CN101048505A - 用于递送双链rna至有害生物的包含至少一个适配子的多结构域rna分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及递送双链RNA(dsRNA)至有害生物体的方法和构建体。更具体地，本发明涉及由包含以下的核苷酸序列组成的多结构域RNA分子：(i)至少一个适配子和(ii)至少一个形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退货的互补链，其中之一包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。本发明还涉及编码所述多结构域RNA分子的核酸，以及所述多结构域RNA分子在农业中的各种应用。

Description

用于递送双链RNA至有害生物的包含至少一个适配子的多结构域RNA分子

技术领域

本发明一般地涉及RNAi及其在基因沉默中的用途。而且，本发明还涉及用于递送双链RNA(dsRNA)至有害生物(pest)体的方法和构建体。

背景技术

基因表达的靶向抑制是生物技术和基因工程中长期以来未能满足的需求。在过去的几年里，核酸化学和基因转移的进步已激发产生了设计特异性干扰基因表达的新方法。

这些方法之一由作为用于控制基因表达的工具的双链RNA抑制(RNAi)组成，如WO 99/32619和WO 00/01846中所描述。双链RNA抑制基于将RNA导入活细胞以抑制靶基因在该细胞中的基因表达。所述RNA具有带双链结构的区域。双链RNA(dsRNA)具有以序列特异性方式使基因丧失功能的能力。当dsRNA被导入细胞时，其可激活靶向所述细胞质mRNA降解的机制，从而可在转录后水平上有效地沉默全部基因表达。已在许多不同来源真核生物(包括原生动物、真菌、植物、无脊椎动物和哺乳动物)的细胞类型中观察到RNAi。当长dsRNA一进入细胞，其就被具有RNA酶III样活性的酶(Dicer)切割成长度为21-25个碱基对的双链小干扰RNA(siRNA)。切割成siRNA是RNAi沉默机制中的早期步骤。双链RNA(dsRNA)的导入可在多种生物和细胞类型中引起基因特异性RNA干扰反应。

在植物中，该技术可用于例如改变或提高植物对病原体和有害生物的抗性的目的。后种技术可包括当有害生物食用所述植物时，dsRNA被有害生物吸收。在通过摄食进行的递送中，dsRNA可以以营养物相同的方式被分配至来自摄食生物的肠的细胞。还可以想象位于“感染”细胞中的dsRNA可以经历细胞外排(cellular exit)和重新进入相邻“未感染”细胞的连续循环。

然而，通过摄食递送dsRNA至有害生物是有限制的。涉及将dsRNA递送至摄食靶生物的困难很多，例如可包括需要使用非常高量的dsRNA以获得有效性。而且，dsRNA可容易地在植物中或在递送至靶生物体的过程中分解。此外，为了获得有效性，所述dsRNA分子应当被有害生物高效地吸收并递送至所述有害生物的正确靶部位。

由于双链RNA抑制的出现，已经认识到对设计用于在有害生物中定点递送双链RNA的专门化构建体的需要。尽管存在各种可获得的用于直接或间接地将dsRNA导入细胞的方法，但很清楚这些方法效率通常很低，且具有实际的限制。因此，根据上述内容，存在对发展用于更高效地递送dsRNA至有害生物细胞以获得RNAi和杀死或麻痹所述有害生物的工具和方法的需要。本发明目标是提供用于在有害生物(包括线虫、昆虫和真菌)中递送双链RNA的改进方法和构建体。因此，本发明的一个目的是提供具有改进的性质以被高效地吸收入所述有害生物物种的细胞或组织内的dsRNA构建体。

昆虫、真菌和线虫有害生物是对世界上商业重要的农作物造成损害的主要原因。针对减少农作物损失的当前策略主要依赖于化学杀虫剂。可替代地，具有内在有害生物抗性的转基因作物提供了很有前景的另一选择且正在继续开发。抗有害生物的植物可减少有害生物群体的生长、杀虫剂使用量和杀虫剂的环境影响。在本领域仍然存在对显示有害生物抗性的植物的巨大需要。因此，本发明的另一个目的是提供显示对有害生物如线虫、昆虫和真菌的抗性的抗有害生物植物。

发明内容

本发明提供了用于辅助将双链核糖核酸分子递送至有害生物的新的细胞递送分子以及这些分子的各种用途。

具体地，在第一方面，本发明涉及由(核糖)核苷酸序列构成的多结构域RNA分子，其包含：

-至少一个适配子(aptamer)，和

-至少一个形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。

与特定基因具有同源性的双链RNA分子已显示通过RNA干扰导致所述特定靶基因的沉默。在本发明中，我们描述了核苷酸序列的概念和设计，所述核苷酸序列包含连接至能够触发特定靶基因的基因沉默的dsRNA分子的RNA适配子序列。连接至dsRNA分子的适配子序列此处也称作嵌合适配子-dsRNA分子。这些嵌合适配子-dsRNA分子可在体外通过化学合成或通过从DNA模板体外转录来制备，或可在体内从转基因DNA或RNA表达。这些嵌合适配子-dsRNA分子在沉默目的上比常规已知的构建体更有效，因为适配子部分可以：

1.结合至特定的跨膜蛋白，从而改进表达所述靶基因的细胞通过内吞作用对dsRNA的结合和吸收；

2.使得能够通过转胞吞作用或其他转运机制将dsRNA转移至其他靶组织，从而允许所述dsRNA分子的全身性扩散。

3.结合至特定的肠道(gut)细胞蛋白(例如毒素受体、线虫和昆虫中诱导苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)抗性的蛋白质(例如，Cry蛋白、糖基转移酶蛋白、果蝇EGGHEAD和BRAINIAC)，等)，从而改进所述dsRNA内化至有害生物肠道或消化道衬层的细胞内。

4.结合至肠细胞表面分子(碳水化合物如N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNac)和甘露糖、无脊椎动物特异性糖脂等)，从而使所述dsRNA更紧密地与细胞-壁和/或有害生物消化道衬层细胞上的受体接触；

5.结合至特定的植物蛋白或(亚)细胞结构，从而高效地在生产细胞中积累和/或浓缩dsRNA；

6.将dsRNA靶向宿主细胞或生物体中的(亚)细胞结构；

7.保护dsRNA免受Dicer的加工或被生产细胞中的其他核酸酶降解；

8.保护dsRNA分子在细胞外环境中免受降解。

本发明的其他优点包括：容易将双链RNA导入细胞或组织，可使用的RNA的低浓度，双链RNA的稳定性和抑制的有效性。因此，本发明的多结构域RNA分子提供了用于需要递送dsRNA至靶有害生物的各种农学和研究应用的强有力工具。

本发明还提供了使用此处描述的多结构域RNA分子的多种方法，包括帮助递送双链核糖核苷酸分子至有害生物的方法和用于在有害生物物种中下调靶基因表达的方法。

因此，在另一方面，本发明涉及用于递送双链RNA分子至有害生物物种的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种本发明的多结构域RNA分子，和

-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于递送双链RNA分子到有害生物物种的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少2种本发明的多结构域RNA分子，且其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链具有与所述靶基因的靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，和

-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。

在另一个方面，本发明涉及用于在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种本发明的多结构域RNA分子，和

-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少2种本发明的多结构域RNA分子，其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链具有与要被下调的靶基因的靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，和

-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。

在另一个方面，本发明也涉及使用本发明的多结构域RNA分子用于下调有害生物物种中靶基因表达的用途。

在另一个方面，本发明还涉及编码本发明的多结构域RNA分子的核酸以及包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明的多结构域RNA分子的核酸或包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明涉及组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包含至少一种此处定义的多结构域RNA分子，和任选地还包含至少一种赋形剂，例如适合将所述组合物保持在稳定状态的赋形剂。

在另一个方面，本发明涉及用于生产抗有害生物物种的转基因植物的方法，其包括：

-在植物细胞中表达至少一种本发明的多结构域RNA分子，和

-从所述植物细胞再生植物。

本发明也涉及使用本发明的多结构域RNA分子生产转基因植物，特别是生产抗有害生物物种的转基因植物的用途。更具体地，通过产生表达这些抗有害生物靶基因转录物的嵌合适配子-dsRNA分子的转基因植物，可使用本发明的多结构域RNA分子可用于产生抗有害生物的农作物。

本发明还在另一方面涉及可通过本发明的任意方法获得的抗有害生物物种的转基因植物，基本上来源于其的变种、其植物部分、植物细胞或原生质体。

本发明也提供了转基因植物、基本上来源于其的变种、植物部分、植物细胞或其原生质体，它们包含编码此处定义的多结构域RNA分子的核酸，其中所述核酸针对所述转基因植物或基本上来源于其的变种、其植物部分、植物细胞或植物原生质体的基因组是异源的。

本发明也提供包含载体的转基因植物，所述载体包含编码本发明的多结构域RNA分子的核酸。

本发明还涉及已用编码此处定义的多结构域RNA分子的核酸转化的植物、基本上来源于其的变种、其植物部分、植物细胞或原生质体。

在另一个方面，本发明涉及表达(核糖)核苷酸序列的植物、基本上来源于其的变种、其植物部分、植物细胞或原生质体，所述(核糖)核苷酸序列包含：

-至少一个适配子，和

-至少一个形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。

在另一些实施方案中，本发明涉及从本发明的植物或基本由其衍生的变种获得的植物的后代或部分或衍生物。

本发明的另一些方面根据下面的详细描述将是显而易见的。

附图说明

图1是产生本发明的多结构域RNA分子的DNA模板的示意图。1和2表示产生适配子-dsRNA复合物的DNA模板：1是指用于产生通过分子内碱基配对包含dsRNA的单个转录物的DNA模板，而2是指用于产生可在转录后退火形成dsRNA的分开的正义和反义转录物的DNA模板；P是指启动子(真核生物启动子、原核生物启动子、用于体外转录的启动子即T7或SP6启动子)；I、II和III是指可包含合成适配子序列的区域；S是指以正义方向排列的靶基因的片段，而AS是指以反义方向排列的所述靶基因的片段；A至F表示单个适配子-dsRNA复合物，其中A是在5’末端具有适配子部分的转录物，B是在3’末端具有适配子部分的转录物，C是在dRNA发夹结构的环结构内具有适配子部分的转录物，D、E和F是包含不同适配子的转录物；G至I是指来源于分开的正义和反义转录物的适配子dsRNA-复合物，其中G是在转录物之一的5’末端具有适配子的复合物，H是在转录物之一的3’末端具有适配子的复合物，I是包含不同适配子序列的适配子-dsRNA复合物的实例。

图2表示产生本发明的不同的多结构域RNA分子和对照的DNA模板，所述多结构域RNA分子包含nhx-2-sup-35适配子-dsRNA融合物。P是指启动子(真核生物启动子、原核生物启动子、用于体外转录的启动子即T7或SP6启动子)；白色框是指包含抗nhx-2第5个细胞外环的合成适配子序列的区域；S-sup-35是指以正义方向排列的sup-35的片段，而AS-sup-35是指以反义方向排列的sup-35的片段；A是指在5’末端具有适配子部分的转录物；B是指在3’末端具有适配子部分的转录物；C是指无适配子部分的转录物。

图3举例说明经sup-35RNAi，pha-1突变体在限制性温度下的存活。

图4举例说明Nhx-2基因的核酸序列(蛋白质序列：NP_495614，核苷酸序列：NM_063213(粗体和下划线：nhx-2蛋白的第5个细胞外环)(SEQ IDNO 1)。

图5举例说明编码dsRNA sup-35片段的sup-35DNA序列(SEQ ID NO2)。

图6至9举例说明导致干扰特定有害生物的微管蛋白基因的靶序列的实例(SEQ ID NO 3至6)。

图10举例说明本发明的一个具体实施方案。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及由(核糖)核苷酸序列构成的多结构域RNA分子，其包含：

-至少一个适配子，和

-至少一个感兴趣核苷酸序列，其中所述感兴趣核苷酸序列能够形成双链RNA，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链包含对应于(或互补于)有害生物靶核苷酸序列的核苷酸序列。

已发现可将适配子共价地结合至双链(核糖)核酸分子以形成多结构域RNA分子。这样的多结构域RNA分子极大地促进了吸收效率并允许将dsRNA高效地体内递送入有害生物的细胞或组织中，从而提高dsRNA的功效和杀死所述有害生物物种的速度。

尽管本发明主要涉及将双链核糖核酸分子递送入有害生物以实现RNA干扰目的，但此处描述的多结构域RNA分子也可用于帮助递送其他非编码RNA例如小暂时RNA(small temporal RNA)、小核RNA、小核仁RNA或microRNA，它们可用于RNA干扰以外的用途。

A.多结构域RNA分子

本发明涉及由核苷酸序列构成的多结构域RNA分子，所述核苷酸序列包含：

-至少一个适配子，和

-至少一个(能够)形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。

本发明中的表述“至少一个”是指至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个等，且直到至少10个或至少15个。

适配子(aptamer)

本发明中的术语“适配子”或“适配子序列”、或“适配子结构域”此处用作同义词且对于本领域技术人员来说是熟知的。这些术语表示能够特异性地结合广泛的靶分子例如蛋白质或代谢物的合成核酸配体。如此处所用的，适配子是具有以高亲和力和特异性识别几乎任何种类靶分子的能力的寡核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，适配子特异性地结合植物组织中的结构或结合有害生物物种中的结构。

连接至dsRNA分子的适配子(序列)此处也称为“嵌合适配子-dsRNA分子”或“适配子-dsRNA构建体”或称为“适配子-dsRNA复合物”或称为“适配子-dsRNA融合物”。

适配子是基于其结合其他分子的能力从随机库中选择的DNA或RNA分子。类似于抗体-抗原相互作用，适配子以高亲和力和选择性结合其对应的抗原。已选择了结合核酸、蛋白质、小有机化合物和甚至完整生物体的适配子。适配子通过经典Watson-Crick碱基配对以外的相互作用对分子具有特异性结合亲和力。典型的适配子大小为10-15kDa(30-45个核苷酸)，以亚纳摩尔的亲和力结合其靶，且可区分密切相关的靶(例如，通常不结合来自相同基因家族的其他蛋白)。系列结构研究已显示适配子能够使用驱动抗体-抗原复合物中的亲和力和特异性的相同类型的结合相互作用(氢键结合、静电互补、疏水性接触、立体排阻等)。

通常通过称为“经指数富集的配体的系统进化”(SELEX，DS Wilson和JW Szostak Annu.Rev.Biochem.1999，68：611-647)的体外进化方法产生适配子。该方法是基于选择和扩增期望的紧密结合适配子的反复过程。用于选择适配子的起始文库包含具有随机化序列(多至10¹⁵种不同序列)中央区的单链DNA寡核苷酸，所述中央区旁侧是用于随后转录、反转录和DNA扩增的恒定区。通过PCR扩增起始文库并通过T7转录将其转录为RNA起始库。通过使该库和靶分子相互作用来从所述库中选择靶特异性RNA，只将具有高亲和力的紧密结合的RNA分子从反应循环中取出，将所述紧密结合的RNA分子反转录成cDNA并通过PCR扩增成双链DNA。将这些富集的结合序列转录回RNA，所述RNA是下一次选择和扩增循环的源。通常重复这种选择循环5-12次以只获得对靶分子具有最高结合亲和力的序列。

根据第一方面，本发明提供了包含适配子的构建体，所述适配子将dsRNA靶向有害生物物种中的高亲和力结合部位。这些构建体可定位在摄食有害生物的肠道上皮细胞上、该摄食有害生物体中的其他细胞上或甚至例如以植物组织为食的真菌的相互作用细胞表面上。

本发明涉及由至少一种适配子和至少一种靶序列构成的多结构域RNA分子的用途，所述适配子增强有害生物肠道细胞中的内吞作用或增强对肠道或真菌细胞表面的结合，所述靶序列将下调所述有害生物物种的基因。就此来说，构建多结构域RNA分子，所述分子由以下组成：

-至少一个亚基或适配子结构域(序列)，其能够结合被内吞入有害生物细胞如肠细胞内的蛋白质或糖部分，或能够结合该有害生物细胞的内吞作用受体，例如结合肠细胞的内吞作用受体，和

-至少一个靶向有害生物物种的靶核苷酸序列的dsRNA序列。

通过标准技术(SELEX)产生适配子。使用标准分子生物学技术从体外产生的合成基因的转录获得多结构域RNA。

用例如图1：A至F中举例说明的合成基因、或例如图1：G至I中举例说明的基因来转化植物，导致所述多结构域RNA分子的表达。所述转基因的表达模式是遍在的或局限在有害生物的摄食部位区域。用于转基因表达的启动子的选择依赖于所靶向的有害生物物种的摄食行为。例如，当靶物种专门以根为食时，转基因RNA优选地在根组织中表达。

在摄食转基因植物后，有害生物摄入了所述多结构域RNA分子。该分子的适配子结构域(序列)导致所述分子快速地靶向例如肠道细胞膜。肠道质膜上完整RNA的浓度增加可导致内吞的dsRNA的净量增加，从而增加RNAi效应。

类似地，可用包含所述多结构域RNA分子的组合物(等)喷洒易受有害生物侵袭的植物或表面或物质，从而保护所述植物或表面或物质免受多种有害生物的侵袭。

根据另一个实施方案，本发明涉及上述的多结构域RNA分子

-其中至少一种适配子结合被有害生物物种的肠细胞内吞或转胞吞的蛋白质或糖部分，或

-其中至少一种适配子结合被内吞入有害生物物种的细胞内的蛋白质或糖部分，或

-其中至少一种适配子结合内吞作用受体分子，例如肠细胞的内吞作用受体分子，或结合转胞吞作用受体分子，或

-(碳水化合物如N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNac)和甘露糖，无脊椎动物特异性糖脂等)，从而使所述dsRNA更紧密地与有害生物消化道衬层细胞上的细胞-壁和/或受体接触。例如结合碳水化合物如甘露糖的适配子可促进穿越进入血淋巴，从而创造通过喂食本发明的多结构域RNA分子将dsRNA递送至有害生物物种的新的和有效的方法。

适配子能够将多结构域RNA分子靶向并进而将与其融合的dsRNA靶向至活有害生物中的靶向部位。如此处所用的，术语“靶向部位”是指活有害生物的特定细胞或组织，如此处定义，本发明的多结构域RNA分子靶向至所述部位。

“内吞作用”此处定义为通过质膜的局限性区域进行大分子和颗粒性物质的细胞吸收，其中所述区域围绕所述物质并收缩脱离质膜形成细胞内小泡。“受体介导的内吞作用”是所有真核生物包括无脊椎动物如昆虫或线虫中的关键过程，并且是一般细胞功能所必需的，包括营养物(例如，低密度脂蛋白[LDL]或转铁蛋白)的吸收以及膜和膜蛋白的再循环。

“转胞吞作用”此处定义为分子通过细胞的一侧进入，然后迁移穿过该细胞在另一侧离开的过程。转胞吞作用是指通过吸收入包被小泡并从其释放进行的物质跨上皮组织的转运。同样“受体介导的转胞吞作用”也是真核细胞中的关键过程。

术语“肠细胞(enterocyte)”是指构成肠上皮外表面大部的终末分化细胞。优选地，肠细胞形成有害生物物种的肠道或肠或消化道的衬层。

因此在本发明的某些实施方案中，多结构域RNA分子可包含允许经内吞作用进入有害生物肠道细胞例如肠细胞的适配子。在另一个实例中，适配子允许(或促进或使得能够)从有害生物的肠道内腔至组织液(coelumicfluid)或血淋巴的转胞吞作用。在本发明的另一些实施方案中，多结构域RNA分子可包含允许经转包吞作用进入有害生物的组织细胞(例如，但不限于肌肉细胞、生殖腺细胞、神经细胞)的适配子。在另一个实施方案中，适配子允许(或促进或使得能够)从有害生物器官衬层的内皮细胞至所述器官内腔的转胞吞作用。在本发明的另一些实施方案中，多结构域RNA分子包含至少两个适配子，例如允许(或促进或使得能够)经转胞吞作用从有害生物的肠道细胞至该有害生物的组织液或血淋巴的一个适配子，和允许(或促进或使得能够)经内吞作用进入该有害生物的组织细胞的另一个适配子。

在另一个实施方案中，多结构域RNA分子包含至少一个被有害生物肠道细胞上受体例如内吞作用受体分子或转胞吞作用受体分子所识别的适配子，且该识别触发适配子和dsRNA之间复合物的胞吞作用或转胞吞作用。

为了增加到达有害生物物种中靶mRNA的活性dsRNA的量，可以考虑其他的适配子构建体。

根据一个具体实施方案，本发明涉及上述的多结构域RNA分子，其中至少一个适配子特异性地和以高亲和力结合特定的肠道细胞蛋白，例如但不限于毒素受体、在线虫和昆虫中诱导苏芸金杆菌(Bt)抗性的蛋白质(例如但不限于Cry蛋白、糖基转移酶蛋白、果蝇-EGGHEAD和BRAINIAC等)。

根据另一个特定的实施方案，本发明涉及上述的多结构域RNA分子，其中至少一个适配子特异性地和以高亲和力地结合肠细胞表面分子如碳水化合物，例如但不限于N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNac)和甘露糖或无脊椎动物特异性糖脂等。

此外，根据另一个方面，本发明提供了包含保护dsRNA在植物中免受降解的适配子的构建体。

为了增加到达有害生物物种中的靶mRNA的活性dsRNA的量，用由(1)dsRNA序列和(2)适配子构成的转基因转化植物，其中(1)所述dsRNA序列靶向所述有害生物中的mRNA和(2)所述适配子设计用于以高亲和力特异性结合内源植物蛋白或分泌的有害生物蛋白。

因此在一个优选的实施方案中，本发明涉及上述的多结构域RNA分子，其中至少一个适配子特异性地和以高亲和力结合内源植物蛋白质。在所述植物细胞中，设计所述适配子使之将所述适配子-dsRNA复合物靶向参与将分子运输至叶绿体、线粒体、质体或其他细胞器的蛋白质。在这些细胞器中，所述适配子-dsRNA分子可能受到保护而免受细胞浆中植物Dicer的加工和/或降解。这样，更多和更长的dsRNA片段将保留在植物组织中。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述的多结构域RNA分子，其中至少一个适配子特异性地和以高亲和力结合分泌的有害生物蛋白质。在一个具体实例中，适配子结合由真菌物种分泌的酶或蛋白质，所述酶或蛋白质参与被所述真菌物种用于经摄食吸收营养物的任意过程。作为摄食过程的一部分，所述酶或蛋白质又被所述真菌物种吸收。因此，根据本发明，所述多结构域RNA分子可通过其适配子部分对所述分泌酶或蛋白质(或对其被重吸收的部分)的结合被真菌同时吸收。

为了增加到达有害生物物种中靶mRNA的活性dsRNA的量，也可用由(1)序列和(2)适配子构成的转基因转化植物，其中(1)所述序列靶向有害生物中的mRNA，和(2)所述适配子设计用于以高亲和力结合并特异性抑制酶，如存在于所述植物中或在有害生物的肠道中分泌的核酸酶。在两种情况下，通过抑制植物核酸酶或有害生物核酸酶，有害生物肠道中的未加工dsRNA的浓度增加。可用于内吞的dsRNA的量增加，从而提高了RNAi效应。

在另一个优选的实施方案中，本发明因此提供了包含适配子的构建体，所述适配子结合和/或抑制参与dsRNA的加工和/或降解的植物或有害生物的酶。因此根据另一个实施方案，本发明也涉及上述的多结构域RNA分子，其中至少一个适配子结合和/或抑制参与dsRNA的加工和/或降解的植物酶。因此根据另一个实施方案，本发明也涉及上述的多结构域RNA分子，其中至少一个适配子结合和/或抑制参与dsRNA的加工和/或降解的有害生物的酶。

因此，本发明包括几种类型的适配子，例如但不限于这样的适配子：

-能够结合被有害生物物种的肠细胞内吞或转胞吞的蛋白质或糖，

-能够结合被内吞入有害生物物种的细胞内的蛋白质或糖，

-能够结合肠细胞内吞作用受体分子或肠细胞转胞吞作用受体分子，

-特异性地和以高亲和力结合至存在于肠细胞表面的特定蛋白质，例如但不限于毒素受体、在线虫和昆虫中诱导苏芸金杆菌(Bt)抗性的蛋白质，

-特异性地和以高亲和力结合至存在于肠细胞表面上的糖，例如但不限于N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNac)和甘露糖，或无脊椎动物特异性糖脂等，

-特异性地和以高亲和力结合至内源植物蛋白质，

-特异性地和以高亲和力结合至分泌的有害生物蛋白质，

-结合和/或抑制参与dsRNA的加工和/或降解的植物酶，或

-结合和/或抑制参与dsRNA的加工和/或降解的有害生物的酶。

根据另一些实施方案，本发明的多结构域RNA分子包含至少两种，优选地至少三种，更优选地至少四种选自上述适配子的适配子。

双链DNA和靶基因

此处所用的“靶基因”是指需要在靶(有害生物)物种中被沉默的基因。靶基因可选自此处描述的任何物种的基因组。根据一个优选的实施方案，靶序列选自一种生物体的基因组，该生物不同于其中表达能够导致干扰的dsRNA的生物体。这意味着所述dsRNA在一种(宿主)细胞或生物体中表达且随后转移至(或被吸收至)包含所述靶基因的另一种细胞或生物体。根据本发明的一个特定的实施方案，所述dsRNA在植物或植物细胞中表达，而靶基因选自细菌、病毒或无脊椎动物，更具体地选自植物有害生物物种例如线虫、真菌或昆虫的基因组。在本说明书中，表述“dsRNA”涉及能够导致RNA干扰的双链RNA。

根据另一个实施方案，所述dsRNA在细菌或真菌细胞中表达，且所述细菌或真菌细胞被有害生物物种吸收或食用。根据另一个实施方案，所述dsRNA分离自、或纯化自表达该dsRNA的细菌或真菌细胞，且提供所述dsRNA作为针对所述有害生物物种的杀虫剂或杀虫制剂。

特别合适的靶基因是参与靶有害生物物种的关键生物途径的基因，即靶基因对于靶有害生物物种是必需基因，且靶基因的基因沉默对靶有害生物物种的生活力、生长、发育、摄食、运动和/或生殖具有不利影响。合适的靶基因是与有害生物物种在宿主中的感染、增殖或致病相关的基因。在另一个优选的实施方案中，有害生物中的靶RNA序列包含对于有害生物的发育、神经功能、生殖或消化是必需的基因的序列。

根据本发明，所述多结构域RNA分子由包含至少一个(能够)形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列的序列构成。

根据本发明，可使用能够指导靶基因的RNAi或RNA介导的基因沉默的任何合适的双链RNA片段。

如此处所用，“双链核糖核酸分子(dsRNA)”是指包含形成RNA双链体的两条链的任何RNA分子、片段或区段，无论是否存在未配对的核苷酸的单链突出端。

双链RNA包含退火后的互补双链，其中一条链具有对应于要被下调的靶基因的靶核苷酸序列的核苷酸序列。双链RNA的另一条链与该靶核苷酸序列互补。

根据本发明，“dsRNA”或“双链RNA”，每当所述表述涉及能够导致干扰的RNA时，可由两个或更多个分开的多核苷酸链形成，所述多核苷酸链一起形成双链的、折叠的或装配的结构，所述结构包括至少一个在通过RNAi进行基因沉默中有效的双链部分。例如，所述dsRNA可由两个分开的(正义和反义)、退火在一起的RNA链形成，在该实施方案中，所述dsRNA的正义和反义链来源于不同的多结构域RNA分子。当折叠或装配时，所述RNA分子可包含双链和单链区域。在另一些实施方案中，其中一条链来源于本发明的多结构域RNA分子，而另一条链是在相同或在另一个细胞中表达的另一个RNA分子，且该RNA分子可包含或可以不包含保护其免受降解或指导其至特定位置的结构域或序列。如进一步所描述的，所述dsRNA可包含不与靶基因或序列互补但具有其他功能的其他序列。

可替代地，可从包含自我互补区域的单个RNA多核苷酸分子形成所述dsRNA，这样当折叠时，其能够形成包含一个或多个在经RNAi的基因沉默中有效的双链部分(也称作“dsRNA片段”)。例如，所述dsRNA可具有折叠的茎-环或发夹结构，其中所述dsRNA的两条退火链共价连接。在该实施方案中，dsRNA的正义和反义链由部分自身互补的单个嵌合RNAi分子的不同区域形成。构成所述双链RNA的正义和反义部分的组织是可变的。如果所述dsRNA准备通过体内表达例如在下述宿主细胞或生物体中表达、或通过体外转录合成，那么具有该结构的RNA非常方便。除了其不应当损害分子的双链部分介导RNAi的能力外，连接两个RNA链的“环”的精确性质和序列通常不是本发明的关键。用于RNAi的“发夹结构”或“茎环结构”的特征在本领域内是公知的(参照：WO 99/53050)。然而，根据本发明的一些特定实施方案，连接两条RNA链的环可包含适配子序列。

此外，如此处所用，双链核糖核酸分子还可包括形成功能性茎环结构的单链RNA分子，如小暂时RNA、短发夹结构RNA和microRNA，从而形成具有单链突出端的RNA双链体的结构等同物。本发明的多结构域RNA分子可以是分离的、纯化的、天然的或重组的，且可通过添加、缺失、替换和/或改变一个或多个核苷酸(包括非天然核苷酸，包括加在5’和3’末端以增加核酸酶抗性)来进行修饰。

如果本发明的方法用于在宿主中控制有害生物的生长或侵染，优选地，所述dsRNA对靶生物以外的生物体无害，因此所述双链RNA与任何宿主基因、或至少与宿主的任何必需基因不具有任何显著的同源性。在本说明书中，优选地所述双链RNA与宿主细胞的任何基因显示低于30％、更优选地低于20％、更优选地低于10％和更优选地低于5％的核酸序列一致性。％序列一致性应当根据能够导致RNA干扰的双链RNA序列的全长来计算。如果宿主生物的基因组序列数据是可获得的，那么使用标准的生物信息学工具相互检验与双链RNA的序列一致性是很简单的。

可替代地，在本说明书中，优选地所述dsRNA的21个连续碱基对不存在于宿主生物体的基因组中。

优选地，能够导致RNA干扰的双链RNA序列不具有与靶生物体以外的生物体的序列相同的20个连续核苷酸。例如，当靶生物是植物病原体例如植物寄生线虫或昆虫时，所述双链RNA不具有与来自植物或哺乳动物(特别是人)的核苷酸序列相同的20个连续核苷酸。

靶有害生物基因的“靶区域”可以是该基因的任何合适区域。靶区域应当包含靶基因的至少17或18个连续核苷酸，更优选地靶基因的至少19、20或21个核苷酸和更优选地至少22、23、24或25个核苷酸。

此处所用的“互补”表示DNA-DNA和RNA-RNA互补以及DNA-RNA互补。依此类推，术语“RNA等同物”表示在DNA序列中，碱基“T”可被通常存在于核糖核酸中的对应碱基“U”取代。

术语“与......互补的核苷酸序列”是指与靶基因的核苷酸序列的至少一部分互补的序列。术语“互补”，当在本发明中用于dsRNA时，是指与靶基因的一条链具有实质性序列一致性。在本发明中，互补序列通常包含与靶基因的对应序列具有超过约75％序列一致性的核苷酸序列，然而，更高的同源性可产生靶基因表达的更高效抑制。优选地，序列一致性是大约80％、85％、90％、95％和更优选地超过约99％。在本发明中，表述“超过约”与“至少”具有相同含义。

最优选地双链RNA(至少其一部分)与靶有害生物基因的靶序列具有100％序列一致性。然而，应该认识到，100％序列一致性不是功能性RNA抑制所必需的。已发现相对于靶序列，具有插入、缺失和单点突变的RNA序列对于RNA抑制也是有效的。因此，术语“对应于”，当用于指双链RNA和靶基因的靶区域之间的序列对应时，应解释为不绝对地要求100％序列一致性。

尽管所述dsRNA必须包含对应于靶基因的靶区域的序列(即其中所述dsRNA的一条链和靶(例如有害生物)核苷酸序列的至少一部分互补)，但整个dsRNA对应于靶区域的序列不是绝对必需的。例如，dsRNA可在靶特异性序列旁侧含有短的非靶区域，前提是该序列不实质性影响dsRNA在RNA抑制中的性能。

串联体

在另一个实施方案中，本发明的多结构域RNA分子包含多重dsRNA片段，每个片段包含退火后的互补链，其中一条链和待沉默的靶核苷酸序列的至少一部分互补。用于本发明的多重dsRNA片段通常也称为“串联体”。因此，本发明提供由核苷酸序列构成的多结构域RNA分子，其包含：

-至少一个适配子，和

-多个dsRNA片段(串联体)，每个包含退火后的互补链，其中一条链包含互补的核苷酸序列。

本发明中术语“多个”是指至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个等和多至至少10、15、20或至少30个。

用于本发明的合适串联体的非限定性实例包括三叶草形串联体(concatemer cloverleaf)、哑铃形串联体(concatemer dumbbell)、发夹结构串联体、茎dsRNA串联体。

在一个实施方案中，所述多结构域RNA分子包含与一个靶基因中不同(例如，截然不同)序列互补的多个dsRNA片段。在另一个实施方案中，所述多结构域RNA分子包含与不同(例如，截然不同)靶基因互补的多个dsRNA片段。在另一个实施方案中，所述多结构域RNA分子包含一个dsRNA片段的至少一个重复。此处所用的“一个重复”是指相同dsRNA片段的2个拷贝。在另一个实施方案中，所述多结构域RNA分子包含一个(例如，相同)dRNA片段的至少2个或3个拷贝，优选地至少4个、5个或6个拷贝，更优选地至少7、8、9、10或更多个拷贝。换句话说，所述多重dsRNA片段是单个dsRNA片段的重复。在一个优选的实施方案中，所述dsRNA片段不被非杂交RNA片段分离开。在另一个实施方案中，通过连接子或间隔子序列分隔开所述dsRNA片段。优选地，所述连接子或间隔子序列是双链且所述链互补，从而也形成双链区域。所述连接子序列可包含不和靶序列互补的短随机核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述dsRNA片段不被连接子、间隔子或进一步描述的锁序列(lock sequence)分隔开。

本发明包括多结构域RNA分子，所述分子包含至少一个适配子和由退火后互补链构成的一个dsRNA，其中一条链具有与有害生物靶基因的靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，并且其包含一个或多个额外的dsRNA片段，每个片段由退火后的互补链构成，其中各dsRNA片段的至少一个互补链，各自独立地包含与下列序列互补的核苷酸序列：

-所述有害生物靶基因的所述核苷酸序列的至少一部分，或

-所述有害生物靶基因的另一核苷酸序列的至少一部分，或

-另一有害生物靶基因的核苷酸序列的至少一部分，或其组合。

应当清楚，多结构域RNA分子中的“多个dsRNA”表述也包括包含一个或多个dsRNA片段的拷贝且还包含其他dsRNA片段(该dsRNA片段与所述重复的或拷贝的dsRNA片段不同)的多结构域RNA分子。因此，本发明也涉及多结构域RNA分子，所述多结构域RNA分子除了包含至少一个适配子外，包含一个或多个dsRNA片段的重复，且还包含至少一个与所述重复片段不同的dsRNA片段。

在包含多结构域分子的串联体中，各dsRNA片段的长度可以是至少17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp或更多，例如约30bp、约40bp、约50bp、约60bp、约70bp、约80bp、约90bp、约100bp、约110bp或约120bp。包含多结构域分子的串联体中的优选的dsRNA片段具有17至300bp，优选地21至250bp，优选地40至150bp，更优选地50至120bp或其间任何数目的长度。

术语“另一个靶基因”或“另外的靶基因”可互换使用且表示例如第二、第三或第四靶基因等。

根据一个优选的实施方案，所述dsRNA片段靶向对于有害生物的生活力、生长、发育或生殖是必需的至少一个靶基因和靶向参与致病性或传染性的至少一个基因。可替代地，所述dsRAN片段靶向相同类型的多个基因，例如所述dsRNA片段靶向至少两个必需基因或至少两个参与致病性的基因或至少两个参与任意细胞功能的基因。根据另外的实施方案，所述dsRNA片段靶向至少2个靶基因，所述靶基因参与不同的细胞功能。例如，所述dsRNA片段靶向两个或更多个参与蛋白质合成(例如，核糖体亚基)、蛋白质降解(例如蛋白酶体亚基)、微管细胞骨架的形成(例如β微管蛋白基因)等的基因。

可如下组合多结构域RNA分子中的dsRNA片段；

a)当组合靶向单一靶基因的多个dsRNA片段时，可以原始顺序(即所述区域在靶基因中呈现的顺序)将其组合在多结构域RNA分子中，

b)可替代地，可忽略所述片段的原始顺序，从而可以打乱并以任何顺序随机地或有意地将其组合入多结构域RNA分子中，

c)可替代地，单独一个片段可在多结构域RNA分子中重复几次，例如从1至10次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或

d)可以正义或反义方向组合dsRNA片段(靶向单个或不同的靶基因)。

因此本发明包括包含至少一个适配子和靶向不同靶基因的多个dsRNA片段的多结构域RNA分子，所述靶基因来源于单个靶(或有害生物)物种，或其中所述不同的靶基因来源于截然不同的靶(或有害生物)物种，例如属于相同(在一个实施方案中)或属于不同(在另一些实施方案中)属、科、目或甚至门的有害生物物种。

包含这些多个dsRNA片段和靶向多个靶基因的多结构域RNA分子，其特征在于累积多种RNAi能力，从而导致协同作用，并能够在靶细胞或靶生物体中引发多重RNAi效应。

保护免受RNA加工

所述dsRNA还可含有DNA碱基、非天然碱基或非天然骨架连接或糖磷酸骨架的修饰，例如以增强保存期间的稳定性或增强对核酸酶降解的抗性。

能够导致干扰的双链RNA片段自身在长度上优选地大于17bp，优选地在长度上大于19bp，更优选地在长度上大于20bp，更优选地大于21bp或大于22bp或大于23bp，或大于24bp，或大于25bp。

在实施例部分记录了用于本发明的包含双链RNA的合适多结构域RNA分子的设计和生产。任选地，在本发明的嵌合RNAi分子内，可包括一个或多个能够保护所述双链RNA部分(导致RNA干扰)免受RNA加工的部分。这些部分和结构描述于申请人的具有申请号0423659.2且在2004年10月25日提交于英国专利局(且一旦获得其公开号，即予提供)的专利申请，和申请人的具有申请号US 60/621,800且在2004年10月25日提交的和具有申请号US 60/683,551且在2005年5月5日提交于美国专利商标局的另外专利申请(且一旦获得其公开号，即予提供)。两个专利申请在此以其全文引用作为参考。因此本发明的嵌合RNAi构建体可包含不同的dsRNA核心类型，任选地包含连接子类型，任选地包含经设计以保护所述dsRNA核心在表达所述dsRNA构建体的宿主细胞中免受RNA加工的不同锁类型。在本发明的一个实施方案中，能够保护dsRNA免受RNA加工的序列也称作“锁”。(关于用于本特定部分、涉及dsRNA的保护的术语，参考申请人的上述英国和美国专利申请)。

每当描述被稳定的或被保护的多结构域RNA分子时，术语“核心”是指dsRNA部分，该核心可包含至少一个dsRNA片段或其可包含多个dsRNA片段。

此处使用的术语“dsRNA核心”是指dsRNA分子的核心。不同的dsRNA核心类型是例如包含一个dsRNA的单茎结构、包含多个dsRNA片段(串联体)的单茎结构，所述dsRNA片段各自独立地互补于一个靶基因或互补于一个靶基因的不同靶序列或互补于不同的靶基因。

此处所用的术语“锁”是指能够保护dsRNA或其部分免受RNA加工的序列。不同的锁类型包括富含GC的夹、约4或约5个碱基对的短环、错配锁或蛋白质结合RNA结构如IRES、病毒的5’区、铁应答元件或被蛋白质识别的其他RNA基序。

可将保护dsRNA免受RNA加工的其他机制组合在本发明的多结构域RNA分子内，例如将dsRNA嵌入类病毒中或天然未加工的RNA结构(例如mi RNA、tRNA、核糖体RNA、剪接体组分或转录自RNA聚合酶I、II或III启动子的其他非编码RNA)中。在例如Navarro和Flores(2000 EMBOJournal 19(11)p 2662)中描述和举例说明了将dsRNA嵌入类病毒样dsRNA结构中。可将dsRNA并入原样类病毒内，或并入突变的类病毒中以避免内部切割(例如被核酶切割)或避免翻译。突变可基于来自Dais等人(1991，NAR19(8)，p 1893)的信息。这些类型的构建体可转运至叶绿体，在叶绿体中其可接受额外的免受dsRNA加工的保护。

保护dsRNA免受加工的另一个机制是将dsRNA的信号导向宿主细胞的细胞内区室中。例如，在dsRNA被转移至靶宿主细胞前，其可被区隔在中间宿主细胞中。特别地，多结构域RNA分子可被区隔在植物细胞中，例如，在其被转移至植物有害生物物种(例如植物有害生物线虫或昆虫)之前，其可位于叶绿体、线粒体或质体中。区隔化作用可以多种方式发生，例如通过使用类病毒结构，或通过使用信号序列例如叶绿体、线粒体或质体信号序列。这些细胞器是原核生物起源的且可提供避开植物RNA加工机器的保护性环境。

连接子

此处使用的术语“连接子”是指使锁能够连接至dsRNA核心的分子。不同的连接子类型是条件性自我切割的RNA部分，例如在低pH或在高pH被切割的连接子或在疏水条件下被切割的连接子，或是内含子或非互补RNA序列之一。任选地，所述嵌合RNAi分子可包含茎间碱基配对部分或可以是三联RNA的形式。在一个优选的实施方案中，所述多结构域RNA分子的多个dsRNA片段不用连接子连接。在另一个实施方案中，连接子存在于多结构域RNA分子中的至少一个适配子和dsRNA之间。在另一个优选的实施方案中，通过一个或多个连接子连接所述多结构域RNA分子的多个dsRNA片段。

在一个具体实施方案中，连接子可以用于在有害生物中分离开较小的dsRNA区。有利地，在此情况下连接子序列可在特定条件下促进长dsRNA分裂成较小的dsRNA，导致在这些条件下释放分离的dsRNA片段并且通过这些较小的dsRNA片段引起更高效的基因沉默。合适的条件性自我切割连接子的非限定性实例是在合适pH条件下自我切割的RNA序列。Borda et al.(NucleicAcids Res.2003 May 15，31(10)：2595-600)描述了这种RNA序列的合适实例，该文件通过参考并入此处。该序列源自锤头形核酶HH16的催化核心。作为替代，连接子在内体中是自我切割的。当本发明的多结构域RNA分子通过内吞或转胞吞作用被有害生物吸收，并因而被区隔化到有害生物的内体中时，这可能是有利的。内体可具有低pH环境，导致连接子的切割。当通过细胞壁转移从一个细胞转移到另一个时，如跨越有害生物的细胞壁，疏水条件下自我切割的连接子尤其可用于本发明的多结构域RNA分子。适用该技术的具体感兴趣植物有害生物是植物寄生真菌或植物寄生病毒或细菌。

内含子可用作连接子。此处所用“内含子”可以是信使RNA的任意非编码RNA序列。本发明多结构域RNA分子的特别合适的内含子序列是(1)富含-U(35-45％)；(2)平均长度为100bp(从约50至500bp可变)，其中碱基对可以是随机选择的或基于已知内含子序列；(3)从具有-AT:GT-或-CG:GT-的5’端开始和/或(4)在其3’端具有-AG/GC-或AG:AA。

根据本发明，连接子序列可存在或不存在于dsRNA片段之间。优选地，在dsRNA片段之间不存在连接子序列。例如当化学合成包含dsRNA片段的dsRNA时，dsRNA片段可直接彼此邻接，不存在非靶序列。当存在时，连接子可以例如包含不与靶序列互补的短随机核苷酸序列，但这是由于克隆造成的。

自身不互补的RNA序列也可用作连接子，范围从约1碱基对至约10000碱基对，例如至少10、20、30、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、1500、2000、3000、10000碱基对，或其间的任意数目。

选择被根据本发明的多结构域RNA分子靶向的靶基因

选择被根据发明的多结构域RNA分子靶向的靶基因，有赖于为了获得期望的有害生物防治作用而对靶机体或机体中要被沉默的靶基因的选择。对于此处以下设计的多结构域RNA分子，靶基因选自如下一或更多类型的基因：

1.“必需”基因，包括一个或更多靶机体的关键基因，当其沉默时导致致死性或严重的(如运动、摄食、麻痹、吸收、繁殖力)表型。

2.“致病性基因”，是参与有害生物致病性或感染性的基因。

3.“有害生物特异性”基因，包括在非有害生物中没有基本同源的对应部分的基因，这可以通过生物信息学同源性搜索确定，例如通过BLAST搜索。选择有害生物特异性靶基因导致物种特异性RNAi作用，而在非靶生物中没有作用或基本没有(不利)作用。

4.“保守通路”基因，包括参与相同生物通路或细胞过程的基因，或包括在不同物种中具有相同功能的基因，导致特异性和强效的RNAi作用以及更高效的有害生物控制。

5.根据本发明，多结构域RNA分子靶向诱导改善有害生物中递送/吸收/内吞的基因，例如甲壳素合酶基因、编码围食膜膜蛋白、分泌的RNAse、参与肠道中Rnase分泌的蛋白的基因；紧密连接基因、分隔连接基因、编码参与肠道酸化的蛋白质(尤其对于鳞翅目昆虫，如离子通道)以及参与维持和/或再生肠道上皮的蛋白质的基因。

多个靶序列或多个靶物种的组合

本发明的多结构域RNA分子和方法尤其可用于同时靶向多个序列。这些多重序列可源自一个靶基因。作为替代，这些多重序列可源自多重靶基因。这些多重靶基因可源自一个和相同的有害生物物种。作为替代，这些多重靶基因可源自相同或不同目的不同有害生物物种。因此，本发明的一个多结构域RNA分子，例如以三叶草形串联体、茎串联体、或发夹串联体的形式，可同时靶向相同和/或多重靶基因的多重序列，所述靶基因起源自相同和或不同有害生物物种，如线虫、昆虫、细菌和/或真菌。

根据本发明的一个具体实施方案，所述多结构域RNA分子靶向源自多种物种的多个靶基因。例如，多结构域RNA分子可靶向源自多种植物有害生物物种的多个基因，并通过在植物中表达所述多结构域RNA分子，植物获得同时抗多种植物有害生物的抗性。相似地，可以用包含多结构域RNA分子的组合物(等)喷洒对有害生物侵染易感的植物或表面或物质，从而保护所述植物或表面或物质抵抗多种有害生物的侵染。例如，植物获得抗线虫和昆虫的抗性，或抗线虫、昆虫和/或真菌的抗性。所述多结构域RNA分子还允许植物获得抗不同属、科、目或纲的多种线虫的抗性，和/或抗不同属、科或目的昆虫的抗性，和/或抗不同属、科或目的真菌的抗性。

本发明的另一个具体实施方案中，所述多结构域RNA分子靶向源自相同目不同物种的多重靶基因。例如，靶向不同细菌、病毒、真菌、昆虫或线虫物种的基因的一个多结构域RNA分子可用作有效且广谱的细菌、病毒、真菌、昆虫杀虫剂或广谱线虫杀虫剂。将靶向来自不同有害生物物种的多重靶序列的dsRNA片段组合到根据本发明的一种多结构域RNA分子中有利于扩大所述dsRNA分子RNAi作用的有害生物物种谱。

本发明的另一个具体实施方案中，所述多结构域RNA分子靶向源自相同生物例如来自相同有害生物物种的多个靶基因。这些构建体提供一种优点：来自相同生物的多个弱靶基因可以被一起沉默以便高效防治所述有害生物，而分开沉默一个或更多个弱靶基因不能有效防治所述有害生物。并且，为进一步改进有害生物控制的效果，或避免因突变引起的有害生物抗性，可同时沉默来自相同生物的几个强靶基因。

靶和有害生物物种

术语“靶生物”或“靶物种”或“有害生物”或“有害生物物种”此处用作同义词，并且表示需要被杀死或麻痹的任何生物或物种。合适的靶物种选自包含以下的组：病毒、细菌、酵母、真菌、昆虫、螨虫、原生动物、后生动物(包括线虫)、藻类、植物、动物(包括哺乳动物)。最适合本发明方法的靶物种是有害生物物种。优选地，在本发明中，术语“靶物种”或“有害生物物种”表示植物有害生物物种如线虫、昆虫、真菌、细菌和病毒，优选表示分类学上属于昆虫纲，或线形动物门，或真菌的任何生物。

线虫

此处所用的“线虫”包含线形动物门(Nematoda)的物种。线虫的很多物种是寄生的并且引起人和动物(例如蛔目(Ascaradida)、尖尾目(Oxyurida)、圆线虫目(Strongylida)、类圆线虫目(Stronglyloides)以及毛首目(Trichocephalida)的物种)、以及植物和真菌(例如滑刃目(Aphelenchida)、垫刃目(Tylenchida)以及其他目的物种)的健康问题。优选地，此处所用“线虫”表示植物寄生线虫和生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于，外寄生虫如剑线虫(Xiphinema spp.)、长针线虫(Longidorus spp.)、以及毛刺线虫(Trichodorus spp.)；半寄生虫如垫刃线虫(Tylenchulus spp.)；迁移性内寄生虫如腐线虫(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫(Radopholus spp.)、以及盾线虫(Scutellonerna.spp.)；定居寄生虫如胞囊线虫(Heterodera spp.)、球胞囊线虫(Globodera spp.)、以及根结线虫(Meloidogyne spp.)，以及茎和叶内寄生虫如茎线虫(Ditylenchus spp.)、刃线虫(Aphelenchoides spp.)、以及Hirshmaniellaspp.。根据本发明的一个优选实施方案，所述线虫是植物寄生线虫，尤其是根寄生性土壤线虫，例如胞囊线虫和球胞囊线虫属(成胞囊线虫)以及根结线虫属(根结线虫)的线虫。本发明的RNA构建体尤其适用于控制根结线虫属的有害物种，例如南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，和胞囊线虫属的有害生物物种，例如大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)，以及球胞囊线虫属的有害生物物种，例如马铃薯球胞囊线虫(Globodera rostochiensis)(马铃薯胞囊线虫)，还有迁移性内寄生虫的代表，例如穿刺根腐线虫(Pratylenchuspenetrans)或香蕉穿孔线虫(Radopholus similes)，以及外寄生虫的代表，例如毛刺线虫(Trichodorus spp.)和剑线虫(Xiphinema spp.)。然而根据发明的RNA构建体的用途决不限于这些属，还以相同方式扩大到其他线虫。

昆虫

此处所用“昆虫”包括所有昆虫物种。在一个实施方案中，所述昆虫物种包括鳞翅目(Lepidoptera)的物种。根据本发明的一个优选实施方案，所述昆虫是破坏植物的昆虫，其中包括鳞翅目昆虫有害生物，如实夜蛾属(Heliothisspp.)、铃夜蛾属(Helicoverpa spp.)、灰翅夜蛾属(Spodoptera spp.)、秆野螟属(Ostrinia spp.)、Pectinophora spp、地老虎属(Agrotis spp.)、Scirphophaga spp.、纵卷叶野螟属(Cnaphalocrocis spp.)、蛀茎夜蛾属(Sesamia spp)、陲夜蛾属(Chilospp.)、干煞夜蛾属(Anticarsia spp.)、Pseudoplusia spp.、Epinotia spp.、和Rachiplusia spp.，优选烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)、谷实夜蛾(Helicoverpazea)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、Helicoverpa punctera、Ostrinia nubilafis、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Scirphophaga incertulas、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、大螟(Sesamia inferens)、斑禾草螟(Chilopartellus)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、夜小卷蛾(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu。优选昆虫的实例包括但不限于鞘翅目(coleoptera)的成员(Anobium、龟象属(Ceutorhynchus)、棕榈象属(Rhynchophorus)、Cospopolites、Lissorhopterus spp.、稻水象甲(Lissorhopterus oryzophilus)、Meligethes、稻象甲(Echinocnemus squamos)、Hypothenemus、海小蠹属(Hylesinus)、叶甲(Acalymma)、Lema、Psylliodes、金花虫属(Leptinotarsa)、土甲属(Gonocephalum)、叩甲属(Agriotes)、Dermolepida、异爪犀金龟属(Heteronychus)、猿叶甲属(Phaedon)、拟谷盗属(Tribolium)、米象属(Sitophilus spp.)、玉米象(Sitophilus zeamais)、根萤叶甲属(Diabrotica spp.)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)、北美玉米根叶甲(Diabrotica barberi))、稻负泥虫(Oulema oryzae)、玉米跳甲(Chaetocnemapulicaria)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、Cerotoma trifurcata、科罗拉多金花虫(Leptinotarsa decemlineata)、花象属(Anthonomus spp.)、墨西哥棉铃象甲(Anthonomus grandis)、或圆皮蠹属(Anthrenus spp.))，鳞翅目(例如Ephestia、长吻夜蛾属(Mamestra)、Earias、Pectinophora、秆野螟属(Ostrinia)、粉夜蛾属(Trichoplusia)、粉蝶属(Pieris)、贪夜蛾属(Laphygma)、地老虎属(Agrotis)、Amathes、Wiseana、Tryporyza、杆草螟属(Diatraea)、Sporganothis、小卷蛾属(Cydia)、黄卷蛾属(Archips)、菜蛾属(Plutella)、陲夜蛾属(Chilo)、实夜蛾属(Heliothis)、铃夜蛾属(Helicoverpa)(尤其是棉铃虫(Helicoverpaarmigera))、灰翅夜蛾属(Spodoptera)或谷蛾属(Tineola spp.))，双翅目(Diptera)(例如蝇属(Musca)、伊蚊属(Aedes)、按蚊属(Anopheles)、库蚊属(Culex)、舌蝇属(Glossina)、蚋属(Simulium)、螫蝇属(Stomoxys)、黑角蝇属(Haematobia)、虻属(Tabanus)、齿股蝇属(Hydrotaea)、绿蝇属(Lucilia)、Chrysomia、锥蝇属(Callitroga)、肤蝇属(Dermatobia)、胃蝇属(Gasterophilus)、皮蝇属(Hypoderma)、种蝇属(Hylemyia)、芒蝇属(Atherigona)、黄潜蝇属(Chlorops)、植潜蝇属(Phytomyza)、蜡实蝇属(Ceratitis)、斑潜蝇属(Liriomyza)、和蜱蝇属(Melophagus spp.))，虱毛目(Phthiraptera)、半翅目(Hemiptera)(例如灰飞虱(Laodelphax striatellus)、白背飞虱(Sogatellafurcifera)、玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)、大戟长管蚜(Macrosiphumeuphorbiae)、蚜属(Aphis spp.)(棉蚜(Aphis gossypii)、大豆蚜(Aphis glycines))、伯粉虱属(Bemisia spp.)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、Phorodon、Aeneoplamia、小绿叶蝉属(Empoasca spp.)(蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)、南方浮尘子(Empoasca solana))、Parkinsiella、Pyrilla、Aonidiella、Coccus、粉蚧属(Pseudococcus)、Helopeltis、草盲蝽属(Lygus)、Dysdercus、Oxycarenus、绿蝽属(Nezara)、Aleurodes、锥蝽属(Triatoma)、Rhodnius、木虱属(Psylla)、瘤蚜属(Myzus spp.)、烟蚜(Myzus persicae)、Megoura、根瘤蚜属(Phylloxera)、Adelyes、飞虱属(Nilaparvata spp.)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、Nephrotettixspp.、二点黑尾叶蝉(Nephotettix virescens)、或臭虫属(Cimex spp.))，直翅目(Orthoptera)(例如飞蝗属(Locusta)、蟋蟀属(Gryllus)、Schistocerca或Achetaspp.)，网翅目(Dictyoptera)(例如姬蠊属(Blattella)、大蠊属(Periplaneta)或蠊属(Blatta spp.))，膜翅目(Hymenoptera)(例如芫菁叶蜂属(Athalia)、Cephus、美切叶蚁属(Atta)、毛蚁属(Lasius)、火蚁属(Solenopsis)或小家蚁属(Monomorium spp.))，等翅目(Isoptera)(例如土白蚁属Odontotermes和散白蚁属(Reticulitermes spp.))，蚤目(Siphonaptera)(例如栉头蚤属(Ctenocephalides)或蚤属(Pulex spp.)，缨尾目(Thysanura)(例如衣鱼属(Lepisma spp.)，革翅目(Dermaptera)(例如Forficula spp.)和啮虫目(Psocoptera)(例如围啮属(Peripsocus spp.)和缨翅目(Thysanoptera)(例如烟蓟马(Thrips tabaci)。

真菌

此处所用“真菌”包括真菌分类的所有物种。根据本发明的一个优选实施方案，所述靶基因源自植物寄生真菌如稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)(稻瘟病，之前称Magnaporthe grisae；anamorph Pyricularia oryzae Cav.以及Pyricularia grisae)；丝核菌(Rhizoctonia spp.)，尤其是立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)以及稻丝核菌(Rhizoctonia oryzae)；藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)；铁锈真菌(Sclerotinium spp.)；歧曲长蠕孢菌(Helminthosporium sigmoideum)；腐霉(Pythium spp.)；链格孢霉属(Alternaria spp.)，尤其是早疫病链格孢霉(Alternaria solani)；镰刀菌(Fusarium spp.)，尤其是腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)以及Fusarium germinearum；小枝顶孢属(Acremoniella spp.)；稻小球腔菌(Leptosphaeria salvinii)；柄锈菌属(Puccinia spp.)，尤其是小麦叶锈菌(Puccinia recondita)以及小麦条锈菌(Puccinia striiformis)；颖枯壳针孢(Septoria nodorum)；大麦网斑病菌(Pyrenophora teres)；Rhincosporiumsecalis；多囊丝壳属(Erysiphe spp.)，尤其是禾白粉菌(Erysiphe graminis)；芽枝霉菌属(Cladosporium spp.)；核腔菌属(Pyrenophora spp.)；腥黑粉菌属(Tilletia spp.)；疫霉属(Phytophthora spp.)，尤其是致病疫霉(Phytophthorainfestans)；葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)；葡萄白粉病菌(Uncinulanecator)；灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；黑腐病菌(Guiguardia bidwellii)；C.viticola；苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)；Erwinia armylovora；白叉丝单囊壳菌(Podosphaera leucotricha)；梨黑星病菌(Venturia pirina)；层锈菌属(Phakospora sp)(大豆锈病)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米黑粉病)。

细菌

破坏植物并能用本发明的构建体和方法防治的“细菌”例如是：农杆菌属(Agrobacterium ssp.)、蛛网菌属(Arachnia ssp.)、棒形杆菌属(Clavibacterssp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium ssp.)、欧文氏菌属(Erwinia ssp.)、梭形杆菌属(Fusobacterium ssp.)、哈夫尼亚菌属(Hafnia ssp.)、假单胞菌属(Pseudomonas ssp.)、螺原体属(Spiroplasma ssp.)、链霉菌(Streptomyces ssp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas ssp.)、XyIeIIa ssp.和嗜木质菌属(Xylophilus ssp.)。

病毒

破坏植物并能用本发明的构建体和方法防治的“病毒”例如是：非洲木薯花叶病毒、苜宿花叶病毒、美洲离子线条病毒、安第斯马铃薯潜隐病毒、安第斯马铃薯斑驳病毒、苹果萎黄叶点病毒、苹果花叶病毒、苹果茎沟病毒、南芥菜花叶病毒、滇芎B病毒oca株、芦笋病毒2号、澳洲葡萄藤类病毒、鳄梨日斑病类病毒素、大麦和性花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、大麦黄矮病毒、大麦黄花叶病毒、菜豆普通花叶病毒、菜豆金色花叶病毒、菜豆卷叶病毒、菜豆荚斑驳病毒(缩写BPMV)、芸豆黄化花叶病毒、有芒鸢尾花叶马铃薯Y病毒、甜菜曲顶病毒、甜菜缩叶病毒、甜菜花叶病毒、甜菜坏死黄脉病毒、甜菜伪黄化病毒、Beet westem yellows virus、甜菜黄矮病毒、颠茄斑点病毒、Blackrasberry latent virus、枯萎病(et analogues/en analoge)、蓝莓叶条纹病毒、蚕豆萎蔫病毒、Bromoviruses、可可肿枝病毒、可可树黄花叶病毒、仙人掌X病毒、Cadan-cadang viroid、Camation cryptic virus、香石竹蚀环病毒、香石竹潜隐病毒、香石竹斑驳病毒、香石竹坏死斑点病毒、Camation ringspot virus、香石脉斑驳病毒、木薯普通花叶病毒、花椰菜花叶病毒、樱桃卷叶病毒、樱桃锉叶病毒、樱桃锉叶病毒(美洲)、Cherry rugose virus、菊花B病毒、Chrysanthenum stunt viroid、柑桔裂皮类病毒、柑桔曲叶病毒、柑桔花叶病毒、柑桔衰退病毒(欧洲分离株)、柑桔衰退病毒(非欧洲分离株)、Citrus variegationvirus、Citrus veinenation woody gall、Citrus viroids、芹菜黄脉病毒、Cocksfootmild mosaic virus group、Cocksfoot streak virus、豇豆轻斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、Cucumber yellows virus、Cucumovirus satellites、兰花花叶病毒、大丽菊花叶病毒、芋头嵌纹病毒、Dianthoviruses、Echtes Ackerbohnenmosaic virus、Elderberry carlavirus、大戟花叶病毒、佛罗里达番茄病毒、阿尔及利亚葡萄潜隐病毒、保加利亚葡萄潜隐病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄金黄化病支原体、葡萄藤卷叶关联病毒(I至V)、Grapevine tunusian ringspot virus、葡萄病毒A、葡萄黄斑类病毒(I和II)、Grapewine chrome mosaic virus、Heracleurn latentvirus、百子莲花叶病毒、忍冬潜隐病毒、Hop(American)latent virus、Hop latentvirus、啤酒花花叶病毒、啤酒花矮化类病毒啤酒花病毒A、啤酒花病毒C、Hydrangea ringspot virus、Iliaviruses、鸢尾微斑花叶病毒、韭葱黄条纹病毒、Leprosis、莴苣传染性枯黄病毒、莴苣花叶病毒、Lilac chlorotic leafspot virus、Lilac ring mottle virus、Lilly symptomless virus、黄矮病毒卫星、玉米矮花叶病毒、玉米条纹病毒、Marafiviruses、甜瓜坏死斑病毒、Myrobolan latent ringspotvirus、水仙潜隐病毒水仙花叶病毒、Narcissus tip necrosis virus、水仙黄条病毒、Oat golden stripe virus、燕麦花叶病毒、齿兰环斑病毒、橄榄潜隐环斑病毒、洋葱矮化病毒、番木瓜花叶病毒、番木瓜轮点病毒、欧防风黄点病毒、豌豆早枯病毒、豌豆肿突花叶病毒、豌豆种传花叶病毒、桃花叶病毒(美洲)、Pear declinemycoplasm、天竺葵卷叶病毒、辣椒轻型虎斑病毒、植物呼肠孤病毒、Plum linepattern virus(American)、李痘病毒、猩猩木花叶病毒、杨树花叶病毒病、马铃薯珊瑚状花叶病毒、马铃薯黑环病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯卷叶病毒(非欧洲分离株)、马铃薯帚顶病毒、马铃薯纺锤形块茎类病毒、马铃薯病毒A、马铃薯病毒A(非欧洲分离株)、马铃薯病毒M、马铃薯病毒M(非欧洲分离株)、马铃薯病毒S、马铃薯病毒S(非欧洲分离株)、马铃薯病毒T、马铃薯病毒X、马铃薯病毒X(非欧洲分离株)、马铃薯病毒Y、马铃薯病毒Y(非欧洲分离株)、马铃薯黄矮病毒、马铃薯黄花叶病毒、李矮缩病毒、李环斑病毒、覆盆子丛矮病毒、覆盆子卷叶病毒(美洲)、悬钩子环斑病毒、Raspberry vein chlorosis virus、Red clover mottle virus、红三叶草脉花叶病毒、长叶车前花叶病毒、水稻条纹叶枯病毒组、Rubus yellow net virus、Saguro cacao virus Satellites(andere dangeciteerde)、蜜柑萎缩病毒、葱潜伏病毒、Sharka virus、Sobemoviruses、藜草花叶病毒、Sowthistle yellow vein virus、Spinach latent virus、南瓜曲叶病毒、Stolbur mycoplasm、草莓皱缩病毒、草莓潜伏C病毒、草莓潜隐环斑病毒、草莓轻性黄边病毒、草莓脉带病毒、Sugar beet yellows virus、Tater leafvirus、烟草蚀纹病毒、烟草花叶病毒、烟草坏死病毒、烟叶响尾病毒、烟草环斑病毒、烟草条纹病毒、烟草矮化病毒、番茄顶矮化类病毒、番茄不孕病毒、番茄黑环病毒、Tomato bunchy top viroid、番茄丛矮病毒、番茄花叶病毒、Tomato plantamacho viroid、番茄环斑病毒、番茄斑萎病毒、Tomato yellow leaf curf virus、土拉苹果花叶病毒、郁金香碎色病毒、芜菁皱缩病毒卫星、芜菁皱缩病毒、芜菁花叶病毒、芜菁黄花叶病毒、Tymoviruses、绒毛烟斑驳病毒、其他类病毒、西瓜花叶病毒2号、小麦矮缩病毒、土传小麦花叶病毒、小麦梭线条花叶病毒、小麦黄花叶病毒、白三叶草花叶病毒、薯芋花叶病毒、小西葫芦黄斑点病毒、和小西葫芦黄化花叶病毒。

有害生物可以是任何物种。优选地，有害生物是经济上重要的任何昆虫或线虫，例如引起疾病的生物、居室有害生物、农业有害生物、或与植物如玉米、马铃薯、大豆、甜菜、草、树、果园和葡萄园、花园、蔬菜等疾病有关的有害生物。

所述有害生物可以处于发育的任何阶段，但是当所述生物是昆虫时，当递送dsRNA时优选它处于幼虫或成虫发育阶段。

B.核苷酸序列-载体-宿主细胞

根据另一方面，本发明还涉及编码此处所述任何多结构域RNA分子的核酸。

根据另一个实施方案，本发明涉及包含框内(in frame)信号序列的如上所述的核酸，所述信号序列将所编码的多结构域RNA分子导向至植物细胞内特定位置，如细胞骨架或植物细胞器，如叶绿体、质体、线粒体。

载体

根据本发明的另一方面，提供表达构建体，此处还称作重组DNA构建体，以辅助导入宿主细胞以及例如植物细胞和/或辅助表达和/或辅助维持编码根据本发明的多结构域RNA分子的核苷酸序列。所述表达构建体可插入商业可获得的质粒或载体中。

根据本发明的一个实施方案，所述表达构建体是表达载体，其适用于转化入宿主生物如酵母、细菌、真菌或植物或植物细胞，并且适用于根据本发明的多结构域RNA分子在转化宿主细胞中的维持和表达。“表达载体”是可以用于转化所选宿主细胞并且在所选宿主中提供编码序列的表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合载体。因此本发明还涉及包含上述任何核酸的载体。所述载体还可包含用于在所述宿主细胞中控制所述核酸表达的调节序列。

根据本发明的一方面，所述表达构建体是植物表达载体，其适用于转化入植物以及适用于在转化植物细胞中维持和表达根据本发明的多结构域RNA分子。因此本发明还涉及包含上述任何核酸的载体。所述载体还可包含在植物细胞中控制所述核酸表达的调节序列。

此处所用术语“调节序列”和“控制序列”应作广义理解，表示能驱动和/或调节与其连接和/或可操作性连接的序列的表达的调节性核酸序列。所述控制序列根据预期宿主生物以及待表达序列的性质而不同。对于在原核生物中表达蛋白质，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点、和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子，以及在有些情况下还包括增强子、和/或5’和3’非翻译区。术语“控制序列”意图包括，至少，表达所必需的所有组分，还可以包括其他有利组分。根据本发明的一个实施方案，所述控制序列在植物中可操作；优选所述控制序列是衍生自植物序列的序列。术语“控制序列”包括启动子或能够激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的序列。

用于dsRNA表达的启动子是来自RNA Pol I、RNA Pol II、RNA Pol III、T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的启动子。这些启动子典型用于dsRNA的体外生产，所述dsRNA然后被包括在抗杀虫药剂中，例如抗杀虫液体、喷雾剂或粉剂中。

适用于根据本发明的构建体和方法的启动子的实例是组成型植物启动子，如CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒(FMV)34S启动子、rubisco启动子、肌动蛋白启动子或泛素启动子。

为了改善dsRNA从植物细胞向植物有害生物的转移，植物优选在植物有害生物容易接触的植物部分表达所述dsRNA。表达所述dsRNA的优选组织是根、叶、茎、根状茎、芽、块茎、花药、叶柄、种子、花、果实。因此，可以使用组织优选的启动子，如根特异性启动子或叶特异性启动子。根优选启动子的实例是PsMTA(Fordam-Skelton，AP.，et al.，1997 Plant Molecular Biology 34：659-668.)、III型甲壳素酶启动子，等......叶和茎特异性或者也被光激活的光合组织特异性启动子的实例是甜菜的两个叶绿素结合蛋白(cab1和cab2)的启动子(Stahl D.J.，et al.，2004 BMC Biotechnology 2004 4：31)、rbcS编码的(Nomura M.et al.，2000 Plant Mol.Biol.44：99-106)核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的A(gapA)和B(gapB)亚基的启动子(Conley T.R.et al.1994 Mol.Cell Biol.19：2525-33；Kwon H.B.et al.1994Plant Physiol.105：357-67)、编码叶和茎特异性(ST-LS1)蛋白质的马铃薯(Solanum tuberosum)基因的启动子(Zaidi M.A.et al.，2005 Transgenic Res.14：289-98)、茎调节的、防卫诱导基因的启动子如JAS启动子(专利公开号20050034192/US-A1)、花特异性启动子如查耳酮(chalcone)合酶启动子(FaktorO.et al.1996 Plant Mol.Biol.32：849)以及果实特异性启动子如草莓的RJ39的启动子(WO 98 31812)。其他适合的启动子是病原体-诱导的启动子，如线虫诱导的植物启动子、或摄食部位特异性启动子，其实例是Wun-1(Hansen et al.1996.Physiol.Mol.Plant Pathol.48：161-170)；Lea-14，Lemmi 9(Van derEycken W et al.Plant J.19969(1)：45-54；Escobar C et al.Mol Plant MicrobeInteract.1999，12(5)：440-9)、pin-2(Keil et al.1989.EMBO J.8：1323-1330)以及TobRB7(Opperman et al.1994.Science，263：221-223)。根据本发明的一个实施方案，所述载体包含组成型启动子。根据本发明的另一个实施方案，所述载体包含诱导型启动子。根据本发明的另一个实施方案，所述载体包含组织特异性启动子，例如当有害生物主要以植物根为食时在减轻有害生物侵染条件下的根特异性启动子，或例如当有害生物主要以植物叶为食时在减轻有害生物侵染条件下的叶特异性启动子。仅在某些组织或细胞中起始转录的启动子在此分别称为“组织特异性”或“细胞特异性”启动子。此外，本发明涉及根据发明的载体，其中所述启动子选自包含以下的组：组织特异性启动子，如选自包含以下的组的任意启动子：编码PsMTA III型甲壳素酶的基因的根特异性启动子，光合作用组织特异性启动子如cab1和cab2、rbcS、gapA、gapB以及ST-LS1蛋白的启动子，JAS启动子，查耳酮合酶启动子以及来自草莓的RJ39的启动子。

任选地，一个或更多转录终止序列也可以并入所述表达构建体中。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，它发出原始转录物的3’加工和多聚腺苷酰化以及转录终止的信号。另一些调节元件，如转录或翻译增强子，可以并入所述表达构建体中。

本发明的表达构建体还可包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起始。一个实例是当需要在细菌细胞中维持表达构建体作为附加体遗传元件时(如质粒或粘粒分子)。优选的复制起始包括但不限于f1-ori和colE1 ori。

所述表达构建体可任选地包含选择标记基因。如此处所用，术语“选择标记基因”包括任何基因，所述基因向其表达细胞赋予某种表型，有助于细胞鉴定和/或筛选，所述细胞用本发明的表达构建体转染或转化。适当的标记是赋予抗生素或除草剂抗性的标记或可视标记。选择标记的实例包括新霉素磷酸转移酶(nptll)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)或除草剂Basta。适当的选择标记的其他实例包括抗氨苄青霉素(Amp^r)、四环素(Tc^r)、卡那霉素(Kan^r)、草胺膦以及氯霉素(CAT)的抗性基因。另一些适合的标记基因提供代谢性状，例如manA。也可以使用可视标记基因，并且它们包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶以及绿色荧光蛋白(GFP)。

多结构域RNA分子在植物细胞器中的表达

根据本发明的一个优选实施方案，所述多结构域RNA分子在植物细胞器中表达来保护dsRNA免受加工。

根据另一个实施方案，本发明涉及如上所述的核酸，其包含框内信号序列，用于将所编码的多结构域RNA分子导向至植物细胞内特定位置，如细胞骨架或植物细胞器，如叶绿体、质体、线粒体，例如发出信号指导所述多结构域RNA分子导向至宿主细胞的细胞内区隔，以另一种机制来保护dsRNA免受加工。在另一些实施方案中，所述核酸或包含所述核酸的载体包含允许所述RNA分子在植物细胞器中表达的启动子，如叶绿体、质体、线粒体(见上)。

例如在所述多结构域RNA分子转移至靶宿主细胞如有害生物细胞之前，可以先将其区隔化在中间宿主细胞中。具体而言，在所述多结构域RNA分子转移至植物有害生物物种例如植物有害生物线虫或昆虫以前，可以先区隔化在植物细胞中，例如其可以位于叶绿体、线粒体或质体中。可以多种方式实现区隔化，如，例如通过使用类病毒结构，或通过使用信号序列，例如叶绿体、线粒体或质体信号序列。这些细胞器是原核起源的，并且可提供免于植物RNA加工机制的保护性环境。

因此，区隔化所述多结构域RNA分子的主要优点包括，所述分子得以保护免受核/胞质的dsRNA加工(切割)。此外，区隔化提供dsRNA序列的积累。

正义和反义靶RNA的区隔化表达

保护多结构域RNA分子中所包含dsRNA免受RNA加工的另一个机制是分别表达正义和反义，并且将它们靶向到表达所述正义和反义链的宿主细胞或生物内的不同位置。在这个实施方案中，与特定有害生物物种的选定基因对应的正义和反义mRNA片段被克隆在不同启动子之后，驱动在以下定位处的表达：(i)独立的植物组织或(ii)在相同细胞内但是在独立的细胞区隔中。这些启动子是组织或细胞器特异性的，并且允许在不同细胞区隔或临近组织中同时大量表达。

例如，所述正义和反义链可以靶向到不同的植物组织或细胞类型。例如，在叶子中，正义链可以在神经细胞中表达，而反义链在栅栏组织中表达。这可以通过使用不同的启动子驱动正义和反义链的表达来实现。该技术的优势在于，在植物细胞中正义和反义链从不在一起，因此在植物中不会发生Dicer引起的降解或自我沉默或RNA干扰。当有害生物摄食所述植物时，所述链被释放并混合，允许dsRNA在肠道腔内退火，并且可以发生正义和反义链之间的碱基配对而形成长dsRNA。随后该dsRNA可被高效吸收并导致期望的RNAi反应，导致靶mRNA在有害生物中降解以及有害生物的死亡。这种方法可以通过将两个例如提供在组合物中的细菌株喂给有害生物来实现，其中一株产生正义，另一株产生反义链。

另外的递送部分

根据另一个实施方案，在本发明的多结构域RNA分子内可以与由不同模块组成的RNA递送分子共表达。这种递送模块可以由例如多肽序列组成，所述多肽序列包含(i)至少一个RNA-结合结构域，(ii)至少一个能够与细胞内吞和/或转胞吞受体分子结合的靶向多肽以及(iii)任选地至少一个肽连接子和/或至少一个纯化标签。

这种递送促进分子被用于促进双链RNA吸收和正确递送至以植物为食的有害生物中的合适靶位用于RNA干扰。术语“RNA递送模块”、“RNA递送分子”和“RNA递送载体”在此处用作同义词，表示结合至dsRNA介导的沉默分子的多结构域或多模块蛋白质。

在本发明的一个实施方案中，由不同模块组成的RNA递送分子，包含至少一个RNA结合模块、至少一个能被内吞和/或转胞吞或能与细胞内吞和/或转胞吞受体分子结合的靶向模块、任选地至少一个用于将dsRNA结合模块和靶向模块连接的连接子、以及任选地包含纯化标签的模块。

所述RNA递送分子的一个模块是RNA结合结构域。此处所用的“RNA结合结构域”可以一般地或特异地结合双链RNA，一般地或特异地结合单链RNA。所述RNA结合分子可以结构特异地结合dsRNA和/或ssRNA。

RNA结合蛋白的优选实例包括但不限于大肠杆菌噬菌体HK022 NUN蛋白、枯草杆菌(Bacillus subtilis)LicT蛋白、或噬菌体MS2衣壳蛋白或其主要部分、或其同源物。

所述RNA递送分子的第二模块包含靶向模块。术语“靶向模块”和“靶向蛋白”在此处用作同义词，并且表示能够将所述RNA递送分子靶向至活的有害生物中靶向位点的蛋白质、或其关键部分、或同源物。

所述靶向模块优选包含能被内吞和/或转胞吞到有害生物细胞中的蛋白质，或能与有害生物细胞或组织上存在的内吞和或转胞吞受体分子结合的蛋白质，或其任意组合。

宿主细胞

在另一个实施方案中，本发明涉及包含此处所定义核酸或载体的宿主细胞或生物。可根据本发明使用的宿主细胞的实例包括细菌、酵母、真菌、或植物细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌和根癌农杆菌，或可以是真核细胞如酵母、或植物细胞。优选宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞。

因此，本发明还涉及包含此处所定义的任何多结构域RNA分子、dsRNA、核酸或载体的细胞，如宿主细胞。本发明还包括原核细胞(如，但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞)和真核细胞(如，但不限于酵母或植物细胞)。优选所述细胞是细菌细胞或植物细胞。本发明还包括转基因植物，包含这种植物细胞的转基因植物的繁殖或扩增材料。

根据本发明的载体或核酸分子可以整合至宿主细胞基因组中或以染色体外的一定形式维持。

在实施例部分，描述了多结构域RNA分子的多种构建体，包括制备它们的可行方法。应该清楚，本发明不限于此处所举例的具体构建体。

C.方法

本发明涉及向有害生物物种递送dsRNA的方法、在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，以及生产抗有害生物物种抗性的转基因植物的方法。

根据本发明的方法包括将所述多结构域RNA分子喂给所述生物以便向所述生物组织递送所述dsRNA。可以构想本发明的方法将可用于控制由摄食生物引起的植物疾病。提供了生物的有害生物控制方法，以及保护植物对抗生物的方法。

在本发明的方法中，只要所述表述涉及能够引起干扰的RNA，“dsRNA”或“双链RNA”可以通过两条独立(正义和反义)的RNA链一起退火而形成。在该实施方案中，所述dsRNA的正义和反义链源自截然不同的RNA分子，其中所述RNA分子的至少一个是此处所述的多结构域RNA分子。作为替代，所述多结构域RNA分子可以有折回的茎环或发夹结构，其中所述dsRNA的两条退火链被共价连接。在该实施方案中，所述dsRNA的正义和反义链是从部分自身互补的单个多结构域RNA分子的不同区域形成的。构成双链RNA的正义和反义链的来源是可变的。表达多结构域RNA分子的表达策略的非限定性实例如图1和2所示。

有害生物可以通过多种方式吸收多结构域RNA分子。

本发明涉及向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据本发明的多结构域RNA分子，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

在另一个实施方案中，本发明涉及向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括将至少一种根据本发明的多结构域RNA分子喂给有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子被吸收入有害生物物种的肠道，和

其中所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而在有害生物细胞中下调靶基因的表达。

根据本发明的术语“摄食”可涉及向有害生物物种喂食宿主细胞或生物，如植物细胞、细菌、真菌、酵母等、或其混合物，其包括表达、喷或包裹本发明的至少一种多结构域RNA分子。在一个实施方案中，细菌或植物细胞的混合物可喂给有害生物物种，由此所述混合物包含至少一种细菌或植物(细胞)，其包含或表达包含正义或反义RNA链的第一多结构域RNA分子，所述混合物还包含至少另一种细菌或植物(细胞)，其包含或表达另一种多结构域RNA分子，所述另一种RNA分子能够与所述第一多结构域RNA分子的正义或反义RNA的一部分形成双链RNA(为了在有害生物物种中引起RNA干扰)。

在另一个实施方案中，本发明涉及向有害生物物种递送双链RNA分子的方法：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据本发明的多结构域RNA分子以及包含单链RNA的至少一种另外的RNA分子，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中之一的核苷酸序列与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补，和

-将所述植物细胞喂给所述有害生物物种。

应该明白，只要术语“另一些RNA分子”用在所有关于根据本发明的方法的实施方案中时，该术语表示可以是或不是另一个多结构域RNA分子的RNA分子，并且该RNA分子可以包含或不包含保护其免受降解或指导其至特定位置的结构域或序列。因此“另一些RNA分子”可以表示另一个此处定义的多结构域RNA分子，或表示不包含适配子序列的RNA分子。

在另一个实施方案中，本发明涉及向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括将至少一种根据本发明的多结构域RNA分子以及包含单链RNA的至少一种另外的RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

其中所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道中，和

其中所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而在有害生物细胞中下调靶基因的表达。

在另一个实施方案中，本发明涉及向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少两种根据本发明的多结构域RNA分子其中各多结构域RNA分子包括至少一个适配子序列，和

其中各多结构域RNA分子还包括和另一个多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

在另一个实施方案中，本发明提供向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括用至少两种根据本发明的多结构域RNA分子喂给有害生物物种，

其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

其中所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道中，和

其中所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而在有害生物细胞中下调靶基因的表达。

本发明还涉及在有害生物物种中下调靶基因表达的方法。在第一实施方案中，本发明涉及在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据本发明的多结构域RNA分子，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

另一种方法包括用至少一种根据本发明的多结构域RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述RNA分子包含至少一个适配子序列，还包含其包含退火互补链的双链RNA，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道中，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而在有害生物细胞中下调靶基因的表达。

在另一个实施方案中，提供在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，

其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据本发明的多结构域RNA分子以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

作为替代，在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，包括将至少一种根据本发明的多结构域RNA分子和至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子喂给有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而在有害生物细胞中下调靶基因的表达。

在另一个实施方案中，提供在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少两种根据本发明的多结构域RNA分子，

其中各多结构域RNA分子包含至少一个适配子，和

其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-将所述植物细胞或植物喂食给所述有害生物物种。

作为替代，在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，包括将至少两种根据本发明的多结构域RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中各多结构域RNA分子包含至少一个适配子序列，和

其中各多结构域RNA分子还包含(能够)与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，

其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而在有害生物细胞中下调靶基因的表达。

本发明还涉及生产对有害生物物种有抗性的转基因植物的方法，其包括在植物细胞中表达至少一种根据本发明的多结构域RNA分子以及从所述植物细胞再生植物。

在另一个实施方案中，本发明还涉及生产对有害生物物种有抗性的转基因植物的方法，其包括

-在植物细胞中表达至少两种根据本发明的多结构域RNA分子，

其中各多结构域RNA分子包含(能够)与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-从所述植物细胞再生植物。

在另一个实施方案中，本发明提供生产对有害生物物种有抗性的转基因植物的方法，其包括

-在植物细胞中表达至少一种根据本发明的多结构域RNA分子以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子，

其中所述多结构域RNA分子包含能够与所述另外的多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-从所述植物细胞再生植物。

本发明还涉及任何上述方法，其中所述至少一种多结构域RNA分子包含选自前面定义的适配子中的一个适配子。

本发明还涉及任何上述方法，其中至少一种多结构域RNA分子包含选自前面定义的适配子中的两个适配子。

本发明还涉及任何上述方法，其中所述至少一种多结构域RNA分子包含选自前面定义的适配子中的三个适配子。

本发明还涉及任何此处所述的方法，其中所述有害生物物种是此处所述的任何有害生物物种，优选有害生物物种选自包含以下的组：酵母、真菌、昆虫和线虫。

因此本发明提供生产转基因植物、植物细胞或植物组织的方法，其包括向所述植物、植物细胞或植物组织的基因组中引入根据本发明的核酸或载体。

转基因植物

本发明还涉及通过此处所述方法可获得的对有害生物物种有抗性的转基因植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码此处定义多结构域RNA分子的核酸的转基因植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述核酸对所述转基因植物、或其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体的基因组是异源的。

在另一个实施方案中，本发明提供包含此处所述载体的转基因植物。

此处所用“转基因植物”包括参考这种植物，在其基因组内包含异源多核苷酸。通常，所述异源多核苷酸稳定整合在基因组中，使得所述多核苷酸可传至后代。所述异源多核苷酸可单独或作为载体的一部分整合至基因组中。此处使用的“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，由于存在包括那些转基因的异源核苷酸，它们的表型已经被改变，所述那些转基因可以是初始改变的以及从初始转基因经有性杂交或无性繁殖所产生的。

在本发明的另一个实施方案中，提供已经用编码此处定义的至少一种多结构域RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体。

在本发明的另一个实施方案中，提供已经用编码此处定义的至少一种多结构域RNA分子转化、并且已经用编码至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

应该理解，只要术语“另外的RNA分子”用在关于根据本发明的植物的所有实施方案中时，该术语表示可以是或不是另一种多结构域RNA分子的RNA分子，并且所述RNA分子可以包含或不包含保护其免受降解或将其导向至特定位置的结构域或序列。因此“另外的RNA分子”可以表示此处定义的另一种多结构域RNA分子，或表示不包含适配子序列的RNA分子。

还提供已经用编码至少两种此处定义的多结构域RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还提供表达至少一种此处定义的多结构域RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述多结构域RNA分子包含至少一个适配子序列并且还包含双链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还涉及表达至少一种此处定义的多结构域RNA分子、而且还表达至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述多结构域RNA分子包含(能够)与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还涉及表达至少两种此处定义的多结构域RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中各多结构域RNA分子包含(能够)与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

此处所用术语“转化”表示向宿主细胞中转移外源多聚核苷酸，而不考虑用于转移的方法。所述多聚核苷酸可以暂时或稳定地被引入宿主细胞或生物中，并可以非整合地例如作为质粒维持，或作为替代，可以整合至宿主基因组中来维持。转化可以是暂时的或者稳定的。因此本发明还涉及这种暂时或稳定转化的转基因植物、植物细胞或植物组织。本发明还涉及包含任何根据本发明的载体的任何植物。

根据另一个实施方案，本发明还涉及此处所述的任何转基因植物，其包含编码此处定义的多结构域RNA分子的核酸，其特征在于所述植物对有害生物的抗性增强，例如与对照植物相比抗性增强30％-80％。

在另一些实施方案中，本发明还涉及通过本发明或者如此处所述方法可获得的植物或其基本衍生品种的后代，其已经以有性或无性方式获得。

本发明还包括通过本发明或如此处所述的方法可获得的部分或衍生物，如但不限于叶、茎、根、芽、插条或外植体等、原生质体、体细胞胚、花药、叶柄、培养细胞、种子、花、果实和块茎。

在另一个实施方案中，本发明涉及控制有害生物物种的方法，其包括用至少一种此处定义的多结构域RNA分子喂给所述有害生物物种，其中所述多结构域RNA分子包含

至少一个适配子，和

至少一个形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞；和

由此所述双链RNA在有害生物细胞中引起对靶基因的RNAi干扰，使得有害生物物种被杀死或麻痹。

在另一个实施方案中，本发明涉及控制有害生物物种的方法，其包括将至少一种此处定义的多结构域RNA分子以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子包含(能够)与另一种RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞；和

由此所述双链RNA在有害生物细胞中引起对靶基因的RNAi干扰，使得有害生物物种被杀死或麻痹。

在另一个实施方案中，本发明涉及控制有害生物物种的方法，其包括用至少两种此处定义的多结构域RNA分子喂给所述有害生物物种，和

其中各多结构域RNA分子包含至少一个适配子序列，和

其中各多结构域RNA分子还包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

由此各多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此各多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，和

由此所述双链RNA在有害生物细胞中引起对靶基因的RNAi干扰，使得有害生物物种被杀死或麻痹。

在另一个实施方案中，本发明还涉及控制有害生物物种的方法，其包括用此处所定义的对所述有害生物物种有抗性的转基因植物、或者其任意后代或部分来喂食所述有害生物物种。

在另一个实施方案中，本发明提供保护植物抵抗有害生物物种的方法，其包括在所述植物中表达此处定义的多结构域RNA分子。

植物

在一个优选实施方案中，所述宿主生物是植物并且所述有害生物物种是植物病原性有害生物。

在一个优选实施方案中，所述宿主生物是植物并且所述有害生物物种是植物病原性有害生物。

此处所用术语“植物”包括任何植物材料，其中如植物细胞、植物组织(包括愈伤组织)、植物部分、完整植物、先祖以及后代。植物部分可以是植物的任何部分或器官并且包括例如种子、果实、茎、叶、芽、花、花药、根或块茎。所述植物材料应该表达，或有能力表达，包含dsRNA的多结构域RNA分子，所述dsRNA对应待杀死或麻痹的有害生物物种的一个或更多靶基因。术语“植物”还包括悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、配偶体、孢子体、花粉以及小孢子。此处所用植物涉及包括藻类、蕨类和树的所有植物。在一个优选实施方案中所述植物属于绿色植物超科(the superfamily of Viridiplantae)，更优选的是单子叶或双子叶植物。根据本发明的一个实施方案，所述植物对植物致病性和/或寄生性线虫、真菌和/或昆虫的侵染易感。特别可用于本发明方法的植物是农作物植物，包括例如单子叶植物如甘蔗和谷类(包括小麦、燕麦、大麦、高粱、黑麦、粟、玉米、水稻)以及双子叶植物如马铃薯、番茄、葡萄、苹果、梨、香蕉、向日葵、大豆、canola油菜、苜蓿、油菜和棉花。特别可用于本发明方法的树是松树、桉树和白杨。

可以通过本领域技术人员公知的多种方式实现向细胞“施用”DNA。可用技术的实例是鸟枪法、基因枪法、电传孔、转染以及转化。在本发明的一些具体实施方案中，其中细胞是植物细胞，为RNAi的目的在植物中表达外源双链RNA的一般技术是本领域公知的(见Baulcombe D，2004，Nature.431(7006)：356-63.RNA silencing in plants，其内容经引用并入本文)。更具体地，为了在植物有害生物如线虫或昆虫中下调基因表达在植物中表达双链RNA的方法是本领域公知的。为了在植物病原体真菌中下调靶基因的表达，可以类似方式应用相似方法在植物中表达多结构域RNA分子。为了实现这种作用，必要的仅仅是让植物在与真菌直接接触的植物部分中表达(转录)多结构域RNA分子，使得所述双链RNA可以被有害生物物种吸收。根据有害生物物种的性质以及有害生物物种与宿主植物的关系，所述多结构域RNA分子的表达可以发生在植物的细胞或组织中，其中有害生物物种也将存在于所述植物细胞或组织的生命周期中，或者所述多结构域RNA分子可以分泌到细胞之间的空间中，如质外体，有害生物物种将在其生命周期中占据所述空间。此外，所述多结构域RNA分子可以位于植物细胞中，例如胞质溶胶中，或植物细胞的细胞器如叶绿体、线粒体、液泡或内质网中。

作为替代，所述多结构域RNA分子可以被植物细胞或被植物分泌到植物外部。由此，所述dsRNA可以在植物表面形成保护层。

因此本发明涉及生产转基因细胞或生物的方法，其包括向所述细胞或生物施用此处所述核酸或载体的步骤。优选地，所述细胞是植物细胞或所述生物是植物。本发明还涉及通过上述方法可以获得的任何转基因细胞或转基因生物，优选所述转基因细胞或生物是植物细胞或植物生物。

本发明用于生产转基因生物的方法还可包括在促进生长和发育的条件下培养转基因细胞的步骤。当所述转基因生物是植物时，这些方法还可包括以下步骤：从植物组织再生植物，允许生长至成熟和繁殖。作为替代，所述转基因植物组织可采用其他形式或可以形成其他植物的部分，实例是嵌合植物和嫁接(例如嫁接到未转化接穗的转化砧木)。

只要在本文使用，dsRNA从植物“转移”至有害生物物种表示dsRNA在植物细胞中生产并被有害生物吸收、重新定位或与之接触。例如植物寄生线虫或昆虫可通过摄食植物从植物细胞质吸收植物中产生的dsRNA。与dsRNA接触的真菌细胞可以是处于植物细胞外生活阶段的植物病原体真菌细胞，例如菌丝、萌发管、附着胞、分生孢子(无性孢子)、子囊果、闭囊壳或子囊孢子(植物外的有性孢子)的形式。作为替代，与dsRNA接触的真菌细胞可以是处于植物细胞之内生活阶段的植物病原体真菌细胞，例如病原体形式，如侵染钉(penetration peg)、菌丝、孢子或吸器。根据本发明的另一些实施方案，dsRNA可充分接触有害生物细胞或有害生物物种，该情况下dsRNA转移表示与包含dsRNA或dsRNA构建体的组合物相接触。

D.用途

一般地，本发明涉及此处所述的多结构域RNA分子用于需要向靶有害生物递送dsRNA的各种农学和研究应用的用途。

在一个具体实施方案中，本发明涉及此处所述的多结构域RNA分子用来向有害生物物种递送dsRNA的用途。

从本说明书中应该理解，本发明的多结构域RNA分子尤其适用于改进将dsRNA递送至摄食表达dsRNA的植物的有害生物。作为替代，显而易见，根据本发明的多结构域RNA分子也非常可用于通过任何其他方式改进将dsRNA递送至有害生物，所述方式包括但不限于注射dsRNA、将所述生物浸泡在dsRNA溶液中、或用同时表达正义和反义RNA并可获得dsRNA的大肠杆菌喂养有害生物。

在另一个实施方案中，本发明的多结构域RNA分子也非常可用于在有害生物物种中下调靶基因的表达。因此本发明还提供此处所述多结构域RNA分子用于在有害生物物种中下调靶基因表达的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的多结构域RNA分子用于生产对有害生物有抗性的转基因植物的用途。

在更具体的实施方案中，本发明涉及此处所述的对有害生物有抗性的转基因植物的用途，其用于控制有害生物群体生长、和/或用于减少有害生物侵染和/或杀死或麻痹有害生物、和/或用于预防或减少化学物(如杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂)应用的量和数目、和/或用于减少化学物应用杀虫剂对环境影响、和/或用于降低作物中疾病发生率、和/或用于提高作物产量。

在另一个实施方案中，本发明涉及已经用编码至少一种此处所述的多结构域RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体的用途，其用于提高对有害生物的抗性，和/或用于控制有害生物群体生长，和/或用于预防或减少有害生物物种侵染和/或用于杀死或麻痹有害生物，和/或用于减少化学物(如杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂)应用的量和数目，和/或用于减少化学物应用杀虫剂对环境的影响和/或用于降低作物中疾病发生率和/或用于提高作物产量。

在另一个实施方案中，本发明涉及已经用编码至少两种此处所述的多结构域RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体的用途，其用于提高对有害生物的抗性，和/或用于控制有害生物群体生长，和/或用于预防或减少有害生物物种侵染和/或用于杀死或麻痹有害生物，和/或用于减少化学物(如杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂)应用的量和数目，和/或用于减少化学物应用杀虫剂对环境的影响和/或用于降低作物中疾病的发生率和/或用于提高作物产量。

在另一个实施方案中，本发明涉及表达至少一种此处定义的多结构域RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体的用途，

其中所述多结构域RNA分子包含至少一个适配子序列并且还包含双链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，

其用于提高对有害生物的抗性，和/或用于控制有害生物群体生长，和/或用于预防或减少有害生物物种侵染和/或用于杀死或麻痹有害生物，和/或用于减少化学物(如杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂)应用的量和数目，和/或用于减少化学物应用杀虫剂对环境的影响和/或用于减少作物中疾病的发生率和/或用于提高作物的产量。

在另一个实施方案中，本发明涉及表达至少两种此处定义的多结构域RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体的用途，

其中各多结构域RNA分子包含与另一种RNA分子或另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，

其用于提高对有害生物的抗性，和/或用于控制有害生物群体生长，和/或用于预防或减少有害生物物种侵染和/或用于杀死或麻痹有害生物，和/或用于减少化学物(如杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂)应用的量和数目，和/或用于减少化学物应用杀虫剂对环境的影响和/或用于减少作物中疾病的发生率和/或用于提高作物的产量。

在另一个实施方案中，本发明涉及从此处所述的任何植物或其基本衍生品种获得的植物的后代或部分或衍生物的用途，其用于提高对有害生物的抗性，和/或用于控制有害生物群体生长，和/或用于预防或减少有害生物物种侵染和/或用于杀死或麻痹有害生物，和/或用于减少化学物(如杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂)应用的量和数目，和/或用于减少化学物应用杀虫剂对环境的影响和/或用于减少作物中疾病的发生率和/或用于提高作物的产量。

在一个另外的具体实施方案中，本发明的方法还可用作实验研究的工具，尤其是在功能基因组学领域。通过RNAi靶向下调有害生物基因可用体外或体内分析，以研究基因功能。基于靶向下调特定有害生物基因的分析导致可测量的表型，其还可成为用于新型杀虫剂的化合物筛选的基础。

E.组合物和试剂盒

在另一方面，本发明涉及用于减少有害生物群体生长和/或用于杀死或麻痹有害生物和/或用于提高植物对有害生物的抗性、用于提高对有害生物的抗性、和/或用于控制有害生物群体生长、和/或用于预防或减少有害生物物种侵染和/或用于杀死或麻痹有害生物、用于减少作物中疾病发生率和/或用于提高作物产量的组合物，所述组合物包含至少一种此处所述的多结构域RNA分子。

根据一个实施方案，本发明涉及包含至少一种此处所述的多结构域RNA分子以及生理或农学可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物。本发明还包括所述组合物作为植物或植物的扩增或繁殖材料的杀虫剂的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及包含至少一种此处所述的多结构域RNA分子以及生理或农学接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物。

所述组合物还可以含有用于在长期保存组合物期间稳定所述dsRNA和/或防止所述dsRNA降解的组分。

所述组合物还可含有增强或促进有害生物吸收所述dsRNA的组分。这些可以包括，例如，通常促进RNA吸收入细胞的化学剂例如lipofectamin等、以及能够消化真菌细胞壁的酶或化学试剂例如甲壳素酶。

所述组合物可以是施用于有害生物、基质、细胞(如植物细胞)、或被有害生物物种感染或对其侵染易感的生物的任何合适的物理形式。

在另一个实施方案中，本发明提供包含至少一种此处所述的多结构域RNA分子的组合物，

其中各多结构域RNA分子包含(能够)与另一种多结构域RNA分子或另一个多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还涉及生产此处所述多结构域RNA分子的方法，其包括：

-向宿主细胞引入编码任何此处所述的多结构域RNA分子的分离DNA分子、编码本发明的任何多结构域RNA分子的核酸、或包含所述核酸的载体；

-在适于表达所述多结构域RNA分子的条件下生长宿主细胞，和

-分离由所述宿主细胞生产的多结构域RNA分子。

在制备此处所述的多结构域RNA分子的内容中，术语“宿主细胞”可以是任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。

根据另一个实施方案，本发明还涉及包含至少一种此处所述的多结构域RNA分子的试剂盒。根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及包含至少两种此处所述的多结构域RNA分子的试剂盒。根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及包含编码此处所述多结构域RNA分子的至少一种核酸的试剂盒。本发明还涉及包含任何此处所述载体的试剂盒，所述载体包含编码任何此处所述多结构域RNA分子的核酸。应该理解，根据本发明的这些核酸序列可以包含在一个或多个独立载体中。在另一个优选实施方案中，本发明涉及包含此处定义的至少一种组合物的试剂盒。

可以考虑本发明的“组合物”可作为“部分的盒(kit-of-parts)”来提供，其在一个容器中包含所述多结构域RNA分子以及在分开容器中包含所述RNA的适合稀释剂或载体。本发明还涉及单独供应所述多结构域RNA分子而不含任何其他组分。在这些实施方案中所述dsRNA可以浓缩形式提供，如浓缩水溶液。甚至可以冷冻形式或冷冻干燥的或冻干形式提供。后者在长期保存中可以更稳定并且可在使用之前即刻解冻和/或用适合的稀释剂重建。

本发明还涉及任何此处所述的多结构域RNA分子、构建体、核苷酸序列、重组DNA构建体或其组合物的医药用途。

在一个具体实施方案中，所述组合物是分别用于治疗或预防人或动物的有害生物感染的药学或兽医组合物。这样的组合物将包含至少一种根据本发明的多结构域RNA分子，以及分别适合药学或兽医应用的至少一种载体、赋形剂，其中所述多结构域RNA分子包含双链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的有害生物物种靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

所述组合物可以是适合局部应用的组合物，如施用于动物或人的皮肤，例如作为施用于皮肤的液体组合物，作为滴剂、或刷、或喷，以及霜、软膏等，用于局部施用，以及透皮贴剂。

还可以生产其他常规药学剂型，包括片剂、胶囊、阴道栓剂、栓剂等。所选形式将有赖于有害生物的性质以及期望治疗的疾病的性质。

引起人和动物感染的有害生物的实例是真菌。人致病性和动物致病性靶真菌包括但不限于以下：

人中：假丝酵母属(Candida spp.)，尤其是白假丝酵母(Candida albicans)；皮肤癣菌，包括表皮癣菌属(Epidermophyton spp.)，毛癣菌属(Trichophytonspp.)，以及小孢子菌属(Microsporum spp.)；曲霉菌属(Aspergillus spp.)，尤其是黄曲霉菌(Aspergillus flavus)，烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)，构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)，黑曲霉菌(Aspergillus niger)，土曲霉菌(Aspergillusterreus)组；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)；粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)；新型隐球菌(Crytococcus neoformans)；荚膜组织孢浆菌荚膜变种或迪氏变种(Histoplasma capsulatum Var.capsulatum or Var.duboisii)；申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)；镰孢菌属(Fusarium spp.)；短帚霉菌(Scopulariopsisbrevicaulis)；着色真菌属(Fonsecaea spp.)。

动物中：假丝酵母属(Candida spp.)；小孢子菌属(Microsporum spp.)，尤其是犬小孢子菌(Microsporum canis)，石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)；须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)；曲霉菌属(Apergillusspp.)；新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)。

所述组合物可以是适合农学应用的组合物，如喷剂、涂剂、粉剂等。具体而言，本发明涉及开发用于农业或园艺的杀虫组合物。这些杀虫组合物可按照原本已知的方式制备。例如，所述活性化合物可以转变成常规制剂，如溶液、乳剂、可湿性粉剂、水分散性颗粒剂、混悬剂、粉剂、隔离剂(dusting agent)、泡沫剂、糊剂、可溶性粉剂、颗粒剂、悬乳液浓缩剂(susp-emulsion concentrates)、微胶囊、熏剂、浸有活性化合物的天然和合成材料以及极细小的胶囊和聚合物质。

此外，根据本发明的杀虫组合物可包含增效剂。根据本发明的多结构域RNA分子、构建体、核苷酸序列或其组合物，原样或在其制剂中，也可以在与已知杀真菌剂、杀细菌剂、杀螨剂、杀线虫剂或杀昆虫剂的混合物中使用，来扩大例如活性谱或防止发生抗性。很多情况下，这导致协同作用，即：混合物的活性超过单个组分的活性。

此外根据本发明的多结构域RNA分子、构建体、核苷酸序列或其组合物，原样或在其制剂或上述混合物中，也可以在与其他已知活性化合物如除草剂、肥料和/或生长调节剂的混合物中使用。

本发明还涉及纤维性杀虫剂组合物及其作为杀虫剂的用途，其中所述纤维性组合物包含非织造纤维以及有效量的此处所述的至少一种多结构域RNA分子、构建体、核苷酸序列、重组DNA构建体或其组合物，它们可以共价附着或稳定吸附在所述纤维上。

在另一个具体实施方案中，所述纤维是可生物降解的并且此处所述的吸附多结构域RNA分子或其组合物可以缓慢释放到环境的局部区域，在一段时间内控制该区域的有害生物。

本发明还包括包含此处所述分子或构建体的缓释杀虫组合物的固体制剂、及其作为杀虫剂的用途。所述制剂将此处所述的多结构域RNA分子以可控且缓慢的方式(几天至数月内完全释放)(a)向环境(土壤、水性介质、植物)中释放。

本发明还涉及干燥易分散颗粒形式的用于杀虫用途的表面活性剂-硅藻土组合物，其包含此处所述的至少一种多结构域RNA分子。除了硅藻土之外，所述颗粒还包含设计用于向颗粒提供结合、再湿和崩解性质的表面活性剂组合物。硅藻土表示特征为每单位体积具有大表面积的硅胶材料。硅藻土是天然存在的材料并且主要由积累的贝壳或硅藻分泌的杂乱结构的无定形含水硅胶的硅藻壳组成。

本发明还提供固体、水不溶性脂质球及其作为杀虫剂的用途，其中所述脂质球由具有嵌在核心表面的磷脂层的固体疏水核心形成，在核心中、在磷脂中、附着于磷脂上、或其组合中包含此处所述的至少一种多结构域RNA分子。

包含脂质球的杀虫化合物有多种优势，包括稳定性、试剂成本低、易于制造、在水性介质中的高分散性、所挟裹的化合物的释放速率受磷脂涂层和载体控制。

本发明还涉及微胶囊形式的杀虫制剂，所述微胶囊具有由尿素/二醛预缩合物制成的胶囊壁并且包含至少一种此处所述的多结构域RNA分子。

在另一个具体实施方案中，所述组合物可以是可施加到基质上的涂层，以便保护所述基质免受有害生物物种如真菌的侵染和/或预防、阻滞或降低有害生物在基质上生长，从而防止所述有害生物物种引起的破坏。在此实施方案中，所述组合物可用于保护对有害生物物种侵染或所引起破坏敏感的任何基质或材料，例如粮食和其他易腐材料，以及木材等基质。对此实施方案优选的靶真菌物种包括，但不限于，如下：(葡萄状穗霉属)、(曲霉属)、(链格孢属)或(枝孢属)。

在该实施方案中，所述组合物将包含至少一种根据本发明的多结构域RNA分子，以及任选地适用于预期用途的至少一种载体、赋形剂，其中所述多结构域RNA分子包含特异性结合至所述真菌物种的相互作用细胞表面的适配子，还包含双链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的有害生物物种靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

赋形剂的性质和组合物的物理形式可根据期望处理的基质性质而变化。例如，所述组合物可以是刷或喷或印入待处理材料或基质的液体，或施加到待处理材料或基质的涂剂。

本发明还包括处理和/或预防真菌对基质侵染的方法，包括向所述基质施用有效量的此处所述任何组合物。

本发明还涉及处理和/或预防有害生物对基质侵染的方法，包括向所述基质施用有效量的此处所述的多结构域RNA分子、核酸、载体、或其组合物。

本发明还涉及处理和/或预防有害生物生长和/或有害生物侵染植物或植物的扩增或繁殖材料的方法，包括向植物或向植物的扩增或繁殖材料施用有效量的此处所述的多结构域RNA分子、核酸、载体、或其组合物。

在另一个实施方案中，本发明涉及控制有害生物在细胞或生物上生长或者预防有害生物侵染对所述有害生物物种侵染敏感的细胞或生物的方法，包括使所述有害生物物种接触此处所述的任何多结构域RNA分子、核酸、载体、或其组合物，由此所述多结构域RNA分子被所述有害生物物种吸收，从而控制生长或预防侵染。

可以将细菌工程化来生产本发明的任何dsRNA或dsRNA构建体。这些细菌可被所述有害生物物种吃掉。当被吸收时，所述dsRNA可以启动RNAi反应，导致所述靶mRNA降解并削弱或杀死摄食的有害生物物种。

因此，在一个更具体的实施方案中，所述多结构域RNA分子被原核生物如细菌、或真核生物如酵母、宿主细胞或宿主生物所表达。

有些细菌和宿主植物有非常紧密的相互作用，如共生根瘤菌(Rhizobium)与豆科植物(Legminosea)(例如大豆)。这种重组细菌可以与种子混合(即涂敷)并用作土壤改良剂。作为替代，生产dsRNA的细菌如苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)物种可直接喷洒作物。可能的应用包括集约温室培养，例如从GMO观点较少感兴趣的作物，以及更广范围的作物如大豆。

该方法有多种优势，如：由于不存在可能被植物宿主切割的问题，允许向摄食有害生物的肠道内腔递送dsRNA；细菌用作杀昆虫剂不涉及转基因农作物的产生，尤其对于难以获得转基因变体的某些作物；广泛而灵活的应用表现在可以在同一田块上同时处理不同作物和/或可以同时靶向不同的有害生物物种，例如通过组合产生不同dsRNA的不同细菌。

根据另一个具体实施方案，本发明包括GMO方法，因此涉及上述方法，其中所述双链RNA由所述有害生物物种侵染或对其侵染易感的所述细胞或生物表达，例如所述细胞是植物细胞或所述生物是植物。

本发明还涉及用来增加植物产量的方法，包括以可表达的形式向植物引入任何所述多结构域RNA分子、核酸、载体或其组合物。

F.优点

本发明多结构域RNA分子用于从植物向摄食生物递送dsRNA的用途是非常多的。

根据本发明的多结构域RNA分子的第一个主要优点是它允许在靶生物中更高效地细胞内递送dsRNA。其优点之一是喂给生物可被高效内吞的dsRNA能够导致更高效的dsRNA吸收(实现作用需要更低的dsRNA浓度)。被昆虫吃掉的RNA分子通过内吞(结合Toll样受体)或转运蛋白相关机制能够进入肠道细胞。据推测在摄食实验中大于80bp的dsRNA比小的21-聚体更有效，因为其电荷使得它们非特异性结合到肠细胞表面。多结构域RNA分子可以由结合植物或昆虫的蛋白质或糖部分的结构域组成，其在昆虫肠道中被高效内吞，例如在肠道中结合至转铁蛋白、凝集素等。包含所述适配子和dsRNA的多结构域RNA分子通过摄食被靶生物吸收，能通过内吞进入肠道细胞，如通过进入内吞小泡，并从而能够进入细胞质。在内体中适配子-dsRNA分子可以被降解。一部分dsRNA将随后以与文献中公知的反义RNA递送机制相似的方式进入细胞。

昆虫肠道环境是恶劣的，具有低或高的pH值以及降解RNA的RNase。如在鳞翅目动物肠道中可发现的高pH可以化学增强地降解RNA。RNA分子转胞吞至血淋巴使得能够快速将dsRNA从富含RNAse和/或pH恶劣的环境中移除。在一种情况下，根据本发明的多结构域RNA分子包含能够结合蛋白质的适配子，所述蛋白质可通过靶生物肠道转胞吞至血淋巴或体液，或可与转胞吞受体结合，通过摄食被靶生物吸收的嵌合多结构域RNA分子能进入肠道并且穿过肠道至血淋巴或体液。多结构域RNA分子转胞吞至血淋巴或体液允许将dsRNA导向至广范围的靶组织，包括肌肉、CNS及其他。

在另一些情况下，还可以需要组合内吞和转胞吞作用，以高效地并且位点特异地递送所述多结构域RNA分子中存在的dsRNA。

本发明的系统利用适配子序列能递送和吸收本发明的多结构域RNA分子，其包含为RNA干扰目的的双链RNA。所述多结构域RNA分子甚至可以包含小RNA片段，如21聚体，并且将其高效递送至靶有害生物的肠道细胞。向靶生物喂食已经与根据本发明的适配子结合的并且可被高效递送的dsRNA导致dsRNA吸收被提高。因此，为了在靶生物中获得合适的作用，仅需较低量的dsRNA。

本发明多结构域RNA分子的另一个优点是，当适配子和能够形成dsRNA的RNA形成多结构域RNA分子时，其中所述dsRNA目的是引起干扰，适配子部分能够有效保护dsRNA分子在植物以及靶生物肠道中免受降解，而其中植物以及靶生物肠道的环境恶劣。

因此本发明多结构域RNA分子允许在植物中表达长和短的dsRNA片段，其通过摄食向靶生物递送。通常，为了通过摄食向靶生物递送，在植物中表达长的(如80bp或更长)dsRNA片段。长dsRNA片段的表达涉及几种缺点。例如，这使得有必要保护植物细胞质中的这些长RNA片段免于内源植物中的Dicer活性。长RNA片段的切割可产生切割片段，它们可通过破坏(titteringaway)正常植物生长和生理所需的RISC而在植物中导致显性负效应，或下调植物基因或染色质或甚至表达基因的转基因dsRNA。有利地，较小的RNA分子(甚至21bp那么短)可以被靶生物有效摄食并且被肠道肠细胞吸收，导致靶的敲低。结果，可以不再需要在植物中表达80bp或更长的长RNA片段，从而可以在植物中表达更短的因此更特异性和选择性的靶片段。

此外，在一种情况下，仍然需要在植物中表达80bp或更长的长RNA片段时，应用包含可保护RNA的适配子的本发明多结构域RNA分子，可以省去对额外保护这些片段免于内源性植物中切割活性的需要。

如果使用与细胞植物蛋白或结构特异性结合的适配子序列，可以产生另一个优点，允许所述dsRNA分子积累于植物中选定区隔(如核仁、核、胞质、trna或核糖体、韧皮部)以便更高效地积累或向有害生物递送。

通过参考如下非限定性实施例经进一步理解发明。

实施例

除非另有指明，本发明的实施将采用用于重组DNA技术、分子生物学、生物学测试等等本领域技术人员已知的常规技术。这些技术在文献中已经全部解释。

实施例1：识别秀丽隐杆线虫中致死基因的适配子-dsRNA融合物的非限定性实例

简而言之，dsRNA分子被连接至适配子，例如和识别nhx-2的适配子，其中nhx-2是Na-H交换蛋白，其由基因BO495.4编码，是动物摄食所需的。Nhx-2位于蠕虫肠的上皮细胞。Nhx-2是跨膜蛋白，显示多个被10-12个跨膜结构域分开的细胞外和细胞内环。已经表明Nhx-2被细胞内吞机制内化，这是增加dsRNA吸收的理想靶通路。设计适配子来特异性并且高亲和性地结合nhx-2的细胞外环。适配子融合至靶向沉默sup-35的dsRNA，sup-35是pha-1温度敏感突变的抑制子。通过摄食/浸泡于适配子-dsRNA融合物，所述适配子将融合物靶向至肠道细胞，导致所述dsRNA的吸收提高。通过计数在非允许温度下到达L4阶段的pha-1动物的数目来定量由sup-35dsRNA诱导的RNAi作用增加(详见如下)。

步骤1：“nhx-2-ap”适配子的选择和生产

为了将dsRNA靶向nhx-2，选择识别nhx-2的适配子。Nhx-2的全序列(蛋白质序列：NP_495614，核苷酸序列：NM_063213)如图4所示(SEQ IDNO 1)。图4中粗体下划线表示nhx-2蛋白的第五个细胞外环，其被选作适配子的识别靶位点，因为它是该蛋白质中预测的最大细胞外环。用标准方法合成对应第5个nhx-2细胞外环的合成肽，例如由NeoMPS公司提供(NeoMPS SA-7rue de Boulogne-67100 Strasbourg-法国)。此外，还生产由相同核苷酸组合物按照随机顺序组成的对照适配子或混杂(scrambled)适配子。然后合成肽被用作鉴定适配子的诱饵，其中所述适配子设计用于特异性识别并结合nhx-2的第5个细胞外环。在步骤1结束时，鉴定了nhx-2的第5个细胞外环的高选择性且强效的适配子。

步骤2：多结构域RNA分子的构建和体外生产

通过标准分子生物学技术构建多结构域RNA分子。多结构域RNA分子包含(1)步骤1所述的适配子以及(2)靶向sup-35沉默的dsRNA片段。先前已经表明，RNAi-诱导的sup-35的沉默可抑制pha-1温度敏感突变体的致死性。编码dsRNA sup-35片段的Sup-35DNA序列如图5所示(SEQ ID NO 2)。

编码所述适配子的DNA框内融合至编码正义RNA的DNA的5’位置(图2A)或编码反义RNA的DNA的3’位置(图2B)。作为阴性对照，混杂适配子(即随机打乱)用于生产与dsRNA在编码正义RNA的DNA的5’位置或在编码反义RNA的DNA的3’位置的融合物。在另一个对照中，使用单个sup-35特异性DNA(图2C)。用标准的体外转录分析方法生产五种RNA样品(见图3)。

适配子-dsRNA融合物包含：

-nhx-2_ap_5′/sup-35_ds(根据图2-A)

-nhx-2_ap_3′/sup-35_ds(根据图2-B)

混杂适配子-dsRNA融合物包含：

-nhx-2_ap_混杂5′/sup-35_ds

-nhx-2_ap_混杂_3′/sup-35_ds

裸dsRNA包含sup-35(根据图2-C)。

步骤3：由nhx-2ap/sup-35ds诱导的RNAi作用提高-秀丽隐杆线虫体内测试

在体内分析中测试所述四种多结构域RNA分子和裸dsRNA的作用。典型情况下，将秀丽隐杆线虫动物浸泡在含浓度增加的体外合成多结构域RNA分子(见步骤2)的介质中(DRC)。在典型实验中，到达L4阶段的平均动物数目指示所述各种多结构域RNA分子诱导抗sup-35的RNAi作用的效力。

浸泡RNAi方法

如下实施例中，浸泡RNAi方法用于在pha-1突变体背景下通过RNAi敲低sup-35(没有适配子融合物)。以上所示的发明，其中所述dsRNA融合至适配子，将提高仅用sup-35实现的作用。例如，当使用显著更低的dsRNA浓度时可以实现RNAi作用。

实施浸泡RNAi方法所需的材料包括：pha-1(e2123)或野生型N2 Bristol株；M9介质以及M9+PEG；靶基因的dsRNA(3.8mg/ml)，例如通过T7RiboMAX^TM Express RNAi系统，Promega获得，或通过Megascript RNAi^TM试剂盒，Ambion获得；lipofectamine(2mg/ml)，Invitrogen；big drop 3cm NGM板。

浸泡RNAi方法包括如下步骤：按照RNA dsRNA试剂盒制造商(如Promega、Ambion等)提供的方案用T7聚合酶转录模板DNA生产dsRNA；生长pha-1或N2至L4阶段(15℃)；用M9除去L4雌雄同体并洗3次；将虫转移至新鲜的未接种的NGM板并干燥15分钟。同时，虫将继续爬行，于是仍存在于肠道中的细菌将被完全去除；用4μl靶dsRNA(3.8mg/ml)+1μllipofectamine(2mg/ml)装入PCR管；将10μl M9置于PCR管的帽中，并将L4 pha-1虫放入帽中；1300rpm下离心1分钟；20℃下孵育24小时以浸泡；将虫转移至大滴(big drop)已接种的3cm NGM板，并干燥板；在大滴已接种3cm NGM板上分开所有虫；25℃下孵育至3天；给虫的后代数目或虫的表型评分；用sup-35 dsRNA拯救pha-1：根据后代＞＝L4幼虫阶段的数目对用sup-35dsRNA处理的pha-1虫评分。

通过浸泡诱导的sup-35 RNAi结果如表1和图3所示。在该试验中，dsRNA GFP或milli Q水用作阴性对照：

表1

	n	平均后代＞＝L4	SD	阴性对照
					sup-35dsRNAGFP dsRNAMQ	374416	27.10.640.05	10.41.30.2	26.500.05

可以通过建立剂量效应曲线分析鉴定实现某种表型(如pha-1拯救、致死性)到特定任意水平的dsRNA浓度来检查RNAi的有效性。同常规dsRNA构建体相比，应用一系列3-倍稀释系列的dsRNA(从3.8μg/μl开始)来确定要求保护的构建体的有效浓度。

实施例2：构建识别有害生物物种中致死基因的多结构域RNA分子

原则上所述适配子-dsRNA分子是包含靶RNA序列以及位于3’或5’端具有蛋白质识别序列的适配子的融合构建体，所述蛋白质如nhx-2(NM_063213)。

实施例1中，基因sup-35用于举例说明本发明。在另一个实施例中，靶基因是β-微管蛋白(秀丽隐杆线虫β-微管蛋白的Genbank登记号NM_066966)，见表2。测试的靶RNA序列的长度为80-300碱基对。相应地克隆靶物种的靶基因。

表2：实施例总览：β-微管蛋白片段在四种不同植物有害生物物种中，南方根结线虫、秀丽隐杆线虫、跳蚤例如褐飞虱以及稻瘟菌。

	南方根结线虫	秀丽隐杆线虫	褐飞虱	稻瘟菌
					靶基因体外吸收植物内	β-微管蛋白饮用分析须根分析、完整植物	β-微管蛋白浸泡/饮用分析X	β-微管蛋白体外摄食分析完整植物	β-微管蛋白浸泡须根分析、完整植物

对于表2举例说明的四种有害生物物种，靶基因β-微管蛋白序列的RNAi片段分别在图6至9(SEQ ID NO 3至6)中提供。

实施例3：识别碳水化合物分子(或糖部分)的适配子-dsRNA融合物的非限定性实例

简而言之，dsRNA分子被连接至识别碳水化合物分子(或糖部分)的适配子。例如碳水化合物分子(或糖部分)位于虫肠道的上皮细胞。适配子设计成特异性并高亲和性地结合至特定碳水化合物分子(或糖部分)，如GalNac或甘露糖。所述适配子融合至靶向沉默例如sup-35的dsRNA，其中sup-35是pha-1温度敏感突变体的抑制子。通过摄食/浸泡于适配子-dsRNA融合物，适配子将所述多结构域RNA分子靶向至肠道细胞上的所述糖蛋白，导致所述dsRNA的吸收增加。通过计数在非允许温度下到达L4阶段的pha-1动物数目来定量sup-35dsRNA诱导的RNAi作用增加(详见如下)。

步骤1：适配子的选择和生产

对应所述碳水化合物分子(或糖部分)的合成肽通过使用标准方法合成，例如，由NeoMPS公司提供(NeoMPS SA-7 rue de Boulogne-67100 Strasbourg-法国)。

其他步骤和细节见实施例1。

实施例4：高效有害生物控制的植物中测试

将本发明的多结构域RNA分子克隆至适于植物转化的二元载体中CaMV35S启动子、根特异性启动子或摄食部位特异性启动子(如tobRB7)之后。通过三亲本交配(如通过含pRK2013辅助质粒的大肠杆菌HB101)将所述二元载体转移至发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中。所述二元质粒从大肠杆菌转移至根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中。然后，通过农杆菌介导的转化技术用所述构建体转化作物植物(如马铃薯、大豆、棉花或烟草)。作为对照，使用无二元载体的农杆菌。进一步的对照是不含本发明所述适配子或本发明所述连接子的多结构域RNA分子。

本发明的多结构域RNA分子在植物细胞中的稳定性

相对于对照转基因植物中的量，用定量实时PCR确定转基因植物细胞中存在的本发明所表达的构建体的量来分析本发明所表达的构建体的稳定性。实时监测PCR的方法先前已经描述，并且基于Taqman探针或嵌入染料(SYBR绿)。

相对于模板的标准稀释系列来定量所表达的多结构域RNA分子。通过应用来自相同样本的一组管家基因的定量PCR数据对结果进行标准化(Vandesompele et al.，Genome Biology 2002，3：research0034.1-0034.11)。

番茄或棉花的须根转化

通过应用发根农杆菌转化番茄(如Lycopersicum esculentum cv.Marmande)、或棉花(Gossypium hirsutum)子叶，并测试转化须根的线虫抗性。用南方根结线虫J2幼虫对必要数目的独立转化系(如15)和每系的重复(如10)进行接种，并对根结和卵质形成进行评分。孵育卵质并研究所述寄生虫的生殖力。最终其后代被用于测试第二代的感染性/生活力。

进行类似的分析，由此用具有真菌靶序列的多结构域RNA分子转化须根，并由此用真菌如稻瘟菌接种须根。

完整植物转化

用本发明的构建体转化植物组织(如番茄组织)，并将其再生为全植物。用所述有害生物物种接种全转基因植物并监测植物的表型。

Claims (48)

1.由核苷酸序列组成的多结构域RNA分子，其包含：

-至少一个适配子，和

-至少一个形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。

2.根据权利要求1的多结构域RNA分子，

-其中至少一个适配子结合至被有害生物的肠细胞内吞或转胞吞的蛋白质或糖，或

-其中至少一个适配子结合至被内吞入有害生物的细胞内的蛋白质或糖，或

-其中至少一个适配子结合至有害生物内吞或转胞吞受体分子。

3.根据权利要求1的多结构域RNA分子，其中所述适配子特异性并以高亲和力结合至内源植物蛋白。

4.根据权利要求1的多结构域RNA分子，其中所述适配子特异性并以高亲和力结合至分泌的有害生物蛋白。

5.根据权利要求1的多结构域RNA分子，其中所述适配子结合和/或抑制参与dsRNA加工和/或降解的植物酶。

6.根据权利要求1的多结构域RNA分子，其中所述适配子结合和/或抑制参与dsRNA加工和/或降解的有害生物的酶。

7.根据权利要求1的多结构域RNA分子，其包含至少两个选自权利要求2至6任一项定义的适配子中的适配子。

8.根据权利要求1的多结构域RNA分子，其包含至少三个选自权利要求2至6任一项定义的适配子中的适配子。

9.向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

10.向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括将至少一种根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子被吸收入所述有害生物物种的肠道，和

其中所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而下调有害生物细胞中靶基因的表达。

11.向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据权利要求1至7任一项的多结构域RNA分子，和至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

12.向有害生物物种递送双链RNA分子的方法，其包括将至少一种根据权利要求1至7任一项的多结构域RNA分子、以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而下调有害生物细胞中靶基因的表达。

13.在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

14.在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括用至少一种根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述RNA分子包含至少一个适配子序列，并且还包含双链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和

由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而下调有害生物细胞中靶基因的表达。

15.在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括：

-在植物细胞或植物中表达至少一种根据权利要求1至7任一项的多结构域RNA分子、以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-将所述植物细胞或植物喂给所述有害生物物种。

16.在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括用至少一种根据权利要求1至7任一项的多结构域RNA分子、以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子喂给所述有害生物物种，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

由此所述多结构域RNA分子被吸收至有害生物物种的肠道，和由此所述多结构域RNA分子被肠道细胞和/或组织细胞转胞吞和/或内吞，从而下调有害生物细胞中靶基因的表达。

17.生产对有害生物物种有抗性的转基因植物的方法，其包括：

-在植物细胞中表达至少一种根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子，和

-从所述植物细胞再生植物。

18.生产对有害生物物种有抗性的转基因植物的方法，其包括：

-在植物细胞中表达至少一种根据权利要求1至7任一项的多结构域RNA分子、以及至少一种包含单链RNA的另外的RNA，

其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

-从所述植物细胞再生植物。

19.根据权利要求11、12、15、16或18任一项的方法，其中所述另外的RNA分子包含根据权利要求1至7任一项的另一种多结构域RNA分子、或者不包含适配子序列的RNA分子。

20.根据权利要求9至19任一项的方法，其中所述多结构域RNA分子的至少一种包含选自权利要求2至6任一项定义的适配子中的一个适配子。

21.根据权利要求9至19任一项的方法，其中所述多结构域RNA分子的至少一种包含选自权利要求2至6任一项定义的适配子中的两个适配子。

22.根据权利要求9、10、13、14或17任一项的方法，其中所述多结构域RNA分子的至少一种包含选自权利要求2至6任一项定义的适配子中的三个适配子。

23.根据权利要求9至22任一项的方法，其中所述有害生物物种选自酵母、真菌、昆虫和线虫。

24.根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子用于在有害生物物种中下调靶基因表达的用途。

25.根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子用于生产对有害生物物种有抗性的转基因植物的用途。

26.编码权利要求1至8任一项定义的多结构域RNA分子的核酸。

27.根据权利要求26的核酸，其包含将所编码的多结构域RNA分子导向至植物细胞器如叶绿体、质体、线粒体的框内信号序列。

28.包含权利要求26或27的核酸的载体。

29.根据权利要求28的载体，其中所述核酸受植物细胞中所述核酸表达的调节序列的控制。

30.根据权利要求28或29的载体，还包含组织特异性或细胞特异性启动子。

31.根据权利要求30的载体，其中所述启动子是诱导型或组成型启动子。

32.包含根据权利要求26或27的核酸、或根据权利要求28至31任一项的载体的宿主细胞。

33.根据权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、酵母、真菌或植物细胞。

34.包含至少一种权利要求1至8任一项定义的多结构域RNA分子、以及任选还包含至少一种合适赋形剂的组合物。

35.包含至少一种权利要求1至8任一项定义的多结构域RNA分子的试剂盒。

36.生产根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子的方法，其包括：

-向宿主细胞中引入编码根据权利要求1至8任一项的多结构域RNA分子的分离DNA分子；

-在适于表达所述多结构域RNA分子的条件下生长所述宿主细胞；和

-分离由所述宿主细胞生产的多结构域RNA分子。

37.根据权利要求17至23任一项的方法可获得的对有害生物物种有抗性的转基因植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体。

38.包含编码权利要求1至8任一项定义的多结构域RNA分子的核酸的转基因植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述核酸对所述转基因植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体的基因组是异源的。

39.已经用编码至少一种权利要求1至8任一项定义的多结构域RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体。

40.已经用编码至少一种权利要求1至7任一项定义的多结构域RNA分子的核酸转化、并且已经用编码至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子的核酸转化的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

41.表达至少一种权利要求1至8任一项定义的多结构域RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述多结构域RNA分子包含至少一个适配子序列并且还包含双链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与待下调的靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

42.表达至少一种权利要求1至7任一项定义的多结构域RNA分子、并且还表达至少一种包含单链RNA的另外的RNA分子的植物、其基本衍生品种、植物部分、植物细胞或原生质体，其中所述多结构域RNA分子包含与所述另外的RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与靶基因的至少一部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

43.根据权利要求39至42任一项的植物，其中所述植物已经被稳定转化。

44.根据权利要求39至42任一项的植物，其中所述植物已经被瞬时转化。

45.包含根据权利要求28至31任一项的载体的转基因植物。

46.权利要求37至45任一项的植物或其基本衍生品种的后代，其以有性或无性方式获得。

47.从权利要求37至45任一项的植物或其基本衍生品种可获得的植物的部分或衍生物。

48.根据权利要求47的植物的部分或衍生物，其包括叶、茎、根、芽、插条或外植体等、原生质体、体细胞胚、花药、叶柄、培养细胞、种子、花、果实和块茎。

Images