CN109943514A - 复制系统及其在基因表达中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供获得目的基因表达产物的方法，包括在宿主菌中表达重组RNA分子，并在存在噬菌体RNA复制酶以及适合于目的基因表达的条件下培养所述宿主菌；其中所述重组RNA分子包含可被噬菌体RNA复制酶识别并进行RNA复制过程的5’复制识别序列和3’复制识别序列以及位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目的基因序列。本发明还提供可表达该重组RNA分子的重组菌。本发明的方法可以从直接增加RNA表达量的层面对工程菌进行改造，以促进目的基因的表达。

Description

复制系统及其在基因表达中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及含有可复制的RNA序列在复制酶作用下增强靶基 因信使RNA及蛋白质含量中的用途。

背景技术

微生物发酵是现代工业生产中制备食品药品的重要途径，其依赖于经过人工改造的工业微生物。 对于很多天然微生物不能生产或者生产不佳的代谢产物，可以利用代谢工程在底盘菌株中引入新的代 谢通路(Steen,E.J.,Kang,Y.,Bokinsky,G.,Hu,Z.,Schiremer,A.,McClure,A.,Del Cardayre,S.B.,and Keasling,J.D.(2010).Microbialproduction of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass.Nature,463,559.)和调节已有代谢通路(Varma,A.,and Palsson,B.O.(1994).MetabolicFlux Balancing: Basic Concepts,Scientific and Practical Use.Bio/technology,12.)，从而使目的产物得到表达或使其表 达产量得到显著提升。因此，构造能高效且稳定表达外源基因的工业菌株是微生物生产的核心步骤。

在过去的研究中，研究者们主要从以下四个层面对外源目的基因进行调节：DNA层面、转录层 面、RNA稳定性层面及翻译层面。DNA层面主要包括目的基因表达形式的选择，分别涉及基因组表 达和质粒表达。基因组表达相对稳定，突变及丢失情况低，但基因组的低拷贝数限制了其表达，同时 多个相同序列的插入会引发自发基因组重排问题；质粒系统表达能获得更高的目的基因拷贝数，但在 生产培养中存在着质粒易丢失(Smith,M.A.,andBidochka,M.J.(1998).Bacterial fitness and plasmid loss: the importance ofculture conditions and plasmid size.Canadian journal of microbiology,44,351-355.)、 承载量有限、抗性选择带来生长压力等问题。通常来讲，基因组作为目的基因的表达载体更为合适， 但由于表达量瓶颈所限工业生产仍以质粒表达为主，如何提升基因组上的目的基因表达量是目前亟待 解决的问题之一。转录层面主要包括对目的基因使用的启动子进行改造，目前已有大量研究，为菌种 改造提供了大量不同特性的启动子。RNA稳定性层面主要包括对信使RNA序列进行设计，从而减弱 其降解速率(Carrier,T.A.,andKeasling,J.D.(1997).Controlling messenger RNA stability in bacteria:strategies for engineering gene expression.Biotechnology progress,13,699-708.)，目前研究相对较少。 翻译层面主要包括对目的基因本身密码子使用及其5’序列(包括核糖体结合位点等)的改造，使之更 适合在工业菌中表达。综上，目前已有的研究从不同层面对工程菌进行了相应的优化改造，也取得了 长足的进步，但仍存在一些问题亟待解决。

在中心法则中(DNA-RNA-蛋白质)，RNA在遗传信息流中起着中间体的作用，但由于RNA是 唯一一种既能编码遗传信息又具有催化活性的分子，因此RNA在进化中起着更为关键的作用，以 RNA为模板合成RNA对于生物进化以及大量的RNA病毒都有着重要的意义。在不同的RNA病毒 中，除了逆转录病毒，其余自身遗传物质的扩增均完全由RNA复制过程进行，其中，可复制的RNA 病毒广泛存在于噬菌体、真菌病毒、植物病毒与动物病毒中。相对于真核RNA病毒，RNA噬菌体具 有复制过程相对简单、基因组较小等优点，同时考虑到我们的目标宿主为细菌，因此我们选择本身能 在细菌中进行复制的RNA病毒。目前被发现的RNA病毒共有3属40种(Ackermann,H.W.(2003). Bacteriophage observations andevolution.Research in Microbiology,154,245-251.)，一个属为双链 RNA病毒，两个属为单链RNA病毒。

Qβ噬菌体是一种正链噬菌体，其本身基因为正链(Kashiwagi,A.,and Yomo,T.(2011).Ongoing phenotypic and genomic changes in experimental coevolution ofRNA bacteriophage Qβand Escherichia coli. PLoS genetics,7,e1002188.)，Qβ噬菌体的复制过程依赖于Qβ噬菌体复制酶，同时研究发现Qβ噬 菌体的复制酶除了复制自身完整基因组外，可以在体外复制多种不同长度不同序列的RNA。

对于改造病毒运用于宿主目前已有一定的研究。具体的应用实例包括使用RNA复制病毒作为免 疫原(Garcia-Sastre,A.(2000).Transfectant influenza viruses asantigen delivery vectors.Advances in virus research,55,579-597.)、使用病毒源RNA复制序列作为瞬时载体表达目的蛋白(Ying,H.,Zaks,T.Z., Wang,R.F.,Irvine,K.R.,Kammula,U.S.,Marincola,F.M.,Leitner,W.W.,and Restifo,N.P.(1999).Cancertherapy using a self-replicating RNA vaccine.Nature medicine,5,823.)、使用体外提纯的RNA复制酶进 行体外序列扩增或RNA直接测序、使用RNA复制系统构建最小人工生命体(Ichihashi,N.,Usui,K., Kazuta,Y.,Sunami,T.,Mastsuura,T.,and Yomo,T.(2013).Darwinian evolution in a translation-coupled 等。目前为止， 虽然已有部分研究将RNA复制相关过程进行工程化改造，但整体对其的工具化应用还处于比较初步 的阶段。无论是体外提纯RNA复制酶进行扩增测序方面的应用，还是真核系统中RNA病毒进行免疫 方面的应用，均存在对应的缺陷。

传统研究中主要把RNA复制子作为目的基因唯一载体，但RNA复制速度与复制子稳定性之间并 不能实现很好的平衡，对于RNA复制子的长期存留不利。目前尚没有研究明确提出将RNA复制过程 作为稳定的载体对目的基因表达的研究，同时也并无在原核系统中使用RNA复制相关工具的研究。

由于噬菌体与细菌之间的竞争关系由来已久，可以预见到细菌中或许会产生某种机制抵抗噬菌体 的入侵。例如Cas系统(Sorek,R.,Kunin,V.,and Hugenholtz,P.(2008).CRISPR--a widespread system that provides acquired resistance against phagesin bacteria and archaea.Nature reviews.Microbiology,6, 181.)就是一种广泛在细菌中存在的抵抗噬菌体(主要是DNA噬菌体)及外源DNA片段侵入的系 统。Rnc基因作为一种双链RNA酶，其在细胞中可以切割双链RNA。由于细菌中本身几乎不含双链 RNA，Rnc基因本身可能作为一种抗RNA噬菌体侵染的机制存在，帮助细菌抵抗RNA噬菌体的感 染。同时在哺乳动物细胞中双链RNA酶也同样承担着一定的抵抗双链RNA(病毒RNA)入侵的功 能(Aguado,L.C.,Schmid,S.,May,J.,Sabin,L.R.,Panis,M.,Blanco-Melo,D.,Shim,J.V.,Sachs,D., Cherry,S.,Simon,A.E.,et al.(2017).RNase III nucleases from diversekingdoms serve as antiviral effectors.Nature,547,114-+)，同时Yin等人也证明敲除Rnc的大肠杆菌菌株(Yin,G.,Sun,Z.,Liu, N.,Zhang,L.,Song,Y.Z.,Zhu C.X.,and WenF.J.(2009).Production of double-stranded RNA for interference with TMVinfection utilizing a bacterial prokaryotic expression system.Appliedmicrobiology and biotechnology,84,323-333.)更适合生产双链RNA。

发明内容

本发明一方面提供获得目的基因表达产物的方法，包括：在宿主菌中稳定表达重组RNA分子， 并在存在噬菌体RNA复制酶以及适合于目的基因表达的条件下培养所述宿主菌；

其中所述重组RNA分子包含：(1)5’复制识别序列和3’复制识别序列，其可被噬菌体RNA复 制酶识别并进行RNA复制过程；和(2)位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目的基因序 列。

在一些实施方案中，5’复制识别序列和3’复制识别序列包含RNA噬菌体的5’非翻译区和3’非翻 译区，或人工设计的5’复制识别序列和3’复制识别序列，或由其组成。

在一些实施方案中，5’复制识别序列和3’复制识别序列包含Qβ噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译 区，MS2噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区，fr噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区或RQ135的5’非 翻译区和3’非翻译区，或由其组成。

在一些实施方案中，还在宿主菌中稳定表达RNA复制酶。

在一些实施方案中，所述重组RNA分子包含表达所述噬菌体RNA复制酶的序列。

在一些实施方案中，所述噬菌体RNA复制酶为Qβ噬菌体RNA复制酶、MS2噬菌体RNA复制 酶或fr噬菌体RNA复制酶。

在一些实施方案中，所述重组RNA分子包含可形成发卡结构的序列；优选地，所述序列中含有 多个G和U，这些G和U可以相互配对使得该序列形成发卡结构，而与之互补的负链序列上不产生 发卡结构。

在一些实施方案中，所述重组RNA分子包含位于5’复制识别序列上游或3’复制识别序列下游的 可切割序列。

在一些实施方案中，位于5’复制识别序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

在一些实施方案中，位于3’复制识别序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

在一些实施方案中，所述目的基因编码蛋白；优选地，所述目的基因编码的蛋白为酶。

在一些实施方案中，所述目的基因为选自由荧光蛋白BFP编码基因，荧光蛋白GFP编码基因， 氯霉素编码基因CmR、半乳糖激酶编码基因GALK、β-半乳糖苷酶编码基因LacZ、5-氨基乙酰丙酸 合成基因Hem1构成的组的一个基因或两个或更多个基因的组合。

在一些实施方案中，所述宿主菌为大肠杆菌、乳酸菌或Lb.caseil Zhang。

在一些实施方案中，所述宿主菌中Rnc基因被敲除。

在一些实施方案中，由宿主菌的基因组稳定表达上述重组RNA分子。

在一些实施方案中，由存在于宿主菌中的表达质粒稳定表达上述重组RNA分子。

在一些实施方案中，将可以转录出上述重组RNA分子的DNA分子导入到宿主菌中，使得宿主菌 表达所述重组RNA分子。

本发明的另一方面提供重组菌，所述重组菌可以于基因组上稳定表达重组RNA分子，其中所述 重组RNA分子包括：(1)5’复制识别序列和3’复制识别序列，其可被噬菌体RNA复制酶识别并进 行RNA复制过程；和(2)位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目的基因序列。

在一些实施方案中，5’复制识别序列和3’复制识别序列包含RNA噬菌体的5’非翻译区和3’非翻 译区，或人工设计的5’复制识别序列和3’复制识别序列，或由其组成。

在一些实施方案中，5’复制识别序列和3’复制识别序列包含Qβ噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译 区，MS2噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区，fr噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区或RQ135的5’非 翻译区和3’非翻译区，或由其组成。

在一些实施方案中，所述重组菌还稳定表达所述噬菌体RNA复制酶。

在一些实施方案中，所述重组RNA分子包含括表达所述噬菌体RNA复制酶的序列。

在一些实施方案中，所述噬菌体RNA复制酶为Qβ噬菌体RNA复制酶、MS2噬菌体RNA复制 酶或fr噬菌体RNA复制酶。

在一些实施方案中，所述重组RNA分子包含可形成发卡结构的序列；优选地，所述序列中含有 多个G和U，这些G和U可以相互配对使得该序列形成发卡结构，而与之互补的负链序列上不产生 发卡结构。

在一些实施方案中，所述重组RNA分子包含位于5’复制识别序列上游或3’复制识别序列下游的 可切割序列。

在一些实施方案中，位于5’复制识别序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

在一些实施方案中，位于3’复制识别序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

在一些实施方案中，所述目的基因编码蛋白；优选地，所述目的基因编码的蛋白为酶。

在一些实施方案中，所述目的基因为选自由荧光蛋白BFP编码基因，荧光蛋白GFP编码基因， 氯霉素编码基因CmR、半乳糖激酶编码基因GALK、β-半乳糖苷酶编码基因LacZ、5-氨基乙酰丙酸 合成基因Hem1构成的组的一个基因或两个或更多个基因的组合。

在一些实施方案中，所述重组菌为大肠杆菌、乳酸菌或Lb.caseil Zhang。

在一些实施方案中，所述重组菌中Rnc基因被敲除。

在一些实施方案中，由所述重组菌的基因组稳定表达上述重组RNA分子。

在一些实施方案中，由存在于所述重组菌中表达质粒稳定表达上述重组RNA分子。

在一些实施方案中，所述重组菌通过向宿主菌中导入可以转录上述重组RNA分子的DNA分子而 获得。

附图说明

图1显示了复制酶与复制序列分别表达时的复制效率。(A)复制序列与复制酶分别表达示意图； (B)复制序列与复制酶分别表达时复制系统对蓝色荧光报告基因的蛋白表达水平效果。

图2显示了优选的RNA复制系统的建立及其工作效果。(A)优选的复制系统示意图；(B)复制系 统对荧光蛋白的促进作用，证明优选的复制系统在不同诱导剂浓度下对目的基因BFP蛋白含量的增 强；(C)复制系统RNA表达情况(使用qRT-PCR测量)，证明优选的复制系统在不同诱导剂浓度下 对复制系统内序列的RNA表达增强作用，其中使用针对复制酶基因的引物进行检测。

图3是复制系统表达质粒RRS-T7M5-BFP和对照复制系统表达质粒RRS突变-T7M5-BFP的质粒 图谱。

图4显示了使用tRNA或HDV核酶对RNA复制系统的5’端或3’端进行切割，以去复制系统的其 余序列对其可能的影响。(A-C)使用HDV核酶对复制系统RRS-T7M5-BFP的3’下游对RNA分子进行 切割，仅保留复制系统的3’接头序列(A)，及其对复制系统促进蛋白含量功能的影响(B，C)；(D-G)使 用转运RNA序列对复制系统的5’上游对RNA分子进行切割，仅保留复制系统的5’接头序列(D)，及 其对复制系统促进蛋白含量功能的影响(E-G)。

图5显示了使用HDV核酶对复制系统正负链进行切割。(A)HDV核酶对复制系统正链进行切割 的示意图。(B)中断正链对复制系统促进蛋白表达功能的影响，证明了复制过程需要复制序列的完整 性。(C)负链表达目的基因验证复制过程发生的示意图。(D)通过检测反义互补的目的基因表达情况验 证复制过程中负链的产生，证明了复制过程的发生并且产生了负链。(E)中断负链后复制系统工作示 意图。(F)中断负链对复制系统促进蛋白表达功能的影响，证明了负链对复制过程的重要性。

图6是HDV插入至RRS-T7M5-BFP中BFP和复制酶之间的质粒的图谱。

图7显示了复制系统在不同启动子及不同表达载体下的工作效果。(A，B)复制系统在不同启动子 控制下的工作效果，在两种组成型启动子下复制系统对促进蛋白表达功能的影响(A)，及在阿拉伯糖 诱导启动子下复制系统对促进蛋白表达功能的影响(B)。(C)复制系统在不同表达载体下的工作效果， 证明复制系统在基因组表达或质粒表达时均能发挥作用。

图8显示了复制系统在不同目的菌株中的工作效果。(A)复制系统在不同类型大肠杆菌中的工作 效果，证明复制系统对于不同的大肠杆菌目的菌株均能发挥作用。(B)复制系统在乳酸菌Lb.caseil Zhang中的工作效果，证明复制系统在革兰氏阳性菌种同样能发挥作用。

图9显示了RNA复制抑制基因Rnc敲除对系统工作的必要性。(A)复制系统在不同强度的类T7 启动子下的工作效果，证明复制系统只能在起始模板表达量较低时效果较好。(B～D)Rnc基因敲除能 促进复制系统的工作效果，验证了Rnc基因敲除(B)，及Rnc基因敲除后复制系统对蓝色荧光报告基 因表达情况(C)和对蓝色荧光报告基因的RNA表达水平(D)。

图10显示了Rnc基因敲除后复制系统在不同强度的T7启动子下的工作效果。(A～D)Rnc基因敲 除后复制系统在四种不同强度的类T7启动子(T7，T7M2，T7M4，T7M5)下的工作效果，分别检测 T7启动子下复制系统作用(A)，T7M2启动子下复制系统作用(B)，T7M4启动下复制系统作用(C)及 T7M6启动下复制系统作用(D)。(E)Rnc基因敲除后不同启动子下复制系统的复制效率，证明Rnc基 因敲除后复制系统工作效率优于未敲除菌株。

图11显示了复制系统在不同的表达形式下的工作效果。将复制系统分别整合至基因组表达、 P15A质粒表达或ColE1质粒表达，证明复制系统以基因组形式或质粒形式表达时均能发挥作用。

图12显示了复制系统的基因容量检测。在复制系统中表达不同长度的目的基因，利用两种报告 基因，检测复制系统的BFP荧光报告基因表达强度(A)和GFP荧光报告基因表达强度(B)，证明在一定 目的基因长度范围内，复制系统发挥较好的工作效果。

图13显示接头序列对复制系统工作的重要性。(A)接头序列去除后复制系统变化示意图。(B，C) 去除接头序列后复制系统的工作效果，分别检测了T7M2启动子下去除接头序列后复制系统的BFP荧 光报告基因表达强度(B)，及T7M5启动子下去除接头序列后复制系统的BFP荧光报告基因表达强度 (C)，证明接头序列是维持复制过程正常发生必须的。(D，E)接头序列替换为RQ135序列后复制系统 的工作效果，检测替换接头序列后复制系统促进荧光报告基因蛋白表达情况(D)及与原始接头序列促 进荧光报告基因蛋白表达情况的比较(E)。

图14显示Qβ噬菌体原始序列回补对复制系统的影响。(A)对复制系统回补不同长度的A2序列示 意图。(B)A2序列回补后复制系统的工作效果。(C)对复制系统回补A1序列或突变的A1序列示意 图。(D)A1序列回补后复制系统的工作效果。

图15显示复制酶优化对复制系统的影响，主要是改变复制酶RBS后复制系统的工作效果。

图16显示插入发卡结构对复制系统的影响。(A)发卡结构设计示意图。(B)插入发卡结构后复制 系统的工作效果。

图17显示复制系统对ALA的生产效果。

图18显示复制系统对于不同噬菌体来源元件的工作效果。

图19显示复制系统对生产PhaP蛋白的效果。

具体实施方式

本发明仿照噬菌体构建复制系统，同时对复制系统进行进一步的优化，构建一种增加目的基因表 达的工具。具体地，本发明构建特定的复制系统，并将该复制系统导入到宿主菌中以持续表达目的基 因RNA，并通过RNA复制酶识别复制系统中的元件从而对目的基因RNA直接进行复制，由此从直 接增加RNA表达量的层面对工程菌进行改造，以促进目的基因的表达，这种改造方式是本发明首次 提出。

在本发明中，优选地，可以使用DNA作为复制系统的信息载体，以实现RNA复制速度和稳定性 之间的平衡，RNA复制子在本发明的系统和方法中仅作为一种辅助工具，。

本发明中，术语“复制系统”可与“复制系统序列”或“复制序列”互换使用。复制系统是一种 复制盒，其包含可以促使目的基因的RNA被复制的元件，复制系统至少包括5’复制识别序列及3’复 制识别序列，和位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目的基因，其中5’复制识别序列和3’ 复制识别序列的RNA序列可以被RNA复制酶识别并进行RNA复制过程。复制系统以DNA形式或 RNA形式存在，RNA形式的复制系统即本发明所述的重组RNA分子(在本发明中也可以被称为重组 复制系统RNA分子)，DNA形式的复制系统是能够表达所述重组RNA分子的DNA分子，DNA形 式的复制系统的目的是为了稳定持续地表达RNA形式的复制系统，复制系统在RNA形式下被RNA 复制酶识别并启动目的基因的复制过程。所述重组RNA分子包括可被RNA复制酶识别并进行RNA 复制过程的5’复制识别序列及3’复制识别序列，和位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目 的基因序列。由于RNA复制酶可以识别5’复制识别序列和3’复制识别序列并复制5’复制识别序列和 3’复制识别序列之间的RNA序列，因此可以对重组DNA分子中的目的基因RNA进行复制，从而增 加目的基因的RNA的量，由此促进目的基因的表达。本发明中，复制系统优选是DNA形式的。

本发明中，术语“RNA复制酶”又可称为RNA依赖型RNA聚合酶，它以RNA为模板催化合成 RNA，它是本领域公知的，本领域熟知存在多种RNA复制酶，例如在病毒中或噬菌体中存在的RNA 复制酶。本发明的RNA复制酶可以是任何具有RNA复制酶功能的酶，可以是任何来源的RNA复制 酶，例如病毒RNA复制酶或噬菌体RNA复制酶，更优选是Qβ噬菌体RNA复制酶、MS2噬菌体 RNA复制酶或fr噬菌体RNA复制酶。本发明的RNA复制酶可以是野生型RNA复制酶，例如野生型 Qβ噬菌体的RNA复制酶、野生型的MS2噬菌体RNA复制酶或野生型fr噬菌体的RNA复制酶；也 可以是野生型RNA复制酶的功能等同变体，例如Qβ噬菌体RNA复制酶、MS2噬菌体RNA复制酶 或fr噬菌体RNA复制酶的功能等同变体；或病毒突变体或噬菌体突变体的RNA复制酶，例如Qβ噬 菌体突变体的RNA复制酶、MS2噬菌体突变体的RNA复制酶或fr噬菌体突变体的RNA复制酶。

本发明中，5’复制识别序列和3’复制识别序列的作用是作为RNA复制酶识别并进行复制的位 点。本领域技术人员知道，RNA病毒或RNA噬菌体的RNA复制酶能够特异性识别自身RNA并进行 复制，其识别位点是RNA的5’非翻译区和3’非翻译区，RNA复制酶可以特异性识别该5’非翻译区和 3’非翻译区并对二者之间的RNA进行复制。以Qβ噬菌体为例，通常认为，Qβ复制酶识别Qβ噬菌体 的5’端与3’端形成的特殊结构(Morozov I Y,Ugarov V I,Chetverin A B,et al.Synergism in replication and translation of messenger RNAin a cell-free system.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,1993,90(20):9325-9329)并对其加以复制，该特殊结构形成相对稳定， 同时暴露出位于5’的数个G与3’的数个C进行自引物化起始复制。本领域技术人员已知多种能被 RNA复制酶识别的5’复制识别序列和3’复制识别序列(DonaldR.Mills.Engineered recombinant messenger RNA can be replicated and expressedinside bacterial cells by an RNA bacteriophage replicase.[J]. Journal ofMolecular Biology,1988,200(3):489-500；Yumura M,Yamamoto N,Yokoyama K,Mori H,Yomo T,Ichihashi N.Combinatorial selection for replicable RNA by Qβreplicasewhile maintaining encoded gene function.[J].PLoS One,2017,12(3):e0174130)，本领域技术人员也可以根据所使用的RNA复制 酶确定其所能识别的5’复制识别序列和3’复制识别序列。

本发明中，术语“5’复制识别序列”又可被称为“5’接头”、或“5’接头序列”，是可以被RNA 复制酶识别并进行复制的核酸序列。由于病毒或噬菌体的5’非翻译区(也可称为5’上游非翻译区或5’ 上游非编码区)可以被病毒或噬菌体的RNA复制酶识别，因此，5’复制识别序列可以包含该5’非翻 译区，或者由该5’非翻译区组成。5’复制识别序列除了包含5’非翻译区之外，还可以包含来自于病毒 或噬菌体的其它序列。5’复制识别序列可以是任何可被RNA复制酶识别并进行复制的5’接头序列， 例如可以是任何来源的5’复制识别序列，例如来自于病毒的5’复制识别序列，其可以被病毒RNA复 制酶识别并进行复制，或来自于噬菌体的5’复制识别序列，其可以被噬菌体RNA复制酶识别并进行 复制。5’复制识别序列可以是天然的5’复制识别序列，例如来自于天然病毒的5’复制识别序列，或来 自于天然噬菌体的5’复制识别序列，或者可以是天然5’复制识别序列的功能等同物，例如可以是天然 5’复制识别序列的功能变体，或是人工合成的5’复制识别序列。优选的5’复制识别序列是Qβ噬菌体 的5’复制识别序列、MS2噬菌体的5’复制识别序列、fr噬菌体的5’复制识别序列或RQ135序列的5’ 复制识别序列(Alexander V.Munishkin,Leonid A.Voronin,VictorI.Ugarov,Larisa A.Bondareva, Helena V.Chetverina,Alexander B.Chetverin.(1991).Efficient templates for Qβreplicase are formed by recombination fromheterologous sequences.Journal of Molecular Biology,221,463-472)。在一些实施方案中，5’复制识别序列包含Qβ噬菌体5’复制识别序列 GGGTTCCCCCCGTAGGGGGGTACTCTATGTAGTAGCAACCATTACTGGAGGCAAC或由其组成。

在另一些实施方案中，5’复制识别序列包含RQ135的5’复制识别序列 GGGTTCCAACCGGAAGTTGAGGGATGCCTAGGCATCCCCCGTGCGTCCCTT或由其组成。在另一 些实施方案中，5’复制识别序列包含MS2噬菌体的5’复制识别序列 GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGCTAATGCCATTTTTAATGTCTTTA GCGAGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCT或 由其组成。在另一些实施方案中，5’复制识别序列包含fr噬菌体的5’复制识别序列 GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCGACTTCCTGTCAAGCTAAATGCCATTTTTAATGTCTTT AGCGAGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGCAATTCCATTGCTAGGGAGCCTCGT或 由其组成。

本发明中，术语“3’复制识别序列”又可被称为“3’接头”、或“3’接头序列”，是可以被RNA 复制酶识别并进行复制的核酸序列。由于病毒或噬菌体的3’非翻译区(也可称为3’上游非翻译区或3’ 上游非编码区)可以被病毒或噬菌体的RNA复制酶识别，因此，3’复制识别序列可以包含该3’非翻 译区，或者由该3’非翻译区组成。3’复制识别序列除了包含3’非翻译区之外，还可以包含来自于病毒 或噬菌体的其它序列。3’复制识别序列可以是任何可被RNA复制酶识别并进行复制的3’接头序列， 例如可以是任何来源的3’复制识别序列，例如来自于病毒的3’复制识别序列，其可以被病毒RNA复 制酶识别并进行复制，或来自于噬菌体的3’复制识别序列，其可以被噬菌体RNA复制酶识别并进行 复制。3’复制识别序列可以是天然的3’复制识别序列，例如来自于天然病毒的3’复制识别序列，或来 自于天然噬菌体的3’复制识别序列，或者可以是天然3’复制识别序列的功能等同物，例如可以是天然 3’复制识别序列的功能变体，或是人工合成的3’复制识别序列。优选的3’复制识别序列是Qβ噬菌体 的3’复制识别序列、MS2噬菌体的3’复制识别序列、fr噬菌体的3’复制识别序列或RQ135序列的3’ 复制识别序列(Alexander V.Munishkin,Leonid A.Voronin,VictorI.Ugarov,Larisa A.Bondareva, Helena V.Chetverina,Alexander B.Chetverin.(1991).Efficient templates for Qβreplicase are formed by recombination fromheterologous sequences.Journal of Molecular Biology,221,463-472)。在一些实施方案中，3’复制序列包含Qβ噬菌体3’复制识别序列 GGTAGCACCTGGGAGGGGTGCTATACGCACCCTAGGTTAGCAAACTTAAACTAACCTTCTCGAA AGAGAGAGTTGAGGGCTCTGCTTTGCCCTCACTCCTCCC或由其组成。在另一些实施方案中，3’ 复制识别序列包含RQ135的3’复制识别序列 TACGAGGGATTTGAGAGATGCCTAGGCATCTCCCGCGCGCCGGTTTCGGACCTCCAGTGCGTGTT ACCGCACTGTTAGCCCA或由其组成。在另一些实施方案中，3’复制识别序列包含MS2噬菌体的3’ 复制识别序列 CTGACCGAGGGACCCCCGTAAACGGGGTGGGTGTGCTCGAAAGAGCACGGGTGCGAAAGCGGT CCGGCTCCACCGAAAGGTGGGCGGGCTTCGGCCCAGGGACCTCCCCCTAAAGAGAGGACCCGG GATTCTCCCGATTTGGTAACTAGCTGCTTGGCTAGTTACCACCCA或由其组成。在另一些实施方 案中，3’复制识别序列包含fr2噬菌体的3’复制识别序列 CAAAACTGAGGGACCCCCGTAAGCGGGGTGGGTGTGCTCGAAAGAGCACGGGTCCGCGAAAGC GGTGGCTCATCAGAAATGGTGGGTGAGGGTTCGCCCTCTAGGACTGGCCCCGAAAGGTCAGGCC CGGGATTCTCCCGATTTTGGTAGCTAGTTGCTTGGCTAGCTACCACCCA或由其组成。

在本发明的方法和系统中，RNA复制酶和5’复制识别序列及3’复制识别序列的使用应当是配套 的，所使用的RNA复制酶应当能够识别所使用的的5’复制识别序列和3’复制识别序列。本发明的方 法和系统中应当使用能被同一个RNA复制酶识别的5’复制识别序列和3’复制识别序列。在一些实施 方案中，所述RNA复制酶是Qβ噬菌体RNA复制酶，5’复制识别序列和3’复制识别序列分别是Qβ 噬菌体的5’复制识别序列和3’复制识别序列；或者所述RNA复制酶是MS2噬菌体RNA复制酶，5’ 复制识别序列和3’复制识别序列分别是MS2噬菌体的5’复制识别序列和3’复制识别序列；或者所述 RNA复制酶是fr噬菌体RNA复制酶，5’复制识别序列和3’复制识别序列分别是fr噬菌体的5’复制识 别序列和3’复制识别序列；或者所述RNA复制酶是Qβ噬菌体RNA复制酶，5’复制识别序列和3’复 制识别序列分别是RQ135序列的5’复制识别序列和3’复制识别序列。在一些优选的实施方案中，所 述RNA复制酶是Qβ噬菌体RNA复制酶，5’复制识别序列和3’复制识别序列分别包括Qβ噬菌体的 5’非翻译区和3’非翻译区或由其组成；或者所述RNA复制酶是MS2噬菌体RNA复制酶，5’复制识别 序列和3’复制识别序列分别包括MS2噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区或由其组成；或者所述RNA 复制酶是fr噬菌体RNA复制酶，5’复制识别序列和3’复制识别序列分别包括fr噬菌体的5’非翻译区 和3’非翻译区或由其组成；或者所述RNA复制酶是Qβ噬菌体RNA复制酶，5’复制识别序列和3’复 制识别序列分别包括RQ135序列的5’非翻译区和3’非翻译区或由其组成。

本发明的复制系统中，还可以在5’复制识别序列与目的基因之间和/或目的基因的3’下游含有与 复制相关的序列，例如含有与复制相关的噬菌体序列。在一些实施方案中，在5’复制识别序列与目的 基因之间可以含有与复制相关的噬菌体A2蛋白部分序列的编码序列。在一些实施方案中，在目的基 因的3’下游可以含有与复制相关的噬菌体A1蛋白部分序列的编码序列。与复制相关的序列应当是与 复制系统中所使用的复制酶引发的复制过程相关的序列。A1蛋白是噬菌体衣壳蛋白(Priano,C., Arora,R.,Butke,J.,andMills,D.R.(1995).A complete plasmid-based complementation system for RNAcoliphage Qβ:three proteins of bacteriophages Qβ(group III)and SP(group IV)can be interchanged.Journal of molecular biology,249,283-297.)，在噬菌体中，表达A1蛋白的序列位于表达A2蛋白(成熟/裂解 蛋白)的序列之后、表达复制酶的序列之前。本发明中，A1蛋白的编码序列也可被称为A1序列。 A2蛋白是噬菌体成熟/裂解蛋白(Priano,C.,Arora,R.,Butke,J.,and Mills,D.R.(1995).A complete plasmid-basedcomplementation system for RNA coliphage Qβ:three proteins of bacteriophagesQβ(group III)and SP(group IV)can be interchanged.Journal of molecularbiology,249,283-297)，表达A2蛋白的 序列位于噬菌体5’端。本发明中，A2蛋白的编码序列也可被称为A2序列。

本发明中，目的基因可以是任何具有功能性基因产物的基因。功能性基因产物通常是蛋白质，但 对于非编码基因，即不编码蛋白质的基因，其功能性产物是功能性RNA。由基因携带的遗传信息合 成功能性基因产物的过程被称为“基因表达”或“表达”。本发明中，“表达”也可以用于表示由基因携带 的遗传信息转录为RNA的过程，例如当提及“表达重组RNA分子”时，或提及“表达”其他RNA时， 如本领域技术人员所能理解的，该“表达”表示由编码该RNA的基因通过转录获得RNA的过程。本发 明中，“表达”也可以用于表示由基因携带的遗传信息经过转录、翻译合成蛋白质的过程，例如当提及 “表达”蛋白质或酶时，如本领域技术人员所能理解的，该“表达”表示由编码该蛋白质或酶的基因通过 转录和/或翻译形成该蛋白质或酶的过程。本发明中，作为目的基因的功能性产物的蛋白质包括但不 限于酶、荧光蛋白等。功能性RNA包括但不限于转运RNA(transfer RNA，tRNA)、小核RNA (smallnuclear RNA，snRNA)、miRNA、lncRNA等。在一些实施方案中，所述目的基因编码蛋白 质，优选地，所述目的基因编码的蛋白质是酶。在一些实施方案中，目的基因包括但不限于选自荧光 蛋白BFP编码基因，荧光蛋白GFP编码基因，氯霉素抗性基因CmR、半乳糖激酶编码基因GALK、 β-半乳糖苷酶编码基因LacZ、5-氨基乙酰丙酸合成基因Hem1组成的组的一个基因或两个或更多个基 因的组合。在一些实施方案中，目的基因可以是一个基因，也可以是两个或更多个基因的组合。目的 基因的长度可以是任意长度，例如可以是5bp-10kb、10bp-5kb、50bp-3kb、100bp-2kb、500bp-1kb 等。如本领域技术人员所知道的，当目的基因编码蛋白质时，为了表达目的基因编码的蛋白质，目的 基因除了包含该蛋白质的编码序列，还可以包含核糖体结合位点(RBS)，以便于翻译所述蛋白质。 RBS可位于所述蛋白编码序列的起始密码子的5'侧。

本发明中，复制系统表达的重组RNA分子中，还可以含有任何一种或更多种调控序列(在本发 明中也被称作修饰序列)。所述调控序列可以是以任何方式提高目的基因表达的调控序列。

一种调控序列例如可以是可形成发卡结构的序列，也就是说，复制系统表达的重组RNA分子中 可以包含可形成发卡结构的序列。由于RNA复制过程中不可避免地产生双链RNA，含有发卡结构可 以使得双链RNA配对性能减弱，增强单链形式存在的RNA以利于翻译过程。例如，可以通过RNA 上存在的特殊配对模式GU配对，设计“半发卡”结构，该结构在正链上由于GU配对能力表现为发 卡结构，但在负链上由于C与A不能配对，不产生发卡结构。因此，在一些实施方案中，可形成发 卡结构的序列可以含有多个G和U，这些G和U可以相互配对使得该序列形成发卡结构，而与之互 补的负链序列上不产生发卡结构。可形成发卡结构的序列在重组RNA分子中的位置没有特别限制， 只要不影响重组RNA分子的各个组成元件的功能。在一些实施方案中，可形成发卡结构的序列可以 位于重组RNA分子的任意两个相邻组成元件之间。在一些实施方案中，可形成发卡结构的序列可以 位于目的基因的5’上游或目的基因的3’下游。可形成发卡结构的序列的长度没有特别限制，只要能形 成发卡结构即可。可形成发卡结构的序列的长度例如可以是10nt-200nt，例如可以是50nt-200nt，例如可以是50nt-100nt。在一些实施方案中，所述可形成发卡结构的序列可以是 GGGCAGGCGTACAAAATCAGAGATCTGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGG GGTCGGCGGTGTTGCATAATATTGTTGATTCTGTTTATTGTTGATTCTGTTTATTGTTGATTCTGTT GGATCCGGGAAGTCCTAACGGGCAG。在一些实施方案中，所述可形成发卡结构的序列可以是 GGGCAGGCGTACAAAATCAGAGATCTGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGG GGTCGGCGGTGGGCCGTGGCGGATGCGGCGGTGGGGCGAGAGCTGGCCGGTGGAGGCTGGCTT GCATAAGTTAGTTTCTATTGGTTAGTTCTTGTCTTATTGTTGCATTTGTTATGGTTTATTGTTGATT CTGTTTATTGTTGATTCTGTTTATTGTTGATTCTGTTGGATCCGGGAAGTCCTAACGGGCAG。

一种调控序列例如可以是位于5’复制识别序列上游和/或3’复制识别序列下游的可切割序列，用 于去除5’复制识别序列上游和/或3’复制识别序列下游的额外序列，以避免由于这些额外序列导致的 不必要的干扰。因此，复制系统表达的重组RNA分子中可以在5’复制识别序列上游和/或3’复制识别 序列下游包含可切割序列。可切割序列可以是任何在表达后能自切割或能通过其它方式被切割(例如 被特定的酶切割)的序列。

在一些实施方案中，所述可切割序列可以是在表达后能够自切割的序列。这样的序列是本领域技 术人员熟知的，例如具有自切割功能的核酶序列，如剪切型核酶序列。剪切型核酶可以催化自身 RNA在特定的位点自我剪切。剪切型核酶包括但不限于锤头核酶、发夹核酶、HDV核酶或RNaseP。 在一些实施方案中，所述可切割序列是核酶，优选HDV核酶序列，其具体序列例如可以是 GCCGGCCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGGCCGGTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCC TCGGTAATGGCGAATGGGAC。

在一些实施方案中，所述可切割序列还可以是能通过其它方式被切割，例如被特定的酶切割的序 列。这样的序列是本领域技术人员熟知的，例如tRNA序列。tRNA序列能在tRNA 5成熟酶 (RZaseP)作用下被切掉tRNA的5’端附加序列，或者可以在3’内切核酸酶RZase F的作用下被切掉 tRNA 3’端的序列。因此，所述可切割序列可以是可被RZaseP切割5’端附加序列的tRNA序列，或者 可以是可被RZase F切割3’端序列的tRNA序列。任何在成熟时能够被切割的tRNA都可以用于本发 明。在一些实施方案中，所述tRNA序列可以是tRNA-Gly序列 GCGGGAATAGCTCAGTTGGTAGAGCACGACCTTGCCAAGGTCGGGGtCGCGAGTTCGAGTCTCGT TTCCCGCTCCA，或tRNA-Val序列 GCGTCCGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACCACCTTGACATGGTGGGGGTCGGTGGTTCGAGTCCA CTCGGACGCACCA。

在所述重组RNA分子中，可以在仅在5’复制识别序列上游具有可切割序列，或者可以仅在3’复 制识别序列下游具有可切割序列，或者可以在5’复制识别序列上游和3’复制识别序列下游均具有可切 割序列。分别位于5’复制识别序列上游和3’复制识别序列下游的可切割序列可以是相同的或是不同 的。

本发明中，宿主菌可以通过任何可能的方式表达上述重组RNA分子。例如，可以由宿主菌的基 因组表达该重组RNA分子。在这种情况下，一种可能的方式是将能够表达该重组RNA分子的DNA 序列整合到宿主菌的基因组上，使得宿主菌可由其基因组表达该重组RNA分子。将DNA序列整合到 宿主菌的基因组上的方式是本领域熟知的，例如可以通过源自HK022噬菌体的attB/attP整合系统 (Azaro,M.A.,and Landy,A.(2002).λintegrase andtheλInt family.Mobile DNA II.American Society of Microbiology,118-148)将DNA分子整合到宿主菌的基因组上。

所述重组RNA分子还可以由在宿主菌中稳定存在的表达载体表达。表达载体例如可以是质粒， 但不限于此。本领域技术人员熟知各种表达载体，例如质粒，并可以通过多种途径获得可用的表达载 体。在这种情况下，可以将能够表达所述重组RNA分子的表达载体例如质粒导入到宿主菌中，获得 稳定表达所述表达载体的宿主菌。

将表达载体例如质粒导入宿主菌中的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于氯化钙方法、 电穿孔等。可以根据宿主菌的不同选取合适的导入方法。将表达载体如质粒导入宿主菌中后，可以通 过抗生素筛选获得稳定表达所述表达载体的宿主菌。

在一些实施方案中，可以将表达上述重组RNA分子的DNA分子转化至宿主菌中，使得宿主菌稳 定表达所述重组DNA分子。在这种情况下，本发明的复制系统可以是DNA的形式，在所述表达上述 重组RNA分子的DNA分子中包含该复制系统。被转化到宿主菌中的DNA分子可以被整合到宿主菌 的基因组中，也可以以质粒的性质稳定存在于宿主菌中。将DNA分子整合到宿主菌的基因组上的方 式是本领域熟知的，例如可以通过源自HK022噬菌体的attB/attP整合系统(Azaro,M.A.,and Landy,A. (2002).λintegrase and theλIntfamily.Mobile DNA II.American Society of Microbiology,118-148)将 DNA分子整合到宿主菌的基因组上。

DNA形式的复制系统可以在5’复制识别序列的5’上游包含启动子，用于启动转录得到重组复制 系统RNA分子。所使用的启动子没有特别限制，任何可以在宿主菌中启动转录的启动子都可以在本 发明的复制系统中使用，例如诱导型启动子或组成型启动子，可以使用的启动子包括但不限于T7启 动子，类T7启动子例如T7M5启动子、T7M2启动子、T7M4启动子、T7M6启动子，组成型启动子 J23109(例如TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGC)，组成型启动子J23115(例如 TTTATAGCTAGCTCAGCCCTTGGTACAATGCTAGC)，阿拉伯糖诱导启动子例如pAra，乳酸启动 子例如P1144等。本领域熟知的其它启动子也可以用于本发明。

本发明中，在宿主菌中表达上述重组RNA分子，并通过RNA复制酶对所述重组RNA分子进行 复制，以提高目的基因的RNA的量。因此，本发明还提供获得目的基因表达产物的方法，包括在存 在噬菌体RNA复制酶以及适合于目的基因表达的条件下培养可以表达本发明所述的重组RNA分子的 重组菌。

在一些实施方案中，宿主菌在表达所述重组RNA分子的同时，还表达相应的RNA复制酶。RNA 复制酶可以与目的基因分别表达，即编码RNA复制酶的序列与复制系统的序列不在同一条链上。在 这种情况下，可以将表达RNA复制酶的DNA序列整合到宿主菌的基因组上，使得由宿主菌的基因组 表达RNA复制酶，也可以将表达RNA复制酶的表达载体如质粒导入到宿主菌中，使得该表达载体在 宿主菌中稳定存在并表达RNA复制酶。

RNA复制酶的相应序列(如表达RNA复制酶的序列)还可以作为一个组成元件被包含在本发明 的复制系统中，使得表达RNA复制酶的序列与目的基因一同被包含在复制序列中，RNA复制酶的 RNA被包含在所述重组RNA分子中与目的基因一同被表达并被宿主菌中已经存在的RNA复制酶复 制，从而合成更多的RNA复制酶。当宿主菌表达的重组RNA分子包含表达RNA复制酶的序列时， 表达RNA复制酶的序列被置于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的合适的位置。在一些实施方 案中，表达RNA复制酶的序列位于目的基因的5’上游或3’下游。表达RNA复制酶的序列与目的基 因之间可以是紧邻连接，也可以插入其它序列，包括但不限于调控序列或与复制相关的序列。表达 RNA复制酶的序列中包含RBS(核糖体结合位点)，以便于表达RNA复制酶，RBS位于起始密码子 的5’侧。

本发明的复制系统中也可以不包含表达RNA复制酶的序列，使复制序列与RNA复制酶分别表 达。RNA复制酶可以通过另外的表达载体在宿主菌中表达，RNA复制酶可以通过在宿主菌中稳定存 在的质粒在宿主菌中稳定表达，也可以将RNA复制酶的编码序列整合到宿主菌的基因组上，使RNA 复制酶通过宿主菌的基因组稳定表达。在一些实施方案中，也可以外加纯化的RNA复制酶，实现对 宿主菌中的复制系统的复制。

如本领域技术人员所知，噬菌体RNA复制酶可以通过任何适当的方式提供，只要使得表达系统 中存在噬菌体RNA复制酶，即满足“存在噬菌体RNA复制酶”的条件。例如，当表达RNA复制酶 序列作为一个组成元件被包含在复制系统中时，无需另外表达RNA复制酶或外加RNA复制酶，即可 满足“存在噬菌体RNA复制酶”的条件。

本发明中，可以对表达RNA复制酶的序列进行优化，包括但不限于将RNA复制酶的RBS替换 为较高强度的RBS，和/或将RNA复制酶的编码序列替换为密码子优化后的复制酶序列。因此，本发 明中可以使用序列优化的表达RNA复制酶的序列。在一些实施方案中，序列优化的表达RNA复制酶 的序列的一个实例是：

其中密码子优化的复制酶标位粗斜体，替换的强RBS标为粗体下划线。

本发明中，宿主菌用于表达本发明的重组RNA分子，宿主菌可以是细菌，例如革兰氏阳性菌或 革兰氏阴性菌，革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌或乳酸菌，革兰氏阳性菌包括但不限于Lb.caseil Zhang。在一些实施方案中，宿主菌可以是菌株E.coli JM109(DE3)，它是一种噬菌体DE3溶源化菌 株，其基因组上整合有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因，可与T7系列启 动子配合使用，此时，T7系列启动子启动转录需要由IPTG诱导。

本发明中，宿主菌还可以是敲除Rnc基因的宿主菌，例如敲除Rnc基因的大肠杆菌。Rnc基因 (GenBank号：NC_000913.3)的编码产物是RNase III，其在细胞中可以切割双链RNA，由于细菌中 本身几乎不含双链RNA，Rnc基因本身可能作为一种抗噬菌体侵染的机制存在，帮助细菌抵抗RNA 噬菌体的感染，因此，RNA复制系统复制产生的双链RNA可能会被切割，导致复制效果减弱。因 此，本发明中，可以将宿主菌中的Rnc基因敲除，以减少Rnc基因对复制系统工作性能的影响。基因 敲除可以理解为通过任何适当的方式使基因失活，基因敲除的方法是本领域公知的，例如可以通过在 基因中插入、删除或取代一个或多个核苷酸，使得基因功能大幅减弱或基因功能丧失。因此，在一些 实施方案中，宿主菌可以是敲除了Rnc基因的E.coli JM109(DE3)。

本发明中，“复制效率”、“复制倍数”或“倍数”可以互换使用，指实验组的平均荧光强度除 以对照组的平均荧光强度得到荧光强度比值。本发明中，“增加倍数”是指复制倍数增加的百分比， 即复制倍数减去100％。

本发明中，当提及某一元件位于另一元件5’侧(或5’下游)或3’侧(或3’下游)时，这两个元 件可以是紧邻连接，也可以是二者之间具有间隔序列。

本发明中，DNA分子和RNA分子可以是单链或双链，视适用条件而定，当提及某一条序列时， 如无特别说明，该序列是指单链分子的序列，或双链分子的正链序列。

本发明中，RNA分子与RNA序列可以互换使用，DNA分子和DNA序列可以互换使用。RNA分 子和DNA分子不仅限于单独存在的RNA序列或DNA序列，并且还可以指与其它RNA序列或DNA 序列连接在一起的，但具有相对独立功能的RNA序列或DNA序列。

本发明的RNA自我复制扩增的方式可以与传统代谢工程中增加DNA转录的方式相结合，从而在 时间空间上提高工程细胞内目的RNA的水平。在现有的体外方法中，只以RNA复制作为RNA产生 的唯一方式，由于复制要经过合成负链的过程，在起始阶段无法生成与转录相当的RNA，而且RNA 易降解，因此，本发明用DNA作为遗传信息的载体，其保真性和稳定性更好。

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面 的实施例。

实施例1验证复制酶与复制序列分别表达时的复制效率

复制酶与复制序列分别表达的复制系统设计如图1A的示意图所示，将复制序列与复制酶分别表 达，复制系统表达复制序列，但不表达复制酶，复制酶在另外的复制酶质粒中表达。复制系统中包含 的复制序列从5’端到3’端依次包括启动子序列、5’接头序列、目的基因序列(即图中的“目的蛋白区 域”)、失活的复制酶序列(即图中的“噬菌体序列(复制酶失活)”)及3’接头序列，如图1A中 “复制系统”所示。由于复制系统中的复制酶失活，因此当复制系统表达时，目的基因序列不能被一 同表达的复制酶复制。

选用蓝色荧光蛋白(BFP)作为目的基因，使用T7启动子对复制系统RNA分子进行转录，实验 用复制系统示意图如图1A中“RRS1”所示。同时构建由阿拉伯糖启动子控制RNA分子转录、P15A复 制子下的表达复制酶的质粒，通过控制诱导剂浓度进而使得复制酶与复制序列分别表达，如图1A中 “复制酶质粒”示意图所示。

表达复制序列的质粒的构建过程为：包括启动子、5’端及3’端、目的基因(蓝色荧光蛋白)、失 活的复制酶等元件的序列和包含R6Kγ复制子、HK022attP位点、抗生素抗性等序列的骨架均由公司 合成，将目标序列和骨架通过Gibson assembly的方法整合在一起，获得能将复制序列整合进基因组 的质粒。复制酶质粒构建过程为：复制酶序列由公司合成，包含阿拉伯糖启动子、P15A复制子的骨 架由实验室保存质粒PCR获得，将复制酶序列和骨架通过Gibson assembly的方法整合在一起，获得 复制酶质粒。两个质粒共转大肠杆菌JM109(DE3)以分别表达复制序列和复制酶。

检测在不同浓度的阿拉伯糖诱导下，复制酶与复制序列分别表达时复制系统对蓝色荧光报告基因 的表达情况，结果如图1B所示。在不同浓度的阿拉伯糖诱导下，与无复制酶质粒表达的对照相比， 当复制酶质粒和复制序列质粒(表达蓝色荧光报告基因)共表达时蓝色荧光强度更高，当阿拉伯糖浓 度大于0.04g/L时有复制酶质粒表达的蓝色荧光表达强度显著高于无复制酶质粒表达的对照。结果证 明当复制酶与复制序列分别表达即反式存在的复制系统仍然能起到促进报告基因表达的作用。

实施例2构建优选的RNA复制系统及其工作效果检测

(1)构建优选的RNA复制系统的质粒

优选复制系统的示意图如图2A中“优选复制系统”所示，其中将复制酶序列置入复制系统中， 与目的基因共同表达。优选复制系统的RNA分子包含启动子、5’接头序列，目的基因序列(即图中 的“目的蛋白区域”)，复制酶序列(即图中的“Qβ复制酶”)，3’接头序列和HDV核酶序列，其 中HDV核酶序列用于在表达后自切割。

本实施例中使用蓝色荧光蛋白BFP作为目的基因，使用T7M5启动子对复制系统RNA分子进行 转录，该复制系统示意图如图2A中RRS-T7M5-BFP所示(其中终止子未示出)。同时，在该复制系 统RRS-T7M5-BFP的基础上，将Qβ复制酶序列进行移码突变，构建复制酶突变的对照复制系统，其 示意图如图2A中RRS突变-T7M5-BFP所示(其中终止子未示出)，该对照复制系统中的复制酶通过 移码突变而失活，无法复制目的基因序列。

在本实施例以及后面的所有实施例中，对照复制系统均是指复制酶移码突变失活的对照复制系 统，是指在其相应的复制系统基础上，将复制酶序列进行移码突变使其失活；除复制酶序列之外，复 制酶移码突变失活的对照复制系统与其相应的复制系统的其它序列均相同。

具体而言，基于野生型Qβ噬菌体基因组，选取其复制酶序列、5’上游非编码区和3’下游非编码 区这些复制必须序列，在5’上游非编码区的5’端加入T7M5启动子，在5’接头序列之后加入BFP基 因，并在3’UTR后加入HDV核酶序列和终止子，构成复制系统。

分别合成该复制系统的DNA序列和复制酶突变的对照复制系统的DNA序列，合成R6Kγ复制子 以及HK022attP整合位点序列，从质粒pSEVA314上扩增得到氯霉素抗性序列，通过gibson assembly 方法将这些序列整合在一起，分别得到复制系统表达质粒RRS-T7M5-BFP和对照复制系统表达质粒 RRS突变-T7M5-BFP，质粒图谱如图3所示。

其中5’上游非编码区对应的序列为： GGGTTCCCCCCGTAGGGGGGTACTCTATGTAGTAGCAACCATTACTGGAGGCAAC；

3’下游非编码区对应的序列为： GGTAGCACCTGGGAGGGGTGCTATACGCACCCTAGGTTAGCAAACTTAAACTAACCTTCTCGAA AGAGAGAGTTGAGGGCTCTGCTTTGCCCTCACTCCTCCC；

BFP对应的编码核酸序列为： ATGAGCGAACTGATCAAAGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAAGGCACCGTTGACAAC CACCACTTTAAGTGCACGTCTGAGGGTGAGGGTAAGCCGTACGAAGGCACCCAAACCATGCGTA TCAAAGTTGTGGAGGGCGGTCCACTGCCGTTCGCTTTTGACATTCTGGCGACCAGCTTCCTGTACGGTTCCAAAACGTTCATTAACCATACTCAGGGCATTCCGGATTTCTTCAAACAGAGCTTTCCGGA AGGTTTCACCTGGGAGCGTGTCACCACGTATGAAGATGGTGGTGTGTTGACCGCCACCCAAGAT ACCTCCCTGCAAGATGGCTGTCTGATCTATAACGTGAAAATTCGTGGCGTCAACTTTACGAGCAA TGGTCCGGTGATGCAGAAGAAAACCCTGGGTTGGGAGGCGTTTACGGAAACCCTGTATCCGGCC GATGGTGGCCTGGAGGGCCGTAACGACATGGCACTGAAGCTGGTTGGTGGCAGCCATTTGATCG CAAATATCAAGACGACGTACCGCAGCAAGAAACCGGCGAAAAATCTGAAGATGCCGGGTGTTT ACTATGTCGACTACCGTCTGGAACGCATTAAAGAAGCGAATAATGAGACTTACGTGGAGCAGCACGAGGTTGCAGTCGCGCGCTATTGCGACTTGCCTAGCAAGCTGGGTCATAAACTGAATTAA；

野生型Qβ复制酶的编码核酸序列为： ATGTCAAAGACACTGCAGTCGCGTAAGTCGCTTAGCGGAAAACTCCGCCGCGCTGCGAACACAA GAATCGTGGTTGAAGGTAACCTCGCACTGTCTATCGCGAATGATCTATTATCCGCGCTAGATGTA GAACCGTTTAATTCGGAAGAAGACTGTATAAGTCGTTCACCGAAATTCGGCATCTCACCAGATC AATTTAGGAATTCCTATCTTCGTGCTGAGATAATGTCGAAGTACGATTCTTTTAGCCTAGGTATT AATACCGAAGCCGTAGCATGGGAAAAGTTCCTAGCTGCGGAGGCTGAGTGTGCTAAGACGAATC TGAGACTCTATAGGCCTAACTACAATGAGGATTTCAATTTCTCATTGGGTGAGACATGTATTCAC ATGGCTCGCCGAAAAATAGTTAAGCTATTAGGAGATTCAGTTCCGTTTGAGGCTGTGTTGCGACA TTGCCGGTTTTCCGGCGGTGCCACAACAACGAATAGCCGTCTATACGGCCATCCGTCCTTCAAGT TTGCTCTTGCGCAAGAGTGTACCCCACGGGCTGTTCCATATGTGCAAGCTTTAAAGGCCTGTACA AACATGGACCTTGGTATTACCAAGGTTAGCCCTTTCAATAAAGCAGTTACTGTACCAAAGAACA GTAAAACTGATCGCTGCATCGCTATCGAGCCAGGCTGGAATATGTTTTTCCAGTTGGGCATTGGTGGCGTAATTCGCGAAAAGTTGCACTTGTGGAATATCGACCTGAATGATCAGACGATTAACCAGG TGCGCGCATATTCAGGCAGCTGTAGCAATGAACTTGCTACAGTGGATCTCTCGAGCGCGAGTGA TACTATTTCGCTTGCGCTCGTTGAGCTCCTGCTACCCCCTGCGTGGTTTAAAGTCCTTACGGACCT TAGGTCACGAAGGGGTATGTTGCCAGACGGTAGAATCATTACCTATGAGAAAATTTCCTCAATG GGTAACGGTTTCACCTTCGAGCTCGAGTCGCTTATATTTGCAGCTCTTGCTCGGTCTTTATGCGAG TTACTGAACTTACAACCGTCGAGTGTCACGGTCTATGGCGATGATATTATATTGCCATCAGACGC GTGCAGCTCGTTGATTGAAGTTTTCTCCTACGTAGGTTTTAGAACCAACGAGAAGAAGACCTTTT TCGACGGGCCGTTCCGAGAGTCGTGCGGAAAGCACTACTTTATGGGCGTTGACGTCACACCTTTC TACATACGCCACCGTATAGTGAGTCCCTCTGATCTCATACTGGTTTTGAACCAGATGTATCGTTG GGCCACGATTGATGGCGTATGGGATCCTAGGGTATATCCTGTATACACCAAGTACAGACGTCTG CTGCCGGATATTCTCCGCAGAAATGTCGTACCTGATGGATATGGTGATGGTGCCCTCGTCGGATC TGTCCTTACCAGTCCTTTCGCAGAAAATCGCGGTTGGGTTCGGCGTGTGCCGATGATAATTGACA AGAAGAAAGACCGAGTGCGTGACGAGCGTGGTTCATATCTCTATGAACTATGGTCGTTACAGCA GCTCGAATGTGACAGTGAGTTCCCGTTCAACGGGTCGCTGGTTGTTGGTACCAACGATGGAGTTT GCACTTACCGACACCGAGAGCGGGTTTCTACCGCTATCAGTGATTCGGTTGGCGCATACGACATC GTATGGATACCGTGCAGTAGTCGTGTCCTGGCTCCCTACGGGGACTTCCGGAGGCACGAAGGTTCTATCCTAAAATAG；

复制酶的编码核酸序列的5'端另有核糖体结合序列(RBS，具体序列未示出)。

突变的复制酶的编码核酸序列为： ATGTCAAAGACACTGCAGTCGCGTAAGATCGCTTAGCGGAAAACTCCGCCGCGCTGCGAACACA AGAATCGTGGTTGAAGGTAACCTCGCACTGTCTATCGCGAATGATCTATTATCCGCGCTAGATGT AGAACCGTTTAATTCGGAAGAAGACTGTATAAGTCGTTCACCGAAATTACGGCATCTCACCAGA TCAATTTAGGAATTCCTATCTTCGTGCTGAGATAATGTCGAAGTACGATTCTTTTAGCCTAGGTAT TAATACCGAAGCCGTAGCATGGGAAAAGTTCCTAGCTGCGGAGGCTGAGTGTGCTAAGACGAAT CTGATAGACTCTATAGGCCTAACTACAATGAGGATTTCAATTTCTCATTGGGTGAGACATGTATT CACATGGCTCGCCGAAAAATAGTTAAGCTATTAGGAGATTCAGTTCCGTTTGAGGCTGTGTTGCG ACATTGCCGGTTTTCCGGCGGTGCACACAACAACGAATAGCCGTCTATACGGCCATCCGTCCTTC AAGTTTGCTCTTGCGCAAGAGTGTACCCCACGGGCTGTTCCATATGTGCAAGCTTTAAAGGCCTG TACAAACATGGACCTTGGTATTACCAAGGTTAGCCCTTTCAATATAAAGCAGTTACTGTACCAAA GAACAGTAAAACTGATCGCTGCATCGCTATCGAGCCAGGCTGGAATATGTTTTTCCAGTTGGGCATTGGTGGCGTAATTCGCGAAAAGTTGCACTTGTGGAATATCGACCTGAATGATCAGACGATTAA ACCAGGTGCGCGCATATTCAGGCAGCTGTAGCAATGAACTTGCTACAGTGGATCTCTCGAGCGC GAGTGATACTATTTCGCTTGCGCTCGTTGAGCTCCTGCTACCCCCTGCGTGGTTTAAAGTCCTTAC GGACCTTAGGTCACGAAGGGTAGTATGTTGCCAGACGGTAGAATCATTACCTATGAGAAAATTT CCTCAATGGGTAACGGTTTCACCTTCGAGCTCGAGTCGCTTATATTTGCAGCTCTTGCTCGGTCTT TATGCGAGTTACTGAACTTACAACCGTCGAGTGTCACGGTACTATGGCGATGATATTATATTGCC ATCAGACGCGTGCAGCTCGTTGATTGAAGTTTTCTCCTACGTAGGTTTTAGAACCAACGAGAAGA AGACCTTTTTCGACGGGCCGTTCCGAGAGTCGTGCGGAAAGCACTACTTTATGGGCGTTGTAACG TCACACCTTTCTACATACGCCACCGTATAGTGAGTCCCTCTGATCTCATACTGGTTTTGAACCAG ATGTATCGTTGGGCCACGATTGATGGCGTATGGGATCCTAGGGTATATCCTGTATACACCAAGTA CAGACGTCTGCTGCCAGGATATTCTCCGCAGAAATGTCGTACCTGATGGATATGGTGATGGTGCC CTCGTCGGATCTGTCCTTACCAGTCCTTTCGCAGAAAATCGCGGTTGGGTTCGGCGTGTGCCGAT GATAATTGACAAGAAGAAAGACCGAGTGCGTGACGTAAGCGTGGTTCATATCTCTATGAACTAT GGTCGTTACAGCAGCTCGAATGTGACAGTGAGTTCCCGTTCAACGGGTCGCTGGTTGTTGGTACC AACGATGGAGTTTGCACTTACCGACACCGAGAGCGGGTTTCTACCGCTATCAGTGAATTCGGTTGGCGCATACGACATCGTATGGATACCGTGCAGTAGTCGTGTCCTGGCTCCCTACGGGGACTTCCGGAGGCACGAAGGTTCTATCCTAAAATAG；

修饰元件HDV核酶序列为： GCCGGCCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGGCCGGTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCC TCGGTAATGGCGAATGGGAC。

下面的实施例中，如无特别说明，均使用同样的方法构建表达复制系统的质粒和表达对照复制系 统的质粒，即使用R6Kγ复制子以及HK022attP整合位点序列，从质粒pSEVA314上扩增得到氯霉素 抗性序列，通过gibson assembly方法将这些序列和复制系统的DNA序列或对照复制系统的DNA序 列整合在一起，得到表达复制系统的质粒和表达对照复制系统的质粒。

(2)使用HK022的attB/P整合法将表达复制系统的质粒和表达对照复制系统的质粒分别整合到 表达菌株基因组中。

将构建的复制系统表达质粒RRS-T7M5-BFP和复制酶突变对照质粒RRS突变-T7M5-BFP使用 HK022的attB/P方式整合于JM109(DE3)菌株基因组上，具体地，HK022的attP序列为： AGGTCACTAATACTATCTAAGTAGTTGATTCATAGTGACTGGATATGTTGCGTTTTGTCGCATTAT GTAGTCTATCATTTAACCACAGATTAGTGTAATGCGATGATTTTTAAGTGATTAATGTTATTTTGT CATCCTTTAGGTGAATAAGTTGTATATTTAAAATCTCTTTAATTATCAGTAAATTAATGTAAGTAGGTCATTATTAGTCAAAATAAAATCATTTG。

转化后在相应的抗性板上37℃培养过夜，并在含有10g/L葡萄糖的LB培养基中培养过夜，再进 行后续实验。

由于质粒的复制子为R6Kγ，只有在E.coli EC100D/E.coli s17-1中才可复制，而在复制系统的表 达菌株E.coli JM10(DE3)中无法复制，因此需要将复制系统整合进基因组，否则细胞无法获得质粒上 所带的氯酶素抗性，因此本实施例中使用HK022的attB/P整合法将表达复制系统的质粒整合到目的 菌株基因组中，后文中如无特殊说明，均采用该整合方式将表达复制系统的质粒和表达对照复制系统 的质粒整合到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中。

(3)流式细胞术：使用流式细胞仪BD LSRFortessa对细菌中平均荧光强度进行测量。在96孔平 底板每个孔中预先加入200μL已使用22μm滤膜过滤的PBS，再将待测量的细菌以1:20的比例稀释至 每个孔中，并使用流式细胞仪的高通量进样系统进行测量。流式细胞仪测量两种荧光时所用参数如 下。

参数	设定值	测量对象
			FSC	602	分离活细菌与碎片
SSC	186	分离活细菌与碎片
			FITC	422	GFP
Pacific Blue	356	BFP

后续对该复制系统的研究中均使用流式细胞仪测量其荧光表达量，作为BFP表达强度的表征。

(4)实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)：用构建的表达复制系统质粒和对照复制系统质粒转 化JM109(DE3)菌株，收集1ml菌体提取RNA使用qRT-PCR检测BFP和复制酶基因表达量，使用的 引物序列为：BFP-f：CTGCCGTTCGCTTTTGACAT，BFP-r：TGACGCCACGAATTTTCACG，Rep- f：TTCGGTTGGCGCATACGAC，Rep-r：GGGAGGAGTGAGGGCAAAG。以16S基因作为内参，以IPTG浓度为2.5μM时对照复制系统中的突变复制酶作为参照进行归一化处理得到相对基因表达量。

检测复制系统RRS-T7M5-BFP及对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP中BFP在不同浓度的IPTG 诱导下的荧光强度，结果如图2B所示。在不同浓度的IPTG诱导下，复制系统RRS-T7M5-BFP的 BFP荧光表达强度平均值均高于对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP，其中增加倍数在增加29％～127％ 之间，尤其是在诱导浓度为5μM时达到了超过100％的增强。同时在IPTG浓度高于5μM的时候，这 种增加是具有显著性差异的。说明该优化复制系统可以起到促进蛋白表达的效果。

检测复制系统RRS-T7M5-BFP及对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP在不同浓度的IPTG诱导下 的复制酶基因的RNA表达量，从而测定复制系统对信使RNA含量的增加情况，结果如图2C所示。 因复制酶基因被包含于复制系统内，对其相对表达量的测量可以表征整体复制系统RNA分子的含 量。在不同浓度的IPTG诱导下，复制系统RRS-T7M5-BFP的RNA含量平均值均高于对照复制系统 RRS突变-T7M5-BFP，其中增加倍数在增加32％～213％之间，尤其是在诱导浓度为2.5μM时达到了超 过200％的增强。同时在IPTG浓度为2.5μM和7.5μM的时候，这种增加是具有显著性差异的。说明 该优选复制系统可以起到增加信使RNA量的效果。值得注意的是，由于可能存在的翻译差异及测量 技术的差异，在同一浓度下的相对荧光表达强度与相对RNA含量之间不一定完全相同，但复制系统 对其增加的趋势是一致的。

相比实施例1中使用的复制系统，实施例2中的优选复制系统对目的基因促进能力相对更强，且 由于不需要额外表达复制酶蛋白，其应用更加方便。下文中如无特殊说明，所使用及描述的复制系统 均为该优选复制系统RRS-T7M5-BFP或者对该复制系统进行改造获得的复制系统。

实施例3对复制系统的上下游进行切割

本实施例中，分别使用HDV核酶和tRNA对复制系统的3’末端和5’末端进行切割，以测试去除 3’末端和5’末端外侧的其余序列对复制系统工作性能的影响。

(1)使用HDV核酶对复制系统3’末端进行切割，其示意图如图4A所示，即使用实施例2中构 建的复制系统RRS-T7M5-BFP、对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP。另外构建在3’接头序列之后不 含有HDV核酶序列的复制系统RRS-T7M5-BFP和对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测不带HDV核酶序列的复制系统(图4B)及带有HDV的复制系统(图4C)中BFP在5或 50μM IPTG诱导下复制系统的工作情况。在图4B和图4C中，由于表达不同序列时其绝对表达强度 可能因为序列本身特性而有所不同，因而分别使用5μM IPTG诱导下相应对照复制系统的荧光表达强 度作归一化处理。由图4B可以得知，在不同浓度的IPTG诱导下，无HDV核酶序列的复制系统 RRS-T7M5-BFP的BFP荧光表达强度平均值均高于相应的对照复制系统(无HDV核酶的RRS突变- T7M5-BFP)，其中增加倍数在增加194％～227％之间，并且该增加均是显著的。而在图4C中，在不 同浓度的IPTG诱导下，在3’接头序列后具有HDV核酶序列的复制系统RRS-T7M5-BFP的BFP荧光 表达强度相对于对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP增加126％～243％。可以看到，是否具有HDV核 酶并不显著改变复制系统的功效。但考虑到去除3’末端额外的序列可能能够在其余可能的应用中避免 由于序列不同所导致的不必要的干扰发生，因而在后续的实验中，如无特别说明，均使用有HDV核 酶的复制系统。

(2)使用tRNA对复制系统5’末端进行切割，其示意图如图4D所示。构建复制系统RRS-pAra- GFP和对照复制系统RRS突变-pAra-GFP用于测试复制系统5’端切割，其是基于实施例2中的复制系 统RRS-T7M5-BFP和对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP，将蓝色荧光蛋白BFP替换为绿色荧光蛋白 GFP，同时将类T7启动子T7M5替换为阿拉伯糖诱导型启动子pAra，其余序列与实施例2中的复制 系统RRS-T7M5-BFP和对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP相同，获得无tRNA序列的复制系统RRS- pAra-GFP和对照复制系统RRS突变-pAra-GFP。

为使用tRNA对复制系统5’端进行切割，在无tRNA序列的复制系统RRS-pAra-GFP和对照复制 系统RRS突变-pAra-GFP的5’接头序列之前加入tRNA序列，构建在5’端含有tRNA序列的复制系统 RRS-pAra-GFP和相应对照复制系统RRS突变-pAra-GFP，如图4D所示(复制系统中在3’末端具有 HDV核酶序列，图4D中未示出)。

本实验中使用两种tRNA序列，tRNA-Gly序列和tRNA-Val序列，其中：

tRNA-Gly序列为： GCGGGAATAGCTCAGTTGGTAGAGCACGACCTTGCCAAGGTCGGGGtCGCGAGTTCGAGTCTCGT TTCCCGCTCCA；

tRNA-Val序列为： GCGTCCGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACCACCTTGACATGGTGGGGGTCGGTGGTTCGAGTCCA CTCGGACGCACCA。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测无tRNA序列的复制系统RRS-pAra-GFP(图4E)及带有tRNA-Gly的复制系统RRS-pAra- GFP(图4F)中GFP在0.1g/L或1g/L阿拉伯糖诱导下复制系统的工作情况，使用0.1g/L阿拉伯糖诱 导下相应对照复制系统的荧光表达强度作为参照进行归一化处理。由图4E可以得知，在不同浓度的 阿拉伯糖诱导下，在无tRNA的情况下，复制系统RRS-pAra-GFP的GFP荧光表达强度平均值均高于 对照复制系统RRS突变-pAra-GFP，其中增加倍数在增加216％～331％之间。由图4F可以得知，当在 5’接头序列的5’端增加tRNA-Gly序列时，在不同浓度的阿拉伯糖诱导下，复制系统RRS-pAra-GFP 的GFP荧光表达强度平均值均高于对照复制系统RRS突变-pAra-GFP，其中增加倍数在增加 331％～338％之间，均具有显著性，说明该复制系统可以起到促进蛋白表达的作用。

为了进一步确定插入tRNA的类型不影响复制系统的工作效果，进一步检测插入tRNA-Val或 tRNA-Gly后复制系统RRS-pAra-GFP中GFP在0.5g/L阿拉伯糖诱导下复制系统的工作情况，使用插 入tRNA-Val的对照复制系统RRS突变-pAra-GFP的荧光表达强度作为参照进行归一化处理，结果如 图4G所示。当插入tRNA-Val或tRNA-Gly时，复制系统RRS-pAra-GFP的GFP荧光表达强度平均值 均高于对照复制系统RRS突变-pAra-GFP，其中增加倍数分别是390％和482％，均具有显著性，说明 5’端增加的tRNA类型不影响复制系统的工作效果。

综合上述结果可以看到，转运RNA的添加与否或添加种类并不显著改变复制系统的功效。但考 虑到去除5’末端之前的额外的序列可能能够在其余可能的应用中避免由于序列不同所导致的不必要的 干扰发生，因而在后续的实验中，如无特别说明，则当使用阿拉伯糖启动子进行表达时，复制系统中 均在5’接头序列的5’端包含转运RNA(由于T7、T7M2、T7M4、T7M5、T7M6、J23115、J23109启 动子5’端不含有额外序列，因而无需添加转运RNA序列)。

实施例4对复制系统的正负链进行切割

本实施例中，通过HDV核酶分别对复制系统的正链和负链进行切割，以测试复制系统的正链和 负链在复制系统中的作用。

(1)对复制系统正链进行切割的原理示意图如图5A所示，其中显示使用HDV核酶对复制系统 正链进行切割的原理。当正链转录后被HDV核酶切割，RNA复制识别所需要的5’接头序列和3’接头 序列被分割开来，由于RNA复制过程需要RNA的5’接头和3’接头发生自配对环化过程，而当5’接 头与3’接头不处于同一条RNA时复制过程无法发生，因此断裂的mRNA无法进行复制，所有复制过 程及其带来的表达增强均无法发生，但由于mRNA的断裂不中断报告基因序列，因而断裂的mRNA 仍然可以进行翻译产生报告基因。

为验证正链在复制系统中的作用，基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，在BFP和复 制酶序列之间插入HDV核酶序列，构建复制系统RRS-T7M5-BFP(HDV中断正链)。具体而言，通 过PCR扩增获得RRS-T7M5-BFP质粒骨架和HDV核酶序列，利用Gibsonassembly方法将RRS- T7M5-BFP序列与HDV核酶序列整合在一起，获得HDV插入至RRS-T7M5-BFP中BFP和复制酶之 间的质粒，质粒图谱如图6所示。

其中BFP与复制酶序列之间插入的HDV核酶序列为： GCCGGCCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGGCCGGTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCC TCGGTAATGGCGAATGGGAC。

另外构建相应的对照质粒，其中表达对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP(HDV中断正链)，它 与HDV中断正链的复制系统RRS-T7M5-BFP的差别仅在于其中复制酶通过移码突变而失活。

使用与实施例2相同的HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测该复制系统RRS-T7M5-BFP(HDV中断正链)和其相应的对照复制系统在不同浓度的IPTG 诱导下的荧光强度。在不同浓度的IPTG诱导下，复制系统RRS-T7M5-BFP(HDV中断正链)的BFP 荧光表达强度平均值与相应的对照复制系统基本相同(图5B)，说明当复制系统正链被中断时，复 制系统几乎无法工作，这证明复制过程需要复制序列的完整性。

(2)负链表达目的基因验证复制过程发生的原理示意图如图5C所示。通过设计表达序列使得表 达出的mRNA上含有目的基因的反义互补序列，因此正链mRNA(正链)不能进行翻译。如果 mRNA发生复制产生负链，负链上的目的基因为正向可以进行翻译，因此，如果目的基因表达，则一 定是产生了负链，证明了RNA复制过程的发生。同时，设计用HDV核酶切割新生成的负链，即在反 义互补的BFP序列和复制酶序列之间插入反义互补的HDV核酶序列，位于负链上的HDV核酶使得 负链被切断无法复制为正链，保证所有负链均是通过表达的mRNA经过单次复制产生，便于进一步 计算复制效率。

为了对其进行验证，基于实施例2构建的复制系统RRS-T7M5-BFP进行改造，将其中的5’UTR- BFP-复制酶-3’UTR替换为3’UTR反义序列-移码突变失活的复制酶的反义序列-HDV核酶反义序列- BFP反义序列-5’UTR反义序列，获得反义互补复制系统RRS-T7-revBFP，其中使用移码突变失活的 复制酶的反义互补序列是为了维持转录本长度一致。使用与实施例2相同的质粒构建方法获得表达该 复制系统的质粒。

复制系统RRS-T7-revBFP的具体序列包括：

(T7启动子序列为斜体，5’及3’UTR反义互补序列标为下划线，HDV核酶反义互补序列标为粗体，BFP反义互补序列标为斜体下 划线，移码突变的复制酶反义互补序列标为粗斜体)。复制系统RRS-T7-revBFP在3’端包含HDV核 酶序列，即其具体结构为：T7启动子-3’UTR反义序列-移码突变的复制酶反义序列-HDV核酶反义序 列-BFP反义序列-5’UTR反义序列-HDV正义序列，但上述具体序列中未示出该HDV核酶序列。

同时构建P15A复制子、阿拉伯糖诱导启动子表达的复制酶质粒P15A-pAra-Repopt用于表达密码 子优化的复制酶，其中密码子优化的复制酶的编码核酸序列为： ATGTCTAAAACCCTGCAGTCTCGTAAATCTCTGTCTGGTAAACTGCGTCGTGCTGCTAACACCCG TATCGTTGTTGAAGGTAACCTGGCTCTGTCTATCGCTAACGACCTGCTGTCTGCTCTGGACGTTG AACCGTTCAACTCTGAAGAAGACTGCATCTCTCGTTCTCCGAAATTCGGTATCTCTCCGGACCAG TTCCGTAACTCTTACCTGCGTGCTGAAATCATGTCTAAATACGACTCTTTCTCTCTGGGTATCAAC ACCGAAGCTGTTGCTTGGGAAAAATTCCTGGCTGCTGAAGCTGAATGCGCTAAAACCAACCTGC GTCTGTACCGTCCGAACTACAACGAAGACTTCAACTTCTCTCTGGGTGAAACCTGCATCCACATG GCTCGTCGTAAAATCGTTAAACTGCTGGGTGACTCTGTTCCGTTCGAAGCTGTTCTGCGTCATTG CAGGTTCTCTGGTGGTGCGACCACCACCAACTCTCGTCTGTACGGTCACCCGTCTTTCAAATTCG CTCTGGCTCAGGAATGCACCCCGCGTGCTGTTCCGTACGTTCAGGCTCTGAAAGCATGCACCAAC ATGGACCTGGGTATCACCAAAGTTTCTCCGTTCAACAAAGCTGTTACCGTTCCGAAAAACTCTAA AACCGACCGTTGCATCGCTATCGAACCGGGTTGGAACATGTTCTTCCAGCTGGGTATCGGTGGTG TTATCCGTGAAAAACTGCACCTGTGGAACATCGACCTGAACGACCAGACCATCAACCAGGTTCG TGCTTACTCTGGTTCTTGCTCTAACGAACTGGCTACCGTTGACCTGTCTTCTGCTTCTGACACCAT CTCTCTGGCTCTGGTTGAACTGCTGCTGCCGCCGGCTTGGTTCAAAGTTCTGACCGACCTGCGTT CTCGTCGTGGTATGCTGCCGGACGGTCGTATCATCACCTACGAAAAAATCTCTTCTATGGGTAAC GGTTTCACCTTCGAACTGGAATCTCTGATCTTCGCTGCTCTGGCTCGTTCTCTGTGCGAACTGCTG AACCTGCAGCCGTCTTCTGTTACCGTTTACGGTGACGACATCATCCTGCCGTCTGACGCTTGCTCT TCTCTGATCGAAGTTTTCTCTTACGTTGGTTTCCGTACCAACGAAAAAAAAACCTTCTTCGACGG TCCGTTCCGTGAATCTTGCGGTAAACACTACTTCATGGGTGTTGACGTTACCCCGTTCTACATCC GTCACCGTATCGTTTCTCCGTCTGACCTGATCCTGGTTCTGAACCAGATGTACCGTTGGGCTACC ATAGACGGTGTGTGGGACCCGAGAGTTTACCCGGTCTACACCAAATACCGTCGTCTGCTGCCGG ACATCCTGCGTCGTAACGTTGTTCCGGACGGTTACGGTGACGGTGCTCTGGTTGGTTCTGTTCTGACCTCTCCGTTCGCTGAAAACCGTGGTTGGGTTCGTCGT。

用与实施例2相同的方法将构建的反义互补复制系统RRS-T7-revBFP使用HK022的attB/P方式 整合于目的菌株JM109(DE3)基因组或含有阿拉伯糖诱导启动子表达的复制酶质粒P15A-pAra-Repopt 的目的菌株JM109(DE3)基因组上，转化后检测在阿拉伯糖浓度0g/L、0.1g/L或1g/L下的BFP荧光表 达强度。如图5D所示，在不同浓度的阿拉伯糖诱导下，不表达复制酶的目的菌株或阿拉伯糖浓度为 0g/L时表达复制酶的目的菌株几乎没有表达BFP，当阿拉伯糖浓度为0.1g/L或1g/L即相应的复制酶 被诱导表达时，表达复制酶的目的菌株的BFP荧光表达强度平均值均显著高于无复制酶的目的菌株。 同时对于表达复制酶的目的菌株，阿拉伯糖浓度0.1g/L或1g/L(即复制酶表达)时目的菌株的BFP 荧光表达强度平均值均显著高于阿拉伯糖浓度0g/L(即复制酶不表达)时的荧光强度。这些结果说明 无复制酶时(目的菌株不表达复制酶或阿拉伯糖浓度为0g/L时)本身(正链)表达反义互补的荧光 序列无法表达，而当阿拉伯糖诱导表达复制酶时对应的荧光表达也显著增高，证明复制的发生并且产 生了负链。

(3)中断负链后复制系统工作原理示意图如图5E显示。其中使用HDV核酶对负链进行切割， 使得负链中断为两条独立序列，即复制出的负链中的HDV核酶序列通过其自剪切功能将BFP序列和 复制酶序列分割开来。当负链由正链复制后即被HDV核酶切割，而断裂的mRNA无法进行复制，所 以无法得到更多正链，与正常的复制过程相比，第二次复制过程及其带来的表达增强无法发生。

为了检测中断负链的效果，基于实施例2中的复制系统RRS-T7M5-BFP，在其BFP正义序列和复 制酶正义序列之间插入HDV的反义互补序列，即负链的BFP与复制酶区域之间能被HDV核酶中 断，获得复制系统RRS-T7M5-BFP(中断负链)。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测该复制系统RRS-T7M5-BFP(中断负链)在不同浓度的IPTG诱导下荧光强度。在不同浓度 的IPTG诱导下，负链被中断的复制系统的复制倍数相对于正常的复制系统RRS-T7M5-BFP(即实施 例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP)显著下降(图5F)，证明切割负链同样会导致复制系统功 能显著下降，说明负链在RNA复制系统促进目的蛋白表达中起到了重要作用。

实施例5复制系统在不同启动子及不同表达载体下的工作效果

基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，将蓝色荧光蛋白BFP替换为绿色荧光蛋白 GFP，同时将类T7启动子T7M5分别替换为两种组成型启动子J23109 (TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGC)及J23115 (TTTATAGCTAGCTCAGCCCTTGGTACAATGCTAGC)，分别构建复制系统RRS-J23109-GFP和 复制系统RRS-J23115-GFP，并构建相应的复制酶移码突变失活的对照复制系统，

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测这两种复制系统的荧光强度，结果如图7A所示。结果显示在这两种组成型启动子的控制 下，复制系统的GFP荧光表达强度平均值均显著高于相应的对照复制系统，其中RRS-J23109-GFP的 增加倍数为42％，RRS-J23115-GFP的增加倍数为232％。

对于实施例3中构建的带有tRNA序列的阿拉伯糖诱导启动子控制表达的复制系统RRS-pAra- GFP(示意图参见图4D)，检测其在不同浓度的阿拉伯糖诱导下的荧光强度，结果如图7B所示。在 不同浓度阿拉伯糖诱导下，复制系统的GFP荧光表达强度平均值均高于相应的复制酶移码突变失活 的对照复制系统，其中增加倍数在175％～419％，当阿拉伯糖浓度高于0.5g/L时均具有显著差异。这 些结果证明复制系统在不同类型的诱导启动子和组成型启动子下均能发挥作用。

构建组成型启动子J23109控制下分别整合在基因组上表达或由P15A复制子质粒表达的复制系统 RRS-J23109-GFP，检测其的荧光强度，结果如图7C所示。结果显示复制系统在基因组表达或用 P15A质粒表达时，复制系统的GFP荧光表达强度平均值均显著高于相应的复制酶移码突变失活的对 照复制系统RRS突变-J23109-GFP，其中基因组表达增加倍数为42％，P15A质粒表达增加倍数为 37％，证明复制系统在基因组表达或质粒表达时均能发挥作用。

实施例6复制系统在不同目的菌株中的工作效果

使用实施例5中构建的J23109控制下P15A复制子质粒表达的复制系统RRS-J23109-GFP (P15A)，检测其在大肠杆菌MG1655、BL21或JM109中的荧光强度。图8A显示了复制系统在不 同类型大肠杆菌中的工作效果。结果显示在这三种大肠杆菌中，复制系统的GFP荧光表达强度平均 值均显著高于相应的复制酶移码突变失活的对照复制系统RRS突变-J23109-GFP(P15A)，其中在 MG1655中的增加倍数为34％，在BL21中的增加倍数为46％，在JM109中的增加倍数为37％。说明 复制系统对于不同的大肠杆菌目的菌株均能发挥作用。

图8B显示了复制系统在革兰氏阳性菌Lb.caseil Zhang中的工作效果。使用穿梭质粒pNZ5348质 粒为骨架，乳酸菌启动子P1144表达以GFP作为报告基因的复制系统，构建复制系统质粒RRS- P1144-GFP(PNZ5348)及复制酶移码突变失活的对照复制系统质粒RRS突变-P1144-GFP(PNZ5348)和不 含复制系统的质粒P1144-GFP，其中不含复制系统的质粒P114-GFP相对于复制系统质粒RRS-P114- GFP(pNZ5348)而言不含有复制酶的编码序列，检测它们在Lb.caseil Zhang中的荧光强度。结果说明 复制系统的GFP荧光表达强度平均值均显著高于对照复制系统和不表达复制系统的对照，其相对于 对照复制系统增加的倍数是75％，相对于不表达复制系统的对照增加的倍数是249％。结果证明复制 系统在革兰氏阳性菌中同样能发挥作用，进一步证明了复制系统的通用性。

实施例7 RNA复制抑制基因Rnc敲除对系统工作的必要性

本实施例检测复制系统在不同程度的转录起始下的工作效果。基于实施例2中构建的复制系统 RRS-T7M5-BFP，将T7M5启动子分别替换为T7、T7M2、T7M4或T7M6(T7：野生型T7启动子， T7M2：1/2.5弱化的T7启动子，T7M4：1/10弱化的T7启动子，T7M5：1/100弱化的T7启动子， T7M6：1/270弱化的T7启动子)，构建复制系统RRS-T7-BFP、RRS-T7M2-BFP、RRS-T7M4-BFP、 RRS-T7M5-BFP和RRS-T7M6-BFP，使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法 将表达这些复制系统的质粒整合到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光 表达量。

整合在基因组后检测这几种复制系统的荧光强度，结果如图9A所示，其中RRS-BFP为使用不同 启动子的复制系统，RRS突变-BFP为使用不同启动子的对照复制系统。图9A显示了复制系统在不同 强度的类T7启动子下的工作效果，结果说明在野生型T7启动子和T7M2启动子下，复制系统的BFP 荧光表达强度平均值均低于对照复制系统，而随着T7启动子弱化程度的增加，复制系统的BFP荧光 表达强度平均值高于对照复制系统，与前面实施例中所述的结果一致，在T7M5下复制系统相对于对 照复制系统增加的倍数是170％，具有显著差异(T7M6由于表达强度过于弱，低于仪器测量荧光强 度时的准确范围，所以其数据不可信)。这些结果证明复制系统只能在起始模板表达量较低(使用 T7M5启动子)时效果较好，一些因素限制了复制系统在高起始模板时的工作效果。

根据文献调研及前期实验，我们发现Rnc基因作为一种双链RNA酶，其在细胞中可以切割双链 RNA，由于细菌中本身几乎不含双链RNA，Rnc基因本身可能作为一种抗噬菌体侵染的机制存在，帮 助细菌抵抗RNA噬菌体的感染，因此，RNA复制系统复制产生的双链RNA可能会被切割，导致复 制效果减弱。为了减少Rnc基因对复制系统工作性能的影响，选择最优的底盘菌株，我们使用山东农 业大学的朱常香教授提供的JM109(DE3)敲除Rnc的菌株(本文命名为JM109(DE3)ΔRnc)加以验 证。图9B～D显示Rnc基因敲除能促进复制系统的工作效果。

使用qRT-PCR对Rnc基因表达量进行了测量，以16S基因作为内参，以JM109(DE3)ΔRnc菌株 作为参照进行归一化处理得到相对基因表达量。图9B显示了对Rnc敲除的验证，结果证明 JM109(DE3)ΔRnc菌株中的Rnc基因表达量显著低于JM109(DE3)菌株，说明Rnc基因得到有效敲除。

使用实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，检测在100μM IPTG诱导下，复制系统在 JM109(DE3)和JM109(DE3)ΔRnc菌株中的荧光表达强度，图9C显示了Rnc基因敲除后复制系统 RRS-T7M5-BFP的目的基因表达情况，结果表明在JM109(DE3)ΔRnc菌株中，复制系统RRS-T7M5- BFP的BFP荧光表达强度平均值显著高于相应的对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP，增加的倍数是 341％，这显著高于JM109(DE3)菌株中增加的倍数(170％)，证明Rnc基因敲除能显著增加目的基因 的表达量。

基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，使用qRT-PCR方法对复制酶基因在JM109(DE3)和JM109(DE3)ΔRnc菌株中的表达量分别进行测量。以16S基因作为内参，JM109(DE3) 对照复制系统中的突变复制酶作为参照进行归一化处理得到相对基因表达量。图9D显示了Rnc基因 敲除后基因表达量。结果说明JM109(DE3)ΔRnc菌株中，复制系统RRS-T7M5-BFP的复制酶基因相对 表达量显著高于对照复制系统RRS突变-T7M5-BFP，增加的倍数是65％，同时复制系统RRS-T7M5- BFP在JM109(DE3)ΔRnc菌株中的基因相对表达量显著高于JM109(DE3)菌株中的基因相对表达量， 证明Rnc基因敲除能从基因表达量上实现促进效果，进一步说明Rnc基因敲除能促进复制系统的工作 效果。

实施例8 Rnc基因敲除后复制系统在不同强度的T7启动子下的工作效果

基于实施例7中构建的复制系统RRS-T7-BFP、RRS-T7M2-BFP、RRS-T7M4-BFP、RRS-T7M6- BFP，使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM109(DE3)ΔRnc基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

分别检测它们在100μM IPTG诱导下、在JM109(DE3)和JM109(DE3)ΔRnc菌株中的荧光强度。 图10A～D显示了Rnc基因敲除后复制系统在四种不同强度的类T7启动子(T7，T7M2，T7M4， T7M6)下的工作效果。

图10A显示T7启动子下复制系统RRS-T7-BFP的作用，相对于JM109(DE3)菌株中复制系统的 BFP荧光表达强度平均值低于相应的对照复制系统，在JM109(DE3)ΔRnc菌株中复制系统的BFP荧光 表达强度平均值显著高于相应的对照复制系统，增加的倍数是40％，同时复制系统RRS-T7-BFP在 JM109(DE3)ΔRnc菌株中的BFP荧光表达强度显著高于在JM109(DE3)菌株中的。

图10B显示了T7M2启动子下复制系统RRS-T7M2-BFP的作用，同样地，在JM109(DE3)ΔRnc 菌株中复制系统的BFP荧光表达强度平均值显著高于相应的对照复制系统，增加的倍数是40％，同 时复制系统在JM109(DE3)ΔRnc菌株中的BFP荧光表达强度显著高于在JM109(DE3)菌株中的。

图10C显示了T7M4启动下复制系统RRS-T7M4-BFP的作用，与JM109(DE3)菌株相比，在 JM109(DE3)ΔRnc菌株中复制系统的BFP荧光表达强度平均值与突变的复制系统的差距显著增大，增 加的倍数是104％。

图10D显示了T7M6启动下复制系统RRS-T7M6-BFP的作用，在JM109(DE3)ΔRnc菌株中的 BFP荧光表达强度显著增高。

这些结果证明Rnc基因敲除后在不同强度的启动子下目的基因表达量均优于未敲除菌株。

图10E显示了Rnc基因敲除后不同启动子下复制系统的复制效率，其中复制效率是复制系统平均 荧光强度与相应的对照复制系统平均荧光强度的比值。结果说明Rnc基因敲除后复制系统工作效率优 于未敲除菌株，同时与未敲除时类似，复制系统对起始模板低的情况具有更佳的复制效率，但对于更 高的起始模板也能有所促进。

实施例9复制系统在不同的表达形式下的工作效果

基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，将复制系统分别整合至基因组表达、用P15A 质粒表达或用ColE1质粒表达，结果如图11所示。结果说明在这三种不同的表达形式下，复制系统 的BFP荧光表达强度平均值均高于突变的复制系统，其中基因组表达的增加倍数为341％，P15A质 粒表达的增加倍数为439％，ColE1质粒表达的增加倍数为171％，证明复制系统以基因组形式或质粒 形式表达时均能发挥作用。

实施例10复制系统的基因容量检测

前述实施例中采用荧光蛋白BFP或GFP作为目的基因测试复制系统的性能，对应的基因长度较 短，为了进一步测试RNA复制系统对基因的容量以及其他类型目的基因的表达效果，进行如下设 计。

检测复制系统基因容量示意图如图12A所示。基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP， 在BFP序列后分别插入GFP、CmR-GFP、GalK-GFP或LacZ-GFP，构建复制系统RRS-T7M5-BFP- GFP、RRS-T7M5-BFP-CmR-GFP、RRS-T7M5-BFP-GalK-GFP和RRS-T7M5-BFP-LacZ-GFP，利用两 种报告基因及不同长度的其他基因检测复制系统的基因容量。

其中，GFP序列为： ATGTCAAAAGGGGAAGAACTCTTCACCGGGGTTGTGCCTATACTCGTTGAATTGGACGGCGACG TTAATGGACACAAATTTTCCGTGTCAGGGGAGGGCGAAGGCGACGCGACGTACGGGAAACTCACTCTCAAATTTATATGTACCACCGGGAAATTACCCGTTCCTTGGCCTACGCTCGTGACCACCTTAA CCTATGGCGTTCAATGTTTTTCGCGATACCCTGACCATATGAAAAGACATGATTTTTTCAAGTCA GCGATGCCTGAAGGCTATGTGCAGGAAAGGACCATTTTTTTCAAAGACGATGGAAACTACAAGA CTCGTGCAGAAGTGAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTTAATAGGATCGAGTTGAAAGGCATAGA CTTTAAAGAAGACGGGAACATACTCGGGCACAAATTAGAATACAACTATAACTCGCACAATGTC TACATCATGGCGGATAAACAAAAGAATGGGATCAAAGTTAACTTCAAAATAAGGCACAACATA GAAGACGGGAGTGTTCAATTAGCGGATCATTATCAACAAAATACCCCTATAGGTGACGGTCCCGTGCTCTTGCCTGATAACCATTACCTGTCTACGCAATCCGCGCTCTCAAAAGACCCTAACGAAAAG AGGGATCACATGGTGCTCCTGGAGTTTGTGACGGCAGCAGGAATAACGCATGGTATGGACGAAT TATACAAATAA；

CmR-GFP序列为： ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATT TTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCG CCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGAT AGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGA ATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAA ACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGA GTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGG GCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGT TTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAG GGCGGGGCGTAATAATGGATCCCTAGGTAATAATCCTCTACAAATAATTTTGTTTAATCGGTTAA GAAGGAGATATACATATGTCAAAAGGGGAAGAACTCTTCACCGGGGTTGTGCCTATACTCGTTG AATTGGACGGCGACGTTAATGGACACAAATTTTCCGTGTCAGGGGAGGGCGAAGGCGACGCGA CGTACGGGAAACTCACTCTCAAATTTATATGTACCACCGGGAAATTACCCGTTCCTTGGCCTACG CTCGTGACCACCTTAACCTATGGCGTTCAATGTTTTTCGCGATACCCTGACCATATGAAAAGACA TGATTTTTTCAAGTCAGCGATGCCTGAAGGCTATGTGCAGGAAAGGACCATTTTTTTCAAAGACG ATGGAAACTACAAGACTCGTGCAGAAGTGAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTTAATAGGATCGA GTTGAAAGGCATAGACTTTAAAGAAGACGGGAACATACTCGGGCACAAATTAGAATACAACTAT AACTCGCACAATGTCTACATCATGGCGGATAAACAAAAGAATGGGATCAAAGTTAACTTCAAAA TAAGGCACAACATAGAAGACGGGAGTGTTCAATTAGCGGATCATTATCAACAAAATACCCCTAT AGGTGACGGTCCCGTGCTCTTGCCTGATAACCATTACCTGTCTACGCAATCCGCGCTCTCAAAAG ACCCTAACGAAAAGAGGGATCACATGGTGCTCCTGGAGTTTGTGACGGCAGCAGGAATAACGCA TGGTATGGACGAATTATACAAATAA；

GalK-GFP序列为： ATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGGCTACCCTGCCACTCACAC CATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACCGACTACAACGACGGTTTCGTTC TGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTAAAGTTCGC GTGATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCACA TGAAAACTATCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGTAACAAC AGCTTCGGCGGCGTGGACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTT CCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGC GCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGCAGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCA TGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCGGCAAGAAAGATCATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTG GGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTGTGGCTGTCGTCATCATCAACAGTAACTTCAAAC GTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAACAGTGCGAAACCGGTGCGCGTTTCTT CCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGCTGTTGCGCATGAACTGGAC CCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCGTTGAAGCTGCCA GCGCGCTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGGAGTCTCATGCCTCTAT GCGCGATGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTG ATTGGCGACAAAGGTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGA TCCCGGAAGAGCTGGTGCCTGCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGG TATTAAAGAGACTTTTTACGTTTGTAAACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGAGGATCCCTA GGTAATAATCCTCTACAAATAATTTTGTTTAATCGGTTAAGAAGGAGATATACATATGTCAAAAG GGGAAGAACTCTTCACCGGGGTTGTGCCTATACTCGTTGAATTGGACGGCGACGTTAATGGACA CAAATTTTCCGTGTCAGGGGAGGGCGAAGGCGACGCGACGTACGGGAAACTCACTCTCAAATTT ATATGTACCACCGGGAAATTACCCGTTCCTTGGCCTACGCTCGTGACCACCTTAACCTATGGCGT TCAATGTTTTTCGCGATACCCTGACCATATGAAAAGACATGATTTTTTCAAGTCAGCGATGCCTG AAGGCTATGTGCAGGAAAGGACCATTTTTTTCAAAGACGATGGAAACTACAAGACTCGTGCAGA AGTGAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTTAATAGGATCGAGTTGAAAGGCATAGACTTTAAAGAA GACGGGAACATACTCGGGCACAAATTAGAATACAACTATAACTCGCACAATGTCTACATCATGG CGGATAAACAAAAGAATGGGATCAAAGTTAACTTCAAAATAAGGCACAACATAGAAGACGGGA GTGTTCAATTAGCGGATCATTATCAACAAAATACCCCTATAGGTGACGGTCCCGTGCTCTTGCCT GATAACCATTACCTGTCTACGCAATCCGCGCTCTCAAAAGACCCTAACGAAAAGAGGGATCACA TGGTGCTCCTGGAGTTTGTGACGGCAGCAGGAATAACGCATGGTATGGACGAATTATACAAATA A；

LacZ-GFP序列为 ATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCA TTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCG TGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCG CCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAA CGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTG CACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGA TTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGA GCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCT GTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCA ATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGG TGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGG CGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATG AAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGA AGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAA ATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATC AGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGA TACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAG CGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGA AGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTG GATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGT GCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCT GGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGC GAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCT TTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGT GCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCG AACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATA CACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTT ATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAG TGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGA GCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGT TTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGG TCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTC AACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGG AAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAG CCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTC AAAAATAAGGATCCCTAGGTAATAATCCTCTACAAATAATTTTGTTTAATCGGTTAAGAAGGAG ATATACATATGTCAAAAGGGGAAGAACTCTTCACCGGGGTTGTGCCTATACTCGTTGAATTGGAC GGCGACGTTAATGGACACAAATTTTCCGTGTCAGGGGAGGGCGAAGGCGACGCGACGTACGGG AAACTCACTCTCAAATTTATATGTACCACCGGGAAATTACCCGTTCCTTGGCCTACGCTCGTGAC CACCTTAACCTATGGCGTTCAATGTTTTTCGCGATACCCTGACCATATGAAAAGACATGATTTTTTCAAGTCAGCGATGCCTGAAGGCTATGTGCAGGAAAGGACCATTTTTTTCAAAGACGATGGAAAC TACAAGACTCGTGCAGAAGTGAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTTAATAGGATCGAGTTGAAAG GCATAGACTTTAAAGAAGACGGGAACATACTCGGGCACAAATTAGAATACAACTATAACTCGCA CAATGTCTACATCATGGCGGATAAACAAAAGAATGGGATCAAAGTTAACTTCAAAATAAGGCAC AACATAGAAGACGGGAGTGTTCAATTAGCGGATCATTATCAACAAAATACCCCTATAGGTGACG GTCCCGTGCTCTTGCCTGATAACCATTACCTGTCTACGCAATCCGCGCTCTCAAAAGACCCTAAC GAAAAGAGGGATCACATGGTGCTCCTGGAGTTTGTGACGGCAGCAGGAATAACGCATGGTATGGACGAATTATACAAATAA。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

在800μM IPTG诱导下，检测复制系统的BFP荧光表达强度和GFP荧光表达强度，结果如图 12B和图12C所示，其中RRS-T7M5表示插入不同长度目的基因的复制系统，RRS突变-T7M5表示 插入不同长度目的基因的对照复制系统，B表示插入的目的基因是BFP，BG表示插入的目的基因是 BFP-GFP，BCG表示插入的目的基因是BFP-CmR-GFP，BGG表示插入的目的基因是BFP-GalK- GFP，BLG表示插入的目的基因是BFP-LacZ-GFP。图12B显示了插入不同长度目的基因时复制系统 BFP表达情况，当在复制系统中插入不同长度的目的基因时，复制系统的BFP荧光表达强度平均值均 高于相应的对照复制系统，其中目的基因是BFP、BFP-GFP或BFP-CmR-GFP时，BFP荧光表达强度 具有显著差异，增加倍数是11％～261％。图12C显示了插入不同长度目的基因时复制系统GFP表达 情况，同样地，当在复制系统中插入不同长度的目的基因时，复制系统的GFP荧光表达强度平均值 均显著高于相应的对照复制系统，增加的倍数是55％～262％。这些结果说明复制系统对于不同长度的 目的基因均能发挥较好的工作效果。

实施例11接头序列对复制系统工作的重要性

接头序列去除后复制系统变化原理示意图如图13A所示。当去除接头序列后，mRNA无法进行复 制，所以复制过程及其带来的表达增强均无法发生，只有原始转录得到的mRNA才可以进行翻译产 生目的基因。

基于实施例7构建的复制系统RRS-T7M2-BFP和RRS-T7M5-BFP，分别单独删除复制系统的5’ 接头序列、3’接头序列、或同时删除5’和3’接头序列，分别构建复制系统RRS-T7M2-BFP--Δ5’、 RRS-T7M2-BFP--Δ3’、RRS-T7M2-BFP--Δ5’&Δ3’以及RRS-T7M5-BFP--Δ5’、RRS-T7M5-BFP--Δ3’、 RRS-T7M5-BFP--Δ5’&Δ3’，使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这 些复制系统的质粒整合到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

分别检测在100μM IPTG诱导下复制系统的BFP荧光表达强度，去除接头序列后复制系统的工作 效果如图13B～C所示，其中RRS-T7M5-BFP为删除或不删除接头序列的复制系统，RRS突变-T7M5- BFP为相应的删除或不删除接头序列的对照复制系统，WT为不删除任何接头序列，Δ5’为删除5’接 头序列，Δ3’为删除3’接头序列，Δ5’&Δ3’为同时删除5’和3’接头序列。图13B显示了T7M2启动子 下去除接头序列后复制系统的BFP荧光表达强度，结果说明单独去除5’接头序列时，复制系统的 BFP荧光表达强度平均值仍高于相应的对照复制系统，但增加的倍数小于不去除5’接头序列。当去除 3’接头序列或同时去除5’和3’接头序列时，复制系统的BFP荧光表达强度平均值均低于相应的对照复 制系统，降低的倍数是44％和82％，具有显著性。图13C显示了T7M5启动子下去除接头序列后复制 系统的BFP荧光表达强度，结果说明当去除5’接头序列、3’接头序列或同时去除5’和3’接头序列 时，复制系统的BFP荧光表达强度平均值仍高于相应的对照复制系统，但增加的倍数小于不去除接头 序列。这些结果证明接头序列是维持复制过程正常发生必须的。

上述实验证明RNA复制系统中5’非编码区和3’非编码区是系统中必须的序列元件，该二者通过 配对将可复制的序列自环化，进而在复制酶的作用下起始复制过程。根据Munishkin等人报道，在体 外时Qβ复制酶会将复制序列缩短为RQ135序列(AlexanderV.Munishkin,Leonid A.Voronin,Victor I. Ugarov,Larisa A.Bondareva,HelenaV.Chetverina,Alexander B.Chetverin.(1991).Efficient templates for Qβreplicaseare formed by recombination from heterologous sequences.Journal of MolecularBiology,221, 463-472)，此序列更短并且复制效率更高。因此，我们设计将复制系统的5’与3’序列替换为RQ135 的5’与3’序列。

基于实施例2构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，将其5’和3’接头序列分别替换为RQ135的5’和 3’接头序列，构建复制系统RRS-T7M5-BFP-RQ135。具体地，RQ135 5’UTR序列为 GGGTTCCAACCGGAAGTTGAGGGATGCCTAGGCATCCCCCGTGCGTCCCTT，RQ135 3’UTR序列 为 TACGAGGGATTTGAGAGATGCCTAGGCATCTCCCGCGCGCCGGTTTCGGACCTCCAGTGCGTGTTACCGCACTGTTAGCCCA。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测在不同浓度的IPTG诱导下复制系统的BFP荧光表达强度，接头序列替换为RQ135序列后复 制系统的工作效果如图13D～E所示，其中RRS-T7M5-BFP表示复制系统RRS-T7M5-BFP，RRS突变- T7M5-BFP表示相应的复制酶移码突变失活的对照复制系统，原始接头序列表示使用实施例2中构建 的复制系统RRS-T7M5-BFP中的Qβ复制酶的5’和3’接头序列，RQ135接头序列表示使用RQ135的 5’与3’序列。图13D显示了复制系统RRS-T7M5-BFP-RQ135在三种不同浓度的IPTG诱导下的BFP 表达情况，其中复制系统BFP荧光表达强度平均值均显著高于相应的对照复制系统，增加的倍数是 75％～125％。图13E显示了在100μM IPTG诱导下不同接头序列下复制系统的BFP荧光表达强度，其 中接头序列替换为RQ135接头序列后，与具有原始接头序列的复制系统类似，复制系统BFP荧光表 达强度平均值仍高于对照复制系统，增加的倍数是75％。这些结果证明制系统的复制必需序列可被替 换为其余序列。

实施例12 Qβ噬菌体原始序列回补对复制系统的影响

在上述实施例中所述的复制系统中，5’接头部分保留了噬菌体前55bp的序列。为了研究5’端序 列是否还存在与复制相关的序列，我们在实施例2构建的复制系统RRS-T7M5-BFP的基础上，分别在 5’接头和BFP之间插入不同长度的A2序列，或在BFP和复制酶之间插入不同长度的A1序列，观察 插入序列对复制系统是否有影响。我们将在复制系统中插入Qβ噬菌体原始序列称为回补。

图14A和14C显示了噬菌体原始序列序列回补示意图。在图14A中，分别对复制系统回补不同 长度移码突变的A2序列，即在复制系统5’接头后依次插入来源于原始噬菌体序列不同长度移码突变 的A2序列(300bp，600bp，1000bp，1266bp)。在图14C中，分别对复制系统回补A1序列或移码 突变的A1序列。其中移码突变是指在原序列的7处位点进行碱基插入，从而造成移码突变

基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，在5’接头序列和BFP序列之间分别插入300bp 移码突变的A2序列、600bp移码突变的A2序列、1000bp移码突变的A2序列或1266bp移码突变的 A2序列，移码突变的A2序列为： ATGCCACGTTTACCTAGGGCACTTCGTTTCGGACCGAATATGGAGGTCTTAAGCGACTTCCAGGA ACTCTGGTATCCAGAGTCCATTATCGATTCCGATGTGAAATACCCTTTGTATACCTTCAGAGGTA GCATCGGTGGATCTTTCTTTGATTCTTACGGCACGAATAATATCGTCCGCGAGATTCGTAGAACG CCTCACTGTGCTACAGTACCTATAGCCAGTTCTGGCTTAAGGCCCTGTACCTCCGTTTGGTATGA CCCAACCAGCTTGCTCTTCAGGATTCCTGAGATGAGGGCTGAGTGGGACAATGGCATGGGTGAT GCTGGAGATATCGTCTATAAAGACTTTCTCTTCAGCACCCCGGCACCTAAAGAGTTAGATTTCTC GAATTCCTTAGCGCCACGCTACAGTAATGCCTTCTCCGCTTTTAATGCCAAATATGGCGTTATCA TCGGTGAAGGGCACGAAACACTTAAGTATTTCGCGCTGTTACTTCGCAGGCTACATAAAGCAGT CCGTGCCGTTCGGCACGGAGATTTACGTGGCCTCCGGAAAATCCTCGACTCTTATAATAAGGGTC GTTGGAAGCCTGCTACTGCTGGTAATCTCTGGCTCGAGTAAAGGTAAGGTTAAACTCCGCTCTTC CATGACATTAAAAGTGTTATGGATGATTGGAACCGTATTAACGACAAGATCCAGAAACTTCGCC GTTTCTCTGTTGGTCACGGTGAGGATTTCAAGCTATCAATAGATGGTTTGTATCCTGGCCTAACC CACTTCAGGTTATCCGGCGAGATTACCGTCCAGCGCCGTCATCGGTGGGGTATAACCTACGCTAA TCGCGAAGGTTACGCCACATTCGACAACGGTTCCATTCGGCCCGTGTCCGACTGGAAGGAACTC GCTAACGCGTTTATCAACCCTGGCGAAGTTGCATGGGAATTAACACCATACAGCTTCATCGTGG ATTGGTTTATCAACGTTGGCGATATTATTGAGCAGCAGAAGCAATGGTATCAGAATATTGACATT GTCGACGGTTACCAGCGTCGCGATATACGCATGCGTTCCGTCTCTCTTAAAGGAGTACGGAATG GCATACCTGTACGCGTTACTGGATCAGTCGAACTTGTTGATTCCTTTTACAATCGCTCTCATACTA CTCGTATCCCGCAAGCCACACTAGCAATCGATACGTCCTTCTCGAGTATTAAACACGTGATGGACAGTATTTCTCTTATAACTCAGCGCATAAAACGCTGA。

该移码突变的A2序列相对于野生型Qβ噬菌体的A2序列插入了标有下划线的终止子。

所述的300bp移码突变的A2序列、600bp移码突变的A2序列、1000bp移码突变的A2序列或 1266bp移码突变的A2序列是指从上述移码突变的A2序列的5'端开始分别截取300bp、600bp、 1000bp和1266bp。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测在100μM IPTG诱导下复制系统的BFP荧光表达强度，A2序列回补对复制系统的影响如图 14B所示。结果说明A2的不同长度回补对BFP表达产生了不同影响，总体上复制系统BFP荧光表达 强度平均值均高于相应的对照复制系统，增加倍数是43％～211％。这说明虽然A2的不同长度回补对 BFP的表达产生了不同影响，但总体上复制作用仍都可以发生。虽然荧光相对值不同，但其可能是由 于BFP的5’端序列发生了改变从而影响了其翻译。例如以总荧光值超过原始复制系统的回补1000bp 组为例，在考量其复制倍数时尽管其荧光值更高，但其复制倍数与野生型复制系统近似。

基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，在5’接头序列和BFP序列之间分别插入A1序 列或移码突变的A1序列，其中移码突变的A1序列具体为：

ATGGCTAAATTACAAGCTATCACTTTATAGTGGTATTGGGAAGAACGGTGACGTTACTCTGAACC TCAACCCGCGTGGGGTAAATCCCACCAACGGTGTTGCCGCGCTTTCAGAAGCGGGTGCAGTTCC TGCATTGGAGAAGCGTGTTACAATTTCTGTATCACAGCCTTCTCGCAATCGATAAGAACTACAAA GTTCAGGTAAAGATCCAGAACCCAACCTCTTGCACTGCAAGCGGTACTTGTGACCCTTCAGTTAC TCGTTCGGCTTATGCTGACGTGACGTTCTCGTTCACGCAGTACAGCACTGATGAGGAACGTGCAC TCGTAAACGAACAGAGCTTAAAGCCCTGTTGGCGGATCCAATGCTTATCGATGCTATCGATAACT TGAATCCGGCGTACTGAACTGCACTTCTTGGTGATGGCTCAGGGCCTTAGCCCTGTACCGGGTCC TAATCCGGACCCGCCACTGGAGCCGCCGCCAGGGACAGGTAGTTATACCTGTCCTTTCCGTATAT GGGATCTTTCCAGCATTTATGAAGCTGCGAATAGTTCCCACTCGTGGGATATCTATAACGCTGTAACTGAACTCAGTCCTCGCAAATTTGACGTTACCCTTGATGACCTCTTGGGTAACACAGATTGGCG CGATTGGGACGGCAGACTTAGGTATACCACGTTTCGCGGTAGCCGAGGTAACGGATACATTGAC CTTGACGCCACTTCGTTGATAGCAGGATGAATATCTTACATCTTCGAAGTATTTAGTGCGTGAGG GGAAACGTCCCGGTGCTTTCGGTTCAATTGAACGGTTTGTTTATCTTAAATCGATAAACGCATAC TGTTCTCTTAGCGATATTACGGCCTACCACTCCGACGGAGTGTAGTAGTTGGCTTTTGGCGCGAC CCGTCAAGCGGGGGAGCCATACCATTCGACTTTAGCGAGTTTGATTCGAACAAATGTCCGATCC AAGCCGTTATTGTCGTTCCTCGTCTTTAG

该移码突变的A1序列相对于所使用的A1序列插入了标有下划线的碱基。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测在100μM IPTG诱导下复制系统的BFP荧光表达强度，A1序列回补对复制系统的影响的结 果显示于图14D。结果说明回补A1序列或突变的A1序列，与原始复制系统类似，复制系统BFP荧 光表达强度平均值均显著高于对照复制系统，增加倍数是66％和32％，低于原始复制系统增加倍数。 A1序列回补能增加总荧光值，但在复制倍数上低于原始复制系统。

上述结果表明，噬菌体原始序列的回补能在一定程度上改变复制系统的复制效率，在考虑更优的 复制系统时仍保持实施例2中使用的5’接头序列和3’接头序列。

实施例13复制酶优化对复制系统的影响

基于实施例2构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，将复制酶的RBS替换为较高强度的RBS，将复 制酶替换为密码子优化后的复制酶序列，具体地，替换RBS后优化的复制系统对应的序列为：

(T7M5启动子序列为斜体，5’及3’UTR标为下划线，HDV核酶标为粗体，BFP标为斜体下划线，密码子优化的复制酶标位粗斜体，替换的强RBS标为粗 体下划线)。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测在100μM IPTG诱导下复制系统的荧光表达强度，图15显示了改变复制酶核糖体结合位点 RBS时复制系统目的基因表达情况。结果说明相对于原始复制系统RRS-T7M5-BFP，替换RBS后复 制系统的BFP荧光表达强度平均值显著提高，增加的倍数是23％，证明对复制酶RBS优化能在一定 程度上促进复制系统的工作效果。

实施例14插入发卡结构对复制系统的影响

由于RNA复制过程中不可避免地产生双链RNA，我们试图通过设计一段发卡结构来使得双链 RNA配对性能减弱，增强单链形式存在的RNA以利于翻译过程。图16A显示了发卡结构设计示意 图。通过RNA上存在的特殊配对模式GU配对，设计茎长度分别为50nt和100nt的“半发卡”结构。 该发卡结构在正链上由于GU配对能力表现为发卡结构，但在负链上由于C与A不能配对，发卡结构 并不产生。

基于实施例2中构建的复制系统RRS-T7M5-BFP，在目的基因蓝色荧光蛋白序列与复制酶序列之 间分别插入50nt或100nt的发卡结构。

其中，50nt发卡结构对应的DNA序列为： GGGCAGGCGTACAAAATCAGAGATCTGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGG GGTCGGCGGTGTTGCATAATATTGTTGATTCTGTTTATTGTTGATTCTGTTTATTGTTGATTCTGTT GGATCCGGGAAGTCCTAACGGGCAG；

100nt发卡结构对应的DNA序列为： GGGCAGGCGTACAAAATCAGAGATCTGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGGGGTCGGCGGTGGGCGG GGTCGGCGGTGGGCCGTGGCGGATGCGGCGGTGGGGCGAGAGCTGGCCGGTGGAGGCTGGCTT GCATAAGTTAGTTTCTATTGGTTAGTTCTTGTCTTATTGTTGCATTTGTTATGGTTTATTGTTGATT CTGTTTATTGTTGATTCTGTTTATTGTTGATTCTGTTGGATCCGGGAAGTCCTAACGGGCAG。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测在100μM IPTG诱导下复制系统的荧光表达强度，在复制系统中插入50nt或100nt发夹结构 时目的基因表达情况的结果显示于图16B。结果说明相对于原始复制系统RRS-T7M5-BFP(图中显示 为WT)，插入50nt或100nt发夹结构后复制系统的BFP荧光表达强度平均值显著提高，增加的倍数 分别是7％(50nt)和75％(100nt)，证明在复制系统中引入发夹结构能在一定程度上促进复制系统 的工作效果。

实施例15复制系统对ALA的生产效果

本实施例中测试了RNA复制系统对非报告基因的促进生产效果。选用基因Hem1作为目的基 因，对应的序列为： ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGG CTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGCAGCGTTCTATCTTCGCGCGTTTC GGTAACTCTTCTGCGGCGGTTTCTACCCTGAACCGTCTGTCTACCACCGCGGCGCCGCACGCGAA AAACGGTTACGCGACCGCGACCGGTGCGGGTGCGGCGGCGGCGACCGCGACCGCGTCTTCTACC CACGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGAACCACTCTACCCAGGAATCTGGTTTCGACTACG AAGGTCTGATCGACTCTGAACTGCAGAAAAAACGTCTGGACAAATCTTACCGTTACTTCAACAA CATCAACCGTCTGGCGAAAGAATTCCCGCTGGCGCACCGTCAGCGTGAAGCGGACAAAGTTACC GTTTGGTGCTCTAACGACTACCTGGCGCTGTCTAAACACCCGGAAGTTCTGGACGCGATGCACA AAACCATCGACAAATACGGTTGCGGTGCGGGTGGTACCCGTAACATCGCGGGTCACAACATCCC GACCCTGAACCTGGAAGCGGAACTGGCGACCCTGCACAAAAAAGAAGGTGCGCTGGTTTTCTCT TCTTGCTACGTTGCGAACGACGCGGTTCTGTCTCTGCTGGGTCAGAAAATGAAAGACCTGGTTAT CTTCTCTGACGAACTGAACCACGCGTCTATGATCGTTGGTATCAAACACGCGAACGTTAAAAAA CACATCTTCAAACACAACGACCTGAACGAACTGGAACAGCTGCTGCAGTCTTACCCGAAATCTG TTCCGAAACTGATCGCGTTCGAATCTGTTTACTCTATGGCGGGTTCTGTTGCGGACATCGAAAAA ATCTGCGACCTGGCGGACAAATACGGTGCGCTGACCTTCCTGGACGAAGTTCACGCGGTTGGTC TGTACGGTCCGCACGGTGCGGGTGTTGCGGAACACTGCGACTTCGAATCTCACCGTGCGTCTGGT ATCGCGACCCCGAAAACCAACGACAAAGGTGGTGCGAAAACCGTTATGGACCGTGTTGACATGA TCACCGGTACCCTGGGTAAATCTTTCGGTTCTGTTGGTGGTTACGTTGCGGCGTCTCGTAAACTG ATCGACTGGTTCCGTTCTTTCGCGCCGGGTTTCATCTTCACCACCACCCTGCCGCCGTCTGTTATG GCGGGTGCGACCGCGGCGATCCGTTACCAGCGTTGCCACATCGACCTGCGTACCTCTCAGCAGA AACACACCATGTACGTTAAAAAAGCGTTCCACGAACTGGGTATCCCGGTTATCCCGAACCCGTC TCACATCGTTCCGGTTCTGATCGGTAACGCGGACCTGGCGAAACAGGCGTCTGACATCCTGATCA ACAAACACCAGATCTACGTTCAGGCGATCAACTTCCCGACCGTTGCGCGTGGTACCGAACGTCT GCGTATCACCCCGACCCCGGGTCACACCAACGACCTGTCTGACATCCTGATCAACGCGGTTGACGACGTTTTCAA，

其表达的Hem1蛋白为ALA合成通路中的5-氨基酮戊酸合酶，是C4途径中血红素合成代谢的限 速酶。

在我们的设计中，将ALA合成基因Hem1作为目的基因插入复制系统中，同时为了增加表达 量，选用野生型T7启动子，并且使用JM109(DE3)ΔRnc菌株生产。使用与实施例2相同方法构建表 达系统的质粒，将表达复制系统(RRS-T7-Hem1)及相应的对照复制系统(RRS突变-T7-Hem1)和 不表达复制系统(T7-Hem1，与RRS-T7-Hem1相比只是去掉了复制酶)的质粒通过HK022的attB/P 整合法整合到JM109(DE3)ΔRnc菌株基因组中，24h、37度过夜培养，从平板上挑取单克隆接种于 20ml LB培养基培养过夜作为一级种子液。一级种子液以10％的比例接种入20mL LB培养基中培养 过夜作为二级种子液。二级种子液以5％的比例接种入含50mL ALA发酵培养基的500mL摇瓶中进行 培养，具体地，发酵培养基的成分如下表所示：

试剂名称	浓度
		胰蛋白胨	10g/L
酵母提取物	5g/L
		K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O	19g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	29.5g/L
		甘氨酸	3g/L
琥珀酸	6g/L

起始发酵4小时后加入200μM的IPTG诱导Hem1基因表达。起始发酵18小时后补充10g/L葡萄 糖、5g/L甘氨酸及10g/L琥珀酸补充发酵所需碳源及前体物质。起始发酵48小时后结束发酵，并使 用比色法对ALA在培养上清液中的含量进行测量，结果如图17所示。结果证明无复制系统时ALA 的产量约1500mg/L(T7-Hem1)，而引入复制系统后ALA产量增加到约2400mg/L(RRS-T7- Hem1)，提高了60％，说明RNA复制系统能促进ALA产量的提升。

实施例16复制系统对于不同噬菌体来源元件的工作效果

为了验证复制系统的复制功能对于不同的噬菌体是通用的，基于之前的设计，又选择了MS2噬 菌体和fr两种比较常见的单链RNA噬菌体作为研究模型。基于实施例2中构建的复制系统RRS- T7M5-BFP，将复制系统对应的关键元件替换为MS2或fr噬菌体基因组组成元件，其示意图如图18A 所示。具体而言，基于实施例2的复制系统RRS-T7M5-BFP，将其中的5’接头序列和3’接头序列替换 为MS2或fr噬菌体的接头序列，将其中的复制酶序列替换为MS2或fr噬菌体的复制酶序列，构建获 得构建基于MS2或fr噬菌体的复制系统，其中同样以移码突变的复制酶作为对照。

具体地，对于MS2噬菌体，对应元件序列为：

5’UTR： GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGCTAATGCCATTTTTAATGTCTTTA GCGAGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCT；

3’UTR： CTGACCGAGGGACCCCCGTAAACGGGGTGGGTGTGCTCGAAAGAGCACGGGTGCGAAAGCGGT CCGGCTCCACCGAAAGGTGGGCGGGCTTCGGCCCAGGGACCTCCCCCTAAAGAGAGGACCCGG GATTCTCCCGATTTGGTAACTAGCTGCTTGGCTAGTTACCACCCA；

复制酶序列： ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGC CCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTAC AAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGG TGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGC AATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATC TACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGACAACAAAGAAGTTCA ACTCTTTATGTATTGATCTTCCTCGCGATCTTTCTCTCGAAATTTACCAATCAATTGCTTCTGTCGC TACTGGAAGCGGTGATCCGCACAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACTTAAGGGACGAATTG CTCACAAAGCATCCGACCTTAGGTTCTGGTAATGACGAGGCGACCCGTCGTACCTTAGCTATCGC TAAGCTACGGGAGGCGAATGGTGATCGCGGTCAGATAAATAGAGAAGGTTTCTTACATGACAAA TCCTTGTCATGGGATCCGGATGTTTTACAAACCAGCATCCGTAGCCTTATTGGCAACCTCCTCTCT GGCTACCGATCGTCGTTGTTTGGGCAATGCACGTTCTCCAACGGTGCTCCTATGGGGCACAAGTT GCAGGATGCAGCGCCTTACAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTTACCCCCCGCGCTCTGAGA GCGGCTCTATTGGTCCGAGACCAATGTGCGCCGTGGATCAGACACGCGGTCCGCTATAACGAGT CATATGAATTTAGGCTCGTTGTAGGGAACGGAGTGTTTACAGTTCCGAAGAATAATAAAATAGA TCGGGCTGCCTGTAAGGAGCCTGATATGAATATGTACCTCCAGAAAGGGGTCGGTGCTTTCATCA GACGCCGGCTCAAATCCGTTGGTATAGACCTGAATGATCAATCGATCAACCAGCGTCTGGCTCA GCAGGGCAGCGTAGATGGTTCGCTTGCGACGATAGACTTATCGTCTGCATCCGATTCCATCTCCG ATCGCCTGGTGTGGAGTTTTCTCCCACCAGAGCTATATTCATATCTCGATCGTATCCGCTCACACT ACGGAATCGTAGATGGCGAGACGATACGATGGGAACTATTTTCCACAATGGGAAATGGGTTCAC ATTTGAGCTAGAGTCCATGATATTCTGGGCAATAGTCAAAGCGACCCAAATCCATTTTGGTAACG CCGGAACCATAGGCATCTACGGGGACGATATTATATGTCCCAGTGAGATTGCACCCCGTGTGCT AGAGGCACTTGCCTACTACGGTTTTAAACCGAATCTTCGTAAAACGTTCGTGTCCGGGCTCTTTCGCGAGAGCTGCGGCGCGCACTTTTACCGTGGTGTCGATGTCAAACCGTTTTACATCAAGAAACCT GTTGACAATCTCTTCGCCCTGATGCTGATATTAAATCGGCTACGGGGTTGGGGAGTTGTCGGAGG TATGTCAGATCCACGCCTCTATAAGGTGTGGGTACGGCTCTCCTCCCAGGTGCCTTCGATGTTCT TCGGTGGGACGGACCTCGCTGCCGACTACTACGTAGTCAGCCCGCCTACGGCAGTCTCGGTATA CACCAAGACTCCGTACGGGCGGCTGCTCGCGGATACCCGTACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGTA TCGCTCGAGAACGCAAGTTCTTCAGCGAAAAGCACGACAGTGGTCGCTACATAGCGTGGTTCCA TACTGGAGGTGAAATCACCGACAGCATGAAGTCCGCCGGCGTGCGCGTTATACGCACTTCGGAG TGGCTAACGCCGGTTCCCACATTCCCTCAGGAGTGTGGGCCAGCGAGCTCTCCTCGGTAG；

移码突变复制酶序列： ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGC CCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTAC AAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGG TGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGC AATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATC TACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGACAACAAAGAAGTTCA ACaTCTTTATGTATTGATCTTCCTCGCGATCTTTCTCTCGAAATTTACCAATCAATTGCTTCTGTCG CTACTGGAAGCGGTGATCCGCACAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACTTAAGGGACGAATT GCTCACAAAGCATCCGACCTTaAGGTTCTGGTAATGACGAGGCGACCCGTCGTACCTTAGCTATCGCTAAGCTACGGGAGGCGAATGGTGATCGCGGTCAGATAAATAGAGAAGGTTTCTTACATGACA AATCCTTGTCATGGGATCCGGATGTTTTACAAACCAGCATCCtaGTAGCCTTATTGGCAACCTCCT CTCTGGCTACCGATCGTCGTTGTTTGGGCAATGCACGTTCTCCAACGGTGCTCCTATGGGGCACA AGTTGCAGGATGCAGCGCCTTACAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTTACCCCCCGCGCaTCT GAGAGCGGCTCTATTGGTCCGAGACCAATGTGCGCCGTGGATCAGACACGCGGTCCGCTATAAC GAGTCATATGAATTTAGGCTCGTTGTAGGGAACGGAGTGTTTACAGTTCCGAAGAATAATAAAA TAGATCGGGCTGCCTGTAtaAGGAGCCTGATATGAATATGTACCTCCAGAAAGGGGTCGGTGCTT TCATCAGACGCCGGCTCAAATCCGTTGGTATAGACCTGAATGATCAATCGATCAACCAGCGTCT GGCTCAGCAGGGCAGCGTAGATGGTTCGCTTGCGACGATaAGACTTATCGTCTGCATCCGATTCC ATCTCCGATCGCCTGGTGTGGAGTTTTCTCCCACCAGAGCTATATTCATATCTCGATCGTATCCGC TCACACTACGGAATCGTAGATGGCGAGACGATACGATGGGAACTATTTTCCACAATGGtaGAAAT GGGTTCACATTTGAGCTAGAGTCCATGATATTCTGGGCAATAGTCAAAGCGACCCAAATCCATTT TGGTAACGCCGGAACCATAGGCATCTACGGGGACGATATTATATGTCCCAGTGAGATTGCACCC CGTGTGCTAGAGGCaACTTGCCTACTACGGTTTTAAACCGAATCTTCGTAAAACGTTCGTGTCCG GGCTCTTTCGCGAGAGCTGCGGCGCGCACTTTTACCGTGGTGTCGATGTCAAACCGTTTTACATC AAGAAACCTGTTGACAATCTCTTCGCCCTGATGCtaTGATATTAAATCGGCTACGGGGTTGGGGA GTTGTCGGAGGTATGTCAGATCCACGCCTCTATAAGGTGTGGGTACGGCTCTCCTCCCAGGTGCC TTCGATGTTCTTCGGTGGGACGGACCTCGCTGCCGACTACTACGTAGTCAGCCCaGCCTACGGCA GTCTCGGTATACACCAAGACTCCGTACGGGCGGCTGCTCGCGGATACCCGTACCTCGGGTTTCCG TCTTGCTCGTATCGCTCGAGAACGCAAGTTCTTCAGCGAAAAGCACGACAGTGGTCGCTACATA GCGTGGTTCCtaATACTGGAGGTGAAATCACCGACAGCATGAAGTCCGCCGGCGTGCGCGTTATA CGCACTTCGGAGTGGCTAACGCCGGTTCCCACATTCCCTCAGGAGTGTGGGCCAGCGAGCTCTCC TCGGTAG；

fr噬菌体元件对应序列为：

5’UTR： GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCGACTTCCTGTCAAGCTAAATGCCATTTTTAATGTCTTT AGCGAGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGCAATTCCATTGCTAGGGAGCCTCGT；

3’UTR： CAAAACTGAGGGACCCCCGTAAGCGGGGTGGGTGTGCTCGAAAGAGCACGGGTCCGCGAAAGC GGTGGCTCATCAGAAATGGTGGGTGAGGGTTCGCCCTCTAGGACTGGCCCCGAAAGGTCAGGCC CGGGATTCTCCCGATTTTGGTAGCTAGTTGCTTGGCTAGCTACCACCCA；

复制酶序列： ATGGCTTCGAACTTTGAAGAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACGGGAGATGTAAAAGTCG CTCCGAGCAACTTCGCTAACGGGGTTGCAGAATGGATCAGCTCGAACTCACGTTCTCAGGCTTAC AAAGTGACCTGTAGCGTGCGTCAGAGCTCTGCGAACAATCGGAAATACACCGTCAAGGTCGAGG TGCCGAAAGTGGCAACTCAGGTCCAAGGCGGCGTTGAGCTTCCTGTTGCGGCGTGGCGCTCGTA CATGAATATGGAATTAACTATTCCGGTATTCGCGACGAACGACGACTGTGCCTTAATCGTTAAGG CATTGCAAGGCACCTTTAAAACTGGTAACCCAATTGCAACAGCCATCGCAGCCAACTCGGGAAT CTACTAAGAAACCCGTGCCATTCCAACATGAGGAATACCCATGTCAAAATCAACAAAGAAGTTC AACTCTTTATGTATTGATTTGTCTCGCGATCTTTCTCTCGAAGTTTACCAATCAATTGCTAGCGTC GCTACTGGATCTTCTGATCCGCATAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACCTAAGGGACGAGCTTTTAACAAAGCATCCGAACCTAGGGGATGGTAACGACGAAGCAACCCGCAGAAGCCTAGCTATC GCTAAGCTGCTGGAGGCGAATGACCGTTGTGGTCAGATAAATAGGGATGGTTTCTTACATGACG CAACCGCGTCGTGGGATCCGGATGTTTTACAAACCAGCATCCGTAGCCTTATTGGTAACCTCCTT TCTGGCTATAGCAGTCAGTTGTTTAGACACTGTACATTCTCAAACGGTGCCTCTATGGGGCACAA GTTGCAGGATGCAGCGCCTTATAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTGACGCCGAGGGCGTTG AAAGCGGCAGTGCTGGTCAAAGATCAGTGCAGTCCCTGGATCCGTCACTCGCACGTCTTCCCCG AGTCATATACATTTAGGCTCGTGGGAGGCAACGGTGTGTTTACTGTTCCGAAGAACAATAAAATAGATCGGGCTGCTTGCAAAGAGCCTGATATGAATATGTACTTACAGAAAGGGGTCGGCGGTTTC ATCCGTCGCCGCCTTAAGACTGTGGGTATAGACTTGAACGATCAAACGATCAATCAACGCCTGG CTCAACAAGGTAGCCGTGATGGGTCTTTGGCGACGATAGACTTATCGTCTGCTTCTGACTCCATC AGCGACCGCCTAGTGTGGAGTTTTCTCCCACCTGAGCTATATTCATATCTCGACATGATTCGAAG CCACTACGGTTACGTAAATGGCAAGATGATTCGTTGGGAACTATTTTCGACGATGGGTAATGGGT TCACCTTTGAACTAGAGTCCATGATTTTCTGGGCTATAGTCAGGGCTACTCAGATCCATTTTCGTA ACACCGGAACCATTGGCATCTATGGGGACGATATTATATGCCCCACAGAGATTGCACCTCGCGT GCTGGAAGCACTGAGCTTCTACGGTTTCAAACCGAATCTACGAAAGACGTTCACGTCCGGCTCTT TTCGCGAGAGCTGCGGCGCGCACTATTTCCGTGGTGTCGATGTTAAACCATTTTATATCAAGAAA CCAATCACTGACCTATTCTCCCTAATGCTTATACTTAACCGTATACGCGGATGGGGGGTAGTCAA CGGAATAGCAGACCCACGCCTCTACGAGGTATGGGAGAAGCTCTCCAGATTGGTACCGAGATAT TTATTTGGTGGGACGGACCTGCAGGCCGATTACTACGTCGTGTCACCTCCTATTCTGAAAGGAAT TTATTCCAAGATGAATGGGAGACGCGAGTATGCCGAAGCTAGAACAACAGGCTTCAAGCTCGCT CGCATCGCGAGGTGGCGAAAGCACTTTTCCGATAAGCACGACTCAGGTCGGTACATTGCGTGGT TCCATACTGGAGGTGAGATCACCGATAGTATGAAGTCCGCCGGTGTACGCGTTATGCGTACTTCG GAGTGGCTACAGCCGGTTCCCGTGTTCCCTCAGGAATGCGGGCCAGCGAGCTCTCCTCAGTAG；

移码突变复制酶序列： ATGGCTTCGAACTTTGAAGAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACGGGAGATGTAAAAGTCG CTCCGAGCAACTTCGCTAACGGGGTTGCAGAATGGATCAGCTCGAACTCACGTTCTCAGGCTTAC AAAGTGACCTGTAGCGTGCGTCAGAGCTCTGCGAACAATCGGAAATACACCGTCAAGGTCGAGG TGCCGAAAGTGGCAACTCAGGTCCAAGGCGGCGTTGAGCTTCCTGTTGCGGCGTGGCGCTCGTA CATGAATATGGAATTAACTATTCCGGTATTCGCGACGAACGACGACTGTGCCTTAATCGTTAAGG CATTGCAAGGCACCTTTAAAACTGGTAACCCAATTGCAACAGCCATCGCAGCCAACTCGGGAAT CTACTAAGAAACCCGTGCCATTCCAACATGAGGAATACCCATGTCAAAATCAACAAAGAAGTTC AACaTCTTTATGTATTGATTTGTCTCGCGATCTTTCTCTCGAAGTTTACCAATCAATTGCTAGCGTC GCTACTGGATCTTCTGATCCGCATAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACCTAAGGGACGAGCT TTTAACAAAGCATCCGAACCTAaGGGGATGGTAACGACGAAGCAACCCGCAGAAGCCTAGCTATCGCTAAGCTGCTGGAGGCGAATGACCGTTGTGGTCAGATAAATAGGGATGGTTTCTTACATGAC GCAACCGCGTCGTGGGATCCGGATGTTTTACAAACCAGCATCCtaGTAGCCTTATTGGTAACCTCC TTTCTGGCTATAGCAGTCAGTTGTTTAGACACTGTACATTCTCAAACGGTGCCTCTATGGGGCAC AAGTTGCAGGATGCAGCGCCTTATAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTGACGCCGAGGGCaG TTGAAAGCGGCAGTGCTGGTCAAAGATCAGTGCAGTCCCTGGATCCGTCACTCGCACGTCTTCCC CGAGTCATATACATTTAGGCTCGTGGGAGGCAACGGTGTGTTTACTGTTCCGAAGAACAATAAA ATAGATCGGGCTGCTTGCAtaAAGAGCCTGATATGAATATGTACTTACAGAAAGGGGTCGGCGGT TTCATCCGTCGCCGCCTTAAGACTGTGGGTATAGACTTGAACGATCAAACGATCAATCAACGCCT GGCTCAACAAGGTAGCCGTGATGGGTCTTTGGCGACGATaAGACTTATCGTCTGCTTCTGACTCC ATCAGCGACCGCCTAGTGTGGAGTTTTCTCCCACCTGAGCTATATTCATATCTCGACATGATTCG AAGCCACTACGGTTACGTAAATGGCAAGATGATTCGTTGGGAACTATTTTCGACGATGGtaGTAA TGGGTTCACCTTTGAACTAGAGTCCATGATTTTCTGGGCTATAGTCAGGGCTACTCAGATCCATT TTCGTAACACCGGAACCATTGGCATCTATGGGGACGATATTATATGCCCCACAGAGATTGCACCT CGCGTGCTGGAAGCaACTGAGCTTCTACGGTTTCAAACCGAATCTACGAAAGACGTTCACGTCCG GCTCTTTTCGCGAGAGCTGCGGCGCGCACTATTTCCGTGGTGTCGATGTTAAACCATTTTATATCAAGAAACCAATCACTGACCTATTCTCCCTAATGCtaTTATACTTAACCGTATACGCGGATGGGGG GTAGTCAACGGAATAGCAGACCCACGCCTCTACGAGGTATGGGAGAAGCTCTCCAGATTGGTAC CGAGATATTTATTTGGTGGGACGGACCTGCAGGCCGATTACTACGTCGTGTCACCaTCCTATTCTG AAAGGAATTTATTCCAAGATGAATGGGAGACGCGAGTATGCCGAAGCTAGAACAACAGGCTTCA AGCTCGCTCGCATCGCGAGGTGGCGAAAGCACTTTTCCGATAAGCACGACTCAGGTCGGTACAT TGCGTGGTTCCtaATACTGGAGGTGAGATCACCGATAGTATGAAGTCCGCCGGTGTACGCGTTAT GCGTACTTCGGAGTGGCTACAGCCGGTTCCCGTGTTCCCTCAGGAATGCGGGCCAGCGAGCTCTC CTCAGTAG。

使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合 到表达菌株E.coli JM10(DE3)基因组中，使用流式细胞仪测量其荧光表达量。

检测在200μM IPTG诱导下的荧光强度图，结果如18B所示。在200μM IPTG诱导下，复制系统 的BFP荧光值均高于对照复制系统，其中增加倍数分别为243％和247％。图18C显示了两种重组的 复制系统中BFP的相对基因表达水平。在200μM IPTG诱导时，两种设计中用的复制系统的相对基因 表达水平均高于对照复制系统，说明基于其他噬菌体，复制系统也能起到增加信使RNA量的结果。 这些结果说明对于不同的噬菌体组成，复制系统均能发挥作用。但由于在众多噬菌体中，Qβ噬菌体 是一种相对研究较为成熟的模型，因此后续优化均基于Qβ噬菌体进行。

实施例17复制系统对生产PhaP蛋白的效果

本实施例中选用基因PhaP作为另一种目的产物基因，对应的基因序列为： ATGAATATGGACGTGATCAAGAGCTTTACCGAGCAGATGCAAGGCTTCGCCGCCCCCCTCACCC GCTACAACCAACTGCTGGCCAGCAACATCGAGCAGCTGACCCGGTTGCAGCTGGCCTCCGCCAA CGCCTACGCCGAACTGGGCCTCAACCAGTTGCAGGCCGTGAGCAAGGTGCAGGACACCCAGAGT CTGGCTGCCCTCGGCACAGTGCAGCTGGAGACCGCCAGCCAGCTCTCCCGCCAGATGCTGGACG ACATCCAGAAGCTGAGCGCCCTCGGCCAGCAGTTCAAGGAAGAGCTGGATGTCCTGACCGCGGA CGGCATCAAGAAGAGCACGGGCAAGGCCTGA，其表达的PhaP蛋白是颗粒表面蛋白的主要组成成 分，能使聚羟基脂肪酸(PHA)生产菌中PHA颗粒变小，对PHA生产有着一定的应用价值。

在该产物表达中，选取野生型T7启动子，使用Qβ噬菌体的复制酶以及5’和3’非编码序列制备 复制系统，在JM109(DE3)ΔRnc菌株中表达蛋白。使用与实施例2相同的质粒构建方法和HK022的 attB/P整合法将表达这些复制系统的质粒整合到JM109(DE3)ΔRnc菌株基因组中，使用流式细胞仪测 量其荧光表达量。

将表达复制系统(RRS)及突变的复制系统(RRS(mut))的质粒和不表达复制系统(Without RRS)的质粒在目的菌株转化后，24h、37度过夜培养，从平板上挑取单克隆接种于20ml LB培养基 培养过夜，以1:100的比例将菌液转接到新的20ml LB培养基中，37度、2h后加入终浓度为200μM IPTG诱导，将培养基转移到30度摇床中，培养至6～8h收集菌体，处理后使用western blot检测蛋白 相对量，结果如图19所示。结果证明相对于无复制系统或复制系统突变的菌株，引入复制系统后 PhaP相对蛋白量增加了约3倍，说明RNA复制系统在促进特定的蛋白表达上有很好的效果。

本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普 通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护 范围。

Claims (9)

1.重组菌，其特征在于，所述重组菌能够稳定表达重组RNA分子，其中所述重组RNA分子包括：(1)5’复制识别序列和3’复制识别序列，其可被噬菌体RNA复制酶识别并进行RNA复制过程；和(2)位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目的基因序列。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其中5’复制识别序列和3’复制识别序列包含RNA噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区，或人工设计的5’复制识别序列和3’复制识别序列；优选地，5’复制识别序列和3’复制识别序列包含Qβ噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区，MS2噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区，fr噬菌体的5’非翻译区和3’非翻译区或RQ135的5’非翻译区和3’非翻译区。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其中重组菌中还可以稳定表达RNA复制酶；优选地，所述重组RNA分子包含表达所述噬菌体RNA复制酶的序列；更优选地，所述噬菌体RNA复制酶为Qβ噬菌体RNA复制酶，MS2噬菌体RNA复制酶或fr噬菌体RNA复制酶。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组菌，其中所述重组RNA分子包含可形成发卡结构的序列；优选地，所述序列中含有多个G和U，这些G和U可以相互配对使得该序列形成发卡结构，而与之互补的负链序列上不产生发卡结构。

5.根据权利要求1-4任一项所述的重组菌，其中所述重组RNA分子包含位于5’复制识别序列上游和/或3’复制识别序列下游的可切割序列；优选地，位于5’复制识别序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列；优选地，位于3’复制识别序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

6.根据权利要求1-5任一项所述的重组菌，其中所述目的基因编码蛋白；优选地，所述目的基因编码的蛋白为酶；更优选地，所述目的基因为选自由荧光蛋白BFP编码基因，荧光蛋白GFP编码基因，氯霉素编码基因CmR、半乳糖激酶编码基因GALK、β-半乳糖苷酶编码基因LacZ、5-氨基乙酰丙酸合成基因Hem1构成的组的一个基因或两个或更多个基因的组合。

7.根据权利要求1-6任一项所述的重组菌，其中重组菌为大肠杆菌、乳酸菌Lb.caseilZhang；优选地，所述重组菌中Rnc基因被敲除。

8.根据权利要求1-7任一项所述的重组菌，其所述重组菌由其基因组稳定表达所述重组RNA分子，或所述重组菌由存在于其中的表达质粒稳定表达所述重组RNA分子；优选地，所述重组菌通过向宿主菌中导入可以转录所述重组RNA分子的DNA分子而获得。

9.获得目的基因表达产物的方法，包括在存在噬菌体RNA复制酶以及适合于目的基因表达的条件下培养权利要求1-8任一项所述的重组菌。