啡胺、阿奇黄素A、达沙替尼、NVP-LDE225、1-萘基PP1、西拉菌素、MGCD-265、普达非洛、秋水仙碱或硫酸长春碱。在一些实施方案中，M2样巨噬细胞介导抗炎或组织修复反应。在一些实施方案中，炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。在一些实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

在一个方面，本文描述了一种治疗癌症、纤维化或感染性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。还提供了许多实施方案，所述实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施方案中，调节剂是细胞松弛素-B、芬苯达唑、帕苯达唑、甲巯咪唑、前列地尔、FTY720、五氟利多、紫杉醇、smer-3、斑蝥素、SCH79797、米托蒽醌、氯硝柳胺、MS275、HMN-214、DPI、硫链丝菌素、吴茱萸碱、葫芦素-I、NVP 231、洗必泰、二亚苯基碘鎓、LE135、氟伏沙明、莫西诺司他、匹莫齐特、NP-010176、雷公藤红素、FTY720、WP1130、普卢利沙星、二氢鲸蜡醇二乙酸酯或喹啉鎓。在一些实施方案中，癌症是血液系统恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblasticleukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前骨髓细胞性白血病、腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤、库尔契茨基氏细胞癌、大细胞癌、扁豆状癌(lenticularcarcinoma)、扁豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏蛋白性腺癌、黏液癌(melanotic carcinoma)、黏液癌(carcinomamolle)、黏液细胞癌、黏液表皮样癌、黏液癌、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、未侵袭癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、哈-巴二氏黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤或浅表扩展性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的第二癌症疗法。在一些实施方案中，第二癌症疗法是癌症免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂，例如特异性结合免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫检查点蛋白是CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、BGB-A317、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012或STI-A1010。在一些实施方案中，第二癌症疗法是化疗剂，诸如利妥昔单抗、噻替派、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯并霍烷、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、布拉他辛酮、喜树碱、拓扑替康、苔藓抑素、卡利他汀、CC-1065、念珠藻素1、念珠藻素8、尾海兔素、倍癌霉素、五加素、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素、达内霉素、氯膦酸二钠、埃斯佩拉霉素；新制癌菌素载色体、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、多柔比星、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链酶黑素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、脱氧氟尿苷、卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、亚丝醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃博霉素、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、非那西汀、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙肼、甲基苄肼、PSK多糖复合物、雷佐生、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺、单端孢霉烯、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇行菌素、尿烷、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、瓜西托辛、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替派、紫杉醇、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、疏基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、奥沙利铂、卡铂、长春碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺万托、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、伊立替康、RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸或卡培他滨。在一些实施方案中，感染性疾病是病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，感染与COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感、巨细胞病毒、天花和A组链球菌或败血症有关。

在一个方面，本文描述了一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。还提供了许多实施方案，所述实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施方案中，调节剂是博舒替尼、Su11274、阿特波龙、阿司他丁、比生群、雷公藤内酯、洛伐他汀、QS 11、瑞戈非尼、索拉非尼、MLN2238、GW-843682X、KW 2449、阿昔替尼、JTE 013、嘌吗啡胺、阿奇黄素A、达沙替尼、NVP-LDE225、1-萘基PP1、西拉菌素、MGCD-265、普达非洛、秋水仙碱或硫酸长春碱。在一些实施方案中，炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。在一些实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

在一个方面，本文描述了一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的二亚苯基碘鎓(DPI)。还提供了许多实施方案，所述实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施方案中，炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。在一些实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

附图说明

图1A-图1H示出了激活人巨噬细胞的化合物的高通量筛选。图1A和图1B示出了在LPS、IFNγ、TNFα、IFNγ加TNFα(I+T)、IL-10、IL-4或IL-13的存在下将hMDM培养24小时。示出了IFNγ的M1激活巨噬细胞和IL-4的M2激活巨噬细胞的细胞形态的实例(图1A)，以及来自三个独立实验的每个刺激的计算Z分数(图1B)。每个符号代表技术重复份。通过T测试计算Z分数以测量处理与对照之间的细胞形态差异。当诱导细胞呈圆形形态时，刺激具有负Z分数，而当诱导细胞呈细长形态时，刺激物具有正分数。图1C示出了筛选和数据分析的流程图。将从4名健康供体的新鲜血液中分离的等量混合人单核细胞用50ng/mL M-CSF在体外培养7天。将hMDM胰蛋白酶消化并且铺种在384孔板上(50μL中5000个细胞/孔)。将细胞在10ng/mL M-CSF中回收16小时，然后用化合物处理24小时。将细胞洗涤、固定并用鬼笔环肽和DAPI染色。用每孔六个视野的高内涵显微镜扫描板以量化细胞数量和细胞形态。图1D示出了筛选中使用的化合物库的组成。图1E示出了与DMSO对照相比，由两种化合物诱导的细胞形状变化的实例，以及其对应的Z分数。计算细胞偏心度以测量细胞形态。通过T测试计算Z分数以测量每种化合物与DMSO对照之间的细胞形态差异。图1F示出了4126种化合物的Z分数和每个孔中捕获的细胞数的图。虚线是M1激活(左)和M2激活(右)的截止值，其基于来自图1B的Z分数平均值。图1G示出了基于已鉴定的化合物的来源及其已知靶标的功能对其进行的分类。图1H示出了已鉴定的M1或M2激活化合物的已知靶标的途径分析。每个点都是一个特定的途径，其具有化合物的蛋白质靶标，并且点的大小是指化合物的数量。绘制了具有属于一个特定途径的蛋白质靶标的化合物的平均Z分数(y轴)和数量。表明了与巨噬细胞激活相关的所选的已知(黑色)和新型(灰色)途径。

图2A-图2F示出了由已鉴定的新途径的化合物或配体诱导的巨噬细胞激活的验证。图2A-图2B示出了所选化合物诱导的形态变化是剂量依赖性的。基于米氏模型(Michaelis-Menten model)中不同浓度的化合物下的Z分数测量值来计算剂量反应。示出了M1激活(硫链丝菌素)和M2激活(博舒替尼)化合物的代表性剂量响应曲线(图2A)。30种测试化合物中有25种具有典型的剂量依赖性反应(图2B)。有效浓度(EC)定义为诱导细胞形态变化达到M1或M2截止值的化合物浓度。EC、适应度(R平方)和最大Z分数通过米氏方程计算。数据总结自3个独立实验。图2C示出了对8种所选化合物和对照(IL-4和IFNγ)的转录反应的GSEA。用2种M2激活化合物和6种M1激活化合物以及IL-4和IFNγ处理重复的hMDM样品24小时。基因表达水平通过RNA-seq单独地测量。GSEA预排序分析基于全基因组基因列表来执行，所述列表根据基因表达变化进行排序，使用了响应hMDM中的29种刺激的49个转录模块的基因集。bosut.：博舒替尼；alster.：阿特波龙；mocet.：莫西诺司他；thios.：硫链丝菌素；niclo.：氯硝柳胺；chlor.：洗必泰；fenb.：芬苯达唑；fluvo.：氟伏沙明。图2D示出了每种化合物和阳性对照诱导的DEG的GO富集分析。表明了上调和下调的DEG数量。图2E示出了对图1H中的已鉴定的新途径的6个配体的转录反应的GSEA。dopa.：多巴胺；5HT：血清素。将重复的hMDM样品用每个配体刺激，并且单独地通过RNA-seq进行分析。图2F示出了配体和阳性对照诱导的DEG的GO富集分析。表明了上调和下调的DEG数量。

图3A-图3E示出了化合物对分化的巨噬细胞的重编程筛选。图3A示出了hMDM通过IL4加上IL13而分化成M2，然后在不存在分化细胞因子的情况下，用5μM或10μM的127种已鉴定的M1激活化合物中的每一种处理24小时。示出了5μM或10μM化合物之间的Z分数比较。图3B示出了hMDM通过IFNγ加上TNFα而分化成M1，然后在不存在分化细胞因子的情况下，用5μM或10μM的180种已鉴定的M2激活化合物中的每一种处理24小时。示出了5μM或10μM化合物之间的Z分数比较。图3C示出了根据剂量测定计算的40种所选的M1或M2激活化合物的有效浓度。通过米氏方程计算了21种M1极化化合物(三角形)和19种M2极化化合物(圆形)的EC和适应度并进行了绘制。数据总结自3个独立实验。图3D-图3E示出了hMDM通过IL4加上IL13而分化成M2，或通过IFNγ加上TNFα而分化成M1，然后在分化细胞因子的存在下，用127种M1激活(图3D)化合物或180种M2激活(图3E)化合物处理24小时。实心点示出了与37种M1激活(图3A)化合物和21种M2激活(图3B)化合物重叠的点。

图4A-图4F示出了通过所选化合物对分化巨噬细胞进行重编程。图4A示出了每种化合物诱导的DEG数量：上调基因和下调基因。hMDM被IL-4加上IL-13分化成M2，或被IFNγ加上TNFα分化成M1，然后分别用有效浓度的M1激活化合物或M2激活化合物处理重复样品。对照包括两种分化的M1和M2巨噬细胞，用IFNγ处理的M2巨噬细胞和用IL-4处理的M1巨噬细胞。每个样品中的基因表达通过RNA-seq单独地测量。图4B示出了由化合物以及IFNγ和IL-4诱导的7620个DEG的皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)的层次聚类热图。图4C示出了与IFNγ和IL-4相比，对每种化合物的转录反应的GSEA分析。图4D示出了在巨噬细胞激活网络的前10％中央枢纽基因(n＝1255)上使用BiNGO的GO富集术语网络。节点颜色和大小表示富集的GO术语的FDR值。图4E-图4F示出了由每种化合物诱导的DEG的功能富集分析。示出了共享的(图4E)和独特的路径(图4F)。表明了化合物靶标和FDA批准信息。图4E和图4F中的M1激活化合物和M2激活化合物的顺序与图4A中的相同。

图5A-图5E示出了硫链丝菌素诱导巨噬细胞进入促炎状态并且增强体外抗肿瘤活性。图5A示出了火山图，其示出了由硫链丝菌素(n＝2)诱导的hMDM中的转录变化。hMDM用2.5μM硫链丝菌素处理24小时，然后进行RNA-seq。DEG由edgeR在P<0.05下鉴定，至少有2倍变化。未分类为差异表达的基因的数据用黑色绘制。如所示，实心点表示上调和下调的基因。图5B示出了硫链丝菌素诱导的DEG的GO富集分析。图5C示出了对硫链丝菌素的转录反应的GSEA。图5D示出了硫链丝菌素在体外抑制TAM的发育和功能。小鼠BMM在含有或不含2.5μM硫链丝菌素的正常培养基中培养24小时(第1组)，或者在含有或不含2.5μM硫链丝菌素的B16F10肿瘤细胞条件培养基(CM)中培养24小时(第2组)，或者首先用B16F10肿瘤细胞CM培养24小时，然后再用2.5μM硫链丝菌素处理24小时(第3组)。通过qPCR量化所示基因的转录物水平。数据总结自两个独立实验。图5E示出了硫链丝菌素增强巨噬细胞的抗肿瘤活性。小鼠BMM用硫链丝菌素处理24小时。将未处理和处理的巨噬细胞与等量的B16F10黑色素瘤细胞共培养12小时。从细胞总数中减去巨噬细胞后，通过流式细胞术量化肿瘤细胞的数量。数据总结自三个独立实验。**P<0.01，通过T测试。

图6A-图6F示出了硫链丝菌素通过体内重编程肿瘤相关巨噬细胞而表现出抗肿瘤活性。图6A示出了用DMSO、TA99、硫链丝菌素(300mg/kg或150mg/kg)和硫链丝菌素加上TA99腹膜内处理的带有皮下B16F10肿瘤的B6小鼠的肿瘤生长曲线。箭头表明给药时间点。图6B示出了用TA99腹膜内处理的以及用PBS或DMSO或硫链丝菌素(20mg/kg)或硫链丝菌素加上TA99皮下处理的带有皮下B16F10肿瘤的B6小鼠的肿瘤生长曲线(n＝10至12小鼠/组)。图6C-图6D示出了在肿瘤植入后18天，对照、TA99处理的、硫链丝菌素处理的、和硫链丝菌素加上TA99处理的荷瘤小鼠的肿瘤中的TAM(F4/80⁺CD11b⁺Ly6C^-Ly6G^-)、炎性单核细胞(F4/80^intCD11b⁺Ly6C⁺Ly6G^-)和单核细胞(F4/80^-CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G⁺)的流式细胞术分析。示出了对CD45+细胞进行门控的代表性F4/80与CD11b染色图谱(图6C)和来自三个独立实验(每个实验每组3-4只小鼠)的总结数据(图6D)。误差棒表明标准偏差(SD)。图6E示出了肿瘤切片中的F4/80的免疫组织化学染色。比例尺：100μm。图6F示出了通过腹膜内(n＝4)或皮下施用(n＝2)硫链丝菌素或DMSO(n＝2)由肿瘤浸润巨噬细胞中的硫链丝菌素诱导的基因表达变化的比较。在肿瘤植入后18天，将肿瘤浸润巨噬细胞基于CD45⁺F4/80⁺CD11b⁺Gr-1^-从肿瘤组织中分选。I.P.：腹膜内注射；S.C.：肿瘤旁皮下注射。*P<0.05和**P<0.01，通过T测试。

图7A-图7B示出了激活的巨噬细胞的形态和表型。图7A示出了M1和M2样巨噬细胞的F-肌动蛋白染色。hMDM被M-CSF诱导变成M0。所得的巨噬细胞被IFNγ极化为M1，或者被IL4极化为M2。然后，M1巨噬细胞用M2型化合物博舒替尼(1mM)处理24小时，并且M2巨噬细胞用M1型化合物硫链丝菌素(2.5mM)处理24小时。将F-肌动蛋白染色，并通过具有60倍物镜的荧光显微镜获取图像。细胞核用DAPI染色。示出了来自两个独立实验的代表性数据。图7B示出了通过流式细胞术量化的用DMSO或IFNγ或IL4处理的hMDM中的CD163、CD206、CD80和CD86。示出了来自三个独立实验的代表性染色图谱。数字示出了每组3个样品的平均荧光强度(MFI)+/-平均值标准误差(SEM)。

图8示出了M1激活和M2激活化合物靶向的蛋白质的排名靠前的列表。组蛋白脱乙酰酶和VEGF受体以灰色突出显示。

图9A-图9C示出了由所选化合物(图9A)、新途径的配体(图9B)和对照(IL-4和IFNγ)诱导的差异表达基因的比较。图9C示出了由化合物诱导的所选M1标记(CD80和CD86)和M2标记(CD206和CD163)在蛋白质水平上的变化，如通过流式细胞术测定。示出了相对于对照的平均荧光强度(MFI)变化。0.2是指MFI增加20％。

图10示出了在存在或不存在极化细胞因子的情况下，21种M1激活化合物和19种M2激活化合物的EC比较。

图11A-图11E示出了通过所选化合物的分化巨噬细胞的重编程。图11A示出了hMDM对17种M1激活化合物和17种M2激活化合物的全局转录反应的主要组分分析。样品与图4A中的样品相同。图11B示出了由每种化合物诱导的DEG的功能富集分析。示出了组装的热图以及上调和下调的DEG数量(下图)。图11C示出了基于RNA-seq，化合物处理后所选M1和M2基因的相对转录物水平的比较。图11D示出了化合物处理后所选M1和M2基因的转录水平的比较，如通过定量PCR测量。图11E示出了化合物处理后所选M1和M2标记的蛋白质水平的比较，如通过流式细胞术测量。示出了相对于对照的MFI变化。0.2是指MFI增加20％。M1激活化合物和M2激活化合物在b-e中的顺序与图4A中的相同。

图12示出了巨噬细胞激活网络。所述网络由ARACNe推断(Margolin等人2006)。前10％的中央枢纽基因网络通过Cytoscape可视化(Shannon等人2003)。深色标记的节点是转录因子(调节因子)。列出了前10个中央枢纽和前10个中央TF枢纽。

图13A-图13B示出了硫链丝菌素在体外抑制M2样巨噬细胞的发育和功能。图13A示出了小鼠BMM首先用B16F10肿瘤细胞条件培养基(CM)培养24小时，然后用2.5mM硫链丝菌素再处理24小时(来自图5D的第3组)。MHCII、CD80、iNOS、Arg1和CD206的表达通过流式细胞术进行量化。示出了来自两个独立实验的处理的(红色)和未处理的(深色)TAM的代表性染色图谱。图13B示出了小鼠BMM在正常培养基中未处理或者用2.5mM硫链丝菌素处理24小时(第一组)，或者在不存在或存在2.5mM硫链丝菌素的情况下用IL-4/IL-13极化24小时(第2组)，或者在不存在或存在2.5mM硫链丝菌素的情况下用乳酸极化24小时(第4组)。或者，小鼠BMM首先用IL-4/IL-13(第3组)或乳酸(第5组)极化24小时，然后不处理或用2.5mM硫链丝菌素再处理24小时。通过qPCR量化所示基因的转录物水平。数据总结自两个独立实验。

图14A-图14C示出了硫链丝菌素在体外激活巨噬细胞。图14A示出了小鼠BMM用硫链丝菌素处理24小时(与图5E相同)。收集并过滤条件培养基(CM)。B16F10黑色素瘤细胞用CM培养12小时，或者用在95℃下热灭活的CM培养5分钟。通过流式细胞术量化肿瘤细胞的数量。数据总结自两个独立实验。*P<0.05，通过T测试。P值基于t测试显示。图14B-图14C示出了硫链丝菌素增强巨噬细胞的ADCP。小鼠BMM(图14B)或hMDM(图14C)用2.5mM硫链丝菌素处理24小时，然后与等量的eFluro670和抗CD20标记的人B细胞淋巴瘤细胞共培养2小时，并且通过流式细胞术进行分析。吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞被鉴定为efluro670+和CD14+。示出了来自三个不同实验的对CD14+巨噬细胞进行门控的代表性eFluro670直方图。

图15A-图15B示出了硫链丝菌素在体内激活巨噬细胞而不改变肠道细菌计数的总数。图15A示出了在通过腹膜内注射或皮下注射(n＝3)用DMSO或硫链丝菌素处理后6天，小鼠的骨髓和脾脏中的巨噬细胞(F4/80+CD11b+)和单核细胞(F4/80-CD11b+)的流式细胞术分析。示出了对CD45+细胞进行门控的代表性F4/80与CD11b染色图谱。I.P.：腹膜内注射；S.C.：肿瘤旁皮下注射。图15B示出了小鼠粪便样品中的总细菌计数。示出的数据是平均值±标准差。n.s.，通过T检验不显著。

图16A-图16D示出了硫链丝菌素在体内对巨噬细胞、NK细胞和CD8+T细胞的影响。带有皮下B16F10肿瘤的B6小鼠如图6所示接受处理。在植入后18天，由肿瘤制备单细胞悬液，染色，并且通过流式细胞术进行分析。图16A-图16B示出了对F4/80+CD11b+Gr1-TAM进行门控的Arg1与CD86的代表性细胞内染色图谱(图16A)，以及来自两个独立实验的每组5只小鼠的总结数据(图16B)。图16C示出了对CD45+NK1.1+NK细胞(顶部两行)和CD45+CD8a+T细胞(底部两行)进行门控的IFNγ与TNFα的代表性细胞内染色图谱。用于T细胞染色的样品在体外通过T细胞刺激鸡尾酒刺激4小时。图16D示出了来自两个独立实验的每组4至6只小鼠的总结数据。*P<0.05，通过T测试。示出的数据是平均值±标准差。

图17A-图17D示出了TAM在体内对硫链丝菌素的转录反应。图17A示出了GO富集分析，其示出了腹膜内施用硫链丝菌素或DMSO之后，TAM中的上调和下调基因中的某些途径的富集。示出了生物过程的GO集、基因数量和P值。在肿瘤植入后18天，将肿瘤浸润巨噬细胞基于CD45+F4/80+CD11b+Gr1-从肿瘤组织中分选。基因表达水平通过RNAseq测量。图17B示出了GSEA，其示出了通过腹膜内施用在体内由硫链丝菌素诱导的TAM中的富集基因集(FDR q值<0.05)。图17C示出了GO富集分析，其示出了通过皮下施用硫链丝菌素或DMSO诱导的TAM中的上调和下调基因中的某些途径的富集。示出了生物过程的GO集、基因数量和P值。图17D示出了GSEA，其示出了通过皮下施用在体内由硫链丝菌素诱导的TAM中的富集基因集(FDRq值<0.05)。I.P.：腹膜内注射；S.C.：肿瘤旁皮下注射。

图18A-图18D示出了硫链丝菌素抑制骨髓中的肿瘤生长。NSG小鼠被植入1x10⁷个GMB-luc细胞，并在14天和21天后给予两次0.5mg/kg利妥昔单抗(Ritu)和/或300mg/kg硫链丝菌素(Thio)。通过对体内荧光素酶活性进行成像(每组5至6只小鼠)来监测(图18A)和量化(图18B)肿瘤负荷。数据作为平均值±标准误差示出。在肿瘤植入后第28天，通过流式细胞术分析骨髓细胞(图18C)。示出了对CD45⁺细胞进行门控的代表性F4/80与CD11b染色图谱(顶图)，对F4/80⁺CD11b⁺细胞进行门控的Ly6C与Ly6G染色图谱(底图)。对图18C的巨噬细胞进行门控的MHCII直方图。图18D示出了来自图18C的骨髓巨噬细胞中的MHCII表达的总结数据。示出的数据是平均值±标准差。*P<0.05，**P<0.01，并且***P<0.001，通过T测试。

图19A-图19D示出了M1型化合物葫芦素I也激活巨噬细胞并抑制肿瘤生长。图19A示出了葫芦素I在体外抑制由IL4/IL13诱导的肿瘤相关巨噬细胞的发育和功能。小鼠BMM在正常培养基中(第1组)或者在IL4/IL13的存在下(第2组)不处理或者用2.5mM硫链丝菌素处理24小时，或者小鼠BMM用IL4/IL13极化24小时，然后不处理或者用2.5mM硫链丝菌素处理24小时(第3组)。分离RNA，并且通过PCR来量化所示基因的转录物水平。作为平均值±标准差示出的数据总结自两个独立实验。*P<0.05并且**P<0.01，通过T测试。图19B示出了用DMSO、TA99、葫芦素I(1mg/kg)和葫芦素I加上TA99腹膜内处理的B6小鼠中的B16F10肿瘤生长(每组6只小鼠)。数据作为平均值±标准误差示出。图19C-图19D示出了在肿瘤植入后18天，用DMSO、TA99、葫芦素I和葫芦素I加上TA99处理的小鼠的肿瘤中的TAM(F4/80⁺CD11b⁺Ly6C^-Ly6G^-)、炎性单核细胞(F4/80^intCD11b⁺Ly6C⁺Ly6G^-)和单核细胞(F4/80^-CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G⁺)的流式细胞术分析。示出了对CD45+细胞进行门控的代表性F4/80与CD11b染色图谱，以及对来自c的巨噬细胞进行门控的MHCII直方图。

图20A-图20F示出了DPI刺激巨噬细胞中的糖酵解的快速和持续增加。图20A示出了具有所涉及的酶和中间体的糖酵解途径以及具有所选中间体的TCA循环。图20B-图20C示出了DPI对ImKC中的ECAR(图20B)和OCR(图20C)的短期影响。ECAR和OCR通过Seahorse分析仪在ImKC中测量20分钟，然后在添加不同浓度的DPI(5、50或500nM)后再测量120分钟，然后在添加鱼藤酮加上抗霉素A(Rot/AA)(图20B)或2-脱氧葡萄糖(2-DG)(图20C)后再测量40分钟。示出了三个独立实验的代表性数据。图20D-图20E示出了DPI对ECAR的长期影响。将ImKC接种，并且在有或没有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时。然后在依次添加15mM葡萄糖、2μM寡霉素和50mM Rot加上1μM AA的基础条件下测量ECAR值(图20D)。计算了糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备的具体参数，并且数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝18)(图20E)。图20F示出了所选的代谢物水平。ImKC用DPI处理6小时，并通过LC-MS量化糖酵解途径和TCA循环中的所选代谢物。数据表示为平均值±标准差(n＝4)。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图21A-图21I示出了DPI通过GPR3和β-阻遏蛋白2刺激糖酵解。图21A-图21B示出了DPI刺激的糖酵解不依赖于NOX活性。将野生型(WT)和p47phox^-/-BMDM接种，并且在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR(图21A)。在不存在或存在NOX抑制剂夹竹桃麻素(100μM)的情况下，将WT BMDM接种，并且在没有或有DPI(500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR(图21B)。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图21C示出了DPI对WT和p47phox^-/-BMDM中的葡萄糖摄取的影响。在荧光葡萄糖类似物2-NBDG的存在下，用DMSO或DPI(50和500nM)处理BMDM 24小时。通过流式细胞术测量细胞中的2-NBDG的平均荧光强度(MFI)，并将其归一化成野生型BMDM的DMSO对照。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。图21D示出了DPI刺激的糖酵解需要GPR3。使用对Gpr3具有特异性的siRNA或作为对照的乱序siRNA来转染ImKC。48小时后，将转染的ImKC接种，并且在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图21E示出了在2-NBDG的存在下，将转染的ImKC在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，以测量葡萄糖摄取。数据表示为平均值±标准差(n＝4)。图21F示出了ImKC与DMSO、DPI(500nM)或S1P(3mM)一起孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为平均值±标准差(n＝12)。图21G示出了DPI刺激的糖酵解需要β-阻遏蛋白-2。通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑来构建Abbr2^-/-ImKC。将WT和Abbr2^-/-ImKC接种，并且在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图21H示出了在2-NBDG的存在下，将WT和Abbr2^-/-ImKC在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，以测量葡萄糖摄取。数据表示为平均值±标准差(n＝4)。图21I示出了DPI诱导β-阻遏蛋白2易位至细胞质膜。ImKC用Abbr2-GFP融合基因转染，并且用DMSO、DPI(50nM)或S1P(3mM)刺激。在所示时间点用TIRF显微镜捕获GFP信号。示出了来自三个独立实验的0分钟和10分钟时的GFP信号和合并信号的代表性数据。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图22A-图22E示出了DPI通过形成GPR3-β-阻遏蛋白2-GAPDH-PKM2酶促超复合物来刺激糖酵解活性的快速增加。图22A示出了β-阻遏蛋白2与ERK1/2、烯醇化酶、GAPDH和PKM2的Co-IP。ImKC用β-阻遏蛋白2转染，然后用或不用50nM DPI处理6小时。用抗β-阻遏蛋白2沉淀细胞裂解物，并通过蛋白质印迹法分析所示蛋白质的沉淀物。示出了来自三个实验之一的代表性数据。图22B示出了DPI刺激的糖酵解需要PKM2。由野生型和Pkm^-/-小鼠制备BMDM，接种，并且在有或没有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图22C示出了在2-NBDG的存在下，将WT和Pkm^-/-BMDM接种，并且在有或没有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，以测量葡萄糖摄取。数据表示为平均值±标准差(n＝4)。图22D-图22E示出了DPI刺激PKM2和GAPDH的酶活性。野生型和Abbr2^-/-ImKC用DPI(500nM)处理6小时，并且通过比色测定试剂盒测量PKM2(图22D)和GAPDH(图22E)的酶活性。数据表示为平均值±标准差(n＝6)。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图23A-图23D示出了DPI通过PKM2的核易位和转录激活来刺激糖酵解活性的持续增加。图23A示出了DPI诱导的糖酵解基因转录需要PKM2。WT和Pkm^-/-BMDM未处理或用DPI(50和500nM)处理24小时。通过实时qPCR测量Pkm、Ldha、Hk2和c-Myc的转录物水平。数据从两个独立的实验中收集，每组有3个生物学重复份。转录水平首先归一化为β-肌动蛋白，然后归一化为DMSO对照。数据表示为平均值±标准差。图23B示出了DPI对二聚体PKM2的诱导。ImKC未处理或用DPI(50和500nM)处理6或12小时。将细胞裂解物在天然PAGE凝胶上运行，并且通过蛋白质印迹法分析。示出了来自两个独立实验的代表性数据。图23C示出了DPI诱导PKM2的核易位。ImKC和人原代KC未处理或用DPI(50nM)处理24小时，用抗PKM2和DAPI染色，然后进行共聚焦成像。示出了两个独立实验的代表性图像。将放大的区域框起来。图23D示出了DPI刺激c-Myc的反式激活。将c-Myc荧光素酶报告基因质粒转染到WT和Pkm^-/-BMDM中。转染的细胞未处理或用DPI(50和500nM)处理6小时，并且测量荧光素酶活性。数据表示为平均值±标准差(n＝5)。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图24A-图24H示出了DPI通过库普弗细胞中的PKM2表达来抑制HFD诱导的肥胖和肝脏发病机制。图24A-图24B示出了DPI防止喂食HFD的小鼠体重增加。5周龄的雄性B6小鼠用HFD或正常食物(ND)喂养共8周。HFD(箭头)三周后，每五天对一半的小鼠给予DPI的媒介物溶液(2mg/kg)，并且对另一半小鼠仅给予媒介物，总共6剂。每周监测体重(图24A)和食物消耗(图24B)。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差，每组12-15只小鼠。图24C示出了在HFD 8周后小鼠的eWAT和iWAT的重量。每个点代表一只小鼠。图24D示出了快速葡萄糖测定。图24A中的小鼠在第7周加3天时被饥饿过夜(12至16小时)，仅饮水。腹膜内注射葡萄糖(1mg/kg)，并且在所示时间监测血糖水平。计算AUC用于统计(右图)。图24E示出了AST和ALT的血清水平。收集图24A中的小鼠的血清，并且通过比色测定试剂盒(Sigma)测量AST和ALT的活性。图24F示出了在HFD 8周后，用媒介物或DPI处理的HFD小鼠的肝脏切片的H&E染色比较。示出了图24A中每组一只小鼠的代表性H&E染色。箭头指向脂滴。比例尺：100μm。图24G-图24H示出了DPI对喂养HFD的KC特异性Pkm^-/-小鼠的影响。5周龄的雄性KC特异性Pkm^-/-小鼠用HFD喂养总共8周。HFD三周后，每5天对一半的小鼠给予DPI的媒介物溶液(2mg/kg)，并且对另一半小鼠给予媒介物，总共6剂。每周监测体重(图24G)。数据表示为两个独立实验的平均值±标准差，每组6只小鼠。在HFD 8周后，肝脏切片的H&E染色比较。示出了每组一只小鼠的代表性H&E染色。图24F和图24H中的箭头指向脂滴。比例尺：100μm。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图25A-图25D示出了DPI上调HFD喂养的小鼠中的库普弗细胞的糖酵解并抑制其炎症反应。图25A示出了从喂食ND或HFD的小鼠中分离的KC中的基因表达比较。在HFD 8周后，由图24A中的小鼠制备单细胞悬液(每组6只小鼠)，用抗F4/80、抗CD11b和抗Gr-1染色。F4/80⁺CD11b⁺Gr1^低巨噬细胞通过细胞分选进行纯化，然后进行RNAseq。示出了三个组中差异表达的基因。图25B示出了DEG的功能富集分析，其基于HFD喂养和ND喂养的小鼠的KC或用DPI或媒介物处理的HFD喂养的小鼠的KC的比较。图25C示出了HFD和ND小鼠的KC或用DPI或媒介物处理的HFD小鼠的KC的基因表达谱的GSEA。图25B和图25C中的图表表明了标记的上调和下调途径。图25D示出了巨噬细胞极化指数分析，其基于图25A中的表达图谱，使用在线软件MacSpectrum(参见万维网macspectrum.uconn.edu)。M1型极化表示为正分数，而M2型极化表示为负分数。

图26A-图26H示出了DPI上调NAFLD患者的库普弗细胞的糖酵解并抑制其的炎症反应。图26A-图26D示出了巨噬细胞群的scRNAseq分析。将基于CD14和CD68表达的总共5,497个巨噬细胞(图35A中的簇5、8和12)通过tSNE进行聚类分析。总共鉴定了7个簇(图26A)。计算并示出了每个样品中每个簇的相对比例(图26B)。每个簇都基于典型标记的表达进行注释，如点图(图26C)和热图(图26D)所示。图26E示出了弹弓(slingshot)对肝脏巨噬细胞的轨迹推断(Street等人2018)。图26F示出了C3和C1和C2之间的DEG的GO富集分析。图26G-图26H示出了从NAFLD肝脏活检中分离的原代KC中的由DPI诱导的基因表达变化的比较。从NAFLD人肝脏活检(n＝2)的单细胞悬液中分选出CD14⁺KC，并且用DMSO或DPI(500nM)处理24小时，然后进行RNAseq以量化基因表达。示出了糖酵解基因和DAM标记的表达变化(图26G)以及KC中的DPI诱导的DEG的GO富集分析(图26H)。图26F和图26H中的图表表明了标记的上调和下调途径。

图27A-图27C示出了DPI刺激巨噬细胞中的糖酵解的快速和持续增加。图27A示出了在用50nM DPI处理24小时后，DPI刺激人原代巨噬细胞中的糖酵解基因的转录。转录物水平的热图基于对Hu等人2021的RNAseq数据的再分析。图27B示出了DPI在蛋白质水平刺激糖酵解酶的表达，如通过蛋白质印迹法测量。从所示浓度下的未处理或用DPI处理6小时和12小时的小鼠ImKC或者未处理或用DPI处理12小时的人原代巨噬细胞中分离出总蛋白裂解物。对来自全细胞裂解物的等量总蛋白进行蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作内部参照(loading control)。示出了两个独立实验的代表性数据。图27C示出了ImKC中的代谢物分析。ImKC用DPI(500nM)处理24小时，并且通过LC-MS量化所选代谢物。示出了两个独立实验的代表性数据。P值通过学生t测试计算。*P<0.05,**P<0.01。n.s.不显著。

图28A-图28I示出了DPI通过GPR3和β-阻遏蛋白2刺激糖酵解。图28A-图28B示出了DPI刺激的糖酵解不依赖于NOX活性。将野生型(WT)和p47phox^-/-BMDM接种，并且在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。基于两个独立实验来计算和总结糖酵解能力和糖酵解储备的具体参数。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图28C示出了用乱序或siGpr3转染的ImKC中的GPR3的蛋白质印迹。图28D-图28E示出了用对Gpr3具有特异性的siRNA或乱序siRNA转染的ImKC。48小时后，将转染的ImKC接种，并且在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图28F示出了野生型或Abbr2^-/-ImKC中的β-阻遏蛋白2的蛋白质印迹。图28G-图28H示出了，将WT和Abbr2^-/-ImKC接种，并且在没有或有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图28I示出了BMDM用Arrb2-GFP融合基因转染，并且用DMSO或DPI(50nM)刺激。在所示时间点用TIRF显微镜捕获GFP信号。示出了来自三个独立实验的0分钟和10分钟时的GFP信号和合并信号的代表性数据。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。n.s.不显著。

图29A-图29D示出了DPI通过形成GPR3-β-阻遏蛋白-GAPDH-PKM2酶促超复合物来刺激糖酵解活性的快速增加。图29A-图29B示出了DPI对野生型和Pkm^-/-BMDM中糖酵解的影响的比较。由野生型和PKM2^-/-小鼠生成BMDM，接种，并且在有或没有DPI(50和500nM)的情况下孵育24小时，并且通过Seahorse分析仪测量ECAR。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(n＝15)。图29C-图29D示出了DPI对PKM2和GAPDH酶活性的激活被ERK1/2抑制剂抑制。ImKC用单独的DMSO或DPI(500nM)或用DPI加上ERK1/2抑制剂(SCH772984，1mM)处理6小时，并且通过比色测定试剂盒(Biovision)测量PKM2(c)和GAPDH(d)的酶活性。数据表示为平均值±标准差(n＝6)。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。n.s.不显著。

图30A-图30B示出了DPI通过形成二聚体PKM2来刺激糖酵解活性的持续增加。图30A示出了DPI对二聚体PKM2的诱导。ImKC未处理或用DPI(50和500nM)处理6或12小时。细胞用交联剂DSS处理并裂解。将裂解物在SDS-PAGE上运行，并且通过蛋白质印迹法分析。示出了来自两个独立实验的代表性数据。图30B示出了在DPI的存在下，ERK1/2的磷酸化被SCH772984抑制。在存在或不存在SCH772984的情况下，ImKC未处理或用DPI(50和500nM)处理12小时。将细胞裂解，并且通过蛋白质印迹分析总ERK1/2和磷酸化ERK1/2。示出了来自两个独立实验的代表性数据。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。n.s.不显著。

图31示出了DPI刺激小鼠的血糖代谢。对10周龄的C57BL/6小鼠单次腹膜内注射DPI(2mg/kg)。六小时后(-360分钟)，对小鼠腹膜内注射葡萄糖(1.5mg/kg)。在所示时间监测血糖水平。数据表示为平均值±标准差，每组5只小鼠。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图32A-图32E示出了DPI抑制HFD诱导的肥胖和肝脏发病机制。图32A-图32B示出了5周龄的雄性B6小鼠用HFD喂养总共16周。HFD九周后(箭头)，每5天对一半的小鼠给予媒介物，并且对另一半小鼠给予DPI的媒介物溶液(2mg/kg)，总共6剂。每周监测重量(图32A)和食物消耗(图32B)。数据表示为两个独立实验的平均值±标准差，每组9-10只小鼠。图32C示出了在HFD 16周后的eWAT和iWAT的重量。图32D示出了快速葡萄糖测定。在第15周加3天时，图32A中的小鼠被饥饿过夜(12至16小时)，仅饮水。腹膜内注射葡萄糖(1mg/kg)，并且在所示时间测量血糖水平。计算AUC用于统计(右图)。图32E示出了用媒介物或DPI治疗的HFD小鼠的肝脏切片的H&E和三色染色的比较。示出了a中的每组一只小鼠的代表性H&E染色。比例尺：100μm。P值通过学生t测试计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。n.s.不显著。

图33示出了PKM2和PKM1在人和小鼠库普弗细胞和肝细胞中的表达。使用Seurat包中的特征图，再分析正常人肝脏和小鼠肝脏的scRNAseq数据的以获得PKM2和PKM1以及巨噬细胞(VSIG4或F4/80)和肝细胞(APOC3或Apoc3)的标记的表达。在小鼠数据集中，少量的肝细胞(Apoc3+)是由于在富集免疫细胞用于scRNAseq的过程中去除了肝细胞。

图34A-图34C示出了DPI对HFD喂养的库普弗细胞特异性Pkm^-/-小鼠的影响。图34A示出了快速葡萄糖测定。对KC特异性Pkm^-/-小鼠给予HFD，总共8周。HFD三周后，每5天对一半的小鼠给予DPI的媒介物溶液(2mg/kg)，并且对另一半小鼠给予媒介物，总共6剂。在第7周加3天时，小鼠被饥饿过夜(12至16小时)，仅饮水。腹膜内注射葡萄糖(1mg/kg)，并且在所示时间监测血糖水平。图34B示出了HFD 8周后的eWAT和iWAT的重量。图34C示出了AST和ALT的血清水平。在HFD喂养结束时收集小鼠的血清，并且通过比色测定试剂盒(Sigma)测量AST和ALT的活性。示出了来自两个独立实验的代表性数据，每组5至6只小鼠。P值通过学生t测试计算。n.s.不显著。*P<0.05。

图35A-图35D示出了健康和NAFLD人肝脏的活检的免疫细胞的单细胞RNAseq分析。将来自3名健康和3名NAFLD人肝脏活检的总共47,724个免疫细胞通过tSNE聚类成14个簇(图35A)。基于典型标记(如T细胞和B细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)的表达对每个簇进行注释，如点图所示(图35B)。计算并示出了每个样品中的每个簇的细胞分数(图35C)和每个簇的相对比例(图35D)。

图36示出了不同肝脏巨噬细胞亚群的DEG的GO富集分析。如将min.fct设置为0.25并将logfc.阈值设置为0.25所示，使用Seurat包中的FindMarkers函数在不同簇之间鉴定DEG。通过在线工具DAVID(参见万维网david.ncifcrf.gov)将上调和下调的DEG应用于GO本体富集分析。示出了基于重要性和冗余选择的排名靠前的GO术语和p值。图表表明了标记的上调和下调途径。

具体实施方式

巨噬细胞具有显著的可塑性，并且响应于不同的局部刺激可以向多维表型谱极化，包括促炎M1样和抗炎M2样状态。使用高通量表型筛选，从约4000种FDA批准的药物、生物活性化合物和天然产物的库中鉴定出约300种化合物，这些化合物有效激活原代人巨噬细胞为促炎(M1样)或抗炎(M2样)状态。在命中中，约30种能够将M1样巨噬细胞重编程为M2样状态，并且另外约20种能够将M2样巨噬细胞重编程为M1样状态。通过RNA-seq对巨噬细胞重编程上的34个非冗余命中进行转录分析，确定了所选命中调节巨噬细胞激活的共享途径，以及单个化合物刺激巨噬细胞激活的新的独特靶标和途径。一种M1激活化合物，硫链丝菌素，还显示在小鼠中将肿瘤相关巨噬细胞重编程为M1样状态，并且单独或与抗体治疗剂组合表现出有效的抗肿瘤活性。本文描述了参与巨噬细胞激活的新化合物、靶标和途径。本文所述的方法不仅为研究巨噬细胞生物学提供了宝贵的资源，还为开发新型治疗剂或重新定位用于通过调节巨噬细胞激活来治疗疾病的已知药物提供了宝贵的资源。

巨噬细胞是一类关键的吞噬细胞，其容易地吞噬和降解濒死/死亡的细胞以及入侵的细菌和病毒。因此，巨噬细胞在发育、组织稳态和修复以及免疫方面发挥重要作用。一贯地，巨噬细胞在早期个体发育期间和整个成年生活中生成。在哺乳动物中，第一波巨噬细胞从卵黄囊生成，并且在中枢神经系统中产生巨噬细胞，即，例如小胶质细胞。第二波巨噬细胞从胎儿肝脏生成，并在肺中产生肺泡巨噬细胞以及在肝脏中产生库普弗细胞(Kupffercell)等。出生后，巨噬细胞从骨髓中生成，造血干细胞在骨髓中产生单核细胞，单核细胞在从血液迁移到特定组织后分化为组织驻留巨噬细胞。

巨噬细胞的一个显著特征是它们的可塑性：能够响应局部刺激以获得不同的表型和功能，以便响应不断变化的生理需求。来自不同组织的巨噬细胞表现出不同的表型和功能。例如，肝脏中的库普弗细胞在降解毒性和废弃产物以及维持代谢稳态方面发挥作用，而肺中的肺泡巨噬细胞在从呼吸系统表面去除灰尘、微生物和表面活性剂方面发挥作用，尽管它们都来源于胎肝。在同一组织内，巨噬细胞是异质的，并且可以改变表型和功能以响应不断变化的局部组织环境。例如，巨噬细胞可以通过Fc受体介导的吞噬作用(抗体依赖性细胞吞噬作用或ADCP)消除抗体结合的肿瘤细胞。然而，一旦适应了肿瘤微环境，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)就抑制抗肿瘤免疫反应并且促进肿瘤生长和转移。

巨噬细胞的可塑性是它们被激活成表型谱并获得多种功能的能力的基础。一个极端是经典激活的促炎M1巨噬细胞，而另一个极端是替代激活的抗炎M2巨噬细胞。通过表达炎性细胞因子，诸如IFNγ和TNFα以及反应性氧物质，M1巨噬细胞介导抗微生物和抗肿瘤反应，但如果超激活也会引起炎症和组织损伤。相反，通过表达抗炎细胞因子，诸如IL-10、TGFβ和精氨酸酶，M2巨噬细胞介导组织修复，但如果失调也会介导纤维化。虽然M1和M2用于以简单的方式定义巨噬细胞的相反激活状态，但大多数巨噬细胞表现出多维表型谱以响应各种生理和病理信号。通过对响应29种不同刺激(诸如促炎和抗炎细胞因子)的人单核细胞衍生的巨噬细胞(hMDM)的转录分析，确定了49个与巨噬细胞激活相关的基因表达模块。巨噬细胞激活/可塑性的许多方面仍未明确定义。特别地，小分子如何调节巨噬细胞激活仍有待阐明。

因为它们在维持组织稳态和修复方面的关键功能，所以巨噬细胞极化失调涉及导致许多人类疾病，包括癌症、纤维化、肥胖、糖尿病以及感染性疾病、心血管疾病、炎性疾病和神经退行性疾病。例如，TAM是实体瘤中存在的最丰富的免疫细胞之一。临床和实验研究显示，TAM产生各种膜性和可溶性因子，所述因子增强肿瘤细胞的生长和侵袭，并且抑制抗肿瘤免疫反应，从而允许癌细胞逃避免疫监视。TAM衍生自肿瘤微环境中的循环单核细胞，它逐渐使巨噬细胞进入免疫抑制状态，在表型上类似于M2激活的巨噬细胞。将M2样TAM重编程为M1样巨噬细胞与强抗肿瘤活性的表达有关。在显著的协同作用中，环磷酰胺激活的巨噬细胞与单克隆抗体治疗剂相组合，有效地消除了难治性骨髓微环境中的白血病细胞。单独或与抗体治疗剂组合将TAM重新极化为促炎、抗肿瘤发生的M1样状态证明是癌症免疫疗法的有效方法。更广泛地说，由于巨噬细胞激活失调已成为许多疾病发展和进展的关键决定因素，因此调节巨噬细胞激活可能是富有成效的疾病干预方法。

本文描述了激活原代人巨噬细胞的小分子的高通量表型筛选。通过筛选包括FDA批准的药物、生物活性化合物和天然产物的4126种化合物的库，确定了有效激活M-CSF培养的巨噬细胞为促炎M1样或抗炎M2样状态(或谱)的约300种化合物。在这些命中中，约30种能够将IL4/IL13诱导的M2样巨噬细胞重编程为促炎M1样巨噬细胞，并且另外约20种能够将IFNγ/TNFα诱导的M1样巨噬细胞重编程为抗炎M2样巨噬细胞。通过用RNA-seq分析34个所选命中对巨噬细胞重编程的影响，我们鉴定出介导巨噬细胞激活(或重编程)的新细胞途径。M1激活化合物硫链丝菌素和葫芦素I还显示在小鼠中将TAM重编程为M1样巨噬细胞，并且单独或与单克隆抗体治疗剂组合表现出有效抗肿瘤活性。本文的实施例揭示了巨噬细胞极化的显著可塑性，并且不仅为研究巨噬细胞生物学提供了宝贵的资源，还为开发新型疗法或重新定位已知药物以通过巨噬细胞重编程来治疗疾病提供了宝贵的资源。此外，表型筛选可以扩展到更大的化合物库，并且与转录分析相组合是阐明巨噬细胞极化中的用于精确疾病干预的小分子化合物的作用机制的有力方法。

本文所述的高通量表型筛选基于响应于化合物的巨噬细胞形状变化。基于以下考虑，细胞形状变化是巨噬细胞激活的有效表型分析。第一，细胞形状的变化是由细胞骨架动力学的变化介导的，并且已知通常与细胞功能的不同状态有关。更具体地说，在体外激活成不同的表型之后，小鼠和人巨噬细胞都表现出显著不同的细胞形状：M2样巨噬细胞为细长形，而M1样巨噬细胞为圆形。一贯地，我们证明了已知的M1激活刺激LPS、IFNγ和TNFα诱导分化的巨噬细胞的圆形，而已知的M2激活刺激IL4、IL13和IL10诱导分化的巨噬细胞的细长细胞形状(图1)。类似地，基于细胞因子谱和全基因组基因表达，GM-CSF诱导的圆形人巨噬细胞和M-CSF诱导的细长人巨噬细胞分别表现出M1样和M2样表型。第二，已经证明了，通过细胞外应激或药物紫杉醇诱导细胞骨架变化会导致巨噬细胞极化。在本文的实施例中，我们还鉴定出若干种通过直接调控肌动蛋白细胞骨架来调节巨噬细胞形态的化合物/药物，包括紫杉醇以及其他M1激活化合物：细胞松弛素-B、芬苯达唑、帕苯达唑、甲巯咪唑，和M2激活化合物：普达非洛、秋水仙碱和硫酸长春碱。人巨噬细胞对芬苯达唑和紫杉醇的反应的分析进一步证实，这两种药物在转录和翻译水平上将巨噬细胞激活成M1样表型(图2C、图4、图9C和图11)。第三，尽管我们在初始表型筛选中使用细胞形状变化作为高通量读数，但我们通过RNA-seq(图2和图4)和通过流式细胞术的典型M1和M2标记的蛋白质表达(图11)证实了超过40种所选化合物在全基因组水平上对巨噬细胞激活的影响。正如预期的那样，DEG的途径分析将细胞形态发生和细胞骨架组织确定为受化合物调控的主要GO术语(图4C)。因此，基于细胞形状的表型分析是筛选激活人巨噬细胞的小分子化合物的有效方法。本文的实施例中的数据是使用原代人巨噬细胞的第一个概念验证大规模筛选。筛选可以扩展到更大的化合物库，因为基于显微镜的细胞形状分析可以容易地放大。如下文进一步讨论的，表型筛选和转录分析的组合可以是鉴定化合物及其在巨噬细胞激活中的作用机制以开发新药物的有力方法。

本文的数据鉴定出介导巨噬细胞激活的化合物、靶标和途径，并且阐明了潜在的分子机制。在我们的库中，许多化合物具有已知的蛋白质靶标。基于对M1或M2激活化合物的蛋白质靶标的功能途径富集分析，我们鉴定出巨噬细胞激活中的已知途径，诸如细胞因子。更重要的是，我们鉴定出介导巨噬细胞激活的新途径，包括瘦素、VEGF、EGF和神经递质途径。尽管研究证明了巨噬细胞功能中的这些途径，但它们对巨噬细胞激活的影响和潜在机制尚不清楚。我们对巨噬细胞的转录分析表明，这些途径的配体通过调控典型M1和M2模块的基因表达来激活巨噬细胞。例如，在hMDM中，瘦素上调由IFNγ诱导的典型M1模块的表达，同时抑制慢性炎症TPP模块的表达(图2)。值得注意的是，血清素转运蛋白和受体、组胺转运蛋白和受体、多巴胺转运蛋白和受体以及肾上腺素能受体的配体全部刺激了M1样巨噬细胞的激活，从而阐明了神经元和免疫系统之间的串扰以及巨噬细胞激活在神经系统疾病中的潜在角色。

巨噬细胞表现出超越M1和M2的多维表型谱。我们对靶向GPCR、酶、激酶、核激素受体(NHR)和转运蛋白的多种巨噬细胞激活化合物的鉴定(图1G)增加了巨噬细胞可塑性的分子基础，并且还鉴定出巨噬细胞激活的新途径。我们使用超过40种所选化合物进行了广泛的转录分析，确定了每种化合物如何通过共享机制和独特途径刺激巨噬细胞激活。所有化合物都通过常见途径(诸如炎症反应、免疫反应、趋化因子和细胞因子介导的信号传导途径)调节巨噬细胞激活。此外，每种化合物都通过其特定的细胞靶标诱导巨噬细胞的独特转录反应；并且不知道许多这些独特的途径介导巨噬细胞激活。例如，硫链丝菌素显示通过抑制蛋白酶体功能或FOXM而在癌细胞中具有抗增殖活性。在人类和小鼠巨噬细胞中，硫链丝菌素上调促炎基因的表达，以及与IFN/NFκB途径和氧化还原过程相关的基因的表达(图5和图17)。转录分析还揭示了，大多数鉴定的化合物通过调节一部分M1或M2特异性基因模块以及由M1或M2激活细胞因子诱导的共同特性(common denominators)来刺激巨噬细胞激活(图4C和图4D)。预期效果较温和，因为单个化合物仅通过相关蛋白质靶标来调控特异性信号传导途径(图4E)。这些观察结果进一步阐明了巨噬细胞激活的性质。鉴定的大量小分子化合物及其对应的靶标和途径是进一步研究基础巨噬细胞生物学的丰富资源。

本文所述的数据还提供了探索在疾病干预中用于调节巨噬细胞激活的化合物/靶标/途径的丰富的资源。重编程巨噬细胞已成为用于治疗多种疾病的重要方法。通过小分子化合物抑制M2样TAM成为M1样巨噬细胞或将其重编程为M1样巨噬细胞与单独的或与其他治疗剂组合的强抗肿瘤活性的诱导有关。类似地，抑制M1样巨噬细胞变为M2样状态或将其重编程为M2样状态显著抑制炎症和自身免疫疾病的进展。在这项研究中，我们证实了M1激活化合物硫链丝菌素和葫芦素I有效地将TAM重编程为M1样巨噬细胞，并且单独地或与抗体治疗剂组合增强抗肿瘤活性(图6、图18和图19)，从而证明可以探索M1激活化合物以重编程M2样巨噬细胞以治疗癌症和纤维化，其中M2样巨噬细胞在疾病过程中发挥重要作用。类似地，可以探索M2极化化合物以通过抑制M1样巨噬细胞的炎症活性来治疗炎性疾病。在复杂疾病中，已知致病性巨噬细胞是异质的，包括M1和M2样表型，或具有带有M1样和M2样表型的混合特征的过渡或中间表型，或者在疾病进展期间表现出动态表型。为了靶向期望的巨噬细胞群，在正确的时间窗口内抑制致病性巨噬细胞中的签名基因/途径的表达是至关重要的。我们通过转录分析鉴定了由每种化合物调节的独特途径，为选择适当的化合物来重编程巨噬细胞以进行精确疾病干预提供了基础。

激活库普弗细胞中的GPR3-β-阻遏蛋白2-PKM2途径通过增强糖酵解来防止肥胖和 肝脏发病机制

越来越多的证据表明了巨噬细胞在调控体重和肥胖相关病理方面的关键作用。然而，潜在的分子和细胞机制仍有待阐明。在此处，我们证明了作为G蛋白偶联受体3(GPR3)的激动剂的二亚苯基碘鎓(DPI)在细胞水平上刺激糖酵解的快速和持续增加，并且保护小鼠免受高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖和肝脏发病机制。DPI激活GPR3导致β-阻遏蛋白2快速募集至质膜，形成β-阻遏蛋白2-GAPDH-PKM2超复合物，极大增加GAPDH和PKM2的酶活性，因此糖酵解活性迅速增加。DPI刺激还导致形成PKM2二聚体，PKM2从胞质溶胶易位至细胞核、c-Myc的反式激活和糖酵解基因的转录，从而导致糖酵解持续增加。在小鼠中，DPI通过以PKM2依赖性方式增强糖酵解和抑制库普弗细胞的炎症反应来抑制HFD诱导的肥胖和肝脏发病机制。在患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患者中，单细胞RNA测序鉴定出一群疾病相关巨噬细胞，这些巨噬细胞表现出糖酵解基因表达减少，但炎症基因表达增加。DPI刺激糖酵解并且抑制NAFLD患者的库普弗细胞的炎症反应。这些发现确定了GPR3-β-阻遏蛋白2-PKM2信号传导是库普弗细胞的代谢重编程的关键途径，并且这种途径的激活是抑制肥胖和NAFLD发展的潜在方法。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球最常见的肝脏病症，并且是由肝脏中的脂肪沉积诱导的。NAFLD经历一系列阶段：从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)再到肝硬化。尽管疾病的发病机制尚不清楚，但NAFLD的发展与肥胖和糖尿病高度相关，并且在病理遗传上与肝脏中的脂质积累、炎症、损伤和纤维化相关。由于NFLAD也是一种代谢紊乱，将代谢与炎症联系起来的机制提供了对发病机制的深入了解，并且有助于确定治疗剂开发的靶标。

库普弗细胞(KC)是肝脏中的驻留巨噬细胞，并且是体内最丰富的组织巨噬细胞。它们在解毒、去除病原体以及组织修复和稳态方面发挥关键作用，但它们也可能促进肝病(包括NAFLD)的发病机制，因为它们参与炎症和组织损伤的引发和进展。为了响应局部刺激，KC调控稳态肝脏中的代谢和免疫功能。脂质和其他代谢物已经显示不仅调控人巨噬细胞中与免疫反应相关的基因的表达，还可以调节脂肪肝和脂肪性肝炎模型中的KC激活。疾病相关巨噬细胞(DAM)已经通过单细胞RNA测序(scRNAseq)在晚期NAFLD(NASH和肝硬化)患者和小鼠NASH模型的肝脏中鉴定。DAM表现出与炎症和代谢相关的途径表达改变，这表明重编程功能失调的巨噬细胞可能是治疗NAFLD的有前途的策略。

G蛋白偶联受体(GPCR)在代谢紊乱中发挥重要作用，因为它们是代谢物和脂肪酸的受体。在我们筛选可以重编程巨噬细胞的化合物时，我们发现作为GPR3激动剂的二亚苯基碘鎓(DPI)上调参与糖酵解和脂质代谢的基因的表达。GPR3在大脑中高度表达，并且已经显示在神经过程中发挥重要作用。GPR3被认为是一种组成型活性孤儿受体，在不存在配体的情况下介导持续的cAMP产生。调控GPCR信号传导的一个重要机制是脱敏，其涉及受体激酶(GRK)和β-阻遏蛋白。GPR3通过募集支架蛋白β-阻遏蛋白2来调控γ-分泌酶活性，从而刺激Aβ的产生。尽管取得了这些进展，但人们对GPR3信号传导在其他细胞类型中的功能和机制知之甚少，尤其是在调控代谢方面。

我们研究了DPI对巨噬细胞的代谢重编程的影响、潜在的分子机制以及DPI对高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖和发病机制的生理影响。我们证明了：i)DPI通过刺激β-阻遏蛋白2-GAPDH-PKM2超复合物的形成而诱导巨噬细胞中的细胞代谢从氧化磷酸化(OxPhos)快速转变为糖酵解，同时酶活性极大增加；ii)DPI还通过刺激PKM2从胞质溶胶易位至细胞核、c-Myc的反式激活和糖酵解基因的转录来诱导糖酵解活性的延长增加；iii)DPI通过在KC中刺激糖酵解和抑制炎症并且以需要KC中的PKM2表达的方式抑制小鼠中HFD诱导的肥胖和肝脏发病机制；和iv)DPI还刺激糖酵解并且抑制NAFLD患者的KC炎症。这些发现确定了GPR3至β-阻遏蛋白2至PKM2并且至c-Myc信号传导是巨噬细胞的代谢重编程的关键途径，并且在KC中激活该途径是用于肥胖和NAFLD的治疗干预的方法。

据报道，DPI是GPR3的激动剂和NOX的抑制剂。与先前NOX缺乏导致细胞糖酵解降低的观察结果一致，我们发现巨噬细胞中的p47phox^-/-BMDM和夹竹桃麻素(apocynin)对NOX活性的抑制导致糖酵解活性的基础水平显著降低。然而，DPI(50nM)在p47phox^-/-BMDM中刺激糖酵解增加的水平与在野生型BMDM中类似(或者有或没有抑制剂夹竹桃麻素)，从而证明DPI刺激糖酵解不依赖于NOX活性。相反，尽管GPR3敲低也降低了糖酵解活性的基础水平，但DPI(50nM)无法刺激糖酵解的任何显著增加，从而表明DPI通过激活GPR3来刺激糖酵解。同样，β-阻遏蛋白2和PKM2是介导DPI对糖酵解的影响所需的，因为在BMDM中敲除这些基因会消除DPI诱导的糖酵解。β-阻遏蛋白2与PKM2之间的差异在于，前者是维持基础糖酵解活性阈值水平所需的，而后者则不是必需的。这些遗传分析确定了信号传导途径，其涉及GPR3、β-阻遏蛋白2和PKM2介导DPI对糖酵解的影响，以及NOX、GPR3和β-阻遏蛋白2维持基础细胞糖酵解的阈值水平。由于作为GPR3的推定内源性配体的SIP也诱导巨噬细胞中的糖酵解的显著增加，因此确定的途径可能在代谢重编程中发挥作用以响应内源性配体。

与β-阻遏蛋白2通过充当支架蛋白在GPCR信号传导中的关键作用一致，我们证明DPI的GPR3激活导致β-阻遏蛋白2快速募集至质膜(图21I)，大概是快速募集至GPR3。在生物化学方面，我们还证明了，DPI的GPR3激活导致以ERK1/2依赖性方式(图30)形成糖酵解酶超复合物，包括β-阻遏蛋白2、烯醇化酶、GAPDH和PKM2(图22A)。极大增加的GAPDH和PKM2的酶活性为DPI治疗后的糖酵解活性的快速增加提供了生化基础。

我们发现DPI的GPR3激活也以ERK1/2依赖性方式促进PKM2二聚体的形成(图23B和图30A)。已知PKM2二聚体的ERK1/2依赖性形成从胞质溶胶易位至细胞核并且激活糖酵解基因的转录。事实上，DPI以PKM2依赖性方式刺激PKM2易位至ImKC和原代人KC中的细胞核中并且刺激c-Myc转录(图23C)。已知c-Myc通过结合经典的E-box序列来直接激活几乎所有的糖酵解基因。除了增加的转录水平，我们还通过报告基因测定证明了DPI在ImKC中刺激c-Myc反式激活活性(图23D)。这些发现提供了DPI刺激巨噬细胞中的糖酵解活性持续增加的分子机制。

与通过糖酵解提高导致葡萄糖消耗增加一致，DPI在生物体水平上对葡萄糖代谢和HFD诱导的体重增加、脂质沉积和肝脏纤维化具有深远影响。在正常条件下，DPI赋予小鼠更好的葡萄糖耐受(图31)。DPI显著抑制HFD诱导的体重增加而不影响采食量(图24和图32)。令人印象深刻的是，每5天对HFD肥胖小鼠进行DPI治疗能够几乎完全消除肝脏中的脂滴积聚和纤维化(图24F和图32E)，从而表明DPI对肝脏病理的影响并不完全依赖于体重减轻。支持这一观点的是，接受或未接受DPI治疗的HFD饲养小鼠的KC在糖酵解和炎症基因的表达方面存在显著差异(图25)。DPI极大地刺激了糖酵解途径中的基因表达，但抑制了炎症基因的表达，从而证明对肝脏病理的影响可能是糖酵解增加(因此脂质积累减少)和炎症(纤维化)减少的结果。值得注意的是，在小鼠KC中特异性敲除PKM2消除了DPI对HFD诱导的肥胖和肝脏发病机制的影响(图24G-图24H)，从而表明单独KC的代谢重编程足以防止肥胖和肝脏发病机制。

最后，我们证明了NAFLD患者肝脏中DAM的存在，所述DAM与NASH和肝硬化患者的肝脏中发现的那些具有相同的表型，包括TREM2、CD9、GPNMB、MHCII(HLA-DRB1)、C1QA和CLEC10A的表达。由于在具有不同病理(诸如小鼠中HFD诱导的NASH、疤痕组织、阿尔茨海默病和肺纤维化)的各种组织中观察到类似的DAM，来自不同疾病的DAM可能具有共同的基因表达特征。我们的scRNAseq显示DAM在糖酵解中受到抑制，但在炎症中增加，如糖酵解基因下调和炎症基因上调所表明的那样(图26)。重要的是，来自NAFLD患者的KC(包括DAM)通过上调糖酵解基因的转录和下调炎症基因的转录来响应DPI(图26G-图26H)。因此，重编程巨噬细胞代谢(诸如通过DPI)，是治疗多种代谢疾病的很有前途的治疗方法。

在一个方面，本文描述了一种鉴定巨噬细胞激活调节剂的方法。所述方法包括使原代巨噬细胞与候选剂接触；监测或拍摄与候选剂接触的细胞的形态；以及任选地将在候选剂存在的情况下的细胞形态与在候选剂不存在的情况下的细胞形态进行比较；其中在候选剂存在的情况下的形态变化指示巨噬细胞激活的调节。

在另一个方面，本文描述了一种治疗癌症、纤维化或感染性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂将巨噬细胞的形态从细长形改变成圆形。

在一个方面，本文描述了一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂将巨噬细胞的形态从圆形改变成细长形。

在另一个方面，本文描述了一种治疗癌症、纤维化或感染性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

在一个方面，本文描述了一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中调节剂抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

在另一个方面，本文描述了一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的二亚苯基碘鎓(DPI)。

定义

除非本文另外定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。一般来讲，本文所述的与化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学结合使用的名称和技术是本领域众所周知和常用的那些。

除非另外指示，否则本公开的方法和技术一般是根据本领域中众所周知并且如本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来执行。参见例如“Principles of Neural Science”,McGraw-Hill Medical,New York,N.Y.(2000)；Motulsky,“Intuitive Biostatistics”,Oxford University Press,Inc.(1995)；Lodish等人,“Molecular Cell Biology,4th ed.”,W.H.Freeman&Co.,New York(2000)；Griffiths等人,“Introduction to Genetic Analysis,7th ed.”,W.H.Freeman&Co.,N.Y.(1999)；和Gilbert等人,“Developmental Biology,6th ed.”,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(2000)。

本文使用的术语“剂”表示化学化合物(诸如有机或无机化合物、化学化合物的混合物)、生物大分子(诸如核酸、抗体，包括其部分以及人源化、嵌合和人抗体以及单克隆抗体、蛋白质或其部分，例如肽、脂质、碳水化合物)或由生物材料(诸如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织)制成的提取物。剂包括例如结构已知的剂和结构未知的剂。

“辅助剂”或“辅助疗法”泛指影响患者或受试者的免疫学或生理学反应的剂。例如，辅助剂可随时间推移增加抗原存在或增加感兴趣的区域(如肿瘤)的抗原存在，帮助吸收抗原呈递细胞抗原，激活巨噬细胞和淋巴细胞，并且支持细胞因子的产生。通过改变免疫反应，辅助剂可允许较小剂量的免疫相互作用剂来增加特定剂量的免疫相互作用剂的有效性或安全性。例如，辅助剂可防止T细胞耗竭，从而增加特定免疫相互作用剂的有效性或安全性。

术语“减少(decrease)”、“降低的(reduced)”、“降低(reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文中均用于意指减少统计上显著的量。在一些实施方案中，“降低(reduce)”、“降低(reduction)”、“减少(decrease)”或“抑制(inhibit)”通常意指与参考水平(例如，不存在给定配体)相比减少至少10％，并且可以包括，例如，减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低(reduction)”或“抑制(inhibition)”不涵盖与参考水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比的100％抑制。

如本文所用，术语“抗体”可指代完整抗体及其抗原结合片段两者。完整的抗体是包括通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。VH区和VL区可以被进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区间散布着被称为框架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体和抗原结合抗体片段。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留结合抗原的能力的片段。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、

分离的CDRH3和保留完整抗体的至少一部分可变区的其他抗体片段。这些抗体片段可以使用常规重组和/或酶促技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式来筛选抗原结合。

术语“增加的(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“激活(activate)”通常在本文中全部用于意指增加统计上显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％增加、或10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、至少约20倍增加、至少约50倍增加、至少约100倍增加、至少约1000倍增加或更多。

“免疫疗法”是使用受试者的免疫系统治疗癌症的治疗，并且包括例如检查点抑制剂、癌症疫苗、细胞因子、细胞疗法、CAR-T细胞和树突状细胞疗法。

“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人类、灵长类动物、家畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬、猫等)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。

“治疗”病状或患者是指采取措施以获得有益的或所需的结果，包括临床结果。如本文所用以及本领域中很好地理解的，“治疗”是用于获得有益的或所需的结果(包括临床结果)的方法。有益的或所需的临床结果可包括但不限于一种或多种症状或病状的减缓或改善、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病扩散的预防、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可以意指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。

术语“预防”是本领域公认的，并且当相对于病状诸如局部复发(例如，疼痛)、疾病诸如癌症、征候诸如心力衰竭或任何其他医学病状使用时，是在本领域中所熟知的，并且包括施用组合物，相对于不接受所述组合物的受试者，所述组合物减少受试者医学病状的症状的频率，或延缓其发病。因此，癌症的预防例如包括，例如以统计上和/或临床上显著的量，减少接受预防性治疗的患者群体相对于未治疗对照群体的可检测癌性生长的数量，和/或延缓治疗群体相对于未治疗对照群体的可检测癌性生长的出现。

向受试者“施用(administering/administration)”物质、化合物或剂可使用本领域的技术人员已知的各种方法中的一种来实施。例如，化合物或剂可通过以下方式施用：静脉内、动脉内、真皮内、肌内、腹膜内、皮下、经眼部、舌下、口服(通过摄取)、鼻内(通过吸入)、脊柱内、脑内以及透皮(通过吸收，例如，通过皮肤管)。化合物或剂还可适当地通过可再充电或可生物降解聚合物装置或其他为化合物或剂提供延长的、缓慢的或受控的释放的装置(例如贴剂和泵剂)或制剂来引入。施用还可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。

向受试者施用物质、化合物或剂的适当方法还将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或剂的化学和生物特性(例如，溶解性、可消化性、生物利用度、稳定性以及毒性)。在一些实施方案中，例如通过摄取向受试者口服施用化合物或剂。在一些实施方案中，口服施用化合物或剂呈延长释放或缓慢释放的制剂形式，或使用用于这种缓慢或延长释放的装置来施用。

药物或剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物或剂当向受试者施用时将具有预期的治疗性作用的量。完全的治疗性作用并不一定通过施用一次剂量而出现，而可能仅在施用一系列剂量之后才出现。因此，可以一次或多次施用来施用治疗有效量。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的身材、健康和年龄，以及受治疗的病状(诸如癌症或MDS)的性质和程度。技术人员可以容易地通过常规实验确定给定情况的有效量。

筛选测定

本公开提供了鉴定巨噬细胞激活调节剂的方法，其包括使原代巨噬细胞与候选剂接触；监测或拍摄与候选剂接触的细胞的形态；以及任选地将在候选剂存在的情况下的细胞形态与在候选剂不存在的情况下的细胞形态进行比较；其中在候选剂存在的情况下的形态变化指示巨噬细胞激活的调节。

如本文所用，术语“测试化合物”或“候选剂”是指待筛选其对细胞具有影响的能力的剂或剂的集合(例如，化合物)。测试化合物可以包括多种不同的化合物，包括化学化合物、化学化合物的混合物，例如多糖、有机或无机小分子(例如，分子量小于2000道尔顿、小于1500道尔顿、小于1000道尔顿或小于500道尔顿的分子)，生物大分子，例如肽、蛋白质、肽类似物及其类似物和衍生物、拟肽、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料(诸如细菌、植物、真菌、或动物细胞或组织)制成的提取物、天然存在或合成的组合物。

取决于所实施的具体实施方案，测试化合物可以在溶液中游离提供，或者可以附接到载剂或固体支持物(诸如珠子)上。许多合适的固体支持物可以用于固定测试化合物。合适的固体支持物的实例包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖(可商购获得，即Sephadex、Sepharose)羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇(PEG)、滤纸、硝化纤维素、离子交换树脂、塑料膜、聚胺甲基乙烯基醚马来酸共聚物、玻璃珠、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝绸等。此外，对于本文所述的方法，测试化合物可以单独或分组筛选。当预期有效测试化合物的命中率很低时，分组筛选特别有用，使得人们将不预期给定组有超过一个阳性结果。

许多小分子库是本领域已知的并且可商购获得。可以使用本文所述的筛选方法来筛选这些小分子库。化学品库或化合物库是储存的化学品的集合，其可以与本文所述的方法结合使用以筛选候选剂的特定作用。化学品库包含有关每种化合物的化学结构、纯度、数量和理化特性的信息。化合物库可以商购获得，例如从Enzo Life Sciences.TM.、AuroraFine Chemicals.TM.、Exclusive Chemistry Ltd..TM.、ChemDiv,ChemBridge.TM.、TimTecInc..TM.、AsisChem.TM.和Princeton Biomolecular Research.TM.等获得。

非限制地，化合物可以在适当时间段内以相对于对照对细胞发挥作用的任何浓度进行测试。在一些实施方案中，化合物以约0.01nM至约100nM、约0.1nM至约500微米、约0.1微米至约20微米、约0.1微米至约10微米或约0.1微米至约5微米范围内的浓度进行测试。

化合物筛选测定可以用于高通量筛选。高通量筛选是测试化合物库的给定活性的过程。高通量筛选旨在快速和平行地筛选大量化合物。例如，使用微量滴定板和自动测定设备，实验室每天可以并行地执行多达100,000次或更多次测定。

本文所述的化合物筛选测定可以涉及细胞或报告基因功能的多于一种测量(例如，在测定过程中在多个点测量多于一种参数和/或测量一种或多种参数)。多次测量可以允许跟踪测试化合物在孵育时间内的生物活性。在一个实施方案中，在多个时间测量报告基因功能以允许监测测试化合物在不同孵育时间的作用。

筛选测定之后可以进行后续测定，以进一步鉴定所鉴定的测试化合物是否具有预期用途所期望的性质。例如，筛选测定之后可以进行第二测定，所述第二测定选自由以下中的任一项的测量组成的组：生物利用度、毒性或药代动力学，但不限于这些方法。

实施例

现在已经大体上描述了本发明，参考以下实施例将更容易理解本发明，包括所述实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的并且不旨在限制本发明。

实施例1：实验程序

人单核细胞衍生的巨噬细胞和细胞系

使用Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)和LeucoSepTM(Greiner Bio-one)通过密度梯度离心从新鲜血液(Research Blood Components LLC.)中分离人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的方案，使用EasySepTM人单核细胞分离试剂盒(StemcellTechnology)从PBMC中纯化人单核细胞。为了将单核细胞体外分化为人巨噬细胞(M0，原代巨噬细胞)，将分离的单核细胞在补充有10％ FCS(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Corning)和1％ PenStrep溶液(Corning)的完全RMPI1640中、在50ng/mL重组人M-CSF(Peprotech)的存在下培养7天。肿瘤细胞系B16F10购自ATCC，并且在补充有10％ FCS、1％ PenStrep溶液和2mM L-谷氨酰胺的完全DMEM中培养。表达荧光素酶的人淋巴瘤B细胞系(GMB)在Roghanian等人Cancer Immunol Res(2019)中描述，并且在含有10％ FCS、2mM L-谷氨酰胺、0.55mM2-巯基乙醇(Gibco)、1％非必需氨基酸(Lonza)、1mM丙酮酸钠(Cellgro)和1％PenStrep溶液的完全RPMI 1640中培养。

高通量化合物筛选、高内涵显微镜和图像分析

基于M1(圆形)和M2(细长)分化巨噬细胞的形状差异，我们开发了一种筛选可以调节巨噬细胞极化的化合物的高通量方法。在50μL完全RPMI中，在10ng/mL M-CSF的存在下，使用Multidrop Combi分配器(Thermo Scientific)以5,000个细胞/孔的密度将由单核细胞体外分化的人M0原代巨噬细胞接种到光学384孔板(目录号393562，BD Falcon)中，并且培养16小时以进行细胞回收。此阶段(M0)中大约20％的巨噬细胞是细长的。使用CyBi-Well同步移液器(CyBio)，以20μM的最终浓度用超过4000种单独化合物或药物的库来处理细胞。筛选化合物库由麻省理工学院的布罗德研究所(Broad Institute)的治疗剂开发中心的2066种生物活性化合物、320种FDA批准的药物、440种肿瘤药物和1280种天然化合物构成。孵育24小时后，使用微孔板清洗机(Bioteck)去除上清液，并且通过使用分配器添加50μL16％多聚甲醛(Thermo Scientific)来固定细胞20分钟。然后用50μL1xPBS洗涤细胞两次，并且与NucBlue和AF746鬼笔环肽(Invitrogen)一起孵育20分钟以染色细胞核和细胞骨架。然后用50μL 1xPBS洗涤细胞两次，并且保持在PBS中用于图像采集。在Opera Phenix高内涵筛选系统(PerkinElmer)中读取板，以在2个荧光通道(蓝色和远红外)中使用20倍物镜拍摄细胞。每个孔中总共有6个不同的视野，并且每个孔平均成像1,000个细胞。CellProfiler用于通过来自每个细胞的细胞核和细胞骨架的重叠信号来鉴定每个细胞，以及计算偏心度作为测量细胞形态的参数。通过T测试计算Z分数以测量每个处理与对照之间的细胞形态差异。对于384孔板的每一行，将用相同浓度的DMSO处理的第一列和最后两列的总共4个孔合并作为该行中其他20个处理孔的对照。同时，添加了经典的M1和M2刺激以生成具有M1或M2激活的金标准Z分数截止值。经典的M1刺激包括LPS(100ng/mL)、IFNγ(50ng/mL，Peprotech)、TNFα(50ng/mL，Peprotech)或IFNγ加上TNFα。经典的M2刺激包括IL-10(10ng/mL，Peprotech)、IL-4(10ng/mL，Peprotech)或IL-13(5ng/mL，Peprotech)。金标准Z分数被用作截止值，以鉴定将巨噬细胞激活为M1或M2状态的有效化合物。

为了进一步筛选可以重激活或重编程分化的巨噬细胞的化合物，从第一轮筛选中遴选出有效的127种M1激活化合物和180种M2激活化合物。将人巨噬细胞接种到光学384孔板中。十六小时后，将M1板中的培养基替换为M1分化培养基(完全RPMI，具有50ng/mL IFNγ和50ng/mL TNFα)，并且将M2板中的培养基替换为M2分化培养基(完全RPMI，具有5ng/mLIL-4和5ng/mL IL-13)。细胞分化24小时后，分别用M2激活化合物和M1激活化合物处理M1板(M1巨噬细胞)和M2板(M2巨噬细胞)24小时。在处理前，在替换或不替换分化培养基的情况下进行了两个独立的实验。如上所示执行细胞成像和分析。

化合物靶标和途径分析

基于国际基础和临床药理学联合会(IUPHAR)(guidetopharmacology.org)的数据库对所鉴定的化合物进行分类。基于UPHAR和DrugBank(drugbank.ca)的靶标数据库对化合物的蛋白质靶标进行文本挖掘。化合物的蛋白质靶标的途径富集分析基于WikiPathways。

小鼠、抗体和流式细胞术

B6小鼠购自Jackson Laboratory，并且在麻省理工学院(MIT)的动物设施中饲养。NSG小鼠购自Jackson Laboratory，并且在MIT的动物设施中在无特定病原体的条件下饲养。所有动物研究和程序均被麻省理工学院动物保护委员会(Massachusetts Instituteof Technology’sCommittee for Animal Care)批准。对小鼠CD11b(M1/70)、F4/80(BM8)、MHC-II(M5/114.15.2)、Ly6C(HK1.4)、Ly6G(1A8)、Gr-1(RB6-8C5)、CD80(16-10A1)、CD86(GL-1)、CD163(S15049I)、CD206(C068C2)、IFNγ(XMG1.2)和TNFα(MP6-XT22)具有特异性的流式细胞术抗体来自Biolegend(USA)，并且iNOS(CXNFT)来自eBioscience(USA)。对人CD80(2D10)、CD86(BU63)、CD163(GHI/61)和CD206(15-2)具有特异性的流式细胞术抗体来自Biolegend(USA)，并且iNOS(4E5)来自Novus Biologicals(USA)。对人和小鼠都具有特异性的抗体ARG1(A1exF5)来自eBioscience(USA)。如所述制备用于体内研究的B16F10黑色素瘤特异性抗体TA99。如所述由不同器官制备单细胞、用荧光团缀合抗体对细胞进行染色、以及使用流式细胞术对染色细胞进行分析。简而言之，将单细胞悬液中的细胞与特异性抗体一起在4℃下孵育20分钟，洗涤两次，并且重悬于含有任一种DAPI的FACS缓冲液中。根据制造商的方案，使用Cyto-Fast Fix/Perm缓冲液组(Biolegend)来固定和透化细胞以进行细胞内染色。将样品通过细胞刺激鸡尾酒(eBioscience)刺激4小时，然后固定/透化以进行细胞内染色。将细胞在BD-LSRII上运行，每个样品收集20,000到100,000个活细胞。数据通过FlowJo分析。

小鼠肿瘤模型和治疗

对于黑色素瘤模型，将100μL无菌PBS中的1x10⁶个B16F10肿瘤细胞的接种物皮下注射到8至10周大的雄性B6小鼠的侧腹。肿瘤接种后六天，将小鼠随机分为4个治疗组，包括对照(PBS或DMSO)、肿瘤靶向抗体TA99、化合物、化合物加TA99。TA99以每剂100μg腹膜内(I.P.)施用。化合物通过腹膜内或皮下(S.C.)肿瘤旁注射以所示剂量施用。所有小鼠在肿瘤接种后第6天和第12天给药，总共治疗2次。在肿瘤接种后第6天、第12天和第18天将肿瘤大小测量为面积(最长尺寸x垂直尺寸)。在肿瘤接种后第18天对小鼠实施安乐死用于分析。对于淋巴瘤模型，通过尾部静脉内注射将100μL无菌PBS中的1x10⁷个GMB细胞注射到10至12周大的雄性NSG小鼠中。小鼠在肿瘤细胞植入后治疗两周。肿瘤靶向抗体利妥昔单抗(InvivoGen)以10mg/kg腹膜内施用。化合物以所示剂量腹膜内施用。所有小鼠在肿瘤注射后第2周和第3周给药，总共治疗2次。在肿瘤注射后第2周、第3周和第4周使用IVIS光谱生物发光成像系统(PerkinElmer)使肿瘤生长和扩散可视化。在肿瘤接种后第4周对小鼠实施安乐死用于分析。

组织病理学和免疫化学染色

对小鼠实施安乐死，并且分离肿瘤组织，并且用10％中性缓冲福尔马林溶液(Sigma-Aldrich)固定24小时。用组织处理器(Leica Microsystems)处理组织并包埋在石蜡中。根据标准方案，切片以5μm的厚度切割，安装在涂有聚赖氨酸的载玻片(ThermoFisher Scientific)上，脱蜡，再水化，并且进行苏木精和伊红(H&E)染色处理。对于免疫化学染色，通过将载玻片在0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中微波加热30分钟来进行抗原修复。然后将切片浸入封闭缓冲液(3％ BSA、0.2％ Triton X-100的PBS溶液)中1小时，然后在封闭缓冲液中的一抗中在4℃下孵育过夜，随后与二抗缀合HRP在4℃下一起孵育1小时。使用高分辨率Leica Aperio幻灯片扫描仪扫描所有肺部染色切片。图像通过WebScope软件分析。

小鼠骨髓衍生的巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞

如先前所述制备小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(mBMM)⁵⁴。简而言之，从B6小鼠中分离出新鲜的骨髓细胞。将具有2-巯基乙醇的完全RPMI中的细胞以1x10⁶个细胞/毫升接种到6孔板中并培养6天，每2天更换一次新鲜培养基。在10ng/mL mIL-4和mIL-13(Peprotech)或25mM乳酸存在24小时的情况下，或在肿瘤条件培养基(CM)存在的情况下，mBMM分化成相似的TAM。为制备CM，为培养的70％汇合的B16F10替换新鲜培养基，并且在24小时后收集并过滤(0.2μm)肿瘤培养基。mBMM的3体积肿瘤培养基与1体积完全RPMI的混合物用作CM。Arg、Fizz1和Vegfa的表达通过qPCR进行量化，以评估TAM的发育。Tnf、Il1b、Nos2、Cxcl2、Ccl5、Ym1和Tgfb的其他基因用作巨噬细胞激活标记。为了测定肿瘤生长抑制，将mBMM(96孔板中每孔10,000个细胞)用硫链丝菌素处理24小时，然后在新鲜的完全RPMI中与等量的B16黑色素瘤细胞共培养12小时。收集用硫链丝菌素处理或未处理的条件培养基并将其过滤。B16黑色素瘤细胞的数量用条件培养基培养12小时，或者用95℃加热的条件培养基培养5分钟。通过流式细胞术对肿瘤细胞进行量化以确定巨噬细胞依赖性杀伤功能。

RNA分离、RNA测序和数据分析

用RNeasy MiniElute试剂盒(Qiagen)提取RNA，将其转化为cDNA，并且使用下一代测序(Illumina)进行测序。将RNA-seq数据与小鼠基因组(mm10版本)进行比对，并且使用bowtie2 2.2.3和RSEM 1.2.15计算每个样品的每个基因的原始计数。使用程序edgeR以P<0.05执行差异表达分析，变化为2倍。使用cpm函数对不同样品的基因表达水平进行归一化和量化。使用在线功能富集分析工具DAVID(http://david.ncifcrf.gov/)注释差异表达的基因。使用GSEA执行基因集富集分析，FDR q值<0.05。热图用MeV可视化。为了量化RNA转录物的水平，从各种细胞中提取总RNA并且通过

逆转录试剂盒(ABI目录号N8080234)进行逆转录，然后使用特异性引物(表4)用Sybr Green主混合物(Roche目录号04707516001)进行扩增，并通过Roche LightCycler 480进行检测。使用管家基因GAPDH将Ct值归一化以进行比较。

表4示出了qPCR的引物。

化合物诱导的巨噬细胞激活网络

为了通过反映核心巨噬细胞激活网络的化合物(参考图4)来确定所有刺激条件的中央枢纽，基因之间的转录相互作用首先基于34种化合物以及IFNγ和IL4对照的扰动转录谱通过ARACNe确定。12549个独特的现存基因被纳入互信息计算，p值小于1e-7。ARACNe使用的信息论中的数据处理不等式(DPI)定理的阈值设置为0.1，以检测核心巨噬细胞激活网络中总共400,165次调控相互作用。前10％中央枢纽(1255个基因)的GO富集分析和富集图通过BiNGO执行。网络通过Cytoscape可视化。

统计方法

使用双尾未配对或配对学生t测试来确定统计显著性。FDR用q＝p*n/i计算(p＝P值，n＝总测试数，i＝P值的分选等级)。

数据可用性

原始RNAseq存放在Gene Expression Omnibus(GEO)的数据库中，登录号为GSE14992和GSE155551。

实施例2：巨噬细胞激活的表型筛选

从外周血单核细胞(PBMC)中分离人单核细胞，并且在重组人M-CSF的存在下，人单核细胞在7天培养中分化为巨噬细胞。所得的人单核细胞衍生的巨噬细胞(hMDM)用不同的已知M1激活刺激来刺激，包括脂多糖(LPS)、IFNγ、TNFα或IFNγ加TNFα，或者用不同的已知M2激活细胞因子来刺激，包括IL-10、IL-4或IL-13，持续24小时。M1激活的hMDM为圆形，具有点状F-肌动蛋白染色，而M2激活的hMDM为细长形，具有丝状F-肌动蛋白染色(图1A和图7A)。已知的M1标记(包括CD80和CD86)的表达被IFNγ上调并且被IL-4抑制，而M2标记CD206和CD163被IL-4上调并且被IFNγ抑制(图7B)。通过每孔平均1000个细胞的T测试，计算每个刺激的Z分数，从而根据处理孔与未处理孔之间的细胞形状分布来指示其激活能力。M1激活的hMDM的平均Z分数为-4，而M2激活的hMDM的平均Z分数为6(图1B)。M1和M2样人和小鼠巨噬细胞具有不同的形态。

基于细胞形状与巨噬细胞激活之间的相关性，我们开发了一种用于将hMDM激活为M1或M2样状态的化合物的高通量筛选(图1C)。将从四个健康供体纯化的人单核细胞按等比例混合，并且用M-CSF分化为巨噬细胞。将所得巨噬细胞接种到384孔板中，并且在M-CSF的存在下培养过夜，以将巨噬细胞维持在大部分非激活阶段。然后以20μM的最终浓度用4126种化合物中的一种处理每个孔中的巨噬细胞24小时，所述4126种化合物包括2086种生物活性化合物、760种FDA批准的药物和1280种天然产物(图1D)。通过高内涵扫描显微镜拍摄细胞图像，并且通过Cellprofiler量化细胞形状(图1E)。基于Z分数截止值：M1激活的巨噬细胞为-4并且M2激活的巨噬细胞为6，分别鉴定了127种和180种化合物，以将人巨噬细胞激活为M1样状态(称为M1激活化合物)和M2样状态(称为M2激活化合物)(图1F)。127种M1激活化合物中的98种(77％)和180种M2激活化合物中的166种(92％)是FDA批准的药物(图1G)。文本挖掘为127种M1激活化合物中的80种确定了119个已知蛋白质靶标，并且为180种M2激活化合物中的144种确定了220个蛋白质靶标。靶标包括G蛋白偶联受体(GPCR)、酶、激酶、核激素受体(NHR)和转运蛋白(图1G)。M1和M2激活化合物的许多靶标分别属于组蛋白脱乙酰酶家族和VEGF受体家族(图8)。重新发现了一些已知的巨噬细胞极化调节因子，诸如STAT3、FYN、MAP2K1和CDK。蛋白质靶标的途径分析鉴定了巨噬细胞激活中的已知途径，诸如IL-4、IL-1β和TGFβ途径，以及新途径，诸如神经递质、瘦素、EGF和VEGF信号传导途径(图1H和表1)。

表1示出了所鉴定的化合物靶向的蛋白质的途径分析。

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实施例3：所选化合物和途径的验证

为了验证已鉴定的化合物对巨噬细胞激活的影响，我们测定了可商购获得的排名靠前的列表的化合物的剂量反应，以确定它们对细胞形状变化的有效浓度(EC)。23种所选的M1激活化合物中的20种和6种M2激活化合物中的4种显示出强烈的剂量效应，EC低于10μM(图2A-图2B和表2)。我们对6种M1激活化合物(莫西司他、硫链丝菌素、氯硝柳胺、氯己定、芬苯达唑和氟伏沙明)和2种M2激活化合物(博舒替尼和阿特波龙)执行了RNA-seq分析，以确定它们是否在转录水平激活巨噬细胞。新鲜的hMDM使用化合物以EC处理24小时，然后进行RNA-seq。这些化合物诱导不同数量的差异表达基因(DEG)的不同转录反应，其程度与IL-4或IFNγ诱导的类似(图9A)。为了探索化合物诱导的hMDM的功能差异，将对每种化合物的转录反应的基因集富集分析(GSEA)与先前鉴定的响应hMDM中的29种不同刺激的49个基因表达模块进行比较。与IFNγ类似，六种M1激活化合物上调由IFNγ诱导的典型M1模块(模块#7、#8)以及由TNFα/PGE2/P3C诱导的慢性炎症TPP模块(模块#30、#32)的基因表达(图2C)。M1激活化合物也与LPS类似地下调模块(#26、#27)。两种M2激活化合物下调典型M1模块的基因表达，尽管它们不上调IL-4诱导的基因表达模块(模块#15)(图2C)。一贯地，所有M1激活化合物上调经典M1标记CD80和CD86的表达，并且下调经典M2标记CD163和CD206的表达。两种M2激活化合物都下调M1标记(图9C)。然而，基于DEG的功能富集分析，所有8种化合物均诱导与炎症反应、趋化性/趋化因子介导的信号传导以及对IFNγ和TNFα的反应相关的共有途径(图2D)。这些结果表明，所选化合物在转录水平调节巨噬细胞激活。

我们还通过RNA-seq分析了hMDM对新途径配体的转录反应，所述新途径包括血清素(5HT)、多巴胺、VEGF、EGF和瘦素途径。每种配体诱导不同的转录反应(图9B)。具体地说，5HT、VEGF、EGF和瘦素上调典型M1模块(#7、#8)的基因表达，但下调TPP模块(#30、#32)的基因表达(图2E)。相比之下，多巴胺下调典型M1模块的基因表达，但上调TPP模块(图2E)，表明这些配体调控巨噬细胞激活的不同方面。DEG的功能富集分析确定了这些配体诱导与炎症反应、趋化性/趋化因子介导的信号传导和伤口愈合相关的途径(图2F)。总之，这些结果表明，化合物以及其蛋白质靶标的上游信号调节巨噬细胞激活。

表2示出了所选化合物对M0巨噬细胞的剂量信息。

实施例4：化合物对极化巨噬细胞的重编程筛选

为了研究所鉴定的化合物是否可以在M1或M2样分化后重编程或重激活巨噬细胞，我们重新筛选了对M1或M2激活的巨噬细胞的命中。hMDM被IL-4加上IL-13激活为M2样巨噬细胞，或者被IFNγ加上TNFα激活为M1样巨噬细胞。去除分化细胞因子后，在5μM和10μM的最终浓度下，用166种M1激活化合物中的每一种处理M2样巨噬细胞，并且用180种M2激活化合物中的每一种处理M1样巨噬细胞。24小时后，拍摄细胞图像并且量化细胞形状。基于相同的Z分数截止值，鉴定出37种M1激活化合物和21种M2激活化合物在5μM和10μM的浓度下诱导细胞形状变化(图3A-图3B)。使用40种可商购获得的化合物(21种M1激活和19种M2激活)对极化巨噬细胞进行剂量反应。17种M1激活化合物(81％)和18种M2激活化合物(95％)具有典型的剂量依赖性反应，EC低于10μM，并诱导细胞形状的统计显著变化(图3C和表3)。

我们还在分化细胞因子IL-4加上IL-13或IFNγ加上TNFα的存在下重新筛选了对分化巨噬细胞的命中。令人惊讶的是，在5μM的相同化合物浓度下，与不存在这些细胞因子的情况下(46种M1激活和25种M2激活)相比，在这些细胞因子的存在下(67种M1激活和55种M2激活)，更多化合物对细胞形状变化表现出显著作用(图3D-图3E)。一贯地，再次鉴定出37种M1激活化合物中的28种和21种M2激活化合物中的18种在5μM的浓度下诱导显著的细胞形状变化。在剂量反应测定中，在细胞因子存在的情况下的许多M1激活化合物的EC比在细胞因子不存在的情况下的低(图10)。因此，分化细胞因子的存在使巨噬细胞对重编程更敏感。

表3示出了所选化合物对分化巨噬细胞的剂量信息

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实施例5：所鉴定的化合物对巨噬细胞转录的共同和独特影响

为了广泛验证所鉴定的化合物对巨噬细胞激活(重编程)的作用并阐明所述化合物如何激活巨噬细胞，我们选择了EC低于5μM的17种M1激活化合物和17种M2激活化合物，并且通过RNA-seq执行转录分析。由IL-4加上IL-13诱导的M2样巨噬细胞用17种M1激活化合物中的每一种以其EC处理24小时。类似地，由IFNγ加上TNFα诱导的M1样巨噬细胞用17种M2激活化合物中的每一种以其EC处理24小时。不同的化合物上调和下调不同数量的基因(图4A)，总共7247个基因在暴露于至少一种化合物后表现出至少两倍的变化。化合物以及IFNγ和IL-4诱导的DEG的皮尔逊相关(Pearson’scorrelation)的层次聚类显示，所有17种M1激活化合物与IFNγ聚集在一起，并且所有17种M2激活化合物与IL-4聚集在一起(图4)。全局转录反应的主要组分分析(PCA)显示，M1样巨噬细胞、用IFNγ处理的M2样巨噬细胞、用IL-4处理的M1样巨噬细胞和用M2激活化合物处理的M1样巨噬细胞组合在一起，而M2样巨噬细胞和用M1激活化合物处理的M2样巨噬细胞组合在一起(图11A)。虽然大多数化合物以及IL-4适中地调节全局基因表达，但转录功能模块的GSEA显示，所有M1激活化合物聚集在一起并且上调典型的M1模块(#7、#8)和TPP模块(#30、#32)(图4C)。所有M2激活化合物聚集在一起并且下调典型的M1模块(#7、#8)和TPP模块(#30、#32)。被LPS下调的模块(#26、#27)也被M1激活化合物下调，但被M2激活化合物上调。此外，典型的M1标记CD80和CD86的表达被M1激活化合物上调，并且被M2激活化合物抑制，而M2标记CD206和CD163的表达被M2激活化合物上调，并且被M1激活化合物抑制(图11C)。这些结果在转录水平上通过qPCR进一步验证，并且在蛋白质水平上通过流式细胞术进一步验证(图11D-图11E)。

为了研究巨噬细胞激活的共同特性，基于由化合物扰动表达谱计算的每个基因对之间的互信息，通过ARACNe组装了逆向工程调控网络。从网络推断出的前10％中央枢纽基因(n＝1255，最相互关联的基因)共同参与98,048次相互作用。大多数靠前的中央枢纽基因或调节因子，诸如GBP1、FAM26F、STAT1，已经显示在巨噬细胞激活和功能中发挥重要作用(图12)。我们通过BiNGO以GO富集网络的可视化对这些枢纽基因执行了GO富集分析。这种GO期网络鉴定了与巨噬细胞激活相关的功能簇，不仅包括先前鉴定的免疫反应、白细胞或淋巴细胞激活、分解代谢和代谢过程的簇，还包括新的应激反应、细胞迁移、蛋白质转运、分泌、细胞增殖、离子稳态、磷酸化和信号传导、以及组织重塑和伤口愈合的簇(图4D)。此外，DEG的功能富集分析显示，不同的化合物不仅在常见的免疫反应途径和趋化性/趋化因子介导的信号传导途径中调节基因表达，还扰乱特定(独特)途径(图4E-图4F和11B)。一贯地，这些受化合物扰乱的独特途径主要是通过它们的假定靶标。例如，M1激活化合物MS275抑制HDAC(组蛋白脱乙酰酶)，这扰乱了染色质组装途径。M2激活化合物比生群抑制TOP2A(拓扑异构酶II)，这扰乱了DNA拓扑变化的途径(图4F)。这些数据表明，所鉴定的化合物通过调节与巨噬细胞激活相关的基因表达以及每种化合物特有的特定途径，对分化的巨噬细胞进行重编程。

实施例6：硫链丝菌素诱导巨噬细胞进入促炎状态

为了确定所鉴定的化合物是否在体内疾病环境中激活巨噬细胞，我们选择了硫链丝菌素，它是天然的环状寡肽和经批准用于治疗皮肤感染的兽医抗生素，并且测试了硫链丝菌素将巨噬细胞激活为M1样状态。与其他硫肽类抗生素类似，硫链丝菌素抑制细菌蛋白质合成的核糖体功能。最近，硫链丝菌素显示通过抑制蛋白酶体和/或FOXM1转录因子而在人类癌细胞中表现出抗增殖活性。用2.5μM硫链丝菌素处理hMDM 24小时后，hMDM被极化以表达促炎细胞因子TNFα和IL-1β，并且下调M2趋化因子CCL24(图5A)。DEG的功能富集分析显示，IFN/NFκB途径、TNF介导的途径、氧化还原过程、蛋白质多聚泛素化和细胞对LPS的反应被上调，而DNA复制、细胞周期和细胞基质粘附被下调(图5B)。GSEA分析显示，通过NFκB和ROS的TNFα信号传导的途径被上调，而E2F靶标和有丝分裂纺锤体的途径被下调(图5C)。这些结果显示，硫链丝菌素调节hMDM中与蛋白酶体和DNA复制相关的基因的表达。

为了确定硫链丝菌素对体外TAM的影响，在硫链丝菌素不存在或存在的情况下，在B16F10肿瘤细胞的条件培养基(CM)中培养小鼠骨髓巨噬细胞(BMM)24小时。或者，首先在条件培养基中培养BMM 24小时，然后再用硫链丝菌素处理24小时。通过qPCR来测定与巨噬细胞极化相关的选定基因的表达。硫链丝菌素抑制TAM/M2相关基因Arg1、Fizz1、Vegfa、Ym1和Tgfb的表达，但上调M1相关基因Tnf、Il1b、Cxcl2和Nos2的表达(图5D)。无论是将硫链丝菌素添加到条件培养基培养物中，还是首先将BMM分化为TAM，都观察到了硫链丝菌素的作用(比较图5D中的第2组和第3组)。一贯地，流式细胞术分析揭示了MHCII、CD80和iNOS的上调，但揭示了ARG1的下调(图13A)。类似地，我们检查了硫链丝菌素对IL-4/IL-13和乳酸极化的BMM的影响。如图13B所示，硫链丝菌素抑制Arg1、Fizz1、Ym1和Tgfb的表达，但提高Tnf、Il1b、Cxcl2和Ccl5的表达，无论硫链丝菌素是与细胞因子或乳酸一起添加还是在BMM极化后添加。

为了检查硫链丝菌素激活的巨噬细胞或条件培养基是否对肿瘤细胞生长具有影响，用硫链丝菌素处理BMM 24小时。将等量的已接触抗原的BMM和黑色素瘤细胞(B16F10)共培养12小时。与未处理的巨噬细胞相比，在硫链丝菌素处理的巨噬细胞的存在下，以剂量依赖性方式丢失了显著更多的黑色素瘤细胞(图5E)。类似地，与来自未处理的巨噬细胞的条件培养基或热灭活的硫链丝菌素处理的条件培养基相比，来自硫链丝菌素处理的巨噬细胞的条件培养基中丢失的黑色素瘤细胞更多(图14A)。为了确定硫链丝菌素激活的巨噬细胞是否表现出增强的ADCP，将硫链丝菌素激活的巨噬细胞与用eFluro670染料和抗CD20标记的等量的人B淋巴瘤细胞(GMB)共培养2小时。硫链丝菌素提高人和小鼠巨噬细胞的ADCP(图14B-图14C)。这些数据显示，硫链丝菌素激活巨噬细胞并将其重编程为促炎状态，并且增强了它们在体外的肿瘤杀伤活性。

实施例7：通过硫链丝菌素重编程TAM以增强体内抗肿瘤活性

接下来，我们通过激活巨噬细胞检查了硫链丝菌素是否在体内具有抗肿瘤作用。将B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到同基因C57BL/6小鼠中。6天和12天后，通过腹膜内注射(I.P.)用媒介物(DMSO)、黑色素瘤特异性抗体TA99、硫链丝菌素、或TA99和硫链丝菌素的组合来治疗荷瘤小鼠。以剂量依赖性方式(150或300mg/kg)，硫链丝菌素在单独以及与TA99一起的情况下强烈抑制肿瘤生长(图6A)。由于硫链丝菌素抑制细胞增殖并且是抗生素，为了排除其对免疫细胞和肠道微生物组的系统性影响，通过肿瘤旁皮下注射(S.C.)用较低剂量的硫链丝菌素(20mg/kg)治疗荷瘤小鼠。这种局部治疗还抑制了肿瘤生长，并且表现出与TA99的加性效应(图6B)。在肿瘤植入后第18天对解剖肿瘤的单细胞悬液进行的流式细胞术分析显示，与给予媒介物或TA99的小鼠相比，给予硫链丝菌素或硫链丝菌素加TA99的小鼠中的巨噬细胞和单核细胞水平提高(图6C-图6D)。一贯地，与用媒介物或T99治疗的小鼠相比，在用硫链丝菌素或硫链丝菌素加TA99治疗的小鼠的肿瘤切片中，更大量的巨噬细胞通过免疫化学被染色为F4/80阳性(图6E)。在非荷瘤小鼠中，硫链丝菌素的腹膜内施用导致脾脏和骨髓中的巨噬细胞数量增加，而皮下施用对巨噬细胞数量没有显著影响(图15A)。在两种给药策略中，硫链丝菌素都不改变肠道中的总细菌计数(图15B)。此外，TAM的流式细胞术分析揭示了，与给予媒介物或TA99的小鼠相比，给予硫链丝菌素或硫链丝菌素加TA99的小鼠中的iNOS和CD86水平提高，并且Arg1水平降低(图16A-图16B)。有趣的是，与给予媒介物或TA99的小鼠相比，在给予硫链丝菌素或硫链丝菌素加TA99的小鼠肿瘤中发现TNFα⁺IFNγ⁺NK细胞(但不是CD8⁺T细胞)数量增加(图16C)。

为了研究肿瘤浸润的巨噬细胞是否被重编程，在肿瘤植入后第18天，我们从通过腹膜内注射或皮下注射硫链丝菌素或媒介物来给药的小鼠的B16F10黑色素瘤肿瘤中纯化TAM，并且执行RNA-seq。GSEA和功能富集分析显示，在通过腹膜内注射和皮下注射用硫链丝菌素治疗的小鼠的TAM中，硫链丝菌素上调了与炎症反应和ROS相关的基因的表达，并且下调了与有丝分裂相关的基因的表达(图17)。促炎细胞因子(包括Tnf、Il1b、Cxcl1和Cxcl2)的表达也被显著上调(图6F)，这与hMDM的体外硫链丝菌素处理的结果一致(图5A)。

为了进一步证实硫链丝菌素在体内的抗肿瘤作用，我们将表达荧光素酶的人B淋巴瘤细胞静脉内注射到NSG小鼠体内。在肿瘤植入后第2周和第3周，用利妥昔单抗(抗CD20)、硫链丝菌素或两者治疗荷瘤小鼠。通过萤光素酶成像的肿瘤负荷定量显示，硫链丝菌素单独地或与利妥昔单抗一起显著降低了骨髓中的肿瘤负荷(图18A-图18B)。一贯地，与给予媒介物或利妥昔单抗的小鼠相比，在用硫链丝菌素治疗的小鼠的骨髓中发现MHCII表达更高的F4/80⁺CD11b⁺巨噬细胞的百分比更高，而Ly6G⁺中性粒细胞的频率较低(图18C-图18D)。此外，另一种M1激活化合物葫芦素I也通过在体外和体内激活巨噬细胞来抑制B16F10生长(图19)。总之，M1激活化合物可以将TAM重编程为促炎性巨噬细胞，从而抑制体内肿瘤生长。

实施例8：材料和方法

小鼠、抗体、细胞系和质粒

C57BL/6(B6)小鼠、p47phox^-/-、Clec4f-Cre小鼠购自Jackson Laboratory，并且在麻省理工学院(MIT)的动物设施中饲养。在先前的出版物中描述了PKM^flox小鼠。用于流式细胞术的对CD11b(M1/70)、F4/80(BM8)、MHC-II(M5/114.15.2)、CD45.2(104)、CD9(MZ3)具有特异性的抗体来自Biolegend。抗GPR3(#SC390276)来自Santa Cruz Biotechnology。抗β-阻遏蛋白2(#4674)、糖酵解抗体采样器试剂盒(#8337)、抗Myc和抗FLAG来自CellSignaling Technology。抗PKM2(#1C11C7)来自Abcam。β-阻遏蛋白2CRISPR质粒(sc432139)来自Santa Cruz Biotechnology。pCMV-β-阻遏蛋白2-GFP(PS10010)、pCMV6-Flag-myc-b阻遏蛋白2(PS100001)和Arrb2小鼠siRNA寡双链体(基因号216869)来自Origene。永生化库普弗细胞系(ABI-TC192D，AcceGen)、人原代KC(ABC-TC3646，AcceGen)、THP-1(ATCC TIB-202)和293T(CRL-3216)按照供应商的说明(37℃，5％ CO₂)进行培养。根据制造商的说明，使用LipofectamineTM 2000(Thermo Fisher Scientific)完成用siRNA转染ImKC。夹竹桃麻素(PHL83252)来自Sigma。

骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)

制备了小鼠BMDM。从B6小鼠中分离出新鲜的骨髓细胞，在具有2-巯基乙醇和20％L929上清液的完全RPMI中以1x10⁶个细胞/毫升铺种到六孔板上，每2天替换一次培养基，所述上清液通过培养L-929细胞6天来获得。

免疫共沉淀、蛋白质印迹法和天然PAGE

使用

转染试剂(Mirus)，用FLAG标记的β-阻遏蛋白2转染293T细胞。转染后三十六小时，使用含有20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、0.1％ NP-40、10％甘油、蛋白酶抑制剂(Roche目录号11836153001)和磷酸酶抑制剂(Roche目录号04906845001)的冷裂解缓冲液使细胞裂解。将来自裂解物的透明上清液与缀合抗FLAG抗体(Sigma目录号M8823)的M2磁珠在4℃下一起孵育2小时。然后将珠子洗涤两次并且用3xFLAG肽(Sigma目录号F4799)洗脱，如Sigma蛋白质印迹法手册中所述。

用RIPA缓冲液从细胞中提取蛋白质。蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology)来量化。含有20μg总蛋白质的样品在10％ SDS-PAGE凝胶上分离，并且电转移到PVDF膜(Millipore Corporation)上。膜在5％(重量/体积)脱脂牛奶的PBST(含有0.1％Tween-20的PBS)溶液中封闭。根据5％脱脂牛奶中的推荐稀释度，将印迹与一抗：抗pSRC(D49G4，Cell Signaling Technology，1:1000)和pSIK1/2/3(#ab199474，Abcam，1:1000)杂交过夜。印迹在PBST中洗涤两次，然后与抗兔HRP缀合二抗(Cell SignalingTechnology，1:2000)在5％脱脂牛奶中一起孵育。膜在PBST中洗涤两次，并且通过ECL Plus蛋白质印迹检测系统(GE Healthcare)进行蛋白质检测，然后暴露于Kodak BioMax XAR胶卷。将膜剥离，并且用抗β微管蛋白(D49G4，Cell Signaling Technology)重新印迹以获得蛋白质负载对照。

在含有1％洋地黄皂苷的1x天然PAGE样品缓冲液(ThermoFisher)中从细胞中提取蛋白质，然后在12,000x g下旋转20分钟以沉淀碎片。蛋白质提取物使用NativePAGE Novex系统(ThermoFisher)进行分析，并且随后转移到PVDF膜上，固定并进行印迹以获得天然蛋白质。

代谢物分析

用50nM或500nM的DPI(#81050，Cayman)处理ImKC 6小时或24小时。细胞在冰冷的0.9％ NaCl中洗涤一次，并且通过干冰上刮擦在含有用于LC/MS的内标的80％甲醇溶液中提取裂解物，然后在4℃下涡旋混合10分钟。裂解物提取后，通过高速离心去除碎片，并且使用speedvac干燥上清液。在Whitehead Institute代谢物分析核心设施的QExactiveOrbitrap仪器(Thermo Scientific)上通过LC/MS分析样品。使用先前描述的内部软件进行数据分析(Lewis等人，2014)。

β-阻遏蛋白2核易位测定

将BMDM或ImKC与编码FLAG-GPR3-GFP或β-阻遏蛋白2–RFP的质粒共转染。转染后二十四小时，将细胞重新接种到24孔玻璃底板(Nest，Shanghai，China)中，并且用DPI(50nM)、S1P(3mM)或媒介物对照(0.3％ DMSO)处理所示持续时间。使用全内反射荧光(TIRF)显微镜(Olympus)将膜结合受体或β-阻遏蛋白2的荧光信号收集为实时图像。

耗氧量、葡萄糖应激测定、葡萄糖消耗和乳酸产生

使用Seahorse XFe细胞外通量分析仪(Agilent)在分离的组织或培养的ImKC中测量OCR和ECAR。对于组织呼吸测定，通过使用外科活检仪器(Integra Miltex标准活检凿，Thermo Fisher)从腹股沟WAT库中切下1.0mg脂肪组织，并将其放入XF96胰岛捕获微孔板中，并且与pH值为7.4的XF测定培养基一起预孵育。Xf测定培养基补充有1mM丙酮酸钠、2mMGlutaMaxTM-I和25mM葡萄糖。通过添加寡霉素(2μM)，然后添加羰基氰4-(三氟甲氧基)、苯腙(FCCP，5μM)和抗霉素(1μM)，对分离的MDM或库普弗细胞进行线粒体应激测试。对于葡萄糖应激测定和ECAR测量，XF测定培养基仅补充了GlutaMaxTM-I。通过添加高浓度葡萄糖(对于组织，25mM；对于细胞，10mM)，然后添加寡霉素(5μM)、FCCP(5μM)和2-DG(50mM)，对组织或细胞进行葡萄糖应激测试。将细胞接种在培养皿中，并且6小时后用无血清DMEM更换培养基。将细胞孵育12-16小时，然后收集培养基以测量葡萄糖和乳酸浓度。使用葡萄糖(GO)测定试剂盒(Sigma)来确定葡萄糖水平。当与DMEM相比时，葡萄糖消耗是葡萄糖浓度的差异。使用乳酸测定试剂盒(Eton Bioscience)来确定乳酸水平。

免疫荧光和显微镜

将BMDM或库普弗细胞固定，并且与一抗一起孵育，然后根据标准方案用AlexaFluor染料缀合二抗标记并且用Hoechst 33342复染。使用具有

油浸物镜的解卷积显微镜(Zeiss)来检查细胞。使用Zeiss的Axio Vision软件来解卷积Z系列图像。

PKM和GAPDH酶活性

根据制造商的方案，分别使用丙酮酸激酶活性测定试剂盒(Biovision，#K709)和GAPDH活性测定试剂盒(Biovision，#K680)来测量PKM和GAPDH的酶活性。

Myc荧光素酶测定

根据制造商的说明，使用Myc报告基因试剂盒(BPS Biosciences)和双荧光素酶报告基因系统(Promega)来评估c-Myc活性。简而言之，将100μL(1.5x 10⁵个细胞/毫升)的对照细胞和库普弗细胞接种到96孔板中。孵育过夜后，当细胞达到约50％汇合度时，使用Turbofectin8.0将Myc报告基因试剂盒中的1μL报告基因A(60ng/μL)转染到细胞中。48小时后，细胞在25μL被动裂解缓冲液(在双荧光素酶报告基因试剂盒中提供)中裂解。将20μL细胞裂解物转移到96孔板中，并且置于96孔微孔板光度计(GloMax-Multi，Promega)中。依次注射100μL荧光素酶测定试剂II和100μL Stop&Glo试剂(均在双荧光素酶报告基因试剂盒中提供)，并且自动测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。通过萤火虫与海肾荧光素酶活性的比率确定c-Myc活性。

HFD诱导的NAFLD小鼠模型和治疗

将5周龄的C57BL/6小鼠(体重＝23–-25g)随机分配至三组：5只小鼠用正常饮食喂养16周，然后每5天注射1次盐水，持续4周；10只小鼠用HFD(60千卡％脂肪)喂养16周以诱发肥胖和肝脂肪变性，然后分为两组：对HFD+媒介物(HFD)组(n＝5)腹膜内注射媒介物(PEG3000)，并且对HFD+DPI组(n＝5)腹膜内注射DPI的媒介物溶液(2mg/kg)，每5天一次，持续4周。

组织病理学和免疫化学染色

将固定在10％缓冲福尔马林中的肝脏样品包埋在石蜡中，切片(2μm切片)，并且用苏木精和伊红(H&E)染色。以盲法执行形态学变化的组织学检查。根据NAFLD活性分数(NAS)的标准对肝脏切片进行评分。

葡萄糖耐受测试(GTT)

在喂养HFD或NC后19周，在小鼠中执行GTT。对于GTT，小鼠禁食过夜，然后腹膜内注射1g/kg葡萄糖。对于ITT，小鼠禁食6小时，然后腹膜内注射0.75单位/千克胰岛素。注射葡萄糖或胰岛素之前(0分钟)和之后(15、30、60、90和120分钟)，从尾静脉获得血液。使用自动血糖仪(Roche Diagnostics，Rotkreuz,Switzerland)测量葡萄糖水平。

人肝免疫细胞分离和库普弗细胞分离

人肝脏活检从获自被认为不适合肝移植的已故供体的肝脏中获得。在吉林大学第一附属医院(First Affiliated Hospital of Jilin University)的适当机构伦理批准下收集样品。所有实验均根据相关指南和规定执行。此外，还获得了每位受试者的书面知情同意书。在器官取出过程中，供体肝移植物原位灌注冷(HTK)溶液(Methapharm)以彻底冲洗循环细胞，仅留下组织驻留细胞，所述组织驻留细胞然后用于制备单细胞悬液以分离免疫细胞。收集肝移植后未使用的肝尾状叶，并且用在4℃下用HBS+EGTA冲洗以去除任何非肝脏驻留细胞。使用改良的两步胶原酶程序从切除的尾状叶中分离单细胞(MacFarland等人2017ACnano)。单细胞悬液用抗CD45染色以分选用于scRNAseq的所有免疫细胞，或者用抗CD14染色以分选用于通过流式细胞术(BD Aria)的体外处理的KC。

RNA分离、测序和数据分析

将小鼠肝脏解剖，并且用胶原酶IV(Roche)消化。单细胞悬液用抗F4/80、抗CD11b和抗Gr-1染色。F4/80⁺CD11b⁺Gr1^低巨噬细胞通过流式细胞术(BD Aria)进行分选。用RNeasyMinElute试剂盒(Qiagen)提取RNA，将其转化为cDNA，并且使用下一代测序(Illumina)进行测序。RNA-seq数据与人基因组(hg19版本)进行比对，并且使用bowtie2 2.2.3(Langmead等人2009)和RSEM 1.2.15(Li等人2011)来计算每个样品的每个基因的原始计数。使用程序edgeR以P<0.05执行差异表达分析，变化为2倍(Robinson等人2010)。使用cpm函数对不同样品的基因表达水平进行归一化和量化。使用在线功能富集分析工具DAVID对DEG进行注释(Huang等人2007)。

单细胞RNAseq和计算分析

将分选的CD45⁺细胞在0.05％无RNA酶的BSA的PBS溶液中重悬并洗涤，从而根据制造商的说明用10x Chromium Next GEM单细胞3’试剂盒(10XGenomics)制备单细胞库。单细胞cDNA库通过NexSeq500(Illumina)测序。使用Cell Ranger软件v3.1(10XGenomics)对原始序列进行多路分解、比对、过滤、条形码计数、唯一分子标识符(UMI)计数，从而将每种细胞的每个基因的表达数字化。使用Seurat3.0包执行分析。在将来自多个样品的数据组合之前，我们首先分别处理每个单独的数据集。从每个数据集中去除具有极低数量(小于500)或极高数量(大于5,000)基因特征作为双联体、或具有低总UMI(小于1,000)和高线粒体比率(大于15％)的异常细胞。随后，基于鉴定的锚点组合样品以进行以下综合分析。我们运行了主要组分分析(PCA)，并且使用前15个主要组分(PC)来执行tSNE聚类。我们检查了每个簇的定义明确的标记基因，以确定潜在的细胞群，诸如T细胞(CD3E、CD8A、CD4、CD69、IL7R)、B细胞和浆细胞(CD19、MS4A1,SDC1)、DC(CD11C、CLEC9A)、NK细胞(CD56、CD16、GZMB)。对于巨噬细胞分析，选择CD14和CD68阳性簇用于后续分析。我们对巨噬细胞的综合数据集重复进行PCA、tSNE聚类。执行差异表达分析以鉴定与所有其他细胞相比在每个簇中显著上调的基因。对于代表特定细胞功能或途径的基因集，我们通过在线工具DAVID使用Gene Ontology的生物学过程执行了功能富集分析。

统计方法

使用双侧未配对或配对学生t测试来确定统计显著性。FDR用q＝Pxn/i计算，其中P＝P值，n＝总测试数，并且i＝P值的分选等级。

实施例9：DPI刺激巨噬细胞中的糖酵解的快速和持续增加。

DPI刺激人原代巨噬细胞中的糖酵解途径中的许多基因的转录(图20A和图27A)。我们证实了己糖激酶(HK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和烯醇酶在人原代巨噬细胞和永生化小鼠库普弗细胞系(ImKC)中在蛋白质水平上以DIP剂量和处理时间依赖性方式的上调(图27B)。为了研究DPI对细胞代谢的影响，在不存在或存在5nM、50nM和500nM DPI的情况下，我们通过分别测定ImKC中的细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)来测量了糖酵解和氧化磷酸化(OxPhos)中的细胞活性。以剂量依赖性方式，DPI刺激ECAR立即增加以及伴随的OCR减少(图20B-图20C)。DPI刺激的糖酵解增加对葡萄糖、寡霉素和鱼藤酮加上抗霉素A敏感，并且与糖酵解能力和储备的显著增加有关(图20D-图20E)。在DPI治疗后6小时，通过量化ImKC中的糖酵解途径和三羧酸(TCA)循环中的主要中间体的水平，证实了DPI对糖酵解和OxPhos的影响。如图20F所示，以DPI剂量依赖性方式，葡萄糖水平显著降低，而糖酵解途径中的中间体(包括葡萄糖6-磷酸(G6P)、果糖1,6-双磷酸(F1,6BP)、甘油醛3-磷酸(G3P)、丙酮酸和乳酸)的水平显著增加。相比之下，TCA循环中间体(包括乙酰辅酶A、柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐(α-KG)、琥珀酸、富马酸和苹果酸)的水平全部以DPI剂量依赖性方式降低。在DPI治疗后24小时也观察到葡萄糖、糖酵解和TCA循环中间体的水平的类似变化(图27C)。这些结果显示，DPI在两个水平上动态调控细胞代谢：快速刺激糖酵解并同时抑制OxPhos，以及通过上调糖酵解途径中基因的转录和表达来持续刺激糖酵解。

实施例10：DPI通过GPR3和β-阻遏蛋白2刺激糖酵解

DPI是GPR3的激动剂和GAPDH氧化酶(NOX)的抑制剂。我们首先确定了DPI刺激的糖酵解中的NOX需求。由p47phox^-/-小鼠制备骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)，所述巨噬细胞不具有任何功能性NOX活性，因为p47phox是吞噬细胞NAPDH氧化酶(NOX2)的组织者。与野生型(WT)BMDM相比，p47phox^-/-BMDM具有显著较低的糖酵解基础水平、糖酵解能力和糖酵解储备(图21A-图21C和图28A-图28B)。然而，DPI在野生型和p47phox^-/-BMDM中以剂量依赖性方式刺激糖酵解、糖酵解能力和葡萄糖消耗的类似水平增加。类似地，当NOX活性被夹竹桃麻素(一种NOX特异性抑制剂)药理学抑制时，DPI刺激ImKC中糖酵解的类似增加(图21B)。这些数据显示，DPI刺激的糖酵解不依赖于NOX活性。

为了确定GPR3的需求，我们在ImKC中通过siRNA敲低了GPR3(siGpr3)。尽管GPR3敲低约为70％(图28C)，但与用乱序siRNA转染的ImKC相比，siGpr3 ImKC中糖酵解的基础水平和糖酵解能力显著降低(图21D)。重要的是，与对照相比，在50nM下，DPI不刺激siGpr3 ImKC中糖酵解、糖酵解能力和葡萄糖消耗的任何增加(图21D-图21E和图28D-图28E)。然而，在500nM下，DPI刺激siGpr3 ImKC中的糖酵解和糖酵解能力显著增加，但增加幅度显著低于乱序siRNA转染的ImKC中的增加幅度，这可能是由于siRNA部分地敲除GPR3或DPI刺激其他蛋白质。此外，鞘氨醇-1-磷酸(S1P)(一种已报道的GPR3内源性配体)也刺激了ImKC中糖酵解的显著增加，尽管增加的幅度远低于50nM DPI刺激的增加幅度(图21F)，这证明了内源性配体激活GPR3也会刺激巨噬细胞中的糖酵解。

据报道，由Arrb2编码的β-阻遏蛋白2与GPR3结合，并且是GPR3信号传导所需的。为了研究β-阻遏蛋白2在DPI刺激的糖酵解中的需求，我们使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑构建了Arrb2^-/-ImKC(图28F)。与siGpr3 ImKC相同，与亲本ImKC相比，Arrb2^-/-ImKC中的糖酵解基础水平和糖酵解能力显著降低(图21G-图21H和图28G-图28H)，并且在50nM下，DPI不刺激Abbr2^-/-ImKC中的任何糖酵解和糖酵解能力的增加。此外，在ImKC和BMDM中，DPI，而不是S1P，在10分钟内刺激了β-阻遏蛋白2从胞质溶胶易位至质膜(图21I和图28I)。

总之，这些结果显示，DPI刺激的糖酵解依赖于GPR3和β-阻遏蛋白2，并且DPI对GPR3的激活导致β-阻遏蛋白2快速转运至质膜。

实施例11：DPI通过形成GPR3-β-阻遏蛋白2-GAPDH-PKM2超酶促复合物来刺激糖酵 解活性的快速增加

DPI如何刺激糖酵解活性的快速增加？我们研究了β-阻遏蛋白2与代谢酶(包括PKM2和GAPDH)之间的相互作用。为了研究这种机制，我们用或不用DPI处理ImKC 6小时并且免疫沉淀β-阻遏蛋白2，然后进行蛋白质印迹分析。ERK1/2、烯醇化酶、GAPDH和PKM2与β-阻遏蛋白2共沉淀(图22A)。值得注意的是，在DPI治疗后，显著更高水平的GAPDH和PKM2与β-阻遏蛋白2共沉淀，表明DPI促进β-阻遏蛋白2与GAPDH和PKM2之间的相互作用。为了确定PKM2在DPI诱导的糖酵解中的需求，我们用DPI处理来自野生型和Pkm^-/-小鼠的BMDM，并且测量糖酵解活性。与siGpr3 ImKC和Arrb2^-/-ImKC相同，50nM DPI不刺激Pkm^-/-BMDM的糖酵解、糖酵解能力和葡萄糖消耗的任何增加(图22B-图22C和图29A-图29B)。我们还测量了在不存在或存在50nM DPI的情况下，亲本和Arrb2^-/-ImKC中的PKM2和GAPDH的酶活性。如图22D-图22E所示，DPI以β-阻遏蛋白2依赖性方式刺激PKM2和GAPDH酶活性立即增加。此外，当ERK1/2的磷酸化被夹竹桃麻素抑制时，DPI对PKM2和GAPDH酶活性的影响被消除(图29C)。因此，DPI刺激GPR3-β-阻遏蛋白2-GAPDH-PKM2复合物的形成，导致PKM2和GAPDH的酶活性增强，并且为观察到的DPI处理后的糖酵解活性的快速增加提供了机制解释。

实施例12：DPI通过PKM2的核易位和转录激活来刺激糖酵解活性的持续增加

DPI如何刺激糖酵解途径中的基因转录？已知PKM2以单体、二聚体和四聚体形式存在。虽然四聚体形式表现出糖酵解酶活性，但二聚体形式可以易位到细胞核中并且充当转录辅助因子以激活c-Myc的表达，c-Myc继而可以通过结合经典的E-box序列来直接激活几乎所有糖酵解基因的转录。为了测试这种机制，我们首先确定PKM2是否是DPI诱导的糖酵解基因转录所需的。由野生型和Pkm^-/-小鼠制备BMDM，在有或没有50和500nM DPI的情况下孵育24小时，并通过RT-PCR量化关键糖酵解基因的转录物水平。以剂量依赖性方式，DPI刺激野生型中的Pkm、Ldha和Hk2的转录，但不刺激Pkm^-/-BMDM中的转录(图23A)，表明PKM2是介导DPI刺激的糖酵解基因转录所需的。

接下来，我们确定DPI是否诱导二聚体PKM2的形成和核易位。ImKC用50或500nMDPI处理6或12小时，裂解并直接通过Native PAGE凝胶进行分析，然后进行抗PKM2蛋白质印迹法。虽然发现PKM2在无DPI处理的情况下呈单体和四聚体形式，但在DPI处理后以剂量依赖性方式诱导二聚体形式(图23B)。DPI对二聚体PKM2的诱导通过DSS交联然后进行蛋白质印迹法进一步证实，并通过用SCH772984抑制ERK1/2来消除(图30A-图30B)，这与先前的报道一致。为了进一步确定DPI处理后的PKM2核易位，ImKC和人原代KC均未处理或用DPI处理24小时，然后用抗PKM2染色。在未进行DPI处理的情况下，抗PKM2荧光信号位于胞质溶胶中，而在进行DPI处理的情况下，在细胞核中检测到显著量的抗PKM2荧光信号(图23C)，表明PKM2在DPI处理后从胞质溶胶易位到细胞核中。

我们还确定了c-Myc是否以PKM2依赖性方式被DPI诱导。如图23A所示，以剂量依赖性方式，DPI刺激野生型中的c-Myc转录，但不刺激Pkm^-/-BMDM中的转录。为了确定DPI是否激活c-Myc转录活性，我们在亲本ImKC和Pkm^-/-ImKC中执行了c-Myc荧光素酶报告基因检测。荧光素酶活性仅在亲本ImKC中被DPI诱导，在Pkm^-/-ImKC中不被诱导(图23D)，这证明了DPI以PKM2依赖性方式激活c-Myc转录活性。

总之，这些结果证明了，DPI通过PKM2的核易位、c-Myc的转录激活和糖酵解基因的转录来刺激糖酵解活性的持续增加。

实施例13：DPI通过库普弗细胞中的PKM2表达抑制HFD诱导的肥胖和肝脏发病机制

为了探索DPI对糖酵解的体内影响，我们检查了DPI预治疗小鼠的快速葡萄糖反应。C57BL/6(B6)小鼠腹膜内(i.p.)注射2mg/kg DPI，并且6小时后小鼠腹膜内注射1.5mg/kg葡萄糖。在DPI注射前、DPI注射后6小时和葡萄糖注射后的不同时间点测量血糖水平。如图31所示，小鼠在DPI注射前具有相同水平的血糖。DPI注射后6小时，DPI治疗的小鼠血糖水平显著较低，并在葡萄糖注射后15分钟和30分钟维持显著较低的葡萄糖水平，这表明DPI刺激血糖代谢率增加。我们进一步检查了DPI是否抑制高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖和肝脏发病机制。5周龄的B6小鼠用HFD喂养总共8周。在HFD开始三周后，当小鼠表现出显著的体重增加时，每五天通过腹膜内注射对一部分小鼠给予媒介物(PEG3000)，并且对其余小鼠给予DPI(2mg/kg)的媒介物溶液。在HFD喂养的小鼠中，与媒介物治疗组相比，DPI治疗立即并显著降低了体重增加(图24A)，而不影响每周的食物摄入(图24B)。一贯地，DPI治疗的小鼠在HFD 8周后具有显著较低水平的iWAT(图24C)。值得注意的是，DPI治疗的HFD小鼠的体重增加的速度与喂食正常饮食(ND)的小鼠类似(图24A)，这表明DPI抑制了由于额外脂肪摄取而不是正常生长引起的体重增加。葡萄糖耐受测试证明了，与媒介物治疗的HFD小鼠相比，DPI治疗的HFD小鼠表现出葡萄糖耐受的显著增加(图24D)。与媒介物治疗的HFD小鼠相比，DPI治疗还显著减少了肝脏中的脂质沉积(图23E)。一贯地，HFD喂养的小鼠中的血清ALT和AST的浓度显著高于正常饮食喂养的小鼠中的浓度(图23F)。DPI施用显著降低了HFD诱导的血清AST和ALT升高。

我们还检查了DPI对肝脂肪变性的影响。B6小鼠用HFD喂养16周。HFD九周后，当小鼠变得肥胖时，每5天给予一次DPI(2mg/kg)，总共10剂。DPI还显著降低了体重增加，而不影响每周的食物摄入(图24A-图24B)。DPI治疗组中的iWAT的重量显著低于媒介物治疗组(图31C)。类似地，DPI治疗的HFD小鼠表现出葡萄糖耐受增加，并且肝脏中的脂滴、脂肪变性和胶原蛋白沉积减少(图31D-图31E)。总之，这些结果证明了，DPI抑制小鼠的HFD诱导的肥胖、脂质沉积和肝脂肪变性。

为了研究肝脏中介导DPI作用的细胞类型，我们使用已知的单细胞RNAseq数据分析了肝脏中不同细胞类型中的PKM2表达。在人和小鼠中，PKM2在库普弗细胞中高度表达并且在其他免疫细胞中中等表达，而PKM1(PKLR)仅在APOC3⁺肝细胞中表达(图25)。为了直接测试库普弗细胞中的PKM2表达是否介导DPI的作用，我们通过将Clec4f-Cre小鼠与PKM2floxed(Pkm^f/f)小鼠杂交来构建了KC特异性PKM2敲除(Pkm^-/-)小鼠。KC特异性Pkm^-/-小鼠从5周龄开始用HFD喂养8周。HFD三周后，每5天通过腹膜内注射对一半的小鼠给予媒介物，并且对另一半小鼠给予DPI(2mg/kg)。如图24I-图24J所示，DPI不降低HFD诱导的KC特异性Pkm^-/-小鼠的体重增加和肝脏中的脂滴沉积。类似地，接受或未接受DPI治疗的KC特异性Pkm^-/-小鼠具有相似的葡萄糖耐受、血清AST和ALT水平，除了DPI治疗的小鼠具有显著较低水平的iWAT(图33)。这些结果证明了，DPI抑制HFD诱导的肥胖并且肝脏发病机制依赖于库普弗细胞中的PKM2表达。

实施例14：DPI上调HFD喂养的小鼠中的库普弗细胞的糖酵解并抑制其炎症反应

为了进一步研究DPI对体内库普弗细胞的影响，我们从媒介物或DPI治疗的HFD喂养的小鼠和正常饮食的年龄匹配小鼠中纯化KC，并且执行RNA-seq。GSEA和功能富集分析显示，喂食HFD或ND的小鼠的KC的中与免疫和炎症反应相关的基因上调(图25A-图25C)。在DPI治疗后，HFD小鼠的KC中的参与炎症的基因表达被显著抑制。相比之下，在DPI治疗后，在HFD小鼠的KC中下调的许多其他基因的表达显著上调(图25A)。有趣的是，HFD小鼠的KC中的参与糖酵解、氧化磷酸化和脂肪酸代谢的基因的表达下调，而在DPI治疗后，HFD小鼠的KC中的这些基因的表达上调(图25A-图25C)。巨噬细胞极化指数(MPI)分析显示，KC在HFD喂养的小鼠中极化为M1，但在正常饮食的小鼠中极化为M2，而KC在DPI治疗的HFD小鼠中被重编程为中间表型(图25D)。这些结果表明，DPI上调HFD喂养的小鼠中的KC的糖酵解并抑制其炎症反应。

实施例15：DPI上调NAFLD患者的库普弗细胞的糖酵解并抑制其炎症反应

对NASH和肝硬化患者的肝细胞的单细胞RNAseq分析确定了肝脏中的TREM2⁺疾病相关巨噬细胞(DAM)具有较低的代谢基因表达。为了确定DAM是否也存在于NFALD患者中，我们对来自3名健康供体和3名NFALD患者的肝脏活检的免疫细胞执行了scRNAseq。鉴定了14个细胞簇，包括幼稚CD8⁺T细胞、驻留记忆CD8⁺(T_RM)细胞、CD4⁺T细胞、B细胞和浆细胞、CD56^低和CD56^高NK细胞、巨噬细胞或KC、中性粒细胞和增殖细胞(图35)。鉴定并进一步分析了三个肝脏巨噬细胞群(LM1、LM2、LM3)。如图26A-图26E所示，将LM重新分类为7个簇，可以对其进行注释。簇1(C1)和C2是驻留KC，因为它们表达MNDA和FCN1。C1与C2的差异在于表达更高水平的炎症基因(图36)，而C2表达更高水平的糖酵解基因，包括PGAM1、PKM、GAPDH和ENO1(图26C)。C0、C3和C4全部表达MHC-II(HLA-DRB1等)。C4类似于树突状细胞，因为一些细胞表达CD1C。C3与DAM的相似之处在于表达C1QA、APOE、TREM2、CD9、GPNMB和CLEC10A以及补体基因(C1QA等)。C3是NFALD中唯一升高的LM群，具有上调的抗原加工和呈递、单核细胞趋化性、对损伤的反应的途径，以及下调的免疫反应、糖酵解、吞噬作用的途径(图26F)，如在晚期NASH和肝硬化中观察到的那样。基于轨迹推断(图26E)和富集的GO本体途径(图26F和图36)，C0可能是中间体或通过共表达多个基因(包括CD163、LIPA、CCL3、CCL4和CXCL3)的驻留KC(C1和C2)与DAM(C3)之间的分化LM或KC(图26C)。C5表达高水平的骨髓检查点受体LIRB1和LIRB2。C6可能是通过共表达血红蛋白mRNA(HBD和HBA2)来吞噬红细胞的KC(图26C和图36)。

为了直接检查DPI对NFALD患者的人库普弗细胞的影响，我们从两名NFALD患者纯化了KC，并且在离体DPI处理24小时后通过RNA-seq执行转录分析。与人MDM和小鼠ImKC相同，糖酵解基因的表达被DPI上调，而DAM标记(包括APOE、CLEC10A、TREM2和C1QA)的表达被下调(图26G)。功能富集分析显示，DPI治疗的KC不仅上调糖酵解基因的表达，而且抑制与趋化因子介导的信号传导、趋化性和炎症反应相关的基因的表达(图26H)。这些结果显示，DPI也上调NAFLD患者的库普弗细胞的糖酵解并抑制炎症反应。

通过引用并入

本文中所提及的所有公开和专利都特此通过引用整体并入，如同每个个别公开或专利具体地和个别地被指示为通过引用并入。在有冲突的情况下，将以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

等效方案

虽然已经讨论了本发明的具体实施方案，但是以上说明书是说明性的，并非限制性的。在阅读本说明书和下文的权利要求后，本发明的许多变化对本领域技术人员来说将变得显而易见。本发明的完整范围应该通过参考权利要求书连同其等效物的完整范围，以及本说明书连同此类变化方案来确定。

Claims (96)

1.一种鉴定巨噬细胞激活调节剂的方法，其包括：

使原代巨噬细胞与候选剂接触；

监测或拍摄与所述候选剂接触的所述细胞的形态；以及

任选地将在所述候选剂存在的情况下的所述细胞形态与在所述候选剂不存在的情况下的所述细胞形态进行比较；其中在所述候选剂存在的情况下的形态变化指示巨噬细胞激活的调节。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述原代巨噬细胞是骨髓衍生的巨噬细胞或单核细胞衍生的巨噬细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞的形态通过显微镜监测或拍摄。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述显微镜是荧光显微镜。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中通过Opera Phenix高内涵筛选系统来监测或拍摄所述细胞的形态。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中通过CellProfiler来监测或拍摄所述细胞的形态。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞的形态由细长形变为圆形。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述调节剂激活M1样巨噬细胞。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述调节剂使M2样巨噬细胞失活。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述调节剂将肿瘤相关巨噬细胞(TAM)改变为M1样巨噬细胞。

11.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M2样巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

12.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M-CSF巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

13.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述调节剂将GM-CSF巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

14.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述调节剂将原代巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

15.如权利要求7-14中任一项所述的方法，其中所述调节剂诱导LPS、IFNγ或TNFα。

16.如权利要求7-15中任一项所述的方法，其中所述调节剂激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

17.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述调节剂是M1激活化合物。

18.如权利要求7-17中任一项所述的方法，其中所述调节剂是细胞松弛素-B、芬苯达唑、帕苯达唑、甲巯咪唑、前列地尔、FTY720、五氟利多、紫杉醇、smer-3、斑蝥素、SCH79797、米托蒽醌、氯硝柳胺、MS275、HMN-214、DPI、硫链丝菌素、吴茱萸碱、葫芦素-I、NVP 231、洗必泰、二亚苯基碘鎓、LE135、氟伏沙明、莫西诺司他、匹莫齐特、NP-010176、雷公藤红素、FTY720、WP1130、普卢利沙星、二氢鲸蜡醇二乙酸酯或喹啉鎓。

19.如权利要求8-18中任一项所述的方法，其中所述M1样巨噬细胞介导促炎反应、抗微生物反应和/或抗肿瘤反应。

20.如权利要求8-19中任一项所述的方法，其中所述调节剂治疗癌症、纤维化和/或感染性疾病。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblasticleukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前骨髓细胞性白血病、腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤、库尔契茨基氏细胞癌、大细胞癌、扁豆状癌(lenticularcarcinoma)、扁豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏蛋白性腺癌、黏液癌(melanotic carcinoma)、黏液癌(carcinomamolle)、黏液细胞癌、黏液表皮样癌、黏液癌、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、未侵袭癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、哈-巴二氏黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤或浅表扩展性黑色素瘤。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒感染或细菌感染。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述感染与COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感、巨细胞病毒、天花和A组链球菌或败血症有关。

24.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞的形态由圆形变为细长形。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述调节剂激活M2样巨噬细胞。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述调节剂使M1样巨噬细胞失活。

27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M1样巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

28.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M-CSF巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

29.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述调节剂将GM-CSF巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

30.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述调节剂将原代巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

31.如权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述调节剂诱导选自IL4、IL13和IL10的M2激活刺激。

32.如权利要求24-31中任一项所述的方法，其中所述调节剂抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

33.如权利要求24-32中任一项所述的方法，其中所述调节剂是M2激活化合物。

34.如权利要求24-33中任一项所述的方法，其中所述调节剂是博舒替尼、Su11274、阿特波龙、阿司他丁、比生群、雷公藤内酯、洛伐他汀、QS 11、瑞戈非尼、索拉非尼、MLN2238、GW-843682X、KW 2449、阿昔替尼、JTE 013、嘌吗啡胺、阿奇黄素A、达沙替尼、NVP-LDE225、1-萘基PP1、西拉菌素、MGCD-265、普达非洛、秋水仙碱或硫酸长春碱。

35.如权利要求25-34中任一项所述的方法，其中所述M2样巨噬细胞介导抗炎或组织修复反应。

36.如权利要求25-35中任一项所述的方法，其中所述调节剂治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述炎性疾病、所述代谢疾病或所述自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

39.一种治疗癌症、纤维化或感染性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中所述调节剂将巨噬细胞的形态从细长形改变成圆形。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述调节剂激活M1样巨噬细胞。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述调节剂使M2样巨噬细胞失活。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述调节剂将肿瘤相关巨噬细胞(TAM)改变为M1样巨噬细胞。

43.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M2样巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

44.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M-CSF巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

45.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述调节剂将GM-CSF巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

46.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述调节剂将原代巨噬细胞改变为M1样巨噬细胞。

47.如权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述调节剂诱导选自LPS、IFNγ和TNFα的M1激活刺激。

48.如权利要求39-47中任一项所述的方法，其中所述调节剂激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

49.如权利要求39-48中任一项所述的方法，其中所述调节剂是M1激活化合物。

50.如权利要求39-49中任一项所述的方法，其中所述调节剂是细胞松弛素-B、芬苯达唑、帕苯达唑、甲巯咪唑、前列地尔、FTY720、五氟利多、紫杉醇、smer-3、斑蝥素、SCH79797、米托蒽醌、氯硝柳胺、MS275、HMN-214、DPI、硫链丝菌素、吴茱萸碱、葫芦素-I、NVP 231、洗必泰、二亚苯基碘鎓、LE135、氟伏沙明、莫西诺司他、匹莫齐特、NP-010176、雷公藤红素、FTY720、WP1130、普卢利沙星、二氢鲸蜡醇二乙酸酯或喹啉鎓。

51.如权利要求40-50中任一项所述的方法，其中所述M1样巨噬细胞介导促炎反应、抗微生物反应和/或抗肿瘤反应。

52.如权利要求39-51中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前骨髓细胞性白血病、腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌(cerebriformcarcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloidcarcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤、库尔契茨基氏细胞癌、大细胞癌、扁豆状癌(lenticularcarcinoma)、扁豆状癌(carcinomalenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏蛋白性腺癌、黏液癌(melanotic carcinoma)、黏液癌(carcinomamolle)、黏液细胞癌、黏液表皮样癌、黏液癌、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、未侵袭癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、哈-巴二氏黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤或浅表扩展性黑色素瘤。

53.如权利要求39-52中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的第二癌症疗法。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述第二癌症疗法包括癌症免疫疗法。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述癌症免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是特异性结合免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。

58.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、BGB-A317、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012或STI-A1010。

59.如权利要求53所述的方法，其中所述第二癌症疗法包括施用化疗剂。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述化疗剂是利妥昔单抗、噻替派、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯并霍烷、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、布拉他辛酮、喜树碱、拓扑替康、苔藓抑素、卡利他汀、CC-1065、念珠藻素1、念珠藻素8、尾海兔素、倍癌霉素、五加素、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素、达内霉素、氯膦酸二钠、埃斯佩拉霉素；新制癌菌素载色体、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、多柔比星、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链酶黑素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、脱氧氟尿苷、卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、亚丝醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃博霉素、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、非那西汀、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙肼、甲基苄肼、PSK多糖复合物、雷佐生、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺、单端孢霉烯、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇行菌素、尿烷、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、瓜西托辛、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替派、紫杉醇、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、疏基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、奥沙利铂、卡铂、长春碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺万托、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、伊立替康、RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸或卡培他滨。

61.如权利要求39-51中任一项所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒感染或细菌感染。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述感染与COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感、巨细胞病毒、天花和A组链球菌或败血症有关。

63.一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中所述调节剂将巨噬细胞的形态从圆形改变成细长形。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述调节剂激活M2样巨噬细胞。

65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述调节剂使M1样巨噬细胞失活。

66.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M1样巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

67.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述调节剂将M-CSF巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

68.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述调节剂将GM-CSF巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

69.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述调节剂将原代巨噬细胞改变为M2样巨噬细胞。

70.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述调节剂诱导选自IL4、IL13和IL10的M2激活刺激。

71.如权利要求63-70中任一项所述的方法，其中所述调节剂抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

72.如权利要求63-71中任一项所述的方法，其中所述调节剂是M2激活化合物。

73.如权利要求63-72中任一项所述的方法，其中所述调节剂是博舒替尼、Su11274、阿特波龙、阿司他丁、比生群、雷公藤内酯、洛伐他汀、QS 11、瑞戈非尼、索拉非尼、MLN2238、GW-843682X、KW 2449、阿昔替尼、JTE 013、嘌吗啡胺、阿奇黄素A、达沙替尼、NVP-LDE225、1-萘基PP1、西拉菌素、MGCD-265、普达非洛、秋水仙碱或硫酸长春碱。

74.如权利要求64-73中任一项所述的方法，其中所述M2样巨噬细胞介导抗炎或组织修复反应。

75.如权利要求63-74中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病、所述代谢疾病或所述自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。

76.如权利要求63-74中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

77.一种治疗癌症、纤维化或感染性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中所述调节剂激活血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述调节剂是细胞松弛素-B、芬苯达唑、帕苯达唑、甲巯咪唑、前列地尔、FTY720、五氟利多、紫杉醇、smer-3、斑蝥素、SCH79797、米托蒽醌、氯硝柳胺、MS275、HMN-214、DPI、硫链丝菌素、吴茱萸碱、葫芦素-I、NVP 231、洗必泰、二亚苯基碘鎓、LE135、氟伏沙明、莫西诺司他、匹莫齐特、NP-010176、雷公藤红素、FTY720、WP1130、普卢利沙星、二氢鲸蜡醇二乙酸酯或喹啉鎓。

79.如权利要求77-78中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前骨髓细胞性白血病、腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌(cerebriformcarcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloidcarcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤、库尔契茨基氏细胞癌、大细胞癌、扁豆状癌(lenticularcarcinoma)、扁豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏蛋白性腺癌、黏液癌(melanotic carcinoma)、黏液癌(carcinomamolle)、黏液细胞癌、黏液表皮样癌、黏液癌、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、未侵袭癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、哈-巴二氏黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤或浅表扩展性黑色素瘤。

80.如权利要求77-79中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的第二癌症疗法。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述第二癌症疗法是癌症免疫疗法。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是免疫检查点抑制剂。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是特异性结合免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。

85.如权利要求83所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、BGB-A317、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012或STI-A1010。

86.如权利要求80所述的方法，其中所述第二癌症疗法是化疗剂。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述化疗剂是利妥昔单抗、噻替派、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯并霍烷、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、布拉他辛酮、喜树碱、拓扑替康、苔藓抑素、卡利他汀、CC-1065、念珠藻素1、念珠藻素8、尾海兔素、倍癌霉素、五加素、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素、达内霉素、氯膦酸二钠、埃斯佩拉霉素；新制癌菌素载色体、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、多柔比星、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链酶黑素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、脱氧氟尿苷、卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、亚丝醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃博霉素、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、非那西汀、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙肼、甲基苄肼、PSK多糖复合物、雷佐生、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺、单端孢霉烯、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇行菌素、尿烷、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、瓜西托辛、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替派、紫杉醇、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、疏基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、奥沙利铂、卡铂、长春碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺万托、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、伊立替康、RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸或卡培他滨。

88.如权利要求77-78中任一项所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒感染或细菌感染。

89.如权利要求88所述的方法，其中所述感染与COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感、巨细胞病毒、天花和A组链球菌或败血症有关。

90.一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的巨噬细胞激活调节剂；其中所述调节剂抑制血清素转运蛋白或受体、组胺转运蛋白或受体、多巴胺转运蛋白或受体、肾上腺素能受体、VEGF、EGF和/或瘦素。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述调节剂是博舒替尼、Su11274、阿特波龙、阿司他丁、比生群、雷公藤内酯、洛伐他汀、QS 11、瑞戈非尼、索拉非尼、MLN2238、GW-843682X、KW2449、阿昔替尼、JTE 013、嘌吗啡胺、阿奇黄素A、达沙替尼、NVP-LDE225、1-萘基PP1、西拉菌素、MGCD-265、普达非洛、秋水仙碱或硫酸长春碱。

92.如权利要求90-91中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病、所述代谢疾病或所述自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。

93.如权利要求90-91中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

94.一种治疗炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病或神经退行性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的二亚苯基碘鎓(DPI)。

95.如权利要求94所述的方法，其中所述炎性疾病、所述代谢疾病或所述自身免疫疾病是糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心血管疾病、局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、慢性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关性视网膜病变、眼内炎、眼内新生血管病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视神经脊髓炎(NMO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管、视网膜新生血管、雷伯氏遗传性视神经病、视神经炎、贝切特视网膜病变、缺血性视神经病变、视网膜血管炎、抗嗜中性细胞质自身抗体血管炎、普尔夏视网膜病变、肖格伦干眼病、干性AMD、结节病、颞动脉炎、结节性多动脉炎、多发性硬化症、超急性排斥反应、血液透析、慢性闭塞性肺窘迫综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮或肌炎。

96.如权利要求94所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、格林-巴利综合征(GBS)、重症肌无力、大疱性类天疱疮、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、帕金森病或亨廷顿舞蹈症。

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