CN102191246A - 多靶标干扰核酸分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多靶标干扰核酸分子及其应用。该干扰核酸分子由一条反义链和一条正义链组成，双链的总长度至少为30个核苷酸，且在正义链上或反义链上或正、反义链两条链上存在核苷酸缺刻或缺口。该干扰核酸的任意一条链可以靶向至少两个靶RNA，从而干扰转录后翻译过程，并且该干扰核酸不引起干扰素反应。

Description

多靶标干扰核酸分子及其应用

技术领域

本发明涉及多靶标干扰核酸分子及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种转录后的基因沉默效应，是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA识别有同源序列的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，对其特异性切割，从而阻断其翻译的过程。与传统的抑制基因表达的反义寡核苷酸技术和核酶技术相比，小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默基因表达的效果要强大数十倍至数百倍，现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。

RNAi发挥基因沉默作用的机制是：长双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)进入细胞后，与Dicer酶结合并被切割。Dicer酶的切割产物通常是长度为20-25bp，且在每个链的3’末端有两个核苷酸悬垂的siRNA。siRNA与RNA-诱导的沉默复合物(RISC)结合，RISC首先介导siRNA双链的解旋并与siRNA双链中的一条链，通常是反义链偶联。装载有siRNA一条链的RISC以序列特异的方式寻找识别与之匹配的mRNA，之后由RISC的催化组分-Argonaute蛋白切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制转录该mRNA的基因的表达。

RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域。其中应用siRNA治疗老年黄斑变性，呼吸道合胞病毒以及急性肾衰等疾病已进入临床试验阶段。其他可能的临床应用主要集中在抗病毒治疗方面，包括：沉默HIV的宿主受体的表达，沉默甲型肝炎，乙型肝炎和丙型肝炎基因的表达，沉默流感基因表达以及抑制麻疹病毒的复制等。RNAi也有望用于神经组织退化型疾病，如：亨廷顿氏舞蹈病的治疗。此外，RNAi通过沉默肿瘤细胞中特异性高表达的基因或在细胞分裂中起作用的基因为癌症的治疗提供了一个新方向。

引发RNAi效应的dsRNA可设计成能被Dicer剪切的长双链形式，叫做Dicer底物，或者是不需Dicer剪切可直接作为RISC底物的短siRNA形式。在哺乳动物细胞中，由于长dsRNA引发非特异反应，导致干扰素效应。因此，普遍认为应用于哺乳动物时，干扰RNA双链必须短于30bp以抑制干扰素效应。但是，设计长双链干扰RNA用于RNAi仍有实用价值。长干扰RNA双链可带有多个治疗靶标，靶向多个不同的mRNA或同一mRNA的不同位点，增加基因沉默效果，扩大应用范围。以肿瘤的治疗为例，由于肿瘤是一种多基因疾病，它的发生、发展是一个多步骤、多因素参与的复杂的生物学过程，因此，单一癌基因的抑制不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，单靶标治疗有其局限性。那么，研发多靶标、无干扰素反应的长干扰核酸双链，同时抑制多个癌基因的表达，多层次、多途径治疗肿瘤，可能有效提高治疗效果，成为治疗肿瘤的新策略。

发明内容

本发明所公开的组合物及其作用过程需要通过干扰核酸双链实现，该干扰核酸的反义链靶向到两个或多个mRNA、或靶向到两个或多个微小RNA(microRNA，miRNA)、或靶向到两个或多个mRNA或miRNA的子序列，并且该干扰核酸不引起体内的干扰素反应。在一个实施例中，该多靶标干扰核酸由不连续的反义链和连续的正义链组成，其中反义链靶向两个或多个不同基因的mRNA或同一基因mRNA的两个或多个不同位点，且转染到细胞中不会引起长双链核酸诱发的干扰素效应。在另一实施例中，该多靶标干扰核酸的正义链不连续而反义链连续，且反义链靶向两个或多个不同基因的mRNA或同一基因mRNA的两个或多个不同位点。转染到细胞中不会引发干扰素效应。

本发明提供了一种干扰核酸分子，该干扰核酸分子由含一个5’末端和一个3’末端部分的正义链与含一个5’末端和一个3’末端部分的反义链退火而成。其中，反义链至少含两个部分，一个部分靶向第一个RNA，反义链的另一个部分靶向第二个RNA，或者反义链的一个部分靶向某一RNA的第一个部分，反义链的另一个部分靶向同一RNA的第二个部分。该干扰核酸在转染进细胞后不引发干扰素反应。

本发明还公开了一种由两条或多条正义链与两条或多条反义链组成的多靶标干扰核酸分子。其中，反义链与正义链退火以产生干扰核酸分子，在反义链上至少有一个缺刻或一个核苷酸缺口，同时在正义链上至少有一个缺刻或一个核苷酸缺口，每条反义链靶向不同的mRNA或一个mRNA的不同位点，并且至少一条正义链靶向一个mRNA，且上述干扰核酸分子长度至少为30-80个核苷酸。这种不连续的干扰核酸分子结构不会引起哺乳动物细胞的干扰素效应。

通常，干扰核酸分子由一条反义链和一条正义链组成，分子的总长度至少为30个核苷酸，且干扰核酸分子的任意一条链或两条链上有一个或多个缺刻或缺口，将正义链或反义链分割成多段。长度在30个核苷酸之上的双链RNA导入哺乳动物细胞质后会引发干扰素反应，但应用这种分段的正义链或反义链构成的长干扰核酸却没有激发哺乳动物细胞的干扰素反应。

本发明还提供了利用多靶标干扰核酸分子下调或沉默多个目的基因表达的方法，有望在抑制、缓解或减轻病情或防止某些疾病症状的复发方面比单靶标siRNA取得更显著的治疗效果。

本发明与现有技术相比，多靶标干扰核酸分子能够同时抑制多个靶基因的表达，或者靶向一个基因的多个位点，基因沉默效果优于单靶标siRNA。此外，虽然该干扰核酸分子长度大于30bp，但由于结构特殊，并未引起干扰素效应，可应用于哺乳动物细胞。本发明公开的多靶标干扰核酸分子是一种新的siRNA的应用形式，在对疾病的基因治疗方面可能有广泛的应用前景。

附图说明

图1是实时定量PCR检测各实验组Survivin基因的mRNA表达量柱形图。

图2是实时定量PCR检测各实验组Bcl-2基因的mRNA表达量柱形图。

图3是实时定量PCR检测各实验组干扰素相关基因OAS1的mRNA表达量柱形图。

图4是实时定量PCR检测各实验组干扰素相关基因IFNβ1的mRNA表达量柱形图。

图5是WST-8法检测各实验组膀胱癌T24细胞的生长曲线图。

图6是转染了不同干扰核酸分子后T24细胞生长的抑制率柱形图。

具体实施方式

本发明中术语的定义应该用来解释包含没有详述的此领域中相关的术语，并非是对本发明进行限制。

本发明中术语干扰核酸是指有正义和反义链的核苷酸双链，能够在进入RNA诱导沉默复合物(RISC)后诱导靶RNA酶降解。一般情况下，每条链大部分是RNA核苷酸，但可以包含RNA类似物、RNA和RNA类似物、RNA和DNA、RNA类似物和DNA，或一条链与DNA互补且一条链是长度与干扰核酸结构相同的RNA，诱导同源靶RNA酶降解。

本发明中术语“干扰核酸”包括小干扰核酸、能够在体内切割成小干扰核酸的发卡核酸。干扰核酸还包括能在细胞中引发转录本形成干扰核酸分子或发卡干扰核酸的表达载体(也指干扰核酸表达载体)，或该转录本能够在体内产生小干扰核酸分子。该干扰核酸分子包括可形成发卡环或双链干扰核酸的单链。干扰核酸是一种由互补的正义和反义链组成的双链多聚核苷酸分子，该反义链包含一段或部分与一种调节表达的靶基因核苷酸分子互补的核苷酸序列。正义链或反义链带有一个或多个缺刻或缺口。干扰核酸的末端结构可以是平端或粘性末端(悬垂)，且该干扰核酸能够沉默靶RNA。粘性末端结构不局限于3’端悬垂，还包括能够产生RNA干扰效应的5’端悬垂结构。而且，核苷酸的悬垂的数量不局限于2或3，可以是能够诱导RNA干扰效应的任意数量。

本发明中的干扰核酸分子的长度是由从双链的正义链起始5’端的第一个碱基开始计算至正义链3’端的最后一个碱基。

miRNA是调节基因表达的21-23个核苷酸长度的单链RNA分子。miRNA由从DNA转录的基因编码，但不翻译成蛋白质(非编码RNA)；miRNA形成过程是由称做pri-miRNA原始转录本加工成pre-miRNA的短茎环结构，最终形成功能性的miRNA。成熟的miRNA分子部分互补到一个或多个mRNA分子，它们的主要功能是下调基因的表达。

修饰的核苷酸可以在一条干扰核酸反义链、正义链或正、反义两条链中。

在本领域中有很多实施例说明在核苷酸中引入糖、碱基和磷酸修饰可以显著增加核酸酶稳定性和有效性。如，修饰寡核苷酸的核酸酶耐受基团来增强稳定性和/或增强生物学活性，如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-甲氧基、2’-氧-烯丙基、2’-氢的核苷酸碱基修饰(Usman和Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman等，Nucleic Acids Symp.Ser.31：163，1994；Burgin等，Biochemistry 35：14090，1996)。核苷酸分子糖修饰(Perrault等，Nature 344：565-568，1990；Pieken等，Science 253：314-317，1991；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334-339，1992；Burlina等，Bioorg.Med.Chem.5：1999-2010，1997)。

双链结构可以通过自身互补形成干扰核酸分子，可以由发卡结构的RNA或两条独立互补的干扰核酸链来退火形成。

本发明中术语“多靶标”是指干扰核酸分子的反义链靶向到两个或多个mRNA、或靶向到两个或多个微小RNA(microRNA，miRNA)、或靶向到两个或多个mRNA或miRNA的子序列。“单靶标”是指干扰核酸分子的反义链靶向到一个mRNA、或靶向到一个微小RNA(microRNA，miRNA)、或一个mRNA或miRNA的子序列。

一条核酸链上的缺刻是指将一条核酸链上两个核苷酸间的磷酸二酯键断开。

在一些具体实施例中，干扰核酸分子包括独立的正义或反义链，该正义或反义链通过核苷酸或非核苷酸接头共价连接，或者通过离子反应、氢键结合、范德华力、疏水反应或叠加反应进行非共价结合。

干扰核酸分子可以由两条独立的寡核苷酸组合成双链，其中一条链是正义链，另一条是反义链，且正义链或反义链自身互补。(例如，每条链含有与另一条链上核苷酸互补的核苷酸序列；如形成双链上或双链结构的反义链和正义链，双链的长度至少为30个核苷酸)。反义链可以包含与靶核苷酸互补或部分互补的核苷酸序列，正义链可以包含与靶序列一致或部分一致的核苷酸序列。可选择地，干扰核酸分子可以由一条单个寡核苷酸链组成，其中干扰核酸分子的正义或反义链由核苷酸或非核苷酸的接头连接。

干扰核酸分子可以包含一个核苷酸的、非核苷酸的、或核苷酸/非核苷酸混合的接头，用来连接正义和反义链。在一些具体实施例中，一种核苷酸接头的长度可以为3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。一种非核苷酸接头可以为一种脱碱基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、碳氢聚合物、或其它多聚体复合物(如，聚乙二醇，如在其间有2-100个聚乙二醇单位)(Seela和Kaiser，Nucleic Acids Res.18：6353，1990，和Nucleic Acids Res.15：3113，1987；Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：6324，1991；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：5109，1991；Ma等，Nucleic Acids Res.21：2585，1993，和Biochemistry 32：1751，1993；Durand等，Nucleic Acids Res.18：6353，1990；McCurdy等，Nucleosides & Nucleotides 10：287，1991；Jschke等，Tetrahedron Lett.34：301，1993；Ono等，Biochemistry 30：9914，1991)。一种“非核苷酸接头”是指能掺入到一条核苷酸链替换一个或多个核苷酸单位的一种基团和复合物，包括糖和磷酸基团替代物，且能保持碱基的酶活性。这种基团或复合物可以是脱碱基的，可以不包含通常的识别核苷酸碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，如在糖环的C1位上。

术语“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及形成单链或双链的它们的聚合物。该术语中核苷酸包括熟知的核苷酸类似物或修饰的后键残基或连接，可以是人工合成的、天然的和非天然的，含有与核苷酸类似的结合性质和新陈代谢性质。

术语“RNA”是指一种至少包含一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D呋喃核糖基团的2’位上有一个羟基基团的核苷酸。该术语包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、完全纯化的RNA、合成的RNA、重组体产生的RNA，可以通过添加、删除、替换或改变一个或多个核苷酸来改变RNA，使其不同于天然的RNA。这些改变可以包括添加非核苷酸原料，如添加在干扰核酸的末端或中间，如RNA的一个或多个核苷酸。本发明的RNA分子的核苷酸也可以包括非标准的核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些改变的RNA可以是类似物或天然RNA的类似物。本发明中术语“核糖核酸”和“RNA”是指一种分子包含至少一个核糖核苷酸残基。核糖核酸是一种在β-D呋喃核糖基团的2’位上有一羟基基团的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、完全纯化的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，可以通过添加、删除、替换或改变一个或多个核苷酸来改变RNA，使其不同于天然的RNA。这些改变可以包括添加非核苷酸原料，如添加在干扰核酸的末端或中间，如在RNA分子的一个或多个核苷酸包含非标准的核苷酸，如非天然核苷酸或化学合成核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以是类似物。

本发明中互补核苷酸碱基是指通过氢键互相连接一对核苷酸碱基。腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶配对或与RNA中尿嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。互相杂交(通过氢键结合)的互补片段或核苷酸链。“互补”是指一条核苷酸链与另一条核苷酸链可以通过Watson-Crick法则或其它非常规结合方式形成氢键。

干扰核酸分子的正义链上可以有一个末端帽基团，如在正义链的3’端、5’端、或3’端和5’端上有脱氧脱碱基基团。

“帽子结构”是指化学修饰的，可以掺入到寡核苷酸任一末端。这些末端修饰可以保护核苷酸分子免受核酸外切酶降解，可以帮助在细胞中传输和定位。帽子结构可以位于5’-末端(5’-帽)或在3’-端(3’-帽)或同时存在于两个末端。

本发明中“发卡环结构”是指一种线性的干扰核酸分子，其包含一条反义片段、由核苷酸或非核苷酸组成的一个茎环结构、及由核苷酸少于反义片段且与其互补的核苷酸正义片段组成，正、反义片段可以互补与茎环形成双链。

本发明中干扰核酸组合物可以和其它已知的治疗成份一起注射来治疗疾病。

本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持干扰核酸分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。

任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持干扰核酸分子的活性。

本发明中的干扰核酸可以以任何形式给药，如经皮肤或局部注射。

本发明中组合物的剂型可以是口服给药的片剂、胶囊或酏剂，可以是直肠给药的栓剂，可以是注射给药的灭菌溶液、悬液，或是其它在本领域中知晓的剂型。

下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。

实施例1

构建针对Survivin基因和Bcl-2基因的多靶标干扰核酸分子

Survivin和Bcl-2基因是在恶性肿瘤细胞中广泛高表达的，抑制肿瘤细胞凋亡的基因。研究发现，抑制肿瘤细胞中过度表达的Survivin或Bcl-2基因，恢复其正常的凋亡通路可能是治疗肿瘤的新策略。因此，选取Survivin和Bcl-2基因为多靶标干扰核酸分子的靶基因，作为具体实施方式进行说明。

靶向人源Survivin基因siRNA为si-S：

正义链：5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUdTdT-3’(SEQ ID：1)

反义链：5’-AGAAACACUGGGCCAAGUCdTdT-3’(SEQ ID：2)

靶向人源Bcl-2基因的siRNA序列为si-B：

正义链：5’-GGAUGACUGAGUACCUGAAdTdT-3’(SEQ ID：3)

反义链：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCdTdT-3’(SEQID：4)

用序列SEQ ID：1-2退火成双链si-S，结构如下：

(SEQID：1)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUdTdT-3’

3’-dTdTCUGAACCGGGUCACAAAGA-5’

(SEQ ID：2)

用序列SEQID：3-4退火成双链si-B，结构如下：

(SEQ ID：3)

5’-GGAUGACUGAGUACCUGAAdTdT-3’

3’-dTdTCCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：4)

实施例2

一种干扰核酸分子包含一条正义链和两条反义链，反义链的5’端靶向到Bcl-2基因的mRNA，3’端靶向到Survivin基因的mRNA。

序列如下：

正义链：5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’(SEQ ID：5)

反义链：AGAAACACUGGGCCAAGUC(SEQ ID：6)

UUCAGGUACUCAGUCAUCC(SEQ ID：7)

用序列SEQ ID：5-7退火成干扰核酸双链Sub-1，如下：

(SEQ ID：5)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

3’-CUGAACCGGGUCACAAAGA    CCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：6)        (SEQ ID：7)

实施例3

一种干扰核酸分子包含两条正义链和一条反义链，正义链的5’端靶向到Survivin基因的mRNA，3’端靶向到Bcl-2基因的mRNA。

Sub-2结构如下：

正义链：GACUUGGCCCAGUGUUUCU(SEQ ID：8)

GGAUGACUGAGUACCUGAA(SEQ ID：9)

反义链：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCAGUAGAAACACUGGGCCAAGUC-3’

(SEQ ID：10)

用序列SEQ ID：8-10退火成干扰核酸双链Sub-2，如下：

(SEQ ID：8)                        (SEQ ID：9)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCU    GGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

3’-CUGAACCGGGUCACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：10)

实施例4

一种干扰核酸分子含一条正义链和一条反义链。

正义链：5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’(SEQ ID：11)

反义链：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCAGUAGAAACACUGGGCCAAGUC-3’(SEQ ID：12)

用序列SEQ ID：11-12退火成干扰核酸双链Sub-3，如下：

(SEQ ID：11)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

3’-CUGAACCGGGUCACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：12)

实施例5

对干扰核酸分子进行2’-甲氧基修饰，在保持干扰核酸分子活性的同时提高其稳定性。修饰后的结构如下所示，其中加粗标记并下划线标记的为2’-甲氧修饰碱基。

干扰核酸分子si-S-m结构如下：

(SEQ ID：13)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUdTdT-3’

3’-dTdTCUGAACCGGGUCACAAAGA-5’

(SEQ ID：14)

干扰核酸分子si-B-m结构如下：

(SEQ ID：15)

5’-GGAUGACUGAGUACCUGAAdTdT-3’

3’-dTdTCCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：16)

干扰核酸分子Sub-4结构如下：

(SEQ ID：17)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

3’-CUGAACCGGGUCACAAAG     CCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：18)                    (SEQ ID：19)

干扰核酸分子Sub-5结构如下：

(SEQ ID：20)                    (SEQ ID：21)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCU    GGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

3’-CUGAACCGGGUCACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACU-5’

(SEQ ID：22)

干扰核酸分子Sub-6结构如下：

(SEQ ID：23)

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

3’-CUGAACCGGGUCACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACUU-5’

(SEQ ID：24)

实施例6

干扰核酸分子的转染

所有干扰核酸分子由百奥迈科生物技术有限公司合成，退火后的干扰核酸分子纯度大于95％，用无核酸酶水溶解后可直接用于转染。同时用与哺乳动物基因无同源性的siRNA作为阴性对照，序列为：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID：25)

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID：26)

人膀胱癌细胞系T24用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5％CO₂条件下培养。取生长状态良好的T24细胞，转染前一天铺6孔细胞培养板，调整每孔的细胞数，使第二天细胞汇合度达到30％-40％。转染设置12组，分别为：

编号	实验组
		1	si-S转染组
2	si-S-m转染组
		3	si-B转染组
4	si-B-m转染组
		5	Sub-1转染组
6	Sub-2转染组
		7	Sub-3转染组
8	Sub-4转染组
		9	Sub-5转染组
10	Sub-6转染组
		11	阴性对照组(转染阴性对照siRNA)
12	正常对照组(未处理的正常细胞)

转染前将培养基更换为无血清无双抗的Opti-MEM(Invitrogen)培养基培养细胞。以6孔板的一个孔为例说明，使用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000脂质体(简称Lipo2000)进行转染：a)用250μl无血清Opti-MEM培养基稀释5μl Lipo2000，轻轻混匀，室温下静置5min。b)用250μl无血清Opti-MEM培养基稀释适量的siRNA，使转染时的终浓度为50nM。c)混合Lipo2000和siRNA的稀释液(总体积为500μl)。轻轻混匀后，室温下静置20min，以形成siRNA-Lipo2000混和物。d)逐滴将siRNA-Lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和。e)将培养板置于37℃的CO₂培养箱中培养。4-6h后，将孔里含siRNA-Lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的完全培养基，培养至检测时间检测。

每个转染组设3个复孔，实验重复三次。

实施例3

实时定量PCR法检测靶基因mRNA表达

提取总细胞RNA：按上述实施例2方法所转染的各组细胞，培养48h后吸尽培养基，PBS洗2遍。吸尽PBS，按每孔培养细胞中加入1ml RISO(百奥迈科生物技术有限公司)试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后吹打细胞使细胞脱落。将细胞裂解液转移至DEPC处理的离心管中，并反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。按1ml RISO加入0.2ml氯仿的量向细胞裂解液中加入氯仿，盖紧管盖，轻微振荡15s，室温静置2-3min。12,000g，离心15min。小心吸取无色上清液至新的1.5ml DEPC处理的离心管中。每管加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，12,000g，4℃离心10min。弃去上清，加1ml 75％乙醇(每使用1ml RISO试剂至少加1ml 75％乙醇)，涡旋振荡混匀。7,500g，4℃离心5min弃尽上清，超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥，加入适量DEPC-H₂O溶解RNA沉淀(可在55-60℃促溶10min)。取少量RNA用1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳观察28S和18S两条清晰条带，以确保提取的总RNA的纯度和完整性。

采用一步法实时荧光定量PCR进行检测目的基因mRNA的水平，所用引物序列如下，由百奥迈科生物技术有限公司合成。

Survivin基因扩增引物：

上游引物：5’-AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG-3’

下游引物：5’-TCATCCTCACTGCGGCTGTC-3’

Bcl-2基因扩增引物：

上游引物：5’-GGCTGGGATGCCTTTGTG-3’

下游引物：5’-GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG-3’

GAPDH基因扩增引物：

上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

反应体系为：RNA模板10pg～100ng，2×Master mix 12.5μl，50×SYBR green I 0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，DEPC-H₂O补足总体积至25μl。每个样品做3个平行反应。用Bio-Rad公司的MyIQ^TM实时定量PCR仪进行反应，反应条件为：反转录42℃30min，预变性95℃5min，95℃20s，60℃20s，72℃20s，共40个循环。以60-95℃，0.5/10s测定溶解曲线。结果通过2^-ΔΔCt方法计算，目的基因表达差异通过转染组相对于阴性对照组的比值来表示，结果如图1和图2所示。结果表明：一条链上有缺口的干扰核酸干扰核酸分子(Sub-1、Sub-2、Sub-4和Sub-5)同时有效抑制了Survivin和Bcl-2两个基因的表达，与其相应的对照单靶标siRNA(si-S、si-S-m、si-B、si-B-m)抑制效率相比无显著差异。但是连续的干扰核酸分子(Sub3、Sub6)无显著的抑制靶基因mRNA的作用。2’-甲氧基修饰的RNA与其序列相同的未修饰RNA均有效的抑制了目的基因的表达。

实施例4

实时定量PCR法检测干扰素效应

按上述实施例2所述方法分别转染si-S-m、si-B-m、Sub-4、Sub-5、Sub-6和阴性对照RNA至T24细胞中，培养48h后，按上述实施例3方法提取细胞总RNA，并用实时定量PCR法检测干扰素相关基因OAS1和IFNβ1的mRNA水平。所用引物序列如下，由百奥迈科生物技术有限公司合成。

OAS1基因扩增引物：

上游引物：5’-GTGAGCTCCTGGATTCTGCT-3’

下游引物：5’-TGTTCCAATGTAACCATATTTCTGA-3’

IFNβ1基因扩增引物：

上游引物：5’-CCTCCAAATTGCTCTCCTGTTG-3’

下游引物：5’-CAATTGCCACAGGAGCTTCTG-3’

GAPDH基因扩增引物：

上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

结果如图3和图4所示，转染后48h，各转染组IFNβ1的mRNA水平与阴性对照组相比均无明显升高。转染了长双链Sub6诱导了OAS1的显著升高，而si-S-m、si-B-m、Sub-4、Sub-5转染组OAS1的mRNA水平未见显著上升。结果说明，＞30bp的Sub-6诱导了干扰素反应，而不连续的长链结构的多靶标干扰核酸分子则未引起明显的干扰素效应。

实施例5

WST-8法检测siRNA对细胞增殖能力的影响

取生长状态良好的T24细胞，按1000细胞/孔的数量铺96孔板，按实施例2所述方法转染si-S-m、si-B-m、Sub-4、Sub-5到T24细胞中，转染后24h、48h、72h分别取细胞进行WST-8法检测细胞活力，每个时间点设5个复孔。每孔加入10μl WST-8溶液，在细胞培养箱中培养2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度(A值)。

细胞增殖抑制率(IR)＝(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100％。

如图5、6所示：转染后24h，si-S-m、si-B-m、Sub-4、Sub-5转染组与阴性对照组相比分别表现出显著的抑制T24细胞生长的能力，抑制率分别为29％、17％、26％和25％，si-S-m与Sub-4、Sub-5组之间无显著差异，都高于si-B-m转染组。转染后48h各组生长抑制率与24h相比略有下降，si-S-m、Sub-4、Sub-5组之间无显著差异，仍高于si-B-m转染组。转染后72h，si-S-m、si-B-m转染组抑制T24细胞生长的抑制率显著下降至10％和10％，而Sub-4、Sub-5转染组的抑制率仍维持在较高水平，分别为17％和21％。结果表明，靶向Survivin和Bcl-2基因的多靶标干扰核酸分子比其序列相同的单靶标siRNA有着更持续的抑制膀胱癌T24细胞生长的能力。

Claims (9)

1.一种多靶标干扰核酸分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链的至少一个部分，分别靶向不同基因的RNA或同一基因的RNA的不同位点，该多靶标干扰核酸分子转染进入细胞后不会引起干扰素效应。

2.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，由一条正义核苷酸链和至少两条反义链退火形成，其中反义链之间上存在核苷酸缺刻或长度为1-20个核苷酸的核苷酸缺口。

3.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，由至少两条正义核苷酸链和一条反义链退火形成，其中正义链上存在核苷酸缺刻或长度为1-20个核苷酸的核苷酸缺口。

4.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，正义链有至少一个缺刻或核苷酸缺口，反义链有至少一个缺刻或核苷酸缺口，所述的核苷酸缺口的长度为1-20个核苷酸。

5.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，含有至少一个核糖环2’位羟基的取代修饰或核糖环结构修饰。

6.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，所述的RNA是信使RNA或微小RNA。

7.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，含有0-2个核苷酸的3’突出端。

8.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，正义链和反义链通过发夹环结构的核苷酸在末端相连接。

9.根据权利要求1所述的多靶标干扰核酸分子，其特征在于，正义链的5’末端与反义链的3’末端通过发夹环结构的核苷酸相连接或是正义链的3’末端与反义链的5’末端通过发夹环结构的核苷酸相连接。

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