KR20220025757A - 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아 플랫폼 - Google Patents

진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아 플랫폼 Download PDF

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KR20220025757A
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eukaryotic cell
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린제이 엠. 린케
다시 모라
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시벡 바이오테크놀로지스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 진핵 세포에 CRISPR/Cas 시스템을 포함한 유전자 편집 카고(cargo)를 전달하기 위해 침습성, 비병원성 박테리아를 사용하는 박테리아 매개 유전자 편집 전달 플랫폼을 제공한다. 박테리아는 유전자 편집 카고를 암호화하는 원핵생물(prokaryotic) 발현 카세트를 함유한다.

Description

진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아 플랫폼
본 출원은 2019년 6월 1일에 제출된 미국 가출원 제62/856,055호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 비병원성 박테리아 전달 플랫폼을 사용한 진핵 세포로의 유전자 편집 시스템의 전달에 관한 것이다.
유전자 편집은 DNA가 살아있는 유기체의 게놈에서 삽입, 삭제, 변형 또는 교체되는 유전 공학의 한 형태이다. 게놈 내의 특정 서열의 편집은 연구 목적뿐만 아니라, 특정 유전자에 대한 돌연변이를 표적화하거나 기능성 유전자(functional gene)를 유기체에 삽입하고 이를 표적화하여 병원성 표현형 또는 유전 질환과 연관된 결함이 있는 유전자를 교체함으로써 유전자 치료에도 사용될 수 있다. 유전자 편집에 대한 일반적인 방식은 조작된 뉴클레아제 또는 합성 뉴클레아제를 사용하는 것이다. CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas 또는 CRISPR/Cas 시스템이 일례이며, 이는 게놈 편집 분야를 빠르게 발전시키고 있다.
본 발명은, CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 유전자 편집 카고(cargo)를 진핵 세포에 전달하기 위해 침습성, 비병원성 박테리아를 사용하는 박테리아 매개 유전자 편집 전달 플랫폼을 제공하며, 여기서 박테리아는 유전자 편집 카고를 암호화하는 원핵생물(prokaryotic) 발현 카세트와 연관된 원핵생물 프로모터를 함유한다.
한 양태에서, 본 발명은 뉴클레아제 기반 유전자 편집 시스템을 포함한, 유전자 편집 시스템을 생성하여 진핵 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 방법은 침습성 비병원성 박테리아에 의해 진핵 세포를 침습하는 단계를 포함한다. 박테리아는 유전자 편집 시스템을 암호화하는 원핵생물 발현 카세트를 갖는 플라스미드를 함유한다. 원핵생물 발현 카세트는 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp 및 하이브리드 프로모터와 같은 하나 이상의 원핵생물 프로모터의 제어 하에 작용할 수 있다. 이러한 원핵생물 프로모터는 유도성, 구조성(constitutive) 또는 이들의 조합일 수 있다. 플라스미드에 다수의 프로모터가 있거나 박테리아에 다수의 플라스미드가 있는 경우, 시스템에서 프로모터의 상대적 활성에 기반하여 상이한 프로모터 유형을 사용할 수 있다고 고려된다. 상이한 유형의 원핵생물 프로모터를 사용함으로써, 전사체의 레벨을 제어하도록 전사를 조정할 수 있다. 박테리아에서 원핵생물 프로모터를 사용함으로써, 유전자 편집 시스템의 구성요소의 전사가 표적 진핵 세포가 아닌 박테리아 내에서 발생한다.
제2 양태에서, 본 발명은 진핵 세포의 게놈을 변형하는 박테리아를 포함하는 조성물을 제공한다. 박테리아는 원핵생물 벡터를 갖는다. 원핵생물 벡터(또는 벡터들)는 플라스미드로부터의 전사를 제어하기 위해 원핵생물 프로모터를 사용하는, 플라스미드 또는 다수의 플라스미드일 수 있다. 플라스미드 또는 플라스미드들은 (a) 하나 이상의 CRISPR 연관(CRISPR associated, Cas) 효소, (b) 하나 이상의 tracr 서열(들), 및 (c) 하나 이상의 CRISPR RNA(crRNA)를 갖는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화할 수 있다. crRNA는 (i) 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역 및 (ii) 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화(hybridizing)할 수 있는 하나 이상의 스페이서 서열을 가질 수 있다. CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 플라스미드는 핵 위치 신호전달 서열(nuclear localization signaling sequence)을 선택적으로 포함하여 진핵 세포의 핵으로의 유전자 편집 시스템의 핵 변위를 용이하게 할 수 있다. 박테리아는 진핵 세포에 침습하도록 조작된다. 본 발명의 이러한 제2 양태에서, 박테리아는 프로그램 가능한(programmable) 뉴클레아제 시스템을 생성하여 진핵 세포의 핵에서 CRISPR 복합 활성을 지시한다.
제3 양태에서, 본 발명은 침습 인자, 인바신(invasin) 단백질(inv 유전자에 의해 암호화됨) 및 리스테리오리신(listeriolysin) O(LLO) 단백질(hlyA 유전자에 의해 암호화됨)을 사용하여 진핵 세포에 진입할 수 있는, 유전자 편집 시스템(유전자 편집 카고)을 생성 및 전달하는 박테리아 전달 시스템의 사용을 포함하는 조성물을 제공한다. 박테리아 시스템은 유전자 편집 시스템을 생성 및/또는 진핵 세포에 전달하도록 조작된다. 유전자 편집 시스템을 생성 및/또는 전달하는 박테리아 세포의 사용을 포함하는 조성물은 하나 이상의 원핵생물 프로모터를 갖는 하나 이상의 원핵생물 플라스미드, 하나 이상의 진핵생물(eukaryotic) 프로모터를 갖는 하나 이상의 진핵생물 플라스미드, 또는 이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 본 발명의 이러한 제3 양태에서, 이용된 박테리아 시스템은 인바신 단백질을 발현함으로써 진핵 세포에 부착할 수 있고, LLO 단백질을 발현함으로써 진핵생물 엔도솜을 탈출할 수 있으며, 이로써 유전자 편집 카고가 진핵 세포의 세포질로 방출되고, 적절한 경우에 진핵 세포의 핵으로 변위할 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 유전자를 삽입, 삭제 또는 교체하는 진핵 세포의 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo), 또는 생체 외(ex vivo) 조작을 위한 조성물을 제공한다. 시험관 내 사용의 경우, 유전자 편집 시스템을 생성 및 전달하도록 조작된 박테리아 시스템을 사용하여 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역을 삽입, 삭제 또는 교체하고, 시험관 내에서 표적 DNA를 변형할 수 있다. 예를 들어, 시험관 내(살아있는 시스템 외부의 살아있는 세포)의 표적 DNA에 존재하는 CRISPR 모티프 또는 PAM 서열은, 원핵생물 플라스미드로부터 생성되어 박테리아 세포에 의해 진핵 세포로 전달되는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템에 의해 인식될 수 있다. 다른 실시형태에서, 시험관 내 표적 DNA 상의 CRISPR 모티프 또는 PAM 서열은 박테리아 세포에 의한 전달 후 표적 진핵 세포 내부의 진핵생물 플라스미드로부터 전사 및 번역되는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템에 의해 인식된다. 이러한 게놈 변형 실험은 시험관 내에서 수행될 수 있으며, 1차 세포(primary cells), 불멸 세포(immortalized cells), 분열 세포(dividing cells), 비분열 세포(non-dividing cells), 및 조혈 줄기/전구 세포(hematopoietic stem/progenitor cells)의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 시험관 내 유전자 편집의 응용으로는 시험관 내 선별 라이브러리(selection libraries), 불일치 감지 뉴클레아제 분석(mismatch-detection nuclease assays), 고처리량 프로파일링 분석(high-throughput profiling assays), 진단, 및 관련 차세대 서열결정 활동과 함께 사용하기 위한, 질병 연구 목적, 특정 유전자 변형의 병인(pathogenesis), 감염원, 유전 질환, 기능성 게놈 스크리닝, 염색체 채색, 질병 모델 구축(암 모델 포함)을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 생체 외 게놈 편집 및 변형을 위해, 진핵 세포는 살아있는 시스템으로부터 분리되고, 유전자 편집 시스템을 생성 및 전달하도록 조작된 박테리아 시스템은 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역을 삽입, 삭제, 또는 교체하는데 사용되며, 생체 외에서 표적 DNA를 변형한다. 예를 들어, 생체 외(살아있는 시스템으로부터 분리된 세포 내)에 존재하는 CRISPR 모티프 또는 PAM 서열은 원핵생물 플라스미드로부터 생성되어 박테리아 세포에 의해 생체 외에서 진핵 세포로 전달되는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템에 의해 인식될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생체 외 DNA 상에 존재하는 CRISPR 모티프 또는 PAM 서열은 박테리아 세포에 의한 전달 후 표적 진핵 세포 내부의 진핵생물 플라스미드로부터 전사 및 번역되는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템에 의해 인식된다. 일부 경우, 본 발명은 분리된 세포를 치료하여 진핵 세포가 유래한 살아있는 시스템으로 다시 이식하기 위해 표적 조직으로 되돌림으로써 치료적 성공을 달성하는데 사용된다. 생체 외(또는 시험관 내) 응용예는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료를 위한 것으로, 이는 본 발명을 사용하여 환자의 혈액으로부터 유래된 T 세포를 추출하고, 분리된 T 세포의 게놈을 편집하여 특정 종양 항원을 표적으로 하는 인공 수용체를 발현시킨다. 생체내 게놈 편집 및 변형에 대해, 유전자 편집 시스템을 생성 및 전달하도록 조작된 박테리아 시스템은 살아있는 시스템에서 DNA의 특정 게놈 변형을 위해 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역을 삽입, 삭제, 또는 교체하는데 사용할 수 있다. 일부 경우, 본 발명은 표적 조직(예를 들어 눈, 근육, 폐, 뇌, 비강, 위장관, 심장, 피부, 구강, 생식기 조직, 또는 이들의 임의의 조합)에 유전자 편집 시스템을 전달하는데 사용된다. 예를 들어, 생체 내에 존재하는 CRISPR 모티프 또는 PAM 서열은 원핵생물 플라스미드로부터 생성된 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템에 의해 인식되고, 생체 내에서 박테리아 세포에 의해 표적 진핵 세포로 전달될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생체내 DNA에 존재하는 CRISPR 모티프 또는 PAM 서열은 박테리아 세포에 의한 특정 조직으로의 전달 후 표적 진핵 세포 내부의 진핵생물 플라스미드로부터 전사 및 번역되는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템에 의해 인식된다. 이러한 생체내 유전자 편집 응용으로는 질병 치료, 질병 예방 및 희귀 유전 질환 치료를 위한 유전자 이식 배아(transgenic embryos)의 생성을 포함한, 질병 연구 목적, 특정 유전자 변형의 병인, 감염원, 유전 질환, 유전자 녹인 녹아웃 동물의 개발을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
제5 양태에서, 본 발명은 유전자 편집 시스템(유전자 편집 카고)을 생성 및 전달하는 박테리아 전달 시스템의 사용을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 유전자 편집 시스템을 구성하는 요소는 재조합 플라스미드로부터 발현되거나, 박테리아 염색체로부터 발현(박테리아 염색체에 통합)되거나, 이들의 임의의 조합을 이용하여 발현된다. 유사하게는, 진핵 세포에 진입하고, 진핵 세포 엔도솜을 탈출하는데 필요한 침습 인자(inv 및 hlyA)가 재조합 플라스미드로부터 발현되거나, 박테리아 염색체로부터 발현되거나, 이들의 임의의 조합을 이용하여 발현된다. 유전자 편집 시스템의 임의의 구성요소 및 박테리아 침습에 필요한 임의의 인자는 하나 이상의 재조합 플라스미드, 박테리아의 염색체, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 조합되어 발현될 수 있다.
제6 양태에서, 본 발명은 Cas 유전자, NLS, CRISPR 직접 반복 영역, 스페이서 서열(또는 스페이서 서열에 대한 삽입 부위) 및 tracr 서열 중 하나 이상을 함유하는 플라스미드를 제공한다. 이들 구성요소는 박테리아 세포의 형질전환 시에 하나 이상의 원핵생물 프로모터 등의 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 유리한 실시형태에서, 플라스미드는 스페이서 서열(또는 스페이서 서열에 대한 삽입 부위) 및 원핵생물 프로모터 또는 진핵생물 프로모터를 함유한다.
본 발명의 보다 완전한 이해를 위해, 첨부한 도면과 연관하여 취해진 이하의 상세한 설명을 참조해야 하며, 여기서:
도 1은 CRISPR/Cas 시스템과 같은 유전자 편집 카고를 진핵 세포에 전달하기 위한 침습성, 비병원성 박테리아를 사용하는 박테리아 매개 유전자 편집 전달 시스템의 도해적 표현을 제공하는 도면이다. 박테리아는 유전자 편집 카고를 암호화하는 원핵생물 발현 카세트를 함유할 수 있다.
도 2는 본 발명의 하나 이상의 실시형태에서 유전자 편집 시스템을 생성 및 전달하기 위해 박테리아를 유전적으로 조작하는데 사용되는 플라스미드 시스템의 일련의 도면(도 2a, 도 2b 및 도 2c)이다. 도 2a는 하나 이상의 원핵생물 프로모터, 복제 기점, 선별 표지, crRNA 리더(crRNA leader), 관심의 표적 DNA 유전자와 상동인 하나 이상의 스페이서/crRNA, tracr/tracrRNA, CRISPR 직접 반복 서열, 핵 위치 신호(NLS), 및 Cas 유전자를 함유하는 CRISPR 매개 유전자 편집 플라스미드(pSiCRISP)의 추정 서열 길이를 나타내는 개략도이다. 도 2b는 하나 이상의 원핵생물 프로모터, 복제 기점, 선별 표지, 수용체 매개 엔도시토시스를 위한 하나 이상의 침습 인자(침습 인자 A) 및 엔도솜 탈출을 위한 하나 이상의 침습 인자(침습 인자 B)를 함유하는 침습 플라스미드(pSiVEC)의 추정 서열 길이를 나타내는 개략도이다. 도 2c는 하나 이상의 원핵생물 프로모터, 복제 기점, 선별 표지, crRNA 리더, 관심의 표적 DNA 유전자와 상동인 하나 이상의 스페이서/crRNA, tracr/tracrRNA, CRISPR 직접 반복 서열, 핵 위치 신호(NLS), 및 Cas 유전자를 함유하는 CRISPR 매개 유전자 편집 플라스미드(pSiCRISP)의 추정 서열 길이를 나타내는 개략도이다.
도 3은 pSiCRISP_GFP 및 pSiVEC로 공동 형질전환된(co-transformed)되고, PCR용 특정 프라이머를 사용한 (도 3a) 424 bp NLS, (도 3b) 727 bp Cas9 및 (도 3c) 201 bp inv 유전자 발현 카세트의 PCR 증폭을 통해 pSiCRISP_GFP 및 pSiVEC 성분의 존재를 입증하기 위해 PCR 스크리닝된 FEC19 대장균의 3개의 이미지(도 3a, 도 3b 및 도 3c) 세트이다.
도 4는 GFP를 발현하는 A549 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
유전자 편집은 DNA가 살아있는 유기체의 게놈에서 삽입, 삭제, 변형 또는 교체되는 유전 공학의 한 형태이다. 게놈 내 특정 서열의 편집은 연구 목적뿐만 아니라, 특정 유전자에 대한 돌연변이를 표적화하거나 기능성 유전자를 유기체에 삽입하고 이를 표적화하여 병원성 표현형 또는 유전 질환과 연관된 결함이 있는 유전자를 교체함으로써 유전자 치료에도 사용될 수 있다. 유전자 편집에 대한 일반적인 방식은 조작된 뉴클레아제 또는 합성 뉴클레아제를 사용하는 것이다. CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 시스템이 일례이며, 이는 게놈 편집 분야를 빠르게 발전시키고 있다.
CRISPR/CRISPR 연관 단백질(Cas)은 박테리아, 효모, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans), 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 식물, 제브라피시, 및 마우스와 인간의 세포와 같은 각종 모델 유기체의 게놈을 편집하는데 사용되었다(Mali 외 "공학 생물학을 위한 다목적 도구로서의 Cas9(Cas9 as a versatile tool for engineering biology)," Nat. Methods. 10:957-963 (2013)). CRISPR/Cas 시스템은 다양한 전달 메커니즘 및 벡터를 사용하여 이러한 모델 유기체로 전달되었다. 보다 구체적으로, CRISPR/Cas 시스템은 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터를 포함한 다수의 전달 방법을 사용하여 진핵 세포로 전달되었다.
이 분야의 발전에도 불구하고, 표적 세포에 대한, CRISPR/Cas 시스템을 포함한 유전자 편집 뉴클레아제 시스템의 효과적인 시험관 내 및 생체내 전달은 여전히 과제로 남아 있다. 현재 CRISPR/Cas 시스템 전달 방법에는 인간 및 동물 의학에서 유전자 편집 응용 및 치료의 임상적 번역을 방해하는 많은 단점이 있다. 우리는 CRISPR/Cas 시스템을 포함한 임의의 유전자 편집 뉴클레아제 시스템을 표적 진핵 세포에 효과적으로 전달하기 위한 신규한 박테리아 전달 플랫폼을 개발했으며, 이는 일시적인 유전자 편집 응용을 위해, 세포 흡수를 제공하고, 적절한 경우에, 숙주 게놈 통합 없이 유전자 편집 뉴클레아제 시스템의 핵 변위를 제공한다.
본 발명은 진핵 세포 게놈 통합 없이 임의의 진핵 세포(분열 및 비분열)에서 게놈 편집 구성요소의 조직 특정 전달 및 세포내화(intracellularization)를 제공하도록, CRISPR 시스템을 포함한 유전자 편집 시스템을 위한 신규한 박테리아 전달 플랫폼을 제공한다.
유전자 편집 방식은 일반적으로 감염성 질환, 만성 비감염성 질환 및 기타 유전 질환의 예방을 포함한 광범위한 유전자 편집 응용을 효과적으로 다루기 위해 뉴클레아제 기반 시스템(즉, CRISPR/Cas)을 사용하는 것을 특징으로 한다. 일반적으로, 이러한 뉴클레아제는 게놈의 원하는 위치에서 위치 특이적 이중 가닥 손상을 야기한다. 유도된 이중 가닥 손상은 비상동 말단 접합(NHEJ) 또는 상동 재조합(HR)을 통해 복구되어, 게놈에 대한 표적 돌연변이가 발생한다. 유전자 편집의 뉴클레아제 기반 시스템의 예는 CRISPR 시스템이다. 다른 예로는 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector-based nucleases, TALENs), 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nucleases, ZFNs), ARC 뉴클레아제, 아르고너트 시스템 기반 뉴클레아제, TtAgo 뉴클레아제 시스템 및 기타 호밍 엔도뉴클레아제를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
CRISPR 시스템은 2개의 중요한 구성요소로 구성된다. 첫 번째 구성요소는 CRISPR RNA(crRNA)와 tracrRNA의 융합을 나타내는 단일 안내(single guide) RNA 올리고뉴클레오타이드(sgRNA) 또는 안내 RNA(gRNA)이다. 두 번째 구성요소는 Cas 뉴클레아제이다. 이러한 결합된 2개의 구성요소는 sgRNA/gRNA 및 CRISPR 연관 프로테아제/뉴클레아제를 나타낸다. 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)가 표적 DNA 분자의 유전체 자리(genomic locus)에 존재하는 경우, Cas 뉴클레아제는 gRNA에 의해 해당 PAM 자리로 향하고, DNA의 위치 특이적 이중 가닥 손상이 발생하여 안정적인 유전자 편집 이벤트를 유도한다. 이러한 유전자 편집 이벤트는 영구적인 유전자 녹아웃(유전자 제거) 또는 녹인(유전자 삽입)을 야기할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 3개의 주요 유형: I, II 및 III으로 분류된다. 유전자 편집의 메커니즘은 3개의 유형에 따라 다르지만, 3개의 유형 모두 진핵 세포에 적용되는 것으로 고려된다. 진핵 생물에서 가장 일반적으로 사용되는 CRISPR/Cas은 유형 II이고, 이는 단일 Cas 단백질, 즉 Cas9을 필요로 한다. CRISPR/Cas와 유사하게, 다른 유전자 편집 시스템은 원하는 유전적 돌연변이 또는 게놈 변형 이벤트를 제공한다.
이러한 유전자 편집 뉴클레아제 단백질 및 유전자 편집 시스템은 임상 및 연구 발견 응용에 제공하기가 어려웠다. 예를 들어, Cas9 단백질의 큰 크기, Cas9의 양전하, 및 sgRNA의 강한 음전하로 인해, 숙주 진핵 세포에 그리고 세포막을 가로질러 Cas9/sgRNA 복합체를 효과적으로 공동 전달하는 것이 이전 시스템에서는 어려웠다. Cas9, sgRNA, 및 Cas9/sgRNA 복합체는 전달 비이클 없이는 세포막의 지질 이중층을 통과할 수 없다. CRISPR/Cas 유전자 편집을 달성하는 하나의 방법은 플라스미드를 사용하여 sgRNA와 함께 Cas9 단백질을 전달하는 것이다. sgRNA 스캐폴드와 함께 sgRNA는 Cas9 카세트와 함께 플라스미드 내로 통합된다. 또한, 플라스미드는 핵으로 전달되는 유전자 편집 구성요소에 대한 핵 위치 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA 및 Cas9 단백질은 모두 전사를 위해 세포질로부터 핵으로 이동할 수 있도록 NLS가 필요할 수 있다. 본 발명은 진핵 세포로의 전달에 사용되는 박테리아 세포 내에서 유전자 편집 시스템의 발현을 유도하기 위해 원핵생물 프로모터를 갖는 플라스미드를 사용한다. 본 발명에서, 유전자 편집 시스템(즉, 직접 반복 서열, tracr/tracrRNA, 스페이서, Cas9, 및 NLS)의 발현을 유도하기 위해 원핵생물 프로모터를 사용하는 플라스미드는 비병원성 박테리아 세포로 형질전환된다. 또한, 박테리아 세포는 침습성으로 조작되어 수용체 매개 엔도시토시스를 통해 진핵 세포로 들어갈 수 있다. 박테리아 및 플라스미드(들)의 조합된 구성체는 특정 실시형태에서 원핵생물 프로모터의 제어 하에 발현된 유전자 편집 카고와 함께 진핵 세포로 전달될 박테리아 매개 유전자 편집 전달 시스템을 구성한다.
본 명세서에 교시된 박테리아 매개 유전자 편집 전달 플랫폼은 다른 유전자 편집 전달 방법과 비교할 때, 수많은 이점을 제공한다. 첫 번째로, 시스템은 일시적인 전달을 용이하게 한다. 박테리아 전달 플랫폼은 원하는 편집 이벤트를 신속하게 달성하여, 표적 외 편집을 최소화하고, DNA 특이성을 증가시키고, 세포에서 장기간 계속되는 CRISPR/Cas9 또는 다른 뉴클레아제 편집 시스템으로 인한 어떠한 원치 않는 결과를 감소시킨다.
두 번째로, 시스템은 비면역성(non-immunogenic)이다. 박테리아 세포는 항원 제시 세포 인식을 피하도록 조작되고, 시스템은 숙주에서 면역 또는 기타 사이토카인 반응을 유도하지 않는다. 대조적으로, 항체는 나노입자와 같은 기타 전달 비이클에 맞서 형성될 수 있다. 그리고, 리포솜 및 바이러스 벡터는 면역 반응을 유도할 수 있다.
세 번째로, 시스템은 비통합적(non-integrating)이다. 특정 실시형태에서, 유전자 편집 구성요소의 발현은 독점적으로 원핵생물 프로모터에서 유래된다. 이는 숙주 게놈 통합을 억제하고, CRISPR/Cas9 또는 기타 뉴클레아제 편집 시스템의 제어된 전달을 제공하며, 숙주에 대한 발암 및 기타 원치 않는 부작용의 위험을 제거한다. 그러나, 시스템은 진핵생물 프로모터를 갖는 플라스미드를 사용할 수 있고, 비병원성 박테리아를 플라스미드에 대한 전달 비이클로서 사용할 수 있으며, 이에 따라 표적 세포에서 전사될 수 있는 것으로 고려된다.
네 번째로, 시스템은 매우 안정적이다. 전달 플랫폼은 혈청, 프로테아제 및 뉴클레아제에 대한 노출에 의해 억제되지 않아, 박테리아 비이클이 표적 부위에 도달할 때까지 안정적으로 유지할 수 있다. 다른 비바이러스 벡터와는 달리, 당사의 박테리아 전달 플랫폼은 식세포 정리(clearance)에 의해 제거되지 않아, 안정성에 더욱 기여한다.
다섯 번째로, 시스템은 큰 페이로드(payload) 전달 능력을 가능하게 한다. 박테리아 전달 플랫폼은 효소의 크기가 큼에도 불과하고 Cas9과 같은 Cas 효소를 효과적으로 전달할 수 있다. 다른 비바이러스 벡터는 표적 조적에 충분한 Cas9 농도를 전달하기 위해 분투하지만, 본 명세서에 교시된 시스템은 전달되는 유전자 편집 시스템을 함유하는 박테리아 비이클의 효과적인 세포내화 및 엔도솜 방출을 위해 수용체 매개 엔도시토시스를 통해 기능한다.
여섯 번째로, 시스템은 큰 치료적 창(therapeutic window)을 제공한다. 박테리아 전달 플랫폼은 독성을 유발하지 않고 유전자 편집 효과를 달성하기 위해 다양한 투여량으로 투여될 수 있다.
일곱 번째로, 시스템은 효과적인 전달을 가능하게 한다. 전달 플랫폼은 수용체 매개 엔도시토시스를 통해 효과적으로 진핵 세포 내로 진입할 수 있고, 유전자 편집 시스템의 전달을 용이하게 하는 숙주 엔도솜을 효과적으로 벗어날 수 있다.
지금까지, 표적 세포로의 유전자 편집 및 CRISPR/Cas 시스템의 효과적인 생체 내 전달은 도전 과제였다. 현재의 CRISPR/Cas 전달 방법은 주로 기계적 방식(전기천공법, 유체역학 주입법(hydrodynamic injection), 미량주입법) 및 바이러스 벡터 전달(렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스)에 기반한다. 이러한 방법 중 다수가 동물 또는 인간 환자의 임상 응용을 위해 쉽게 번역될 수 있다. 리포솜 및 나노입자와 같은 비바이러스 전달 방법 또한 사용된다. 그러나, 치료 효과를 얻기 위해, CRISPR/Cas 시스템은 전신 투여, 원치 않는 조직으로의 전달, 및 숙주 통합으로 인한 원치 않는 부작용 및 안정성 문제를 피하기 위해 보다 효과적이고 구체적으로 전달될 필요가 있다.
시험관 내 및 생체 내의 CRISPR/Cas9 시스템의 전달에 바이러스 벡터가 사용되었지만, 그것의 근본적인 단점, 예를 들어 숙주 게놈 통합으로 인한 발암의 위험, 제한된 삽입 크기, 원치 않는 면역 반응의 자극, 및 대규모 생산의 어려움은 추가적인 응용을 심각하게 제한한다. 바이러스 백터를 사용한 숙주 게놈 통합은 Cas9 단백질 또는 기타 뉴클레아제의 높은 수준 및 장기적인 발현을 야기하여, 숙주에서의 보다 높은 표적 외 효과 및 강한 면역 반응에 기여할 수 있다. CRISPR/Cas에 대한 대체 비바이러스 전달 시스템이 시급하다. 비바이러스 벡터는 CRISPR/Cas9 전달을 위한 또 다른 잠재적 옵션을 나타낸다. 이들로는 리포솜, 나노입자, 엑소좀, 미세소포(microvesicles), 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptides, CPPs), 및 기타 지질, 폴리머, 및 지질 나노입자를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 시험관 내 유용성에도 불구하고, 복잡한 생리학적 조건은 생체 내에서 이러한 비바이러스 전달 방식을 사용하는데 장벽을 만든다.
본 발명은 전달 전에 유전자의 발현을 유도하는 원핵생물 발현 카세트를 함유하는 침습성, 비병원성 박테리아를 사용하여 진핵 세포에 유전자 편집 또는 CRISPR/Cas 시스템을 전달하는 시스템 및 방법을 제공한다. 다시 말해서, 본 발명에서는 침습성 및 비병원성이며, 박테리아의 침습 특성을 부여함으로써 진핵 세포로의 진입을 가능하게 하는 원핵생물 프로모터에 의해 유도되는 플라스미드를 함유하는 박테리아가 사용된다.
원핵생물 발현 카세트를 함유하는 박테아를 사용하는 이점은 필요한 유전자 편집 카고(올리고뉴클레오타이드 및 뉴클레아제 단백질)가 박테리아에 의해서만 발현되는 것이다. 이들은 전달 전에 박테리아에 의해 생성된다. 박테리아 세포가 숙주 진핵 세포의 세포질 내로 흡수되면, 유전자 편집 유전자 및 단백질을 함유하는 플라스미드는 중합효소 제한으로 인해 진핵 세포에서 발현될 수 없다. 이는 이러한 유전자 편집 유전자와 단백질 및 기타 플라스미드 DNA가 숙주의 게놈 내로 통합되는 것을 방지한다. 이는 게놈 통합이 특히 이들 유전자의 발현, 발암 및 독성을 제어할 수 없는 것을 포함하는 유해한 부작용과 연관되기 때문이다(Kim S 외 2014. 정제된 Cas9 리보핵단백질의 전달을 통한 인간 세포에서 매우 효과적인 RNA 안내 게놈 편집(Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins). 게놈 연구 24:1012-1019). 유전자 편집 이벤트(표적 DNA 변형)는 모든 세포 집단을 통해 영구적인 유전적 변형을 유도하기 위해 DNA 사본 당 1회만 발생할 필요가 있다. 따라서, 일부 경우에는, 유전자 편집 구성요소(즉, Cas9 및 sgRNA)가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 유전자 편집 시스템의 일시적 도입을 위해 전달 시스템을 사용하는 것이 유리하다. 통합 유전자 편집 방식(즉, 바이러스 벡터 전달)으로는, 유전자 편집 구성요소(Cas9 및 sgRNA)가 표적 세포 게놈 내로 통합되기 때문에 DNA의 모든 사본에서 DNA 돌연변이가 계속 발생한다. 표적 세포 게놈 내로의 통합을 피하는 것은 유전자 편집 구성요소의 제어된 발현을 제공하고, 표적 세포에서의 독성 및 표적 외 돌연변이 유발을 추가로 제한한다.
본 발명은, 박테리아가 진핵 세포에 진입하여 진핵 세포에 뉴클레아제 기반 유전자 편집 카고(예를 들어, CRISPR, TALENs, 징크 핑거)를 전달하는 것을 가능하게 하는 침습 인자(예를 들어, inv 및 hlyA)를 함유하는 박테리아를 사용한다. 진핵생물 프로모터가 있는 플라스미드를 함유하는 박테리아를 사용하면, 전달되는 유전자 편집 시스템이 있는 플라스미드이며 유전자 편집 카고가 진핵 세포 내부에 만들어지는 시스템이 생성된다. 원핵생물 프로모터를 사용한 시스템은 박테리아가 유전자 편집 시스템의 전사 및 발현 부위임을 보여준다. 두 가지 전달 경로(예를 들어, 원핵생물 프로모터 및 진핵생물 프로모터의 사용)가 본 발명에서 고려되지만, 원핵생물 프로모터를 사용한 시스템은 시스템이 표적 세포에 통합되지 않음을 보장하는 것을 포함하여 몇 가지 중요한 이점을 제공한다.
본 발명은 광범위한 응용을 발견할 것이다. 예를 들어, 진단에 있어서, 유전 질환과 연관된 게놈 돌연변이를 검출하거나 장기 이식 전에 거부 반응 표지를 검출한다. 본 발명은 진핵 세포의 내부에 존재하는 감염원으로부터의 외래 DNA가 돌연변이를 표적으로 하는 질병(감염성 및 비감염성 박테리아 및 바이러스)의 치료, 암 치료를 위한 CAR-T 응용, DNA 변형이 감소된 감염성 표현형과 연관된 경우의 질병의 예방, DNA 돌연변이가 원치 않는 유전적 표현형과 연관된 경우의 유전 질환(즉, 낭포성 섬유증, 헌팅턴병, 취약 X 증후군, 겸상 적혈구 빈혈증 및 가족성 고콜레스테롤혈증)의 치료, 및 생리학적 효과에 영향을 미치는 기능성 유전자 또는 유전적 서열을 식별하는 것이 중요한 경우의 게놈 전체 유전적 스크리닝(genome wide genetic screening)에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 살아있는 세포에서의 염색체 채색 방법을 제공한다. 이 시스템은 살아있는 세포에서 염색질 역학(chromatin dynamics)을 검출하는 방법으로 CRISPR 이미징을 실시하는데 사용될 수 있다. 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)에 융합된 촉매적으로 불활성인 dCas9(뉴클레아제 dead Cas9은 DNA에 결합하지만, 결합된 DNA는 절단할 수 없다)을 사용하여, 연구원들은 dCas9을 살아있는 세포의 형광 현미경과 호환되는 맞춤형 DNA 라벨러로 바꾸었다. 대안적으로, CRISPR gRNA는 표적이 된 유전체 자리를 시각화하기 위해 형광 단백질로 태그된 특정 RNA 결합 단백질(RNA-binding proteins, RBPs)을 보충하는 RNA 압타머와 상호작용하는 단백질에 융합될 수 있다. 추가적인 응용으로는, 예를 들어 유전학 및 질병의 연구와 같은 과학적 연구 응용에 유용하거나, 예를 들어 특정 질병에 내성이 있는 가축 또는 특정 질병 또는 장애에 내성이 있는 농업종(식물)을 생성하는데 유용한 표적 유전자형 또는 표현형을 생성하도록 동물이 유전적으로 변형된 형질전환 동물을 생성하는 능력을 들 수 있다.
도 1은 진핵 세포에 CRISPR/Cas 시스템과 같은 유전자 편집 카고를 전달하는 침습성, 비병원성 박테리아를 사용한 박테리아 매개 유전자 편집 전달 시스템의 도해적 표현을 제공한다. 예시적 시스템에서, 박테리아는 유전자 편집 카고를 암호화하는 원핵생물 발현 카세트를 함유한다. CRISPR/Cas9 유전자 편집 카고를 생성하여 포유동물 세포에 전달하는 시스템의 능력의 비제한적 예로서 제공되는 표현이 묘사되어 있다. 도면은 진핵 세포의 유전자 편집을 전달 및 수행하는 과정에서 여러 단계를 통해 진행되는 박테리아 매개 유전자 편집 전달 시스템의 작용을 보여준다.
첫 번째로, CRISPR 연관 단백질 9(Cas9) 서열, 트랜스 활성화(trans-activating) CRISPR RNA(tracrRNA), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 서열, 핵 위치 신호(NLS), 및 하나 이상의 스페이서 서열, 모든 부분의 유전자 편집 플라스미드가 박테리아(침습성 박테리아 전달 비이클) 내에서 전사된다. 이러한 전사는 표적 진핵 세포에 전입하기 전에 발생할 수 있다. 박테리아 내부에서 tracrRNA는 crRNA의 직접 반복 영역과 혼성화한 후에 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙한 단일 안내 RNAs(sgRNAs)로 처리되는 반면, Cas9 RNA 전사는 전사체는 활성 효소로 번역된다. 이러한 구성요소(Cas9 효소 및 성숙한 sgRNAs)는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 만든다. 박테리아는 선택적으로 재조합 플라스미드 또는 박테리아 염색체로부터 RNase III에 대한 rnc 유전자를 발현할 수 있다. 두 번째로, CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 생성하는 박테리아 비이클은 인바신 단백틸과 같은 침입 인자에 의해 포유동물 세포를 표적으로 하고, 수용체 매개 엔도시토시스(RME)에 의해 세포로 흡수된다. 세 번째로, 엔도솜은 LLO와 같은 엔도솜 방출을 위한 두 번째 침습 인자에 의해 분해되어, NLS에 의해 안내되는, 진핵 세포핵으로의 전위를 위한 sgRNA(성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체) 및 Cas9 효소를 방출한다. 네 번째로, 일단 핵 내부로 들어가면, sgRNA는 crRNA와 프로토스페이서 DNA 사이의 이질듀플렉스 형성을 통해 프로토스페이서와 하류 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM)로 구성되는 DNA 표적으로 Cas9을 보낸다. 다섯 번째로, Cas9은 PAM의 표적 DNA 상류의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중 가닥 손상을 일으킨다. 여섯 번째이자 마지막 단계에서, 표적 DNA는 영구적으로 변형된다. 이 도면은 표적 유전자 편집을 위해 진핵 세포의 핵에서 CRISPR 복합체 활성을 생성, 전달 및 지시하는 이 박테리아 플랫폼을 적용하는 프로세스의 예를 설명한다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 하나 이상의 실시형태에서 유전자 편집 시스템을 생성 및 전달하는 박테리아를 유전적으로 조작하는데 사용되는 플라스미드 시스템의 예시를 제공한다. 도 2a는 하나 이상의 원핵 생물 프로모터, 복제 기점, 선별 표지, crRNA 리더, 관심 표적 DNA 유전자에 상동인 하나 이상의 스페이서/crRNA, tracr/tracrRNA, CRISPR 직접 반복 서열, NLS, 및 Cas 유전자를 함유하는 CRISPR 매개 유전자 편집 플라스미드(pSiCRISP)의 추정 서열 길이가 있는 개략도이다. 유전자 편집 시스템을 제공하는 pSiCRISP 플라스미드뿐만 아니라, 이 시스템은 박테리아가 진핵 세포에 침입할 수 있도록 하는 구성요소를 필요로 한다. 도 2b는 하나 이상의 원핵 생물 프로모터, 복제 기점, 선별 표지, 수용체 매개 엔도시토시스를 위한 하나 이상의 침습 인자(침습 인자 A) 및 엔도솜 탈출을 위한 하나 이상의 침습 인자(침습 인자 B)를 함유하는 침습 플라스미드(pSiVEC)의 추정 서열 길이가 있는 개략도이다. 이들 두 플라스미드 시스템은 박테리아로 공동 형질전환될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 이들 두 플라스미드의 구성요소는 박테리아 형질전환을 위한 단일 재조합 플라스미드로 조합될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 이들 두 플라스미드의 구성요소는 박테리아의 염색체로부터 발현될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것을 의미하는 것은 아니다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 하기 실시예는 바람직한 실시형태를 나타내고, 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다. 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상 내에 포함되는 변경 및 기타 용도는 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1 - 유전자 편집 활성을 지시할 수 있는 pSiCRISP 플라스미드를 포함하는 침습성 박테리아의 생성:
녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 crRNA를 발현하는 CRISPR 복합체 유도 플라스미드를 나타내는 pSiCRISP_GFP 플라스미드를 합성하고 대장균(FECI 9)으로 형질전환했다. FECI 9 박테리아는 각각 인바신 매개 수용체 매개 엔도시토시스 및 LLO 매개 엔도솜 방출을 위한 inv 및 hlyA 유전자를 함유하는 pSiVEC와 공동 형질전환을 통해 진핵 세포에 침습하도록 추가로 조작되었다. pSiCRISP-GFP 및 pSiVEC를 함유하는, 얻어진 FECI 9 콜로니를 선별을 위한 적절한 항생제를 함유하는 뇌 심장 침출액(Brain Heart Infusion, BHI) 한천 상에 올려 놓았다. 본 발명의 양태의 조성물을 검증하는 방법으로서, 얻어진 FECI 9 박테리아 콜로니(A, B, C, D, E, F 및 G로 식별됨)를 PCR에 의해 스크리닝하여 FECI 9 박테리아 내부의 pSiCRISP 및 pSiVEC 플라스미드의 성공적인 형질전환을 입증한다. Cas9 유전자 및 NLS에 특이적인 pSiCRISP_GFP 서열, 및 inv 유전자에 특이적인 pSiVEC 서열은 PCR 분석에서 특이적 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 424 bp 생성물을 증폭하는 프라이머(도 3a)를 사용하여 NLS의 존재를 확인하고(콜로니 A, D, E, F 및 G에서 스크리닝), 727 bp 생성물을 증폭하는 프라이머(도 3b)를 사용하여 Cas9 유전자의 존재를 확인하고(콜로니 A, B, C, D, E 및 F에서 스크리닝), 201 bp 생성물을 증폭하는 프라이머(도 3c)를 사용하여 inv 유전자의 존재를 확인했다(콜로니 A, D, E 및 F에서 스크리닝). 1kb 래더(ladder)는 참조로서 도면(들)에서 사용된다. FECI 9 + pSiCRISP_GFP(pSiCRISP_GFP에 의해 형질전환된 FECI 9)의 Cas9 및 NLS 서열은 모두 콜로니 D, E 및 F에 존재했다. inv 서열은 시험된 모든 콜로니에 존재했다. inv 및 Cas와 NLS 모두에 대해 PCR 양성인 각 콜로니(콜로니 D, E 및 F)에 대해, 단일 양성 클론은 pSiCRISP_GFP 및 pSiVEC 존재를 확인하기 위해 서열 입증되고 번식되었다. 이 실험은 유전자 편집 플라스미드(pSiCRISP)를 포함하고, 표적 세포 진입을 위한 침습 인자를 함유하는 플라스미드(pSiVEC)를 더 포함하는 대장균(FECI 9)의 생성을 나타낸다. D, E 및 F에 대한 박테리아 스톡은 선별을 위한 적절한 항생제와 함께 BHI 배지에서 생성되었고, 1.0과 동일한 600nm 파장에서 측정된 광학 밀도(OD600)로 성장했다. 이러한 FEC19 + pSiCRISP_GFP + pSiVEC 스톡(D, E, F)은 20% 글리세롤에서 -80℃에서 동결되었다. 플레이트 계산(plate enumeration)을 위해 각 스톡의 단일 동결 앨리쿼트를 해동시켰다. 간단히 말해서, 1mL 앨리쿼트를 5000xg에서 5분 동안 원심분리하고, 세포를 1mL의 BHI에서 재현탁시켰다. 얻어진 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하고, 항생제를 함유하는 BHI 한천 상에 삼중으로 올려 놓았다. 각 희석액에서 콜로니 수를 평균 내어 전체 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL를 계산하여, FECI 9 + pSiCRISP_GFP + pSiVEC 스톡에 대한 생존가능 농도를 나타냈다. 이 시스템은 정량화된, 살아있는 접종원 스톡을 모든 향후 분석에 직접 사용할 수 있게 한다.
실시예 2 - 포유동물 세포주에서의 FEC19 + pSiCRISP + pSiVEC에 의한 CRISPR 매개 유전자 편집:
GFP를 안정적으로 발현하는 인간의 폐포 기저 상피(A549) 세포는 10% 소 태아 혈청, 2mM GlutaMAX, 100U/mL 페니실린, 및 100g/mL 스트렙토마이신이 첨가된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, DMEM)에서 37℃ 5% CO2 배양을 유지한다. pSiCRISP_GFP 플라스미드를 함유하는 침습성(pSiVEC로 형질전환됨) FECI 9 박테리아는 RME를 통해 A549 세포로 진입할 수 있고, 관심 유전자인 GFP를 녹아웃하는데 필요한 CRISPR 매개 유전자 편집 카고를 전달할 수 있다. 이 실험에는 pSiVEC 플라스미드가 GFP를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하고 있는 양성 대조군 처리(FECI 9 + pSiVEC shGFP)가 포함된다. A549 세포에서 GFP를 표적으로 하는 shRNA를 사용한 GFP의 녹다운이 예상되고 이전에 입증되었기 때문에, 이 양성 대조군 처리가 포함된다. 이 침습 분석에는 하기 단계가 포함된다. 첫 번째로, A549 세포를 검은색 24웰 플레이트 상에 고정 농도로 시딩한다. 박테리아 침습 당일, 4개의 FEC19 스톡이 해동된다: 1) FECI 9 + pSiCRISP_GFP + pSiVEC, 2) FECI 9 + pSiCRISP_GFP(비침습성), 3) FECI 9 + pSiCRISP_스크램블(스크램블/넌센스 crRNA를 발현) + pSiVEC, 및 4) FECI 9 + pSiVEC shGFP(GFP에 대한 shRNA를 발현). FECI 9 박테리아 스톡은 1×lO7CFU/mL에서 1×lO5CFU/mL로 DMEM에서 1:10으로 연속 희석된다. A549 세포를 1mL의 각 FECI 9 처리로 2시간 동안 배양한 후에 DMEM으로 세정하여 결합되지 않은 FECI 9 박테리아를 제거한다. Nexcelom Celigo를 사용하여, 침습 직전에 TO 판독값을 취하여 GFP 발현을 72시간 동안 정량화한다. 도 4는 처리되지 않은 A549 세포와 비교하여, 처리 후 0, 24, 48 및 72시간에 4개의 FECI 9 처리 중 1×lO7CFU/mL의 하나와 함께 배양한 후에 GFP를 발현하는 A549 세포의 비율을 나타낸다.
용어의 해설
본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 명세서에서 기술 또는 과학 용어가 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것으로, 어떠한 실시형태도 제한하려는 의도는 아니다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것을 의도한다. 본 명세서에서 사용될 때의 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"는 명시된 특징, 정수, 단계, 작용, 요소, 및/또는 구성요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작용, 요소, 구성요소, 및/또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 하나 이상의 연관 나열 항목의 임의의 모든 조합을 포함한다. 생성물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 "본질적으로 구성되는"은 어떠한 본질적으로 중요한 다른 구성요소 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. 따라서, 명시된 구성요소로 본질적으로 구성되는 조성물은 미량의 오염물질 및 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 다른 구성요소 또는 단계의 미량의 요소 이상을 제외하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드와 같은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낸다. 따라서, 이 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연의 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 비천연의, 또는 유도된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일 또는 이중 가닥 DNA의 약 5 내지 약 100뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 그러나, 본 개시의 목적을 위해, 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 상한은 없다. 올리고뉴클레오타이드는 "올리고머" 또는 "올리고"로도 알려져 있으며, 유전자로부터 분리되거나 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 설명되는 실시형태에 적용 가능한 바와 같이 단일 가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"는 DNA 분자, RNA 분자 또는 이들의 유사체를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 cDNA, genomic DNA 또는 합성 DNA와 같은 DNA 분자, 및 안내 RNA, 메신저 RNA 또는 합성 RNA와 같은 RNA 분자를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
"게놈 DNA"는 박테리아, 바이러스, 진균, 고세균, 식물 또는 동물의 게놈의 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 유기체의 게놈의 DNA를 나타낸다.
DNA를 "조작하는"은 결합, 한 가닥을 니킹, 또는 DNA의 양 가닥을 절단하는 것을 포함하고, 또는 DNA 또는 DNA와 연관된 폴리펩타이드의 변형(예를 들어, 아미드화, 메틸화 등)하는 것을 포함한다. DNA 조작은 DNA에 의해 암호화된 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 침묵, 활성화 또는 조절(증가 또는 감소)시킬 수 있다.
"유전자 편집"은 세포의 게놈에 존재하는 유전 정보를 변화시키는 과정을 나타낸다. 이러한 유전자 편집은 게놈 DNA를 조작함으로써 수행될 수 있으며, 이는 유전 정보의 변형을 야기한다. 이러한 유전자 편집은 편집된 DNA의 발현에 영향을 미칠 수도 있고, 영향을 미치지 않을 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안내 RNA"는 일반적으로 Cas 단백질에 결합할 수 있으며 표적 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA) 내의 특정 위치에 대해 Cas 단백질을 표적화하는 것을 돕는 RNA 분자(또는 집합적으로 RNA 분자군)를 나타낸다. 안내 RNA는 crRNA 조각 및 tracrRNA 조각을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "crRNA" 또는 "crRNA 조각"은 폴리뉴클레오타이드 표적화 안내 서열, 줄기 서열, 및 선택적으로 5' 돌출부(overhang) 서열을 포함하는 RNA 분자 또는 그것의 일부를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "tracrRNA" 또는 "tracrRNA 조각"은 단백질 결합 조각(예를 들어, 단백질 결합 조각은 Cas9과 같은 CRISPR 연관 단백질과 상호작용할 수 있음)을 포함하는 RNA 분자 또는 그것의 일부를 나타낸다. 용어 "안내 RNA"는 단일 안내 RNA(sgRNA)를 포함하며, 여기서 crRNA 조각과 tracrRNA 조각은 동일한 RNA 분자에 위치한다. 용어 "안내 RNA"는 또한 집합적으로 2개 이상의 RNA 분자군을 포함하며, 여기서 crRNA 조각과 tracrRNA 조각은 별도의 RNA 분자에 위치한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 용어 "변형"은 (a) 말단 변형, 예를 들어 5' 말단 변형 또는 3' 말단 변형, (b) 염기의 교체, 삽입 또는 삭제를 포함하는 핵염기(또는 "염기") 변형, (c) 2', 3', 및/또는 4' 위치에서의 변형을 포함하는 당 변형, 및 (d) 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 교체를 포함하는 골격(backbone) 변형을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 일반적으로 뉴클레오타이드 포스페이트를 포함하는, 염기, 당, 및 포스포디에스테르 결합 또는 골격 부분 중 하나 이상의 화학 구조에 대한 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 나타낸다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같이, "변형"은 변형되지 않은 리보뉴클레오타이드, 즉 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 우리딘 리보뉴클레오타이드에서 발견되는 것과는 다른 화학적 일부분(moiety) 또는 화학 구조의 일부를 나타낸다. 용어 "변형"은 변형의 유형을 나타낼 수 있다. 예를 들어, "동일한 변형"은 동일한 유형의 변형을 의미하고, "변형된 뉴클레오타이드가 동일하다"는 것은 변형된 뉴클레오타이드가 동일한 유형(들)의 변형을 갖는 반면 염기(A, G, C, U 등)는 서로 다를 수 있는 것을 의미한다. 유사하게, "두 가지 변형"이 있는 어댑터는 동일 뉴클레오타이드에 있거나 없을 수 있는 두 가지 유형의 변형이 있는 안내 RNA이며, 각 유형은 어댑터의 여러개의 뉴클레오타이드에서 나타날 수 있다. 유사하게, "세 가지 변형"이 있는 어댑터 폴리뉴클레오타이드는 동일한 뉴클레오타이드에 있거나 없을 수 있는 세 가지 유형의 변형이 있는 어댑터이며, 각 유형은 여러개의 뉴클레오타이드에서 나타날 수 있다.
"공여 폴리뉴클레오타이드"는 표적 폴리뉴클레오타이드에서 삽입되도록 의도된 뉴클레오타이드 폴리머 또는 올리고머이다. 공여 폴리뉴클레오타이드는 천연 또는 변형된 폴리뉴클레오타이드, RNA-DNA 키메라, 또는 단일 또는 이중 가닥의 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편일 수 있다. dsDNA 단편이 일반적으로 뉴클레아제 분해에 대해 ssDNA보다 내성이 있기 때문에, 완전한 이중 가닥 공여 DNA는 증가된 안정성을 제공할 수 있기 때문에 유리하다. 용어 "xA", "xG", "xC", "xT", 또는 "x(A,G,C,T)" 및 "yA", "yG", "yC", "yT", 또는 "y(A,G,C,T)"는 Krueger 외, "크기 확장 DNA의 합성 및 특성: 조작된 기능성 유전 시스템을 향하여(Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems)", Acc. Chem. Res. 2007, 40, 141-150(2007)에 기재된 뉴클레오타이드, 핵염기, 또는 핵염기 유사체를 나타내며, 그 내용은 그 전체가 여기에서 참조로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 폴리뉴클레오타이드" 또는 "표적"은 표적 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 표적 뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 특정 실시형태에서는 이중 가닥 DNA이다. 특정 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 RNA이다. 본 명세서에서 사용되는 "표적 핵산 서열" 또는 "표적 서열"은 CRISPR/Cas 시스템 또는 기타 유전자 편집 시스템을 사용하여 결합, 니킹, 또는 절단하고자 하는 특정 서열 또는 그것의 보체(complement)를 의미한다.
용어 "혼성화" 또는 "혼성화하는"은 완전히 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드 가닥이, 적합한 혼성화 조건 하에서 하나가 되어 이중 가득 구조 또는 2개의 구성 가닥이 수소 결합에 의해 결합된 영역을 형성하는 과정을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부분 혼성화"는 이중 가닥 구조 또는 영역이 하나 이상의 돌출부 또는 불일치를 포함하는 경우를 포함한다. 수소 결합은 일반적으로 아데닌과 타이민 또는 아데닌과 우라실(A와 T 또는 A와 U) 또는 사이토신과 구아닌(C와 G) 사이에 형성되지만, 다른 비표준(noncanonical) 염기쌍이 형성될 수 있다(Adams 외, 핵산의 생화학(The Biochemistry of the Nucleic Acids), 11판, 1992 참조). 변형된 뉴클레오타이드는 혼성화를 허용하거나 촉진하는 수소 결합을 형성할 수 있는 것으로 고려된다. "혼성화 가능한" 또는 "상보적인" 또는 "실질적으로 상보적인"은, 적절한 시험관 내 및/또는 생체 내 온도 및 용액 이온 강도의 조건 하에서의 서열 특이적 역평행 방식(즉, 핵산이 상보적 핵산에 특이적으로 결합함)으로 다른 핵산에 핵산(예를 들어, RNA)이 비공유 결합, 즉 왓슨 크릭 염기쌍 및/또는 G/U 염기쌍의 형성, "어닐" 또는 "혼성화"를 가능하게 하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 의미한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 표준 왓슨 크릭 염기쌍으로는 아데닌(A)과 타이미딘(T) 쌍, 아데닌(A)과 우라실(U) 쌍, 및 구아닌(G)과 사이토신(C) 쌍을 들 수 있다. 또한, 2개의 RNA 분자(예를 들어, dsRNA) 사이의 혼성화를 위해 구아닌(G)과 우라실(U)이 염기쌍을 이룬다는 것 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, G/U 염기쌍은 mRNA의 코돈과의 tRNA 안티코돈 염기쌍의 맥락에서 유전자 코드의 퇴화(즉, 중복)에 부분적으로 책임이 있다. 본 개시의 맥락에서, 안내 RNA 분자의 단백질 결합 조각(dsRNA 이중체)의 구아닌(G)은 우라실(U)에 대해 상보적인 것으로 간주되고, 그 반대도 마찬가지이다. 이와 같이, 제공된 뉴클레오타이드 위치에서 안내 RNA 분자의 단백질 결합 조각(dsRNA 이중체)으로 G/U 염기쌍이 만들어질 수 있는 경우, 위치는 비상보적인 것으로 간주되지 않는 대신, 상보적인 것으로 간주된다.
혼성화 및 세정 조건은 잘 알려져 있으며, Sambrook, I, Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), 특히 챕터 11 및 표 11.1; 및 Sambrook, J. 및 Russell, W., 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, 3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)에 예시되어 있다. 온도 및 이온 강도의 조건은 혼성화의 "엄격성"을 결정한다.
혼성화에는 2개의 핵산이 상보적인 서열을 함유할 필요가 있지만, 염기 사이의 불일치는 가능하다. 2개의 핵산 사이의 혼성화에 적절한 조건은 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 따라 달라지며, 이는 당업계에 공지된 변수이다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 상보성의 정도가 클수록, 이들 서열을 갖는 핵산의 혼성을 위한 용융 온도(Tm)의 값이 커진다. 짧은 스트레치의 상보성을 갖는 핵산(예를 들어, 35 이하, 30 이하, 25 이하, 22 이하, 20 이하 또는 18 이하 뉴클레오타이드를 넘는 상보성) 사이의 혼성화의 경우, 불일치의 위치가 중요해진다(Sambrook 외, supra, 11.7-11.8 참조). 일반적으로, 혼성화 가능한 핵산의 길이는 약 10뉴클레오타이드 이상이다. 혼성화 가능한 핵산의 예시적인 최소 길이는 약 15뉴클레오타이드 이상; 약 20뉴클레오타이드 이상; 약 22뉴클레오타이드 이상; 약 25뉴클레오타이드 이상; 및 약 30뉴클레오타이드 이상이다. 또한, 당업자는 온도 및 세정 용액 염 농도가 상보성의 영역의 길이 및 상보성의 정도와 같은 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있는 것을 인식할 것이다.
폴리뉴클레오타이드의 서열이 특이적으로 혼성화 가능하거나 혼성화 가능하도록 표적 핵산의 서열에 100% 상보적일 필요는 없는 것은 당업계에서 이해되는 것이다. 또한, 개재 또는 인접한 조각이 혼성화 이벤트(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않도록 하나 이상의 조각에 걸쳐 폴리뉴클레오타이드를 혼성화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 이들이 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역에 대해 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 화합물의 20뉴클레오타이드 중 18뉴클레오타이드가 표적 영역에 상보적이고, 따라서 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산은 90%의 상보성을 나타낸다. 이 예에서, 나머지 비상보적 뉴클레오타이드는 클러스터링되거나 상보적 뉴클레오타이드와 산재될 수 있으며, 서로 또는 상보적 뉴클레오타이드에 인접할 필요는 없다. 핵산 내의 특정 스트레치의 핵산 서열 사이의 상보성 백분율은 당업계에 공지된 BLAST 프로그램(basic local alignment search tools) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하거나(Altschul 외, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403- 410; Zhang 및 Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656), Smith와 Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 사용하는 기본 설정을 사용한 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용함으로써 관례대로 구할 수 있다.
용어 "절단" 또는 "절단하는"은 폴리뉴클레오타이드의 리보실포스포디에스테르 골격에서의 공유 포스포디에스테르 결합의 파괴를 나타낸다. 용어 "절단" 또는 "절단하는"은 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단 모두를 포함한다. 이중 가닥 절단은 2개의 별개의 단일 가닥 절단 이벤트의 결과로서 발생할 수 있다. 절단으로 인해 평활 말단(blunt ends) 또는 비틀린 말단(staggered ends)이 생성될 수 있다.
용어 "CRISPR 연관 단백질" 또는 "Cas 단백질"은 야생형 Cas 단백질, 그것의 단편, 또는 그것의 돌연변이 또는 변이체를 나타낸다. 용어 "Cas 돌연변이" 또는 "Cas 변이체"는 야생형 Cas 단백질의 단백질 또는 폴리펩타이드 유도체, 예를 들어 하나 이상의 점 돌연변이, 삽입, 결실, 절단, 융합 단밸직 또는 이들의 조합을 갖는 단백질을 나타낸다. 특정 실시형태에서, "Cas 돌연변이" 또는 "Cas 변이체"는 Cas 단백질의 뉴클레아제 활성을 실질적으로 유지한다. 특정 실시형태에서, "Cas 돌연변이" 또는 "Cas 변이체"는 하나 또는 모든 뉴클레아제 도메인이 불활성이 되도록 돌연변이를 일으킨다. 특정 실시형태에서, "Cas 돌연변이" 또는 "Cas 변이체"는 뉴클레아제 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, "Cas 돌연변이" 또는 "Cas 변이체"는 그것의 야생형 대응물의 뉴클레아제 활성의 일부 또는 전부가 결여되어 있다.
"gRNA 기능성"을 갖는 합성 안내 RNA는 Cas 단백질과의 연결과 같은 자연 발생 안내 RNA의 기능, 또는 Cas 단백질과의 연결에서 안내 RNA에 의해 수행되는 기능 중 하나 이상을 갖는 것이다. 특정 실시형태에서, 기능성은 표적 폴리뉴클레오타이드의 결합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성은 표적 폴리뉴클레오타이드에 Cas 단백질 또는 gRNA:Cas 단백질 복합체를 표적화하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성은 표적 폴리뉴클레오타이드를 니킹하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성은 표적 뉴클레오타이드를 절단하기 위해 gRNA:Cas 시스템 내에서 작용하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성은 Cas 단백질과 연결되거나, Cas 단백질에 결합하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성은 조작된 Cas 단백질이 있는 인공 CRISPR/Cas 시스템을 포함한, Cas 단백질이 있는 CRISPR/Cas 시스템에서의 안내 RNA의 임의의 기타 공지된 기능이다. 특정 실시형태에서, 기능성은 천연 안내 RNA의 임의의 기타 기능이다. 합성 안내 RNA는 자연 발생 안내 RNA보다 크거나 작은 정도로 gRNA 기능성을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 합성 안내 RNA는 하나의 특성에 대해서는 더 큰 기능성을 갖고, 다른 특성에 대해서는 더 작은 기능성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조각"은 완전한 서열보다 작은 서열(예를 들어, 뉴클레오타이드 부분서열(subsequence) 또는 아미노산 서열)의 임의의 부분을 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드의 조각은 임의의 길이, 예를 들어 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30,40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 또는 500뉴클레오타이드 이상의 길이일 수 있다. 안내 서열의 일부는 안내 서열의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 예를 들어 안내 서열의 1/3 이하, 예를 들어 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
분자의 맥락에서 용어 "~로부터 유래된"은 모분자(parent molecule) 또는 모분자로부터의 정보를 사용하여 단리되거나 만들어지는 분자를 나타낸다. 예를 들어, Cas9 단일 돌연변이 닉카아제(nickase) 및 Cas9 이중 돌연변이 무효 뉴클레아제(null-nuclease)는 야생형 Cas9 단백질로부터 유래한다.
2개 이상의 폴리뉴클레오타이드(또는 2개 이상의 폴리펩타이드)의 맥락에서 용어 "실질적으로 동일한"은, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 육안 검사에 의해 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬될 때, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 90~95%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 이상의 뉴클레오타이드(또는 아미노산) 서열 동일성을 갖는 서열 또는 부분서열을 나타낸다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드 사이의 "실질적 동일성"은 적어도 약 50뉴클레오타이드 길이, 적어도 약 100뉴클레오타이드 길이, 적어도 약 200뉴클레오타이드 길이, 적어도 약 300뉴클레오타이드 길이, 적어도 약 500뉴클레오타이드 길이, 또는 폴리뉴클레오타이드의 전체 길이에 걸친 폴리뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 존재한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드 사이의 "실질적 동일성"은 적어도 약 50아미노산 잔기 길이, 적어도 약 100아미노산 잔기 길이, 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 걸친 폴리펩타이드의 영역에 걸쳐 존재한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 다양한 값의 범위가 제공된다. 그 범위의 상한 및 하한 사이의 하한의 단위의 1/10까지에 대한 각각의 중간값이 또한 구체적으로 고려되는 것으로 이해된다. 명시된 범위에 포함되는 각각의 더 작은 범위 또는 중간값 또한 구체적으로 고려된다. 용어 "약"은 일반적으로 표시된 숫자의 ±10%를 나타낸다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낼 수 있고, "약 20"은 18 내지 22를 의미할 수 있다. "약"의 다른 의미는 반올림과 같이 문맥에서 명백할 수 있으므로, 예를 들어 "약 1"은 또한 0.5 내지 1.4를 의미할 수 있다.
특정 RNA를 "암호화하는" DNA 서열은 RNA로 전사되는 DNA 핵산이다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되는 RNA(mRNA)를 암호화할 수 있고, 또는 DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되지 않는 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 또는 안내 RNA; "비암호화" RNA 또는 ncRNA라고도 함)를 암호화할 수 있다. "단백질 암호화 서열" 또는 특정 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓인 경우, (DNA의 경우)mRNA로 전사되고 (mRNA의 경우)시험관 내 또는 생체 내에서 폴리펩타이드로 번역되는 핵산 서열이다. 암호화 서열의 경계는 5' 말단(N 말단)의 시작 코돈과 3' 말단(C 말단)의 번역 정지 넌센스 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 핵산을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 일반적으로 암호화 서열의 3'에 위치할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "프로모터 서열"은 RNA 중합효소에 결합할 수 있고 하류(3' 방향) 암호화 또는 비암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 정의하기 위한 목적으로, 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 그 3' 말단에 경계가 형성되고, 상류(5' 방향)로 연장되어 배경 위에서 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소의 최소수를 포함한다. 프로모터 서열 내에서, 전사 개시 부위뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인도 발견될 것이다. 유도성 프로모터를 포함한 다양한 프로모터를 사용하여 본 개시에 기재된 바와 같은 벡터를 유도할 수 있다.
프로모터는 본질적으로 활성인 프로모터(즉, 본질적으로 활성("ON") 상태인 프로모터)일 수 있고, 유도성 프로모터(즉, 상태가 활성("ON") 또는 불활성("OFF")인 프로모터)일 수 있으며, 외부 자극(예를 들어, 특정 온도, 화합물 또는 단백질의 존재)에 의해 제어된다.
선행기술에서 Cas 단백질의 발현에 적합한 프로모터가 바이러스로부터 유래된 경우(따라서 바이러스 프로모터로 칭해질 수 있음), 박테리아에서 Cas9 단백질을 발현시키는데 사용되는 프로모터 또한 바람직하다. 하나의 박테리아에서 Cas9 발현을 유도하는 것으로 알려진 프로모터가 박테리아와 다른 것(종)으로부터 유래된 Cas9 단백질의 발현을 유도하는데 사용되는 것 또한 가능하다. 이러한 경우, 상기 프로모터는 Cas9 단백질과 관련하여 이종성(heterologous)인 것으로 알려져 있다. 용어 "원핵생물 프로모터"는 서열의 전사를 위해 박테리아 내에서 활성인 프로모터를 나타낸다. 박테리아는 파지(phage) RNA 중합효소를 발현하도록 더 조작될 수 있으므로, 파티 프로모터의 사용을 용이하게 한다. 특정 양태에서, 파지 프로모터의 사용은 박테리아가 독성 유전자를 발현하도록 유도하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 파지 프로모터를 사용하여 독성 유전자의 상류에 배치하면 박테리아가 대량의, 아마도 독성의, 다량의 유전자 편집 뉴클레아제를 만들도록 하거나 강제할 수 있다.
침습성 미생물
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 박테리아 치료 입자(bacterial therapeutic particle, BTP)를 언급할 때의 용어 "침습성"은 표적 세포에 적어도 하나의 분자, 예를 들어 RNA 또는 RNA 암호화 DNA 분자를 전달할 수 있는 미생물을 나타낸다. 침습성 미생물은, 세포막을 가로지름으로써 상기 세포의 세포질로 진입할 수 있고, 그 내용물의 일부, 예를 들어 RNA 또는 RNA 암호화 DNA를 표적 세포에 전달하는 미생물일 수 있다. 적어도 하나의 분자를 표적 세포에 전달하는 과정은 바람직하게는 침습 기관을 크게 변형시키지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스킹덤(transkingdom)"은 숙주 게놈 통합 없는 과정을 위해 표적 조직 내에서 핵산을 생성하고 핵산을 세포 내로 전달하기 위해(즉, 계(kingdoms)를 가로지름: 원핵생물에서 진핵생물로, 또는 문(phyla)을 가로지름: 무척추동물에서 척추동물로) 박테리아(또는 다른 침습성 미생물)를 사용하는 전달 시스템을 나타낸다.
침습성 미생물은 세포막, 예를 들어 진핵 세포막을 가로질러 세포질로 들어가는 것과 같이 표적 세포에 적어도 하나의 분자를 자연적으로 전달할 수 있는 미생물뿐만 아니라, 자연적 침습성이 아니며 침습성이 되도록 변형된, 예를 들어 유전자 변형된 미생물도 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 자연적 침습성이 아닌 미생물은 박테리아 또는 BTP를 "진입 인자" 또는 "세포질 표적화 인자"라고도 하는 "침습 인자"에 연결함으로써 침습성이 되도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "침습 인자"는, 인자, 예를 들어 비침습성 박테리아 또는 BTP에 의해 발현되는 경우, 박테리아 또는 BTP를 침습성으로 만드는 단백질 또는 단백질군이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "침습 인자"는 "세포질 표적화 유전자"에 의해 암호화된다. 침습성 미생물은 일반적으로 당업계의 기술분야, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20100189691 A1 및 US20100092438 A1, 및 Xiang, S. 외, Nature Biotechnology 24, 697-702(2006)에 기재되어 있다. 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
바람직한 실시형태에서, 침습성 미생물은, 본 출원의 실시예에 교시된 바와 같이 대장균이다. 그러나, 추가적인 미생물이 유전자 편집 카고의 전달을 위한 트랜스킹덤 전달 비이클로서 수행하도록 잠재적으로 조정될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 비독성 및 침습성 박테리아 및 BTP는 침습 특성을 나타내거나, 침습 특성을 나타내도록 변형되어, 다양한 메커니즘을 통해 숙주 세포에 진입할 수 있다. 일반적으로 전문화된 피소좀(fysosome) 내에서 박테리아 또는 BTP의 파괴를 초래하는, 전문적인 식세포에 의한 박테리아 또는 BTP의 흡수와는 대조적으로, 침습성 박테리아 또는 BTP 균주는 비식세포 숙주 세포에 침투하는 능력이 있다. 이러한 세포 내 박테리아의 자연 발생의 예는 예르시니아(Yersinia), 리케차(Rickettsia), 레지오넬라(Legionella), 브루셀라(Brucella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 콕시엘라(Coxiella), 클라미디아(Chlamydia), 나이세리아(Neisseria), 버크홀데리아(Burkholderia), 보데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 리스테리아(Listeria), 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 포도상구균(Staphylococcus), 연쇄상구균(Streptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 트레포네마(Treponema), 및 비브리오(Vibrio)이지만, 이러한 특성은 또한 침습 관련 유전자의 전달을 통해 프로바이오틱스를 포함한 대장균, 락토바실러스(Lactobacillus), 또는 비피더스균(Bifidobacteriae)과 같은 다른 박테리아 또는 BTP로 옮겨질 수 있다(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, CR. Acad. Sci. Paris 318, 1207(1995)). 트랜스킹덤 전달 비이클로 사용하기 위한 후보로서 추가적인 박테리아종을 평가할 때 고려하거나 다루어야할 요소에는 후보의 병원성 또는 그 결여, 표적 세포에 대한 후보 박테리아의 향성 또는 대안적으로는 박테리아가 표적 세포의 내부에 유전자 편집 카고를 전달하도록 조작될 수 있는 정도, 및 후보 박테리아가 숙주의 선천 면역을 촉발함으로써 제공할 수 있는 임의의 시너지값이 포함된다.
콜로니는 전부가 단일 모세포로부터 유래하는 미생물의 가시적인 덩어리로 정의되고, 따라서 콜로니는 유전적으로 모두 유사한 박테리아의 클론을 구성한다.
프로모터
유전자 발현 조절 요소 중, 프로모터가 중심적인 역할을 한다. 프로모터 분자를 따라, 전사 기계가 조립되고, 전사가 개시된다. 이 초기 단계는 종종 단백질 제조의 후속 단계에 관해 속도 제한적이다. 프로모터에서의 전사 개시는 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 특정 화합물의 존재 또는 외부 자극에 의해 유도되거나, 특정 전개 단계 동안 유전자를 발현하거나, 유전자를 본질적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 전이유전자의 전사는 암호화 서열을 상이한 조절 특징을 갖는 프로모터에 작용가능하게 연결함으로써 조절될 수 있다. 따라서, 프로모터와 같은 조절 요소는 형질전환 유기체의 가치를 향상시키는데 중추적인 역할을 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 작용가능하게 연결된 유전자의 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소 및 연관 시그마 인자와 활성화제 단백질과 같은 기타 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 나타낸다. 프로모터는 유전자의 게놈 복제의 5' 비번역 영역(5' UTR)으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 프로모터 분자는 인공적으로 및 합성적으로 제조되거나 변형된 DNA 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 작용가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현을 조절하기 위한 조절 요소로서 사용될 수 있다. 프로모터 자체는 작용가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 시스 요소 또는 인핸서 도메인과 같은 하위 요소를 함유할 수 있다.
원핵생물에서, 프로모터는 전사 개시 부위의 상류에서 -10 및 -35 위치의 2개의 짧은 서열로 구성된다. 시그마 인자는 프로모터에 대한RNAP 결합을 강화하는데 도움이 될 뿐만 아니라, RNAP가 전사할 유전자를 표적으로 하는데 도움이 된다. -10의 서열을 프리브노우 상자, 또는 -10 요소라고 부르며, 일반적으로 6뉴클레오타이드 TATAAT로 구성된다. 프리브노우 상자는 원핵생물에서 전사를 개시하는데 절대적으로 필요하다. -35의 다른 서열(-35 요소)은 일반적으로 6뉴클레오타이드 TTGACA로 구성된다. 그 존재는 매우 높은 전사율을 가능하게 한다. 상기 양 공통 서열은 평균적으로 보존되지만, 대부분의 프로모터에서 손상되지 않은 상태로 발견된다. 각 공통 서열의 6쌍의 염기쌍 중 평균 3쌍만이 임의의 제공된 프로모터에서 발견된다. 상기 프로모터 서열은 원핵생물 RNA 중합효소와 상호작용하는 시그마 70 단백질에 의해서만 인식된다는 점을 유의해야 한다. 원핵생물 RNA 중합효소와 다른 시그마 인자의 복합체는 완전히 다른 코어 프로모터 서열을 인식한다.
많은 조절 요소는 시스("시스 요소")에서 작용하고, DNA 주형에 대한 RNA 중합효소의 접근을 선택적으로 허용 또는 제한하거나, 전사 개시 부위에서의 이중 나선의 선택적 개방을 용이하게 하는 국소 형태를 생성함으로써, DNA 위상(topology)에 영향을 미치는 것으로 고려된다. 시스 요소는 특정 암호화 서열과 연관된 5' UTR 내에서 발생하며, 종종 프로모터 및 프로모터 조절 서열(유도성 요소) 내에서 발견된다. 시스 요소는 BLAST 프로그램을 사용하여 표적 서열 또는 표적 모티프로서 공지된 시스 요소를 사용함으로써 식별할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 암호화 서열과 연관된 5' UTR에서의 시스 작용 요소의 예로는 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
원핵생물에서, mRNA 번역은 UTG, GTG 또는 드문 경우 UUG로 개시하며, 일반적으로 리보솜 결합 부위의 특징적인 서열이 선행된다(RBS; Shine 및 Dalgamo, PNAS 71 : 1342-1346, 1974). RBS는 AG가 풍부하고 일반적으로 개시 코돈 전에 6bp 내지 12bp에서 발견된다. RBS는 박테리아에서 효과적인 mRNA 번역에 필요한 것으로 여겨진다.
게놈 DNA 서열 내의 프로모터 영역을 예측하는데는 적어도 두 가지 유형의 정보가 유용한다. 첫 번째로, 프로모터는 전사 인자 결합 부위 및 각종 공지된 프로모터 모티프와 같은 서열 "내용"에 기초하여 식별될 수 있다(Stormo, Genome Research 10: 394-397, 2000). 이러한 신호는 TATA 상자 및 전사 인자(transcription factor, TF)와 같은 프로모터와 연관된 부위를 식별하는 컴퓨터 프로그램에 의해 식별될 수 있다. 두 번째로, 프로모터는 "위치", 즉 공지되거나 의심되는 암호화 서열에 대한 근접성을 기반으로 식별될 수 있다(Stormo). 원핵생물 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 전사 또는 전사 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 대략 1 내지 500 염기쌍을 확장하는 영역 내에서 발견된다. 따라서, 프로모터 영역은 암호화 서열의 번역 개시 코돈 또는 전사 개시 부위를 위치시키고, 5' 방향으로 개시 코돈을 넘어 이동하여 프로모터 영역을 위치시킴으로써 식별될 수 있다.
프로모터 서열은 TATA 상자 및 기타 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프와 같은 일반적인 프로모터 서열의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 모티프는 공지된 모든 프로모터에서 항상 발견되는 것은 아니며, 모든 프로모터가 기능하는데 필요한 것도 아니지만, 존재하는 경우에는 DNA의 조각이 프로모터 서열인 것을 나타낸다.
프로모터의 활성 또는 강도는 mRNA tRNA, dsRNA, miRNA, rRNA 또는 단백질이 전이유전자를 함유하는 세포의 성장에서 특정 기간 동안 특이적으로 축적되는 양으로 측정될 수 있다. 상업적으로 중요한 단백질, 또는 상업적으로 중요한 화합물을 제조하는 반응을 촉진시키기 위한 단백질을 제조하기 위해서는 mRNA 제조 수준이 높을 필요가 있을 수 있다. 상업적으로 중요한 단백질에 대한 암호화 서열은 당업자에 의해 식별될 수 있고, mRNA 및 단백질의 제조 수준에 영향을 미치는 본 발명의 프로보터와 함께 사용될 수 있다. 프로모터의 활성 또는 강도는 EH한 세포가, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 화합물의 해독을 허용하는 유전자로 형질전환된 후에 선택 압력 하에서 성장할 때에 향상된 세포 성장 측면에서 측정될 수 있다.
하이브리드 프로모터는 하나의 프로모터의 -35 영역과 다른 프로모터의 -10 영역을 갖는 플라스미드 상의 박테리아 또는 발현 카세트를 조작함으로써 생성되는 프로모터로 정의된다.
선별 표지
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표지"는 그 발현 또는 결핍이 어떤 방식으로 스크리닝되거나 스코어링될 수 있는 임의의 전사가능한 폴리뉴클레오타이드 분자를 나타낸다. 본 발명의 실시에 사용하기 위한 표지 유전자는 β-글루쿠로니다아제(참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 번호 5,599,670에 기재된 GUS), 녹색 형광 단백질 및 그 변이체(미국 특허 번호 5,491,084 및 미국 특허 번호 6,146,826에 기재된 GFP, RFP 등, 모두 참조로 본 명세서에 포함됨), 또는 항생제 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는전사가능한 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
카나마이신(nptII), 하이그로마이신 B(aph IV), 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신(aad, spec/strep), 및 겐타마이신(aac3 및 aacC4)에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 것을 포함한 유용한 항생제 내성 표지가 특히 당업계에 공지되어 있다. 유리한 양성 선별 표지는 hisD(히스티디놀 탈수소효소)이다. 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)의 hisD 유전자는 히스티디놀 탈수소효소를 암호화하며, 이는 L-히스티디놀로의 2단계의 L-히스티디놀의 NAD' 의존 산화를 촉진한다. 히스티딘이 없고 히스티디놀을 함유하는 배지에서는 hisD 생성물을 발현하는 세포만이 생존한다.
용어 "선별가능한 표지"에는 형질전환된 세포를 식별하거나 선별하는 수단으로서 분비가 검출될 수 있는 분비가능한 표지를 암호화하는 유전자 또한 포함된다. 예로는 촉매적으로 검출될 수 있는 분비가능한 효소를 암호화하는 표지를 들 수 있다. 다른 가능한 선별가능한 표지 유전자는 당업자에게 명백할 것이다.
특정 실시형태에서, 선별가능한 표지의 사용은 hisD, 녹색 형광 단백질(GFP), 네오마이신 포스포트란스페라아제 II(nptII), 루시페라아제(LUX), 또는 항생제 내성 암호화 서열(aadA)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 선별가능한 표지는 카나마이신, 스트렙토마이신 및/또는 스펙티노마이신 내성 표지이다. 항생제 및 제초제에 대한 내성을 제공하는 암호화 서열의 예는, 예를 들어 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 출원 공개 20080305952 및 20080280361에서 찾을 수 있다.
세포 형질전환
용어 "형질전환"은 수용 숙주로의 핵산의 도입을 나타낸다. 용어 "숙주"는 원핵 세포, 특히 박테리아 세포를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환된"은 구성물과 같은 외래 폴리뉴클레오타이드 분자가 도입된 세포 또는 유기체를 나타낸다. 도입된 폴리뉴클레오타이드 분자는, 도입된 폴리뉴클레오타이드 분자가 후대에 의해 유전되거나 자가 복제 단위로서 세포질에 머무를 수 있도록 수용 세포 또는 유기체의 게놈 DNA로 통합될 수 있다. "유전자 이식된(transgenic)" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손을 포함한다. 용어 "유전자 이식된"은 하나 이상의 이종 다중핵산 분자를 함유하는 세포 또는 기타 유기체를 나타낸다.
이종 다중핵산 분자를 세포로 도입하는 방법이 많이 있다. 이 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환하는 단계, 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 이종 다중핵산 분자를 원핵생물로 도입하는 적합한 방법은 특히 동결-해동(열 충격), 삼중 교배(triparental mating), 및 전기천공법을 포함한다. 이러한 방법은 원핵생물 형질전환 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
키트
본 발명의 방법을 실행하기 위한 키트가 추가로 제공된다. "키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들어 본 발명의 유전자 편집 박테리아를 포함하는 임의의 제조물(예를 들어, 패키지 또는 용기)을 의미한다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉, 배포 또는 판매될 수 있다. 또한, 키트는, 키트와 그 사용 방법을 설명하는 패키지 삽입물을 포함한다. 키트 시약의 일부 또는 전부는 밀봉된 용기 또는 파우치와 같이 외부 환경으로부터 보호하는 용기 내에 제공될 수 있다.
본 발명의 화합물과 관련하여 용어 "투여" 및 그 변형(예를 들어, 화합물을 "투여하는")은 치료를 필요로 하는 대상체의 시스템 내로 화합물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 다른 활성제(예를 들어, AIV 백신 등)와의 조합으로 제공되는 경우, "투여" 및 그 변형은 각각 화합물 및 기타 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조성물"은 명시된 양으로 명시된 성분을 포함하는 생성물뿐만 아니라, 명시된 양의 명시된 성분의 조합으로부터 직간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 "치료적 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 찾는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 활성 화합물 또는 약제학적 작용제의 양을 의미한다. 바이러스 감염과 관련하여, 임상 질환, 임상 증상, 바이러스 역가 또는 대상체로부터의 바이러스 발산에 의해 입증되는 바와 같이, 또는 동물 사이의 전염을 예방 또는 감소시키는 능력에 의해 입증되는 바와 같이, 유효량은 질병에 걸리는 것을 예방하거나 질병의 중증도를 감소시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유효량은 임상적 질병 및/또는 증상의 시작을 지연시키거나 질병을 예방하기에 충분한 양이다. 일부 실시형태에서, 유효량은 바이러스 역가를 낮추고 그리고/또는 바이러스 발산을 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 이롭거나 원하는 임상 결과를 얻는 것을 나타낸다. 이롭거나 원하는 임상 결과는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 하나 이상의 증상의 완화, 바이러스 감염 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 바이러스 감염 상태, 바이러스 감염 확산(예를 들어, 발산)의 예방 또는 지연, 바이러스 감염 진행의 예방, 지연 또는 감속, 및/또는 체중 유지/체중 증가. 본 발명의 방법은 이러한 치료의 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
"약제학적으로 허용 가능한" 성분은 합리적인 이점/위험 비율에 상응하는 과도한 부작용(예를 들어, 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물에 사용하기에 적합한 성분이다.
"안전하고 유효한 양"은 본 발명의 방법으로 사용될 때 합리적인 이점/위험 비율에 상응하는 과도한 부작용(예를 들어, 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 원하는 치료 반응을 얻기에 충분한 성분의 양을 나타낸다.
전체 출원에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "a" 및 "an"은, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 그들이 "적어도 하나의", "적어도 첫 번째의", "하나 이상의" 또는 "복수의" 참조된 구성요소 또는 단계를 의미하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 용어 "세포(a cell)"는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 전부 또는 임의의 기타 조합"의 의미를 포함한다.
상술한 이점, 및 상술한 설명으로부터 명백해진 이점이 효율적으로 달성된다. 본 발명의 범위를 벗어나는 일 없이 상기 구성으로 소정의 변경이 이루어질 수 있기 때문에, 상술한 설명에 포함되거나 첨부된 도면에 도시된 모든 사항은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다.
본 출원에서 인용된 모든 참고 문헌은 본 명세서와 일치하지 않는 범위 내에서 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
상술한 이점, 및 상술한 설명으로부터 명백해진 이점은 효율적으로 달성되며, 본 발명의 범위를 벗어나는 일 없이 상기 구성으로 소정의 변경이 이루어질 수 있기 때문에, 포함된 모든 사항이 상술한 설명에서 또는 첨부된 도면에서 도시된 것은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로 해석되어야 한다. 또한,
하기 청구범위가 본 명세서에 기재된 본 발명의 모든 일반적이고 구체적인 특징, 및 언어의 문제로서 그 사이에 있다고 말할 수 있는 본 발명의 범위의 모든 진술을 포함하는 것으로 의도되는 것을 이해되어야 한다. 이제, 본 발명이 설명되었다.

Claims (121)

  1. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 CRISPR 연관(CRISPR associated, Cas) 효소, 핵 위치 신호(nuclear localization signal, NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 플라스미드가 암호화된 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 용이하게 하는 원핵생물(prokaryotic) 프로모터를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  2. 청구항 1에 있어서,
    플라스미드가 하나 이상의 CRISPR 연관(Cas) 효소를 암호화하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  3. 청구항 1에 있어서,
    암호화된 CRISPR 연관(Cas) 효소가 Cas9 유전자인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  4. 청구항 1에 있어서,
    진핵 세포가 동물 세포인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  5. 청구항 4에 있어서,
    진핵 세포가 분열 세포(dividing cell) 또는 비분열 세포(non-dividing cell)인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  6. 청구항 1에 있어서,
    침습 인자가 inv, hlyA, HA-1 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  7. 청구항 1에 있어서,
    박테리아가 리스테리아(Listeria), 예르시니아(Yersinia), 리케차(Rickettsia), 시겔라(Shigella), 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 레지오넬라(Legionella), 클라미디아(Chlamydia), 브루셀라(Brucella), 나이세리아(Neisseria), 버크홀데리아(Burkholderia), 보데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 콕시엘라(Coxiella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 포도상구균(Staphylococcus), 연쇄상구균(Streptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 비브리오(Vibrio), 트레포네마(Treponema), 락토바실러스(Lactobacillus), 및 비피더스균(Bifidobacteriae)으로 이루어지는 박테리아군으로부터의 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  8. 청구항 1에 있어서,
    박테리아가 대장균인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  9. 청구항 1에 있어서,
    박테리아가 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 대장균, 파상풍균(Clostridium tetani), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 버지니티스(Gardnerella vaginitis), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus), 장티푸스균(Salmonella typhi), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 나균(Mycobacterium leprae), 나종균(Mycobacterium lepromatosis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), B군 연쇄상구균(group B streptococci), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumonia), 장구균종(Enterococcus spp.), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 리스테리아, 예르시니아, 리케차, 시겔라, 대장균, 살모넬라, 레지오넬라, 클라미디아, 브루셀라, 나이세리아, 버크홀데리아, 보데텔라, 보렐리아, 콕시엘라, 마이코박테리움, 헬리코박터, 포도상구균, 연쇄상구균, 포르피로모나스, 비브리오, 트레포네마, 락토바실러스, 및 비피더스균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  10. 청구항 1에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  11. 청구항 1에 있어서,
    침습 인자가 인바신(invasin) 단백질 및/또는 리스테리오리신(listeriolysin) O(LLO) 단백질인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  12. 청구항 1에 있어서,
    스페이서 서열이 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화(hybridizing)할 수 있는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  13. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  14. 청구항 13에 있어서,
    진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 또는 하나 이상의 tracr 서열이 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  15. 청구항 13에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소가 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  16. 청구항 15에 있어서,
    박테리아가 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 플라스미드가 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열의 전사를 용이하게 하는 원핵생물 프로모터를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  17. 청구항 16에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  18. 청구항 15에 있어서,
    박테리아가 하나 이상의 스페이서 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 플라스미드가 하나 이상의 스페이서 서열의 전사를 용이하게 하는 원핵생물 프로모터를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  19. 청구항 18에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  20. 청구항 13에 있어서,
    암호화된 CRISPR 연관(Cas) 효소가 Cas9 유전자인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  21. 청구항 13에 있어서,
    염색체가 하나 이상의 CRISPR 연관(Cas) 효소를 암호화하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  22. 청구항 13에 있어서,
    침습 인자가 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  23. 청구항 13에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소 및 침습 인자가 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  24. 청구항 13에 있어서,
    침습 인자가 inv, hlyA, HA-1 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  25. 청구항 13에 있어서,
    박테리아가 리스테리아, 예르시니아, 리케차, 시겔라, 대장균, 살모넬라, 레지오넬라, 클라미디아, 브루셀라, 나이세리아, 버크홀데리아, 보데텔라, 보렐리아, 콕시엘라, 마이코박테리움, 헬리코박터, 포도상구균, 연쇄상구균, 포르피로모나스, 비브리오, 트레포네마, 락토바실러스, 및 비피더스균으로 이루어지는 박테리아군으로부터의 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  26. 청구항 13에 있어서,
    박테리아가 대장균인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  27. 청구항 13에 있어서,
    박테리아가 클로스트리듐 디피실, 대장균, 파상풍균, 헬리코박터 파일로리, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 가드네렐라 버지니티스, 포르피로모나스 진지발리스, 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스, 리스테리아 모노사이토제네스, 황색포도상구균, 캄필로박터 제주니, 비브리오 패혈증균, 장티푸스균, 클로스트리듐 보툴리늄, 결핵균, 나균, 나종균, 코리네박테리움 디프테리아, 폐렴간균, 아시네토박터 바우마니, 스트렙토코커스 뮤탄스, B군 연쇄상구균, 황색포도상구균, 스트렙토코커스 아갈락티아, 폐렴연쇄상구균, 장구균종, 엔테로코커스 패칼리스, 리스테리아, 예르시니아, 리케차, 시겔라, 대장균, 살모넬라, 레지오넬라, 클라미디아, 브루셀라, 나이세리아, 버크홀데리아, 보데텔라, 보렐리아, 콕시엘라, 마이코박테리움, 헬리코박터, 포도상구균, 연쇄상구균, 포르피로모나스, 비브리오, 트레포네마, 락토바실러스, 및 비피더스균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  28. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  29. 청구항 28에 있어서,
    플라스미드가 프로모터를 갖고, 프로모터가 진핵생물(eukaryotic) 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  30. 청구항 29에 있어서,
    진핵생물 프로모터가 CMV, EFla, CAG, PGK, TRE, 또는 U6 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  31. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 플라스미드가 암호화된 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 용이하게 하는 원핵생물 프로모터를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  32. 청구항 31에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  33. 청구항 31에 있어서,
    침습 인자가 인바신 단백질 및/또는 리스테리오리신 O(LLO) 단백질인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  34. 청구항 31에 있어서,
    스페이서 서열이 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  35. 청구항 31에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소가 핵 위치 서열(NLS)을 갖는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  36. 청구항 31에 있어서,
    플라스미드가 하나 이상의 CRISPR 연관(Cas) 효소를 암호화하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  37. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 표적 진핵 세포 게놈을 편집하는 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 발현하도록 조작된, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  38. 청구항 37에 있어서,
    유전자 편집 시스템이 CRISPR/Cas, 이펙터 뉴클레아제(effector nuclease), Tal 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 전사 활성화제 유사 이펙터(transcription activator-like effectors, TALEs), ARC 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease), 아르고너트 시스템 기반 뉴클레아제, TtAgo 뉴클레아제 시스템 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  39. 청구항 37에 있어서,
    침습 인자 및/또는 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소가 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  40. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  41. 청구항 40에 있어서,
    프로모터가 원핵생물 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  42. 청구항 41에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  43. 청구항 40에 있어서,
    유전자 편집 시스템이 뉴클레아제 기반 유전자 편집 시스템인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  44. 청구항 43에 있어서,
    뉴클레아제 기반 유전자 편집 시스템이 CRISPR/Cas, TALENs, 및 징크 핑거 뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  45. 청구항 40에 있어서,
    진핵 세포가 동물 세포인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  46. 청구항 40에 있어서,
    진핵 세포가 분열 세포 또는 비분열 세포인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  47. 청구항 40에 있어서,
    유전자 편집 시스템이 CRISPR/Cas, 이펙터 뉴클레아제, Tal 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 전사 활성화제 유사 이펙터(TALEs), ARC 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 아르고너트 시스템 기반 뉴클레아제, TtAgo 뉴클레아제 시스템 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  48. 청구항 40에 있어서,
    플라스미드가 핵 위치 신호전달 서열을 암호화하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  49. 청구항 40에 있어서,
    침습 인자가 inv, hlyA, HA-1 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  50. 청구항 40에 있어서,
    박테리아가 리스테리아, 예르시니아, 리케차, 시겔라, 대장균, 살모넬라, 레지오넬라, 클라미디아, 브루셀라, 나이세리아, 버크홀데리아, 보데텔라, 보렐리아, 콕시엘라, 마이코박테리움, 헬리코박터, 포도상구균, 연쇄상구균, 포르피로모나스, 비브리오, 트레포네마, 락토바실러스, 및 비피더스균으로 이루어지는 박테리아군으로부터의 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  51. 청구항 40에 있어서,
    박테리아가 대장균인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  52. 청구항 40에 있어서,
    박테리아가 클로스트리듐 디피실, 대장균, 파상풍균, 헬리코박터 파일로리, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 가드네렐라 버지니티스, 포르피로모나스 진지발리스, 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스, 리스테리아 모노사이토제네스, 황색포도상구균, 캄필로박터 제주니, 비브리오 패혈증균, 장티푸스균, 클로스트리듐 보툴리늄, 결핵균, 나균, 나종균, 코리네박테리움 디프테리아, 폐렴간균, 아시네토박터 바우마니, 스트렙토코커스 뮤탄스, 황색포도상구균을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아닌 B군 연쇄상구균, 황색포도상구균, 스트렙토코커스 아갈락티아, 폐렴연쇄상구균, 엔테로코커스 패칼리스를 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아닌 장구균종, 리스테리아, 예르시니아, 리케차, 시겔라, 대장균, 살모넬라, 레지오넬라, 클라미디아, 브루셀라, 나이세리아, 버크홀데리아, 보데텔라, 보렐리아, 콕시엘라, 마이코박테리움, 헬리코박터, 포도상구균, 연쇄상구균, 포르피로모나스, 비브리오, 트레포네마, 락토바실러스, 및 비피더스균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  53. 청구항 1 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    의약(medicine) 또는 치료에 사용하기 위한, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  54. 청구항 1 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  55. 청구항 1 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    연구 응용에 사용하기 위한, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  56. 청구항 1 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo), 및/또는 생체 외(ex vivo)에서 사용하기 위한, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  57. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 및 하나 이상의 tracr 서열을 발현하도록 조작된 박테리아; 및
    하나 이상의 스페이서 서열 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 플라스미드
    를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  58. 청구항 57에 있어서,
    프로모터가 원핵생물 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  59. 청구항 58에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  60. 청구항 57에 있어서,
    침습 인자가 inv, hlyA, HA-1 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  61. 청구항 57에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소 및/또는 침습 인자가 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  62. 청구항 57에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소, 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 및 하나 이상의 tracr 서열이 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  63. 청구항 57에 있어서,
    플라스미드가 박테리아와 별도로 포장되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  64. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 및 하나 이상의 tracr 서열을 발현하도록 조작된 박테리아; 및
    하나 이상의 스페이서 서열 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 플라스미드
    를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  65. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 및 하나 이상의 tracr 서열을 발현하도록 조작된 박테리아; 및
    하나 이상의 스페이서 서열 및 스페이서 서열의 전사를 제어하는 프로모터에 대한 삽입 부위를 갖는 플라스미드
    를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  66. 청구항 65에 있어서,
    프로모터가 원핵생물 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  67. 청구항 66에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  68. 청구항 65에 있어서,
    플라스미드가 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 또는 하나 이상의 tracr 서열을 더 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  69. 청구항 65에 있어서,
    침습 인자가 inv, hlyA, HA-1 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  70. 청구항 65에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소 및/또는 침습 인자가 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  71. 청구항 65에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소, 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 및 하나 이상의 tracr 서열이 박테리아의 염색체로부터 발현되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  72. 청구항 65에 있어서,
    플라스미드가 박테리아와 별도로 포장됨으로써, 별도의 포장이 플라스미드 내로의 유전자 편집 서열의 복제를 용이하게 하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  73. 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트로서,
    박테리아가 박테리아의 염색체로부터 유전자 편집 시스템 또는 유전자 편집 시스템의 일부를 발현하도록 조작된, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  74. 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아로서, 침습 인자가 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는, 박테리아; 및
    유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터 또는 프로모터들을 암호화하는 플라스미드
    를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  75. 청구항 74에 있어서,
    플라스미드가 박테리아와 별도로 포장됨으로써, 별도의 포장이 플라스미드 내로의 유전자 편집 서열의 복제를 용이하게 하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  76. 청구항 74에 있어서,
    유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터 또는 프로모터들이 진핵 세포가 아닌 원핵 세포에서 활성인 프로모터(들)인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  77. 비병원성 박테리아; 및
    침습 인자, 유전자 편집 시스템, 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 하나 이상의 플라스미드
    를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  78. 청구항 77에 있어서,
    플라스미드가 (a) 하나 이상의 CRISPR 연관(Cas) 효소, (b) 선택적으로 하나 이상의 핵 위치 신호전달 서열, (c) 하나 이상의 tracr 서열, 및 (i) 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역 및 (ii) 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 스페이서 서열을 포함하는 (d) 하나 이상의 CRISPR RNAs(crRNA)를 암호화하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아의 제조용 키트.
  79. 비병원성 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 원핵생물 발현 카세트를 갖는 플라스미드를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  80. 청구항 79에 있어서,
    침습 인자가 박테리아의 염색체 상의 서열에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  81. 청구항 79에 있어서,
    침습 인자가 inv 유전자, hlyA 유전자, HA-1 유전자 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  82. 청구항 1 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 기재된 박테리아를 제공하는 단계; 및
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서 표적 진핵 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고(cargo)를 전달하는 방법.
  83. 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 플라스미드가 암호화된 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 용이하게 하는 원핵생물 프로모터를 포함하는, 단계; 및
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서 표적 진핵 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  84. 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 플라스미드가 암호화된 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 용이하게 하는 프로모터를 포함하는, 단계; 및
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서 표적 진핵 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  85. 청구항 84에 있어서,
    침습 인자가 inv 유전자, hlyA 유전자, HA-1 유전자 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 암호화되는, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  86. 청구항 84에 있어서,
    플라스미드가 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 스페이서 서열 및 선택적으로 하나 이상의 NLS를 암호화하는, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  87. 청구항 84에 있어서,
    프로모터가 원핵생물 프로모터 및 진핵생물 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  88. 청구항 87에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  89. 청구항 87에 있어서,
    진핵생물 프로모터가 CMV, EFla, CAG, PGK, TRE, 또는 U6로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  90. 청구항 87에 있어서,
    표적 세포가 시험관 내에서 접촉되고, 표적 세포가 1차 세포(primary cell), 불멸 세포(immortalized cell), 분열 세포, 비분열 세포, 및 조혈 줄기/전구 세포(hematopoietic stem/progenitor cell)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포인, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  91. 청구항 87에 있어서,
    방법이, 시험관 내 선별 라이브러리(selection library), 불일치 감지 뉴클레아제 분석(mismatch-detection nuclease assay), 고처리량 프로파일링 분석(high-throughput profiling assay), 진단, 및 관련 차세대 서열결정 활동(related next-generation sequencing activities)과 함께 사용하기 위한 질병 연구, 특정 유전자 변형의 병인(pathogenesis), 감염원, 유전 질환, 기능성 게놈 스크리닝, 염색체 채색, 질병 모델 구축(암 모델 포함)을 포함하는 유전자 편집 응용에 적용되는, 표적 진핵 세포에 유전자 편집 카고를 전달하는 방법.
  92. 살아있는 시스템으로부터 진핵 세포를 분리하는 단계;
    박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 발현하도록 조작된, 단계; 및
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 진핵 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계
    를 포함하는, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  93. 청구항 92에 있어서,
    편집된 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계를 더 포함하는, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  94. 살아있는 시스템으로부터 진핵 세포를 분리하는 단계;
    비병원성 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는, 단계; 및
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 진핵 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계
    를 포함하는, 살아있는 시스템 및 박테리아 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  95. 청구항 94에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  96. 청구항 94에 있어서,
    침습 인자가 인바신 단백질 및/또는 리스테리오리신 O(LLO) 단백질인, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  97. 청구항 94에 있어서,
    유전자 편집 시스템이, CRISPR/Cas, TALENs, 및 징크 핑거 뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템인 뉴클레아제 기반 유전자 편집 시스템인, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  98. 청구항 94에 있어서,
    박테리아가, CRISPR 연관(Cas) 효소 및 단일 안내 RNA(single guide RNA, sgRNA)를 갖는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 살아있는 시스템 및 박테리아 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  99. 청구항 94에 있어서,
    편집된 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계를 더 포함하는, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  100. 청구항 94에 있어서,
    편집된 세포가 눈, 근육, 폐, 뇌, 비강, 위장관, 심장, 피부, 구강, 생식기 조직, 혈액 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표적 조직으로 되돌아가는, 살아있는 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  101. 청구항 94에 있어서,
    세포가, 그것이 분리된 것과 동일한 유기체 또는 동일한 종 내로 도입되는, 살아있는 시스템 및 박테리아 시스템으로부터 분리된 진핵 세포의 생체 외 게놈 편집 및 변형 방법.
  102. 살아있는 시스템으로부터 T 세포를 분리하는 단계;
    비병원성 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자, CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 발현하도록 조작된, 단계;
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 T 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계; 및
    편집된 T 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) T 세포 치료 방법.
  103. 살아있는 시스템으로부터 T 세포를 분리하는 단계;
    비병원성 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 플라스미드를 포함하여, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계;
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 T 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계; 및
    편집된 T 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료 방법.
  104. 살아있는 시스템으로부터 T 세포를 분리하는 단계;
    비병원성 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 발현하도록 조작되었고, 유전자 편집 시스템이 특정 종양 항원을 표적으로 하는 인공 수용체를 발현하도록 편집하는, 단계;
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 T 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계; 및
    편집된 T 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료 방법.
  105. 살아있는 시스템으로부터 T 세포를 분리하는 단계;
    비병원성 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 박테리아가 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 암호화하는 플라스미드를 포함하고, 유전자 편집 시스템이 특정 종양 항원을 표적으로 하는 인공 수용체를 발현하도록 편집하는, 단계;
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 T 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계; 및
    편집된 T 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료 방법.
  106. 살아있는 시스템으로부터 T 세포를 분리하는 단계;
    비병원성 박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작되었고, 플라스미드가 CRISPR 연관(Cas) 효소 및 단일 안내 RNA(sgRNA)를 갖는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하고, 플라스미드가 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 특정 종양 항원을 표적으로 하는 인공 수용체를 발현하도록 편집하기 위해 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 갖는, 단계;
    표적 세포 내로 비병원성 박테리아를 진입시키는데 효과적인 조건 하에서, 분리된 T 세포를 제공된 박테리아와 접촉시키는 단계로서, 이에 따라 방법이, 분리된 진핵 세포 게놈 상의 관심 영역의 삽입, 삭제 또는 교체, 및 생체 외의 표적 DNA의 변형을 용이하게 하는, 단계; 및
    편집된 T 세포를 살아있는 다세포 유기체 내로 재도입하는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료 방법.
  107. 하나 이상의 원핵생물 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 원핵생물 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계로서, 플라스미드가 하나 이상의 스페이서 서열에 대한 삽입 부위를 포함하는, 단계;
    제공된 플라스미드 내로 스페이서 서열을 삽입하는 단계;
    박테리아를 제공하는 단계로서, 박테리아가 박테리아의 염색체 상의 서열로부터 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된, 단계; 및
    하나 이상의 스페이서 서열을 포함하는 플라스미드로 박테리아를 형질전환하는 단계
    를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  108. 청구항 107에 있어서,
    제공된 플라스미드가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 또는 하나 이상의 tracr 서열을 더 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  109. 청구항 107에 있어서,
    제공된 박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 또는 하나 이상의 tracr 서열을 더 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  110. 청구항 107에 있어서,
    제공된 박테리아가 CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 또는 하나 이상의 tracr 서열을 더 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  111. 청구항 107에 있어서,
    CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 또는 하나 이상의 tracr 서열이 박테리아의 염색체 상에서 암호화되는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  112. 청구항 107에 있어서,
    박테리아가 박테리아의 염색체 상의 서열로부터 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  113. 청구항 112에 있어서,
    침습 인자가 인바신 단백질 및/또는 리스테리오리신 O(LLO) 단백질인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  114. 청구항 107에 있어서,
    박테리아가 리스테리아, 예르시니아, 리케차, 시겔라, 대장균, 살모넬라, 레지오넬라, 클라미디아, 브루셀라, 나이세리아, 버크홀데리아, 보데텔라, 보렐리아, 콕시엘라, 마이코박테리움, 헬리코박터, 포도상구균, 연쇄상구균, 포르피로모나스, 비브리오, 트레포네마, 락토바실러스, 및 비피더스균으로 이루어지는 박테리아군으로부터의 박테리아인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 비병원성 박테리아의 제조 방법.
  115. CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드로서,
    플라스미드가 암호화된 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 용이하게 하는 원핵생물 프로모터를 포함하는, 플라스미드.
  116. 청구항 115에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 플라스미드.
  117. CRISPR 연관(Cas) 효소, 핵 위치 신호(NLS), 하나 이상의 CRISPR 직접 반복 영역, 하나 이상의 스페이서 서열에 대한 삽입 부위, 및 하나 이상의 tracr 서열을 암호화하는 플라스미드로서,
    플라스미드가 암호화된 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 용이하게 하는 원핵생물 프로모터를 포함하는, 플라스미드.
  118. 청구항 117에 있어서,
    원핵생물 프로모터가 T7, lacUV5, gapA, T5, recA, Ptac, Patac, pAl, lac, Sp6, araBad, trp, 또는 하이브리드 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로모터인, 플라스미드.
  119. 진핵 세포 게놈을 조절 또는 변형하기 위한 박테리아를 포함하는 조성물로서,
    박테리아가 하나 이상의 원핵생물 프로모터를 갖는 하나 이상의 플라스미드, 및 하나 이상의 유전자 편집 시스템 또는 유전자 편집 시스템의 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 원핵생물 발현 카세트로 구성되고, 박테리아가 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된, 조성물.
  120. 청구항 1에 있어서,
    진핵 세포가 식물 세포인, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
  121. 진핵 세포 내로의 박테리아의 진입을 용이하게 하는 하나 이상의 침습 인자를 발현하도록 조작된 박테리아를 포함하는, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아로서,
    박테리아가 진핵 세포 내부에 존재하는 표적 원핵 세포 게놈을 편집하는 유전자 편집 시스템 및 유전자 편집 시스템의 전사를 제어하는 프로모터를 발현하도록 조작된, 진핵 세포에 유전자 편집 시스템을 전달하기 위한 박테리아.
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