CN108949800A - 一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，是由Ti双元质粒pB01和含有pB01的宿主细胞构成；其中所述Ti双元质粒pB01是以pCMBIA1300质粒为骨架，由T‑DNA的左边界和右边界序列、草丁磷除草剂抗性基因表达盒、含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点元件的质粒拯救系统的核心部件构成；含有pB01的宿主细胞是根瘤农杆菌菌株。本发明遗传转化系统的应用可弥补传统遗传转化系统存在的转化效率低、转化子遗传稳定性差、随机插入无法确实插入位点等缺陷，有助于对丝状真菌进行功能基因的标记以及标记基因的分离，将成为是最具潜力的开展真菌基因功能、真菌分子遗传学研究的有效方法。

Description

一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及 其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用。

背景技术

丝状真菌作为一种低等的高等生物，在工业、农业、医药等领域具有重要的研究与经济价值。在工业方面，以黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus.oryzae)为代表的丝状真菌基因具有分泌性能高、表达量大、发酵工艺成熟等优点，已被广泛用于生产酶类(如蛋白酶和淀粉酶)和有机酸(如柠檬酸等)的工业生产中，具有重大的经济应用价值。许多丝状真菌是重要农作物的致病菌(稻瘟病)，粮食等贮藏过程中的腐败变质的主要原因也是丝状真菌；同时，又有一些丝状真菌(白僵菌、绿僵菌、哈氏木霉等)由于其可寄生于有害昆虫并将其致死的特性，可用于作物病虫害的生物防治。在医药方面，如产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)分别能产生青霉素和头孢菌素，可用于疾病的治疗；一些丝状真菌也与疾病有关，如黄曲霉素产生的黄曲霉一种重要的致癌因子。另外，丝状真菌在基础生物学研究中也具有重要作用，其具有坚硬的几丁质细胞壁；顶端生长特性；营腐生或寄生生活；孢子繁殖；基因组相对较小；多余DNA含量少等特点，使得丝状真菌成为对分子遗传学理论研究极具意义的模式生物[李娟,杨金奎,梁连铭,张克勤.丝状真菌遗传转化系统研究进展.江西农业大学学报.2006,28(4):516-520.]。

尽管丝状真菌具有重要的研究与经济价值，但长期以来，迫切需要一个有效工具实现外源基因的非定点/定点整合、基因敲除、目的基因超表达、大规模突变解析功能基因组等目的，缺少一个有效的转化系统一直限制着丝状真菌理论与应用研究的发展，有效的转化方法是丝状真菌基因工程的前提。

由于丝状真菌具有多核和发生非同源重组频率高的特点，丝状真菌基因敲除通常需要较长的同源序列；需要不断地克隆、筛选，获得所需打靶载体费时费力；在丝状真菌中发生同源重组的频率低,打靶效率低。敲除编码与非同源重组有关蛋白质的基因如KU70、KU80，大幅度提高了转化子的同源重组率[Ninomiya Y,Suzuki K,Ishii C,InoueH.Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient fornonhomologous end-joining.Proc Natl Acad Sci U S A.2004,101(33):12248-12253；Nayak T,Szewczyk E,Oakley CE,Osmani A,Ukil L,Murray SL,Hynes MJ,Osmani SA,Oakley BR.A versatile and efficient gene-targeting system for Aspergillusnidulans.Genetics.2006,172(3):1557-1566.]，但仍存在脱靶现象，在一些基因组序列信息未知的丝状真菌中不好操作。敲除编码与非同源重组有关蛋白质的基因如KU70、KU80，大幅度提高了转化子的同源重组率[Ninomiya Y,Suzuki K,Ishii C,Inoue H.Highlyefficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologousend-joining.Proc Natl Acad Sci U S A.2004,101(33):12248-12253；Nayak T,Szewczyk E,Oakley CE,Osmani A,Ukil L,Murray SL,Hynes MJ,Osmani SA,Oakley BR.Aversatile and efficient gene-targeting system for Aspergillusnidulans.Genetics.2006,172(3):1557-1566.]，但仍存在脱靶现象，在一些基因组序列信息未知的丝状真菌中不好操作。

自1973年Mishra与Tatum首次利用肌醇缺陷型粗糙脉孢菌进行转化实验成功以来[Mishra NC,Tatum EL.Non-mendelian inheritance of DNA-induced inositolindependence in Neurospora.Proc.Natl Acad.Sci.USA.1973,70(12):3875-3879.]，丝状真菌遗传转化系统的研究发展迅速，到目前为止已经在100多种丝状真菌中成功地进行了转化试验，应用也日趋广泛[闫培生,罗信昌,周启.丝状真菌基因工程研究进展.生物工程进展,1999,19(1):36-41.]。有效的遗传转化方法是丝状真菌分子生物学和基因工程研究与应用的关键环节，在有效的选择标记下，多种遗传转化方法(PEG-CaCl₂法、电转化法、基因枪法、REMI法等)被相继发展、完善，由于原生质体制备和再生操作繁琐、重复性差，造成这类方法转化效率很低；电转化法、基因枪法等虽然可以以孢子和菌丝体为受体，简化了操作步骤，但转化效率同样很低，且转化子遗传稳定性差[Fincham JR.Transformation infungi Microbiological Reviews,1989,55(2):148-170]，这些方法都不能有效的突破低转化效率这一瓶颈。与上述几种传统方法相比，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的真菌转化(ATMT)由于其操作简单、转化高效、单拷贝插入、转化子遗传稳定等优点，为开展真菌基因功能、真菌分子遗传学研究方面提供了有力的工具，目前已经实现了几十种真菌的遗传转化[Michielse CB,Hooykaas PJ,van den Hondel CA,RamAF.Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics infungi.Curr Genet.2005,48(1):1-17.]。然而由于根瘤农杆菌介导的真菌转化是随机插入，所以不好确定基因插入座位。经检索，在根瘤农杆菌介导的真菌转化系统基础上，利用质粒拯救方法对Ti双元质粒进行改进，以实现对基因插入座位进行定位而建立的能定位插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用还未见报道。

发明内容

针对目前真菌转化存在的不足，本发明要解决的问题是提供一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用。

本发明所述的高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，其特征是：该遗传转化系统由Ti双元质粒pB01和含有pB01的宿主细胞构成；其中，所述Ti双元质粒pB01是构建于在大肠杆菌和根瘤农杆菌间的穿梭质粒，该质粒为环状，是以pCMBIA1300质粒为骨架，由T-DNA的左边界(LB)和右边界(RB)序列、草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒、含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的质粒拯救系统的核心部件构成；所述含有pB01的宿主细胞是根瘤农杆菌菌株。

上述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中：所述Ti双元质粒pB01中的pCMBIA1300质粒是根瘤农杆菌介导植物转化体系中广泛应用的Ti质粒，该质粒与根瘤农杆菌LBA4404所含有的助手质粒pBL4404能够配合使用，在T-DNA区域含有烟草花叶病毒35S启动子和终止子，并含有潮霉素抗性基因。

上述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中：所述Ti双元质粒pB01中T-DNA的左边界核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述Ti双元质粒pB01中T-DNA的右边界核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述Ti双元质粒pB01中的草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒自上游至下游依次由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)启动子、草丁磷除草剂抗性基因(bar)、构巢曲霉色氨酸C(trpC)终止子组成；其中，gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，草丁磷除草剂抗性基因(bar)核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，trpC终止子核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；所述所述Ti双元质粒pB01中的含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的质粒拯救系统的核心部件的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

上述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中：所述含有pB01的宿主细胞的出发菌株优选是根瘤农杆菌菌株LBA4404。该菌株为Ach5型背景，携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，该质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元质粒T-DNA顺利转移)，具有链霉素和利福平抗性，用于介导植物和丝状真菌的遗传转化。

上述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中Ti双元质粒pB01的构建方法，步骤是：

(1)草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒的构建：

①重组质粒pUC19-trpCt的构建：

利用Hind III和BamH I双酶切质粒pAN7-1，获得带有这2个酶切位点的trpC基因终止子片段，然后利用Hind III和BamH I双酶切质粒pUC19，连接液转化大肠杆菌DH10B，挑选转化子，提取质粒，进行双酶切验证，获得重组质粒pUC19-trpCt。

②pUC19-trpCt-gpdAp的构建：

以pAN7-1为模板，采用PCR的方法扩增含有Bgl II和BamH I酶切位点的gpdA启动子片段，然后利用Bgl II和BamH I酶切gpdA启动子片段，利用BamH I酶切质粒pUC19-trpCt，连接，连接液转化大肠杆菌DH10B，挑选转化子，提取质粒，利用Hind III和BamH I双酶切验证，获得重组质粒pUC19-trpCt-gpdAp。

③pUC19-trpCt-bar-gpdAp的构建：

质粒pDM302为模板，采用PCR的方法扩增带有BamH I酶切位点bar基因DNA片段，利用BamH I酶切bar基因DNA片段和质粒pUC19-trpCt-gpdAp，连接。连接液转化大肠杆菌DH10B，挑取转化子并电泳检测。对滞后转化子用限制性内切酶Hind III，Bgl II双酶切验证，获得重组质粒pUC19-trpCt-bar-gpdAp。

(2)质粒拯救系统的核心部件的构建：以pUC19为模板，采用PCR的方法扩增PCR扩增带有Pst I和BamH I的含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的用于质粒拯救的DNA片段；

(3)含有质粒拯救体系的根瘤农杆菌Ti质粒构建：

①重组质粒pLBRB的构建：

利用同尾酶Xho I和Sal I切去Ti质粒pCMBIA1300的植物启动子与潮霉素和部分的终止子，利用同尾酶的特点使其自连；连接液转化大肠杆菌DH10B，Sal I线性化验证，连接正确，获得含有LB和RB序列的Ti重组质粒pLBRB。

②重组质粒pUC1913的构建：

利用Pst I和BamH I酶切含有质粒拯救系统的核心部件的DNA片段和质粒pLBRB，连接液转化大肠杆菌DH10B，利用Mun I验证，获得含有质粒拯救体系的根瘤农杆菌Ti重组质粒pUC1913。

(4)含质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti重组质粒pB01的构建：以重组质粒pUC19-trpCt-bar-gpdAp为模板，利用PCR的方法扩增带有EcoR I的bar基因表达元件DNA片段；然后利用EcoR I酶切bar基因表达元件DNA片段，利用Mun I酶切质粒pUC1913，连接，并将连接液转化大肠杆菌DH10B，利用Xba I酶切验证，确定获得含有质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti重组质粒pB01。

上述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中含有pB01的宿主细胞的构建方法，步骤是：

(1)Ti双元质粒pB01转化根瘤农杆菌：

利用PEG-CaCl₂或电转化法将将所述Ti双元质粒pB01导入根瘤农杆菌中；

(2)转化子筛选及验证：

利用含利福平和Kan的YEB平板筛选阳性转化子，并从根瘤农杆菌中提取质粒，以提取得到的质粒为模板，进行PCR和酶切验证，确定获得含有质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti双元质粒pB01的宿主细胞。

其中：所述根瘤农杆菌的出发菌株优选是根瘤农杆菌菌株LBA4404；所述利福平的浓度为50μg/ml，Kan的浓度为100μg/ml。

本发明所述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统在丝状真菌转化中的应用。

其中，该应用方法具体是：

(1)根瘤农杆菌介导的丝状真菌转化：利用乙酰丁香酮(acetosyritone，AS)诱导根瘤农杆菌LBA4401，取设定OD₆₀₀的诱导后的LBA4401菌液与设定孢子浓度的丝状真菌在含有乙酰丁香酮(AS)的培养基上混合放置共培养，利用含有草丁磷除草剂(PPT)的筛选培养基进行转化子筛选；

(2)转化子验证：随机挑取在筛选培养基上有生长的菌落和出发菌株，提取丝状真菌基因组DNA，PCR扩增Ti质粒pB01的T-DNA区域中片段，验证转化子；

(3)质粒拯救：

①将转化子接到相应培养基中培养，提取转化子基因组DNA；

②采用EcoR I、Pst I这两种组合酶切基因组DNA，连接使其片段自连，连接液转化大肠杆菌DH10B；

③利用含有氨苄青霉素的LB培养基筛选转化子，提取质粒；

④利用EcoRI和HindIII双酶切提取的质粒，产物经电泳检测，符合预期的结果应该是有多条电泳条带，其中有一条带为2700bp，为质粒拯救核心元件中EcoR I和Hind III两个酶切位点之间的DNA片段大小，另一条带为Hind III和RB基因组序列上EcoR I之间插入位点附近的基因组DNA片段大小；

(4)测序获得插入座位序列信息：选取步骤(3)验证符合预期结果的质粒进行测序，登陆NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST将测序结果与GeneBank中的已知序列进行比对，确定插入座位序列。

上述应用中，进一步优选的实施方式是：

步骤(1)中所述乙酰丁香酮(AS)的浓度为400μg/ml；所述诱导后的根瘤农杆菌LBA4401菌液浓度OD₆₀₀为1.0±0.1，丝状真菌的孢子浓度为10⁶个/ml；共培养时间为3d，共培养之前的预培养时间为6h；其中，所述丝状真菌选择白僵菌、绿僵菌、粗糙脉孢霉、哈氏木霉或稻瘟病菌；所述草丁磷除草剂(PPT)浓度为60μg/ml；

步骤(3)中含有氨苄青霉素的LB培养基中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml。

本发明公开了一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用，是在根瘤农杆菌介导的真菌转化系统基础上，利用质粒拯救方法对Ti双元质粒进行改进，以实现对基因插入座位进行定位。该技术可弥补传统的遗传转化系统存在的转化效率低、转化子遗传稳定性差、随机插入无法确实插入座位等缺陷，有助于对丝状真菌进行功能基因的标记以及标记基因的分离，将成为是最具潜力的开展真菌基因功能、真菌分子遗传学研究的有效方法。

附图说明

图1为实施例1中重组质粒pUC19-trpCt的酶切验证图

其中，M：1kb DNA marker；1：Hind III单酶切pUC19-trpCt；2：BamH I单酶切pUC19-trpCt；3：pUC19-trpCt。

图2为实施例1中重组质粒pUC19-trpCt-gpdAp的酶切验证图

其中，1：BamH I单酶切pUC19-trpCt-gpdAp；2：BamH I和Hind III双酶切pUC19-trpCt-gpdAp；M：1kb DNA marker。

图3为实施例1中重组质粒pUC19-trpCt-bar-gpdAp的酶切验证图

其中，M：1kb DNA marker；1：pUC19-trpCt-bar-gpdAp；2：Hind III和Bgl II双酶切pUC19-trpCt-bar-gpdAp。

图4为实施例1中重组质粒pLBRB的酶切验证图

其中，1：Sal I单酶切重组质粒pLBRB；M：1kb DNA marker。

图5为实施例1中重组质粒pUC1913的酶切验证图

其中，M：1kb DNA marker；1：Mun I单酶切pUC1913。

图6为实施例1中重组质粒pB01的酶切和PCR验证图

其中，M：1kb DNA marker；1：Xba I酶切pB01；2：以pUC1913为模板，利用引物Bar元件-L1和Bar元件-L2进行PCR验证；3：以pB01为模板，利用引物Bar元件-L1和Bar元件-L2进行PCR验证。

图7为实施例2中从根瘤农杆菌中反提的质粒酶切验证图

其中，1：pB01；2：EcoR I酶切pB01；3：EcoR I酶切从根瘤农杆菌中反提的质粒；M：1kb DNA marker。

图8为实施例2中反提的质粒PCR验证图

其中，1：空白；2：以pB01为模板；3：以从1号转化子反提的质粒为模板；4：以从2号转化子反提的质粒为模板；5：以从3号转化子反提的质粒为模板；M：1kb DNAmarker。

图9为实施例3中根瘤农杆菌介导的布氏白僵菌转化的筛选平板

其中，A：根瘤农杆菌LBA4401与布氏白僵菌1019共培养；B：布氏白僵菌1019单独培养。

图10为实施例3中根瘤农杆菌介导的布氏白僵菌转化子PCR验证图

其中，+：以pB01为模板扩增；1～5：布氏白僵菌1～5号转化子基因组DNA；0：以布氏白僵菌1019基因组DNA为模板扩增；M：1kb DNA marker。

图11为实施例4中质粒拯救过程中提取的拯救质粒的PCR验证图

其中，1：以pB01为模板扩增；2：以提取的拯救质粒为模板扩增；3：空白；M：1kb DNAmarker。

图12为实施例4中质粒拯救过程中提取的拯救质粒和双酶切电泳图

其中，1：提取的拯救质粒；2：EcoR I和Hind III双酶切提取的拯救质粒；M：1kbDNA marker。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的保护范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均视为落入本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如参照Sam brook等分子克隆实验手册(Sam brook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照产品说明书建议的条件。

本实施例中使用的根瘤农杆菌LBA4404购自北京华越洋生物公司。涉及的质粒pUC19、pAN7-1、pDM302和pCMBIA1300购自BioVector NTCC保藏中心。

实施例1：Ti双元质粒pB01构建

1、草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒的构建：

(1)重组质粒pUC19-trpCt的构建：

利用Hind III和BamH I双酶切质粒pAN7-1，获得带有这2个酶切位点的trpC基因终止子片段，然后利用Hind III和BamH I双酶切质粒pUC19，连接液转化大肠杆菌DH10B，挑选转化子，提取质粒，利用Hind III和BamH I分别单酶切验证，线性化质粒大小为3456bp(图1)，连接成功，获得含有构巢曲霉色氨酸C终止子的重组质粒pUC19-trpCt。

(2)pUC19-trpCt-gpdAp的构建：

以pAN7-1为模板，采用引物gpdAp-L1

(5’-GCAGATCTGAATTCCCTTGTATCTCTACACA-3’)和gpdAp-L2

(5’-TTGGATCCGGGAAAAGAAAGAGAAAAGAAAAG-3’)进行PCR扩增，扩增含有Bgl II和BamH I酶切位点的gpdA启动子片段，PCR反应条件为，94℃预变性2min，94℃变性1min；66℃退火1min；72℃延伸2min，共30个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。PCR产物大小约2100bp。然后利用Bgl II和BamH I酶切gpdA启动子片段，利用BamH I酶切质粒pUC19-trpCt，连接，连接液转化大肠杆菌DH10B，挑选转化子，提取质粒，利用Hind III和BamH I双酶切验证(图2)，获得重组质粒pUC19-trpCt-gpdAp。

(3)pUC19-trpCt-bar-gpdAp的构建：

以质粒pDM302为模板，采用引物bar-L1

(5’-CAGCGGATCCATGAGCCCAGAACGACGCCC-3’)和bar-L2

(5’-CATTGGATCCTTAGATCTCGGTGACGGGCAG-3’)进行PCR扩增，扩增带有BamH I酶切位点bar基因DNA片段，PCR反应条件为，94℃预变性2min，94℃变性1min；66℃退火1min；72℃延伸45sec，共30个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。PCR产物大小约550bp。利用BamH I酶切bar基因DNA片段和质粒pUC19-trpCt-gpdAp，连接。连接液转化大肠杆菌DH10B，挑取转化子并电泳检测。对滞后转化子用限制性内切酶Hind III，Bgl II双酶切验证(图3)，获得重组质粒pUC19-trpCt-bar-gpdAp。

2、质粒拯救系统的核心部件的构建：

以pUC19为模板，采用引物pUC19-L1(5’-GCACAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATA-3’)和pUC19-L2(5’-GCAC CTGCAG CAATTGGTCGACTCTAGAGGATCCCCG-3’)进行PCR扩增，扩增带有Pst I和BamH I的含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)等元件的用于质粒拯救的DNA片段。PCR反应条件为，94℃预变性2min，94℃变性1min；64℃退火1min；72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。PCR产物大小约2700bp。

3、含有质粒拯救体系的根瘤农杆菌Ti质粒构建

(1)重组质粒pLBRB的构建：

利用同尾酶Xho I和Sal I切去Ti质粒pCMBIA1300的植物启动子与潮霉素和部分的终止子，利用同尾酶的特点使其自连；连接液转化大肠杆菌DH10B，Sal I线性化验证(图4)，连接正确，获得含有LB和RB序列的Ti重组质粒pLBRB。

(2)重组质粒pUC1913的构建：

利用Pst I和BamH I酶切含有质粒拯救系统的核心部件的DNA片段和质粒pLBRB，连接液转化大肠杆菌DH10B，利用Mun I验证(图5)，获得含有质粒拯救体系的根瘤农杆菌Ti重组质粒pUC1913。

4、含质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti重组质粒pB01的构建

以重组质粒pUC19-trpCt-bar-gpdAp为模板，利用引物

Bar元件-L1

(5’-CAGCAAGCTTACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)和

Bar元件-L2

(5’-CATTGAATTCGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’)进行PCR扩增，扩增带有EcoR I的bar基因表达元件DNA片段，PCR反应条件为，94℃预变性2min，94℃变性1min；64℃退火1min；72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。PCR产物大小约3500bp。然后利用EcoR I酶切bar基因表达元件DNA片段，利用Mun I酶切质粒pUC1913，连接，连接液转化大肠杆菌DH10B，利用Xba I酶切，以及利用Bar元件-L1和Bar元件-L2为引物PCR扩增Bar表达元件进行验证(图6)，确定连接成功，获得含有质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti重组质粒pB01。

其中：

上述Ti双元质粒pB01是构建于在大肠杆菌和根瘤农杆菌间的穿梭质粒，该质粒为环状，是以pCMBIA1300质粒为骨架，由T-DNA的左边界(LB)和右边界(RB)序列、草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒、含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的质粒拯救系统的核心部件构成；

上述Ti双元质粒pB01中的T-DNA的左边界核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

上述Ti双元质粒pB01中T-DNA的右边界核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

上述Ti双元质粒pB01中gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

上述Ti双元质粒pB01中草丁磷除草剂抗性基因(bar)核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；

上述Ti双元质粒pB01中trpC终止子核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；

Ti双元质粒pB01中质粒拯救系统的核心部件核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

实施例2：含有质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti双元质粒pB01宿主细胞的构建

1、Ti双元质粒pB01转化根瘤农杆菌：

利用PEG-CaCl₂法将所述Ti双元质粒pB01导入根瘤农杆菌LBA4404中。

2、转化子筛选及验证：

利用含50μg/ml利福平和50μg/ml G418的YEP平板筛选阳性转化子，并从根瘤农杆菌中提取质粒，EcoR I酶切验证，经验证，从根瘤农杆菌中提取的质粒与pB01大小一致(图7)，以提取得到的质粒为模板，利用引物pUC19-L1(5’-GCACAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATA-3’)和pUC19-L2(5’-GCAC CTGCAG CAATTG GTCGACTCTAGAGGATCCCCG-3’)，PCR扩增Ti质粒pB01T-DNA区域中pUC19片段来验证转化子，电泳检测PCR产物大小约2700bp(图8)，符合预期，说明双元质粒pB01的T-DNA片段有效的插入整合至真菌基因组。

实施例3：根瘤农杆菌介导白僵菌转化及转化子的验证

1、根瘤农杆菌介导的布氏白僵菌转化：

(1)根瘤农杆菌的培养处理：

接种含双元载体的根瘤农杆菌LBA4401单菌落于3ml YEB中(含50μg/ml利福平和100μg/ml Kan)，200rpm，28℃培养过夜。10000rpm离心收集菌体，用0.2ml IM液体培养基(含10mmol/L葡萄糖，400μmol/L AS)重悬菌体，诱导培养6h，调整菌液浓度到不同OD值处备用。

(2)布氏白僵菌孢子培养及处理：

培养布氏白僵菌1019菌株至孢子大量产生，在培养皿上刮取分生孢子于5ml无菌0.05％(v/v)Tween-80中，漩涡分散孢子，4层擦镜纸过滤孢子悬液，除去菌丝体。40ml离心管，8000r/m离心10分钟收集孢子。无菌生理盐水(0.85％w/v)重悬，调节孢子浓度到10⁶个/ml。

(3)取诱导后的根瘤农杆菌LBA4401(OD₆₀₀＝1.0左右)和布氏白僵菌1019孢子悬液各100μl，混合均匀，涂布在含5mmol/L葡萄糖和400μM AS的IM固体培养基，28℃共培养3d，用1ml无菌水洗涤上述共培养物，并将洗涤液涂布在含有60μg/ml草丁磷除草剂的(PPT，以转化子)和500μg/ml头孢霉素杀死根瘤农杆菌，26℃培养约8～10d，至抗性菌落出现。结果显示，Ti质粒pB01上的T-DNA成功转入布氏白僵菌，获得草丁磷除草剂PPT抗性菌落(图9)。

2、根瘤农杆菌介导的布氏白僵菌转化子的验证：

随机挑取抗性菌落和出发菌株1019，接种于活化培养基中28℃振荡培养48～72h，真空抽滤法分离菌体，依次用无菌生理盐水洗涤，提取布氏白僵菌基因组DNA。然后以基因组DNA为模板，利用引物pUC19-L1(5’-GCACAAGCTTGGCGTA ATCATGGTCATA-3’)和pUC19-L2(5’-GCAC CTGCAG CAATTGGTCGACTCTAGAGGATCCCCG-3’)，PCR扩增Ti质粒pB01T-DNA区域中pUC19片段来验证转化子。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性1min；64℃退火1min；72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。电泳检测PCR产物大小约2700bp(图10)，符合预期，说明双元质粒pB01的T-DNA片段有效的插入整合至布氏白僵菌基因组。

实施例4：质粒拯救获取插入座位序列信息

1、质粒拯救：

(1)基因组DNA提取：

实施例3中验证双元质粒pB01的T-DNA片段插入整合至布氏白僵菌基因组的转化子接到相应培养基中培养，提取转化子基因组DNA。

(2)基因组DNA酶切、连接及转化：

采用EcoR I、Pst I这两种组合酶切基因组DNA，连接使其片段自连，连接液转化大肠杆菌DH10B，利用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基筛选转化子，提取质粒。

(3)质粒验证：

以步骤(2)提取的质粒为模板，利用引物pUC19-L1(5’-GCACAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATA-3’)和pUC19-L2(5’-GCAC CTGCAG CAATTGGTCGACTCTAGAGGATCCCCG-3’)进行PCR验证，扩增pUC19DNA片段，PCR反应条件为，94℃预变性2min；94℃变性1min；64℃退火1min；72℃延伸1.5，共30个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。电泳检测PCR产物大小约2700bp，符合预期结果(图11)。

(4)质粒双酶切验证：

利用EcoR I和Hind III双酶切提取的质粒，产物经电泳检测，符合预期的结果应该是有多条电泳条带，其中有一条带为2700bp，为质粒拯救核心元件中EcoR I和Hind III两个酶切位点之间的DNA片段大小，另一条带为Hind III和RB基因组序列上EcoR I之间插入座位附近的基因组DNA片段大小。经测定所得的质粒大小约为4000bp，EcoR I和Hind III双酶切产物经电泳检测，发现有2条带，一条约为2700bp，另一条约为1500bp，与预期相符(图12)。

2、测序获得插入座位序列信息：

(1)测序：选取步骤(4)验证符合预期结果的质粒测序。

(2)测序结果比对获得插入座位序列信息：登陆NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST将测序结果与GeneBank中的已知序列进行比对，经比对，发现该片段与木霉基因组exc2y区域DNA片段有最高的相似性，但没有明确的生理功能被揭示。

序列表

<110>齐鲁工业大学

<120>一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用

<141> 2018-8-6

<160>6

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<221>Ti双元质粒pB01中T-DNA的左边界核苷酸序列

<222>（1）…（25）

<400> 1

tggcaggata tattgtggtg taaac 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<221>Ti双元质粒pB01中T-DNA的右边界核苷酸序列

<222>（1）…（25）

<400> 2

tgacaggata tattggcggg taaac 25

<210> 3

<211> 1991

<212> DNA

<213>人工序列

<221> gpdA启动子核苷酸序列

<222>（1）…（1991）

<400> 3

gatctttcga cactgaaata cgtcgagcct gctccgcttg gaagcggcga ggagcctcgt 60

cctgtcacaa ctaccaacat ggagtacgat aagggccagt tccgccagct cattaagagc 120

cagttcatgg gcgttggcat gatggccgtc atgcatctgt acttcaagta caccaacgct 180

cttctgatcc agtcgatcat ccgctgaagg cgctttcgaa tctggttaag atccacgtct 240

tcgggaagcc agcgactggt gacctccagc gtccctttaa ggctgccaac agctttctca 300

gccagggcca gcccaagacc gacaaggcct ccctccagaa cgccgagaag aactggaggg 360

gtggtgtcaa ggaggagtaa gctccttatt gaagtcggag gacggagcgg tgtcaagagg 420

atattcttcg actctgtatt atagataaga tgatgaggaa ttggaggtag catagcttca 480

tttggatttg ctttccaggc tgagactcta gcttggagca tagagggtcc tttggctttc 540

aatattctca agtatctcga gtttgaactt attccctgtg aaccttttat tcaccaatga 600

gcattggaat gaacatgaat ctgaggactg caatcgccat gaggttttcg aaatacatcc 660

ggatgtcgaa ggcttggggc acctgcgttg gttgaattta gaacgtggca ctattgatca 720

tccgatagct ctgcaaaggg cgttgcacaa tgcaagtcaa acgttgctag cagttccagg 780

tggaatgtta tgatgagcat tgtattaaat caggagatat agcatgatct ctagttagct 840

caccacaaaa gtcagacggc gtaaccaaaa gtcacacaac acaagctgta aggatttcgg 900

cacggctacg gaagacggag aagccacctt cagtggactc gagtaccatt taattctatt 960

tgtgtttgat cgagacctaa tacagcccct acaacgacca tcaaagtcgt atagctacca 1020

gtgaggaagt ggactcaaat cgacttcagc aacatctcct ggataaactt taagcctaaa 1080

ctatacagaa taagataggt ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt ccagatcatg 1140

gttgaccggt gcctggatct tcctatagaa tcatccttat tcgttgacct agctgattct 1200

ggagtgaccc agagggtcat gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa 1260

aaatgtgacg aactcgtgag ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga 1320

gacggacgga cgcagagaga agggctgagt aataagccac tggccagaca gctctggcgg 1380

ctctgaggtg cagtggatga ttattaatcc gggaccggcc gcccctccgc cccgaagtgg 1440

aaaggctggt gtgcccctcg ttgaccaaga atctattgca tcatcggaga atatggagct 1500

tcatcgaatc accggcagta agcgaaggag aatgtgaagc caggggtgta tagccgtcgg 1560

cgaaatagca tgccattaac ctaggtacag aagtccaatt gcttccgatc tggtaaaaga 1620

ttcacgagat agtaccttct ccgaagtagg tagagcgagt acccggcgcg taagctccct 1680

aattggccca tccggcatct gtagggcgtc caaatatcgt gcctctcctg ctttgcccgg 1740

tgtatgaaac cggaaaggcc gctcaggagc tggccagcgg cgcagaccgg gaacacaagc 1800

tggcagtcga cccatccggt gctctgcact cgacctgctg aggtccctca gtccctggta 1860

ggcagctttg ccccgtctgt ccgcccggtg tgtcggcggg gttgacaagg tcgttgcgtc 1920

agtccaacat ttgttgccat attttcctgc tctccccacc agctgctctt ttcttttctc 1980

tttcttttcc c 1991

<210> 4

<211> 548

<212> DNA

<213>人工序列

<221>草丁磷除草剂抗性基因（bar）核苷酸序列

<222>（1）…（548）

<400> 4

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgatga 548

<210> 5

<211> 769

<212> DNA

<213>人工序列

<221>trpC终止子核苷酸序列

<222>（1）…（769）

<400> 5

gatccactta acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata taagatcgtt 60

ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga taagatacgt 120

tcatttgtcc aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat gtcaacaaga 180

ataaaacgcg ttttcgggtt tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc 240

attgactgca acctagtaac gccttncagg ctccggcgaa gagaagaata gcttagcaga 300

gctattttca ttttcgggag acgagatcaa gcagatcaac ggtcgtcaag agacctacga 360

gactgaggaa tccgctcttg gctccacgcg actatatatt tgtctctaat tgtactttga 420

catgctcctc ttctttactc tgatagcttg actatgaaaa ttccgtcacc agcncctggg 480

ttcgcaaaga taattgcatg tttcttcctt gaactctcaa gcctacagga cacacattca 540

tcgtaggtat aaacctcgaa atcanttcct actaagatgg tatacaatag taaccatgca 600

tggttgccta gtgaatgctc cgtaacaccc aatacgccgg ccgaaacttt tttacaactc 660

tcctatgagt cgtttaccca gaatgcacag gtacacttgt ttagaggtaa tccttctttc 720

tagaagtcct cgtgtactgt gtaagcgccc actccacatc tccactcga 769

<210> 6

<211> 2694

<212> DNA

<213>人工序列

<221>质粒拯救系统的核心部件的核苷酸序列

<222>（1）…（2694）

<400> 6

gcacaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 60

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 120

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 180

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 240

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 300

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 360

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 420

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 480

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 540

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 600

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 660

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 720

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 780

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 840

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 900

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 960

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 1020

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 1080

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 1140

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 1200

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 1260

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 1320

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 1380

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 1440

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 1500

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 1560

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 1620

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 1680

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 1740

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 1800

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 1860

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 1920

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 1980

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 2040

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 2100

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 2160

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 2220

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 2280

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 2340

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 2400

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 2460

ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 2520

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 2580

gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 2640

aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacca attgctgcag gtgc 2694

Claims (10)

1.一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，其特征是：所述遗传转化系统由Ti双元质粒pB01和含有pB01的宿主细胞构成；其中，所述Ti双元质粒pB01是构建于在大肠杆菌和根瘤农杆菌间的穿梭质粒，该质粒为环状，是以pCMBIA1300质粒为骨架，由T-DNA的左边界(LB)和右边界(RB)序列、草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒、含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的质粒拯救系统的核心部件构成；所述含有pB01的宿主细胞是根瘤农杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，其特征是：所述Ti双元质粒pB01中的pCMBIA1300质粒是根瘤农杆菌介导植物转化体系中广泛应用的Ti质粒，该质粒与根瘤农杆菌LBA4404所含有的助手质粒pBL4404能够配合使用，在T-DNA区域含有烟草花叶病毒35S启动子和终止子，并含有潮霉素抗性基因。

3.根据权利要求1所述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，其特征是：所述Ti双元质粒pB01中T-DNA的左边界核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述Ti双元质粒pB01中T-DNA的右边界核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述Ti双元质粒pB01中的草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒自上游至下游依次由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)启动子、草丁磷除草剂抗性基因(bar)、构巢曲霉色氨酸C(trpC)终止子组成；其中，gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，草丁磷除草剂抗性基因(bar)核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，trpC终止子核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；所述所述Ti双元质粒pB01中的含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的质粒拯救系统的核心部件的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

4.根据权利要求1所述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，其特征是：所述含有pB01的宿主细胞的出发菌株是根瘤农杆菌菌株LBA4404。

5.权利要求1所述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中Ti双元质粒pB01的构建方法，步骤是：

(1)草丁磷除草剂抗性基因(bar基因)表达盒的构建：

①重组质粒pUC19-trpCt的构建；

②pUC19-trpCt-gpdAp的构建；

③pUC19-trpCt-bar-gpdAp的构建；

(2)质粒拯救系统的核心部件的构建：以pUC19为模板，采用PCR的方法扩增PCR扩增带有Pst I和BamH I的含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点(ori)元件的用于质粒拯救的DNA片段；

(3)含有质粒拯救体系的根瘤农杆菌Ti质粒构建：

①重组质粒pLBRB的构建；

②重组质粒pUC1913的构建；

(4)含质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti重组质粒pB01的构建：以重组质粒pUC19-trpCt-bar-gpdAp为模板，利用PCR的方法扩增带有EcoR I的bar基因表达元件DNA片段；然后利用EcoR I酶切bar基因表达元件DNA片段，利用Mun I酶切质粒pUC1913，连接，并将连接液转化大肠杆菌DH10B，利用Xba I酶切验证，确定获得含有质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti重组质粒pB01。

6.权利要求1所述高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统中含有pB01的宿主细胞的构建方法，步骤是：

(1)Ti双元质粒pB01转化根瘤农杆菌：

利用PEG-CaCl₂或电转化法将将所述Ti双元质粒pB01导入根瘤农杆菌中；

(2)转化子筛选及验证：

利用含利福平和Kan的YEB平板筛选阳性转化子，并从根瘤农杆菌中提取质粒，以提取得到的质粒为模板，进行PCR和酶切验证，确定获得含有质粒拯救体系和组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti双元质粒pB01的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征是：所述根瘤农杆菌的出发菌株是根瘤农杆菌菌株LBA4404。

8.权利要求1所述高效便利定位基因插入座位的遗传转化系统在丝状真菌转化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，该应用方法是：

(1)根瘤农杆菌介导的丝状真菌转化：利用乙酰丁香酮(acetosyritone，AS)诱导根瘤农杆菌LBA4401，取设定OD₆₀₀的诱导后的LBA4401菌液与设定孢子浓度的丝状真菌在含有乙酰丁香酮(AS)的培养基上混合放置共培养，利用含有草丁磷除草剂(PPT)的筛选培养基进行转化子筛选；

(2)转化子验证：随机挑取在筛选培养基上有生长的菌落和出发菌株，提取丝状真菌基因组DNA，PCR扩增Ti质粒pB01的T-DNA区域中片段，验证转化子；

(3)质粒拯救：

①将转化子接到相应培养基中培养，提取转化子基因组DNA；

②采用EcoR I、Pst I这两种组合酶切基因组DNA，连接使其片段自连，连接液转化大肠杆菌DH10B；

③利用含有氨苄青霉素的LB培养基筛选转化子，提取质粒；

④利用EcoRI和HindIII双酶切提取的质粒，产物经电泳检测，符合预期的结果应该是有多条电泳条带，其中有一条带为2700bp，为质粒拯救核心元件中EcoR I和Hind III两个酶切位点之间的DNA片段大小，另一条带为Hind III和RB基因组序列上EcoR I之间插入位点附近的基因组DNA片段大小；

(4)测序获得插入位点序列信息：选取步骤(3)验证符合预期结果的质粒进行测序，登陆NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST将测序结果与GeneBank中的已知序列进行比对，确定插入位点序列。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述乙酰丁香酮(AS)的浓度为400μg/ml；所述诱导后的根瘤农杆菌LBA4401菌液浓度OD₆₀₀为1.0±0.1，丝状真菌的孢子浓度为10⁶个/ml；共培养时间为3d，共培养之前的预培养时间为6h；其中，所述丝状真菌选择白僵菌、绿僵菌、粗糙脉孢霉、哈氏木霉或稻瘟病菌；所述草丁磷除草剂(PPT)浓度为60μg/ml；

步骤(3)中含有氨苄青霉素的LB培养基中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml。