KR101961332B1 - Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101961332B1
KR101961332B1 KR1020170095685A KR20170095685A KR101961332B1 KR 101961332 B1 KR101961332 B1 KR 101961332B1 KR 1020170095685 A KR1020170095685 A KR 1020170095685A KR 20170095685 A KR20170095685 A KR 20170095685A KR 101961332 B1 KR101961332 B1 KR 101961332B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
dna
synthetic
artificial sequence
pcr
Prior art date
Application number
KR1020170095685A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180013780A (ko
Inventor
김진수
김정훈
박성욱
김경미
Original Assignee
기초과학연구원
서울대학교산학협력단
서울대학교병원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 기초과학연구원, 서울대학교산학협력단, 서울대학교병원 filed Critical 기초과학연구원
Publication of KR20180013780A publication Critical patent/KR20180013780A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101961332B1 publication Critical patent/KR101961332B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y10S514/912—

Abstract

Cas9 뉴클레아제 및 VEGF -A를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 신생혈관성 안질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물 및 Cas9 뉴클레아제 및 VEGF -A를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질이 제공된다.

Description

Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Eye Disease Comprising Cas9 Protein and Guide RNA}
Cas9 단백질 및 VEGF -A를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 안질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물 및 Cas9 단백질 및 VEGF -A를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질이 제공된다.
CRISPR-Cas9 뉴클레아제를 이용한 RNA 유도 유전체 교정 (RNA-guided genome surgery 또는 RNA-guided genome editing)은 다양한 유전 질환의 치료에 도움이 될 것으로 기대되지만, 비유전 질환에의 CRISPR-Cas9 뉴클레아제의 치료 효과는 밝혀진 바가 거의 없다.
비유전 질환의 일 예로 황반변성(예컨대, 노인성 황반변성(Age-related Macular Disease; AMD))을 들 수 있다. AMD는 선진국의 고령 인구에서의 주요한 실명 원인이다. 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization; CNV)은 신생 혈관성 AMD의 주요 병리학적 특징이며, 주로 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF A)와 같은 혈관 신생 사이토카인(angiogenic cytokines)에 의해 유발된다. 지금까지는, AMD의 치료제로서 VEGF -A를 표적으로 하는 단클론 항체 또는 압타머가 주로 개발되어 왔다. 그러나, VEGF -A가 망막 세포에서 연속적으로 발현되고 분비되기 때문에, 이들 항-VEGF-A 제제는 1년에 적어도 일곱 번 이상 투여되어야 하는 문제가 있다.
따라서, 황반변성 등의 안질환의 보다 근본적이면서 지속적인 치료 기술의 개발이 요구된다.
한국특허공개 제10-2015-0101446호 (2015.09.03 공개)
본 명세서는 VEGF -A의 근본적인 불활성화를 통하여, 그 수준을 병리학적 역치 이하로 낮춤으로써, 안질환의 장기적 또는 영구적인 치료를 가능하게 하는 기술을 제안한다.
일 예는 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제를 포함하는, 안질환의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 예는, VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제를 안질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 안질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제는 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제는 다양한 투여 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예컨대, 안구의 병변부위 국소 투여 또는 망막하 주사에 의하여 투여될 수 있다.
다른 예는, VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제의 안질환의 예방 및/또는 치료, 또는 안질환의 치료제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 불활성화의 표적이 되는 VEGF -A 유전자는 눈, 예컨대, 신생혈관성 안질환이 발생한 눈 또는 신생혈관성 안질환의 병변 부위에 위치하는 것일 수 있다.
상기 VEGF -A 유전자의 불활성화는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다:
(1) VEGF -A 유전자의 전체 또는 1-50bp 또는 1-40bp 길이의 연속적 또는 불연속적 일부분의 결실;
(2) VEGF -A 유전자 중 1-20개, 1-15개, 또는 1-10개의 연속적 또는 불연속적인 뉴클레오타이드의 야생형 VEGF -A 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환;
(3) VEGF -A 유전자 내의 1-20개, 1-15개, 또는 1-10개의 뉴클레오타이드의 삽입 (부가), 이 때, 상기 삽입되는 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 A, T, C, 및 G 중에서 선택됨; 및
(4) 이들의 조합.
상기 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제는 VEGF -A 유전자를 불활성화시킬 수 있는 모든 단백질, 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA), 화학 약물 (chemical drug), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제는 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자 (DNA 또는 mRNA) 및 VEGF -A 유전자를 타겟팅하는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, VEGF -A 유전자의 불활성화는 RNA 유도 유전체 교정 (RNA-guided genome surgery or RNA-guided genome editing)에 의하여 수행될 수 있다.
VEGF -A 유전자의 불활성화가 Cas9 단백질을 이용하여 수행되는 경우, 상기 VEGF-A 유전자의 불활성화는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다:
(1) VEGF -A 유전자 내의 Cas9 단백질의 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한 1-50bp 또는 1-40bp 길이의 연속적 또는 불연속적 부위에 위치하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실;
(2) VEGF -A 유전자 내의 Cas9 단백질의 PAM 서열에 인접한 1-50bp 또는 1-40bp 길이의 연속적 또는 불연속적 부위에 위치하는 1-20개, 1-15개, 또는 1-10개의 연속적 또는 불연속적인 뉴클레오타이드의 야생형 VEGF -A 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환;
(3) VEGF -A 유전자 내의 Cas9 단백질의 PAM 서열에 인접한 1-50bp 또는 1-40bp 길이의 연속적 또는 불연속적 부위에 1-20개, 1-15개, 또는 1-10개의 뉴클레오타이드의 삽입 (부가), 이 때, 상기 삽입되는 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 A, T, C, 및 G 중에서 선택됨; 및
(4) 이들의 조합.
상기 VEGF -A 유전자의 불활성화를 위한 제제는 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자(DNA 또는 mRNA) 및 VEGF -A 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 것일 수 있다.
Cas9 단백질과 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA는
(a) 생체 (또는 병변 부위) 또는 세포 등에 투여되기 전에 Cas9 단백질과 VEGF-A 유전자 특이적 가이드 RNA가 결합하여 형성된 (즉, 투여 전에 미리 조립된) 복합체, 즉, 리보핵산단백질 (ribonucleoprotein; RNP) 형태이거나 (이 경우, 리보핵산단백질 형태로 세포막을 통과하여 세포 내 또는 생체 내로 전달됨),
(b) Cas9 단백질을 암호화하는 DNA 및 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 암호화하는 DNA가 각각 별개의 벡터를 통하여 생체 내 또는 세포 내로 투여 (또는 전달)되거나, 하나의 벡터를 통하여 함께 생체 내 또는 세포 내로 투여 (또는 전달)되어, 생체 또는 세포 내에서 복합체를 이루는 것,
(c) Cas9 단백질을 암호화하는 RNA (mRNA) 및 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 포함하는 RNA 혼합물 형태, 또는
(d) Cas9 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA)를 포함하는 재조합 벡터 및 VEGF-A 유전자 특이적 가이드 RNA (예컨대, in vitro 전사에 의하여 얻어짐)의 혼합물
일 수 있다. 일 예에서, 상기 RNA 혼합물은 통상적인 RNA 전달체에 포함되어 세포 내 또는 생체 내에 전달되는 것일 수 있다.
따라서, 상기 VEGF -A 유전자의 불활성화를 위한 제제는,
(a) 생체 (또는 병변 부위) 또는 세포 등에 투여되기 전 Cas9 단백질과 VEGF-A 유전자 특이적 가이드 RNA가 결합하여 형성된 (즉, 투여 전에 미리 (in vitro) 조립된) 복합체, 즉, 리보핵산단백질 (ribonucleoprotein; RNP) (이 경우, 리보핵산단백질 형태로 세포막을 통과하여 세포 내 또는 생체 내로 전달됨);
(b) Cas9 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA) 및 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 하나의 벡터에 함께 포함하거나, 또는 별개의 벡터에 각각 포함하는 재조합 벡터 (즉 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포;
(c) Cas9 단백질을 암호화하는 RNA (mRNA) 및 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 포함하는 RNA 혼합물;
(d) Cas9 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA)를 포함하는 재조합 벡터 및 VEGF-A 유전자 특이적 가이드 RNA (예컨대, in vitro 전사에 의하여 얻어짐)의 혼합물; 또는
(e) 이들의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 VEGF -A 유전자의 불활성화를 위한 제제의 투여는, 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA)를 포함하는 재조합 벡터와 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터, Cas9 단백질을 암호화하는 RNA (mRNA)와 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA, 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA)를 포함하는 재조합 벡터와 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA를 동시에 투여하거나, 순서와 상관없이 순차적으로 투여하여 수행될 수 있다.
다른 예는, VEGFA 유전자의 특정 표적 부위(target site or target region)를 표적화하기 위한 가이드 RNA를 제공한다. 일 예에서, 상기 가이드RNA는 VEGFA 유전자의 특정 표적 부위의 어느 한 가닥 (예컨대, PAM 서열이 위치하는 가닥과 상보적인 가닥)의 핵산 서열과 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적 핵산 서열을 갖는) 표적화 서열 (targeting sequence)을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는, Cas9 단백질 및 VEGFA 유전자 특이적 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 VEGFA 유전자 특이적 리보핵산단백질 (RNP)을 제공한다.
다른 예는, 상기 가이드 RNA 또는 VEGFA 유전자 특이적 리보핵산단백질 (RNP)을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 황반변성 (예컨대, 노인성 황반변성 (AMD) 등), 망막병증 (예컨대, 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 등) 등과 같은 안질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
다른 예는, 상기 VEGFA 유전자 특이적 리보핵산단백질(RNP)을 안질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 VEGFA 유전자 특이적 리보핵산단백질(RNP)은 약학적 유효량으로 투여될 수 있으며, 예컨대, 안구의 병변부위 국소 투여 또는 망막하 주사에 의하여 투여될 수 있다.
상기 안질환은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 예컨대, VEGF-A의 과발현과 관련된 안질환일 수 있으며, 신생혈관성 안질환 (neovascular eye disease)일 수 있다. 신생혈관성 안질환은 안구의 혈관신생(neovascularization), 예컨대, 맥락막 혈관신생 (choroidal neovascularization; CNV)에 의하여 유발되는 모든 안질환일 수 있으며, 예컨대, 황반변성 (예컨대, 노인성 황반변성 (age-related macular degeneration; AMD), 근시성 맥락막 혈관신생 (myopic choroidal neovascularization) 등), 망막병증 (예컨대, 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy), 허혈성 망막병증 (ischemic retinopathy), 분지정맥폐쇄 (branch retinal vein occlusion), 중심정맥폐쇄 (central retinal vein occlusion), 미숙아 망막병증 (retinopathy of prematurity) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
VEGF-A (Vascular endothelial growth factor A)는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, Human VEGF-A (예컨대, NCBI Accession No. NP_001020537, NP_001020538, NP_001020539, NP_001020540, NP_001020541, NP_001028928, NP_001165093, NP_001165094, NP_001165095, NP_001165096, NP_001165097, NP_001165098, NP_001165099, NP_001165100, NP_001165101, NP_001191313, NP_001191314, NP_001273973, NP_001303939, NP_003367 등), Mouse VEGF-A (NCBI Accession No. NP_001020421, NP_001020428, NP_001103736, NP_001103737, NP_001103738, NP_001273985, NP_001273986, NP_001273987, NP_001303970, NP_033531 등) 등일 수 있다.
Cas9 단백질은 예컨대 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 유래하는 (분리된) 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서,
'표적 유전자 (target gene)'는 유전자 교정 대상이 되는 유전자 (VEGF -A 유전자)를 의미하고,
'표적 부위 (target site or target region)'는 표적 유전자 (VEGF -A 유전자) 내의 Cas9에 의한 유전자 교정 (절단 및 뉴클레오타이드의 결실, 첨가, 및/또는 치환)이 일어나는 유전자 부위를 의미하는 것으로, 표적 유전자 (VEGF -A 유전자) 내의 Cas9 단백질이 인식하는 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위를 의미하고 (이 경우, 유전자 교정은 세포 하나에서의 2쌍의 염색체 중 하나 또는 두 개의 표적 부위에서 일어날 수 있음),
'표적 서열 (target sequence)'은 표적 유전자 (VEGF -A 유전자) 내의 가이드 RNA와 혼성화 가능한 유전자 부위로서, 표적 유전자 (VEGF -A 유전자) 내의 Cas9 단백질이 인식하는 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 20bp 길이의 핵산 서열을 의미하며,
'표적화 서열 (targeting sequence)'은 상기 표적 유전자 내의 표적 서열과 혼성화 가능한 가이드 RNA 부위로서, 17 내지 23개, 예컨대, 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 가이드 RNA 부위일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 표적 서열은 표적 유전자 (VEGF -A 유전자)의 해당 유전자 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때, 실제로 가이드 RNA가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥이므로, 상기 가이드 RNA에 포함된 표적화 서열은, RNA 특성상 T를 U로 변경하는 것을 제외하고, 표적 유전자 (VEGF -A 유전자)에 위치하는 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 갖게 된다. 따라서, 본 명세서에서, 가이드 RNA의 표적화 서열과 표적 유전자 (VEGF -A 유전자)의 표적 서열은 T와 U가 상호 변경되는 것을 제외하고 동일한 핵산 서열로 표시된다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 표적 부위는 표적 유전자 (VEGF -A 유전자) 내의 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
이 경우, VEGF -A 유전자의 불활성화는, VEGF -A 유전자에서,
a) 5'-NGG-3' (N은 A, T, C 또는 G임) 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 최대 50bp 또는 최대 40bp 길이의 핵산 서열 (표적 부위) 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
b) 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 최대 50bp 또는 최대 40bp 길이의 핵산 서열 (표적 부위) 내의 하나 이상 (예컨대, 1-20개, 1-15개, 또는 1-10개)의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
c) 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 최대 50bp 또는 최대 40bp 길이의 핵산 서열 (표적 부위) 내로의 하나 이상 (예컨대, 1-20개, 1-15개, 또는 1-10개)의 뉴클레오타이드의 삽입 (이 때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에서 선택됨), 또는
d) 상기 a) 내지 c) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합
에 의하여 유도된 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 Cas9 단백질의 종류 (즉, 유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.
Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(Xcas9)m-3' (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
Ncas9는 표적화 서열로서, 표적 유전자(VEGF -A 유전자)의 표적 서열에 따라서 결정되는 부위이며, l은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 17 내지 23 또는 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고;
상기 표적 서열의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA) (서열번호 359)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,
Xcas9는 crRNA의 3' 말단쪽에 위치하는 (즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 11일 수 있으며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 예에서, 상기 Xcas9는 UGCUGUUUUG(서열번호 360)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:
5'-(Ycas9)p-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 2)
상기 일반식 2에서,
60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC) (서열번호 361)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,
Ycas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
또한, sgRNA는 상기 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분과 상기 tracrRNA의 필수적 부분 (60개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때, 올리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함). 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서, crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.
일 예에서, sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(올리고뉴클레오타이드 링커)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 3)
상기 일반식 3에서, (Ncas9)l는 표적 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.
상기 sgRNA에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 crRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 표적 유전자(VEGF -A 유전자)의 표적 서열은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:
Vegfa-1: 5'-CTCCTGGAAGATGTCCACCA-3' (서열번호 1) (PAM 서열: GGG);
Vegfa-2: 5'-AGCTCATCTCTCCTATGTGC-3' (서열번호 2) (PAM 서열: TGG);
Vegfa-3: 5'-GACCCTGGTGGACATCTTCC-3' (서열번호 3) (PAM 서열: AGG);
Vegfa-4: 5'-ACTCCTGGAAGATGTCCACC-3' (서열번호 4) (PAM 서열: AGG);
Vegfa-5: 5'- CGCTTACCTTGGCATGGTGG-3' (서열번호 5) (PAM 서열: AGG);
Vegfa-6: 5'- GACCGCTTACCTTGGCATGG-3' (서열번호 6) (PAM 서열: TGG);
Vegfa-7: 5'- CACGACCGCTTACCTTGGCA-3' (서열번호 7) (PAM 서열: TGG); 및
Vegfa-8: 5'- GGTGCAGCCTGGGACCACTG-3' (서열번호 8) (PAM 서열: AGG).
상기 표적 서열들은 포유류 종간 보존이 잘된 서열로, 예컨대, 인간과 설치류 (예컨대, 마우스)에 모두 존재한다. 예컨대, 상기 표적 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 표적 서열은 포유류 간, 예컨대 인간 VEGF -A 유전자와 마우스 VEGF -A 유전자 간에 잘 보존되어 있으며, on target 부위에서의 유전자 교정 효율 (예컨대, indel 빈도(%))가 매우 우수하며, on target 이외의 부분에서는 mismatching nucleotide 개수가 3개 이하, 2개 이하, 1개, 또는 0개인 부위 (off target 부위)가 거의 존재하지 않아서, on target 이외의 부분에서 유전자 교정이 일어날 확률이 매우 낮거나 없어서 안전성이 우수하다 (off-target effect가 매우 낮거나 거의 없음).
이러한 우수한 교정 효율 및 낮은 off-target effect에 근거하여, 본 발명의 일 예는 상기한 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA 및 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자 (DNA 또는 mRNA)를 포함하는 VEGF -A 유전자 교정용 조성물을 제공한다. 상기 VEGF -A 유전자 교정용 조성물은 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵산단백질을 포함하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 리보핵산단백질은 생체 또는 세포에 투여 전 미리 조립된 것일 수 있다.
본 명세서에서, 표적 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열이 위치하는 DNA 가닥)의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.
예컨대, crRNA 또는 sgRNA의 표적화 서열 '(Ncas9)l'는 상기한 서열번호 1 내지 4의 표적 서열과 동일한 서열을 갖는 것일 수 있다 (단, T를 U로 바꿈). 즉, crRNA 또는 sgRNA은 '(Ncas9)l'은 서열번호 9 내지 16에서 선택된 표적화 서열을 포함하는 것일 수 있다:
Vegfa-1: 5'-CUCCUGGAAGAUGUCCACCA-3' (서열번호 9);
Vegfa-2: 5'-AGCUCAUCUCUCCUAUGUGC-3' (서열번호 10);
Vegfa-3: 5'-GACCCUGGUGGACAUCUUCC-3' (서열번호 11);
Vegfa-4: 5'-ACUCCUGGAAGAUGUCCACC-3' (서열번호 12);
Vegfa - 5: 5'- CGCUUACCUUGGCAUGGUGG-3' (서열번호13);
Vegfa - 6: 5'- GACCGCUUACCUUGGCAUGG-3' (서열번호 14);
Vegfa - 7: 5'- CACGACCGCUUACCUUGGCA-3' (서열번호 15); 및
Vegfa - 8: 5'- GGUGCAGCCUGGGACCACUG-3' (서열번호 16).
예컨대, 상기 crRNA 또는 sgRNA는 표적화 서열로서 서열번호 9 또는 서열번호 10을 포함할 수 있다.
일 예에서, 기존에 RNA를 생체 내 또는 세포 내 전달 시 생기는 세포 생존률 (cell viability) 감소의 문제를 해결하기 위하여, 변형된 형태의 RNA를 사용할 수 있다. 예컨대, RNA의 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않도록 변형된 RNA (예컨대, 5' 말단에 트리포스페이트 또는 다이포스페이트를 포함하지 않음)를 가이드 RNA로 사용할 수 있다. 또는, sgRNA (예컨대, 화학적으로 합성된 sgRNA)는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 하나 이상 (예컨대, 1 내지 5개, 또는 2 내지 4개)의 변형된 리보핵산을 포함할 수 있으며, 이때 변형은 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 및/또는 리보오스의 2' 위치의 변형 (예컨대, 2'-acetylation, 2' methylation, 또는 기타 변형) 등을 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 변형된 sgRNA는 5' 말단 및 3' 말단 각각에 위치하는 3개의 뉴클레오타이드에 있는 리보오스의 2'-O 위치가 메틸레이션 (메틸기 첨가) 및/또는 포스포로티오에이트 백본(phosphorothioate backbone)으로의 변형 등을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 서열번호 1 내지 4 중에서 선택된 표적 서열을 포함하는 가이드 RNA가 제공된다.
상기 방법에서, 상기 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 세포 내로의 형질도입은 미리 조립된 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 복합체 (리보핵산단백질)를 통상적인 방법 (예컨대, 전기천공, 리포펙션 등)으로 직접 면역세포에 도입하거나, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자와 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA 또는 mRNA) (또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 염기서열 상동성을 갖는 유전자)를 하나의 벡터 또는 각각 별개의 벡터 (예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 등)에 포함된 상태로 세포에 도입하거나, mRNA delivery를 통하여 수행할 수 있다.
일 예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련(adenoassociated) 바이러스 (AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스(rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이(Sendai), 알파바이러스(alphavirus) 및 피코르나바이러스(picornavirus)와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 폭스바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 Cas9 단백질, 가이드 RNA, 이를 포함하는 리보핵산단백질, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법들 중에서 선택된 적절한 방법을 통하여 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
상기 Cas9 단백질, 가이드 RNA, 이를 포함하는 리보핵산단백질의 핵내 전달을 위하여, 상기 Cas9 단백질 및/또는 가이드 RNA는 통상적으로 사용 가능한 핵 위치호 신호 (nuclear localization signal; NLS)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 VEGF -A 유전자 특이적 리보핵산단백질에 있어서, Cas9 단백질은 미생물에서 분리된 것, 또는 재조합적 방법 또는 화학적 합성 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있으며, 상기 가이드 RNA는 재조합적 또는 화학적으로 생산된 것일 수 있다.
Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자((DNA 또는 mRNA)) 및 VEGF -A 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 VEGF -A 유전자 특이적 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제, 또는 VEGF -A 유전자 특이적 리보핵산단백질은 다양한 투여 경로를 통하여 생체 내에 투여될 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 안질환 (VEGF -A 유전자 과발현과 관련된 안질환) 병변부위에 국소 투여 또는 망막하 투여 등의 경로로 안구에 투여될 수 있다.
상기 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제 또는 VEGF -A 유전자 특이적 리보핵산단백질의 투여 대상은 VEGF -A 유전자 과발현과 관련된 안질환을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 모든 포유 동물, 예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등에서 선택된 동물, 이로부터 분리된 세포 (예컨대, 망막 색소 상피세포 (RPE), 망막 색소 상피세포 (RPE)/맥락막/공막 복합체(RPE/choroid/scleral complex), 등) 또는 조직 (안구 조직), 또는 이의 배양물일 수 있다.
상기 VEGF -A 유전자를 불활성화시키는 제제 또는 VEGF -A 유전자 특이적 리보핵산단백질은 "약학적 유효량"으로 투여되거나 약학 조성물에 포함될 수 있다. "약학적 유효량"은 적용 부위에서 소망하는 효과, 즉 VEGF -A 유전자 교정 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 명세서에서 제안되는 VEGF -A 유전자 교정 기술은 높은 유전자 교정 효율뿐 아니라 매우 낮은 off-target effect를 나타냄으로써 효율적이면서도 안전하게 유전자 교정을 수행할 수 있고, 이를 통하여 VEGF -A 단백질 수준을 병리학적 역치 이하로 낮춤으로써, VEGF -A 과발현과 관련된 안질환의 장기적 또는 영구적인 치료를 가능하게 한다.
도 1a는 마우스 NIH3T3 세포와 인간 ARPE-19 세포의 Vegfa/VEGFA 유전자좌의 표적 부위 서열을 보여준다 (PAM 서열: 파란색); sgRNA 표적 서열: 청색).
도 1b는 NIH3T3 및 ARPE-19 세포에서 Vegfa-특이적 Cas9 RNP 또는 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드의 도입에 의하여 유도된 돌연변이를 T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 1c는 NIH3T3 및 ARPE-19 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP 또는 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드의 도입에 의하여 유도된 돌연변이(indel) 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 1d는 NIH3T3 및 ARPE-19 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP에 의하여 유도되는 대표적인 Vegfa/VEGFA 유전자좌에서의 돌연변이 DNA 서열을 보여준다.
도 1e는 confluent ARPE-19 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP의 도입에 의하여 유도되는 돌연변이 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 1f는 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP가 형질 감염된 confluent ARPE-19 세포에서의 VEGFA mRNA 수준을 보여주는 그래프이다.
도 1g는 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP가 형질 감염된 confluent ARPE-19 세포에서의 VEGFA 단백질 수준을 보여주는 그래프이다.
도 1h는 4종의 sgRNA (Vegfa-1 sgRNA, Vegfa-2 sgRNA, Vegfa-3 sgRNA, 및 Vegfa-4 sgRNA)를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP 또는 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드의 도입에 의해 유발되는 NIH3T3 세포에서의 돌연변이 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 2a는 Cy3 표지된 Cas9 RNP (Cy3 표지된 Cas9 및 Vegfa-1 sgRNA 복합체) 또는 Cy3 표지된 Cas9 단독 (대조군)으로 형질 감염시키고 24시간 후에 NIH3T3 세포를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2b는 Cy3 표지된 Cas9 RNP 또는 Cy3 표지된 Cas9 단독으로 형질 감염 24시간 후의 총 DAPI 양성 핵 개수에 대한 Cy3 양성 핵 개수의 비율 (100*[Cy3 양성 핵 개수]/[총 DAPI 양성 핵 개수])을 보여주는 그래프이다.
도 2c는 형질 감염 24시간 후에 NIH3T3 세포에서 유도된 돌연변이를 T7E1 assay로 분석한 결과를 보여준다.
도 2d는 형질 감염 24시간 후에 NIH3T3 세포에서 유도된 돌연변이 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 2e는 Cy3 표지된 Cas9 RNP를 마우스 눈에 주사 한 후 3 일째에 RPE flat-mount를 형광 현미경으로 관찰한 형광 이미지이다.
도 2f는 Cy3 표지된 Cas9 RNP주사 후 3일째에 망막 색소 상피세포 (RPE)/맥락막/공막 복합체(RPE/choroid/scleral complex)로부터 분리된 유전체 DNA에서 생체 내에서 유도된 indels의 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 2g는 주사 후 24시간 및 72시간째에 RPE/맥락막/공막 복합체에서의 Cas9 단백질의 수준을 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 2h는 망막 색소 상피세포 (RPE)/맥락막/공막 복합체(RPE/choroid/scleral complex) 중의 망막 색소 상피세포 (RPE)의 분포를 형광 현미경으로 관찰한 형광 이미지이다.
도 2i는 주사 후 24시간 및 72시간째에 RPE/맥락막/공막 복합체에서의 Cas9 단백질의 수준을 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 3a는 실시예 3의 시험 과정을 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 3b는 주사 후 7 일째, Rosa26-특이성 Cas9 RNP (대조군) 또는 Vegfa- 특이성 Cas9 RNP를 주사한 C57BL/6J 마우스에서 isolectin B4(IB4)로 염색된 laser-induced CNV를 가시화한 사진이다.
도 3c는 Vegfa- 특이성 Cas9 RNP를 주사한 C57BL/6J 마우스에서의 CNV 면적을 Rosa26-특이성 Cas9 RNP 주사한 대조군의 CNV 면적과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3d는 CNV 영역에서의 Vegfa 단백질 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 3e는 RPE 복합체 내의 Vegfa 표적 부위에서의 Indel 빈도(%)를 보여주는 그래프이다.
도 3f는 RPE 복합체 내의 Rosa26 표적 부위에서의 Indel 빈도(%)를 보여주는 그래프이다.
도 3g는 hematoxylin & eosin 염색으로 시료 단면(cross section)의 Laser-induced CNV 구조를 가시화한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3h는 targeted deep sequencing를 통한 돌연변이 분석에 사용하기 위한 CNV 시료를 보여준다.
도 3i는 레이저 처리 후 7일째의 Laser-induced CNV를 가시화한 사진이다.
도 4a는 in vitro 절단 부위를 보여주는 Genome-wide Circos plot이다.
도 4b는 41 개의 Digenome-capture site (표 5 참조) 및 On-target 서열을 포함한 42개 서열의 Sequence logo를 보여준다.
도 4c는 인간 ARPE-19 세포에서 확인된 off-target 부위 및 indel 빈도를 보여준다.
도 5는 마우스 RPE에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP에 의하여 유도되는 돌연변이 DNA 서열을 나타낸 것으로, a는 RNP 주사 3일 후에 RPE에서 Vegfa-특이적 Cas9 RNP에 의하여 유도되는 대표적인 돌연변이 DNA 서열을 보여주고, b는 RNP 주사 7일 후에 레이저 유도 맥락막 혈관 신생 (laser-induced choroidal neovascularization (CNV))을 갖는 RPE에서의 돌연변이 DNA 서열을 보여준다.
도 6은 마우스 RPE의 20개의 잠재적 off-target 부위에서의 indel 빈도(%)를 보여준다.
도 7a는 Vegfa-specific Cas9 RNP 주입 7일 후의 Vegfa -specific Cas9 RNP 주입된 마우스 및 Vegfa-specific Cas9 RNP가 주입되지 않은 정상 대조군 마우스의 망막으로부터 얻은 형광 단면 이미지이다.
도 7b는 opsin positive 영역(%)을 보여주는 그래프이다.
도 8은 pET28-NLS-Cas9 벡터의 개열지도이다.
도 9는 pRG2 벡터의 개열지도이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[ 참고예 ]
1. Cas9 RNP의 제조
정제된 Cas9 단백질은 ToolGen Inc., South Korea에서 구입하여 준비하였다. sgRNA는 T7 폴리머라제 (New England Biolabs)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 in vitro 전사에 의해 생성하였다. 간략하게, 두 개의 상보적인 올리고뉴클레오티드 (표 1 참조)을 annealing 및 extension하여 sgRNA의 템플릿을 생성하였다.
In vitro transcription templates encoding sgRNAs
sgRNA name RGEN Target (5' to 3')
Vegfa-1 (Forward) GAAATTAATACGACTCACTATAGCTCCTGGAAGATGTCCACCA GTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAG (서열번호 17)
Vegfa-2 (Forward) GAAATTAATACGACTCACTATAGAGCTCATCTCTCCTATGTGC GTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAG (서열번호 18)
Vegfa-3 (Forward) GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCCTGGTGGACATCTTCC GTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAG (서열번호 19)
Vegfa-4 (Forward) GAAATTAATACGACTCACTATAGACTCCTGGAAGATGTCCACC GTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAG (서열번호 20)
Rosa26 (Forward) GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGGTCCTCAGAAGCCAGG GTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAG (서열번호 21)
Universal (Reverse) AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (서열번호 22)
(표적 서열: 밑줄로 표시; crRNA의 필수 부분: 굵은 글씨로 표시;
뉴클레오타이드 링커: 이탤릭체로 표시)
상기 생성된 sgRNA 템플릿을 T7 RNA 폴리머라제와 함께 NTPs (Jena bioscience) 및 RNase 저해제 (New England Biolabs)를 포함하는 반응 완충액 (40 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2 mM spermidine, 1 mM DTT, pH7.9)에 넣고 37℃에서 16시간 동안 배양하여 전사시켰다. 전사된 sgRNA를 37℃에서 30분 동안 DNase I (New England Biolabs)와 함께 배양하였다. sgRNA를 RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하고, Nano drop (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량화하였다. 정제된 sgRNAs (65㎍)를 CIP (Calf　intestinal; 1000 units; Alkaline Phosphatase, New England Biolabs)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하여 3-인산기를 제거하였다. 상기 얻어진 sgRNA를 RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)를 사용하여 다시 정제하고 Nano drop (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량화하였다.
모든 Cas9 단백질 및 sgRNA stock을 사용하여 세포 생존률 및 유전체 교정 (indel) 효율을 시험하여, 고효율의 Cas9 단백질 및 sgRNA stock을 선택하여 in vivo eye injection에 사용하였다.
2. Cas9 단백질 정제
pET28-NLS-Cas9 벡터 (도 8; Cas9: Streptococcus pyogenes 유래임 (서열번호 358))를 대장균 균주 BL21 (DE3)으로 형질 전환시킨 후, 0.5 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 처리하여 18℃에서 12시간 동안 Cas9 단백질 발현을 유도하였다. 상기 대장균 세포를 초음파 처리하여 용해시키고, 20,000g에서 30분 동안 원심분리 한 후, 용해성 용해액(soluble lysate)를 취하여 Ni-NTA 비드 (Qiagen)와 혼합하고, Cy3 염료 (GE Healthcare)를 1:10 비율 (Cas9 단백질: Cy3 염료 분자)로 첨가하였다. 상기 혼합물을 암조건 및 4℃ 조건에서 밤새(12 시간 이상) 배양하였다. 용리 완충액 (elution buffer; 50 mM Tris-HCl [pH 7.6], 150-500 mM NaCl, 10-25%(w/v) 글리세롤, 0.2 M 이미다졸)을 사용하여 Cy3-표지 Cas9를 용출시키고, 투석용 완충액(dialyzing buffer; 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 10%(w/v) 글리세롤)을 사용하여 투석하였다. 정제된 Cy3-표지 Cas9 단백질을 Ultracel 100K cellulose column (Millipore)을 사용하여 농축시켰다. Cy3-표지 Cas9 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해 측정하였다. Cy3 표지 효율은 Cas9 단백질 (280 nm) 및 접합된 Cy3 염료 분자의 흡수 스펙트럼을 비교하여 측정하였다.
3. 세포 배양 및 형질 감염
마우스 NIH3T3 (ATCC® CRL-1658 ™) 및 ARPE-19 (인간 망막 색소 상피세포; ATCC® CRL-2302 ™) 세포주를 10%(v/v) BCS 또는 FBS가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 5% CO2, 37℃, 및 습윤 대기 조건 하에서 배양하였다 (NIH3T3 및 ARPE-19 세포는 mycoplasma 오염 여부가 시험되지 않음). 형질 감염 하루 전에, NIH3T3 및 ARPE-19 세포를 24-웰플레이트에 2x104세포/웰의 양으로 접종하였다. 각 웰에는 항생제 무함유 성장배지 250㎕가 첨가되어 있다.
플라스미드 전달의 경우, Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라, Cas9 (1㎍; Streptococcus pyogenes 유래; 코딩 서열 (4107bp): 서열번호 358) 발현 플라스미드 (pET vector (Addgene) 사용) 및 sgRNA (1㎍; 실시예 1) 발현 플라스미드 (pRG2 vector (도 9 참조) 사용)로 상기 24-웰 플레이트의 세포를 형질 감염시켰다.
RNP 전달의 경우, Cas9 단백질 (4㎍; 실시예 2)을 실온에서 5분 동안 sgRNA (2.25㎍; 실시예 1)와 함께 배양 한 후, 50㎕의 Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)과 1㎕의 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific)을 첨가하였다. 10분 후, 상기 RNP 혼합물을 상기 24-웰 플레이트의 세포에 첨가 하여 세포를 형질감염시켰다. 형질 감염 48 시간 후, 세포를 수확하고 T7E1 분석, targeted deep sequencing, 및 qPCR을 수행하였.
confluent RPE (human retinal pigment epithelial)에서 VEGF-A를 발현시키는 경우, 상기 준비된 ARPE-19 세포는 confluency에 도달한 후 1%(v/v) FBS가 함유된 DMEM/F12에서 유지시켜 시험을 위한 polarized epithelial layer가 형성되도록 하였다. ARPE-19 세포를 12-웰 플레이트에 넣고 Cas9 단백질 8㎍, sgRNA 4.5㎍ 및 lipofectamine 2000 3㎕로 형질 감염시켰다. 형질감염 2일 후, 형질 감염 성장 배지 (DMEM + 1%(v/v) FBS)를 신선한 무혈청 배지 0.5 ml으로 바꾸어주었다. 16 시간 후, 세포 및 배지를 수확하고 targeted deep sequencing, qPCR, 및 ELISA를 수행하였다.
4. Cy3 - 표지 Cas9 RNP의 이미징 및 카운팅
형질 감염 후 1일째에, 세포를 실온에서 10분간 4%(w/v) PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 실온에서 15분 동안 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1㎍/ml, Sigma Aldrich)로 염색하였다. 상기 세포를 x630 배율로 공초점 현미경 (LSM510, Carl Zeiss)으로 시각화하였다. 스캐닝 매개 변수는 다음과 같이 하였다: scaling (x = 0.14㎛/pixel, y = 0.14㎛/pixel, z = 1㎛/pixel), dimensions (x=1024, y=1024, z=6, channels: 3, 12-bit) (with objective C-Apochromat 63x/1.20W Korr UV-VIS-IR). ZEN 2 소프트웨어 (검정색 판, Ver 10.0, Carl Zeiss)를 사용하여 Cy3 양성 핵(Cy3 positive nuclei)을 계수하였다. Cy3 양성 핵의 빈도(frequency)를 정량화하기 위해, 우리는 배율 630배에서 관찰되는 시야 범위에서 Cy3 염색된 핵을 갖는 세포의 수와 전체 세포수를 세고, 4 개 시야에 걸쳐서 관찰되는 Cy3 양성 핵의 평균 백분율을 계산 하였다 (n = 3).
5. T7E1 Assay
DNeasy Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포 및 조직으로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. PCR을 사용하여 표적 부위를 증폭시킨 후, 생성물을 열 순환기를 사용하여 변성시키고 어닐링시켰다. 이 때 사용 된 프라이머를 아래의 표 2에 정리하였다:
T7E1 assay에 사용된 프라이머.
1 st PCR 2 nd PCR
Target Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3') 		Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3')
Vegfa-1 (mouse) CAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 23) AGATGGTCAAATCGTGGAGAG (서열번호 24) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 25) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGGGCTTCATCGTTACA (서열번호 26)
Vegfa-1 (human) CATCGTGTGATCTCTGGAATGAA (서열번호 27) CCACCTGTTCCCAAAGTGTTA (서열번호 28) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTA (서열번호 29) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAGATGCCCACCTGCAT (서열번호 30)
어닐링 된 PCR 산물을 T7 엔도뉴클레아제 I (ToolGen, Inc.)과 함께 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하고, 아가로오스 겔 전기 영동으로 분석하였다.
6. Targeted deep sequencing
Phusion 폴리머라제 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 유전체 DNA로부터 온-타겟(on-target) 및 잠재적 오프-타겟(off-target) 영역을 증폭시켰다. Illumina MiSeq(LAS Inc. 한국)을 사용하여 PCR 증폭물의 쌍을 이룬 서열의 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머를 표 3내지 표 5에 정리하였다:
targeted deep sequencing에 사용된 프라이머
1 st PCR 2 nd PCR
Target Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3') 		Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3')
Vegfa-1 (mouse) CAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 23) AGATGGTCAAATCGTGGAGAG (서열번호 24) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 25) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGGGCTTCATCGTTACA (서열번호 26)
Vegfa-2 (mouse) ACCTATCCCTGCTCAGTAGAA (서열번호 31) CCCAAGAGAGGAAGCAAGAA (서열번호 32) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCTGCTCCCTCCCTCTAC (서열번호 33) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCCATCACCATCACCACCACCAC (서열번호 34)
Vegfa-3 (mouse) CAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 23) AGATGGTCAAATCGTGGAGAG (서열번호 24) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 25) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGGGCTTCATCGTTACA (서열번호 26)
Vegfa-4 (mouse) CAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 23) AGATGGTCAAATCGTGGAGAG (서열번호 24) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAATCTGGGTGGCGATAGA (서열번호 25) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGGGCTTCATCGTTACA (서열번호 26)
Vegfa-1 (human) CATCGTGTGATCTCTGGAATGAA (서열번호 27) CCACCTGTTCCCAAAGTGTTA (서열번호 28) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTA (서열번호 29) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAGATGCCCACCTGCAT (서열번호 30)
Rosa26
(mouse)		 CCAAAGTCGCTCTGAGTTGT (서열번호 35) TCGGGTGAGCATGTCTTTAATC (서열번호 36) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAAAGTCGCTCTGAGTTGT (서열번호 37) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTTAAGCCTGCCCAGAAGA (서열번호 38)
potential off-target 부위에서의 targeted deep sequencing에 사용된 프라이머
1 st PCR 2 nd PCR
No. Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3') 		Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3')
OT1 TCTGTCTGTCTCCAGACATTTG (서열번호 39) GTCCTGCTTCTATCCTGCTTTA (서열번호 40) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGATCAGCTGACTTCCAGTTC (서열번호 41) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCACAACTCAAGTCCCATTAC (서열번호 42)
OT2 GACGTGAGAGTGAGCAGTTTAT (서열번호 43) ACAGCACCCAGATTGTCTTC (서열번호 44) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTTGTGTCCTTTGATGCTCT (서열번호 45) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGGTCTGCACCATGAATCC (서열번호 46)
OT3 GCTGTGCTCAAGACCAACAA (서열번호 47) CCGGTTCTGTACTGGTGTCT (서열번호 48) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGCCTACCTCCACCTTCT (서열번호 49) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGATGCTGCCCTACATGAAC (서열번호 50)
OT4 GTAGGCTCAACAGCTCTTTCT (서열번호 51) CATAGTGTGAGTGGTACTGGTG (서열번호 52) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTGAGCTTCCTCTGTCCTAAT (서열번호 53) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCACTGCTTCTCCTCTCTAT (서열번호 54)
OT5 GCCCAAAGTAGCAGGTGATTA (서열번호 55) CTCAGGCTGTAACTGACGATATG (서열번호 56) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACAGGATGCAAGTCCACATC (서열번호 57) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATTCTTCACAGGGCCATCA (서열번호 58)
OT6 AGAAGCTAAGGAGCCCAATTT (서열번호 59) TACTTTGCCAAGCCCATGT (서열번호 60) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTTCTCTCTTGGCTGTAA (서열번호 61) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAACCTACTCTCATCGTGCTAC (서열번호 62)
OT7 GAGGAGCCCAAGTATATCACAG (서열번호 63) GGTCACCATAGCTACAAGAGAG (서열번호 64) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGGCTCCATTAGCCTCTTC (서열번호 65) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTCATGGTGCACATCATTC (서열번호 66)
OT8 CCCTGCAGCATTCTCTGTAT (서열번호 67) GACCCAGTGTATTGTGGGTAG (서열번호 68) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGACAAGCCTGACAGTTCATC (서열번호 69) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTGATGGTGAGCAGAAA (서열번호 70)
OT9 CTGGAACCAGAGTCATAGATAGTTG (서열번호 71) TCTGAAGCACACACCAGAAG (서열번호 72) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAGATACCAAAGCAGGTGTTC (서열번호 73) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAAGCAGTTCAGAGGTCTATGT (서열번호 74)
OT10 CTAGAAGAAGGCAGAGGGAGTA (서열번호 75) AGGAGGGACAGACTGGTATAAA (서열번호 76) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACAGCGAGCCAGAATACA (서열번호 77) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTGCTACCTGATCTACTCAAC (서열번호 78)
OT11 GTGTGAATGGAGGCGAAATTG (서열번호 79) GCAGCTGAGAAGCTAAGGAATA (서열번호 80) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTACATAAAGTCCCTGCAACCTG (서열번호 81) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTACCAGGACTCTAGTGAGTGG (서열번호 82)
OT12 TAGTACCTGCCCACCAGATAG (서열번호 83) GGGCACTTCTTCAATGCTTTAC (서열번호 84) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTCCTGACCAGTGTTCTGTAAT (서열번호 85) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAACCTCGAGTAGGAAGGGA (서열번호 86)
OT13 CCCACTGAGGTTGTATCAGTTC (서열번호 87) GATCCAATGGCTTTGCACATAC (서열번호 88) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAAGAAGACCAGTGAAGGACTG (서열번호 89) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTCTGATGACCCGAGTTCTA (서열번호 90)
OT14 TCTATATAGGCAGGTTATGAAAGCA (서열번호 91) AACCAGGACATATGTGGTAGAAA (서열번호 92) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATGGCCTTCTGGGAAAGT (서열번호 93) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAGTCTGAGAGCTTGTAGTG (서열번호 94)
OT15 CACAGACAGTCGCCTTCAAT (서열번호 95) TGGAAGCCTTAACAGGTCAATAA (서열번호 96) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTTCAATGAATCTCCCTTTG (서열번호 97) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTTCATTGGCAGCACTTAC (서열번호 98)
OT16 GGAAGATCAGCAGTCTCAACTAA (서열번호 99) CACATTACCTCAAAGCTGTTTCTT (서열번호 100) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTCAGTGACAGAGACTCACCTA (서열번호 101) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGTGACATGGCTGTATCTT (서열번호 102)
OT17 CTTCCACCGGGTATTTCCTATC (서열번호 103) TCCCAGAGAGAGTTAGGTTAAGA (서열번호 104) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGATGAATGAGCACCAGAGAAA (서열번호 105) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGACAAGAAAGGGCAGTAAGAA (서열번호 106)
OT18 CCTGGGAACAACAGCCATAA (서열번호 107) GAACATTGGGTAGGTGAGGAAG (서열번호 108) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTCTGTTGAGGTGGGATTTG (서열번호 109) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTACTGCTTGAGGAGCTTGT (서열번호 110)
OT19 TGAGCCAGTCCATTCATTCC (서열번호 111) TCCCTCCTGTTCTTCTCTTCT (서열번호 112) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGGGACAAGTGTACAGAGAAC (서열번호 113) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTTCACCTACAGAGAAGAGA (서열번호 114)
OT20 CCCACAAACCAAGAACAACAA (서열번호 115) CAGTGTTAAGTGCCTCTGTAGAT (서열번호 116) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGAAGGGCGGCATCAG (서열번호 117) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTAGTCTCTGGTTTCCACCT (서열번호 118)
Digenome-seq에 의하여 포획된 potential off-target 부위에서의 targeted deep sequencing에 사용된 프라이머
1 st PCR 2 nd PCR
No. Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3') 		Forward
(5' to 3') 		Reverse
(5' to 3')
OT1 ATGGAGCTTGCATTTTAACA (서열번호 119) CTTTTTTCCCGTGATCCTCA (서열번호 120) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGGAGCTTGCATTTTAACA (서열번호 121) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGGCTTATTTCATCATTTAG (서열번호 122)
OT2 CAAACTGTCAGTGAGCCAATAC (서열번호 123) GAAGTGATCCTCCTCTCAATACC (서열번호 124) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGGAAGTCAAGCAGGAAGA (서열번호 125) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCCATCCATTCATAACTTTGGA (서열번호 126)
OT3 GTCCAATACTCTAAGCCTCAGTT (서열번호 127) ACCAGCACCACACTATCTATTT (서열번호 128) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATACCTAGTTTGTAGGGTTGTT (서열번호 129) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCACCACACTATCTATTTCTGTTAT (서열번호 130)
OT4 ACACTATGATCTTTCCCTGCAA (서열번호 131) CAGAAACCCTGAAGTCTTGAATTG (서열번호 132) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTTCCCTGCAAAGAAGTAAGA (서열번호 133) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTCATTGTCCAGAACTGTGT (서열번호 134)
OT5 GGGCAGAAAGGACAGAAACT (서열번호 135) GGAGAAACTGAAACCAGGAGAA (서열번호 136) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTAACAGCACCTTGGTCAT (서열번호 137) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAAACCAGGAGAAGTGTAGTC (서열번호 138)
OT6 AGTAGGTGGGAGGGTTCTTAT (서열번호 139) CACCATCTCTGTGTCTCATCTG (서열번호 140) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGAAACAGGCATCTGGAGAAC (서열번호 141) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCAGCATAGTCTTGCTCGTC (서열번호 142)
OT7 TAAGCCTGGCCTGTCTCTT (서열번호 143) AGAGCAGGACGTGGTGAG (서열번호 144) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTCTTCCTGGGACCCT (서열번호 145) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATACCTAGGAATGCAGAACAAG (서열번호 146)
OT8 GGGATTGCACTTAGGTTCTTCT (서열번호 147) CTATGCGGTCTCTTGTGCTAAT (서열번호 148) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTCAGGTGGGTAATGATTTCTG (서열번호 149) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTAATCTGCCTTATGTAATGGGTTCT (서열번호 150)
OT9 GACTCCTCTGTGGAAAGAGC (서열번호 151) AGGACTCCAGTGCTGAGCAC (서열번호 152) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCTCTGTGGAAAGAGCCT (서열번호 153) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACCGTCTCTCCTTTGTGC (서열번호 154)
OT10 AGGGACCGTATCAGATATTGTTAATC (서열번호 155) TCCAATGTATTGCAGCCATCT (서열번호 156) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATCAATCCTTGTGCAGCTTAATG (서열번호 157) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCCATCTTGCCCTTTGA (서열번호 158)
OT11 CATTGAGGAACCTCACCTTCTAT (서열번호 159) ATGAATGTCTTGGTACTGTCCTC (서열번호 160) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAAGAGGTGTATTAGGCCATT (서열번호 161) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTCTTCTCTCTTGCTTCATCTC (서열번호 162)
OT12 CAAAGCAGCTCCTCTTCCTC (서열번호 163) CAGTGCCTTTCAGTGAACCT (서열번호 164) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTGGGTATAGAGACCATGACA (서열번호 165) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACAGCCTGAGATAATGATAGAGAG (서열번호 166)
OT13 GGAGTCGTACCCTGGTTTATTT (서열번호 167) GAAGCATTGTTCCACCTTAACC (서열번호 168) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGATAGAAGATTAGGCAGAGTATG (서열번호 169) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCATGTTTGAAAGGATGAGC (서열번호 170)
OT14 CTCTCAGACCCTACTCACCTAT (서열번호 171) CACTGGAAGTACCTGTGGAAG (서열번호 172) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGACCCTACTCACCTATATCCTTT (서열번호 173) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTACCTGTGGAAGCAGGAGA (서열번호 174)
OT15 GGCCATCCTCAAAGACATGAA (서열번호 175) TCTCAAACTCCCGACCTCA (서열번호 176) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCATTTCTATTTATTCATCTCCCACAG (서열번호 177) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGGATTACAGGCGTGAG (서열번호 178)
OT16 AGAAGTTTCAGGATGACAGATCC (서열번호 179) CAATCCACATCTGCGTGTTTC (서열번호 180) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGAAGTTTCAGGATGACAGATCC (서열번호 181) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAATCCACATCTGCGTGTTTC (서열번호 182)
OT17 TGACTCATTGTGAATGCCTTTATTC (서열번호 183) GAGTTGGGTTCTCTGCAACT (서열번호 184) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATAGAGTCTAGATTAGCAGTAGAGC (서열번호 185) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGTCTTATCTGATACATGGATACC (서열번호 186)
OT18 TGCAGCTCTGGACAGGAA (서열번호 187) GGTGGGTTTCACCATCCTC (서열번호 188) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGTGATTCCCTCTGTGG (서열번호 189) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATCCTCCTGCCCTCT (서열번호 190)
OT19 GACAGCACTTAGGGATGATGAA (서열번호 191) GATGGAGCTGCCCAAGAAA (서열번호 192) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGATGATGAATGGCTGGAT (서열번호 193) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTCTCCATGTAGGTGCCTT (서열번호 194)
OT20 CCTGAGAACAAGGAGTGTCAAG (서열번호 195) CCATGGAATGCCCAGATAGTT (서열번호 196) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTGATATCCCAGCTTAAGCAATC (서열번호 197) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTAAACATCATTTCTGGCACGTC (서열번호 198)
OT21 AGCTATTGCTGTCAATCTCTTACT (서열번호 199) TACCCAGTCTCAGGTAGTTCTT (서열번호 200) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGTCAATCTCTTACTGTAACTA (서열번호 201) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTAGCAATGCGAGAACAGACTAA (서열번호 202)
OT22 TGCCACACATCCCATCATATC (서열번호 203) CAGCAGACACAGACTCACAA (서열번호 204) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAACATGAAATGCCAGAGTCAAA (서열번호 205) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCATTCAAGTTGCAATCACTATC (서열번호 206)
OT23 TCCTGAAAGAAGGGATAAGGTAAG (서열번호 207) TGAGGATGGGTTTCGGTAAAT (서열번호 208) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATAAGGTAAGCTCAGCCTGTC (서열번호 209) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTTCAACATGAAGGCAAGGAG (서열번호 210)
OT24 CAAGAAGGGTGTTAGGTTATGAAAG (서열번호 211) ACAGTCAACCCTTAAGGAAGAG (서열번호 212) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGTGTTAGGTTATGAAAGTTTAAGG (서열번호 213) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGGAAGAGTTGTCTTCACTCG (서열번호 214)
OT25 CTTTCACAGCCAGTCACAAATAAA (서열번호 215) CTCACACTCTAGGAAACAGATGATAG (서열번호 216) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAATCCACTCAGACTACAGAGAAA (서열번호 217) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGACAGGAGTGTTCTCCAAATC (서열번호 218)
OT26 GTGAGCCAAGATCACACCAT (서열번호 219) CTCTCAGCAAGAAGGCAGATT (서열번호 220) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGATCACACCATTGCACTCC (서열번호 221) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAGATCAGTGTCTGCTAAA (서열번호 222)
OT27 GGACACGCTGAGTCAAAGTT (서열번호 223) CCTTTCCTTCGTGCTGATTGA (서열번호 224) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAACCACGTCGACAATACA (서열번호 225) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGGAAGTGACAAGCAAGTTA (서열번호 226)
OT28 CCCAACAATTCCTTCTTTGAGC (서열번호 227) TCTGCTATTAGAGGAGGCTAGAA (서열번호 228) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAATTCCTTCTTTGAGCTCACTAT (서열번호 229) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGGCTAGAACAACCTTGGA (서열번호 230)
OT29 GGGCAAATCCATAACCCAGAATA (서열번호 231) AGGCGATGCATGAGCTTAAA (서열번호 232) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGCAAATCCATAACCCAGA (서열번호 233) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTAGCTAATCTGGCTACCATCAC (서열번호 234)
OT30 ATTGGCTGGCACACAGTAG (서열번호 235) CCCAGGATCTAGCAAACATTCA (서열번호 236) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGAATGAATGAAGGAAAGAATGGG (서열번호 237) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAAACATTCATCTTTCGAGCTA (서열번호 238)
OT31 CACTTCTCGCCTTTGACCTT (서열번호 239) TGGCTGTGCTCACTTTACTG (서열번호 240) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGAGGAGGAAACTGGAGCTTA (서열번호 241) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTTTACTGCCACCAGTGC (서열번호 242)
OT32 ATCTTCCACAGGTGCAAATCT (서열번호 243) TTGCCTATGGCTGCCTTG (서열번호 244) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGGTCATTCTCTTCCGTCAAA (서열번호 245) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACAGTATGGGCCTGAAAAG (서열번호 246)
OT33 CATGTAACCACGACTACCTCAA (서열번호 247) CCATGGCTTGCAGCAATTT (서열번호 248) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTAACCACGACTACCTCAAGATATAA (서열번호 249) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACACAGACGTACTGTTAAGGA (서열번호 250)
OT34 CTTAGAGGAAAGAGAACTGGGATTAT (서열번호 251) AGTGTGGCTGATTATGGTGATTA (서열번호 252) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAAGAGTAGCCTAACCTTTACAA (서열번호 253) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACGTAAATTGCACCTGTCAC (서열번호 254)
OT35 TTTCTCTGCCATTCTTCCTCTG (서열번호 255) GAATGAAGACACGAGGCATTTG (서열번호 256) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTAGCCCATGTTGCTTCC (서열번호 257) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCAGAATGTACCTTGCACTTT (서열번호 258)
OT36 TGCTGTCTTTAGTTCCTTCATT (서열번호 259) TTAACCCAGCATCAGCTCTC (서열번호 260) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGTCTTTAGTTCCTTCATT (서열번호 261) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTAACCCAGCATCAGCTCTC (서열번호 262)
OT37 TTTCCAGAAGAGCCGACAAG (서열번호 263) CCAACAACCACCACGACTAA (서열번호 264) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGCCCTTCTGCTTTGAG (서열번호 265) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTCTCCCATGAAGGCTGTA (서열번호 266)
OT38 AAAGTACATAGAGGACGTGCATAG (서열번호 267) AGTTCACCACCACCACAAG (서열번호 268) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTGCAAATACTACGCCATTTC (서열번호 269) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAAGTTTGCACTTGCTTTCA (서열번호 270)
OT39 CACCTGGACCACCAGAAA (서열번호 271) GCTGTTTGCAAATGCCTCA (서열번호 272) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACCTGGACCACCAGAAA (서열번호 273) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCCATCTCTGCAGACCTTA (서열번호 274)
OT40 CTGATTTCCTGAGTTTCTCCCTAA (서열번호 275) AAGTGTGGGCTGTGCATAA (서열번호 276) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGTGAAGGGATTTCAAACTTTCC (서열번호 277) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGATCAAGGCTAACGTCATCA (서열번호 278)
OT41 CATCTCCTGCTGTGTCATCTT (서열번호 279) CCAGTCTCGGGTATGTCTTTATT (서열번호 280) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACTGACTTCCATCTTCCTCAC (서열번호 281) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGACTAATACATCCGGTCTCATC (서열번호 282)
PAM 서열의 상류 3bbp 부위 주위의 돌기는 Cas9 RNP 활성으로 인한 돌연변이로 간주되었다.
7. RNA 추출 및 qPCR
easy-spinTM Total RNA 추출 키트 (iNtRON, 한국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NIH3T3 및 ARPE-19 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. Superscript II (Enzynomics, South Korea)를 사용하여 250 ng의 RNA를 역전사시켰다. SYBR Green (KAPA) 및 다음의 프라이머를 사용하여 정량적 PCR (Quantitative PCR; qPCR)을 수행하였다:
mouse Vegfa: 5'-ACGTCAGAGAGCAACATCAC-3' (forward; 서열번호 283), 5'-CTGTCTTTCTTTGGTCTGCATTC-3' (reverse; 서열번호 284);
mouse Gapdh: 5'-GCTGAGTATGTCGTGGAGTCTA-3' (forward; 서열번호 285), 5'-GTGGTTCACACCCATCACAA-3' (reverse; 서열번호 286);
human VEGFA - 1: 5'-CGAGTACATCTTCAAGCCATCC-3' (forward; 서열번호 287), 5'-GGTGAGGTTTGATCCGCATAAT-3' (reverse; 서열번호 288);
human VEGFA - 2: 5'-AGAAGGAGGAGGGCAGAAT-3' (forward; 서열번호 289), 5'-CACAGGATGGCTTGAAGATGTA-3' (reverse; 서열번호 290);
human GAPDH: 5'-CAATGACCCCTTCATTGACC-3' (forward; 서열번호 291), 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' (reverse; 서열번호 292).
8. confluent ARPE -19 세포를 사용한 VEGFA ELISA
인간 VEGFA ELISA를 수행하기 위하여, Vegfa-특이적 Cas9 RNP 처리된 confluent ARPE-19 세포를 무혈청 (serum-free) 배지에서 16시간 동안 배양한 후, 상기 세포 배양물로부터 무혈청 상청액(supernatant)을 수집하고, 인간 VEGF Quantikine ELISA Kit (DVE00, R & D systems)를 사용하여 제조사 지침에 따라 분비된 VEGFA 단백질 수준을 측정하였다.
9. 유전체 DNA의 in vitro cleavage 및 Digenome sequencing
DNeasy Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 ARPE-19 세포 (ATCC)에서 유전체 DNA를 분리 하였다. Digenome sequencing을 위하여, 유전체 DNA를 다음의 방법으로 in vitro 절단하였다. 간단히 설명하면, 유전체 DNA (20㎍)를 Cas9 단백질 (16.7㎍) 및 sgRNA (12.5㎍)와 함께 반응 완충액 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100㎍/ml BAS, pH 7.9)에서 37℃ 조건으로 3시간 동안 인큐베이션하여 Cas9에 의한 유전체 DNA의 절단이 일어나도록 하였다. 절단된 유전체 DNA를 RNase A (50㎍/ml, Sigma Aldrich)로 37 ℃에서 30분간 처리하고, DNeasy Tissue Kit (Qiagen)로 정제하였다. Whole-genome sequencing과 Digenome sequencing은 관련 기술분야에 알려진 방법으로 수행하였다 (Kim, D., Kim, S., Kim, S., Park, J. & Kim, J. S. Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome research 26, 406-415 (2016)).
10. RNP가 망막하 주입된 동물의 준비
본 명세서의 실시예에서 사용된 모든 동물의 관리, 사용 및 치료는 Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee에서 정한 가이드라인 및 'ARVO statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research'을 엄격하게 준수하며 수행하였다. 성체 (6 주령) 수컷 SPF C57BL/6J 마우스를 연구에 사용하였다. 마우스는 12시간/12시간의 명/암 주기 하에 유지시켰다.
상기 준비된 마우스에 대하여 다음의 방법으로 RNP를 망막하 주입(Subretinal injections)하였다. 우선, Cas9 단백질 (8㎍), sgRNA (4.5㎍) 및 Lipofectamine 2000 (20%(v/v))으로 구성된 RNP를 2㎕ 또는 3㎕ (injection volume)가 되도록 혼합하였다. 상기 준비된 RNP (2㎕ 또는 3㎕)를 수술 현미경 (Leica Microsystems Ltd.) 하에서 33G 무딘 바늘 (World Precision Instruments Inc.)이 장착된 Nanofil 주사기를 사용하여 마우스의 망막 밑 공간(subretinal space)에 주사하였다. 망막 출혈이 있는 마우스 개체는 시험에서 제외시켰다.
11. 레이저 유도 맥락막 혈관신생 (Laser-induced choroidal neovascularization; CNV ) 동물 모델 제작
tiletamine과 zolazepam를 1:1의 중량비로 혼합한 혼합물을 2.25 mg/kg(체중)의 양으로 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. phenylephrine (0.5%(w/v))과 tropicamide (0.5%(w/v))가 포함된 점안액으로 마우스의 동공을 확장시켰다. Indirect head set delivery system (Iridex)과 레이저 시스템 (Ilooda)을 사용하여 레이저 광응고(Laser photocoagulation)를 수행하였다. 레이저 파장은 532 nm로 하였다. 레이저 매개 변수(Laser parameters)는 다음과 같다: 스팟 크기: 200㎛, 전력: 1W, 및 노출 시간: 100ms. 변형된 시신경 원반(optic disc) 주위의 12시 위치 (우안) 또는 6시 위치 (왼쪽 눈)에 레이저 화상(laser burn)을 유도시켰다. 유리체 출혈(vitreous hemorrhage)이 없는 거품을 발생시킨 레이저 화상만을 시험 대상에 포함시켰다. 레이저 화상의 사분면에서 RNP의 망막하 주입을 시행하였다. Cas9 RNP (sgRosa26 (Rosa26 targeting sgRNA 포함) 또는 sgVegfa(Vegfa targeting sgRNA 포함))는 각 마우스의 왼쪽 눈 또는 오른쪽 눈에 무작위로 할당하였다. Cas9 RNP의 망막하 주사에 의하여 물집(bleb)이 만들어졌다. 이 물집이 레이저 화상 부위와 중첩되었음을 확인하였다. 물집이 레이저 화상 부위와 중첩된 개체를 이후 시험에 사용하였다. 레이저 처리 7일 후, 안구를 실온에서 1시간 동안 4%(w/v) PFA(paraformaldehyde)에서 고정시켰다. RPE (retinal pigment epithelium) 복합체 (RPE/맥락막/공막)을 isolectin-B4 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. I21413, 1:100)으로 4℃에서 밤새 처리하여 면역 염색시켰다. 염색된 RPE 복합체를 형광현미경(Eclipse 90i, Nikon)에 편평하게 올려놓고 x40 배율로 관찰하였다. CNV 면적은 blind observer가 Image J 소프트웨어 (1.47v, NIH)를 사용하여 측정하였다.
12. 면역 형광 염색 및 이미징
RPE 복합체 중의 RPE 세포수를 고배율 필드 영역 (high power field area) (100㎛x 100㎛, n=8)에서 파라핀에 삽입된 단편 시료(cross section sample, 4㎛) 내의 DAPI 염색된 핵을 계수하여 산정하였다. 주사 후 7 일째에 얻은 단편 시료(n=4)를 anti-opsin 항체 (Millipore, AB5405, 1:1000)와 Alexa Fluor 488 항체 (Thermo Fisher Scientific, 1:500)로 면역염색하였다. opsin positive 영역은 blind observer가 Image J 소프트웨어 (1.47v, NIH)를 사용하여 측정하였다. 공초점현미경(LSM 710, Carl Zeiss)을 사용하여 RPE flat-mount에서의 Cy3-Cas9 단백질의 세포 내 분포를 이미징하였다. 스캐닝 파라미터는 다음과 같다: scaling (x=0.042㎛/pixel, y=0.042㎛/pixel, z=0.603㎛/pixel), dimensions (x=1024, y=1024, z=12, channels: 2, 8-bit), and zoom (5.0) with objective C-Apochromat 40x/1.20W Korr M27. ZEN 2 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리하였다.
13. CNV 영역 및 RPE 복합체로부터 유전체 DNA 추출
RNP를 주사하고 3 일째에 RPE 복합체로부터 유전체 DNA를 분리하고, CNV 면적 측정 후 RNP를 주사하고 7 일째 CNV 시료로부터 유전체 DNA를 분리하였으며, 유전체 DNA 분리는 NucleoSpin Tissue Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 수행하였다. RNP 효능을 평가하기 위해, 각 RPE 복합체를 4 사분면으로 분할하고, RNP가 주입된 사분면을 처리하여 유전체 DNA를 분리하였다. CNV 영역의 RPE 복합체에서의 indel 빈도를 평가하기 위해, RPE flat-mount를 이미징한 후 PBS로 세척하였다. 유전체 DNA는 다음의 두 개 영역으로부터 분리하였다: (i) CNV의 RNP 주입 영역을 포함하는 사분면 (주입 부위를 대표함); 및 (ii) 반대 사분면 (opposite quadrant; 비주입 부위를 대표함).
14. 마우스 VEGF -A ELISA
마우스 VEGF-A ELISA의 경우, 안구에 총 30 개의 레이저 화상을 유발시킨 후, RNP (3㎕)를 망막하 공간(subretinal space)에 주사하였다. 주사 후 3 일째, 전체 RPE 복합체를 망막으로부터 분리하고, 추가 분석을 위해 동결시켰다. RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% lgepal CA-630, 0.5% Na.deoxycholate, 0.1% SDS)으로 세포를 용해시키고, 마우스 VEGF Quantikine ELISA Kit (MMV00, R & D systems)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 VEGF-A 수준을 측정 하였다.
15. 웨스턴 블라팅 (Western blotting)
RNP의 생체내 전달 후 시간 경과에 따른 RNP 수준을 분석하기 위해, 주사 후 1 일 및 3 일에 얻은 RPE 복합체에 대하여 웨스턴 블라팅을 수행 하였다. 동량의 단백질 (20㎍)을 함유한 시료를 분석하였으며; Cas9와 액틴은 각각 항-HA 고친화성 항체 (Roche, 1:1000) 및 항-β-액틴 항체 (Sigma Aldrich, 1:1000)를 사용하여 검출하였다. ImageQuant LAS4000 (GE healthcare)를 사용하여 디지털 이미징하였다.
16. 통계처리
데이터 분석은 SPSS 소프트웨어 버전 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행하였다. P value는 unpaired, two sided Student's t-test 또는 one-way ANOVA 및 Tukey post-hoc test (다수의 시험군의 경우)에 의해 결정하였다. 데이터는 s.e.m (standard error of the mean)과 함께 평균값으로 표시하였다.
실시예 1: Cas9 ribonucleoproteins ( RNPs )를 통한 Vegfa / VEGFA 유전자의 표적 돌연변이 유발
마우스 NIH3T3및 인간 망막 색소 상피 세포주 ARPE-19에서, VEGF 수용체 1 및 2에 대한 결합 부위를 암호화하는 Vegfa 유전자의 엑손 3과 엑손 4에서 표적 부위를 타겟팅하는 4 개의 단일 사슬 가이드 RNAs (sgRNAs) (Vegfa-1, 2, 3 및 4로 표시)를 시험하였다. 상기 4종의 sgRNA (Vegfa-1, 2, 3 및 4)는 참고예 1을 참조하여 제작하였다.
VEGFA / Vefga 유전자 내의 CRISPR-Cas9의 표적 서열(target sequence)을 타겟팅하는 sgRNA의 표적화 서열(targeting sequence) 및 인간 유전체와 마우스 유전체에서의 homologous site 개수를 아래의 표 6에 정리하였다:
Target sgRNA with PAM (5' to 3') Position Direction Number of mismatches at homologous sites*
0 1 2
Vegfa-1
human CTCCTGGAAGATGTCCACCAGGG
(서열번호 293)		 Exon 3 - 1 0 1
mouse 1 0 1
Vegfa-2
human AGCTCATCTCTCCTATGTGCTGG
(서열번호 294)		 Exon 4 - 1 0 1
mouse 1 0 3
Vegfa-3
human GACCCTGGTGGACATCTTCCAGG
(서열번호 295)		 Exon 3 + 1 0 0
mouse 1 0 1
Vegfa-4
human ACTCCTGGAAGATGTCCACCAGG
(서열번호 296)		 Exon 3 - 1 0 1
mouse 1 0 0
(* Determined using Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/);
밑줄: PAM 서열)
상기한 바와 같이 제조된 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP를 마우스 NIH3T3 세포 및 인간 ARPE-19 세포에 각각 도입 (transfection)하여 하기의 시험을 진행하였다. 상기 RNP의 세포 내로의 도입은, 참조예 3에 기재된 바와 같이, 플라스미드를 통하여 세포 내에 전달된 핵산 분자가 세포 내에서 sgRNA와 Cas9 단백질을 발현하도록 하는 방식 (도면에서 plasmid로 표시)으로 수행하거나, 미리 sgRNA와 재조합 Cas9 단백질의 복합체(또는 혼합물)를 양이온성 지질 (Lipofectamine)을 사용하여 세포 내로 도입시키는 방식(도면에서 RNP로 표시)으로 수행하였다.
마우스 NIH3T3 세포와 인간 ARPE-19 세포의 Vegfa/VEGFA 유전자좌의 표적 부위 서열을 도 1a에 나타내었다 (PAM 서열: 파란색); sgRNA 표적 서열: 청색).
형질감염 2일 후에 Targeted deep sequencing (참고예 6 참조)을 수행하여, 상기 제조된 4종의 sgRNA (Vegfa-1 sgRNA, Vegfa-2 sgRNA, Vegfa-3 sgRNA, 및 Vegfa-4 sgRNA)를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP 또는 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드의 도입에 의해 유발되는 NIH3T3 세포에서의 돌연변이 빈도를 측정하여, 그 결과를 도 1h에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=3), One-way ANOVA and Tukey post-hoc tests, *** P < 0.001).
또한, T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 분석 (참고예 5 참조)을 수행하여, NIH3T3 및 ARPE-19 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP 또는 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드의 도입에 의하여 유도된 돌연변이를 검출하여, 도 1b에 나타내었다. 도 1b에서 화살표는 T7E1에 의해 절단된 DNA 밴드의 예상 위치를 나타낸다.
또한, 형질감염 2일 후에 Targeted deep sequencing (참고예 6 참조)을 수행하여, NIH3T3 및 ARPE-19 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP 또는 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드의 도입에 의하여 유도된 돌연변이 빈도를 측정하여, 그 결과를 도 1c에 나타내었다 (error bar: s.e.m (n=3); One-way ANOVA and Tukey post-hoc tests, * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001).
NIH3T3 및 ARPE-19 세포에서 Vegfa-특이적 Cas9 RNP(Vegfa-1 sgRNA 포함)에 의하여 유도되는 대표적인 Vegfa/VEGFA 유전자좌에서의 돌연변이 DNA 서열을 도 1d에 나타내었다 (밑줄: sgRNA가 타겟팅 하는 표적 서열, 파란색: 삽입된 뉴클레오타이드, -: 결실 부위, WT: 야생형; 삼각형: 절단 위치; 오른쪽 수치: 삽입 또는 결실된 뉴클레오타이드 수).
또한, 형질감염 64시간 후에 targeted deep sequencing (참고예 6 참조)을 수행하여, confluent ARPE-19 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP의 도입에 의하여 유도되는 돌연변이(indel) 빈도를 측정하였으며, 그 결과를 도 1e에 나타내었다. 또한, 정량적 PCR (qPCR) (참고예 7 참조)을 수행하여 측정된 상기 세포에서의 VEGFA mRNA의 상대적 수준을 도 1f에 나타내었으며, 참고예 8을 참조하여 VEGFA ELISA를 수행하여 측정된 상기 세포에서의 VEGFA 단백질 수준을 도 2g에 나타내었다 (Error bar: s.e.m. (n = 5), Student's t-test, ** P < 0.01, *** P < 0.001).
도 1h에 나타난 바와 같이, 4종의 sgRNA 중 Vegfa-1 sgRNA가 Cas9와 복합체를 형성하여 RNP 형태로 세포내에 도입되는 경우에 NIH3T3 세포에서 가장 높은 indel 효율을 나타냈다. 또한, 도 1b 및 1c에 나타난 바와 같이, indel 효율이 가장 높은 Vegfa-1 sgRNA는 NIH3T3 세포 및 ARPE-19 세포에서 돌연변이를 유발하며, 특히 RNP 형태로 도입시 82±5 % (NIH3T3 세포) 또는 57±3 %(ARPE-19 세포)의 빈도로 표적 부위에서 작은 삽입 및 결실 (indels)을 유도하는 것이 확인되었다. sgRNA와 Cas9가 RNP 형태로 전달되는 경우, 플라스미드를 통한 형질 감염보다 indel 효율이 높게 나타났다 (도 1c).
도 1e에서와 같이, Vegfa-specific Cas9 RNP 처리시, ARPE-19 세포에서의 돌연변이(indel)는 40±8%의 빈도로 검출되었으며, 도 1f 및 1g에서와 같이, Vegfa-specific Cas9 RNP는 post-mitotic condition 하에서 confluent ARPE-19 세포에서의 VEGFA mRNA 수준과 VEGF 단백질 수준을 각각 24±4% (mRNA 수준) 및 52±9% (단백질 수준)의 감소폭으로 감소시켰다.
실시예 2: Cy3 -labeled Cas9 RNP의 In vitro 및 in vivo 전달
in vitro 및 in vivo에서의 Cas9 RNP의 위치를 모니터링하기 위하여, Cy3가 접합된 Cas9 단백질(참고예 4)을 사용하였으며, Vegfa-1 sgRNA와 결합되거나 결합되지 않은 Cy3-Cas9를 양이온성 지질과 혼합하여 NIH3T3 세포에 형질 감염시키거나, 망막하 주사를 통하여 Vegfa 특이적 Cy3 표지 또는 비표지 Cas9 RNP를 성체 마우스 안구에 주입하여 하기의 시험을 수행하였다.
Cy3 표지된 Cas9 RNP (Cy3 표지된 Cas9 및 Vegfa-1 sgRNA 복합체) 또는 Cy3 표지된 Cas9 단독 (대조군)으로 형질 감염시키고 24시간 후에 NIH3T3 세포를 공초점 현미경으로 관찰하여 세포 내 Cy3 신호의 위치를 이미징하였다 (참고예 4 참조). 상기 얻어진 이미지를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에서, 흰색 화살표는 Cy3 염료의 핵 co-localization을 보여주고, 오른쪽의 z 축 이미지는 Cy3 표지된 Cas9가 핵 내부에 위치함을 보여준다.
또한, 상기 형질 감염 24 시간 후에, 총 DAPI 양성 핵 개수에 대한 Cy3 양성 핵 개수의 비율 (100*[Cy3 양성 핵 개수]/[총 DAPI 양성 핵 개수])을 측정하여, 도 2b에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=3), Student's t-test, *** P < 0.001).
또한, 상기 형질 감염 24 시간 후에, T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 분석 (참고예 5 참조)을 수행하여, NIH3T3 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP의 도입에 의하여 유도된 돌연변이를 검출하여, 도 2c에 나타내었다. 도 2c에서 화살표는 T7E1에 의해 절단된 DNA 밴드의 예상 위치를 나타낸다.
또한, 상기 형질 감염 24 시간 후에, Targeted deep sequencing (참고예 6 참조)을 수행하여, NIH3T3 세포에서 Vegfa-1 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP의 도입에 의하여 유도된 돌연변이 빈도를 측정하여, 그 결과를 도 2d에 나타내었다 (error bar: s.e.m (n=3); One-way ANOVA and Tukey post-hoc tests, *** P < 0.001).
Cy3 표지된 Cas9 RNP를 마우스 눈에 주사 한 후 3 일째에, 대표적으로 선택된 RPE flat-mount를 형광 현미경으로 관찰하여 (참고예11 및 12 참조), 그 결과를 도 2e에 나타내었다. 도 2e에서, 흰색 화살표는 Cy3 염료의 핵 co-localization을 나타낸다.
망막 색소 상피세포 (RPE)/맥락막/공막 복합체(RPE/choroid/scleral complex) 중의 망막 색소 상피세포 (RPE)의 분포를 형광 현미경으로 관찰하여 (참고예11 및 12 참조), 그 결과를 도 2h에 나타내었다. 도 2h는 RPE/맥락막/공막 복합체의 대표적인 단면도를 보여준다. DAPI 양성 RPE 세포 및 다른 세포는 고배율 필드 영역 (100㎛x 100㎛)에서 계수되었다. 도 2h의 노란색 선은 RPE와 맥락막 사이의 경계를 표시하는 것이며, 백색 화살표는 RPE/맥락막/공막 복합체 중의 RPE 핵 (10.5±2.8%, n=8)을 나타낸다.
참고예 13을 참조하여, 망막 색소 상피세포 (RPE)/맥락막/공막 복합체(RPE/choroid/scleral complex)로부터 분리된 유전체 DNA를 사용하여, 생체 내에서 유도된 indels의 빈도를 결정 하였다. Indels 빈도는 주사 후 3 일째에 Targeted deep sequencing (참고예 6 참조)을 수행하여 분석 하였다. 얻어진 결과를 도 2f에 나타내었다 (Error bars are s.e.m. (n=6), Student's t-test, ** P < 0.01).
생체 내에서 Vegfa-특이적 Cas9 RNP (Vegfa-1 sgRNA 포함)에 의하여 유도되는 돌연변이 DNA 서열을 도 5에 나타내었다. 도 5에서, a는 주사 3일 후에 RPE에서 Vegfa-특이적 Cas9 RNP에 의하여 유도되는 대표적인 돌연변이 DNA 서열을 보여주고, b는 주사 7일 후에 레이저 유도 맥락막 혈관 신생 (laser-induced choroidal neovascularization (CNV))을 갖는 RPE에서의 돌연변이 DNA 서열을 보여준다. PAM 서열은 붉은 색으로 나타내고, WT는 야생형을 의미하며, 오른쪽 수치는 삽입되거나 결실된 뉴클레오타이드 개수를 나타낸다.
웨스턴 블라팅을 수행하여 (참고예 15), 주사 후 24시간 및 72시간째에 RPE/맥락막/공막 복합체에서의 Cas9 단백질의 수준을 측정하였으며 (n=4), 그 결과를 도 2g 및 도 2i에 나타내었다.
도 2a 내지 2d는 in vitro 결과를 보여준다. 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, Cy3-Cas9 RNP는 다수의 핵에서 검출되며, 도 2c 및 2d에 나타난 바와 같이, 표적 부위에서 indel을 유도하는 것이 확인되었다.
Cy3-Cas9 RNP 처리시의 Cy3 양성 핵의 비율 (42±6%) (도 2b)은 표적 부위에서 indel 빈도 (40±3%) (도 2d)와 거의 유사하게 나타났으며, 이러한 결과는 핵에 위치한 Cas9에 의하여 세포 내에서 표적 부위가 거의 완전하게 절단되며, 이러한 유전체 교정에 있어서의 rate limiting factor가 Cas9의 핵 위치화라는 것을 의미한다. 한편, Cy3-Cas9가 sgRNA 없이 단독으로 도입된 경우, 핵에서 거의 검출되지 않고 indels을 유도하지 않았다 (도 2a 및 2d). Cas9는 pI 값이 9.12 인 양전하를 띠는 단백질이며 음전하를 띠는 sgRNA가 없을 때 양이온성 지질과 복합체를 형성할 수 없다. Cy3-Cas9 RNP는 Cy3 표지되지 않은 Cas9 RNP보다 활성이 낮았으며, 표지되지 않은 Cas9 RNP는 80%의 빈도로 표적 특이 적 돌연변이를 유도했다 (도 2d).
도 2e 내지 2g 및 도 102 내지 도 104는 in vivo 결과를 보여준다. Cy3-Cas9 RNP 주사 3일 후에, Cy3 형광 신호가 망막 색소 상피세포 (RPE)의 핵에서 관찰되었다 (in vivo, 도 2e). RPE는 망막하 주사에 의한 RNP 전달의 주요 표적이기 때문에, RPE 세포 단독으로도 돌연변이 빈도를 이상적으로 분석 가능하다. 그러나 실제로는 targeted deep sequencing을 위해, RPE/맥락막/공막 복합체로부터 RPE 세포를 분류하는 것이 쉽지 않다. 대신, DAPI 양성 핵을 계산하여 RPE 세포의 비율을 계산하였으며, RPE 세포는 RPE/맥락막/공막 복합체의 세포들 중 11±3%를 차지하였다 (도 2h). 특히, Cy3-비표지 Cas9 RNP의 망막하 주사는 주사 후 3 일째에 indel을 16±2%의 빈도로 유발했으며, 생체 내 RPE 세포의 Vegfa 유전자의 표적 부위의 대부분에서 교정이 일어났다 (n=6, 도 2f 및 도 5의 a). 또한, 웨스턴 블라팅 분석을 통하여, Cas9 단백질이 주입 후 3 일째에 완전히 분해됨을 확인하였으며 (그림 2g 및 2i), 이는 Cas9가 생체 내에서 빠르게 전환됨을 보여준다.
실시예 3: Vegfa 를 표적으로 하는 Cas9 RNP의 망막하 주사의 노인성 황반변성(AMD) 및 레이저 유발 맥락막 혈관 신생 ( CNV )에 대한 효과 시험
Cas9 RNP가 AMD 마우스 모델에서 CNV의 치료에 사용될 수 있는지 조사하기 위하여, 레이저로 유도된 맥락막 혈관 신생 (laser-induced CNV)을 갖는 마우스에 Vegfa 특이적 Cas9 RNP (Vegfa-specific Cas9 RNP; Vegfa-1 sgRNA 포함) 또는 Rosa26 특이적 Cas9 RNP (Rosa26-RNP; Rosa26 sgRNA 포함)를 망막하 주사하여 아래의 시험을 수행하였다. 망막하 주사는 그 자체로 CNV의 크기를 증가시키기 때문에, Rosa26-RNP를 대조군으로 사용하였다.
laser-induced CNV를 갖는 마우스에 미리 조립된 Vegfa-특이적인 Cas9 RNP를 망막하 주사로 투여하였다. 주사 후 7 일째에, 안구 안의 망막 색소 상피세포 (RPE) 복합체를 flat-mounting하고, CNV 영역을 분석 하였다. Cas9 RNP 주입 영역 또는 반대쪽 비 주사 영역 (RNP가 없는 영역)에서 분리된 유전체 DNA를 targeted deep sequencing으로 분석하였다. Vegfa ELISA는 주사 후 3 일째에 수행하였다. 상기 시험 과정을 도 3a에 모식적으로 나타내었다.
주사 후 7 일째, Rosa26-특이성 Cas9 RNP (대조군) 또는 Vegfa- 특이성 Cas9 RNP를 주사한 C57BL/6J 마우스에서 isolectin B4(IB4)로 염색된 laser-induced CNV를 가시화하여 (참고예 11 참조), 얻어진 대표적 이미지를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에서 노란색 선은 CNV 영역을 구분한다.
주사 후 7 일째, CNV 면적을 평가하여 치료 효과를 평가 하였다. 참고예 11을 참조하여, Vegfa- 특이성 Cas9 RNP를 주사한 C57BL/6J 마우스에서의 CNV 면적을 측정하여, Rosa26-특이성 Cas9 RNP 주사한 대조군의 CNV 면적 (100%)에 대한 상대값(%)으로 도 3c에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=15), Student's t-test, *** P < 0.001).
CNV 영역에서의 Vegfa 수준 (pg/ml)을 ELISA로 측정하여 (참고예 14 참조), 그 결과를 도 3d에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=10), Student's t-test, ** P < 0.01).
RPE 복합체 내의 Vegfa 표적 부위에서의 Indel 빈도(%)를 도 3e에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=7), One-way ANOVA and Tukey post-hoc tests, *** P < 0.001).
RPE 복합체 내의 Rosa26 표적 부위에서의 Indel 빈도(%)를 도 3f에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=7), Student's t-test, * P < 0.05).
hematoxylin & eosin 염색으로 시료 단면(cross section)의 Laser-induced CNV 구조를 가시화하여 도 3g에 나타내었다. 도 3g에서, 노란색 선은 CNV 경계를 나타내며, 흰색 삼각형은 RPE/맥락막/공막 복합체 중의 망막 색소 상피세포 (RPE) 층을 나타낸다. 대부분의 RPE 세포는 CNV 영역에서 손상을 입은 것을 확인할 수 있다 (Ch: 맥락막, R: 망막, S: 공막).
targeted deep sequencing를 통한 돌연변이 분석에 사용하기 위한 대표적인 CNV 시료를 도 3h에 나타내었다. 도 3h에서, 빨간 선은 돌연변이 분석을 위한 RPE/맥락막/공막 복합체의 경계를 나타낸다. RPE 세포는 노란색 선으로 표시된 CNV 영역 외부에 주로 존재하였다.
레이저 처리 후 7일째의 Laser-induced CNV를 도 3i에 나타내었다. IB4 마커와 DAPI로 공동 염색된 내피 세포를 CNV 영역으로 모집하였다 (가운데).
도 3b 및 3c에 나타난 바와 같이, Rosa26-RNP를 주입한 마우스와 비교하여, Vegaf-RNP를 주입한 한 마우스에서 CNV 면적이 유의하게 감소했다 (Rosa26-RNP 주입 마우스 대비 58±4%, n = 15, P <0.001, Student 's t-test).
또한, 도 3d에서 보여지는 바와 같이, Vegfa-specific Cas9 RNP 주입시, CNV 영역에서의 Vegfa 단백질의 농도가 300±20pg/ml (n=10)로, Rosa26-RNP 주입시 (440±30pg/ml, n=10)와 비교하여 CNV 영역에서 Vegfa 단백질의 농도를 효과적으로 감소시킴을 확인할 수 있다.
또한, 도 3e및 3f에 나타난 바와 같이, Vegfa-specific Cas9 RNP 처리된 CNV 및 Rosa26-RNP 처리된 CNV에서의 각각의 RNP의 표적 부위(도 5의 b 참조)에서의 indel 빈도가 각각 3.5±0.3% (Vegfa indel) 및 3.3±1.0% (Rosa26 indel)의 빈도로 검출된 반면, 음성 대조군에서는 indel이 전혀 검출되지 않았다. 이러한 결과는 Vegfa-specific Cas9 RNP의 망막하 주사에 의하여 크기가 작은 마우스 눈에서도 국소적 치료가 가능함을 보여준다.
한편, 도 3g에 보여지는 바와 같이, CNV 내의 대부분의 RPE 세포는 레이저 처리에 의해 사멸하였다. 죽은 세포에서는 Cas9 RNP에 의한 유전자 교정이 일어나지 않고, 살아있는 RPE 세포에서만 유전자 교정이 일어났으며 (도 3h), 그 결과, CNV가 없는 영역의 세포와 비교하여, 살아있는 RPE 세포에서의 indel 빈도가 더 낮다. 또한, 레이저 치료 후 3 일째에, 내피 세포가 CNV 영역으로 모이고 새로운 혈관이 형성됨을 확인하였다 (도 3i). 이 세포는 유전자 교정되지 않아서 CNV 영역에서의 indel 빈도는 더욱 감소한다. 이러한 결과는 Cas9 RNPs를 이용한 눈에서의 Vegfa의 불활성화가 AMD 또는 당뇨병성 망막증과 같은 안구 질환의 효과적인 치료를 위한 치료적 유전체 교정 (therapeutic genome surgery)을 가능하게 함을 시사한다.
치료적 유전체 교정에서의 중요한 문제는 CRISPR-Cas9 뉴클레아제의 표적 특이성이다. 본 실험에 사용된 Vegfa-specific Cas9 RNP가 마우스 눈 또는 사람 세포에서 off-target 돌연변이를 일으켰는지 여부를 조사하였다. 먼저, Cas-OFFinder를 사용하여, 마우스 유전체에서 Cas9 RNP의 Vegfa-1 sgRNA의 표적 서열과 상동성이 가장 높은 20 개의 잠재적인 off-target 부위를 확인하여, 아래의 표 7에 정리하였다:
Potential off-target sites of the Vegfa-1 sgRNA (with PAM) in the mouse genome
No. Gene Sequence Chromosome Position Direction
On Vegfa Exon CTCCTGGAAGATGTCCACCAGGG (서열번호 293) chr17 46025487 -
OT1 Intergenic region - CTCCTGGAAGATTTTCACCAGGG (서열번호 297) chr2 123023449 -
OT2 Arhgef7 Intron CTCCTGGAAGATCTCCAGGAAGG (서열번호 298) chr8 11735358 -
OT3 Gsc Exon CTCCTGGAAGAGGTTCTCCAGGG (서열번호 299) chr12 104472064 +
OT4 Ptpm2 Exon CTCTTGGCAGATGTCCACAAGGG (서열번호 300) chr12 116842612 +
OT5 Gpr139 Intron CTCCTGGAAGCTGCCCATCATGG (서열번호 301) chr7 119178456 -
OT6 Kank4 Intron CTCCTGGAAAATGCCCACCCTGG (서열번호 302) chr4 98816689 +
OT7 Stk32b Intron CTCCTGGAAGATGTGGGCCATGG (서열번호 303) chr5 37675822 -
OT8 Ptpn11 Intron CTCCTGAAAGCTGACCACCACGG (서열번호 304) chr5 121146230 +
OT9 Acad12 Intron CACATGGAGGATGTCCACCATGG (서열번호 305) chr5 121606239 +
OT10 Intergenic region - CTCCTGGAAGCTGTTGACCAGGG (서열번호 306) chr5 138824186 +
OT11 Intergenic region - CTCCTGGAAGAGGACAACCAAGG (서열번호 307) chr13 44510080 -
OT12 Fibp Exon CTGCTGGATGTTGTCCACCAGGG (서열번호 308) chr19 5462580 -
OT13 Intergenic region - CTCCTGGAAGTTGTCCTCCTTGG (서열번호 309) chr15 87360502 -
OT14 Intergenic region - CCCCTGGAAGATTTCCATCAAGG (서열번호 310) chr17 37793411 +
OT15 Intergenic region - CTCTTGGCAGCTGTCCACCATGG (서열번호 311) chr10 24365585 -
OT16 Intergenic region - CTCCAAGAAGATGTCCTCCATGG (서열번호 312) chr10 55869098 -
OT17 Fam180a Exon CTCCTGGAAGATGTCCTGGAAGG (서열번호 313) chr6 35325901 -
OT18 Rasgrf1 Exon CTCCTGGTAGATGTTCAGCATGG (서열번호 314) chr9 89970376 -
OT19 Abca13 Intron GTCCTGGAAGCTGTCCACAAAGG (서열번호 315) chr11 9509771 +
OT20 C130046K22Rik Intron CTCAGTGAAGATGTCCACCAAGG (서열번호 316) chr11 103713336 +
Cas9 RNP로 처리된 마우스 눈의 CNV-free RPE 복합체로부터 유전체 DNA를 분리하여 targeted deep sequencing을 수행하여, 상기 20개의 잠재적 off-target 부위에서의 indel 빈도(%)를 구하여 도 6에 나타내었다 (Error bars indicate s.e.m. (n=3 for Cas9 Mock, n=5 for Cas9 RNP, respectively). 도 6에서 Mismatched nucleotide는 붉은 색으로, PAM 서열은 파란색으로 각각 나타내었다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, Cas9 RNP이 처리된 경우, 20개의 잠재적 off-target 부위 모두에서 indel 빈도가 0.1%을 넘지 않았으므로, off-target 돌연변이 비율이 시퀀싱 오류 비율 (sequencing error rate; 평균 0.1%)을 넘지 않음이 입증되었다. 즉, 본 시험에서 사용된 Vegfa-specific Cas9 RNP는 RPE에서 off-target effect를 나타내지 않음이 확인되었다.
실시예 4: 인간 유전체에서의 Vegfa -특이적 Cas9 RNP의 전장 유전체 표적 특이성(Genome-wide target specificity) 시험
인간 유전체에서의 Vegfa-특이적 Cas9 RNP의 전장 유전체 표적 특이성(Genome-wide target specificity)을 Digenome-seq로 확인하였다 (참고예 6 및 9 참조).
도 4a는 in vitro 절단 부위를 보여주는 Genome-wide Circos plot으로, 인간 유전체 DNA는 붉은 색으로, RGEN-digested 유전체 DNA는 파란색으로 표시되어 있다.
41 개의 Digenome-capture site (표 5 참조) 및 On-target 서열을 포함한 42개 서열의 Sequence logo를 도 4b에 나타내었다.
targeted deep sequencing에 의해 인간 ARPE-19 세포에서 확인된 off-target 부위 및 indel 빈도를 도 4c에 나타내었다. 도 4c에서, mismatched 뉴클레오타이드는 붉은색으로, PAM 서열은 파란색으로 각각 나타내었다.
도 4a 및 4b에 나타난 Vegfa-특이적 Cas9 RNP의 특정 표적 서열은 인간 VEGFA 유전자에서 잘 보존되어 있다.
Digenome-seq (Kim et al., Nature Methods 12, 237-243 (2015))을 사용하여 전장 유전체 특이성을 확인하였으며, 이 때, 시험관 내에서 (in vitro) 무세포 인간 유전체 DNA (cell-free human genomic DNA)에 Vegfa-특이적 Cas9 RNP를 처리한 후 전체 유전체 시퀀싱을 수행하였다. In vitro 절단 부위에서의 sequence leads은 무작위로 정렬하기보다는 균일하게 정렬하는 것으로 계산적으로 확인되었고, 이를 통하여 잠재적 off-target 부위의 리스트를 얻었다. 이와 같이 Digenome-seq를 사용하여 얻어진 on target 부위를 포함한 Vegfa-specific Cas9 RNP의 42 개의 in vitro 절단 부위를 아래의 표 8에 정리하였다:
In vitro cleavage sites in the human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA
No. Gene Sequence Chromosome Position Direction
On VEGFA Exon CTCCTGGAAGATGTCCACCAGGG (서열번호 293) chr6 43745263 -
OT1 NAALADL2 Intron ATCCTGTAAGACATCCACCCTGG (서열번호 317) chr3 174605831 -
OT2 Intergenic region - TTGCTGGAAGATGTCCCCCTTGG (서열번호 318) chr12 28147929 -
OT3 CPNE4 Intron TACCTGGAAGAATTCCACCACGG (서열번호 319) chr3 131485198 -
OT4 ABTB2 Intron GCCTGGGAAGATGTCCACCAGGG (서열번호 320) chr11 34241888 -
OT5 ARFGEF3 Intron TTCCAGGAAGAAATCCACCATGG (서열번호 321) chr6 138531951 -
OT6 Intergenic region - ACAATAGAAGAAGTCCACCATGG (서열번호 322) chr5 21242334 +
OT7 BAIAP2 -AS1 Exon CTCCAGGAAGTTCTCCACCAAGG (서열번호 323) chr17 79006487 -
OT8 HOMER1 Intron AATTAATAAGATGTCCACCTACG (서열번호 324) chr5 78719511 -
OT9 ABCA3 Exon GTCCTGGAAGATGAGCACCAAGG (서열번호 325) chr16 2327650 -
OT10 Intergenic region - GTGATGGAAGATGTCCACTTAGG (서열번호 326) chr2 129298046 -
OT11 Intergenic region - CTCCAGGAAGATTTCCATCATGG (서열번호 327) chr4 16957810 +
OT12 Intergenic region - GTCCTGGAGGATTTCCACCAGGG (서열번호 328) chr8 70150186 -
OT13 DSCAM Intron GTCCAGAAAGATATCCACCTAGG (서열번호 329) chr21 42029091 -
OT14 CLIP2 Intron CACCTGGAAGATTTCCACCTTGG (서열번호 330) chr7 73770600 +
OT15 Intergenic region - CTACTGGAAGAGGTCCACCCTGG (서열번호 331) chr14 103748791 +
OT16 ACSS2 Intron CTACTGGGAGAAGTCCACCTTGG (서열번호 332) chr20 33506330 +
OT17 Intergenic region - CTTCAGGAAGATGTCCACAATGG (서열번호 333) chr4 74527941 +
OT18 Intergenic region - CTCCCGGAAGCTGTCCACCCTGG (서열번호 334) chr14 106089679 +
OT19 ITIH4 , RP5-966M1.6 Intron ACTCCTGAAGATGTACACCCTGG (서열번호 335) chr3 52863033 +
OT20 Intergenic region - GAACTGGATGATGTCCACCTTGG (서열번호 336) chr6 157061270 +
OT21 LINC01170 Exon GCCTTGGAAGATGTCCCTCATGG (서열번호 337) chr5 123650052 +
OT22 Intergenic region - CTCCTTGAAAGAGTCCACCCAGG (서열번호 338) chr2 236108683 +
OT23 Intergenic region - CTCCTGCAAGATGTCCTCCAGGA (서열번호 339) chr2 120420942 -
OT24 Intergenic region - GGCCTGGAAAATGTCCACCGTGG (서열번호 340) chr2 122905021 +
OT25 MGAT5 Intron TCATGGAAGATATTCCACCAGGG (서열번호 341) chr2 134952386 -
OT26 U91319.1 Intron AAGATGGAAGACATCCACCAGGG (서열번호 342) chr16 13592695 +
OT27 Intergenic region - CAGCTGGAAGATGTCCACCTTTG (서열번호 343) chr16 84252079 +
OT28 Intergenic region - CAGCTGGAAGATGTCCACCACGA (서열번호 344) chr1 59037909 +
OT29 Intergenic region - CTCCTGGAAGGAGTCCACCATGA (서열번호 345) chr5 72463793 +
OT30 SLC9A9 Intron TACTCCTGGGATCTCCACCCATG (서열번호 346) chr3 143166935 -
OT31 PTPRS Exon CGTCTGAAAGATGTCCACCACGC (서열번호 347) chr19 5207995 +
OT32 Intergenic region - GGTCTGGAAGATGTCAACCACAG (서열번호 348) chr10 131177201 -
OT33 Intergenic region - CTCCTGGTCAATATCCACCCAAG (서열번호 349) chr22 25944921 +
OT34 ERC2 Intron CCCTGGAAGAATGTCCACCAGGA (서열번호 350) chr3 55563577 +
OT35 CTD - 2130O13 .1 Intron TGCCTGAAAGACATCCACCAAGG (서열번호 351) chr18 44830053 -
OT36 Intergenic region - TGACAGGAAGATGTCCACCCATG (서열번호 352) chr9 28979308 +
OT37 Intergenic region - CCTCCTGCTGATGTCCACCCAGG (서열번호 353) chr16 1065437 +
OT38 Intergenic region - GCTCCTGGAAGAATCCACCACAG (서열번호 354) chr10 130753819 +
OT39 BRD1 Intron CAGCTGGGAGATGTCCACCATGA (서열번호 355) chr22 50174426 +
OT40 CACNG3 Intron TTGGGGGAAGAAGTCCACCAAGG (서열번호 356) chr16 24310237 +
OT41 RP11- 57C13 .6, RP11-57C13.3 Intron CCCTAGGAAGAGGTCCACCAGGG (서열번호 357) chr10 89404735 -
상기 표 8에 열거된 부위를 유효성 확인을 위하여, Vegfa-specific Cas9 RNP가 형질 감염된 ARPE-19 세포에서 분리된 유전체 DNA를 사용하여 targeted deep sequencing를 수행하였다 (도 4c 참조). 그 결과, 이들 부위는 in vitro에서 효율적으로 절단되지만, 41개의 off-target 부위의 절단 부위에서 모두 off-target indel 빈도가 sequencing error rate(평균 0.1%)를 넘지 않는 것으로 확인되었다.
필요하다면, 개선된 특이성을 갖는 변형 된 gRNA (Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M. & Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature biotechnology 32, 279-284 (2014); Cho, S. W. et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome research 24, 132-141 (2014)) 또는 Cas9 변이체 (Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 529, 490-495 (2016); Slaymaker, I. M. et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351, 84-88 (2016))를 사용함으로써, 미미하나마 존재하는 off-target effect를 더욱 감소시키거나 방지할 수 있다.
상기 결과를 종합하면, 본 명세서에서 제공되는 Vegfa 표적화 서열을 갖는 sgRNA를 포함하는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP는 마우스와 인간 모두에서 매우 높은 특이성(in vivo 및 in vitro)을 보임을 확인할 수 있다.
실시예 5: Vegfa -특이적 Cas9 RNP의 부작용 시험
노인성 황반변성(AMD) 또는 당뇨병성 망막증과 같은 안과 질환의 치료를 위해 Vegfa 유전자를 돌연변이시킬 때의 또 다른 주요 관심사는 눈에서의 영양적 측면에서의 Vegfa의 역할이다. Vegfa 돌연변이시의 가장 심각한 변화는 원추세포 장애 (Cone dysfunction)인데, 마우스 RPE에서의 Vegfa 유전자의 조건부 결실 3 일 후에 관찰된다.
본 명세서에서 제공되는 Vegfa-특이적 Cas9 RNP가 와 같은 원추세포 장애를 일으키는지 여부를 시험하기 위하여, 참고예 12를 참조하여 opsin positive 영역을 형광현미경으로 관찰하고 그 면적을 계산하여, 도 7a (형광 이미지) 및 도 7b (opsin positive 영역(%))에 나타내었다.
도 7a는 Vegfa-specific Cas9 RNP 주입7일 후의 Vegfa -specific Cas9 RNP 주입된 정상 C57BL/6J 마우스 (레이저 처리 없이 RNP 주사만 시행한 정상 마우스) 및 Vegfa-specific Cas9 RNP가 주입되지 않은 정상 대조군 마우스의 망막으로부터 얻은 형광 단면 이미지로, opsin은 녹색으로 DAPI은 파란색으로 보여진다. 도 7b는 opsin positive 영역(%)을 보여주는 그래프로, 정상 대조군 (3.0±0.5%)과 Vegfa-specific Cas9 RNP 주입군 (3.1±0.5%) 간 유의미한 차이가 없다 (Error bars indicate s.e.m. (n=4); #, P > 0.05 (Student's t-test)).
도 7a 및 7b에서 확인되는 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 Vegfa-specific Cas9 RNP는 처리 후 7일째에도 미처리 정상 대조군과 비교하여 원추세포의 opsin positive 영역에 차이가 없었으며, 이는 원추세포에 기능 이상이 발생하지 않았음을 의미한다. 이러한 결과는 상기 Vegfa-specific Cas9 RNP가 Vegfa 유전자의 표적 서열만 특이적으로 돌연변이 시키며, 이러한 돌연변이가 심각한 부작용을 유발하지 않음을 보여준다. 또한, 기존의 Vegfa-표적 치료에서, 처리 3일 후에 부작용이 발생한 것과 비교하여, Vegfa-specific Cas9 RNP를 사용하는 경우에는 처리 7일 후에도 부작용이 발생하지 않았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE Seoul National University R&DB Foundation SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Eye Disease Comprising Cas9 Protein and Guide RNA <130> DPP20173118KR <150> US 62/367,674 <151> 2016-07-28 <160> 361 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-1 target sequence of VEGF-A gene) <400> 1 ctcctggaag atgtccacca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-2 target sequence of VEGF-A gene) <400> 2 agctcatctc tcctatgtgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-3 target sequence of VEGF-A gene) <400> 3 gaccctggtg gacatcttcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-4 target sequence of VEGF-A gene) <400> 4 actcctggaa gatgtccacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-5 target sequence of VEGF-A gene) <400> 5 cgcttacctt ggcatggtgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-6 target sequence of VEGF-A gene) <400> 6 gaccgcttac cttggcatgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-7 target sequence of VEGF-A gene) <400> 7 cacgaccgct taccttggca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-8 target sequence of VEGF-A gene) <400> 8 ggtgcagcct gggaccactg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-1 targeting sequence) <400> 9 cuccuggaag auguccacca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-2 targeting sequence) <400> 10 agcucaucuc uccuaugugc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-3 targeting sequence) <400> 11 gacccuggug gacaucuucc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-4 targeting sequence) <400> 12 acuccuggaa gauguccacc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-5 targeting sequence) <400> 13 cgcuuaccuu ggcauggugg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-6 targeting sequence) <400> 14 gaccgcuuac cuuggcaugg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-7 targeting sequence) <400> 15 cacgaccgcu uaccuuggca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Vegfa-8 targeting sequence) <400> 16 ggugcagccu gggaccacug 20 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro transcription template (forward) encoding sgRNA Vegfa-1) <400> 17 gaaattaata cgactcacta tagctcctgg aagatgtcca ccagttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro transcription template (forward) encoding sgRNA Vegfa-2) <400> 18 gaaattaata cgactcacta tagagctcat ctctcctatg tgcgttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro transcription template (forward) encoding sgRNA Vegfa-3) <400> 19 gaaattaata cgactcacta taggaccctg gtggacatct tccgttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro transcription template (forward) encoding sgRNA Vegfa-4) <400> 20 gaaattaata cgactcacta tagactcctg gaagatgtcc accgttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro transcription template (forward) encoding sgRNA Rosa26) <400> 21 gaaattaata cgactcacta tagggcggtc ctcagaagcc agggttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 22 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro transcription template (reverse) encoding sgRNA (universal)) <400> 22 aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60 ttgctatttc tagctctaaa ac 82 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for the T7E1 assay (mouse Vegfa-1, 1st PCR)) <400> 23 caaatctggg tggcgataga 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for the T7E1 assay (mouse Vegfa-1, 1st PCR)) <400> 24 agatggtcaa atcgtggaga g 21 <210> 25 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for the T7E1 assay (mouse Vegfa-1, 2nd PCR)) <400> 25 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaaatct gggtggcgat aga 53 <210> 26 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for the T7E1 assay (mouse Vegfa-1, 2nd PCR)) <400> 26 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaggg cttcatcgtt aca 53 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for the T7E1 assay (human Vegfa-1, 1st PCR)) <400> 27 catcgtgtga tctctggaat gaa 23 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for the T7E1 assay (human Vegfa-1, 1st PCR)) <400> 28 ccacctgttc ccaaagtgtt a 21 <210> 29 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for the T7E1 assay (human Vegfa-1, 2nd PCR)) <400> 29 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtggtga agttcatgga tgtcta 56 <210> 30 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for the T7E1 assay (human Vegfa-1, 2nd PCR)) <400> 30 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaagat gcccacctgc at 52 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (mouse Vegfa-2, 1st PCR)) <400> 31 acctatccct gctcagtaga a 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (mouse Vegfa-2, 1st PCR)) <400> 32 cccaagagag gaagcaagaa 20 <210> 33 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (mouse Vegfa-2, 2nd PCR)) <400> 33 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatctgct ccctccctct ac 52 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (mouse Vegfa-2, 2nd PCR)) <400> 34 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtccat caccatcacc accaccac 58 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (mouse rosa26, 1st PCR)) <400> 35 ccaaagtcgc tctgagttgt 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (mouse rosa26, 1st PCR)) <400> 36 tcgggtgagc atgtctttaa tc 22 <210> 37 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (mouse rosa26, 2nd PCR)) <400> 37 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccaaagt cgctctgagt tgt 53 <210> 38 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (mouse rosa26, 2nd PCR)) <400> 38 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctttaa gcctgcccag aaga 54 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT1, 1st PCR)) <400> 39 tctgtctgtc tccagacatt tg 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT1, 1st PCR)) <400> 40 gtcctgcttc tatcctgctt ta 22 <210> 41 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT1, 2nd PCR)) <400> 41 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgatca gctgacttcc agttc 55 <210> 42 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT1, 2nd PCR)) <400> 42 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctccac aactcaagtc ccattac 57 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT2, 1st PCR)) <400> 43 gacgtgagag tgagcagttt at 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT2, 1st PCR)) <400> 44 acagcaccca gattgtcttc 20 <210> 45 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT2, 2nd PCR)) <400> 45 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccttgtg tcctttgatg ctct 54 <210> 46 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT2, 2nd PCR)) <400> 46 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaggtc tgcaccatga atcc 54 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT3, 1st PCR)) <400> 47 gctgtgctca agaccaacaa 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT3, 1st PCR)) <400> 48 ccggttctgt actggtgtct 20 <210> 49 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT3, 2nd PCR)) <400> 49 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgccta cctccacctt ct 52 <210> 50 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT3, 2nd PCR)) <400> 50 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagatgc tgccctacat gaac 54 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT4, 1st PCR)) <400> 51 gtaggctcaa cagctctttc t 21 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT4, 1st PCR)) <400> 52 catagtgtga gtggtactgg tg 22 <210> 53 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT4, 2nd PCR)) <400> 53 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcctgagc ttcctctgtc ctaat 55 <210> 54 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT4, 2nd PCR)) <400> 54 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccact gcttctcctc tctat 55 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT5, 1st PCR)) <400> 55 gcccaaagta gcaggtgatt a 21 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT5, 1st PCR)) <400> 56 ctcaggctgt aactgacgat atg 23 <210> 57 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT5, 2nd PCR)) <400> 57 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacaggat gcaagtccac atc 53 <210> 58 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT5, 2nd PCR)) <400> 58 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcattct tcacagggcc atca 54 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT6, 1st PCR)) <400> 59 agaagctaag gagcccaatt t 21 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT6, 1st PCR)) <400> 60 tactttgcca agcccatgt 19 <210> 61 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT6, 2nd PCR)) <400> 61 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgccttct ctcttggctg taa 53 <210> 62 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT6, 2nd PCR)) <400> 62 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaacct actctcatcg tgctac 56 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT7, 1st PCR)) <400> 63 gaggagccca agtatatcac ag 22 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT7, 1st PCR)) <400> 64 ggtcaccata gctacaagag ag 22 <210> 65 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT7, 2nd PCR)) <400> 65 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaggctc cattagcctc ttc 53 <210> 66 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT7, 2nd PCR)) <400> 66 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgtca tggtgcacat cattc 55 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT8, 1st PCR)) <400> 67 ccctgcagca ttctctgtat 20 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT8, 1st PCR)) <400> 68 gacccagtgt attgtgggta g 21 <210> 69 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT8, 2nd PCR)) <400> 69 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgacaag cctgacagtt catc 54 <210> 70 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT8, 2nd PCR)) <400> 70 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctga tggtgagcag aaa 53 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT9, 1st PCR)) <400> 71 ctggaaccag agtcatagat agttg 25 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT9, 1st PCR)) <400> 72 tctgaagcac acaccagaag 20 <210> 73 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT9, 2nd PCR)) <400> 73 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaagata ccaaagcagg tgttc 55 <210> 74 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT9, 2nd PCR)) <400> 74 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaagca gttcagaggt ctatgt 56 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT10, 1st PCR)) <400> 75 ctagaagaag gcagagggag ta 22 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT10, 1st PCR)) <400> 76 aggagggaca gactggtata aa 22 <210> 77 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT10, 2nd PCR)) <400> 77 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcacagcg agccagaata ca 52 <210> 78 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT10, 2nd PCR)) <400> 78 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgtgc tacctgatct actcaac 57 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT11, 1st PCR)) <400> 79 gtgtgaatgg aggcgaaatt g 21 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT11, 1st PCR)) <400> 80 gcagctgaga agctaaggaa ta 22 <210> 81 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT11, 2nd PCR)) <400> 81 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttacataa agtccctgca acctg 55 <210> 82 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT11, 2nd PCR)) <400> 82 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttacca ggactctagt gagtgg 56 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT12, 1st PCR)) <400> 83 tagtacctgc ccaccagata g 21 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT12, 1st PCR)) <400> 84 gggcacttct tcaatgcttt ac 22 <210> 85 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT12, 2nd PCR)) <400> 85 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctcctga ccagtgttct gtaat 55 <210> 86 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT12, 2nd PCR)) <400> 86 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaacct cgagtaggaa ggga 54 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT13, 1st PCR)) <400> 87 cccactgagg ttgtatcagt tc 22 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT13, 1st PCR)) <400> 88 gatccaatgg ctttgcacat ac 22 <210> 89 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT13, 2nd PCR)) <400> 89 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaagaag accagtgaag gactg 55 <210> 90 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT13, 2nd PCR)) <400> 90 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtctg atgacccgag ttcta 55 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT14, 1st PCR)) <400> 91 tctatatagg caggttatga aagca 25 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT14, 1st PCR)) <400> 92 aaccaggaca tatgtggtag aaa 23 <210> 93 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT14, 2nd PCR)) <400> 93 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaatggcc ttctgggaaa gt 52 <210> 94 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT14, 2nd PCR)) <400> 94 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgagt ctgagagctt gtagtg 56 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT15, 1st PCR)) <400> 95 cacagacagt cgccttcaat 20 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT15, 1st PCR)) <400> 96 tggaagcctt aacaggtcaa taa 23 <210> 97 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT15, 2nd PCR)) <400> 97 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgccttca atgaatctcc ctttg 55 <210> 98 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT15, 2nd PCR)) <400> 98 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcttca ttggcagcac ttac 54 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT16, 1st PCR)) <400> 99 ggaagatcag cagtctcaac taa 23 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT16, 1st PCR)) <400> 100 cacattacct caaagctgtt tctt 24 <210> 101 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT16, 2nd PCR)) <400> 101 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctcagtg acagagactc accta 55 <210> 102 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT16, 2nd PCR)) <400> 102 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtggtg acatggctgt atctt 55 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT17, 1st PCR)) <400> 103 cttccaccgg gtatttccta tc 22 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT17, 1st PCR)) <400> 104 tcccagagag agttaggtta aga 23 <210> 105 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT17, 2nd PCR)) <400> 105 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagatgaa tgagcaccag agaaa 55 <210> 106 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT17, 2nd PCR)) <400> 106 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagacaa gaaagggcag taagaa 56 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT18, 1st PCR)) <400> 107 cctgggaaca acagccataa 20 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT18, 1st PCR)) <400> 108 gaacattggg taggtgagga ag 22 <210> 109 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT18, 2nd PCR)) <400> 109 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctctgt tgaggtggga tttg 54 <210> 110 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT18, 2nd PCR)) <400> 110 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtactg cttgaggagc ttgt 54 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT19, 1st PCR)) <400> 111 tgagccagtc cattcattcc 20 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT19, 1st PCR)) <400> 112 tccctcctgt tcttctcttc t 21 <210> 113 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT19, 2nd PCR)) <400> 113 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgggac aagtgtacag agaac 55 <210> 114 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT19, 2nd PCR)) <400> 114 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccttc acctacagag aagaga 56 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT20, 1st PCR)) <400> 115 cccacaaacc aagaacaaca a 21 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT20, 1st PCR)) <400> 116 cagtgttaag tgcctctgta gat 23 <210> 117 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing (OT20, 2nd PCR)) <400> 117 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagaagg gcggcatcag 50 <210> 118 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing (OT20, 2nd PCR)) <400> 118 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttttagt ctctggtttc cacct 55 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT1, 1st PCR)) <400> 119 atggagcttg cattttaaca 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT1, 1st PCR)) <400> 120 cttttttccc gtgatcctca 20 <210> 121 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT1, 2nd PCR)) <400> 121 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatggagc ttgcatttta aca 53 <210> 122 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT1, 2nd PCR)) <400> 122 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctggc ttatttcatc atttag 56 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT2, 1st PCR)) <400> 123 caaactgtca gtgagccaat ac 22 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT2, 1st PCR)) <400> 124 gaagtgatcc tcctctcaat acc 23 <210> 125 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT2, 2nd PCR)) <400> 125 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaggaag tcaagcagga aga 53 <210> 126 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT2, 2nd PCR)) <400> 126 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatcca tccattcata actttgga 58 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT3, 1st PCR)) <400> 127 gtccaatact ctaagcctca gtt 23 <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT3, 1st PCR)) <400> 128 accagcacca cactatctat tt 22 <210> 129 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT3, 2nd PCR)) <400> 129 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctataccta gtttgtaggg ttgtt 55 <210> 130 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT3, 2nd PCR)) <400> 130 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcacca cactatctat ttctgttat 59 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT4, 1st PCR)) <400> 131 acactatgat ctttccctgc aa 22 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT4, 1st PCR)) <400> 132 cagaaaccct gaagtcttga attg 24 <210> 133 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT4, 2nd PCR)) <400> 133 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctttcc ctgcaaagaa gtaaga 56 <210> 134 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT4, 2nd PCR)) <400> 134 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtctca ttgtccagaa ctgtgt 56 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT5, 1st PCR)) <400> 135 gggcagaaag gacagaaact 20 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT5, 1st PCR)) <400> 136 ggagaaactg aaaccaggag aa 22 <210> 137 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT5, 2nd PCR)) <400> 137 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcgtaaca gcaccttggt cat 53 <210> 138 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT5, 2nd PCR)) <400> 138 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgaaa ccaggagaag tgtagtc 57 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT6, 1st PCR)) <400> 139 agtaggtggg agggttctta t 21 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT6, 1st PCR)) <400> 140 caccatctct gtgtctcatc tg 22 <210> 141 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT6, 2nd PCR)) <400> 141 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagaaaca ggcatctgga gaac 54 <210> 142 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT6, 2nd PCR)) <400> 142 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcagc atagtcttgc tcgtc 55 <210> 143 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT7, 1st PCR)) <400> 143 taagcctggc ctgtctctt 19 <210> 144 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT7, 1st PCR)) <400> 144 agagcaggac gtggtgag 18 <210> 145 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT7, 2nd PCR)) <400> 145 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctcttc ctgggaccct 50 <210> 146 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT7, 2nd PCR)) <400> 146 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatacct aggaatgcag aacaag 56 <210> 147 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT8, 1st PCR)) <400> 147 gggattgcac ttaggttctt ct 22 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT8, 1st PCR)) <400> 148 ctatgcggtc tcttgtgcta at 22 <210> 149 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT8, 2nd PCR)) <400> 149 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggtcagg tgggtaatga tttctg 56 <210> 150 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT8, 2nd PCR)) <400> 150 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctaatc tgccttatgt aatgggttct 60 60 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT9, 1st PCR)) <400> 151 gactcctctg tggaaagagc 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT9, 1st PCR)) <400> 152 aggactccag tgctgagcac 20 <210> 153 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT9, 2nd PCR)) <400> 153 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcctctg tggaaagagc ct 52 <210> 154 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT9, 2nd PCR)) <400> 154 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacaccg tctctccttt gtgc 54 <210> 155 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT10, 1st PCR)) <400> 155 agggaccgta tcagatattg ttaatc 26 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT10, 1st PCR)) <400> 156 tccaatgtat tgcagccatc t 21 <210> 157 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT10, 2nd PCR)) <400> 157 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaatcaat ccttgtgcag cttaatg 57 <210> 158 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT10, 2nd PCR)) <400> 158 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcca tcttgccctt tga 53 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT11, 1st PCR)) <400> 159 cattgaggaa cctcaccttc tat 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT11, 1st PCR)) <400> 160 atgaatgtct tggtactgtc ctc 23 <210> 161 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT11, 2nd PCR)) <400> 161 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggaagag gtgtattagg ccatt 55 <210> 162 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT11, 2nd PCR)) <400> 162 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctctt ctctcttgct tcatctc 57 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT12, 1st PCR)) <400> 163 caaagcagct cctcttcctc 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT12, 1st PCR)) <400> 164 cagtgccttt cagtgaacct 20 <210> 165 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT12, 2nd PCR)) <400> 165 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctgggt atagagacca tgaca 55 <210> 166 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT12, 2nd PCR)) <400> 166 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacagc ctgagataat gatagagag 59 <210> 167 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT13, 1st PCR)) <400> 167 ggagtcgtac cctggtttat tt 22 <210> 168 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT13, 1st PCR)) <400> 168 gaagcattgt tccaccttaa cc 22 <210> 169 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT13, 2nd PCR)) <400> 169 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgggatag aagattaggc agagtatg 58 <210> 170 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT13, 2nd PCR)) <400> 170 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcatg tttgaaagga tgagc 55 <210> 171 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT14, 1st PCR)) <400> 171 ctctcagacc ctactcacct at 22 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT14, 1st PCR)) <400> 172 cactggaagt acctgtggaa g 21 <210> 173 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT14, 2nd PCR)) <400> 173 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagaccct actcacctat atccttt 57 <210> 174 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT14, 2nd PCR)) <400> 174 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttacctg tggaagcagg aga 53 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT15, 1st PCR)) <400> 175 ggccatcctc aaagacatga a 21 <210> 176 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT15, 1st PCR)) <400> 176 tctcaaactc ccgacctca 19 <210> 177 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT15, 2nd PCR)) <400> 177 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcatttc tatttattca tctcccacag 60 60 <210> 178 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT15, 2nd PCR)) <400> 178 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctggga ttacaggcgt gag 53 <210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT16, 1st PCR)) <400> 179 agaagtttca ggatgacaga tcc 23 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT16, 1st PCR)) <400> 180 caatccacat ctgcgtgttt c 21 <210> 181 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT16, 2nd PCR)) <400> 181 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagaagtt tcaggatgac agatcc 56 <210> 182 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT16, 2nd PCR)) <400> 182 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaatcc acatctgcgt gtttc 55 <210> 183 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT17, 1st PCR)) <400> 183 tgactcattg tgaatgcctt tattc 25 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT17, 1st PCR)) <400> 184 gagttgggtt ctctgcaact 20 <210> 185 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT17, 2nd PCR)) <400> 185 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttatagag tctagattag cagtagagc 59 <210> 186 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT17, 2nd PCR)) <400> 186 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagtct tatctgatac atggatacc 59 <210> 187 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT18, 1st PCR)) <400> 187 tgcagctctg gacaggaa 18 <210> 188 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT18, 1st PCR)) <400> 188 ggtgggtttc accatcctc 19 <210> 189 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT18, 2nd PCR)) <400> 189 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgggtgat tccctctgtg g 51 <210> 190 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT18, 2nd PCR)) <400> 190 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccatcc tcctgccctc t 51 <210> 191 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT19, 1st PCR)) <400> 191 gacagcactt agggatgatg aa 22 <210> 192 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT19, 1st PCR)) <400> 192 gatggagctg cccaagaaa 19 <210> 193 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT19, 2nd PCR)) <400> 193 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgggatga tgaatggctg gat 53 <210> 194 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT19, 2nd PCR)) <400> 194 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttctc catgtaggtg cctt 54 <210> 195 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT20, 1st PCR)) <400> 195 cctgagaaca aggagtgtca ag 22 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT20, 1st PCR)) <400> 196 ccatggaatg cccagatagt t 21 <210> 197 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT20, 2nd PCR)) <400> 197 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgttgata tcccagctta agcaatc 57 <210> 198 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT20, 2nd PCR)) <400> 198 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttaaac atcatttctg gcacgtc 57 <210> 199 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT21, 1st PCR)) <400> 199 agctattgct gtcaatctct tact 24 <210> 200 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT21, 1st PCR)) <400> 200 tacccagtct caggtagttc tt 22 <210> 201 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT21, 2nd PCR)) <400> 201 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgctgtc aatctcttac tgtaacta 58 <210> 202 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT21, 2nd PCR)) <400> 202 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttagcaa tgcgagaaca gactaa 56 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT22, 1st PCR)) <400> 203 tgccacacat cccatcatat c 21 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT22, 1st PCR)) <400> 204 cagcagacac agactcacaa 20 <210> 205 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT22, 2nd PCR)) <400> 205 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaacatg aaatgccaga gtcaaa 56 <210> 206 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT22, 2nd PCR)) <400> 206 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccatt caagttgcaa tcactatc 58 <210> 207 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT23, 1st PCR)) <400> 207 tcctgaaaga agggataagg taag 24 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT23, 1st PCR)) <400> 208 tgaggatggg tttcggtaaa t 21 <210> 209 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT23, 2nd PCR)) <400> 209 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctataaggt aagctcagcc tgtc 54 <210> 210 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT23, 2nd PCR)) <400> 210 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtttca acatgaaggc aaggag 56 <210> 211 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT24, 1st PCR)) <400> 211 caagaagggt gttaggttat gaaag 25 <210> 212 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT24, 1st PCR)) <400> 212 acagtcaacc cttaaggaag ag 22 <210> 213 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT24, 2nd PCR)) <400> 213 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgggtgtt aggttatgaa agtttaagg 59 <210> 214 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT24, 2nd PCR)) <400> 214 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaggaa gagttgtctt cactcg 56 <210> 215 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT25, 1st PCR)) <400> 215 ctttcacagc cagtcacaaa taaa 24 <210> 216 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT25, 1st PCR)) <400> 216 ctcacactct aggaaacaga tgatag 26 <210> 217 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT25, 2nd PCR)) <400> 217 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaatcca ctcagactac agagaaa 57 <210> 218 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT25, 2nd PCR)) <400> 218 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagacag gagtgttctc caaatc 56 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT26, 1st PCR)) <400> 219 gtgagccaag atcacaccat 20 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT26, 1st PCR)) <400> 220 ctctcagcaa gaaggcagat t 21 <210> 221 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT26, 2nd PCR)) <400> 221 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagatcac accattgcac tcc 53 <210> 222 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT26, 2nd PCR)) <400> 222 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaga tcagtgtctg ctaaa 55 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT27, 1st PCR)) <400> 223 ggacacgctg agtcaaagtt 20 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT27, 1st PCR)) <400> 224 cctttccttc gtgctgattg a 21 <210> 225 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT27, 2nd PCR)) <400> 225 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcaacca cgtcgacaat aca 53 <210> 226 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT27, 2nd PCR)) <400> 226 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtgga agtgacaagc aagtta 56 <210> 227 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT28, 1st PCR)) <400> 227 cccaacaatt ccttctttga gc 22 <210> 228 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT28, 1st PCR)) <400> 228 tctgctatta gaggaggcta gaa 23 <210> 229 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT28, 2nd PCR)) <400> 229 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaattcc ttctttgagc tcactat 57 <210> 230 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT28, 2nd PCR)) <400> 230 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggct agaacaacct tgga 54 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT29, 1st PCR)) <400> 231 gggcaaatcc ataacccaga ata 23 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT29, 1st PCR)) <400> 232 aggcgatgca tgagcttaaa 20 <210> 233 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT29, 2nd PCR)) <400> 233 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgggcaaa tccataaccc aga 53 <210> 234 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT29, 2nd PCR)) <400> 234 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtagct aatctggcta ccatcac 57 <210> 235 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT30, 1st PCR)) <400> 235 attggctggc acacagtag 19 <210> 236 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT30, 1st PCR)) <400> 236 cccaggatct agcaaacatt ca 22 <210> 237 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT30, 2nd PCR)) <400> 237 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgaatga atgaaggaaa gaatggg 57 <210> 238 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT30, 2nd PCR)) <400> 238 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaaac attcatcttt cgagcta 57 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT31, 1st PCR)) <400> 239 cacttctcgc ctttgacctt 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT31, 1st PCR)) <400> 240 tggctgtgct cactttactg 20 <210> 241 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT31, 2nd PCR)) <400> 241 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagaggag gaaactggag ctta 54 <210> 242 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT31, 2nd PCR)) <400> 242 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacttta ctgccaccag tgc 53 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT32, 1st PCR)) <400> 243 atcttccaca ggtgcaaatc t 21 <210> 244 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT32, 1st PCR)) <400> 244 ttgcctatgg ctgccttg 18 <210> 245 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT32, 2nd PCR)) <400> 245 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctggtca ttctcttccg tcaaa 55 <210> 246 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT32, 2nd PCR)) <400> 246 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacagt atgggcctga aaag 54 <210> 247 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT33, 1st PCR)) <400> 247 catgtaacca cgactacctc aa 22 <210> 248 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT33, 1st PCR)) <400> 248 ccatggcttg cagcaattt 19 <210> 249 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT33, 2nd PCR)) <400> 249 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtaacca cgactacctc aagatataa 59 <210> 250 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT33, 2nd PCR)) <400> 250 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacaca gacgtactgt taagga 56 <210> 251 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT34, 1st PCR)) <400> 251 cttagaggaa agagaactgg gattat 26 <210> 252 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT34, 1st PCR)) <400> 252 agtgtggctg attatggtga tta 23 <210> 253 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT34, 2nd PCR)) <400> 253 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccaagag tagcctaacc tttacaa 57 <210> 254 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT34, 2nd PCR)) <400> 254 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacgta aattgcacct gtcac 55 <210> 255 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT35, 1st PCR)) <400> 255 tttctctgcc attcttcctc tg 22 <210> 256 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT35, 1st PCR)) <400> 256 gaatgaagac acgaggcatt tg 22 <210> 257 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT35, 2nd PCR)) <400> 257 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcttagc ccatgttgct tcc 53 <210> 258 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT35, 2nd PCR)) <400> 258 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccaga atgtaccttg cacttt 56 <210> 259 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT36, 1st PCR)) <400> 259 tgctgtcttt agttccttca tt 22 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT36, 1st PCR)) <400> 260 ttaacccagc atcagctctc 20 <210> 261 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT36, 2nd PCR)) <400> 261 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgctgtc tttagttcct tcatt 55 <210> 262 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT36, 2nd PCR)) <400> 262 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttaacc cagcatcagc tctc 54 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT37, 1st PCR)) <400> 263 tttccagaag agccgacaag 20 <210> 264 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT37, 1st PCR)) <400> 264 ccaacaacca ccacgactaa 20 <210> 265 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT37, 2nd PCR)) <400> 265 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgggccct tctgctttga g 51 <210> 266 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT37, 2nd PCR)) <400> 266 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtctc ccatgaaggc tgta 54 <210> 267 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT38, 1st PCR)) <400> 267 aaagtacata gaggacgtgc atag 24 <210> 268 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT38, 1st PCR)) <400> 268 agttcaccac caccacaag 19 <210> 269 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT38, 2nd PCR)) <400> 269 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgtgcaa atactacgcc atttc 55 <210> 270 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT38, 2nd PCR)) <400> 270 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacaagt ttgcacttgc tttca 55 <210> 271 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT39, 1st PCR)) <400> 271 cacctggacc accagaaa 18 <210> 272 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT39, 1st PCR)) <400> 272 gctgtttgca aatgcctca 19 <210> 273 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT39, 2nd PCR)) <400> 273 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcacctgg accaccagaa a 51 <210> 274 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT39, 2nd PCR)) <400> 274 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacccat ctctgcagac ctta 54 <210> 275 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT40, 1st PCR)) <400> 275 ctgatttcct gagtttctcc ctaa 24 <210> 276 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT40, 1st PCR)) <400> 276 aagtgtgggc tgtgcataa 19 <210> 277 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT40, 2nd PCR)) <400> 277 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctgtgaa gggatttcaa actttcc 57 <210> 278 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT40, 2nd PCR)) <400> 278 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgatca aggctaacgt catca 55 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT41, 1st PCR)) <400> 279 catctcctgc tgtgtcatct t 21 <210> 280 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT41, 1st PCR)) <400> 280 ccagtctcgg gtatgtcttt att 23 <210> 281 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT41, 2nd PCR)) <400> 281 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgactgac ttccatcttc ctcac 55 <210> 282 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for targeted deep sequencing captured by Digenome-seq (OT41, 2nd PCR)) <400> 282 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagact aatacatccg gtctcatc 58 <210> 283 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for qPCR (mouse vegfa) <400> 283 acgtcagaga gcaacatcac 20 <210> 284 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for qPCR (mouse vegfa) <400> 284 ctgtctttct ttggtctgca ttc 23 <210> 285 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for qPCR (mouse gapdh) <400> 285 gctgagtatg tcgtggagtc ta 22 <210> 286 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for qPCR (mouse gapdh) <400> 286 gtggttcaca cccatcacaa 20 <210> 287 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for qPCR (human vegfa-1) <400> 287 cgagtacatc ttcaagccat cc 22 <210> 288 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for qPCR (human vegfa-1) <400> 288 ggtgaggttt gatccgcata at 22 <210> 289 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for qPCR (human vegfa-2) <400> 289 agaaggagga gggcagaat 19 <210> 290 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for qPCR (human vegfa-2) <400> 290 cacaggatgg cttgaagatg ta 22 <210> 291 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Forward primer used for qPCR (human gapdh) <400> 291 caatgacccc ttcattgacc 20 <210> 292 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Reverse primer used for qPCR (human gapdh) <400> 292 ttgattttgg agggatctcg 20 <210> 293 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Target sequence of sgRNA with PAM (Vegfa-1 gene)) <400> 293 ctcctggaag atgtccacca ggg 23 <210> 294 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Target sequence of sgRNA with PAM (Vegfa-2 gene)) <400> 294 agctcatctc tcctatgtgc tgg 23 <210> 295 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Target sequence of sgRNA with PAM (Vegfa-3 gene)) <400> 295 gaccctggtg gacatcttcc agg 23 <210> 296 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Target sequence of sgRNA with PAM (Vegfa-4 gene)) <400> 296 actcctggaa gatgtccacc agg 23 <210> 297 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT1)) <400> 297 ctcctggaag attttcacca ggg 23 <210> 298 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT2)) <400> 298 ctcctggaag atctccagga agg 23 <210> 299 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT3)) <400> 299 ctcctggaag aggttctcca ggg 23 <210> 300 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT4)) <400> 300 ctcttggcag atgtccacaa ggg 23 <210> 301 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT5)) <400> 301 ctcctggaag ctgcccatca tgg 23 <210> 302 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT6)) <400> 302 ctcctggaaa atgcccaccc tgg 23 <210> 303 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT7)) <400> 303 ctcctggaag atgtgggcca tgg 23 <210> 304 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT8)) <400> 304 ctcctgaaag ctgaccacca cgg 23 <210> 305 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT9)) <400> 305 cacatggagg atgtccacca tgg 23 <210> 306 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT10)) <400> 306 ctcctggaag ctgttgacca ggg 23 <210> 307 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT11)) <400> 307 ctcctggaag aggacaacca agg 23 <210> 308 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT12)) <400> 308 ctgctggatg ttgtccacca ggg 23 <210> 309 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT13)) <400> 309 ctcctggaag ttgtcctcct tgg 23 <210> 310 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT14)) <400> 310 cccctggaag atttccatca agg 23 <210> 311 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT15)) <400> 311 ctcttggcag ctgtccacca tgg 23 <210> 312 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT16)) <400> 312 ctccaagaag atgtcctcca tgg 23 <210> 313 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT17)) <400> 313 ctcctggaag atgtcctgga agg 23 <210> 314 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT18)) <400> 314 ctcctggtag atgttcagca tgg 23 <210> 315 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT19)) <400> 315 gtcctggaag ctgtccacaa agg 23 <210> 316 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Potential off-target site of Vegfa-1 sgRNA with PAM in mouse genome (OT20)) <400> 316 ctcagtgaag atgtccacca agg 23 <210> 317 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT1)) <400> 317 atcctgtaag acatccaccc tgg 23 <210> 318 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT2)) <400> 318 ttgctggaag atgtccccct tgg 23 <210> 319 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT3)) <400> 319 tacctggaag aattccacca cgg 23 <210> 320 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT4)) <400> 320 gcctgggaag atgtccacca ggg 23 <210> 321 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT5)) <400> 321 ttccaggaag aaatccacca tgg 23 <210> 322 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT6)) <400> 322 acaatagaag aagtccacca tgg 23 <210> 323 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT7)) <400> 323 ctccaggaag ttctccacca agg 23 <210> 324 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT8)) <400> 324 aattaataag atgtccacct acg 23 <210> 325 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT9)) <400> 325 gtcctggaag atgagcacca agg 23 <210> 326 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT10)) <400> 326 gtgatggaag atgtccactt agg 23 <210> 327 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT11)) <400> 327 ctccaggaag atttccatca tgg 23 <210> 328 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT12)) <400> 328 gtcctggagg atttccacca ggg 23 <210> 329 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT13)) <400> 329 gtccagaaag atatccacct agg 23 <210> 330 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT14)) <400> 330 cacctggaag atttccacct tgg 23 <210> 331 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT15)) <400> 331 ctactggaag aggtccaccc tgg 23 <210> 332 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT16)) <400> 332 ctactgggag aagtccacct tgg 23 <210> 333 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT17)) <400> 333 cttcaggaag atgtccacaa tgg 23 <210> 334 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT18)) <400> 334 ctcccggaag ctgtccaccc tgg 23 <210> 335 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT19)) <400> 335 gactcctgaa gatgtacacc ctgg 24 <210> 336 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT20)) <400> 336 gaactggatg atgtccacct tgg 23 <210> 337 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT21)) <400> 337 gccttggaag atgtccctca tgg 23 <210> 338 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT22)) <400> 338 ctccttgaaa gagtccaccc agg 23 <210> 339 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT23)) <400> 339 ctcctgcaag atgtcctcca gga 23 <210> 340 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT24)) <400> 340 ggcctggaaa atgtccaccg tgg 23 <210> 341 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT25)) <400> 341 tcatggaaga tattccacca ggg 23 <210> 342 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT26)) <400> 342 aagatggaag acatccacca ggg 23 <210> 343 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT27)) <400> 343 cagctggaag atgtccacct ttg 23 <210> 344 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT28)) <400> 344 cagctggaag atgtccacca cga 23 <210> 345 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT29)) <400> 345 ctcctggaag gagtccacca tga 23 <210> 346 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT30)) <400> 346 tactcctggg atctccaccc atg 23 <210> 347 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT31)) <400> 347 cgtctgaaag atgtccacca cgc 23 <210> 348 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT32)) <400> 348 ggtctggaag atgtcaacca cag 23 <210> 349 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT33)) <400> 349 ctcctggtca atatccaccc aag 23 <210> 350 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT34)) <400> 350 ccctggaaga atgtccacca gga 23 <210> 351 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT35)) <400> 351 tgcctgaaag acatccacca agg 23 <210> 352 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT36)) <400> 352 tgacaggaag atgtccaccc atg 23 <210> 353 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT37)) <400> 353 cctcctgctg atgtccaccc agg 23 <210> 354 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT38)) <400> 354 gctcctggaa gaatccacca cag 23 <210> 355 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT39)) <400> 355 cagctgggag atgtccacca tga 23 <210> 356 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT40)) <400> 356 ttgggggaag aagtccacca agg 23 <210> 357 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (In vitro cleavage site in human genome identified by Digenome-seq using the VEGFA sgRNA with PAM (OT41)) <400> 357 ccctaggaag aggtccacca ggg 23 <210> 358 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Cas9 conding sequence) <400> 358 atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggtacca acagcgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgc 120 cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180 gccacccgcc tgaagcgcac cgcccgccgc cgctacaccc gccgcaagaa ccgcatctgc 240 tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccaccgc 300 ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcgccaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcgcaag 420 aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcgcctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccgcggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg cccgcctgag caagagccgc 660 cgcctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900 ctgctgagcg acatcctgcg cgtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgccagc 960 atgatcaagc gctacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgc 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgcgagga cctgctgcgc 1200 aagcagcgca ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc gccgccagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg cgagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ccctggcccg cggcaacagc 1380 cgcttcgcct ggatgacccg caagagcgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcgcaagcc cgccttcctg 1620 agcggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680 gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgacag cgtggagatc 1740 agcggcgtgg aggaccgctt caacgccagc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860 ctgaccctga ccctgttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctgaa gacctacgcc 1920 cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgcc gccgctacac cggctggggc 1980 cgcctgagcc gcaagcttat caacggcatc cgcgacaagc agagcggcaa gaccatcctg 2040 gacttcctga agagcgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 agcctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtga gcggccaggg cgacagcctg 2160 cacgagcaca tcgccaacct ggccggcagc cccgccatca agaagggcat cctgcagacc 2220 gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggccgcc acaagcccga gaacatcgtg 2280 atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacag ccgcgagcgc 2340 atgaagcgca tcgaggaggg catcaaggag ctgggcagcc agatcctgaa ggagcacccc 2400 gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggccgc 2460 gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aaccgcctga gcgactacga cgtggaccac 2520 atcgtgcccc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gacccgcagc 2580 gacaagaacc gcggcaagag cgacaacgtg cccagcgagg aggtggtgaa gaagatgaag 2640 aactactggc gccagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcgcaagtt cgacaacctg 2700 accaaggccg agcgcggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat caagcgccag 2760 ctggtggaga cccgccagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag ccgcatgaac 2820 accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgcgaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880 aagctggtga gcgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060 atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccgcaagcgc 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgcgacttc 3240 gccaccgtgc gcaaggtgct gagcatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 cagaccggcg gcttcagcaa ggagagcatc ctgcccaagc gcaacagcga caagctgatc 3360 gcccgcaaga aggactggga ccccaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420 tacagcgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaaga gcaagaagct gaagagcgtg 3480 aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cgcagcagct tcgagaagaa ccccatcgac 3540 ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgcccaag 3600 tacagcctgt tcgagctgga gaacggccgc aagcgcatgc tggccagcgc cggcgagctg 3660 cagaagggca acgagctggc cctgcccagc aagtacgtga acttcctgta cctggccagc 3720 cactacgaga agctgaaggg cagccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780 cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttcag caagcgcgtg 3840 atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca ccgcgacaag 3900 cccatccgcg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960 cccgccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctacac cagcaccaag 4020 gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gtctgtacga gacccgcatc 4080 gacctgagcc agctgggcgg cgactaa 4107 <210> 359 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Essential part of crRNA) <400> 359 guuuuagagc ua 12 <210> 360 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (3' end part of crRNA) <400> 360 ugcuguuuug 10 <210> 361 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Essential part of tracrRNA) <400> 361 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60

Claims (9)

  1. Cas9 단백질 및 VEGF-A 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 VEGF-A 유전자 특이적 가이드 RNA를 포함하고,
    상기 Cas9 단백질과 가이드 RNA는 미리 조립된 리보핵산단백질 형태이고,
    상기 가이드 RNA는 VEGF-A 유전자의 엑손 3 또는 엑손 4 내의 Cas9 단백질이 인식하는 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp 길이의 표적 부위에 혼성화 가능한 핵산 서열을 포함하는 것인,
    VEGF-A 과발현과 관련된 안질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리보핵산단백질은 미리 조립된 형태로 세포막을 통과하는 것인, 안질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 VEGF-A 유전자 내의 서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 표적 부위에 혼성화 가능한 것인, 안질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 9 내지 16 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 안질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF-A 과발현과 관련된 안질환은 황반변성 또는 망막병증인, 안질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. Cas9 단백질 및 VEGF-A 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 VEGF-A 유전자 특이적 가이드 RNA를 포함하고,
    상기 가이드 RNA는 VEGF-A 유전자의 엑손 3 또는 엑손 4 내의 Cas9 단백질이 인식하는 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp 길이의 표적 부위에 혼성화 가능한 핵산 서열을 포함하고,
    미리 조립된 형태인,
    리보핵산단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 VEGF -A 유전자 내의 서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 표적 부위에 혼성화 가능한 것인, 리보핵산단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 9 내지 16 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 리보핵산단백질.
  9. 삭제
KR1020170095685A 2016-07-28 2017-07-27 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물 KR101961332B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662367674P 2016-07-28 2016-07-28
US62/367,674 2016-07-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180013780A KR20180013780A (ko) 2018-02-07
KR101961332B1 true KR101961332B1 (ko) 2019-03-22

Family

ID=61016342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170095685A KR101961332B1 (ko) 2016-07-28 2017-07-27 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11123409B2 (ko)
EP (1) EP3492096A4 (ko)
JP (1) JP6875500B2 (ko)
KR (1) KR101961332B1 (ko)
CN (1) CN109789185A (ko)
WO (1) WO2018021855A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102253939B1 (ko) 2020-06-25 2021-05-20 제주대학교 산학협력단 티로시나아제 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의용도
WO2023249475A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 연세대학교 산학협력단 망막색소상피에 특이적으로 작동하는 crispr/cas 복합체를 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학조성물

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143701A (zh) * 2019-06-26 2020-12-29 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 基于rna定点编辑的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂
JP2022547105A (ja) * 2019-09-04 2022-11-10 博雅▲輯▼因（北京）生物科技有限公司 オフターゲット評価に基づく遺伝子編集治療の評価方法
WO2021243105A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-02 University Of Southern California Composition and method for treating retinal vascular disease with vegf gene disruption
CN112662674B (zh) * 2021-01-12 2023-04-11 广州瑞风生物科技有限公司 靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用
KR20230016751A (ko) * 2021-07-26 2023-02-03 서울대학교산학협력단 염기 편집기 및 이의 용도

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2365077B1 (en) * 2004-03-12 2013-05-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
CA2716793A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
KR101706085B1 (ko) 2012-10-23 2017-02-14 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
EP4299741A3 (en) * 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP3741868A1 (en) * 2013-03-15 2020-11-25 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
BR112015031611A2 (pt) * 2013-06-17 2017-12-12 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas
US9526784B2 (en) * 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
ES2765481T3 (es) * 2013-12-12 2020-06-09 Broad Inst Inc Administración, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas crispr-cas y composiciones para la edición genómica
US20150376587A1 (en) * 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
JP6597248B2 (ja) * 2015-12-04 2019-10-30 ヤマハ株式会社 システムおよび制御方法
WO2017099494A1 (ko) * 2015-12-08 2017-06-15 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Glenn Yiu, et al. ARVO 2016 Annual Meeting Abstract, 2016.05.01., Program Number:1159*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102253939B1 (ko) 2020-06-25 2021-05-20 제주대학교 산학협력단 티로시나아제 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의용도
WO2023249475A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 연세대학교 산학협력단 망막색소상피에 특이적으로 작동하는 crispr/cas 복합체를 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US20180078620A1 (en) 2018-03-22
CN109789185A (zh) 2019-05-21
JP6875500B2 (ja) 2021-05-26
JP2019522034A (ja) 2019-08-08
US11123409B2 (en) 2021-09-21
KR20180013780A (ko) 2018-02-07
EP3492096A4 (en) 2020-04-15
EP3492096A1 (en) 2019-06-05
WO2018021855A1 (ko) 2018-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101961332B1 (ko) Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물
US10752919B2 (en) Methods and products for expressing proteins in cells
JP7408284B2 (ja) 単純ヘルペスウイルスを治療するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ関連方法及び組成物
KR20190127797A (ko) 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
RU2767201C2 (ru) Искусственная модификация генома для регуляции экспрессии гена
US20130245096A1 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
WO2020168051A1 (en) Methods of editing a disease-associated gene using adenosine deaminase base editors, including for the treatment of genetic disease
EP4114941A2 (en) Improved methods and compositions for modulating a genome
KR20210027389A (ko) 공여자 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의한 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법
EP3924478A1 (en) Compositions and methods for treating glycogen storage disease type 1a
US11713463B2 (en) Compositions and methods for increasing expression of SCN2A
CA2949345C (en) Small interfering rna (sirna) for the therapy of type 2 (ado2) autosomal dominant osteopetrosis caused by clcn7 (ado2 clcn7-dependent) gene mutation
US20230220361A1 (en) Crispr-cas9 mediated disruption of alcam gene inhibits adhesion and trans-endothelial migration of myeloid cells
TW202342064A (zh) 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
JP2023513188A (ja) 遺伝子の発現増加のためのｍｉｒｎａ－４８５阻害剤
JPWO2022071974A5 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant