BRPI0615791B1 - Rna de fita dupla isolado compreendendo fitas complementares aneladas, método de controle de infestação de peste e uso de uma ração artificial compreendendo a sequência de ribonucleotídeo de fita dupla para tratar infestação de plantas por insetos - Google Patents

Abstract

métodos baseados em plantas transgências para o controle de pestes com o uso de rnai. a presente invenção relaciona-se com métodos de controle de infestação de pestes usando moléculas de rna de filamentos duplos. a invenção proporciona métodos para produzir plantas transgênicas que expressam as moléculas rna de filamentos duplos, assim como também agentes pesticidas e produtos de commmodity produzidos pelas plantas inventivas.

Description

(54) Título: RNA DE FITA DUPLA ISOLADO COMPREENDENDO FITAS COMPLEMENTARES ANELADAS,

MÉTODO DE CONTROLE DE INFESTAÇÃO DE PESTE E USO DE UMA RAÇÃO ARTIFICIAL COMPREENDENDO A SEQUÊNCIA DE RIBONUCLEOTÍDEO DE FITA DUPLA PARA TRATAR INFESTAÇÃO DE PLANTAS POR INSETOS (73) Titular: DEVGEN NV. Endereço: Technologiepark 30, B-9052 Zwijnaarde, BÉLGICA(BE) (72) Inventor: PASCALE FELDMANN; GEERT PLAETINCK; IRENE NOOREN; ELS VAN BLEU; FRÉDÉRIC PECQUEUR; ROMAAN RAEMAEKERS

Código de Controle: 954E4C7D1C17ABF2 268EF79FAA5B47CC

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 03/04/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 03/04/2018

Assinado digitalmente por:

Júlio César Castelo Branco Reis Moreira

Diretor de Patente

1/225 “RNA DE FITA DUPLA ISOLADO COMPREENDENDO FITAS COMPLEMENTARES ANELADAS, MÉTODO DE CONTROLE DE INFESTAÇÃO DE

PESTE E USO DE UMA RAÇÃO ARTIFICIAL COMPREENDENDO A

SEQUÊNCIA DE RIBONUCLEOTÍDEO DE FITA DUPLA PARA TRATAR

INFESTAÇÃO DE PLANTAS POR INSETOS”

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se genericamente ao controle genético de infestações de pestes. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a tecnologias de RNA de fita dupla recombinante para a repressão ou inibição da expressão de uma sequência de codificação alvo em uma peste.

Introdução

O meio ambiente está repleto de pestes e numerosos métodos tem tentado controlar infestações por pestes de plantas. Têm sido providas composições para o controle de infestações de pestes microscópicas na forma de composições antibióticas, antivirais e antifúngicas. Métodos para o controle de infestações por pestes maiores, tais como nematódeos, estão tipicamente na forma de composições químicas que são aplicadas às superfícies nas quais a peste se encontra, ou administradas aos animais infestados na forma de péletes, pós, tabletes, pastas ou cápsulas.

Os cultivos comerciais são frequentemente alvos do ataque de insetos.

Um progresso substancial foi obtido nas últimas décadas no sentido do desenvolvimento de métodos e composições mais eficientes para o controle de infestações de insetos em plantas. Pesticidas químicos têm sido bem efetivos na erradicação de infestações de pestes. Entretanto, existem várias desvantagens na utilização de agentes pesticidas químicos. Não apenas os pesticidas químicos são potencialPetição 870170085441, de 06/11/2017, pág. 7/10

2/225 mente negativos para o meio ambiente, mas também não são seletivos e são nocivos a vários cultivos e para a fauna não alvo. Os pesticidas químicos permanecem no meio ambiente e, em geral, são de metabolização lenta, se são de alguma forma metabolizados. Eles se acumulam na cadeia alimentar e, particularmente, nas espécies predadoras superiores. O acúmulo destes agentes pesticidas químicos resulta no desenvolvimento de resistência aos agentes e, em espécies acima na escala evolutiva, podem agir como mutagênicos e/ou carcinógeno provocando modificações genéticas irreversíveis e deletérias.

Tendo em vista os perigos associados aos pesticidas químicos, foram desenvolvidas abordagens moleculares para o controle de infestações de pestes em plantas. Por exemplo, a bactéria Bacillus thuringienszs (Bt) está disponível comercialmente e é utilizada em inseticidas ambientalmente seguros e aceitáveis por mais de trinta anos. A redução da aplicação de agentes pesticidas químicos resultou em solos mais limpos e águas mais claras provenientes dos solos para os riachos, rios, lagoas e lagos circunvizinhos. Adicionalmente a estes benefícios ambientais, ocorreu um aumento apreciável no número de insetos benéficos nos campos cultivados, nos quais plantas transgênicas resistentes a insetos são cultivadas, por causa da redução da utilização de agentes inseticidas químicos.

O RNA de Interferência (RNAi) provê uma ferramenta potencialmente poderosa para o controle da expressão genética, tendo em vista sua especificidade na seleção do alvo ê considerável alta eficiência na supressão de mRNA alvo. O RNAi refere-se ao processo de silenciamento genético pós-transcricional específico para seqüência mediado por RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Zamore, P. e colaboradores, Cell 101:25-33 (2000); Fire, A. e colaboradores, Nature 391:806 (1998); Hamilton e colaboradores, Science 286, 950-951 (1999); Lin e colabora3/225 dores, Nature 402:128-129 (1999)). Embora os mecanismos relativos ao RNAi não estejam totalmente caracterizados, acredita-se que a presença de dsRNA em uma célula acione o RNAi pela ativação de enzima ribonuclease III Dicer (Zamore, P. e colaboradores, (2000); Hammond e colaboradores, Nature 404, 293 (2000)). A Dicer processa o dsRNA em pedaços pequenos chamados de RNAs de interferência (siRNAs), que contêm cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento e compreendem cerca de 19 pares de bases duplexes (Zamore e colaboradores, (2000); Elbashir e colaboradores, Genes Dev., 15, 188 (2001)). Após a liberação nas células, as moléculas de siRNA associadas com um complexo de endonucleases, comumente chamado de complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que une a fita anti-senso do siRNA com o gene do mRNA celular alvo. O RISC cliva o mRNA, o qual é então liberado e degradado. É importante citar que o RISC é então capaz de degradar cópias adicionais do mRNA alvo.

Desta forma, a presente invenção provê métodos e composições para o controle de infestações por pestes pela repressão, retardo, ou de alguma outra forma de redução da expressão genética de uma peste particular.

Sumário da Invenção

Num aspecto, a invenção provê uma seqüência de nucleotídeos isolada compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos apresentada nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160-163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240-247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 508-513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 10664/225

1071,	1073,	1075,	1077,	1079,	1081,	1083,	1085,	1087,	1089,	1091,
1093,	1095,	1097,	1099,	1101,	1103,	1105,	1107,	1109,	1111,	1113,
1161-	1571,	1572,	1577,	1582,	1587,	1592,	1597,	1602,	1607,	1612,
1617,	1622,	1627,	1632,	1637,	1642,	1647,	1652,	1657,	1662,	1667,
1672,	1677,	1682,	1684,	1686,	1688,	1690,	1692,	1694,	1696,	1698,
1700,	1702,	1704,	1730-2039,	2040,	2045,	2050,	2055,	2060,	2065,
2070,	2075,	2080,	2085,	2090,	2095,	2100,	2102,	2104,	2106,	2108,

2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476, e 2481. Numa realização, é provida uma seqüência de ribonucleotídeos de fita dupla produzida a partir da expressão de uma seqüência de polinucleotídeo, em que a ingestão da dita seqüência de ribonucleotídeos por uma peste de planta inibe o crescimento da dita peste. Numa modalidade adicional, a ingestão da dita seqüência inibe a expressão de uma seqüência de nucleotídeos substancialmente complementar à dita seqüência. Noutra realização, uma célula é transformada com o polinucleotídeo. Ainda noutra realização, uma célula vegetal é transformada com o polinucleotídeo. Em uma modalidade adicional, uma semente ou produto é produzido a partir da planta transformada. Ainda noutra realização, o produto é selecionado do grupo que consiste em alimento, ração, fibra, torta, proteína, amido, farinha, silagem, café, chá e óleo.

Noutro aspecto, a invenção provê uma seqüência de nucleotídeos apresentando pelo menos 70% de identidade de seqüência a uma seqüência de ácidos nucléicos apresentada em qualquer uma das SEQ

ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160-163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493,

498, 503, 508-513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591,

596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793,

5/225

795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1066- 1071, 1073,

1075,	1077,	1079,	1081,	1083,	1085,	1087,	1089,	1091,	1093,	1095,
1097,	1099,	1101,	1103,	1105,	1107,	1109,	1111,	1113,	1161-	-1571,
1572,	1577,	1582,	1587,	1592,	1597,	1602,	1607,	1612,	1617,	1622,
1627,	1632,	1637,	1642,	1647,	1652,	1657,	1662,	1667,	1672,	1677,
1682,	1684,	1686,	1688,	1690,	1692,	1694,	1696,	1698,	1700,	1702,
1704,	1730-2039,	2040,	2045,	2050,	2055,	2060,	2065,	2070,	2075,
2080,	2085,	2090,	2095,	2100,	2102,	2104,	2106,	2108,	2120-2338,

2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 23842460, 2461, 2466, 2471, 2476, e 2481. Numa modalidade, é provida uma seqüência de ribonucleotídeos de fita dupla produzida a partir da expressão de uma seqüência de polinucleotídeo, onde a ingestão da dita seqüência de ribonucleotídeos por uma peste de planta inibe o crescimento da dita peste. Numa modalidade adicional, a ingestão da dita seqüência inibe a expressão de uma seqüência de nucleotídeos substancialmente complementar à dita seqüência. Noutra modalidade, uma célula é transformada com o polinucleotídeo. Ainda noutra modalidade, uma célula vegetal é transformada com o polinucleotídeo. Numa realização adicional, uma semente ou produto é produzido a partir da planta transformada. Em ainda uma outra modalidade, o produto é selecionado do grupo que consiste em alimento, ração, fibra, torta, proteína, amido, farinha, silagem, café, chá, e óleo.

Noutro aspecto, a invenção provê um ortólogo de um gene compreendendo pelo menos 17 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159,

160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225,

230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488,

493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591,

6/225

596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908- 1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097,

1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572,

1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627,

1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682,

1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704,

1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476, e 2481, ou um complemento destas. Em uma modalidade, é provida uma seqüência de ribonucleotídeos de fita dupla produzida a partir da expressão de uma seqüência de polinucleotídeo, onde a ingestão da dita seqüência de ribonucleotídeos por uma peste de planta inibe o crescimento da dita peste. Numa modalidade adicional, a ingestão da dita seqüência inibe a expressão de uma seqüência de nucleotídeos substancialmente complementar à dita seqüência. Noutra modalidade, uma célula é transformada com o polinucleotídeo. Ainda noutra realização, uma célula vegetal é transformada com o polinucleotídeo. Numa modalidade adicional, uma semente ou produto é produzido a partir da planta transformada. Ainda noutra realização, o produto é selecionado do grupo que consiste em alimento, ração, fibra, torta, proteína, amido, farinha, silagem, café, chá, e óleo.

Noutro aspecto, a invenção provê uma planta compreendendo uma seqüência de ácido ribonucléico derivada de espécies de pestes. Numa modalidade, a peste é selecionada do grupo que consiste em insetos, aracnídeos, crustáceos, fungos, bactérias, vírus, nematódeos, platelmintos, nematelmintos, oxiúros, ancilóstomos, tênias, tripanos7/225 somos, esquistossomos, moscas-do-berne, pulgões, carrapatos, ácaros e piolhos. Noutra modalidade, a planta é macho estéril citoplasmático. Noutra modalidade, a seqüência inibe a atividade biológica de uma peste. Noutra modalidade, a seqüência inibe a expressão de uma seqüência alvo. Numa modalidade adicional, a seqüência alvo é uma seqüência de inseto, nematódeo, bactéria ou fungo.

Noutro aspecto, a invenção provê um método para o controle de infestação por peste compreendendo o fornecimento a uma peste com material vegetal compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo que inibe uma atividade biológica da peste. Numa modalidade, a seqüência de polinucleotídeo é apresentada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160-163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240-247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503,

508-513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601,

603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797,

799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896,

908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1066-1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097,

1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572,

1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627,

1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682,

1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704,

1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476, e 2481, ou um complemento destas.

Noutro aspecto, a invenção provê um pesticida compreendendo uma planta que expressa uma seqüência de polinucleotídeo alvo.

XÁ.

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Noutro aspecto, a invenção provê um método para o controle de infestação por peste, compreendendo: (a) identificação de uma seqüência alvo em uma peste; (b) introdução da dita seqüência em uma planta; e (c) fornecimento da dita planta, ou parte desta, à dita peste.

Noutro aspecto, a invenção provê um método para o controle de infestação por peste, compreendendo: (a) identificação de uma seqüência alvo em uma primeira espécie de peste; (b) pesquisa por uma seqüência alvo ortóloga em uma segunda espécie de peste; (c) introdução da dita seqüência ortóloga em uma planta; e (d) fornecimento da dita planta, ou parte desta, à dita segunda peste. Noutra modalidade, o alvo é um gene de L. decemlineata e a dita planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijãofradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, ervadoce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couve-rábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

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Noutro aspecto, a invenção provê um método para aumentar o rendimento de culturas que compreende: (a) introdução de um polinucleotídeo em uma planta; e (b) cultivo da dita planta para possibilitar a expressão do polinucleotídeo, onde a dita expressão inibe a alimentação de uma peste e perda de rendimento devido à infestação pela peste. Numa modalidade, a peste é selecionada do grupo que consiste em insetos, nematódeos e fungos. Noutra modalidade, a expressão do polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que reprime um gene alvo em um inseto que ingeriu uma parte da dita planta, onde o dito gene alvo realiza pelo menos uma função essencial selecionada do grupo que consiste em alimentação da peste, viabilidade da peste, apoptose celular da peste, diferenciação e desenvolvimento da peste ou de qualquer célula da peste, reprodução sexual da peste, formação de músculo, amadurecimento muscular, contração muscular, formação e/ou redução do hormônio juvenil, regulação do hormônio juvenil, regulação e transporte iônicos, manutenção do potencial da membrana celular, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de feromônio, sensibilidade a feromônio, formação de antena, formação de asas, formação de pernas, formação de ovo, maturação de larva, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, transição do estágio de larva, pupação, emergência da pupação, divisão celular, metabolismo de energia, respiração, síntese e manutenção da estrutura citoesquelética, metabolismo de nucleotídeo, metabolismo de nitrogênio, utilização da água, retenção de água e percepção sensorial.

Noutro aspecto, a invenção provê um método para a produção de um produto de consumo que compreende: (a) identificação de uma seqüência alvo em uma peste; (b) introdução da dita seqüência em uma célula vegetal; (c) crescimento da dita célula vegetal sob condições

10/225 adequadas para a geração de uma planta; e (d) produção de um produto de consumo a partir da dita planta ou parte desta. Noutra modalidade, o alvo é um gene de L. decemlineata e a dita planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijãofradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, ervadoce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couve-rábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de P. cochleariae e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”,

11/225 alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couve rábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o referido alvo é um gene de E. varivetis e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couve rábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião,

12/225 melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de A. grandis e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de T. castaneum e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couve13/225 rábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de M. persicae e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

14/225

Noutra modalidade, o alvo é um gene de N. lugens e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de C. suppressalis e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro,

15/225 avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de P. xylostella e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de A. domesticus e a planta

16/225 é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, o alvo é um gene de um fungo e a planta é selecionada do grupo que consiste em acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda,

17/225 nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

Noutra modalidade, a invenção provê a utilização de uma seqüência de nucleotídeos isolada, de uma seqüência de ribonucleotídeo de fita dupla, de uma célula, de uma planta, ou de um produto, para o tratamento de plantas infestadas por insetos.

Noutra modalidade, a invenção provê a utilização de uma seqüência de nucleotídeos isolada, de uma seqüência de ribonucleotídeo de fita dupla, de uma célula, de uma planta, ou de um produto, para o tratamento de plantas infestadas por nematódeos.

Noutra modalidade, a invenção provê a utilização de uma seqüência de nucleotídeos isolada, de uma seqüência de ribonucleotídeo de fita dupla, de uma célula, de uma planta, ou de um produto, para o tratamento de plantas infestadas por fungos.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1-LD: Sobrevivência de L. decemlineata em ração artificial tratada com dsRNA. Os insetos do segundo estágio larval foram alimentados com ração tratada com 50 μΐ de solução aplicada topicamente de dsRNA (alvos ou controle gfp). A ração foi substituída por ração nova contendo dsRNA aplicado topicamente após 7 dias. O número de insetos sobreviventes foi obtido nos dias 2, 5, 7, 8, 9 e 13. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio). Alvo LD006: (SEQ ID No.: 178); Alvo LD007 (SEQ ID

18/225

No.: 183); Alvo LD010 (SEQ ID No.: 188); Alvo LD011 (SEQ ID No.: 193); Alvo LD014 (SEQ ID No.: 198); gfp dsRNA (SEQ ID No.: 235).

Figura 2-LD: Sobrevivência de L. decemlineata em ração artificial tratada com dsRNA. Os insetos do segundo estágio larval foram alimentados com ração tratada com 50 μΐ de solução aplicada topicamente de dsRNA (alvos ou controle gfp). A ração foi substituída por ração nova apenas após 7 dias. O número de insetos sobreviventes foi obtido nos dias 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12 e 14. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio). Alvo

LD001 (SEQ ID No.: 163); Alvo LD002 (SEQ ID No.: 168); Alvo LD003 (SEQ ID No.: 173); Alvo LD015 (SEQ ID No.: 215); Alvo LD016 (SEQ ID No.: 220); gfp dsRNA (SEQ ID No.: 235).

Figura 3-LD: Peso médio das larvas de L. decemlineata em discos de folhas de batata tratadas com dsRNA. Os insetos do segundo estágio larval foram alimentados com discos de folha com 20 μΐ de uma solução aplicada topicamente (10 ng/μΐ) de dsRNA (alvo LD002 ou gfp). Após dois dias os insetos foram transferidos para folhas não tratadas a cada dia.

Figura 4-LD: Sobrevivência de L. decemlineata em ração artifici20 al tratada com versões mais curtas do alvo LD014 de dsRNA e dsRNA concatâmeros. Os insetos do segundo estágio larval foram alimentados com ração tratada com 50 μΐ de solução aplicada topicamente de dsRNA (gfp ou alvos). O número de insetos sobreviventes foi obtido nos dias 3, 4, 5, 6 e 7. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio).

Figura 5-LD: sobrevivência de larvas de L. decemlineata em ração artificial tratada com diferentes concentrações de dsRNA do alvo LD002 (a), alvo LD007 (b), alvo LD010 (c), alvo LD011 (d), alvo LD014 (e), alvo LD015 (f), LD016 (g) e alvo LD027 (h). Os insetos do segundo

19/225 estágio larval foram alimentados com ração tratada com 50 μΐ de solução aplicada topicamente de dsRNA. A ração foi substituída por ração nova contendo dsRNA aplicado topicamente após 7 dias. O número de insetos sobreviventes foi obtido a intervalos regulares. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio).

Figura 6-LD: Efeitos de cepas de E. coli que expressam dsRNA alvo LD010 sobre a sobrevivência de larvas do besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, no tempo. As duas cepas bacteri10 anas foram testadas em bio-ensaios baseados em ração artificial separados: (a) AB309-105; os pontos de dados para pGBNJ003 e pGN29 representam os valores de mortalidade médios de 5 clones bacterianos diferentes, (b) BL21(DE3); os pontos de dados para pGBNJ003 e pGN29 representam os valores de mortalidade médios de 5 clones bacterianos diferentes e um clone bacteriano único, respectivamente. As barras de erro representam desvios padrão.

Figura 7-LD: Efeitos de diferentes clones de cepas de E. coli (a) AB309-105 e (b) BL21(DE3) expressando dsRNA alvo LD010 sobre a sobrevivência de larvas de besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 12 dias após a infestação. Os pontos de dados são os valores de mortalidade médios para cada clone para pGN29 e pGBNJ003. O clone 1 de AB309-105 contendo o plasmídeo pGBNJ003 mostrou 100% de mortalidade para CPB neste ponto no tempo. As barras de erro representam desvios padrão.

Figura 8-LD: Efeitos de diferentes clones de cepas de E. coli (a)

AB309-105 e (b) BL21(DE3) que expressam dsRNA alvo LD010 sobre o crescimento e desenvolvimento de sobreviventes de larvas do besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 7 dias após a infestação. Os pontos de dados são os valores médios percentuais do peso das

20/225 larvas para cada clone (um clone para pGN29 e cinco clones para pGBNJ003) com base nos dados da Tabela 10. Tratamento apenas com a ração representa 100% do peso larval.

Figura 9-LD: Sobrevivência de larvas do besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, em plantas de batata borrifadas com bactérias produtoras de RNA de fira dupla 7 dias após a infestação. O número de larvas sobreviventes foi contado e expresso em termos de mortalidade %. A cepa bacteriana hospedeira utilizada foi a cepa AB309-105 deficiente em RNaselII. O gene alvo do inseto foi o LD010.

Figura 10-LD: O retardamento do crescimento-desenvolvimento das larvas sobreviventes do besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, alimentadas em plantas de batatas borrifadas com bactérias produtoras de dsRNA 11 dias após a infestação. A cepa bacteriana hospedeira utilizada foi a cepa AB309-105 deficiente em RNaselII. Os dados estão representados como percentagem do peso larval normal; 100% do peso larval normal é dado para o tratamento apenas com ração. O gene alvo do inseto foi o LD010. As barras de erro representam desvios padrão.

Figura 11-LD: Resistência obtida por bactérias produtoras de RNA a dano em batata provocado por larvas do besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 7 dias após a infestação. À esquerda, plantas borrifadas com 7 unidades de bactéria AB309-105 contendo o plasmídeo pGN29; à direita, plantas borrifadas com 7 unidades de bactéria AB309-105 contendo o plasmídeo pGBNJ003. Uma unidade é definida como o equivalente a 1 ml de uma suspensão bacteriana a valor OD de 1 a 600 nm. O gene alvo do inseto foi o LD010.

Figura 12-LD: Sobrevivência de adultos de L. decemlineata em discos de folha de batata tratada com dsRNA. Os insetos adultos jovens

21/225 foram alimentados com discos de folha tratada com RNA de fita dupla pelos primeiros dois dias e então foram colocados em folhagem de batata não tratada. O número de insetos sobreviventes foi obtido regularmente; os insetos móveis foram registrados como insetos que estavam vivos e se movimentavam normalmente; os insetos moribundos foram registrados como insetos que estavam vivos, mas se mostravam doentes e se movimentando lentamente - estes insetos não eram capazes de se endireitarem uma vez virados de costas. Alvo LD002 (SEQ ID No.: 168); Alvo LD010 (SEQ ID No.: 188); Alvo LD014 (SEQ ID

No.: 198); Alvo LD016 (SEQ ID No.: 220); gfp dsRNA (SEQ ID No.: 235).

Figura 13-LD: Efeitos de RNA de fita dupla alvo produzido por bactéria contra larvas de L. decemlineata. Cinqüenta μΐ de uma suspensão OD 1 de bactérias tratadas com calor expressando dsRNA (SEQ ID No.: 188) foram aplicados topicamente sobre ração artificial sólida em cada poço de uma placa de 48 poços. Larvas de CPB no estágio L2 foram colocadas em cada poço. No dia 7, as larvas de CPB foram fotografadas em uma placa contendo (a) ração com bactérias expressando RNA de fita dupla alvo 10, (b) ração com bactérias contendo o vetor pGN29 vazio, e, (c) apenas ração.

Figura 14-LD: Efeitos sobre a sobrevivência e crescimento de larvas de CPB de diferentes quantidades da cepa AB309-105 de E. coli desativada contendo o plasmídeo pGBNJ003 aplicadas topicamente a folhagem de batata antes da infestação com insetos. Dez larvas LI foram alimentadas com batata tratada por 7 dias. Quantidade de suspensão bacteriana borrifada sobre as plantas: 0,25 U, 0,08 U, 0,025 U, 0,008 U do alvo 10 de pGN29 (controle negativo; incluída também água Milli-Q). Uma unidade (U) é definida como a quantidade de bactéria equivalente presente em 1 ml de cultura com uma densidade ótica de 1 a 600 nm. Um volume total de 1,6 ml foi borrifado em cada

22/225 planta. O gene de inseto alvo foi o LD010.

Figura 15-LD: Resistência obtida por cepa AB309-105 de E. coli desativada contendo o plasmídeo pGBNJ003, a dano em batata provocado por larvas de CPB sete dias após a infestação, (a) água, (b) 0,25 U de E. coli AB309-105 contendo pGN29, (c) 0,025 U de E. coli AB309-105 contendo pGBNJ003, (d) 0,008 U de E. coli AB309-105 contendo pGBNJ003. Uma unidade (U) é definida como a quantidade de bactéria equivalente presente em 1 ml de cultura com uma densidade ótica de 1 a 600 nm. Um volume total de 1,6 ml foi borrifado em cada planta. O gene de inseto alvo foi o LD010. O gene de inseto alvo foi o LD010.

Figura 1-PC: Efeitos do dsRNA alvo ingerido sobre a sobrevivência e crescimento de larvas de P. cochleariae. Larvas recém nascidas foram alimentadas com discos de folha de colza tratada com 25 μΐ de solução aplicada topicamente de 0,1 pg/μΐ de dsRNA (alvos ou controle gfp). Após 2 dias, os insetos foram transferidos para novos discos de folha tratada com dsRNA. No dia 4, as larvas de uma replicata para cada tratamento foram coletadas e colocadas em uma placa de Petri contendo folhagem de colza nova não tratada. Os insetos foram observados nos dias 2, 4, 7, 9 e 11. (a) Sobrevivência de larvas de E. varivestis em discos de folha de colza tratada com dsRNA. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio), (b) Peso médio de larvas de P. cochleariae em discos de folha de colza tratada com dsRNA. Insetos de cada replicata foram pesados juntos e o peso médio por larva foi determinado. As barras de erro representam desvios padrão. Alvo 1 : SEQ ID No.: 473; alvo 3: SEQ ID No.: 478; alvo 5: SEQ ID No.: 483; alvo 10: SEQ ID No.: 488; alvo 14: SEQ ID No.: 493; alvo 16: SEQ ID No.: 498; alvo 27: SEQ ID No.: 503; gfp dsRNA: SEQ ID No.: 235.

Figura 2-PC: sobrevivência de P. cochleariae em discos de folha

23/225 de colza tratada com diferentes concentrações de dsRNA de (a) alvo PCO1O e (b) alvo PC027. Larvas recém nascidas foram colocadas em discos de folha tratada com 25 μΐ de solução aplicada topicamente de dsRNA. Os insetos foram transferidos para novos discos de folha tratada no dia 2. No dia 4 para o alvo PC010 e dia 5 para o alvo PC027, os insetos foram transferidos para folhas não tratadas. O número de insetos sobreviventes foi obtido nos dias 2, 4, 7, 8, 9 e 11 para PC010 e 2, 5, 8, 9 e 12 para PC027. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio).

Figura 3-PC: Efeitos da cepa AB309-105 de E. coli que expressa dsRNA alvo PC010 sobre a sobrevivência de larvas do besouro da folha de mostarda, P. cochleariae, no tempo. Os ponto de dados para cada tratamento representam os valores de mortalidade médios de 3 diferentes replicatas. As barras de erro representam desvios padrão. Alvo 10:

SEQ ID No.: 488.

Figura 1-EV: Sobrevivência de larvas de E. varivestis em discos de folha de ervilha tratada com dsRNA. As larvas recém nascidas foram alimentadas com discos de folha de ervilha tratada com 25 μΐ de solução aplicada topicamente de 1 pg/μΐ de dsRNA (alvos ou controle gfp). Após 2 dias, os insetos foram transferidos para novos discos de folha tratada com dsRNA. NO dia 4, as larvas de um tratamento foram coletadas e colocadas em uma caixa de plástico contendo folhagem de ervilha não tratada. Os insetos foram analisados para mortalidade nos dias 2, 4, 6, 8 e 10. A percentagem de larvas sobreviventes foi calcula25 da em relação ao dia 0 (início do ensaio). Alvo 5: SEQ ID No.: 576; alvo 10: SEQ ID No.: 586; alvo 15: SEQ ID No.: 591; alvo 16: SEQ ID No.: 596; gfp dsRNA: SEQ ID No.: 235.

Figura 2-EV: Efeitos do dsRNA alvo ingerido sobre a sobrevivên57

24/225 cia de E. varivestis adultos e resistência ao dano foliar causado por mordida do inseto, (a) Sobrevivência de E. varivestis adultos em folha de ervilha tratada com dsRNA. Os adultos foram alimentados com discos de folha tratada com 75 μΐ de solução aplicada topicamente de

0,1 pg/μΙ de dsRNA (alvos ou controle gfp). Após 24 horas, os insetos foram transferidos para novos discos de folha tratada com dsRNA. Após mais 24 horas, os adultos de um tratamento foram coletados e colocados em caixa de plástico contendo plantas inteiras de ervilha em vaso. Os insetos foram analisados para mortalidade nos dias 4, 5, 6, 7, 8 e

11. A percentagem de adultos sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio). Alvo 10: SEQ ID NO: 586; alvo 15: SEQ ID NO: 591; alvo 16: SEQ ID NO: 596; gfp dsRNA: SEQ ID NO: 235. (b) Resistência conferida por dsRNA ao dano foliar em ervilha causado por adultos de E. varivestis. Plantas inteiras contendo insetos de um tratamento (ver (a)) foram verificadas visualmente para dano foliar no dia 9. (i) alvo 10; (ii) alvo 15; (iii) alvo 16; (iv) gfp dsRNA; (v) não tratada.

Figura 1-TC: Sobrevivência de larvas de T. castaneum em ração artificial tratada com dsRNA do alvo 14. Larvas recém nascidas foram alimentadas com ração a base de uma mistura farinha/leite com 1 mg de dsRNA alvo 14. O controle foi água (sem dsRNA) na ração. Quatro replicatas de 10 larvas de primeiro instar por replicata foram obtidas para cada tratamento. Os insetos foram analisados para sobrevivência como média percentual nos dias 6, 17, 31, 45 e 60. A percentagem de larvas sobreviventes foi calculada em relação ao dia 0 (início do ensaio).

As barras de erro representam desvios padrão. Alvo TC014: SEQ ID No.: 878.

Figura 1-MP: Efeito da ingestão do alvo 27 de dsRNA sobre a sobrevivência de ninfas de Myzus persicae. Insetos de primeiro instar foram colocados em câmeras de alimentação contendo 50 μΐ de ração

25/225 líquida com 2 pg/μΐ de dsRNA (alvo 27 ou controle gfp dsRNA). Por tratamento, 5 câmeras de alimentação foram preparadas com 10 instares em cada em cada câmera de alimentação. O número de sobreviventes foi obtido 8 dias após o início do bio-ensaio. As barras de erro representam desvios padrão. Alvo MP027: SEQ ID No.: 1061; gfp dsRNA: SEQ ID No.: 235.

Figura 1-NL: Sobrevivência de Nilaparvata lugens em ração líquida artificial tratada com dsRNA. As ninfas do primeiro e do segundo estágios larvais foram alimentadas com ração suplementada com 2 mg/ml de solução de dsRNA alvos em bio-ensaios separados: (a) NL002, NL003, NL005, NL010; (b) NL009, NL016; (c) NL014, NL018; (d) NL013, NL015, NL021. A sobrevivência dos insetos nos alvos foi comparada com apenas ração e ração com controle gfp dsRNA na mesma concentração. A ração foi substituída por ração nova contendo dsRNA a cada dois dias. O número de insetos sobreviventes foi obtido a cada dia.

Figura 2-NL: Sobrevivência de Nilaparvata lugens em ração líquida artificial tratada com diferentes concentrações de dsRNA alvo NL002. Ninfas do primeiro e do segundo estágios larvais foram alimentadas com ração suplementada com 1, 0,2, 0,08 e 0,04 mg/ml (concentração final) de NL002. A ração foi substituída por ração nova contendo dsRNA a cada dois dias. O número de insetos sobreviventes foi obtido a cada dia.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê um meio para o controle de infestações por pestes pela administração a uma peste de uma seqüência de codificação alvo que suprime ou inibe após a transcrição uma função biológica essencial na peste. Em um aspecto, a invenção contempla a alimentação de uma peste com um ou mais moléculas de ácidos nucléico de fita dupla ou de interferência pequeno (RNA) transcritas de

26/225 toda ou parte de uma seqüência de codificação alvo que é essencial para o sustento e sobrevivência da peste. Desta forma, a presente invenção refere-se à inibição seqüência específica de seqüências de codificação pela utilização de RNA de fita dupla (dsRNA), incluindo RNA de interferência pequeno (siRNA), como meio para o controle de peste.

Até o momento, tem sido impraticável prover-se moléculas de dsRNA na ração da maioria das espécies de peste porque as moléculas de RNA são facilmente degradadas por nucleases no ambiente e acreditava-se serem instáveis em ambientes levemente alcalinos ou ácidos, tais como os encontrados nos tratos digestivos da maioria das pestes invertebradas. Por esta razão, havia a necessidade de métodos aperfeiçoados de modulação de expressão genética pela repressão, retardo, ou qualquer outra forma de redução da expressão genética em uma peste em particular para o propósito de controle da infestação pela peste ou para introduzir novos traços fenotípicos.

Os presentes inventores identificaram meios para o controle de infestações por pestes, provendo moléculas de dsRNA na ração da dita peste. A seqüência do dsRNA corresponde a parte ou ao todo de um gene essencial da peste e provoca a sub-regulação da peste alvo por meio de interferência de RNA (RNAi). Como resultado da sub-regulação do mRNA, o dsRNA evita a expressão de proteína da peste alvo e resulta em um ou mais dos seguintes atributos (não se limitando a estes): redução da alimentação por parte da peste, redução da viabilidade da peste, morte da peste, inibição da diferenciação e do desenvolvimento da peste, ausência de reprodução sexual ou capacidade reduzida desta pela peste, formação muscular, formação de hormônio juvenil, regulação do hormônio juvenil, regulação e transporte iônico, manutenção do potencial da membrana celular, biossíntese de aminoácido, degradação de aminoácido, formação de esperma, síntese de feromônio, sensibilida27/225 de a feromônio, formação de antena, formação de asa, formação de perna, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação de larva, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo energético, respiração, apoptose, e qualquer componente de uma estrutura citoesquelética de células eucarióticas, tais como, por exemplo, actinas e tubulinas. Qualquer um ou qualquer combinação destes atributos pode resultar em inibição efetiva da infestação da peste, e no caso de uma peste de planta, na inibição da infestação na planta.

Todos os termos técnicos empregados neste relatório são utilizados comumente em bioquímica, biologia molecular e agricultura; desta forma, são entendidos pelos especialistas no campo ao qual esta invenção pertence. Estes termos técnicos podem ser encontrados, por exemplo, em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook & Russel, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Current Protocols In Molecular Biology, ed. Ausubel e colaboradores, Greene Publishing Associates δε WileyInterscience, New York, 1988 (com atualizações periódicas); Short Protocols In Molecular Biology: A Compendium Of Methods From Current Protocols In Molecular Biology, 5^a ed., vol. 1-2, ed. Ausubel e colaboradores, John Wiley δε Sons, Inc., 2002; Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green e colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997.

Metodologias envolvendo técnicas de biologia vegetal são descritas aqui e também são descritas em detalhes em tratados tais como Methods In Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed. Maliga e colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Várias técnicas que utilizam PCR estão descritas, por exemplo, em Innis e colaboradores, PCR Protocols: A

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Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, 1990 e em Dieffenbach e Dveksler, Per Primer: A Laboratory Manual, 2^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Pares de iniciadores de PCR podem ser obtidos de seqüências por técnicas conhecidas tais como as que utilizam programas de computador destinados a este propósito, por exemplo, Primer, versão 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA. Métodos de síntese química de ácidos nucléicos são discutidas, por exemplo, em Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-62 (1981), e Matteucci & Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981).

Digestões, fosforilações, ligações e transformações com enzima de restrição foram descritas em Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos os reagentes e materiais utilizados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foram obtidos da Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.), DIFCO Laboratories (Detroit, Mich.), Invitrogen (Gaithersburg, Md.), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.), a não ser que diferentemente especificado.

Agrobacterium ou transformação bacteriana: conforme bem conhecido no campo, Agrobacterias que são utilizadas para a transformação de células vegetais são derivados desarmados e virulentos, usualmente, de Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, que contêm um vetor. O vetor tipicamente contém um polinucleotídeo desejado que é localizado entre as extremidades de um T-DNA. Entretanto, qualquer bactéria capaz de transformar uma célula vegetal pode ser utilizada, tal como, Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, Phyllobacterium myrsinacearum, SinoRhízobium meliloti, e MesoRhizobium lotí.

Angiosperma: plantas vasculares apresentando sementes en29/225 capsuladas em um ovário. As angiospermas são plantas sementeiras que produzem flores que produzem frutos. As angiospermas são divididas em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Atividade biológica refere-se ao comportamento biológico e aos efeitos de uma proteína ou peptídeo e suas manifestações em uma peste. Por exemplo, um RNAi inventivo pode evitar a tradução de um mRNA particular, desta forma inibindo a atividade biológica da proteína codificada pelo mRNA ou outra atividade biológica da peste.

No presente Relatório, uma molécula de RNAi pode inibir uma atividade biológica em uma peste, resultando em um ou mais dos seguintes atributos (não se limitando a estes): redução da alimentação por parte da peste, redução da viabilidade da peste, morte da peste, inibição da diferenciação e do desenvolvimento da peste, ausência de reprodução sexual ou capacidade reduzida desta pela peste, formação muscular, formação de hormônio juvenil, regulação do hormônio juvenil, regulação e transporte iônico, manutenção do potencial da membrana celular, biossíntese de aminoácido, degradação de aminoácido, formação de esperma, síntese de feromônio, sensibilidade a feromônio, formação de antena, formação de asa, formação de perna, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação de larva, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo energético, respiração, apoptose, e qualquer componente de uma estrutura citoesquelética de células eucarióticas, tais como, por exemplo, actinas e tubulinas.

Produto de consumo engloba qualquer produto obtido ou de alguma forma derivado de uma planta, incluindo, mas não se limitando a, alimento, ração, fibra, papel, torta, proteína, amido, farinha, silagem, café, chá e óleo.

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DNA complementar (cDNA) refere-se a DNA de fita única sintetizado a partir de um molde de mRNA maduro. Embora existam vários métodos, o cDNA é mais freqüentemente sintetizado a partir de mRNA maduro (completamente dividido), utilizando-se a enzima transcriptase reversa. Esta enzima opera em uma única fita de mRNA, gerando seu DNA complementar com base no pareamento de pares de bases de RNA (A, U, G, C) em seus complementos de DNA (T, A, C, G). Duas fitas de ácido nucléico são substancialmente complementares quando pelo menos 85% de suas bases combinam.

Polinucleotídeo Pretendido: um polinucleotídeo desejado da presente invenção é um elemento genético, tal como um promotor, amplificador, ou terminador, ou gene ou polinucleotídeo que deve ser transcrito e/ou traduzido em uma célula transformante que compreende o polinucleotídeo desejado em seu genoma. Se o polinucleotídeo desejado compreende uma seqüência que codifica um produto protéico, a região de codificação pode ser ligada operativamente a elementos reguladores, tais como um promotor ou um terminador, que possibilitam a expressão de um transcrito de RNA mensageiro associado e/ou um produto protéico codificado pelo polinucleotídeo desejado. Desta forma, um “polinucleotídeo desejado” pode compreender um gene que está operativamente ligado na orientação 5’ para 3’, um promotor, um gene que codifica uma proteína, e um terminador. Alternativamente, o polinucleotídeo desejado pode compreender um gene ou fragmento deste, em uma orientação “senso” e/ou “anti-senso”, a transcrição do qual produz ácidos nucléicos que podem afetar a expressão de um gene endógeno na célula vegetal. Um polinucleotídeo desejado pode também produzir, por transcrição, um RNA de fita dupla, pelo que inicia a interferência de RNA de um gene ao qual o polinucleotídeo desejado está associado. Um polinucleotídeo desejado da presente invenção pode

31/225 ser posicionado em um vetor, de tal forma que as seqüências das extremidades esquerda e direita ou flanqueiam ou estão em qualquer um dos lados do polinucleotídeo desejado. A presente invenção possibilita a integração estável de um ou mais polinucleotídeos desejados no genoma de pelo menos uma célula hospedeira. Um polinucleotídeo desejado pode ser mutante ou uma variante de sua seqüência selvagem. Deve ser entendido que todo ou parte do polinucleotídeo desejado pode ser integrado no genoma de um hospedeiro. Deve ser entendido também que o termo “polinucleotídeo desejado” engloba um ou mais de tais polinucleotídeos. Desta forma, um vetor da presente invenção pode compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais polinucleotídeos desejados.

Planta dicotiledônea (dicot) é uma planta floral cujos embriões apresentam sementes com duas partes ou cotilédones, nervuras foliares de ramificação, e partes florais em múltiplos de quatro ou cinco. Exemplos de dicots incluem, mas sem limitação, Eucalyptus, Populus, Liquidamber, Acacia, teca, mogno, algodão, tabaco, Arabidopsis, tomate, batata, beterraba, brócolis, mandioca, batata doce, pimenta, poinsétia, ervilha, alfafa, soja, cenoura, morango, alface, carvalho, bordo, nogueira, rosa, menta, abobrinha, margarida, gerânio, abacate e cacto.

Exógeno, em relação a um ácido nucléico, significa que este ácido nucléico é derivado de organismos não hospedeiros. De acordo com a presente invenção, DNA ou RNA exógeno representa ácidos nucléicos que são de ocorrência natural na formação genética de fungos, bactérias, vírus, mamíferos, peixes ou pássaros, mas que não são de ocorrência natural no hospedeiro que será transformado. Desta forma, um ácido nucléico exógeno é um que codifica, por exemplo, um polipeptídeo que não é naturalmente produzido pelo hospedeiro transformado. Um ácido nucléico exógeno não necessita codificar uma pro32/225 teína produto.

Fungos ou célula(s) fúngica(s), conforme se utiliza aqui, refere-se a qualquer célula presente em ou derivada de um organismo pertencente ao reino Fungi. Os métodos da invenção são aplicáveis a todos os fungos ou células fúngicas que sejam susceptíveis ao silenciamento genético por interferência de RNA e que sejam capazes de internalizar RNA de fita dupla a partir de seus ambientes imediatos.

Numa modalidade da invenção, o fungo pode ser um bolor, ou mais particularmente um fungo filamentoso. Em outras realizações da invenção, o fungo pode ser uma levedura.

Numa modalidade, o fungo pode ser um fungo ascomiceto, isto é, um fungo pertencente ao filo Ascomycota.

Em realizações e métodos preferidos, mas não limitativos, da invenção, a célula fúngica é selecionada do grupo que consiste em:

Uma célula fúngica ou uma célula derivada de um fungo patogênico de planta, tal como, mas não se limitando a, Acremoniella spp., Allomyces spp., Alternaria spp. (por exemplo, Alternaria brassicola ou Alternaria solani], Amorphothec spp., Ascochyta spp. (por exemplo, Ascochyta pisi], Aspergillius spp., Aureobasidium spp., Blastocladiella spp., Botrytis spp. (por exemplo, Botrytis cinerea ou Bottyotinia fuckeliana), Candida spp., Cladosporium spp., Cercospora spp. (por exemplo, Cercospora kikuchii ou Cercospora zaea-maydis), Chaetomium spp., Cladosporium spp. (por exemplo, Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por exemplo, Colletotrichum lindemuthianum), Coccidioides spp., Conidiobolus spp., Coprinopsis spp., Corynascus spp., Cryphonectria spp., Cryptococcus spp., Cunninghamella spp., Curvularia spp., Debarymyces spp., Diplodia spp. (por exemplo, Diplodia maydis), Emericella spp., Encephalitozoon spp., Eremothecium spp., Erysiphe spp. (por exemplo, Erysiphe graminis fsp. graminis, Erysiphe graminis fsp. hordei

33/225 ou Erysiphe pisi), Erwinia armylovora, Fusarium spp. (por exemplo, Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioid.es, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solam, Fusarium moniliforme ou Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por exemplo, Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Geomyces spp., Gibberella spp. (por exemplo, Gibberella zeae), Gloeophyllum spp., Glomus spp., Helminthosporium spp. (por exemplo, Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporium mavdis ou Helminthosporium sigmoideum), Hypocrea spp., Kluyveromyces spp., Lentinula spp., Leptosphaeria salvinii, Leucosporidium spp., Macrophomina spp. (por exemplo, Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por exemplo, Magnaporthe oryzae), Metharhizium spp., Mucor spp., Mycosphaerella spp., Neurospora spp., Nectria spp. (por exemplo Nectria heamatococca), Ophiostoma spp., Paracocidioides spp, Peronospora spp. (por exemplo, Peronospora manshurica ou Peronospora tabacinà), Phoma spp. (por exemplo, Phoma betae), Phaeopsheria spp., Phanerochaete spp., Phakopsora spp. (por exemplo, Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por exemplo, Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por exemplo, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae ou Phytophthora infestans), Plasmopara spp. (por exemplo, Plasmopara viticola), Pneumocystis spp., Podosphaera spp. (por exemplo, Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por exemplo, Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recôndita ou Puccinia arachidis), Pythium spp. (por exemplo, Pythium aphanidermatum), Pyronema spp., Pyrenophora spp. (por exemplo, Pyrenophora triticirepentens ou Pyrenophora teres), Pyricularia spp. (por exemplo, Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por exemplo, Pythium ultimum), Rhincosporium

34/225 secalis, Rhizoctonia spp. (por exemplo, Rhizoctonia solará, Rhizoctonia oryzae ou Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por exemplo, Rhizopus chinensid), Saccharomyces spp., Scerotium spp. (por exemplo, Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por exemplo, Sclerotinia sclerotiorum), Septoría spp. (por exemplo, Septoría lycopersici, Septoría gly tines, Septoría nodorum ou Septoría trítiti), Spizellomyces spp., Thermomyces spp., Thielaviopsis spp. (por exemplo, Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trametes spp., Trichoderma spp. (por exemplo, Trichoderma vírde), Tríchophyton spp., Untinula spp. (por exemplo, Untinula necatof), Ustilago maydis (por exemplo, carvão do milho) Venturia spp. (por exemplo, Venturia inaequalis ou Venturia pirina), Yarrwia spp. ou VerticilHum spp. (por exemplo, VertitilHum dahliae ou VerticilHum alboatrum).

Gene refere-se a um polinucleotídeo que compreende seqüências de controle e codificação necessárias para a produção de um polipeptídeo ou precursor. O polipeptídeo pode ser codificado por uma seqüência de codificação de comprimento total ou por qualquer parte da seqüência de codificação. Um gene pode ser constituído de uma seqüência de codificação ininterrupta ou pode incluir um ou mais introns, ligados pelas junções apropriadas. Além disto, um gene pode conter uma ou mais modificações tanto na região de codificação quanto na região não traduzida, as quais poderíam afetar a atividade biológica ou a estrutura química do produto da expressão, a taxa de expressão, ou a forma de controle da expressão. Tais modificações incluem, mas sem limitação, mutações, inserções, deleções, e substituições de um ou mais nucleotídeos. Neste sentido, tais genes modificados podem ser chamados de “variantes” do gene “nativo”.

Elemento genético é qualquer seqüência de nucleotídeos discreta tal como, mas não se limitando a, um promotor, gene, termina35/225 dor, intron, amplificador, espaçador, região 5’ não traduzida, região 3’ não traduzida, ou sítio de reconhecimento de recombinase.

Modificação genética refere-se à introdução estável de DNA no genoma de certos organismos pela aplicação de métodos de biologia molecular e celular.

“Supressão genética” ou “sub-regulação da expressão genética” ou “inibição da expressão genética” são utilizadas indiferentemente entre si e referem-se a uma redução mensurável ou observável na expressão genética ou uma completa abolição de expressão genética detectável, no nível de proteína produto e/ou produto de mRNA a partir do gene alvo. A sub-regulação ou inibição da expressão genética é “específica” se a sub-regulação ou inibição do gene alvo ocorre sem efeitos manifestos sobre outros genes da peste.

Dependendo da natureza do gene alvo, a sub-regulação ou inibição da expressão genética em células de uma peste pode ser confirmada por análise fenotípica da célula ou da peste como um todo ou por determinação da expressão do mRNA ou proteína utilizando-se técnicas moleculares tais como hibridização de RNA em solução, proteção de nuclease, hibridização Northern, transcrição reversa, monitoramento da expressão genética com um micro-arranjo, ligação a anticorpo, ensaio por enzimas imunoadsorvidas (ELISA), Western blotting, radioimunoensaio (RIA), outros ensaios imunológicos, ou análise celular ativada por fluorescência (FACS).

Gimnosperma, conforme se utiliza aqui, refere-se a uma planta sementeira que apresenta semente sem ovários. Exemplos de gimnospermas incluem coníferas, cicadáceas, ginkgos e efedras.

Homologia, conforme se utiliza aqui, refere-se a seqüências. Proteína, ou seqüências de nucleotídeos são consideradas como homólogas se mostram um nível “significativo” de similaridade de seqüência

36/225 ou mais preferivelmente de identidade de seqüência. Seqüências verdadeiramente homólogas estão relacionadas por divergência de um gene ancestral em comum. Seqüências homólogas podem ser de dois tipos: (i) quando existem homólogos em espécies diferentes, são conhecidos como ortólogos, por exemplo, os genes de α-globina em camundongo e seres humanos são ortólogos; (ii) parálogos são genes homólogos dentro de uma mesma espécie, por exemplo, os genes da α e da β globinas em camundongo são parálogos.

Célula hospedeira refere-se a um microrganismo, a uma célula procariótica, a uma célula eucariótica, ou a uma linhagem de célula cultivada como uma entidade unicelular que pode ser, ou foi, utilizada como recipiente para um vetor recombinante ou outro vetor de transferência de polinucleotídeos, e inclui a progênie da célula original que foi transfectada. A progênie de uma célula única não precisa necessariamente ser completamente idêntica no que diz respeito à morfologia ou à genômica ou no complemento do DNA total, à parental devido a mutação natural, acidental ou deliberada.

Inseto, conforme se utiliza aqui, pode ser qualquer inseto, o que significa qualquer organismo pertencente ao reino animal, mais especificamente ao filo Arthropoda, e à classe Insecta ou à classe Arachnida. Os métodos da invenção são aplicáveis a todos os insetos e que sejam susceptíveis ao silenciamento genético por interferência de RNA e que sejam capazes de internalizar RNA de fita dupla a partir de seus ambientes imediatos.

Numa modalidade a invenção, o inseto pode pertencer às seguintes ordens: Acari, Araneae, Anoplura, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Giylloblatodea, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera,

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Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera, e Zoraptera.

Em realizações e métodos preferidos, mas não limitativos, da invenção, o inseto é escolhido do grupo que consiste em:

Um inseto que é uma peste de planta, tal como, mas não se limitando a, Nilaparvata spp. (por exemplo, N. lugens (cigarrinha marrom)); Laodelphax spp. (por exemplo, L. striatellus (cigarrinha marrom pequena)); Nephotettix spp. (por exemplo, N. virescens ou N. cincticeps (cigarrinha verde), ou N. nigropictus (cigarrinha do arroz)); Sogatella spp. (por exemplo, S. furcifera (cigarrinha de dorso branco)); Blissus spp. (por exemplo, B. leucopterus leucopterus (percevejo)); Scotmophora spp. (por exemplo, S. vermidulate (percevejo preto do arroz)); Acrostemum spp. (por exemplo, A. hilare (percevejo do mato verde)); Pamara spp. (por exemplo, P. guttata (bicho do arroz)); Chilo spp. (por exemplo, C. suppressalis (broca do colmo de arroz rajada), C. auricilius (broca do colmo dourada), ou C. polychrysus (broca do colmo de cabeça preta)); Chilotraea spp. (por exemplo, C. polychrysa (broca do talo de arroz)); Sesamia spp. (por exemplo, S. inferens (broca do arroz rosada)); Tryporyza spp. (por exemplo, T. innotata (broca do arroz branca), ou T. incertulas (broca do arroz amarela)); Cnaphálocrocis spp. (por exemplo, C. medinalis (lagarta enroladeira do arroz)); Agromyza spp. (por exemplo, A. oryzae (bicho mineiro), ou A. parvicomis (traça da mancha do milho)); Diatraea spp. (por exemplo, D. saccharalis (broca da cana-de-açúcar), ou D. grandiosella (broca do milho do sudoeste)); Namaga spp. (por exemplo, N. aenescens (lagarta verde do arroz)); Xanthodes spp. (por exemplo, X. transversa (lagarta verde)); Spodoptera spp. (por exemplo, S. frugiperda (lagarta-do-cartucho de outono), S. exígua (lagarta-do-cartucho da beterraba), S. littoralis (lagarta trepadeira) ou S. praefica (lagarta-docartucho rajada de amarelo do oeste)); Mythimna spp. (por exemplo,

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Mythmna (Pseudaletia) seperata (lagarta-do-cartucho)); Helicoverpa spp. (por exemplo, H zea (lagarta da espiga)); Colaspis spp. (por exemplo, C. brunnea (colaspis da uva)); Lissorhoptrus spp. (por exemplo, L. oryzophilus (gorgulho do arroz)); Echinocnemus spp. (por exemplo, E. squamos (gorgulho do arrozal)); Diclodispa spp. (por exemplo, D. armigera (hispa do arroz)); Oulema spp. (por exemplo, O. oryzae (besouro da folha); Sitophilus spp. (por exemplo, S. oryzae (gorgulho do arroz)); Pachydiplosis spp. (por exemplo, P. oryzae (mosquito da galha do arroz)); Hydrellia spp. (por exemplo, H. griseola (bicho mineiro do arroz pequeno), ou H.

sasákii (percevejo do colmo do arroz)); Chlorops spp. (por exemplo, C. oryzae (percevejo do colmo)); Ostrinia spp. (por exemplo, O. nubilalis (broca do milho européia)); Agrotis spp. (por exemplo, A. ipsílon (lagarta preta)); Elasmopalpus spp. (por exemplo, E. lignosellus (broca do caule do milho pequena)); Melanotus spp. (verme-arame); Cyclocephala spp.

(por exemplo, C. borealis (escaravelho mascarado do norte), ou C. immaculata (escaravelho mascarado do sul)); Popillia spp. (por exemplo,

P. japonica (besouro japonês)); Chaetocnema spp. (por exemplo, C. pulicaria (besouro do milho)); Sphenophorus spp. (por exemplo, S. maidis (“billbug” do milho)); Rhopalosiphum spp. (por exemplo, R. maidis (pulgão da folha de milho)); Anuraphis spp. (por exemplo, A. maidiradicis (pulgão da raiz de milho)); Melanoplus spp. (por exemplo, M. femurrubrum (gafanhoto de perna vermelha) M. differentialis (gafanhoto diferencial) ou M. sanguinipes (gafanhoto migratório)); Hylemya spp. (por exemplo, H platura (larva da semente de milho)); Anaphothrips spp. (por exemplo, A. obscrurus (tripés do gramado)); Solenopsis spp. (por exemplo, S. milesta); ou spp. (por exemplo, T. urticae (ácaro rajado), T. cinnabarinus (ácaro rajado carmim); Helicoverpa spp. (por exemplo, H. zea (lagarta do algodão), ou H. armigera (lagarta americana)); Pectinophora spp. (por exemplo, P. gossypiella (lagarta-rosada)); Earias spp.

39/225 (por exemplo, E. vittella (lagarta manchada)); Heliothis spp. (por exemplo, H. virescens (lagarta do botão de tabaco)); Anthonomus spp. (por exemplo, A grandis (bicudo)); Pseudatomoscelis spp. (por exemplo, P. seriatus (cigarrinha do algodão)); Trialeurodes spp. (por exemplo, T.

abutiloneus (mosca branca), T. vaporariorum (mosca branca de estufa)); Bemisia spp. (por exemplo, B. argentifolíi (mosca branca de asa preateada)); Aphis spp. (por exemplo, A. gossypii (pulgão do algodão), A. mellifera); Lygus spp. (por exemplo, L. lineolaris (besouro de planta descorado) ou L. hesperus (besouro de planta descorado do oeste)); Euschistus spp.

(por exemplo, E. conspersus (percevejo do mato consperse)); Chlorochroa spp. (por exemplo, C. sayi (percevejo do mato Say)); Nezara spp. (por exemplo, N. viridula (percevejo do mato verde do sul)); Thrips spp. (por exemplo, T. tabaci (tripés da cebola)); Frankliniella spp. (por exemplo, F. fusca (tripés do tabaco), ou F. ocddentalis (tripés foliar do oeste));

Leptinotarsa spp. (por exemplo, L. decemlineata (besouro da batata do Colorado), L. juncta (besouro da batata falso), ou L. texana (besouro da batata falso Texano)); Lema spp. (por exemplo, L. trilineata (besouro da batata trilineado)); Epitrix spp. (por exemplo, E. cucumeris (besouro da batata), E. hirtipennis (besouro saltador), ou E. tuberis (besouro saltador do tubérculo)); Epicauta spp. (por exemplo, E. vittata (burrinho listrado)); Empoasca spp. (por exemplo, E. fabae (cigarrinha da batata)); Myzus spp. (por exemplo, M. persicae (pulgão verde)); Paratrioza spp. (por exemplo, P. cockerelli (psilídeo)); Conoderus spp. (por exemplo, C. falli (verme-arame da batata do sul), ou C. vespertinus (verme-arame do tabaco)); Phthorímaea spp. (por exemplo, P. operculella (verme do tubérculo da batata)); Macrosiphum spp. (por exemplo, M. euphorbiae (pulgão da batata)); Thyanta spp. (por exemplo, T. pallidovirens (percevejo do mato vermelho)); Phthorímaea spp. (por exemplo, P. operculella (verme do tubérculo da batata)); Helicoverpa spp. (por exemplo, H. zea

40/225 (verme da fruta do tomateiro); Keiferia spp. (por exemplo, K. lycopersicella (oxiúro do tomateiro)); Limonius spp. (verme-arame); Manduca spp. (por exemplo, M. sexta (verme do tabaco), ou M. quinquemaculata (verme do tomateiro)); Liriomyza spp. (por exemplo, L. sativae, L. trifolli ou L.

huidobrensis (traça)); Drosophilla spp. (por exemplo, D. melanogaster, D. yakuba, D. pseudoobscura ou D. simulans); Carabus spp. (por exemplo, C. granulatus); Chironomus spp. (por exemplo, C. tentanus); Ctenocephalides spp. (por exemplo, C. fetis (pulga de gato)); Diaprepes spp. (por exemplo, D. abbreviatus (gorgulho da raiz)); Ips spp. (por exemplo, I. pini (bicho gravador do pinheiro)); Tribolium spp. (por exemplo, T. castaneum (besouro castanho da farinha)); Glossina spp. (por exemplo, G. morsitans (mosca tsetse)); Anopheles spp. (por exemplo, A. gambiae (mosquito da malaria)); Helicoverpa spp. (por exemplo, H. armigera (lagarta africana)); Acyrthosiphon spp. (por exemplo, A. pisum (pulgão da ervilha)); Apis spp.

(por exemplo, A. melifera (abelha)); Homalodisca spp. (por exemplo, H. coagulate (cigarrinha da asa vítrea)); Aedes spp. (por exemplo, Ae. aegypti (mosquito da febre amarela)); Bombyx spp. (por exemplo, B. mori (bicho-da-seda), B. mandarina); Locusta spp. (por exemplo, L. migratória (gafanhoto peregrino)); Boophilus spp. (por exemplo, B. microplus (carrapato de gado)); Acanthoscurria spp. (por exemplo, A. gomesiana (aranha caranguejeira vermelha)); Diploptera spp. (por exemplo, D. punctata (barata do Pacífico)); Heliconius spp. (por exemplo, H. erato (borboleta vermelha do maracujá) ou H. melpomene (borboleta postman)); Curculio spp. (por exemplo, C. glandium (gorgulho da bolota de carvalho)); Plutella spp. (por exemplo, P. xylostella (traça das crucíferas)); Amblyomma spp. (por exemplo, A. variegatum (carrapato de gado)); Anteraea spp. (por exemplo, A. yamamai (mariposa-da-seda)); Bélgica spp. (por exemplo, B. antartica), Bemisa spp. (por exemplo, B. tabací), Bicyclus spp., Biphillus spp., Callosobruchus spp., Choristoneura spp.,

Μ

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Cicindela spp., Culex spp., Culicoid.es spp., Diaphorina spp., Diaprepes spp., Euclidia spp., Glossina spp., Gryllus spp., Hydropsyche spp., Julodis spp., Lonomia spp., Lutzomyia spp., Lysiphebus spp., Meladema spp., Mycetophagus spp., Nasonia spp., Oncometopia spp., Papílio spp., Pediculus spp., Plodia spp., Rhynchosciara spp., Sphaerius spp., Toxoptera spp., Trichoplusa spp., e Armigeres spp. (por exemplo, A. subalbatus).

“Agente de controle de peste” ou “agente de supressão genética” referem-se a uma molécula de RNA particular compreendendo um primeiro segmento de RNA e um segundo segmento de RNA, onde a complementaridade entre o primeiro e o segundo segmentos resulta na capacidade dos dois segmentos se hibridizarem in vivo e in vitro para formar uma molécula de fita dupla. Em geral, pode ser preferível incluir um terceiro segmento de RNA ligando e estabilizando a primeira e a segunda seqüências, de tal forma que um tronco unido pode ser formado em uma extremidade de cada um dos primeiro e segundo segmentos pelo terceiro segmento formando uma alça, de tal forma que a estrutura inteira se forma em uma estrutura em tronco e alça, ou as estruturas hibridizadas ainda mais firmemente podem se formar em uma estrutura tronco-alça com nós. Alternativamente, um grampo de cabelo simétrico pode ser formado sem um terceiro segmento no qual não se forma qualquer alça, no entanto por razões estéricas, um grampo de cabelo poderia criar sua própria alça quando o tronco é longo o suficiente para se estabilizar a si próprio. O primeiro e o segundo segmentos de RNA, em geral, recairão no comprimento da molécula de RNA e podem ser substancialmente repetições invertidas entre si e unidas pelo terceiro segmento de RNA. Os primeiro e o segundo segmentos correspondem invariavelmente e não respectivamente a uma seqüência senso e a uma seqüência anti-senso em relação

42/225 ao RNA alvo transcrito a partir do gene alvo no inseto peste alvo que é suprimido pela ingestão da molécula de dsRNA.

O agente de controle de peste pode ser também uma molécula de ácido nucléico substancialmente purificada (ou isolada) e mais especificamente moléculas de ácido nucléico ou fragmentos moleculares de ácido nucléico a partir de um DNA genômico (gDNA) ou biblioteca de cDNA. Alternativamente, os fragmentos podem compreender oligonucleotídeos menores apresentando de cerca de 15 a cerca de 250 resíduos de nucleotídeo, e mais preferivelmente, de cerca de 15 a cerca de 30 resíduos de nucleotídeo.

Introdução, conforme se utiliza aqui, refere-se à inserção de uma seqüência de ácidos nucléicos em uma célula por métodos incluindo infecção, transfecção, transformação ou transdução.

Planta monocotiledônea (monocot) é uma planta floral apresentando embriões com um cotilédone ou folha semente, nervuras foliares paralelas, e partes florais em múltiplo de três. Exemplos de monocots incluem, mas sem limitação, gramas, milho, arroz, aveia, trigo, cevada, sorgo, orquídea, íris, lírio, cebola e palmeiras.

Nematódeos ou nematelmintos são um dos mais comuns filos de animais, com mais de 20.000 espécies diferentes descritas (mais de 15.000 são parasíticas). Estão onipresentes na água doce, no mar e no meio ambiente terrestre, onde freqüentemente superam em número outros animais tanto em contagem individual quanto em espécies, e são encontrados em locais tão diversos quanto a Antártida e caminhos oceânicos. Além disto, existem em muitas formas parasíticas, incluindo patógenos na maioria das plantas e animais.

Os métodos da invenção são aplicáveis a todos os nematódeos que são susceptíveis de silenciamento genético por interferência de RNA e que são capazes de internalizar RNA de fita dupla a partir de seus

43/225 ambientes imediatos.

Numa modalidade da invenção, o nematódeo pode pertencer à família Heteroderidae, englobando o gênero Heterodera e Globodera.

Em realizações e métodos preferidos, mas não limitativos, da invenção, o inseto é escolhido do grupo compreendendo, mas não se limitando a: Meloidogyne spp. (por exemplo, M. incógnita, M. javanica, M. graminicola, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla ou M. pamnaensis); Heterodera spp. (por exemplo, H. oryzae, H. glycines, H. zeae ou H. schachtii); Globodera spp. (por exemplo, G. pallida ou G. rostochiensis); Rotylenchulus spp. (por exemplo, R. reniformis); Pratylenchus spp. (por exemplo, P. coffeae, P. Zeae ou P. goodeyi); Radopholus spp. (por exemplo, R. similis); Hirschmaniella spp. (por exemplo, H. oryzae); Ancylostoma spp. (por exemplo, A. caninum, A. ceylanicum, A. duodenale ou A. tubaeforme); Anisakíd; Aphelenchoides spp. (por exemplo, A. Besseyi); Ascarids; Ascaris spp., (por exemplo, A. suum ou A. lumbridoides); Belonolaimus spp.; Brugia spp. (por exemplo, B. tnalayi ou B. pahangí); Bursaphelenchus spp.; Caenorhabditis spp. (por exemplo, C. elegans, C. briggsae ou C. remanei); Clostridium spp. (por exemplo, C. acetobutylicum); Cooperia spp. (por exemplo, C. oncophora); Criconemoides spp.; Cyathostomum spp. (por exemplo, C. catinatum, C. coronatum ou C. pateratum); Cylicocyclus spp. (por exemplo, C. insigne, C. nassatus ou C. radiatus); Cylicostephanus spp. (por exemplo, C. goldi ou C. longibursatus); Diphyllobothrium; Dirofilaria spp. (por exemplo, D. immitis); Ditylenchus spp. (por exemplo, D. dipsaci, D. destructor ou D. Augustus); Enterobius spp. (por exemplo, E. vermicularis); Haemonchus spp. (por exemplo, H. contortus); Helicotylenchus spp.; Hoplolaimus spp.; Litomosoides spp. (por exemplo, Z,. sigmodontis); Longidorus spp. (por exemplo, Z. macrosoma); Necator spp. (por exemplo, N. americanus); Nippostrongylus spp. (por exemplo, N. brasiliensis); Onchocerca spp. (por exemplo,

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O. volvulus); Ostertagia spp. (por exemplo, O. ostertagi); Parastrongyloides spp. (por exemplo, P. trichosuri); Paratrichodorus spp. (por exemplo,

P. minor ou P. teres); Parelaphostrongylus spp. (por exemplo, P. tenuis); Radophulus spp.; Scutellonema. spp.; Strongyloides spp. (por exemplo,

S. Ratti ou S. stercoralis); Teladorsagia spp. (por exemplo, T. circumcincta); Toxascaris spp. (por exemplo, T. leonina); Toxocara spp. (por exemplo, T. canis ou T. cati); Trichinella spp. (por exemplo, T. britovi, T. spirális ou T. spirae); Trichodorus spp. (por exemplo, T. similis); Trichuris spp. (por exemplo, T. muris, T. vulpis ou T. trichiura); Tylenchulus spp.; Tylenchorhynchus spp.; Uncinaria spp. (por exemplo, U. stenocephala); Wuchereria spp. (por exemplo, W. bancrofti); Xiphinema spp. (por exemplo, X. Index ou X. americanum).

Os nematódeos parasíticos de planta causam graves perdas em cultivos. Os gêneros mais comuns são: Aphelenchoides (nematódeos foliares), Meloidogyne (nematódeos do nó radicular), Heterodera, Globodera (nematódeos do cisto) tal como nematódeo da raiz de batata, Nacobbus, Pratylenchus (nematódeos de lesão), Ditylenchus, Xiphinema, Longidorus, Trichodorus. Outros nematódeos atacam árvores de corte e florestais. O mais importante representante deste grupo é o Bursaphelenchus xylophilus, o nematódeo do pinheiro, presente na Ásia e na América e recentemente descoberto na Europa.

Célula normal refere-se a uma célula de um fenótipo não transformado ou exibindo uma morfologia de uma célula não transformada do tipo de tecido em exame.

Ligado operativamente significa a combinação de duas ou mais moléculas de uma forma tal que na combinação estas funcionam apropriadamente em uma célula vegetal. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado e um gene estrutural quando o promotor controla a transcrição do gene estrutural.

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Ortólogos são genes que estão relacionados por descendência vertical de um ancestral em comum e que codifica proteínas com a mesma função em diferentes espécies. Devido à sua separação seguinte a um evento de especificação, os ortólogos podem divergir, no entanto, usualmente, apresentam similaridade na seqüência e a níveis estruturais. Dois genes que são derivados de um ancestral comum e que codificam proteínas com função similar são chamados de ortólogos. A identificação de ortólogos é crítica para previsões confiáveis da função genética em genomas recentemente seqüenciados.

Peste ou peste alvo inclui, mas sem limitação, insetos, aracnídeos, crustáceos, fungos, bactérias, vírus, platelmintos, nematelmintos, oxiúros, ancilóstomos, tênias, tripanossomos, esquistossomos, moscasdo-berne, pulgas, carrapatos, ácaros e piolhos, que são disseminados no ambiente humano e que causam danos às plantas. Uma peste pode ingerir ou entrar em contato com uma ou mais células, tecidos, ou produtos produzidos por uma planta transformada com um agente de supressão genética de fita dupla.

Pesticida refere-se a qualquer substância ou mistura de substâncias destinadas à prevenção, destruição, repelir, ou reduzir qualquer peste. Um pesticida pode ser uma substância química ou um agente biológico, tal como uma planta transgênica, utilizado contra pestes incluindo insetos, patógenos de plantas, ervas daninhas, nematódeos, e micróbios que competem com seres humanos por alimento, destroem propriedade, disseminam doenças, ou são incômodos.

Fenótipo é uma característica distintiva de uma planta, o qual pode ser alterado de acordo com a presente invenção pela integração de um ou mais “polinucleotídeos desejados” e/ou marcadores selecionáveis no genoma de pelo menos uma célula vegetal de uma planta transformada. O(s) “polinucleotídeo(s) desejado(s)” e/ou marcadores podem

46/225 conferir uma alteração no fenótipo de uma planta transformada, pela modificação de qualquer um de um número de características ou propriedades genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas ou agronômicas da célula vegetal ou planta inteira transformadas. Desta forma, a expressão de um ou mais polinucleotídeos desejados integrados de forma estável em um genoma vegetal, pode gerar um fenótipo selecionado do grupo que consiste em, mas não se limitando a, tolerância aumentada a doença, tolerância a inseto aumentada, tolerância à seca aumentada, tolerância ao frio e a geada aumentada, vigor aumentado, cor aperfeiçoada, características de saúde e nutricionais aumentadas, armazenamento aperfeiçoado, rendimento aumentado, tolerância à salinidade aumentada, tolerância a metais pesados aumentada, tolerância a estresse hídrico aumentada, quantidade de açúcares aumentada, vigor aumentado, sabor aperfeiçoado, textura aperfeiçoada, teor de fosfato reduzido, germinação aumentada, absorção de micronutrientes aumentada, composição de amido aperfeiçoada, e longevidade floral aumentada.

Tecido vegetal: uma “planta” é qualquer um de vários organismos fotossintéticos, eucarióticos, multicelulares do reino Plantae que caracteristicamente produzem embriões, contendo cloroplastos e apresentando paredes celulares de celulose. Uma parte de uma planta, isto é, um “tecido vegetal” pode ser tratado de acordo com os métodos da presente invenção para produzir uma planta transgênica. Muitos tecidos vegetais adequados podem ser transformados de acordo com a presente invenção e incluem, sem limitação, embriões somáticos, pólen, folhas, caules, calos, estolhos, micro-tubérculos, e brotações. Desta forma, a presente invenção está direcionada para a transformação de plantas angiospermas e gimnospermas tais como acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas,

47/225 beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couverábano, lariço, alface, alho-porro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre, abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

De acordo com a presente invenção “tecido vegetal” engloba também células vegetais. As células vegetais incluem culturas em suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotações, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes e micrósporos. Os tecidos vegetais podem estar em vários estágios de maturidade e podem ser crescidos em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou meio adequado em vasos, estufas ou campos. Um tecido vegetal refere-se também a qualquer clone de tal planta, semente, progênie, propágulo gerado sexualmente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer um destes, tais como mudas ou sementes.

Transformação vegetal e cultura de célula: refere-se de maneira ampla ao processo pelo qual células vegetais são geneticamente modificadas e transferidas para um meio de cultura vegetal apropria48/225 do para a manutenção, crescimento e/ou desenvolvimento posteriores. Tais métodos são bem conhecidos do especialista na técnica.

Progênie: uma “progênie” da presente invenção, tal como a progênie de uma planta transgênica, é uma que é nascida, gerada, ou derivada de uma planta ou planta transgênica. Desta forma, uma planta “progênie”, isto é, uma planta de geração “Fl” uma prole ou uma descendente da planta transgênica produzida pelos métodos da invenção. Uma progênie de uma planta transgênica pode conter em pelo menos um, alguns ou todos seus genomas, o polinucleotídeo desejado que foi integrado em uma célula da planta transgênica parental pelos métodos descritos aqui. Desta forma, o polinucleotídeo desejado é “transmitido” ou “herdado” pela progênie. O polinucleotídeo desejado que é herdado na progênie pode consistir em uma construção de TDNA, a qual é também herdada pela progênie de seu parental. O termo “progênie”, conforme utilizado aqui, pode ser considerado também como sendo a prole ou descendente de um grupo de plantas.

Promotor: promotor significa um ácido nucléico, preferivelmente DNA, que liga RNA polimerase e/ou outros elementos reguladores de transcrição. Tal como com qualquer promotor, os promotores da presente invenção facilitam ou controlam a transcrição de DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que está operativamente ligada ao promotor. Conforme afirmado anteriormente, o RNA gerado pode codificar uma proteína ou polipeptídeo ou pode codificar um RNA de interferência, ou molécula anti-senso.

Um promotor vegetal é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais sua origem sendo ou não uma célula vegetal. Promotores vegetais típicos incluem, mas sem limitação, os que são obtidos a partir de plantas, vírus de plantas, e bactérias tais como

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Agrobacterium ou Rhizobium, que compreendem genes expressos em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como xilema, folhas, raízes ou sementes. Tais promotores são conhecidos como promotores preferidos de tecidos. Promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são conhecidos como promotores tecido-específicos. Um promotor específico para um tipo de célula aciona a expressão principalmente em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas, por exemplo, um promotor específico de raiz. Um promotor indutível ou repressível é um promotor que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Promotores tecido-específicos, preferidos de tecidos, específico para tipo de célula e indutíveis constituem a classe dos promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que está ativo sob a maioria das condições ambientais, e na maioria das partes de plantas.

Polinucleotídeo é uma seqüência de nucleotídeos compreendendo uma seqüência de codificação genética ou um fragmento desta, um promotor, um intron, uma região amplificadora, um sítio de poliadenilação, um sítio de início de tradução, regiões não traduzidas 5’ ou 3’, um gene repórter, um marcador de selecionável ou semelhantes. O polinucleotídeo pode constituir um DNA ou RNA de fita única ou dupla. O polinucleotídeo pode compreender bases modificadas ou uma cadeia modificada. O polinucleotídeo pode ser genômico, um transcrito de RNA (tal como um mRNA) ou uma seqüência de nucleotídeos processada (tal como um cDNA). O polinucleotídeo pode compreender uma seqüência na orientação tanto senso quanto anti-senso.

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Um polinucleotídeo isolado é uma seqüência de polinucleotídeo que não está em seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotídeo é compreendido de uma seqüência de nucleotídeos não encontrada na natureza ou o polinucleotídeo é separado das seqüências de polinucleotídeo com as quais tipicamente está em proximidade ou está próximo a seqüências de nucleotídeos com as quais não está tipicamente em proximidade.

Seqüência de nucleotídeos recombinante refere-se a uma molécula de ácido nucléico que contém uma modificação geneticamente engenheirada através da manipulação por mutagênese, enzimas de restrição e outros.

RNA de interferência (RNAi) refere-se à supressão da expressão genética específica de seqüência ou específica de gene (síntese de proteína) que é mediada por RNA de interferência curto (siRNA).

Semente: uma “semente” pode ser encarada como um óvulo vegetal maduro contendo um embrião, e uma parte de propagação de uma planta, tal como um tubérculo ou esporo. Uma semente pode ser incubada antes da transformação mediada por microrganismo, no escuro, por exemplo, para facilitar a germinação. A semente pode também ser esterilizada antes da incubação, tal como por tratamento breve com lixívia. A muda resultante pode então ser exposta a uma bactéria desejada para a transformação.

Marcador selecionável: um gene que, se expresso em plantas ou tecidos vegetais, torna possível distinguir estas plantas ou tecidos vegetais de outras plantas ou tecidos vegetais que não expressam este gene. Procedimentos de varredura podem requerer ensaios para a expressão de proteínas codificadas pelo gene marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem o gene da neomicina fosfotransferase (ΝΡΤΏ) que codifica resistência a kanamicina e geneti51/225 cina, o gene da higromicina fosfotransferase (HPT ou APHIV} que codifica resistência a higromicina, ou outros genes similares conhecidos na técnica.

Identidade de seqüência: conforme se utiliza aqui, “identidade 5 de seqüência” ou “identidade” no contexto de duas seqüências de ácidos nucléicos incluem os resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima em uma região especificada. Quando as seqüências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Seqüências que diferem por tais substituições conservativas são ditas apresentarem “similaridade de seqüência” ou “similaridade”. Os meios para se fazer este ajuste são bem conhecidos do especialista na técnica.

Conforme se utiliza aqui, percentagem de identidade de seqüên15 cia significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências alinhadas idealmente por uma janela de comparação, onde a parte da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços) quando em comparação com a seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) no alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais ocorrem os ácidos nucléicos básicos idênticos em ambas as seqüências para produzir o número de posições que combinam, dividindo o número de posições que combinam pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência.

“Identidade de seqüência” tem um significado reconhecido na técnica e pode ser calculada utilizando-se técnicas publicadas. Ver Computationál Molecular Biology, Lesk, ed. (Oxford University Press,

52/225

1988), Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, ed. (Academic Press, 1993), Computer Analysis Of Sequence Data, PARTE I, Griffin & Griffin, eds., (Humana Press, 1994), Sequence Analysis In Molecular Biology, Von Heinje ed., Academic Press (1987), Sequence Analysis Primer, Gribskov & Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991), e Carillo 85 Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Os métodos comumente empregados para a determinação da identidade ou similaridade entre duas seqüências incluem, mas sem limitação, os descritos no Guide To Huge Computers, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) e Carillo 85 Lipton, supra. Os métodos para a determinação da identidade e similaridade estão codificados em programas de computador. Métodos de programa de computador preferidos para a determinação da identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, mas sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux e colaboradores, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTN, FASTA (Atschul e colaboradores, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)) e FASTDB (Brutlag e colaboradores, Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)).

RNA em grampo curto (shRNA) são RNAs curtos de fita simples apresentando um alto grau de estrutura secundária, de tal forma que uma parte da fita de RNA forma uma alça em grampo.

RNA de interferência curto (siRNA) refere-se a moléculas de RNA de fita dupla de cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento que são nomeadas por sua capacidade em interferir especificamente com a expressão de proteína por um gene.

Seqüência alvo refere-se a uma seqüência de nucleotídeos em uma peste que é selecionada para supressão ou inibição por tecnologia de RNA de fita dupla. Uma seqüência alvo codifica uma característica essencial ou atividade biológica da peste.

Terminadores de transcrição: as construções de DNA da

53/225 presente invenção tipicamente apresentam uma região de terminação de transcrição na extremidade oposta à região reguladora do início da transcrição. A região de terminação de transcrição pode ser selecionada, para a estabilidade do mRNA, para aumentar a expressão e/ou para a adição de caudas de poliadenilação adicionadas ao produto de transcrição do gene. A tradução de um polipeptídeo nascente é submetida a terminação quando qualquer um dos três códons de terminação de cadeia entra no sítio A do ribossomo. Os códons de terminação de tradução são UAA, UAG e UGA.

DNA de transferência (T-DNA): um T-DNA bacteriano é um elemento genético que é bem conhecido como um elemento capaz de integrar uma seqüência de nucleotídeos contida em suas bordas em um outro genoma. A este propósito, um T-DNA é flanqueado, tipicamente, por duas seqüências de “borda”. Um polinucleotídeo desejado da presente invenção e um marcador selecionável podem ser posicionados entre a seqüência da borda esquerda e a seqüência da borda direita de um T-DNA. O polinucleotídeo desejado e o marcador selecionável contidos no t-DNA podem ser ligados operativamente a uma variedade de ácidos nucléicos específicos de planta (isto é, nativos) ou a ácidos nucléicos exógenos, como promotores e elementos reguladores de terminação que facilitam sua expressão, isto é, a transcrição e/ou tradução da seqüência de DNA codificada pelo polinucleotídeo desejado ou marcador selecionável.

Transformação de células vegetais: um processo pelo qual um ácido nucléico é inserido de forma estável no genoma de uma célula vegetal. A transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais utilizando-se vários métodos bem conhecidos na técnica. A transformação pode ser baseada em qualquer método conhecido para a inserção de seqüências de ácidos nucléicos em uma célula hospedeira

54/225 procariótica ou eucariótica, incluindo protocolos de transformação mediada por Agrobacterium, tais como “transformação de refino” ou “melhoramento preciso”, infecção viral, “whiskers”, eletroporação, micro-injeção, tratamento com polietilenoglicol, choque térmico, lipofecção e bombardeamento de partícula.

Planta transgênica: uma planta transgênica da presente invenção é uma que compreende pelo menos um genoma celular no qual um ácido nucléico exógeno foi integrado de forma estável. De acordo com a presente invenção, uma planta transgênica é uma planta que compreende apenas uma célula geneticamente modificada e genoma celular, ou é uma planta que compreende algumas células geneticamente modificadas, ou é uma planta na qual todas as células são geneticamente modificadas. Uma planta transgênica da presente invenção pode ser uma que compreende a expressão do polinucleotídeo desejado, isto é, o ácido nucléico exógeno, em apenas algumas partes da planta. Desta forma, uma planta transgênica pode conter apenas células geneticamente modificadas em algumas partes de sua estrutura.

Variante: uma “variante”, tal como se utiliza aqui, significa uma seqüência de nucleotídeos que se desvia do padrão, ou de uma dada seqüência de nucleotídeos de um gene particular. Os termos “isoforma”, “isotipo” e “análogo” referem-se também a formas “variantes” de uma seqüência de nucleotídeos. Uma seqüência de nucleotídeos que é alterada pela adição, remoção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, pode ser considerada como uma seqüência “variante”. “Variante” pode se referir também a um “shuffled gene⁰ tal como os descritos nas patentes da Maxygen.

Deve ser entendido que a presente invenção não se limita à metodologia, protocolos, vetores e reagentes, etc. Em particular descritos aqui, na medida em que podem variar. Deve ser entendido também

55/225 que a terminologia utilizada aqui é utilizada apenas com o propósito de se descrever realizações particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção. Deve ser observado que, conforme se utiliza aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um(a)”, “o” e “a” incluem os plurais, a não ser que o contexto claramente dite em contrário. Desta forma, por exemplo, uma referência a “um gene” é uma referência a um ou mais genes e inclui equivalentes deste conhecidos dos especialistas na técnica e assim em diante.

I - Pestes Alvo

A presente invenção provê metodologia e construção para o controle de infestações por pestes pela administração a uma peste de uma seqüência de codificação que reprime ou inibe após a transcrição uma função biológica essencial na peste. Conforme utilizado aqui, o termo “peste” refere-se a insetos, aracnídeos, crustáceos, fungos, bactérias, vírus, nematódeos, platelmintos, nematelmintos, oxiúros, ancilóstomos, tênias, tripanossomos, esquistossomos, moscas-doberne, pulgões, carrapatos, ácaros e piolhos e semelhantes que são difundidos em humanos, animais e plantas. Uma peste pode ingerir ou entrar em contato com uma ou mais células, tecidos ou produtos produzidos por uma planta transformada com um agente de supressão de gene de fita dupla.

Uma característica de “resistência a peste” é uma característica de uma planta hospedeira transgênica que faz com que a planta seja resistente ao ataque de uma peste que tipicamente é capaz de causar danos ou perdas à planta. Tal resistência a peste pode ser devida a uma mutação natural ou mais tipicamente devida à incorporação de DNA recombinante que confere a resistência a peste. De maneira a conferir resistência a inseto a uma planta transgênica, um DNA recombinante, por exemplo, pode ser transcrito em uma molécula de RNA que <§3

56/225 forma uma molécula de dsRNA nos tecidos ou fluidos da planta recombinante. A molécula de dsRNA é compreendida em parte por um segmento de RNA que é idêntico a um segmento de RNA correspondente codificado por uma seqüência de DNA em um inseto peste que prefere se alimentar na planta recombinante. A expressão do gene no inseto alvo é suprimida pelo dsRNA, e a supressão da expressão do gene no inseto alvo resulta no fato da planta ser resistente ao inseto.

Pestes adequadas incluem qualquer herbívoro que cause dano a uma planta ou parte desta. A invenção contempla pestes de insetos, nematódeos, e fungos em particular.

Insetos peste são de interesse particular e incluem, mas sem limitação:

Da ordem Lepidoptera, por exemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Croddolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalís, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.

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Da ordem Coleoptera, por exemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopólites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Mélolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophílus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp.

Da ordem Orthoptera, por exemplo, Blatta spp., Blattella spp., GryUotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp., e Schistocerca spp.

Da ordem Isoptera, por exemplo, Reticulitemes spp.

Da ordem Psocoptera, por exemplo, Liposcelis spp.

Da ordem Anoplura, por exemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. e Phylloxera spp.

Da ordem Mallophaga, por exemplo, Damalinea spp. e Trichodectes spp.

Da ordem Thysanoptera, por exemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci e Scirtothrips aurantii.

Da ordem Heteroptera, por exemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., família Miridae spp. tal como Lygus hesperus e Lygus lineoloris, família Lygaeidae spp., tal como Blissus leucopterus, e família Pentatomidae spp.

Da ordem Homoptera, por exemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp.,

58/225

Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium comi, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae e Unaspis citri.

Da ordem Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. e Vespa ssp.

Da ordem Diptera, por exemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sdara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. e Tipula spp.

Da ordem Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp. e Xenopsylla cheopis.

E da ordem Thysanura, por exemplo, Lepisma saccharina.

Nematódeos peste de interesse particular incluem, por exemplo, A. caninum, A. ceylancium, H. contortus, O. ostertagi, C. elegans, C. briggsae, P. pacificus, S. stercoralis, S. ratti, P. trichosuri, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla, M. incógnita, M. javanica, M. paraensis, G. rostochiensis, G. pallida, H. glycines, H. schattii, P. penetrans, P. vulnus, R. similis, Z. punctata, A. suum, T. canis, B. malayi, D. immitis, O. volvulus,

T. vulpis, T. spirális, X. index. A. duodenale, A. lumbricoides, bem como

59/225 espécies dos seguintes gêneros: Aphelenchoides, Nacobbus, Ditylenchus, Longidorus, Trichodorus, e Bursaphelenchus.

Pestes fúngicas de particular interesse incluem, mas sem limitação, Acremoniella spp., Alternaria spp. (por exemplo, Alternaria brassicola ou Alternaria solani), Ascochyta spp. (por exemplo, Ascochyta pisi), Botrytis spp. (por exemplo, Botrytis cinerea ou Botryotinia fuckeliana), Cladosporium spp., Cercospora spp. (por exemplo, Cercospora kikuchii ou Cercospora zaea-tnaydis), Cladosporium spp. (por exemplo, Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por exemplo, Colletotrichum lindemuthianum), Curvularia spp., Díplodia spp. (por exemplo, Diplodia maydis), Erysiphe spp. (por exemplo, Erysiphe graminis f.sp. graminis, Erysiphe graminis f.sp. hordei ou Erysiphe pisi), Eiwinia armylovora, Fusarium spp. (por exemplo, Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme ou Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por exemplo, Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Gibberella spp. (por exemplo, Gibberella zeae), Helminthosporium spp. (por exemplo, Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporium mavdis ou Helminthosporium sigmoideum), Leptosphaeria salvinii, Macrophomina spp. (por exemplo, Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por exemplo, Magnaporthe oryzae), Mycosphaerella spp., Nectria spp. (por exemplo, Nectria heamatococca), Peronospora spp. (por exemplo, Peronospora manshurica ou Peronospora tabacina), Phoma spp. (por exemplo, Phoma betae), Phakopsora spp. (por exemplo, Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por exemplo, Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por exemplo, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae ou Phytophthora infestans),

60/225

Plasmopara spp. (por exemplo, Plasmopara viticola), Podosphaera spp. (por exemplo, Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por exemplo, Puccinia sorghi, Puccinia striíformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recôndita ou Puccinia arachidis), Pythium spp. (por exemplo, Pythium aphanidermatum), Pyrenophora spp. (por exemplo, Pyrenophora tritici-repentens ou Pyrenophora teres), Pyricularia spp. fe. g. Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por exemplo, Pythium ultimum), Rhincosporium secalis, Rhizoctonia spp. (por exemplo, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae ou Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por exemplo, Rhizopus chinensid), Scerotium spp. (por exemplo, Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por exemplo, Sclerotinia sclerotiorum), Septoria spp. (por exemplo, Septoria lycopersici, Septoria glycines, Septoria nodorum ou Septoria tritici), Thielaviopsis spp. (por exemplo, Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trichoderma spp. (por exemplo, Trichoderma virde), Uncinula spp. (por exemplo, Uncinula necator), Ustilago maydis (por exemplo, “corn smut”/, Venturia spp. (por exemplo, Venturia inaequalis ou Venturia pirina) ou Verticillium spp. (por exemplo, Verticillium dahliae ou VerticiUium albo-atrum).

II - Identificação de Seqüências Alvo A presente invenção provê um método para a identificação e obtenção de um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos para a produção de um dsRNA ou siRNA. Por exemplo, tal método compreende: (a) sondagem de uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico com uma sonda de hibridização compreendendo toda ou uma parte de uma seqüência de nucleotídeos ou um homólogo desta a partir de um inseto alvo; (b) identificação de um clone de DNA que se hibridiza com a sonda de hibridização; (c) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); e (d) seqüenciamento do fragmento de cDNA ou DNA genômico que compreende o clone isolado na etapa (c) onde a molécula

61/225 de ácido nucléico seqüenciada transcreve todo ou uma parte substancial da seqüência de ácido nucléico de RNA ou um homólogo desta.

Adicionalmente, a presente invenção contempla um método para a obtenção de um fragmento de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos para a produção de uma parte substancial de um dsRNA ou siRNA compreendendo: (a) síntese de um primeiro e um segundo oligonucleotídeo iniciador correspondendo a uma das seqüências de nucleotídeos de uma peste alvo; e (b) amplificação de um molde de cDNA ou DNA genômico em um vetor de clonagem utilizando-se os primeiro e segundo oligonucleotídeos iniciadores da etapa (a) onde a molécula de ácido nucléico amplificada transcreve uma parte substancial de um dsRNA ou siRNA da presente invenção.

Na prática da presente invenção, um gene alvo pode ser derivado de qualquer peste que cause danos a plantas cultivadas e subseqüentes perdas de rendimento. Vários critérios podem ser empregados na seleção de genes alvo preferidos. O gene é um cuja proteína produto apresenta uma taxa de “tumover” rápida, de tal forma que a inibição de dsRNA irá resultar em uma redução rápida nos níveis de proteína. Em certas realizações é vantajoso se selecionar um gene para o qual uma pequena queda dos níveis de expressão resulta em efeitos deletérios para a peste receptora. Se for desejado se atingir uma ampla variedade de espécies de insetos, por exemplo, é selecionado um gene que é altamente conservado por todas estas espécies. Por outro lado, para o propósito de conferir especificidade, em certas realizações da invenção, é selecionado um gene que contenha regiões que são fracamente conservadas entre as espécies individuais de insetos, ou entre insetos e outros organismos. Em algumas realizações, pode ser desejável se selecionar um gene que não apresente homólogos em outros organis62/225 mos.

Conforme utilizado aqui, o termo “derivado de” refere-se a uma seqüência de nucleotídeos específica que pode ser obtida de uma fonte ou espécie específica em particular, embora não necessariamente a partir desta fonte ou espécie específica.

Numa modalidade, é selecionado um gene que é expresso no intestino do inseto. Objetivando-se genes expressos no intestino evitase a necessidade do dsRNA se espalhar no inseto. Genes alvo para utilização na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que compartilham homologias substanciais às seqüências de nucleotídeos de genes expressos em intestino conhecidos que codificam componentes de proteína da próton V-ATPase de membrana plasmática (Dow e colaboradores, 1997; Doe, 1999), por exemplo, a V-ATPase B ou a subunidade E. Este complexo protéico é o único estimulante do transporte iônico epitelial e é responsável pela alcalinização do lúmen do intestino médio. A V-ATPase é expressa também nos túbulos de Malpighi, uma protuberância do intestino posterior dos insetos que funciona no equilíbrio fluido e desintoxicação de componentes estranhos de maneira análoga a um rim de um mamífero.

Noutra modalidade, é selecionado um gene que está essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de um inseto. Genes típicos incluem, mas sem limitação, subunidades estruturais de proteínas ribossomais e um gene beta-coatamer, gene CHD3. Proteínas ribossomais, tais como S4 (RpS4) e S9 (RpS9) são constituintes estruturais do ribossomo envolvido na biossíntese de proteína e que são componentes da subunidade ribossomal pequena citosólica, as proteínas ribossomais, tais como L9 e L19, são constituintes estruturais do ribossomo envolvido na biossíntese de proteína que se localiza no ribossomo. O gene beta-coatamer em C. elegans codifica

63/225 uma proteína que é uma subunidade de um complexo multimérico que forma um revestimento vesicular na membrana. Seqüências similares foram encontradas em diversos organismos, tais como Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, e Saccharomyces cerevisiae. Seqüências relativas são encontradas em diversos organismos, tais como Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Epilachna varivetis, Anthonomus grandis, Tribolium castaneum, Myzus persicae, Nilaparvata lugens, Chilo suppressalis, Plutella xylostella e Acheta domesticus. Outros genes alvo para utilização na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que representam papéis importantes na viabilidade, reprodução e infectividade. Estes genes alvo incluem, por exemplo, genes de manutenção, fatores de transcrição, e genes específicos de inseto ou mutações “knockout” letais em Caenorhabditis ou Drosophila. Os genes alvo para utilização na presente invenção podem ser também aqueles que são derivados de outros organismos, por exemplo, de nematódeo (por exemplo, Meloidogyne spp. ou Heterodera spp.), outros insetos ou aracnídeos (por exemplo, Leptinotarsa spp., Phaedon spp., Epilachna spp., Anthonomus spp., Tribolium spp., Myzus spp., Nilaparvata spp., Chilo spp., Plutella spp., ou Acheta spp.). Adicionalmente, as seqüências de nucleotídeos para utilização como seqüência alvo na presente invenção podem ser também derivadas de genes virais, bacterianos, fúngicos, ou de inseto cujas funções foram estabelecidas a partir da literatura e as seqüências de nucleotídeos que compartilham similaridade substancial com os genes alvo no genoma de um inseto.

Para muitos dos insetos que são alvos potenciais para controle pela presente invenção, é possível que haja informação limitada a respeito das seqüências da maioria dos genes ou quanto ao fenótipo resultante da mutação de genes particulares. Por esta razão, os genes podem ser selecionados com base na informação disponível relativa a

64/225 genes correspondentes em um organismo modelo, tal como Caenorhabditis ou Drosophila, ou em alguma outra espécie de inseto. Os genes podem ser também selecionados com base em informação de seqüência disponível para outras espécies, tais como espécies de nematódeos ou de fungos, nas quais os genes foram caracterizados. Em alguns casos será possível se obter a seqüência de um gene correspondente de um inseto alvo por busca em bancos de dados, tais como GenBank, utilizando-se ou o nome do gene ou a seqüência genética. Uma vez a seqüência tendo sido obtida, pode-se utilizar PCR para amplificar um segmento selecionado apropriado do gene no inseto para uso na presente invenção.

De maneira a se obter um segmento de DNA de um gene correspondente em uma espécie de inseto, por exemplo, iniciadores de PCR podem ser desenhados com base na seqüência conforme encontrada em

C. elegans ou Drosophila, ou um inseto do qual o gene já tiver sido clonado. Os iniciadores são desenhados para amplificar um segmento de DNA de comprimento suficiente para utilização na presente invenção. As condições de amplificação são selecionadas de tal forma que a amplificação ocorrerá mesmo que os iniciadores não se combinem exatamente com a seqüência alvo. Alternativamente, o gene, ou parte deste, pode ser clonado a partir de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de espécies de inseto peste, utilizando um gene do inseto conhecido como sonda. Técnicas para a realização de PCR e de clonagem a partir de bibliotecas são conhecidas. Detalhes adicionais do processo pelo qual segmentos de DNA de espécies de inseto peste alvo podem ser isolados com base na seqüência de genes previamente clonados a partir de uma espécie de inseto são providos nos Exemplos. Um especialista na técnica reconhecerá que uma variedade de técnicas pode ser utilizada para isolar segmentos de genes

65/225 a partir de espécies de inseto peste que correspondem a genes previamente isolados de outras espécies.

III - Métodos de Inibição ou Supressão de um Gene Alvo

A presente invenção provê métodos para inibir a expressão genética de um ou mais genes alvo em uma peste alvo utilizando-se métodos de dsRNA. A invenção é particularmente útil na modulação da expressão de gene eucariótico, em particular a modulação da expressão de genes presentes em pestes que exibem um nível de pH do sistema digestivo que varia de cerca de 4,5 a cerca de 9,5, preferivelmente de cerca de 5,0 a cerca de 8,0, e ainda mais preferivelmente de cerca de

6,5 a cerca de 7,5. Para pestes de plantas com um sistema digestivo que exibe níveis de pH fora destas faixas, pode ser desejável a utilização de métodos de liberação que não requeiram a ingestão de moléculas de dsRNA.

Os métodos da invenção englobam a provisão simultânea ou seqüencial de dois ou mais RNAs de fita dupla ou construções de RNA ao mesmo inseto, de tal forma que se obtenha a sub-regulação ou inibição de genes alvo múltiplos ou se obtenha uma inibição mais potente de um único gene alvo.

Alternativamente, alvos múltiplos são atingidos pela provisão de um RNA de fita dupla que atinge seqüências alvo múltiplas, e um alvo único é mais eficientemente inibido pela presença de mais de uma cópia do fragmento de RNA de fita dupla correspondendo ao gene alvo. Desta forma, Numa modalidade da invenção, a construção de RNA de fita dupla compreende regiões de dsRNA múltiplas, pelo menos uma fita de cada região de dsRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos parte de uma seqüência de nucleotídeos alvo de um gene alvo de inseto. De acordo com a invenção, as

66/225 regiões de dsRNA na construção de RNA podem ser complementares aos mesmos genes alvo ou a genes alvo diferentes e/ou as regiões de dsRNA podem ser complementares a alvos das mesmas espécies de inseto de espécies de inseto diferentes. A utilização de tais construções de dsRNA em uma célula hospedeira vegetal estabelece, desta forma, uma resistência mais potente a uma espécie de inseto única ou a espécies de inseto múltiplas. Numa modalidade, a região de dsRNA de fita dupla compreende cópias múltiplas da seqüência de nucleotídeos que é complementar ao gene alvo. Altemativamente, o dsRNA atinge mais de uma seqüência alvo do mesmo gene alvo. A invenção engloba desta forma construções de RNA de fita dupla isoladas compreendendo pelo menos duas cópias da dita seqüência de nucleotídeos complementar a pelo menos parte de uma seqüência de nucleotídeos de um inseto alvo. O dsRNA que atinge mais de um dos alvos mencionados acima, ou uma combinação de diferentes dsRNAs contra alvos diferentes entre os mencionados acima, são desenvolvidos e utilizados nos métodos da presente invenção. Nucleotídeos de dsRNA adequados e construções de dsRNA adequadas são descritas no documento WO 2006/046148 do depositante, documento este que é incorporado aqui em sua totalidade.

Os termos “atinge”, “atingem” e “atingindo” são palavras alternativas para indicar que pelo menos uma das fitas do dsRNA é complementar, e como tal pode se ligar a, ao gene alvo ou seqüência de nucleotídeos.

O efeito modulador do dsRNA é aplicável a uma variedade de genes expressos nas pestes incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutenção, fatores de transcrição, e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular.

Conforme utilizada aqui, a frase “inibição de expressão genética”

67/225 ou “inibição da expressão do gene alvo na célula de uma peste” refere-se à ausência (ou redução observável) no nível de proteína e/ou produto de mRNA do gene alvo. Especificidade refere-se à capacidade em inibir o gene alvo sem efeitos manifestos sobre outros genes da célula e sem quaisquer efeitos sobre qualquer gene na célula que está produzindo a molécula de dsRNA. A inibição da expressão genética do gene alvo no inseto peste pode resultar em novas características fenotípicas no inseto peste.

“Supressão genética” refere-se a quaisquer dos métodos bem conhecidos para a redução dos níveis de transcrição do gene a mRNA e/ou subseqüente tradução do mRNA. Por supressão genética pretende-se também significar a redução da expressão de proteína a partir de um gene ou de uma seqüência de codificação incluindo a supressão genética pós-transcricional e supressão transcricional. A supressão genética pós-transcricional é mediada pela homologia entre o todo ou parte de um mRNA transcrito a partir de um gene ou seqüência de codificação que se pretende suprimir e o correspondente RNA de fita dupla utilizado para a supressão, e refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomos. O RNA transcrito pode estar na orientação senso para efetuar o que se chama de co-supressão, na orientação anti-senso para efetuar o que se chama de supressão anti-senso, ou em ambas as orientações produzindo um dsRNA para efetuar o que é chamado de RNA de interferência (RNAi).

A supressão transcricional é mediada pela presença na célula de um agente de supressão genética de dsRNA exibindo identidade substancial de seqüência a uma seqüência de DNA promotora ou o complemento desta para efetuar o que se chama de uma trans supressão por promotor. A supressão genética pode ser efetiva contra um gene vegetal

68/225 nativo associado a uma característica, por exemplo, para prover plantas com níveis reduzidos de uma proteína codificada pelo gene nativo ou com níveis aumentados ou reduzidos de um metabólito. A supressão genética pode ser também afetiva contra genes alvo em pestes de planta que podem ingerir ou entrar em contato com material vegetal contendo agentes de supressão genética, especificamente desenhados para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais seqüências homólogas ou complementares nas células da peste. A supressão genética póstranscricional por RNA de orientação anti-senso ou senso para regular a expressão genética em células vegetais é descrita nas patentes US 5.107.065. 5.759.829. 5.283.184. e 5.231.020. A utilização de dsRNA para suprimir genes em plantas é descrita nos documentos WO 99/53050, WO 99/49029, publicação dos pedidos de patente US n^os 2003/0175965, e 2003/0061626, pedido de patente US n° 10/465.800, e patentes US 6.506.559 e 6.326.193.

Um bom método de supressão genética pós-transcricional em plantas emprega RNA transcrito tanto na orientação senso quanto na orientação anti-senso que está estabilizado, por exemplo, como uma estrutura em grampo, tronco e alça. Uma construção de DNA preferida para se efetuar a supressão genética pós-transcricional é uma na qual um primeiro segmento codifica um RNA que exibe uma orientação antisenso exibindo identidade substancial a um segmento de um gene que se deseja suprimir, que está ligado a um segundo segmento na orientação senso que codifica um RNA que exibe complementaridade substancial ao primeiro segmento. Uma construção tal forma uma estrutura em tronco e alça por hibridização do primeiro segmento com o segundo segmento e uma estrutura em alça das seqüências de nucleotídeos ligando os dois segmentos (ver documentos WO 94/01550, WO 98/05770, US 2002/0048814 e US 2003/0018993).

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De acordo com uma realização da presente invenção, é provida uma seqüência de nucleotídeos, para a qual a expressão in vitro resulta na transcrição de uma seqüência de dsRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de RNA de um gene alvo em uma peste que compreende uma seqüência de RNA codificada por uma seqüência de nucleotídeos do genoma da peste. Desta forma, após a peste ter ingerido, ou de alguma outra forma absorvido, a seqüência de dsRNA incorporada em uma ração ou aspergida na superfície de uma planta, ocorre a sub-regulação da seqüência de nucleotídeos correspondente ao gene alvo nas células da peste alvo.

A inibição de um gene alvo utilizando a tecnologia do dsRNA da presente invenção é específica para seqüência no sentido de que seqüências de nucleotídeos que correspondem à região duplex do RNA são objetivadas para a inibição genética. RNA contendo uma seqüência de nucleotídeos idêntica à parte do gene alvo é preferido para a inibição. Observou-se que seqüências de RNA com inserções, deleções e mutações de ponto único relativas à seqüência alvo são mais efetivas para a inibição. Na realização da presente invenção, é preferido que o dsRNA inibidor e a parte do gene alvo compartilhem pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência, ou de cerca de 85% de identidade de seqüência, ou de cerca de 90% de identidade de seqüência, ou de cerca de 95% de identidade de seqüência, ou de cerca de 95% de identidade de seqüência, ou ainda cerca de 100% de identidade de seqüência. Alternativamente, a região duplex do RNA pode ser definida funcionalmente como uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de se hibridizar com uma parte do gene alvo transcrito. Uma seqüência menor que de comprimento total exibindo uma maior homologia compensa uma seqüência mais longa de menor homologia. O comprimento das seqüências de nucleotídeos idênticas pode ser pelo menos de cerca de 25,

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50, 100, 200, 300, 400, 500 ou de pelo menos cerca de 1000 bases. Normalmente, uma seqüência maior do que 20-100 nucleotídeos deve ser utilizada, embora uma seqüência de mais de cerca de 200-300 nucleotídeos seja preferida, e uma seqüência com mais de cerca de 5001000 nucleotídeos seja especialmente preferida dependendo do tamanho do gene alvo. A invenção tem a vantagem de ser capaz de tolerar variações de seqüência que poderíam ser esperadas devido a mutação genética, polimorfismo de cepa, ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucléico introduzida pode não necessitar apresentar homologia absoluta, pode não necessitar ser de comprimento total, em relação tanto ao produto de transcrição primário quanto ao mRMA completamente processado do gene alvo. Por esta razão, os especialistas na técnica devem observar que, conforme descrito aqui, uma identidade de seqüência de 100% entre o RNA e o gene alvo não é requerida para a prática da presente invenção.

IV - Métodos de Preparação de dsRNA Moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. O dsRNA pode ser formado por uma única fita de RNA auto-complementar ou de duas fitas de RNA complementares. RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição in vivo, ou RNA polimerase clonada pode ser utilizada para a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pode direcionada por transcrição específica em um órgão, tecido, ou célula; estímulo de uma condição ambiental (por exemplo, infecção, estresse, temperatura, indutores químicos); e/ou transcrição engenheirada em um estágio de desenvolvimento ou idade. As fitas de RNA podem ser ou não poliadeniladas; as fitas de RNA podem ser ou não capazes de serem traduzidas em um polipeptídeo pela aparelhagem de tradução de uma célula.

Um RNA, dsRNA, siRNA, ou miRNA da presente invenção pode

71/225 ser produzido quimicamente ou enzimaticamente por um especialista na técnica por meio de reações manuais ou automatizadas ou in vivo em um outro organismo. O RNA pode ser também produzido por síntese orgânica parcial ou total; qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática ou orgânica in vitro. O RNA pode ser sintetizado por uma RNA polimerase celular ou por uma RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, T3, T7, SP6). A utilização e a produção de uma construção de expressão são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, documento WO 97/32016; patentes US 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693). Se sintetizado quimicamente ou por síntese enzimática in vitro, o RNA pode ser purificado antes da introdução na célula. Por exemplo, o RNA pode ser purificado a partir de uma mistura pela extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia, ou uma combinação destes. Alternativamente, o RNA pode ser utilizado sem purificação ou com um mínimo de purificação para se evitar perdas devidas ao processamento da amostra. O RNA pode ser secado para armazenagem ou dissolvido em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o anelamento e/ou estabilização das fitas duplas.

V - Seqüências de Polinucleotídeos Seqüências de nucleotídeos são providas de acordo com a invenção, a expressão das quais resulta em uma seqüência de RNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de RNA de um gene alvo em uma peste que compreende uma seqüência de RNA codificada por uma seqüência de nucleotídeos do genoma da peste. Desta forma, após a ingestão da seqüência de dsRNA pode ser obtida a sub-regulação da seqüência de nucleotídeos do gene alvo nas células da peste resultando em um efeito deletério sobre a manutenção, viabilidade, proliferação, reprodução e infestação da peste.

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Cada “seqüência de nucleotídeos” definida aqui é apresentada como uma seqüência de desoxiribonucleotídeos (abreviados como A, G, C e T). No entanto, por “seqüência de nucleotídeos” de uma molécula de ácido nucléico ou polinucleotídeo significa uma molécula de DNA ou polinucleotídeo, uma seqüência de desoxiribonucleotídeos e uma molécula de RNA ou polinucleotídeo, a seqüência correspondente de ribonucleotídeos (A, G, C e U) onde cada desoxinucleotídeo timidina (T) na seqüência de desoxinucleotídeo específica é substituído por um ribonucleotídeo uridina (U).

Conforme utilizado aqui, o termo “ácido nucléico” refere-se a um polímero de fita simples sou dupla das bases desoxiribonucleotíticas ou ribonucleotídicas lidas da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Um ácido nucléico pode conter também opcionalmente bases nucleotídicas de ocorrência não natural ou alteradas que permitem a leitura correta por uma polimerase e não reduzem a expressão de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico. Os termos “seqüência de nucleotídeos” ou “seqüência de ácidos nucléicos” referem-se tanto a fitas senso quanto a fitas anti-senso de um ácido nucléico seja de fita simples quanto de fita dupla.

O termo “ácido ribonucléico” (RNA) inclui RNAi (RNA inibidor), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (RNA de interferência pequeno), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), tRNA (RNA de transferência, carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar) e o termo “ácido desoxiribonucleico” (DNA) inclui cDNA e DNA genômico e híbridos DNA-RNA.

Os termos “segmento de ácido nucléico”, “segmento de seqüência de nucleotídeos”, ou mais genericamente “segmento” devem ser entendidos pelos especialistas na técnica como um termo funcional que inclui tanto seqüências genômicas, seqüências de RNA ribossomais, seqüênθ

73/225 cias de RNA de transferência, seqüências de RNA mensageiro, seqüências de operons quanto seqüências de nucleotídeos engenheiradas menores que expressão ou podem ser adaptadas para expressar proteínas, polipeptídeos ou peptídeos.

Da mesma forma, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo um polinucleotídeo apresentando uma seqüência selecionada do grupo que consiste em qualquer uma das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083,

1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103, 1105,

1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642, 1647,

1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690,

1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040, 2045,

2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100,

2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359,

2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e

2481. A invenção provê também fragmentos funcionais das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773,

J-OV’

74/225

778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089,

1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111,

1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662,

1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696,

1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060,

2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106,

2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368,

2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481. A invenção provê adicionalmente ácidos nucléicos complementares, ou fragmentos destes, a qualquer uma das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247,

249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498,

503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601,

603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797,

799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099,

1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577,

1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632,

1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684,

1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 17302039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085,

2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344,

2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461,

2466, 2471, 2476 e 2481, bem como um ácido nucléico, compreenden75/225 do pelo menos 15 bases contíguas, que se hibridiza a qualquer uma das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193,

198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259,

275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521,

533-575, 576, 581, 586, 91, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767,

768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087,

1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109,

1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657,

1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694,

1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055,

2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481.

A invenção provê também seqüências ortólogas, e complementos e fragmentos destas, das seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID

Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247,

249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498,

503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601,

603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797,

799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896,

908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077,

1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099,

1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577,

1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632,

76/225

1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684,

1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085,

2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 - 2338, 2339, 2344,

2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461,

2466, 2471, 2476 e 2481 da invenção. Da mesma forma, a invenção engloba genes alvo que são ortólogos de um gene de inseto compreendendo uma seqüência de nucleotídeos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,

49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208,

215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473,

478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576,

581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778,

783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883,

888, 890, 892, 894, 896, 908- 1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061,

1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091,

1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113,

1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667,

1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698,

1700, 1702, 1704, 1730 - 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065,

2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108,

2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481. Como exemplo, ortólogos de inseto podem compreender uma seqüência de nucleotídeos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 49-123, 275434, 533-562, 621-738, 813-852, 908-1010, 1161-1437, 1730-1987, 2120-2290, 2384-2438, ou um fragmento destas de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 nucleotídeos. Uma lista

Jl

77/225 não limitativa de genes ortólogos de inseto ou aracnídeo ou seqüências compreendendo pelo menos um fragmento de 15, preferivelmente pelo menos 17 bp de uma das seqüências da invenção é fornecida na Tabela

4.

A invenção engloba também genes alvo que são ortólogos de um gene de nematódeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085,

1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107,

1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642, 1647, 1652,

1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692,

1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040, 2045, 2050,

2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102,

2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364,

2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481 da invenção. Como exemplo, ortólogos de nematódeo podem compreender uma seqüência de nucleotídeos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 124-135, 435-446, 563, 564, 739-751, 853, 854, 1011-1025, 1438-1473, 1988-2001, 2291-2298, 2439-2440 da invenção, ou um fragmento de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos destas. De acordo com um outro aspecto, a invenção engloba desta forma quaisquer dos métodos descritos aqui para o

78/225 controle do crescimento de nematódeo em um organismo, ou para a prevenção de infestação por nematódeo em um organismo susceptível à infestação por nematódeo, compreendendo o contato de células de nematódeo com um RNA de fita dupla, onde o RNA de fita dupla compreende fitas complementares aneladas, uma das quais apresenta uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos parte da seqüência de nucleotídeos de um gene alvo compreendendo um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de qualquer uma das seqüências tal como representadas nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253,

255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515,

517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607,

609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081,

1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103,

1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642,

1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688,

1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040,

2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095,

2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354,

2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471,

2476 e 2481, pelo que o RNA de fita dupla é ingerida pelo fungo e, desta forma, controla o crescimento ou previne a infestação. A invenção refere-se também a plantas transgênicas resistentes a nematódeo compreendendo um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de qualquer uma das seqüências tal como representadas

J

79/225 nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225,

230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488,

493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591,

596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793,

795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097,

1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572,

1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627,

1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682,

1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704,

1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339,

2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460,

2461, 2466, 2471, 2476 e 2481. Uma lista não limitativa de genes ortólogos de nematódeo ou seqüências compreendendo pelo menos um fragmento de 15, preferivelmente pelo menos 17 bp, de uma das seqüências da invenção é dada na Tabela S.

De acordo com uma outra realização, a invenção engloba genes alvo que são ortólogos de um gene de fungo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230,

247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493,

498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596,

601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795,

797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, j

<3

80/225

1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097,

1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572,

1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627,

1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682,

1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704,

1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481 da invenção. Como exemplo, ortólogos de fungo podem compreender uma seqüência de nucleotídeos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 136-158, 447-472, 565-575, 752-767, 855-862, 1026-1040, 1474-1571, 2002-2039, 22992338, 2441-2460, ou um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 nucleotídeos destas. De acordo com um outro aspecto, a invenção engloba quaisquer dos métodos descritos aqui para o controle do crescimento de fungos em uma célula ou em um organismo, ou para a prevenção de infestação fúngica em uma célula ou organismo susceptível a infestação por fungo, compreendendo o contato de células do fungo com um RNA de fita dupla, onde o RNA de fita dupla compreende fitas complementares aneladas, uma das quais apresenta uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos parte da seqüência de nucleotídeos de um gene alvo compreendendo um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de qualquer uma das seqüências tal como representadas nas SEQ ID

Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247,

249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498,

503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601,

603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797,

81/225

799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099,

1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577,

1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632,

1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684,

1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 17302039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085,

2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344,

2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461,

2466, 2471, 2476 e 2481, pelo que o RNA de fita dupla é absorvido pelo fungo e, desta forma, controla o crescimento ou previne a infestação. A invenção refere-se também a plantas transgênicas resistentes a fungo compreendendo um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de qualquer uma das seqüências tal como representadas nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225,

230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488,

493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591,

596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793,

795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097,

1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572,

1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627,

1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682,

1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704,

1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339,

JX5

82/225

2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460,

2461, 2466, 2471, 2476 e 2481. Uma lista não limitativa de genes ortólogos de fungo ou seqüências compreendendo pelo menos um fragmento de 15, preferivelmente de pelo menos 17 bp, de uma das seqüências da invenção é dada na Tabela 6.

Numa modalidade adicional, uma molécula de dsRNA da invenção compreende qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188,

193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249, 251, 253, 255, 257,

259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519,

521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085,

1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107,

1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642, 1647, 1652,

1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692,

1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040, 2045, 2050,

2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102,

2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364,

2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481, embora as seqüências apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188,

193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247, 249 , 251, 253, 255, 257,

259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 513, 515, 517, 519,

521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046,

83/225

1051,	1056,	1061,	1071, 1073, 1075,	1077,	1079,	1081,	1083,	1085,
1087,	1089,	1091,	1093, 1095, 1097,	1099,	1101,	1103,	1105,	1107,
1109,	1111,	1113,	1161-1571, 1572,	1577,	1582,	1587,	1592,	1597,
1602,	1607,	1612,	1617, 1622, 1627,	1632,	1637,	1642,	1647,	1652,
1657,	1662,	1667,	1672, 1677, 1682,	1684,	1686,	1688,	1690,	1692,
1694,	1696,	1698,	1700, 1702, 1704,	1730-2039,	2040,	2045,	2050,
2055,	2060,	2065,	2070, 2075, 2080,	2085,	2090,	2095,	2100,	2102,
2104,	2106,	2108,	2120-2338, 2339,	2344,	2349,	2354,	2359,	2364,
2366,	2368,	2370,	2372, 2384-2460, :	2461,	2466,	2471,	2476 e	: 2481

não sejam limitativos. Uma molécula de dsRNA da invenção pode compreender qualquer gene alvo contíguo de uma espécie de peste (por exemplo, cerca de 15 a cerca de 25 ou mais, ou cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 ou mais nucleotídeos contíguos).

Por molécula(s) de ácido nucléico “isolada(s)” se quer dizer uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, moléculas de DNA recombinante em uma construção de DNA são consideradas isoladas para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de moléculas de DNA isoladas incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificadas (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vitro das moléculas de DNA da presente invenção. Moléculas de ácido nucléico isoladas, de acordo com a presente invenção incluem adicionalmente moléculas produzidas sinteticamente.

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem estar na forma de RNA, tal como mRNA, ou na forma de DNA, incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genômico obtidos por clonagem ou produzidos sinteticamente. O DNA ou RNA podem ser de fita dupla ou de fita simples. O DNA de fita simples pode ser a fita de codificação, também

84/225 conhecida como fita senso, ou pode ser uma fita não codificadora, também chamada de fita anti-senso.

VI - Análise da Seqüência

A não ser que de outra forma indicado, todas as seqüências de nucleotídeos determinadas pelo seqüenciamento de uma molécula de DNA foram determinadas utilizando-se um seqüenciador de DNA automatizado (tal como o modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.). Desta forma, como conhecido na técnica para qualquer seqüência de DNA determinada por esta abordagem automática, qualquer seqüência de nucleotídeos determinada aqui pode conter alguns erros. As seqüências de nucleotídeos determinadas por automação são tipicamente pelo menos cerca de 95% idênticas, mais tipicamente pelo menos cerca de 96% a pelo menos cerca de 99,9% idênticas à verdadeira seqüência de nucleotídeos da molécula de DNA seqüenciada. A seqüência real pode ser determinada mais precisamente por outras abordagens incluindo métodos manuais de seqüenciamento de DNA bem conhecidos na técnica. Como também conhecido na técnica, uma inserção ou deleção únicas em uma seqüência de nucleotídeos determinada comparada com a seqüência real irá provocar uma troca de quadro na tradução da seqüência de nucleotídeos de tal forma que a seqüência de aminoácidos prevista codificada por uma determinada seqüência de nucleotídeos pode ser completamente diferente da seqüência de aminoácidos real codificada pela molécula de DNA seqüenciada, que se inicia no ponto de tal inserção ou deleção.

Noutro aspecto, a invenção provê uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de hibridização rigorosas a uma parte do polinucleotídeo em uma molécula de ácido nucléico da invenção descrita acima. Por polinucleotídeo que se hibridiza a uma “parte” de um polinucleotídeo

85/225 quer-se dizer um polinucleotídeo (DNA ou RNA) que se hibridiza a pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, e mais preferivelmente a pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, a ainda mais preferivelmente a pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, e mais preferivelmente a mais de 30 nucleotídeos do polinucleotídeo de referência. Estes fragmentos que se hibridizam aos fragmentos de referência são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores. Para o propósito da invenção, duas seqüências se hibridizam quando formam um complexo de fita dupla em uma solução de hibridização de 6X SSC, SDS 0,5%, 5X solução de Denhardt e 100 pg de veículo de DNA não específico. Ver Ausbel e colaboradores, seção

2.9. suplemento 27 (1994). As seqüências podem hibridizar com “estringência moderada”, o que é definido como uma temperatura de 60°C em uma solução de hibridização de 6X SSC, SDS 0,5%, 5X solução de Denhardt e 100 pg de veículo de DNA não específico. Para hibridização a “estringência alta”, a temperatura é aumentada para 68°C. Após a reação de hibridização a estringência moderada, os nucleotídeos são lavados em uma solução de 2X SSC, SDS 0,05% por cinco vezes a temperatura ambiente, com lavagens subseqüentes com 0,lX SSC mais SDS 0,1% a 60°C por 1 h. Para alta estringência, a temperatura de lavagem é aumentada para 68°C. Para o propósito da invenção, nucleotídeos hibridizados são aqueles que são detectados utilizando-se 1 ng de uma sonda radio-rotulada apresentando uma radioatividade específica de 10000 cpm/ng, onde os nucleotídeos hibridizados são claramente visíveis após exposição a filme de Raio-X a -70°C por mais de 72 horas.

A presente invenção está direcionada para tais moléculas de ácido nucléico, as quais são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas a uma seqüência de ácido nucléico descrita em qualquer uma das SEQ ID

JÁ3

86/225

Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 247,

249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498,

503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601,

603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797,

799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099,

1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577,

1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632,

1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684,

1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 - 2338, 2339, 2344,

2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461,

2466, 2471, 2476 e 2481. No entanto, são preferidas moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à seqüência de ácidos nucléicos mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159,

160, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225,

230, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275-472, 473, 478, 483, 488,

493, 498, 503, 513, 515, 517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591,

596, 601, 603, 605, 607, 609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793,

795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892,

894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1071, 1073, 1075,

1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097,

1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572,

1577, 1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627,

1632, 1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682,

87/225

1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471, 2476 e 2481. Podem ocorrer diferenças entre duas seqüências de ácidos nucléicos nas posições terminais 5’ e 3’ da seqüência de nucleotídeos de referência ou em qualquer ponto entre estas posições terminais, dispersos ou individualmente entre nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Por uma questão prática, quando qualquer molécula de ácido nucléico particular for pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotídeos de referência isto se refere a uma comparação feita entre duas moléculas utilizando-se algoritmos padrão bem conhecidos na técnica e pode ser determinada de forma convencional utilizando-se programas de computador disponíveis publicamente tais como o algoritmo BLASTN. Ver Altschul e colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

Numa modalidade da invenção, um ácido nucléico compreende uma fita anti-senso contendo de cerca de 15 a cerca de 30 (por exemplo, cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30) nucleotídeos, onde a fita anti-senso é complementar a uma seqüência de RNA ou uma parte desta que codifica uma proteína que controla o ciclo celular ou recombinação homóloga, e onde o dito siNA compreende adicionalmente uma fita senso contendo de cerca de 15 a cerca de 30 (por exemplo, cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30) nucleotídeos, e onde a dita fita senso e a dita fita anti-senso são seqüências de nucleotídeos distintas onde pelo menos cerca de 15 nucleotídeos em cada fita são complementares aos da outra

88/225 fita.

Numa modalidade, a presente invenção provê moléculas de ácido nucléico de fita dupla que mediam o silenciamento genético por RNA de interferência. Noutra modalidade, as moléculas de siNA da invenção consistem em moléculas de ácido nucléico de fita dupla contendo cerca de 15 a cerca de 30 pares de bases entra os oligonucleotídeos compreendendo cerca de 15 a cerca de 30 (por exemplo, cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30) nucleotídeos. Ainda noutra realização, as moléculas de siNA da invenção compreendem moléculas de ácido nucléico de fita dupla com extremidades pendentes de cerca de 1 a cerca de 32 (por exemplo, cerca de 1, 2 ou 3) nucleotídeos, por exemplo, cerca de duplexes com cerca de 21 nucleotídeos com cerca de 19 pares de bases e mononucleotídeo, dinucleotídeo i=ou trinucleotídeo pendentes no terminal 3’. Ainda noutra realização, as moléculas de siNA da invenção compreendem moléculas de ácido nucléico de fita dupla com extremidades cegas, onde ambas as extremidades são cegas, ou, alternativamente, onde uma das extremidades é cega.

Uma molécula de siNA da presente invenção pode compreender nucleotídeos modificados enquanto que mantendo a capacidade de mediar RNAi. Os nucleotídeos modificados podem ser utilizados para melhorar características in vitro ou in vivo tais como estabilidade, atividade e/ou biodisponibilidade. Por exemplo, uma molécula de siNA da invenção pode compreender nucleotídeos modificados como uma percentagem do número total de nucleotídeos presente na molécula de siNA. Como tal, uma molécula de siNA da invenção pode genericamente compreender cerca de 5% a cerca de 100% de nucleotídeos modificados (por exemplo, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de

89/225 nucleotídeos modificados). A percentagem real de nucleotídeos modificados presentes em uma dada molécula de siNA irá depender do número total de nucleotídeos presente na siNA. Se a molécula de siNA é de fita única, a modificação percentual pode ser baseada no número total de nucleotídeos presente nas moléculas de siNA de fita única. Da mesma forma, se a molécula de siNA é de fita dupla, a modificação percentual pode ser baseada no número total de nucleotídeos presente na fita senso, fita anti-senso, ou tanto na fita senso quanto na fita antisenso.

VII - Construções de Ácido Nucléico

Um vetor de ácido nucléico recombinante pode, por exemplo, ser um plasmídeo circular linear ou circular. O sistema vetor pode ser um vetor único ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que em conjunto contêm o ácido nucléico total a ser introduzido no genoma do hospedeiro bacteriano. Adicionalmente, um vetor bacteriano pode ser um vetor de expressão. Moléculas de ácido nucléico, tal como apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 161, 162, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208,

215, 220, 225, 230, 240-246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 275472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 508-512, 513, 515, 517, 519,

521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607, 609, 621767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813-862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908-1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1066-1070, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099, 1101, 1103,

1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577, 1582, 1587,

1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632, 1637, 1642,

1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684, 1686, 1688,

1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1730-2039, 2040,

90/225

2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095,

2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344, 2349, 2354,

2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461, 2466, 2471,

2476 e 2481, ou fragmentos destas, podem, por exemplo, ser adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funcione em um ou mais hospedeiros microbianos para acionar a expressão de uma seqüência de codificação ou outra seqüência de DNA ligadas. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e a seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucléico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira em particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo de sua função (amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira em particular com a qual é compatível. Os componentes do vetor para transformação bacteriana incluem, em geral, mas não se limitando a, um ou mais do que se segue: uma seqüência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes de marcação selecionáveis, e um promotor indutível possibilitando a expressão de DNA exógeno.

Promotores “Ligado operativamente”, conforme utilizado com referência a uma seqüência reguladora e a uma seqüência de nucleotídeos estrutural, significa que as seqüências reguladoras regulam a expressão da seqüência de nucleotídeos estrutural. “Seqüências reguladoras” ou “elementos de controle” referem-se a seqüências de nucleotídeos localizadas a montante (seqüências não codificadoras 53, dentro, ou a jusante (seqüências não traduzidas 33 de uma seqüência de nucleotídeos estrutural, e que influenciam o tempo e nível ou quantidade de transcrição, o processamento ou estabilidade do RNA, ou a tradução da seqüência de nucleotídeos estrutural associada. As seqüências regula91/225 doras podem incluir promotores, seqüências líder de tradução, introns, amplificadores, estruturas tronco-alça, seqüências repressoras de ligação, e seqüências de reconhecimento de poliadenilação, e outras.

Um vetor de expressão para a produção de um mRNA pode conter também um promotor indutível que é reconhecido pelo organismo bacteriano hospedeiro e é ligado operativamente ao ácido nucléico que codifica , por exemplo, a molécula de ácido nucléico que codifica o mRNA de D. v. virgifera ou um fragmento de interesse deste. Promotores indutíveis adequados para uso com hospedeiros bacterianos inclu10 em o promotor de β-lactamase, fago λ de E. coli e promotores PL e PR, e o promotor de galactose de E. coli, promotor de arabinose, promotor de fosfatase alcalina, promotor de triptofano (trp), e o promotor de operon de lactose e variações destes e promotores híbridos tais como o promotor tac. No entanto, outros promotores indutíveis bacterianos conheci15 dos são adequados.

A invenção contempla promotores que funcionam em diferentes espécies vegetais. Promotores úteis para a expressão de polipeptídeos em plantas incluem aqueles que são indutíveis, virais, sintéticos, ou constitutivos como descrito em Odell e colaboradores (1985), e/ou promotores que são regulados temporariamente, regulados espacialmente, e regulados espaço-temporariamente. Promotores preferidos incluem os promotores CaMV35S amplificados, e o promotor FMV35S. Para o propósito da presente invenção, por exemplo, para o controle ótimo de espécies que se alimentam nas raízes, pode ser preferível se obter os níveis mais altos de expressão destes genes nas raízes de plantas. Um número de promotores amplificados de raiz foi identificado e é conhecido na técnica (Lu e colaboradores, 2000; patentes US 5.837.848 e 6.489.542).

Numa modalidade, o vetor de transformação vegetal compreende íl

-ΛΛ5

92/225 uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo um promotor ligado operativamente a uma ou mais seqüências de nucleotídeos da presente invenção. A seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 49-158, 159, 160, 161, 162, 163, 168, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240-246, 247, 249, 251, 253, 255, 257,

259, 275-472, 473, 478, 483, 488, 493, 498, 503, 508-512, 513, 515,

517, 519, 521, 533-575, 576, 581, 586, 591, 596, 601, 603, 605, 607,

609, 621-767, 768, 773, 778, 783, 788, 793, 795, 797, 799, 801, 813862, 863, 868, 873, 878, 883, 888, 890, 892, 894, 896, 908- 1040, 1041, 1046, 1051, 1056, 1061, 1066-1070, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, 1093, 1095, 1097, 1099,

1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1161-1571, 1572, 1577,

1582, 1587, 1592, 1597, 1602, 1607, 1612, 1617, 1622, 1627, 1632,

1637, 1642, 1647, 1652, 1657, 1662, 1667, 1672, 1677, 1682, 1684,

1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 17302039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085,

2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120-2338, 2339, 2344,

2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384-2460, 2461,

2466, 2471, 2476 e 2481. A seqüência de nucleotídeos inclui um segmento que codifica todo ou parte de um RNA presente em um transcrito de RNA da peste alvo e pode compreender repetições invertidas de todo ou de parte de um RNA da peste alvo. A molécula de DNA compreendendo o vetor de expressão pode conter também uma seqüência intron funcional posicionada ou a montante da seqüência de codificação ou ainda dentro da seqüência de codificação, e pode conter também uma seqüência líder não traduzida de cinco primas (5Ί (isto é, uma UTR ou 5’-UTR) posicionada entre o promotor e o ponto de início da tradução.

93/225

Genes marcadores selecionáveis

Um vetor ou construção de DNA recombinante da presente invenção tipicamente compreende um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável a células vegetais. Os marcadores selecionáveis podem ser utilizados também para se selecionar plantas ou células vegetais que contêm os ácidos nucléicos exógenos que codificam polipeptídeos ou proteínas da presente invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, kanamicina, bleomicina G418, higromicina, etc.), ou resistên10 cia a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas sem limitação, um gene neo que codifica para resistência a kanamicina e pode ser selecionado pela utilização de kanamicina, G418, etc., um gene bar que codifica para resistência a bialafos; um gene da EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene se nitrilase que confere resistência a bromoxinil; um gene da acetolactase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona ou sulfoniluréia; e um gene DHFR resistente a metotrexato. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas patentes US 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

Um vetor ou construção recombinante da presente invenção pode incluir também um marcador de varredura. Marcadores de varredura podem ser utilizados para monitorar a expressão. Marcadores de varredura típicos incluem o gene da #-glucuronidase ou gene uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (Jefferson, 1987; Jefferson e colaboradores, 1987); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta e colaboradores, 1988); e o gene da β-lactamase (Sutcliffe e colaboradores, 1978), um gene que codifica uma enzima

94/225 para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow e colaboradores, 1986) um gene xylE (Zukowsky e colaboradores, 1983) que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikatu e colaboradores, 1990); um gene de tirosinase (Katz e colaboradores, 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA e dopaquinona que, por sua vez, se condensa a melanina; e α-galactosidase que catalisa um substrato de α-galactose cromogênico.

Vetores de transformação vegetal preferidos incluem os derivados de plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, patentes US 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, 5.501.967 e EP 0 122 791). Plasmídeos de Agrobacterium rhizogenes (ou “Ri”) são também úteis e conhecidos na técnica. OUtros vetores de transformação vegetal preferidos incluem os descritos, por exemplo, por Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) e no documento EP 0 120 516.

Em geral, é preferível introduzir-se um DNA recombinante funcional em uma localização não específica no genoma de uma planta. Em casos especiais pode ser útil se inserir uma construção de DNA recombinante por integração específica de sítio. Existem vários sistemas de recombinação específica de sítio os quais são conhecidos por funcionarem em plantas incluindo cre-lox tal como descrito na patente US 4.959.317 e FLP-FRT tal como descrito na patente US 5.527.695.

Um vetor de transformação pode ser facilmente preparado utilizando-se métodos disponíveis na técnica. O vetor de transformação compreende uma ou mais seqüências de nucleotídeos que são capazes de serem transcritas a uma molécula de RNA e que são substancialmente homólogas e/ou complementares a uma ou mais seqüências codificadas pelo genoma do inseto, de tal forma que pela ingestão do

95/225

RNA ocorre a sub-regulação da expressão de pelo menos uma das respectivas seqüências de nucleotídeos do genoma do inseto.

Um vetor de transformação vegetal pode conter seqüências de mais de um gene, desta forma possibilitando a produção de mais de um dsRNA para a inibição da expressão de dois ou mais genes nas células de uma peste alvo. Um especialista na técnica observará facilmente que segmentos de DNA cuja seqüência corresponda à presente em diferentes genes podem ser combinados em um único segmento de DNA composto para a expressão em uma planta transgênica. Altemativamente, um plasmídeo da presente invenção já contendo pelo menos um segmento de DNA pode ser modificado pela inserção seqüencial de segmentos de DNA adicionais entre o amplificador e o promotor e as seqüências terminadoras. No agente de controle de inseto da presente invenção desenhado para a inibição de genes múltiplos, os genes a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de inseto de maneira a aumentar a efetividade do agente de controle de inseto. Em certas realização, os genes podem ser derivados de diferentes insetos de maneira a ampliar a faixa de insetos contra os quais o agente é efetivo. Quando genes múltiplos são objetivados para a supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado tal como ilustrado em Fillatti, publicação de pedido US n° 2004/0029283.

O vetor de transformação pode ser uma construção de dsDNA e pode também ser definido como uma molécula recombinante, um agente de controle de inseto, uma molécula genética ou uma construção genética quimérica. Uma construção genética quimérica da presente invenção pode compreender, por exemplo, seqüências de nucleotídeos que codificam um ou mais transcritos anti-senso, um ou mais transcritos senso, um ou mais de cada um dos mencionados anteriormente,

96/225 onde o todo ou parte de um transcrito destes é homólogo a toda ou parte de uma molécula de RNA compreendendo uma seqüência de RNA codificada por uma seqüência de nucleotídeos do genoma de um inseto.

VIII - Plantas para Engenharia Genética

Uma “planta” é qualquer um de vários organismos fotossintéticos, eucarióticos, multicelulares do reino Plantae caracteristicamente produzindo embriões, contendo cloroplastos e apresentando paredes celulares de celulose. Uma parte de uma planta, isto é, um “tecido vegetal” pode ser tratada de acordo com os métodos da presente inven10 ção para produzir uma planta transgênica. Muitos tecidos vegetais adequados podem ser transformados de acordo com a presente invenção e incluem, mas sem limitação, embriões somáticos, pólen, caules, folhas, calos, estolhos, micro-tubérculos e brotações.

Desta forma, a presente invenção está direcionada para a transformação de plantas angiospermas e gimnospermas tais como acácia, alfafa, maçã, abricó, alcachofra, fraxino, aspargo, abacate, banana, cevada, ervilhas, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão amarelo, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, cereais, aipo, castanho, cereja, repolho chinês, cítricos, mexerica, trevo, café, algodão, feijão-fradinho, pepino, cipreste, berinjela, olmo, chicória, eucalipto, erva-doce, figo, abeto, gerânio, uva, toranja, “groundnuts”, alquequenje amarelo, pinheiro canadense, nogueira, couve, kiwi, couve-rábano, lariço, alface, alhoporro, limão, lima, alfarrobeira, pinheiro, avença, milho, manga, bordo, melão, painço, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta, flor ou árvore ornamental, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, guandu, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, salgueiro, espinafre,

97/225 abeto, abobrinha, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, rabanete, vinha, agrião, melancia, trigo, inhames, teixo, e feijões.

De acordo com a presente invenção “tecido vegetal” engloba 5 também células vegetais. Células vegetais incluem culturas em suspensão, calos, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotações, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes e micrósporos. Os tecidos vegetais podem estar em vários estágios de maturidade e podem ser crescidos em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou meio adequado em vasos, estufas ou campos. Um tecido vegetal refere-se também a qualquer clone de tal planta, semente, progênie, propágulo gerado sexualmente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer / um destes, tais como mudas ou sementes.

T “Progênie” da presente invenção, tal como a progênie de uma planta transgênica, é uma que é nascida, gerada, ou derivada de uma planta ou planta transgênica. Desta forma, uma planta “progênie”, isto é, uma planta de geração “Fl”, é uma prole ou uma descendente da planta transgênica produzida pelos métodos da invenção. Uma progênie de uma planta transgênica pode conter em pelo menos um, alguns ou todos seus genomas celulares, o polinucleotídeo desejado que foi integrado em uma célula da planta transgênica parental pelos métodos descritos aqui. Desta forma, o polinucleotídeo desejado é “transmitido” ou “herdado” pela progênie. O polinucleotídeo desejado que é herdado assim na progênie pode consistir em uma construção de T-DNA, a qual é também herdada pela progênie de seu parental. O termo “progênie”, conforme utilizado aqui, pode ser considerado também como sendo a prole ou descendente de um grupo de plantas.

Uma “semente” pode ser encarada como um óvulo vegetal maduro contendo um embrião, e uma parte de propagação de uma

98/225 planta, tal como um tubérculo ou esporo. Uma semente pode ser incubada antes da transformação mediada por Agrobacterium, no escuro, por exemplo, para facilitar a germinação. A semente pode também ser esterilizada antes da incubação, tal como por tratamento breve com lixívia. A muda resultante pode então ser exposta a uma cepa de Agrobacterium desejada ou outra bactéria adequada para a transformação.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado) e a planta é batata, berinjela, tomate, pimenta, tabaco, alquequenje amarelo ou arroz, milho ou algodão.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Phaedon cochleariae (besouro da folha da mostarda) e a planta é mostarda, repolho chinês, nabo, couve-de-folhas ou “bok choy”.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Epilachna varivetis (besouro do feijão mexicano) e a planta é feijão, feijão comum, feijão de jardim, feijão-vagem, feijão de lima, “mung beans”, vagem, mucuna-preta, soja, feijão-fradinho, guandu, trevo ou alfafa.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Anthonomus grandis (bicudo do algodão) e a planta é algodão.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Tribolium castaneum (besouro castanho da farinha) e a planta está na forma de grãos armazenados tais como farinha, cereais, torta, biscoitos, feijões, temperos, massa, torta mista, ração animal seca, flores secas, chocolate, amêndoas, sementes e mesmo peças de museu secas.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde

99/225 o inseto é Myzus persicae (pulgão verde) e a planta é uma árvore tal como Prunus, particularmente pêssego, abricó e ameixa; uma hortaliça das famílias Solanaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, e Cucurbitaceae, incluindo, mas não se limitando a, alcachofra, aspargo, feijão, beterraba, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, cenoura, couveflor, melão amarelo, aipo, milho, pepino, erva-doce, couve, couverábano, nabo, berinjela, alface, mostarda, quiabo, salsa, pastinaga, ervilha, pimenta, batata, rábano, espinafre, abobrinha, tomate, agrião e melancia; uma plantação tal como, mas não se limitando a, tabaco, beterraba e girassol; flores ou outras plantas ornamentais.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Nilaparvata lugens e a planta é uma espécie de arroz.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Chilo suppressalis (broca do colmo de arroz rajada) e a planta é uma planta de arroz, cevada, sorgo, milho, trigo ou uma gramínea.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Plutella xylostella (traça das crucíferas) e a planta é uma espécie de Brassica tal como, mas não se limitando a, repolho, repolho chinês, couve de Bruxellas, couve, colza, brócolis, couve-flor, nabo, mostarda ou rábano.

A presente invenção se estende aos métodos descritos aqui, onde o inseto é Acheta domesticus (grilo doméstico) e a planta é qualquer planta descrita aqui ou qualquer matéria orgânica.

IX - Métodos de Engenharia Genética

A presente invenção contempla a introdução de uma seqüência de nucleotídeos em uma planta para se obter níveis inibidores de peste da expressão de um ou mais moléculas de dsRNA. Os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção podem ser introduzidos em uma célula vegetal hospedeira por procedimentos padrão conhecidos na técnica

100/225 para a introdução de seqüências recombinantes em uma célula hospedeira alvo. Tais procedimentos incluem, mas sem limitação, transfecção, infecção, transformação, absorção natural, fosfato de cálcio, eletroporação, biolística de micro-injeção e protocolos de transformação mediada por microrganismo. Ver, por exemplo, Miki e colaboradores, 1993, “Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”, In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick δε Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88. Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira.

Transferência de gene mediada por microrganismo refere-se à utilização de um microrganismo para a introdução de um gene exógeno em uma planta hospedeira. Embora a Agrobacterium (Horsch e colaboradores, Science 227:1229-31, 1985) tenha sido amplamente utilizada para a transferência de genes para uma planta, não é a única bactéria capaz de transformar plantas. Por exemplo, foi mostrado que várias espécies de bactérias fora do gênero Agrobacterium podem ser modificadas para mediar a transferência de genes para diversas plantas. Bactéria de duas famílias, e três gêneros, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti e Mesorhizobium loti, foram tornadas competentes para transferência de gene pela aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de um vetor binário. Broothaerts, W. e colaboradores Nature Feb. 10, 433 (7026):629-633 (2005). Transformação estável de três espécies vegetais, tabaco, arroz e Arabidopsis, foi obtida com estas espécies não Agrobacterium utilizando-se disco de folha, calo derivado de escutelo ou pela técnica de “floral dip”. Id. Desta forma, diversas bactérias associadas a planta, quando contendo um plasmídeo Ti desarmado e vetor binário (ou presumidamente um plasmídeo Ti cointegrado ou total), são prontamente capazes de transferir T-DNA para plantas e podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção.

101/225

Uma planta transgênica da presente invenção é uma que compreende pelo menos um genoma celular no qual um ácido nucléico exógeno foi integrado de forma estável. De acordo com a presente invenção, uma planta transgênica que compreende apenas uma célula e genoma celular geneticamente modificado, ou é uma planta que compreende algumas células geneticamente modificadas, ou é uma planta na qual todas as células são geneticamente modificadas. Uma planta transgênica da presente invenção pode ser uma que compreende a expressão do polinucleotídeo desejado, isto é, o ácido nucléico exógeno, em apenas algumas partes da planta. Desta forma, uma planta transgênica pode conter apenas células geneticamente modificadas em algumas partes de sua estrutura.

São conhecidos métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucléicos heterólogos em plantas em particular e podem ser utilizados com os ácidos nucléicos providos aqui para preparar plantas transgênicas que exibem susceptibilidade reduzida à alimentação por parte de um organismo peste alvo. Vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, pela inserção do dsRNA produtor de ácidos nucléicos descrito aqui em vetores de transformação de plantas e introdução destes em plantas. Um sistema vetor conhecido foi derivado pela modificação do sistema de transferência de gene natural da Agrobacteríum tumefaciens. O sistema natural compreende plasmídeos Ti grandes (indutores de tumor) contendo um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Um outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região do T-DNA é flanqueada por repetições terminais. Nos vetores binários modificados os genes indutores de tumor foram retirados e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA exógeno flanqueado pelas seqüências

102/225 de borda do T-DNA. A região T pode conter também um marcador selecionável para recuperação eficiente das plantas e células transgênicas, e um sítio de clonagem múltiplo para a inserção de seqüências para a transferência, tal como um ácido nucléico que codifica dsRNA.

Uma planta transgênica formada utilizando-se um método de transformação com Agrobacterium ou outros métodos de transformação baseados em microrganismo, tipicamente contém uma seqüência de nucleotídeos recombinante inserida em um cromossomo e é chamada de evento transgênico. Essas plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotos para a seqüência exógena inserida. Uma planta transgênica homozigota em relação a um transgene pode ser obtida pela individualização de uma planta transgênica segregante independente para produzir a semente Fl. Um quarto da semente F1 produzida será homozigoto em relação ao transgene. A germinação da semente Fl resulta em plantas que podem ser testadas para heterozigosidade e homozigosidade, tipicamente utilizando-se um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).

Da mesma forma, a presente invenção provê plantas ou células vegetais, compreendendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente invenção. Numa modalidade, as plantas são angiospermas ou gimnospermas. Além do significado normal de planta, o termo “plantas” significa também o fruto, semente, flor, estróbilo, etc. da planta. A planta da presente invenção pode ser um transfectante direto, significando que o vetor foi introduzido diretamente na planta, tal como através de Agrobacterium, ou a planta pode ser a progênie de uma planta transfectada. A progênie pode ser obtida também por reprodução assexuada de uma planta transfectada. A segunda ou subseqüente geração pode ser ou não um gametófito (estágio haplóide) ou um

JL^

103/225 esporófito (estágio diplóide).

X - Melhoramentos/Cruzamentos Convencionais

Em adição à transformação direta de uma planta com uma construção de ácido nucléico recombinante, plantas transgênicas podem ser preparadas por cruzamento de uma primeira planta contendo uma construção de ácido nucléico recombinante com uma segunda planta não contendo a construção. Por exemplo, ácido nucléico recombinante para a supressão genética pode ser introduzido na primeira linhagem vegetal que é susceptível a transformação para produzir uma planta transgênica que pode ser cruzada com uma segunda linhagem vegetal para a introgressão do ácido nucléico recombinante para supressão genética na segunda linhagem vegetal.

Pode ser vantajoso se expressar uma construção de ácido nucléico recombinante em uma planta macho estéril, por exemplo, como um meio para reduzir a preocupação a propósito do fluxo do transgene para plantas vizinhas.

A presente invenção pode ser, na prática, combinada com outras características de controle de insetos em uma planta para se obter as características desejadas de controle aperfeiçoado de infestação por insetos. A combinação características de controle de inseto que empregam modos de ação distintos pode prover plantas transgênicas protegidas contra insetos com durabilidade superior em relação a plantas apresentando uma única característica de controle de inseto, tendo em vista a probabilidade reduzida de desenvolvimento de resistência no campo.

A combinação de algumas construções de dsRNA com um ou mais genes de proteína de controle de peste pode resultar em sinergias que aumentam o fenótipo de controle de peste de uma planta transgênica. Bioensaios de peste empregando ração artificial ou tecido vegetal <0 Υ

104/225 total podem ser utilizados para definir as respostas a dosagem para mortalidade larval, por exemplo, ou inibição do crescimento utilizandose tanto dsRNA quanto proteínas de controle de peste. Um especialista na técnica pode testar misturas de moléculas de dsRNA e proteínas de controle de peste em um bioensaio para identificar combinações de ativos que são sinérgicos e desejáveis para o emprego em plantas protegidas (Tabashnik, 1992). Sinergismo no combate a pestes foi mostrado entre diferentes proteínas de controle de peste (para uma revisão, ver Schnepf e colaboradores, 1998). Antecipa-se que sinergismos existirão entre certos dsRNAs e entre certos dsRNAs e certas proteínas de controle de peste.

XI. Quantificação da Inibição da Expressão do Gene Alvo

A inibição da expressão do gene alvo pode ser quantificada pela mensuração ou do RNA alvo endógeno ou da proteína produzida pela tradução do RNA alvo e as conseqüências da inibição podem ser confirmadas pelo exame das propriedades externas da célula ou organismo. Técnicas para a quantificação do RNA e proteínas são bem conhecidas de um especialista na técnica. Marcadores selecionáveis múltiplos estão disponíveis que conferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, forfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina e tetraciclina e outros.

Em algumas realizações, a expressão genética é inibida em pelo menos 10%, preferivelmente em pelo menos 33%, mais preferivelmente em pelo menos 50%, e ainda mais preferivelmente em pelo menos 80%. Em realizações particularmente preferidas da invenção a expressão genética é inibida em pelo menos 90%, mais preferivelmente em pelo menos 95%, ou em pelo menos 99% nas células da peste, desta forma

105/225 ocorre uma inibição significativa. Por inibição significativa se quer referir a inibição suficiente que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, interrupção do crescimento larval, paralisia ou mortalidade, etc.) ou uma redução detectável no RNA e/ou proteína correspondente ao gene alvo sendo inibido. Embora em algumas realizações da invenção a inibição ocorra em substancialmente todas as células do inseto, em outras realizações preferidas a inibição ocorre em apenas um subconjunto de células expressando o gene. Por exemplo, se o gene a ser inibido representa um papel essencial no trato alimentar do inseto, a inibição do gene nestas células é suficiente para exercer um efeito deletério no inseto.

XII - Produtos

A invenção provê também produtos de consumo contendo uma ou mais das seqüências da presente invenção, e produzidos a partir de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das seqüências de nucleotídeos da invenção. Um produto de consumo contendo uma ou mais das seqüências da presente invenção inclui, mas sem limitação, tortas, óleos, grãos ou sementes moídos ou inteiros de uma planta, qualquer produto alimentício compreendendo qualquer torta, óleo, grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombinante, ou qualquer silagem, fibra, papel, ou outro produto derivado de uma planta da invenção contendo uma ou mais das seqüências da presente invenção. A detecção de uma seqüência inventiva em um produto de consumo provê uma evidencia de fato que o produto compreende uma planta transgênica, ou parte desta, expressando uma seqüência inventiva para o controle de infestação por peste utilizando métodos de supressão genética mediada por dsRNA.

Exemplos específicos são apresentados abaixo dos métodos para a identificação de seqüências alvo compreendendo pelo menos um ou

106/225 mais moléculas de RNA de fita dupla exemplificadas aqui destinadas a suprimir uma característica ou função essenciais em uma paste, bem como para a introdução de seqüências alvo em plantas. Pretende-se que sejam exemplares e não limitativos da presente invenção.

Exemplo 1

Silenciamento de Genes Alvo de C. elegans em C. elegans em Varredura de Alto Rendimento Uma biblioteca ampla de genoma de C. elegans foi preparada em um vetor pGN9A (WO 01/88121) entre dois promotores T7 idênticos e terminadores, acionando sua expressão nas direções senso e anti-senso pela expressão da polimerase T7, a qual foi induzida por IPTG.

Esta biblioteca foi transformada na cepa bacteriana AB301-105 (DE3) no formato de placa de 96 poços. Para a varredura ampla do genoma, estas células bacterianas foram alimentadas à cepa de C.

elegans nuc-l(el392) deficiente em nuclease.

A alimentação de vermes de C. elegans nuc-1 (el392) com dsRNA produzido na cepa bacteriana AB301-105 (DE3), foi realizada em uma placa de 96 poços como se segue: ovos de nuc-1 foram transferidos para uma placa separada e deixados eclodir simultaneamente a 20°C para sincronização da geração Ll. As placas de 96 poços foram preenchidas com 10 μΐ de meio de crescimento líquido compreendendo IPTG com 10 μΐ de cultura de célula bacteriana AB301-105 (DE3) a ODõooI da biblioteca de dsRNA de C. elegans cada um contendo um vetor com fragmento genômico de C. elegans para a expressão do dsRNA. A cada poço foram adicionados 4 dos vermes Ll sincronizados e incubou-se a 25°C por pelo menos 4 a 5 dias. Estes experimentos foram realizados em quadruplicata. Na tela foram utilizados 6 controles:

- pGN29 = controle negativo, tipo selvagem

- pGZl = unc-22 = fenótipo twitcher

107/225

- pGZ18 = quitina sintase = letal embriônico

- pGZ25 = pos-1 = letal embriônico

- pGZ59 = bli-4D = letal agudo

- ACC = acetil co-enzima A carboxilase = letal agudo

Após 5 dias, o fenótipo dos vermes de C. elegans nuc-1 (el392) alimentados com as bactérias produzindo dsRNA, foi comparado com o fenótipo dos vermes alimentados com o vetor vazio (pGN29) e com os outros controles. Os vermes que foram alimentados com o dsRNA foram selecionados para letalidade (aguda ou larval), letalidade para a geração parental (Po), letalidade (embriônica) para a primeira geração (Fl), ou para retardo do crescimento de Po como se segue: (i) Letalidade aguda de Po: Os LI não se desenvolveram e morreram, este fenótipo nunca produz progênie e o poço parece bem vazio; (ii) Letalidade (larval de Po: Po morreu em um estágio posterior ao de Ll, este fenótipo também nunca produziu progênie. Larvas mortas e vermes adultos mortos são encontrado nos poços; (iii) Letalidade para Fl: Os Ll se desenvolveram até o estágio adulto e ainda estão vivos. Este fenótipo não tem progênie. Isto pode ser devido à esterilidade, letalidade embriônica (ovos mortos no fundo dos poços), interrupção embriônica ou interrupção larval (eventualmente acaba sendo letal); (iv) Interrupção do crescimento e retardo /atraso no crescimento: Em comparação com um poço com desenvolvimento normal e número normal de progênie.

Para as seqüências alvo apresentadas na Tabela IA, concluiu-se que o silenciamento mediado por dsRNA do gene alvo de C. elegans em nematódeos, tais como C. elegans, apresentou um efeito fatal sobre o crescimento e viabilidade do verme.

Subseqüentemente ao experimento de silenciamento por dsRNA acima, foi conduzido um experimento mais detalhado de fenotipagem foi conduzido em C. elegans em uma formato de alto rendimento em placas

108/225 fU de 24 poços. A biblioteca de dsRNA produzida na cepa bacteriana AB301-105 (DE3), conforme descrito acima, foi alimentada a vermes de C. elegans nuc-1 (el392) em placas de 24 poços como se segue: ovos de nuc-1 foram transferidos para uma placa separada e deixados eclodir simultaneamente a 20°C para sincronização da geração Ll. Subseqüentemente, 100 vermes Ll sincronizados foram embebidos em uma mistura de 500 μΐ de meio de alimentação completo S, compreendendo 5 pg/ml de colesterol, 4 μΙ/ml de PEG e lmM de IPTG, e 500 μΐ de cultura de célula bacteriana AB301-105 (DE3) a ODôooI da biblioteca de dsRNA de cada um contendo um vetor com fragmento genômico de C. elegans para a expressão do dsRNA. Os vermes Ll embebidos foram rolados por 2 horas a 25°C.

Após centrifugação e remoção de 950 μΐ do sobrenadante, 5 μΐ do pélete remanescente e re-suspendido (compreendendo cerca de 10 a

15 vermes) foram transferidos para o meio de cada poço de uma placa de 24 poços, preenchidos com uma camada de caldo LB em agar. A placa inoculada foi incubada a 25°C por 2 dias. No estágio adulto, um verme adulto foi individualizado e incubado a 25°C por 2 dias para inspeção de sua progênie. Os outros vermes adultos foram inspeciona20 dos in situ na placa de 24 poços original. Estes experimentos foram realizados em quadruplicata.

O fenótipo dos vermes alimentados com dsRNA de C. elegans foi comparado com o fenótipo dos vermes de C. elegans nuc-1 alimentados com vetor vazio.

Com base neste experimento concluiu-se que o silenciamento de genes alvo de C. elegans como representados na Tabela IA apresentou um efeito fatal sobre o crescimento e viabilidade dos vermes e que o gene alvo é essencial para a viabilidade dos nematódeos. Desta forma, estes genes são bons genes alvo para o controle (eliminação ou preven109/225 ção de crescimento) de nematódeos por meio de silenciamento genético mediado por dsRNA. Da mesma forma, a presente invenção engloba a utilização de ortólogos de nematódeo do gene alvo de C. elegans acima para controlar infestação de nematódeo, tal como infestação de nematódeos em plantas.

Exemplo 2

Identificação de Ortólogos de D. melanogaster

Conforme descrito no Exemplo 1 acima, numerosas seqüências letais de C. elegans foram identificadas e podem ser utilizadas para a identificação de ortólogos em outras espécies e gêneros. Por exemplo, as seqüências letais de C. elegans podem ser utilizadas para identificar seqüências ortólogas de D. melanogaster. Isto é, cada seqüência de C. elegans pode ser comparada contra uma base de dados pública, tal como GenBank, para seqüências ortólogas em D. melanogaster. Ortólogos potenciais de D. melanogaster foram selecionados que compartilham um alto grau de homologia de seqüência (valor E preferivelmente abaixo ou igual a 1E-30) e as seqüências são os melhores hits bidirecionais via blast, o que significa que as seqüências de diferentes organismos (por exemplo, C. elegans e D. melanogaster] são os melhores hits via blast entre si. Por exemplo, a seqüência C de C. elegans é comparada contra seqüências em D. melanogaster utilizando-se o BLAST. Se a seqüência C apresentasse a seqüências D de D. melanogaster como melhor hit e quando D é comparada com todas as seqüências de C. elegans, também se mostra como sendo a seqüência C, então D e C são melhores hits bidirecionais. Este critério é frequentemente utilizado para definir ortologia, significando que seqüências similares de diferentes espécies apresentam função similar. Os identificadores da seqüência de D. melanogaster estão representados na Tabela IA.

Exemplo 3

110/225

Leptinotarsa decemtíneata (Besouro da Batata do Colorado}

A. Clonagem Parcial de

Seqüências de Gene de Leptinotarsa decemtíneata

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de 4 estágios larvais diferentes de Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado; fonte: Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162, 6700 AD Wageningen, Holanda) utilizando-se o reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação do RNA foi removido por tratamento com DNase seguindo-se as instruções do fabricante (Cat. n° 1700, Promega). O cDNA foi gerado utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes LD001, LD002, LD003, LD006, LD007, LDO10, LDO11, LD014, LD015, LD016 e LD018, uma série de reação PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-LD, a qual mostra os genes alvo de Leptinotarsa decemlineata incluindo as seqüências iniciadoras e as seqüências de cDNA obtidas. Estes iniciadores foram utilizados nas respectivas reação PCR com as seguintes condições: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706,

J.^-7

111/225

Qiagen), clonados no vetor pCR8/GW/topo (Cat. n° K2500 20, Invitrogen), e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representados pelas respectivas SEQ ID Nos. tais como fornecidas na Tabela 2-LD e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. tais como fornecidas na Tabela 3-LD, onde o início do quadro de leitura está indicando em colchetes.

B - Produção de dsRNA dos Genes de Leptinotarsa decemlineata

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit comercialmente disponível T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P 1700, Promega). Primeiramente foram gerados dois moldes únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 em duas reação PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores específicos T7 positivos e iniciadores reversos específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-LD. As condições nas reação PCR foras as seguintes: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivos específicos e iniciadores reversos específicos T7 em uma reação PCR com as mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-LD. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados com kit de purificação de PCR (Qiaquick PCR Purification Kit, Cat. n° 28106,

112/225

Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo T7 e reverso foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas por acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8LD. A Tabela 8-LD mostra seqüências para a preparação de fragmentos de dsRNA de seqüências alvo de Leptinotarsa decemlineata e seqüências de concatâmeros, incluindo as seqüências de iniciadores.

C - Clonagem de Genes de Leptinotarsa decemlineata no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência por RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, conforme selecionadas acima, foram clonadas nas orientações senso e anti-senso, separadas por intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção em grampo de dsRNA. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (=pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) foi obtido da VIB/Plant Systems Biology com um acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR foi realizada utilizando-se a mistura de enzimas LR Clonase™ II (Cet. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes LD002, LD006, LD007, LDOIO, LDO11, LD014 e LD016, contendo ou o promotor senso - intron -CmR - intron - orientação anti-senso, ou promotor - anti-senso - intron CmR - intron - orientação senso, e onde o promotor é o promotor operativo em planta 35S. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para a transforma

113/225 ção em A. tumefaciens.

Para o LD002, foi realizada uma digestão dupla com enzimas de restrição BsoBI & Pvul e, LD002 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 3A). Para o LD006, uma digestão com a enzima de restrição BsoBI foi realizada em LD006 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 3A). Para o LD007, uma digestão com a enzima de restrição BsoBI foi realizada em LD007 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 3A). Para o LD007, uma digestão com a enzima de restrição BsoBI foi realizada em LD007 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 3A). Para o LDO 10, uma digestão dupla com as enzimas de restrição Pvul & PvuII foi realizada em LD010 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 3A). Para o LDO 14, uma digestão com a enzima de restrição BsoBI foi realizada em LDO 14 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 1). Para o LDO 16, uma digestão com a enzima de restrição BsoBI foi realizada em LDO 16 clonado em pCR8/GW/topo (ver Exemplo 3A). A banda contendo o gene de interesse flanqueada pelos sítios attL foi purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng de fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntamente com a enzima LR clonase II e incubados por pelo menos lha 25°C. Após o tratamento com solução de proteinase (10 minutos a 37°C), a mistura recombinante total foi transformada em células Top 10 quimicamente competentes. Os clones positivos foram selecionados por análise de digestão por restrição. A seqüência completa da construção em grampo para:

- LD002 (anti-senso - intron - CmR - intron - senso) é apresentada na SEQ ID No.: 240;

- LD006 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é apresentada na SEQ ID No.: 241;

- LD007 senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é apresenta114/225 da na SEQ ID No.: 242;

- LD010 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é apresentada na SEQ ID No.: 243;

- LD011 (anti-senso - intron - CmR - intron - senso) é apresen5 tada na SEQ ID No.: 244;

- LD014 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é apresentado na SEQ ID No.: 245;

- LD016 (anti-senso - intron - CmR - intron - senso) é mostrada na SEQ ID No.: 246.

D. Seleção de dsRNAs Alvo

Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade

Contra Leptinotarsa decemlineata

Foi preparada ração artificial para o besouro da batata do Colorado como se segue (adaptada de Gelman e colaboradores, 2001, J. Ins.

Sc., vol. 1, n° 7, 1-10): água e agar foram autoclavados e os demais ingredientes (mostrados na Tabela 2 abaixo) foram adicionados quando a temperatura se reduziu para 55°C. Nesta temperatura, os ingredientes foram bem misturados antes da ração ser dividida em alíquotas em placas de 24 poços (Nunc) com uma quantidade de 1 ml de ração por poço. A ração artificial foi deixada solidificar por resfriamento para a temperatura ambiente. A ração foi armazenada a 4°C por até três semanas.

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Ingredientes	Volume para 1 litro
água	768 ml
gar	14 g
aveia em pélete	40 g
levedura Torula	60 g
hidrolisado de lactoalbumi- na	30 g
caseína	10 g
frutose	20 g
mistura de sal de Wesson	4 g
pó de tomate	12,5 g
pó de folha de tomate	25 g
b-sitosterol	1 g
ácido sórbico	0,8 g
metil-parabeno	0,8 g
mistura de vitamina Vander- zant	12 g
sulfato de neomicina	0,2 g
aureomicina	0,130 g
rifampicina	0,130 g
cloranfenicol	0,130 g
nistatina	0,050 g
óleo de soja	2 ml
óleo de germe de trigo	2 ml

Cinqüenta μΐ de uma solução de dsRNA a uma concentração de 1 mg/ml foram aplicados topicamente na ração artificial sólida nos poços da placa multi-poços. A ração foi secada em câmara de fluxo laminar. Por tratamento, vinte e cinco larvas de besouro da batata do

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Colorado (2° estágio), com dois insetos por poço, foram testadas. As placas foram armazenadas na câmara de cultivo de inseto a 25 ± 2°C, umidade relativa de 60%, com um fotoperíodo luz:escuro de 16:8 horas. Os besouros foram verificados como vivos ou mortos a cada 1, 2 ou 3 dias. Após sete dias, para os alvos LD006, LD007, LD010, LD011, e LD014, a ração foi substituída por ração fresca com dsRNA aplicado topicamente na mesma concentração (1 mg/ml); para os alvos LD001, LD002, LD003, LD015, e LD016, a ração foi substituída apenas por ração fresca. Os alvos de dsRNA foram comparados para apenas com ração ou com dsRNA aplicado topicamente correspondendo a um fragmento da seqüência de codificação GFP (proteína fluorescente verde) (SEQ ID No.: 235).

Alimentando-se com ração artificial contendo dsRNAs nus intactos a larvas de L. decemlineata resultou em aumentos significativos nas mortalidades larvais conforme indicado em dois bioensaios separados (Figuras 1LD-2LD).

Todos os dsRNAs testados resultaram basicamente em 100% de mortalidade após 7 a 14 dias. A ração com ou sem dsRNA de GFP sustentou os insetos durante o bioensaio com pouca ou nenhuma mortalidade.

Tipicamente, em todos os ensaios observados, larvas de segundo estágio CPB se alimentaram normalmente com a ração com ou sem dsRNA por 2 dias e mudaram para o terceiro estágio larval. Neste novo estágio larval, observou-se que os CPB reduziram ou interromperam significativamente sua alimentação, com um aumento na mortalidade como resultado.

E - Bioensaio de Alvos de dsRNA

Utilizando-se Discos de Folha de Batata

Para Atividade Contra Leptinotarsa decemlineata

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Um método de bioensaio alternativo foi empregado utilizando-se material de folha de batata no lugar de ração artificial como fonte alimentícia para CPB. Discos de aproximadamente 1,1 cm de diâmetro (ou 0,95 cm²) foram cortados de folhas de 2 a 3 semanas de idade de plantas de batata utilizando-se uma furadeira de cortiça de tamanho adequado. Os discos de folha tratados foram preparados pela aplicação de 20 μΐ de uma solução 10 ng/μΐ de dsRNA de LD002 alvo ou controle gfp dsRNA na superfície foliar adaxial. Os discos de folha foram deixados secar e foram colocados individualmente em 24 poços de uma placa de 24 poços (Nunc). Um único CPB no segundo estágio larval foi colocado em cada poço, o qual foi então coberto com papel tecido e uma tampa plástica multi-poço. A placa contendo os insetos e discos de folha foram mantidos em uma câmara de inseto a 28°C com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. Os insetos foram deixados se alimentarem nos discos de folha por 2 dias, após os quais os insetos foram transferidos para uma nova placa contendo novos discos de folha tratada. Posteriormente, os insetos foram transferidos para uma placa contendo discos de folha não tratada todos os dias até o dia 7. A mortalidade e peso dos insetos foram determinados.

A alimentação das larvas de L. decemlineata com discos de folha de batata com a superfície tratada com dsRNA nu intacto do alvo LD002 resultou em um aumento significativo na mortalidade larval (isto é, no dia 7 todos os insetos estavam mortos; 100% de mortalidade) enquanto que o controle gfp dsRNA não apresentou qualquer efeito sobra a sobrevivência do CPB. O dsRNA do alvo LD002 afetou severamente o crescimento das larvas após de 2 a 3 dias, enquanto que as larvas alimentadas com gfp dsRNA na mesma concentração se desenvolveram normalmente (Figura 3-LD).

F - Seleção de Versões Mais Curtas de dsRNA

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Utilizando Ração Artificial Para Atividade Contra Leptinotarsa decemlineata

Este Exemplo mostra a observação de que fragmentos de dsRNA mais curtos (60 ou 100 bp) por si só ou como construções de concatâ5 mero são suficientes para causar toxidez contra o besouro da batata do Colorado.

LD004, um alvo conhecido por induzir letalidade em besouro da batata do Colorado, foi selecionado para este exemplo. Este gene codifica uma subunidade E de V-ATPase (SEQ ID No.: 15).

Um fragmento de 100 pares de bases, LDO14_F1, na posição

195-294 da SEQ ID No.: 15 (SEQ ID No.: 159) e um fragmento de 60 pares de bases, LD014_F2, na posição 235-294 da SEQ ID No.: 15 (SEQ ID No.: 160) foram adicionalmente selecionados. Ver também Tabela 7LD.

Dois concatâmeros de 300 pares de bases, LDO14_C1 e

LD014_C2, foram desenhados (SEQ ID No.: 161 e SEQ ID No.: 162). O LDO14_C1 continha 3 repetições do fragmento de 100 pares de bases descrito acima (SEQ ID No.: 159) e o LD014_C2 continha 5 repetições do fragmento de 60 pares de bases descrito acima (SEQ ID No.: 160).

Ver também Tabela 7-LD.

Os fragmentos LDO14_F1 e LD014_F2 foram sintetizados como iniciadores senso e anti-senso. Estes iniciadores foram anelados para criar as moléculas de DNA de fita dupla antes da clonagem. Foram incluídos sítios das enzimas de restrição Xbcü. e XmàL nas extremidades

5’ e 3’ dos iniciadores, respectivamente, para facilitar a clonagem.

Os concatâmeros foram obtidos como genes sintéticos de 300 pares de bases. Foram incluídos sítios das enzimas de restrição Xbcü e Xmal nas extremidades 5’ e 3’ dos fragmentos de DNA sintético, respectivamente, para facilitar a clonagem.

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As 4 moléculas de DNA, isto é, as 2 unidades simples (LDO14_F1 e LD014_F2) e os 2 concatâmeros (LDO14_C1 e LD014_C2), foram digeridas com Xbal e Xmal e sub-clonadas em pBluescriptII SK+ linearizado por digestão com Xbal e Xmal, resultando nos plasmídeos recombinantes pl, p2, p3 e p4, respectivamente.

Produção de RNA de fita dupla: o dsRNA foi sintetizado utilizando-se o kit comercialmente disponível T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P1700, Promega). Primeiramente dois moldes de promotor separados únicos de 5’ T7 RNA polimerase foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7. Para o LDO14_F1, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se o iniciador positivo T7 específico oGBM159 e o iniciador reverso específico OGBM164 (representados aqui como SEQ ID No.: 204 e SEQ ID No.: 205, respectivamente) em uma reação PCR nas seguintes condições: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se o iniciador positivo específico oGBM163 e o iniciador reverso T7 específico 0GBMI6O (representados aqui como SEQ ID No.: 206 e SEQ ID No.: 207, respectivamente) em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados por um kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante é representada aqui pela SEQ ID No.: 203.

J

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Para o LD014_F2, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se o iniciador positivo T7 específico 0GBMI6I e o iniciador reverso específico 0GBMI66 (representados aqui como SEQ ID No.: 209 e SEQ ID No.: 210, respectivamente) em uma reação PCR nas seguintes condições: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se o iniciador positivo específico OGBM165 e o iniciador reverso T7 específico oGBM162 (representados aqui como SEQ ID No.: 211 e SEQ ID No.: 212, respectivamente) em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados por kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante é representada aqui pela SEQ ID No.: 208.

Também para os concatâmeros, moldes de promotor separados únicos de 5’ T7 RNA polimerase foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7. Os plasmídeos recombinantes p3 e p4 contendo LDO14_C1 e LD014_C2 foram linearizados com Xbaí ou Xmaí, os dois fragmentos lineares para cada construção foram purifica25 dos e utilizados como moldes para os ensaios de transcrição in vitro, utilizando-se os promotores T7 flanqueando os sítios de clonagem. O RNA de fita dupla foi preparado por transcrição in vitro utilizando-se o T7 RiboMAX™ Express RNAi System (Promega). As fitas senso do dsRNA resultante para LDO14_C1 e LD014_C2 estão representadas aqui

121/225 como SEQ ID No.: 213 e SEQ ID No.: 214, respectivamente.

As seqüências mais curtas do alvo LD014 e concatâmeros foram capazes de induzir letalidade em Leptinotarsa decemlineata, conforme mostrado na Figura 4-LD.

G - Seleção de dsRNAs a Diferentes Concentrações Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade Contra Leptinotarsa decemlineata

Cinqüenta μΐ de uma solução de dsRNA em concentrações em série de dez vezes a partir de 1 pg/μΐ (para o alvo LD027 a partir de 0,1 pg/μΐ) até 0,01 ng/μΐ, foram aplicados topicamente em ração artificial sólida nos poços de uma placa de 24 poços (Nunc). A ração foi secada em uma cabine de fluxo laminar. Foram testados vinte e quatro larvas de besouro da batata do Colorado (2° estágio) por tratamento, com dois insetos por poço. As placas foram armazenadas em uma câmara de criação de inseto a 25 ± 2°C, umidade relativa de 60%, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Os besouros foram examinados como vivos ou mortos em intervalos regulares até o dia 14. Após sete dias, a ração foi substituída por ração fresca com dsRNA aplicado topicamente nas mesmas concentrações. Os alvos de dsRNA foram comparados com apenas ração.

A alimentação de larvas de L. decemlineata com ração artificial contendo dsRNA nu intacto de diferentes alvos resultou em mortalidades larvais altas em concentrações tão baixas quanto entre 0,1 e 10 ng de dsRNA/μΐ como mostrado na Figura 5-LD.

H - Clonagem de um Fragmento do Gene de CPB num Vetor Adequado Para Produção Bacteriana de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

Embora qualquer promotor bacteriano eficiente possa ser utilizado, um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de

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MLB foi clonado em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano (ver WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo qualquer uma das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em um reação PCR com as seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gal de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfl (referência ao documento W000188121A1), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJ003.

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação do fragmento do gene alvo LD010 são providas na Tabela 8 (iniciador positivo SEQ ID No.: 191 e iniciador reverso SEQ ID No.: 190). O molde utilizado foi o vetor pCR8/GW/topo contendo a seqüência do LD010 (SEQ ID No.: 11). Os iniciadores foram utilizados em um reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante foi analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfl (referência ao documento W000188121A1), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à SEQ ID No.: 188 tal como fornecida na Tabela

8. O vetor recombinante contendo esta seqüência foi denominada de

123/225 pGBNJ003.

I - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Esch.erich.ia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do alvo LD010 em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de submetê-las a um tratamento de choque térmico de 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopro124/225 piltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada atualização. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

J. Experimentos Laboratoriais

Para Testar Escherichia coli que Expressa Alvo de dsRNA LDO1O

Contra Leptinotarsa decemlineata d

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Dois métodos de bioensaio foram empregados para testar o RNA de fita dupla produzido em Escherichia coli contra larvas de besouro da batata do Colorado: (1) bioensaio baseado em ração artificial e (2) bioensaio baseado em planta.

Bioensaios baseados em ração artificial

Foi preparada ração artificial para o besouro da batata do Colorado tal como descrito previamente no Exemplo 4. Meio mililitro de ração foi colocado em cada um dos poços de uma placa de teste multipoço de 48 poços (Nunc). Para cada tratamento, 50 μΐ de uma suspen10 são OD 1 de bactérias tratadas termicamente (o que equivale a aproximadamente 5 x 10⁷ células bacterianas) expressando dsRNA foram aplicados topicamente sobre a ração sólida nos poços e as placas foram deixadas secar em uma capela de fluxo laminar. Foram testados, por tratamento, 48 besouros da batata do Colorado em 2° estágio, um em cada poço contendo ração e bactéria. Cada fileira de uma placa (isto é, 8 poços) foi considerada como uma replicata. As placas foram mantidas em uma câmara de criação de inseto a 25 ± 2°C, 60 ± 5% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Após cada 4 dias, os besouros foram transferidos para ração fresca contendo bactéria aplicada topicamente. Os besouros foram examinados como vivos ou mortos a cada um ou três dias após a infestação. Para os sobreviventes, o crescimento e desenvolvimento em termos de peso larval foram registrados no dia 7 após a infestação.

Para a cepa AB309-105 de E. coli deficiente em RNaselII, as bac25 térias contendo o plasmídeo pGBNJ003 e aquelas contendo o vetor pGN29 vazio (referência ao documento WO 00/188121 Al) foram testadas em bioensaios para toxidez em CPB. As bactérias contendo o plasmídeo pGBNJ003 mostraram um claro aumento de mortalidade dos insetos no tempo, enquanto que pouca ou nenhuma mortalidade foi

126/225 observada para o controle pGN29 e apenas ração (Figuras 6a-LD e 7aLD). O crescimento e desenvolvimento das larvas de besouro da batata do Colorado sobreviventes, 7 dias após a alimentação com ração artificial contendo bactéria expressando alvo LD 010 de dsRNA, foram severamente impedidos (Tabela 10-LD, Figura 8a-LD).

Para a cepa BL21(DE3) de E. coli, as bactérias contendo o plasmídeo pGBNJ003 e as contendo o vetor vazio pGN29 foram testadas contra larvas de besouro da batata do Colorado. Foram observados efeitos prejudiciais sobre as larvas alimentadas com ração suplementada com bactérias BL21 (DE3) tal como para a cepa deficiente em RNaselII, AB309-105 (Figuras 6b-LD e 7b-LD). Entretanto, o número de sobreviventes para os cinco clones foi mais alta para a BL21(DE3) que para a AB309-105; no dia 12, os valores médios de mortalidade foram de aproximadamente 25% mais baixos para esta cepa em comparação com a cepa deficiente em RNaselII. Da mesma forma, os pesos médios dos sobreviventes alimentados com ração contendo BL21(DE3) expressando dsRNA correspondendo ao alvo LD010 foram severamente reduzidos (Tabela 10-LD, Figura 8b-LD).

O retardo no crescimento e desenvolvimento das larvas de CPB alimentadas com ração contendo ambas as duas cepas bacterianas contendo o plasmídeo pGBNJ003, foi diretamente correlacionado com a inibição da alimentação uma vez que nenhum excremento era visível nos poços de placas reabastecidas a partir do dia 4 em diante quando em comparação com as bactérias contendo o vetor vazio pGN29 ou apenas ração. Esta observação foi similar à de quando o CPB foi alimentado com RNA de fita dupla transcrito in vitro aplicado topicamente à ração artificial (ver Exemplo 3D); aqui, a interrupção da alimentação ocorreu a partir do dia 2 em diante com a ração tratada.

Bioensaios baseados em planta.

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Plantas de batata inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias induzidas quimicamente expressando dsRNA antes de utilizar as plantas na alimentação de larvas de CPB. As plantas de batata da variedade “linhagem 5” foram cultivadas a partir de tubérculos até o estágio de 8-12 folhas não abertas em uma câmara de cultivo vegetal nas seguintes condições: 25 ± 2°C, 60% de umidade relativa, fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa colocado no solo em um vaso e a base da garrafa cortada e coberta com uma malha de nylon fina para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir que as larvas escapassem. Foram colocadas 50 larvas do besouro da batata do Colorado no estágio Ll em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo os plasmídeos pGBNJ003 (clone 1; Figura 7a-LB) ou o plasmídeo pGN29 (clone 1; ver Figura 7a-LD). Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão bacteriana a um valor de densidade ótica de 1 em comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de 1,6 ml foi aspergido na planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta foi utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes foi contado e o peso de cada sobrevivente foi registrado.

A aspersão das planta com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático da mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. A contagem de mortalidade foi mantida quando a quantidade de suspensão de célula bacteriana foi diluída 9 vezes (Figura 9-LD). Os pesos médios das larvas sobreviventes no dia

Aél

128/225 nas plantas aspergidas com bactéria contendo o vetor pGBNJ003 foram aproximadamente 10 vezes menores que com pGN29 (Figura 10LD). O dano por alimentação pelas larvas de CPB nas plantas de batata aspergidas com bactéria contendo o plasmídeo pGBNJ003 foi muito reduzido quando em comparação com o dano ocorrido em uma planta de batata aspergida com bactéria contendo o vetor vazio pGN29 (Figura 11-LD).

Estes experimentos mostraram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência genética alvo de inseto produzido tanto no sistema de expressão de bactéria selvagem quanto no de bactéria deficiente em RNaselII, é tóxico contra o inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade dos insetos e retardo no crescimento/desenvolvimento das larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que um exemplo foi provido para a proteção efetiva de plantas/plantações contra dano por insetos pela utilização de aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondente a um alvo de gene de inseto.

K. Teste de Várias Densidades de Cultura em Suspensão de Escherichia coli

Expressando Alvo LD010 de dsRNA

Contra Leptinotarsa decemlineata

A preparação e o tratamento de culturas bacterianas são descritos no Exemplo 3J. Diluições seriais em três vezes das culturas (iniciando em 0,25 unidades equivalentes) da cepa AB309-105 deficien25 te em RNaselII de Escherichia coli expressando RNA de fita dupla do alvo LD010 foram aplicadas a folhagens da planta de batata da variedade “Bintje” no estágio de 8-12 folhas não abertas. Dez larvas Ll de L. decemlineata foram colocadas sobre plantas tratadas, com uma planta por tratamento. A pontuação para a mortalidade dos insetos e impedi129/225 mento de crescimento foi realizada no dia 7 (isto é, 7 dias após a infestação).

Conforme mostrado na Figura 14-LD, foi registrada uma alta mortalidade das larvas de CPB (90 a 100%) após uma semana que os insetos se alimentavam com plantas de batata tratadas com uma aplicação tópica de aspersão fina de culturas desativadas por calor de E. coli contendo o plasmídeo pGBNJ003 (para a expressão do dsRNA alvo 10) nas densidades de 0,25, 0,08 e 0,025 unidades bacterianas. Nas unidades 0,008, cerca de um terço dos insetos foram mortos, entretanto, os insetos sobreviventes estavam significativamente menores que aqueles no grupo de controle (£. coli contendo o vetor vazio pGN29 e apenas água). O dano por alimentação pelas larvas de CPB na planta de batata aspergida com bactéria contendo o plasmídeo pGBNJ003 nas concentrações de 0,025 e 0,008 unidades foi muito reduzido quando em comparação com o dano ocorrido em uma planta de batata aspergida com bactéria contendo o vetor vazio pGN29 (Figura 15-LD).

L - Os Adultos são Extremamente Susceptíveis a dsRNA Ingerido Oralmente

Correspondente aos Genes Alvo

O Exemplo provido abaixo salienta a observação de que insetos adultos (e não apenas insetos em estágio larval) são extremamente susceptíveis a dsRNA ingerido oralmente correspondente a genes alvo.

Quatro alvos foram escolhidos para este experimento: alvos 2, 25 10, 14 e 16 (SEQ ID Nos.: 168, 188, 198 e 220, respectivamente. O fragmento gfp de dsRNA (SEQ ID No.: 235) foi utilizado como controle. Adultos jovens (2 a 3 dias de idade) foram tomados ao acaso de nossa cultura criada em laboratório sem se considerar o gênero do inseto. Dez adultos foram escolhidos por tratamento. Os adultos foram préJ&3

130/225 jejuados por pelo menos 6 horas antes do início do tratamento. No primeiro dia de tratamento, cada adulto foi alimentado com quatro discos de folha de batata (diâmetro de 1,5 cm²) os quais foram prétratados com uma aplicação tópica de 25 μΐ de 0,lpg/^l de dsRNA alvo (sintetizado como descrito no Exemplo 3A; a aplicação tópica foi como descrito no Exemplo 3E) por disco. Cada adulto foi confinado em uma pequena placa de Petri (diâmetro de 3 cm) de maneira a se assegurar que todos os insetos ingerissem quantidades iguais de alimento e, desta forma, recebessem doses iguais de dsRNA. No dia seguinte, cada adulto foi novamente alimentado com discos de folha tratados como descrito acima. No terceiro dia, todos dez adultos por tratamento foram coletados e colocados juntos em uma gaiola consistindo em uma caixa plástica (dimensões 30 cm x 20 cm x 15 cm) com uma malha de nylon fina instalada na tampa para prover uma boa aeração. No interior da caixa, foi colocado na base algum papel de filtro umedecido. Alguma folhagem (não tratada) de batata foi colocada em cima do papel para manter os adultos durante o experimento. A partir do dia 5, análises regulares foram conduzidas de maneira a contar o número de insetos mortos, vivos (em movimento) e moribundos. Para a análise da moribundez, os adultos foram colocados de virados para baixo para se verificar se poderíam se virar de volta por si só em vários minutos; um inseto foi considerado moribundo apenas se não era capaz de se virar de volta.

Foram demonstrados efeitos tóxicos específicos claros do RNA de fita dupla correspondente a diferentes alvos em adultos do besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, neste experimento (Figura 12-LD). O RNA de fita dupla correspondente a um fragmento gfp não mostrou toxidez para adultos de CPB no dia da análise final (dia 19). Este experimento mostrou claramente que a sobrevivência de

Jék

131/225 adultos de CPB foi severamente reduzida após apenas uns poucos dias de exposição ao dsRNA quando administrado oralmente. Por exemplo, para o alvo 10, no dia 5, 5 de 10 adultos estavam moribundos (doentes e se movimentando lentamente); no dia 6, 4 de 10 adultos estavam mortos com três dos sobreviventes moribundos; no dia 9 todos os adultos estavam mortos.

Como conseqüência deste experimento, a aplicação dos RNAs de fita dupla alvo contra insetos peste pode ser ampliada para incluir os dois estágios de vida de um inseto peste (isto é, larvas e adultos) que podem causar dano extensivo em plantas cultivadas, como é o caso do besouro da batata do Colorado.

Exemplo 4

Phaedon cochlearíae (Besouro da Folha da Mostarda)

A - Clonagem de uma Seqüência Parcial dos Genes PCOO1, 15 PC003, PC005, PC010, PC014, PC016 e PC027 de Phaedon cochlearíae (Besouro da Folha da Mostarda) por Meio de PCR de Família

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de Phaedon cochlearíae (besouro da folha de mostarda; fonte Dr. Caroline Muller, Julius-vonSachs-Institute for Biosciences, Grupo de Ecologia Química, Universi20 dade de Wuerzburg, Julius-von-Sachs-Platz 3, D-97082 Wuerzburg, Alemanha) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo25 se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma

132/225 parte dos genes PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016 e PC027, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-PC. A Tabela 2-PC mostra genes alvo de Phaedon cochleariae incluindo seqüências de iniciador e seqüências de cDNA obtidas. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-PC e são referidas como seqüências parciais.

As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3PC. A Tabela 3-PC provê seqüências de aminoácidos de clones de cDNA, e o início do quadro de leitura está indicado entre colchetes.

B - Produção de dsRNA de Genes de Phaedon cochleariae

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° PI700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

133/225 <s^<s=Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-PC. A Tabela

8-PC provê detalhes da preparação dos fragmentos de RNA de seqüências alvo de Phaedon cochleariae, incluindo as seqüências dos iniciadores.

As condições nas reações PCR foram como se segue: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a

60°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-PC. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-PC.

C - Recombinação dos Genes de Phaedon cochleriae (Besouro da Folha de Mostarda) no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes

134/225 alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações senso e anti-senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 4A) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) foi obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR foi realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes PC001, PC010, PC014, PC016 e PC027, contendo o promotor senso - intron - CmR intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo 4B): para o PC001, uma digestão dupla com BsoBI e Pvul; para o PC010, uma digestão dupla com Pvul e PvuII; para o PC014, uma digestão tripla com HincII, Pvul e Xhol; para o PC016, uma digestão única com ApaLI; para o PC027, uma digestão dupla com Aval e Drdl. A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL foi purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubado por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total foi transformada em células quimicamente compeJós

135/225 tentes Top 10. Os clones positivos foram selecionados por análise de digestão por restrição. A seqüência completa da construção em grampo para:

- PC001 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 508;

- PC010 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 509;

- PC014 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 510;

- PC016 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 511;

- PC027 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 512.

A Tabela 9-PC provê as seqüências para cada uma das construções em grampo.

D. Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Discos de Folha de Colza Para Atividade Contra Larvas de Phaedon cochleariae

O Exemplo provido abaixo é um exemplo da observação de que larvas do besouro da folha de mostarda (MLB) são susceptíveis a dsRNA ingerido oralmente correspondente a genes alvo próprios.

De maneira a se testar as diferentes amostras de RNA de fita dupla contra larvas de MLB, um ensaio de disco de folha foi empregado utilizando-se material de folha de colza (Brassica napus variedade SW Oban; fonte: Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, UK) como fonte de alimento. As culturas de inseto foram mantidas na mesma variedade de colza na câmara de inseto a 25 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa com um fotoperíodo de 16 horas de

136/225 luz/8 horas de escuro. Foram cortados discos de aproximadamente 1,1 cm de diâmetro (ou 0,95 cm²) de folhas de plantas de colza de 4 a 6 semanas de idade utilizando-se um cortador de tamanho adequado. Amostras de RNA de fita dupla foram diluídas para 0,1 pg/μΙ em água

Milli-Q contendo 0,05% de Triton X-100. Os discos de folha tratados foram preparados pela aplicação de 25 μΐ da solução diluída do dsRNA dos alvos PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016, PC027 e dsRNA gfp de controle ou 0,05% de Triton X-100 em uma superfície foliar adaxial. Os discos de folha foram deixados secar e colocados individualmente em cada um dos 24 poços de uma multi-placa de 24 poços contendo 1 ml de agar 2% gelificado o que auxilia para prevenir que o disco de folha seque. Duas larvas de MLB recém nascidas foram colocadas em cada um dos poços da placa, que então foram cobertos com uma tampa plástica multi-poço. A placa (um tratamento contendo

48 insetos) foi dividida em 4 replicatas de 12 insetos por replicata (cada fileira). A placa contendo os insetos e os discos de folha foi mantida em uma câmara de inseto a 25 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuro. Os insetos foram alimentados com os discos de folha por 2 dias após o que foram transferidos para uma nova placa contendo novos discos de folha tratados. Após isto, 4 dias depois do início do bioensaio, os insetos de cada replicata foram coletados e transferidos para uma placa de Petri contendo folhas de colza novas não tratadas. A mortalidade e peso médio larval foram registrados nos dias 2, 4, 7, 9 e 11.

A alimentação das larvas de P. cochleariae com folhas de colza tratadas com dsRNA nu intacto resultou em aumentos significativos na mortalidade larval para todos os alvos testados, conforme indicado na Figura l(a). O RNA de fita dupla testado para o alvo PC010 levou a 100% de mortalidade larval no dia 9 e para o alvo PC027 no dia 11.

137/225

Para todos os outros alvos, valores de mortalidade altos foram alcançados no dia 11 quando em comparação com o dsRNA gfp, 0,05% de Triton X-100 apenas ou apenas folha não tratada (valor médio em percentagem ± intervalo de confiabilidade com alfa 0,05) PC001 (94,4 ± 8,2); PC003 (86,1 ± 4,1); PC005 (83,3 ± 7,8); PC014 (63,9 ± 20,6); PC016 (75,0 ± 16,8); dsRNA gfp (11,1 ± 8,2); 0,05% Triton X-100 (19,4 ± 10,5); apenas folha (8,3 ± 10,5).

As larvas sobreviventes foram analisadas com base em seu peso médio. Para todos os alvos testados, as larvas do besouro da folha de mostarda apresentaram pesos médios significativamente reduzidos após o dia 4 do bioensaio; os insetos alimentados com o controle dsRNA gpf ou 0,05% de triton X-100 apenas, se desenvolveram normalmente, tal como para as larvas com apenas folha (Figura l(b)-PC).

E - Experimentos de Laboratório Para Selecionar dsRNAs a Diferentes Concentrações Utilizando-se Discos de Folha de Colza Para Atividade Contra Larvas de Phaedon cochleariae

Vinte e cinco μΐ de uma solução de dsRNA do alvo PC010 ou PC027 em concentrações seriais de dez vezes a partir de 0,1 pg/μΙ até 0,1 ng/μΙ foram aplicados topicamente sobre o disco de folha de colza, como descrito no Exemplo 4D acima. Como controle negativo, Triton X100 a 0,05% apenas foi aplicado ao disco de folha. Por tratamento, 24 larvas recém nascidas de besouro da folha de mostarda, com dois insetos por poço, foram testadas. As placas foram armazenadas na câmara de criação de inseto a 25 ± 2°C, 60 ± 5% de umidade relativa, como um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. No dia 2, as larvas foram transferidas para uma nova placa contendo novos discos de folha tratados com dsRNA. No dia 4 para o alvo PC010 e dia 5 para o alvo PC027, os insetos de cada replicata foram transferidos para uma placa

138/225 de Petri contendo material foliar não tratado abundante. Os besouros foram analisados como vivos ou mortos nos dias 2, 4, 7, 8, 9 e 11 para o alvo PCO1O e 2, 5, 8, 9 e 12 para o alvo PC027.

A alimentação com discos de folha de colza contendo dsRNA nu intacto dos dois alvos diferentes, PC010 e PC027, às larvas de P. cochleariae resultou em mortalidades altas a concentrações decrescentes a tão baixo quanto 1 ng de dsRNA/μΙ de solução, como mostrado nas Figuras 2(a) e (b). Os valores médios de mortalidade em percentagem ± intervalo de confiabilidade com alfa 0,05 para diferentes concen10 trações de dsRNA para o alvo PC010 no dia 11, 0 pg/μΙ: 8,3 ± 9,4; 0,1 pg/μΙ: 100; 0,01 pg/μΙ: 79,2 ± 20,6; 0,001 pg/μΙ: 58,3 ± 9,4; 0,0001 pg/μΙ: 12,5 ± 15,6; e para o alvo PC027 no dia 12, 0 pg/μΙ: 8,3 ± 9,4; 0,1 pg/μΙ: 95,8 ± 8,2; 0,01 pg/μΙ: 95,8 ± 8,2; 0,001 pg/μΙ: 83,3 ± 13,3; 0,0001 pg/μΙ: 12,5 ± 8,2.

F - Clonagem de um Fragmento de Gene de MLB em um Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de MLB em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a

139/225

72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfl (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOO (a ser completada).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação do fragmento do gene PC010 são providas na Tabela 8-PC.

O molde utilizado foi o vetor pCR8/GW/topo contendo a seqüência do PC010 (SEQ ID No.: 253). Os iniciadores foram utilizados em uma reação PCR “touch-down” nas seguintes condições: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C com uma redução de temperatura de -0,5°C por ciclo e 1 minutos a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante foi analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfl (referência ao documento WO

00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à SEQ ID No.: 488 tal como fornecida na Tabela 8-PC. O vetor recombinante contendo esta seqüência foi denominado de pGCDJOOl.

G - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli AB309-105

Os procedimentos descritos abaixo são seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Neste experimento é utilizada uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105.

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Transformação de AB309-105.

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ da cepa AB309-105 de E. coli quimicamente competente. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico de 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas e volta em gelo por mais 5 minutos. Foram adicionados 450 μΐ de meio SOC à temperatura ambiente às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão de célula bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo de Luria-Bertani (LB) líquido suplementado com 100 μΐ/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Inova 4430 (250 rpm) a 37°C durante a noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105.

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105, foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo em ambas as direções senso e anti-senso, uma vez que flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado e ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta kl desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio

141/225 completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/μΐ de colesterol) suplementado com 100 μg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando RNA de fita dupla não é um pré-requisito para induzir toxidez contra insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em um volume total de 50 ml de uma solução a 0,05% de Triton X-100. O tubo foi armazenado a 4°C até a utilização.

H - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Phaedon cochleariae

Bioensaios de disco de folha.

O método de bioensaio de disco de folha foi empregado para se testar RNA de fita dupla do alvo PC010 produzido em Escherichia coli (a partir do plasmídeo pGCDJOOl) contra larvas do besouro da folha de mostarda. Foram preparados discos de folha de colza, como descrito no Exemplo 4. Foram pipetados 20 μΐ de uma suspensão bacteriana, com uma densidade ótica de 1 a comprimento de onda de 600 nm, em cada disco. O disco de folha foi colocado em um poço de uma placa de 24 poços contendo 1 ml de agar gelificado. Em cada disco de folha foram colocadas duas larvas recém nascidas. Para cada tratamento, foram preparadas 3 replicatas de 16 larvas recém nascidas por replicata. As

J >5»

142/225 placas foram mantidas em uma câmara de criação de inseto a 25 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. No dia 3 (isto é, 3 dias após o início do bioensaio), as larvas foram transferidas para uma nova placa contendo novos discos de folha tratados (mesma dosagem). O material foliar foi renovado a cada dia sim dia não a partir do dia 5 em diante. O bioensaio foi pontuado para mortalidade e peso médio. Os controles negativos foram discos de folha tratados com bactérias contendo o plasmídeo pGN29 (vetor vazio) e folha apenas.

Um claro aumento na mortalidade das larvas de P. cochleariae no tempo foi mostrado após os insetos terem se alimentado com as folhas de colza tratadas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli deficiente em RNaselII contendo o plasmídeo pGCDJOOl, enquanto que pouca ou nenhuma mortalidade foi observada no caso de bactérias com o plasmídeo pGN29 ou folha apenas (Figura 3-PC).

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o MLB com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. O MLB foi colocado em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo os plasmídeos pGBNJOOl ou pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma

143/225 suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento.

O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

Exemplo 5

Epilachna varivetis (Besouro do Feijão Mexicano)

A - Clonagem de Seqüências Genéticas Parciais de Epilachna varivetis

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de 4 estágios larvais diferentes de Epilachna varivetis (besouro do feijão mexicano; fonte: Thomas Dorsey, Entomologista Supervisor, New Jersey Department of Agriculture, Division of Plant Industiy, Bureau of Biological Pest Control, Phillip Alampi Beneficiai Insect Laboratory, PO Box 330,

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J?7

Trenton, New Jersey 08625-0330, EUA) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes EV005, EV009, EV010, EV015 e EV016, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-EV, que mostra os genes alvo de Epilachna varivetis incluindo seqüências de iniciador e seqüências de cDNA obtidas. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: para EV005 e EV009, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C, 1 minuto e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C; para EV014, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C; para EV010 e EV016, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto e 40 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são

145/225 representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-EV e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ

ID Nos. fornecidas na Tabela 3-EV, onde o início do quadro de leitura está indicado entre colchetes.

B - Produção de dsRNA de Genes de Epilachna varívetis

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P1700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-EV.

As condições nas reações PCR foram como se segue: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-EV. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados

146/225 foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na

Tabela 8-EV.

C - Recombinação dos Genes de Epilachna varivetis no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações senso e anti-senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) é obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes alvo, contendo o promotor senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumef adens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo Β). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL é purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n°

À g<O

147/225

28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubado por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total é transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos são selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Discos de Folha de Feijão Para Atividade Contra Larvas de Epilachna varivetis

O Exemplo provido abaixo é um exemplo da observação de que larvas do besouro do feijão mexicano (MBB) são susceptíveis a dsRNA ingerido oralmente correspondente a seus próprios genes alvo.

De maneira a se testar as diferentes amostras de RNA de fita dupla contra larvas de MBB, um ensaio de disco de folha foi empregado utilizando-se material de folha de feijão comum (Phaseolus vulgaris variedade Montano; fonte: Aveve NV, Bélgica) como fonte de alimento. A mesma variedade de feijão foi utilizada para manter as culturas de insetos na câmara de inseto a 25 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. Foram cortados discos de aproximadamente 1,1 cm de diâmetro (ou 0,95 cm²) de folhas de plantas de feijão de 1 a 2 semanas de idade utilizando-se um cortador de tamanho adequado. Amostras de RNA de fita dupla foram diluídas para 1 pg/μΐ em água Milli-Q contendo 0,05% de Triton X-100. Os discos de folha tratados foram preparados pela aplicação de 25 μΐ da solução diluída do dsRNA dos alvos EV005, EV010, EV015, EV016 e dsRNA gfp de controle ou 0,05% de Triton X-100 em uma superfície foliar adaxial. Os discos de folha foram deixados secar e

148/225 colocados individualmente em cada um dos 24 poços de uma multiplaca de 24 poços contendo 1 ml de agar 2% gelificado o que auxilia para prevenir que o disco de folha seque. Uma única larva de MBB recém nascida foi colocada em cada um dos poços da placa, que então foi coberta com uma tampa plástica multi-poço. A placa foi dividida em replicatas de 8 insetos por replicata (cada fileira). A placa contendo os insetos e os discos de folha foram mantidos em uma câmara de inseto a 25 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuro. Os insetos foram alimentados com os discos de folha por 2 dias, após o que os insetos foram transferidos para uma nova placa contendo discos de folha recentemente tratados. Após isto, dias depois do início do bioensaio, os insetos foram transferidos para uma placa de Petri contendo folhas de feijão novas não tratadas a cada dia até o dia 10. A mortalidade foi registrada no dia 2 e doravante dia sim dia não.

A alimentação das larvas de E. varivetis com folhas de feijão comum contendo dsRNA nu intacto aplicado à superfície resultou em aumentos significativos na mortalidade larval, conforme indicado na Figura 1. Os RNAs de fita dupla testado para os alvos EV010, EV015 e EV016 levou a 100% de mortalidade após 8 dias, enquanto que o dsRNA do alvo EV005 levou 10 dias para matar todas as larvas. A maioria dos insetos alimentados em discos de folha tratados contendo o controle dsRNA gfp ou apenas o surfactante se manteve durante todo o ensaio (Figura 1-EV).

E - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA Utilizando-se Discos de Folhas de Feijão Para Atividade Contra Adultos de Epilachna varivetis

O Exemplo provido abaixo é um exemplo da observação de que

JS’^149/225 adultos do besouro do feijão mexicano são susceptíveis a dsRNA ingerido oralmente correspondente a genes alvo próprios.

Em um bioensaio semelhante ao estabelecido para larvas do besouro do feijão mexicano, MBBs adultos foram testados contra RNAs de fita dupla aplicado topicamente a discos de folha de feijão. DsRNA de teste de cada alvo EV010, EV015 e EV016 foi diluído em Triton X100 a 0,05% para uma concentração final de 0,1 pg/μΐ. Discos de folha de feijão foram tratados por aplicação tópica de 30 μΐ da solução teste sobre cada disco. Os discos foram deixados secar completamente antes de colocar cada um em uma fatia de agar 2% gelificado em cada poço de uma placa de 24 poços. Adultos com três dias de idade foram coletados das gaiolas de cultura e jejuados por 7-8 horas antes de colocar um adulto em cada um dos poços da placa de bioensaio (assim 24 adultos por tratamento). As placas foram mantidas na câmara de criação de inseto (sob as mesmas condições que as larvas de MBB por 24 horas) após o que os adultos foram transferidos para uma nova placa contendo novos discos de folha tratados com dsRNA. Após mais 24 horas, os adultos de cada tratamento foram coletados e colocados em uma caixa plástica com dimensões de 30 cm x 15 cm x 10 cm contendo duas plantas de feijão em vaso com três semanas de idade não tratadas. A mortalidade dos insetos foi analisada a partir do dia 4 até o dia 11.

Todos os três alvos de dsRNA (EV010, EV015 e EV016) ingeridos pelos adultos de Epilachna varivetis resultaram em aumentos significativos na mortalidade a partir do dia 4 (4 dias após o início do bioensaio), conforme mostrado na Figura 2(a)-EV. A partir do dia 5, alterações dramáticas nos padrões de alimentação foram observadas entre os insetos alimentados inicialmente com discos de folha de feijão tratados com dsRNA alvo e aqueles que foram alimentados com discos contendo o controle dsRNA gfp ou surfactante Triton Χ-100. Reduções no dano

150/225 foliar por MBBs adultos em plantas de feijão não tratadas eram claramente visíveis para todos os três alvos quando em comparação com os controles dsRNA gfp e apenas surfactante, embora com variações de nível; os insetos alimentados com o alvo 15 causaram o menor dano à folhagem de feijão (Figura 2(b)-EV).

F - Clonagem de um Fragmento de Gene de MBB num Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de MBB em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8-EV. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfi (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-EV. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

G - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

151/225 (1) AB309-105, e, (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de submetê-las a um tratamento de choque térmico de 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações

152/225 opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

H - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Epilachna varivetis

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias

-Jès θ <=, <SL

153/225 quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o MBB com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados MBBs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por

154/225 insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

Exemplo 6

Anthonomus grandis (Besouro do Feijão Mexicano)

A - Clonagem de Seqüências Parciais de Anthonomus grandis

Foi isolado RNA intacto de alta qualidade de 3 instares de Anthonomus grandis (bicudo do algodão; fonte: Dr. Gary Benzon,

Benzon Research Inc., 7 Kuhn Drive, Carlisle, Pensilvânia 17013, EUA) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instru15 ções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes AG001, AG005, AG010, AG014 e AG016, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-AG. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: para AG001, AG005 e AG016, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C e 1 minuto e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C; para

155/225

AG010, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 2 minutos e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C; para AG014, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-AG e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. tal como fornecidas na Tabela 3AG.

B - Produção de dsRNA de Genes de Anthonomus grandis (Bicudo do Algodão)

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° PI700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-AG. Uma reação PCR “touch-down” foi realizada nas seguintes condições: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C com uma redução de temperatura de 0,5°C por ciclo e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30

JSB

156/225 segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-AG. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaC104. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-AG.

C - Recombinação dos Genes de Anthonomus grandis no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações senso e anti-senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) é obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram

157/225 em uma construção em grampo para cada um dos genes alvo, contendo o promotor - senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumef adens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo

2). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL é purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubados por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total é transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos são selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA, Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade Contra Larvas de Grilo Doméstico, Acheta domesticas

Foram mantidos grilos domésticos, Acheta domesticus, na Insect Investigations Ltd. (origem: Blades Biological Ltd., Kent, UK). Os insetos foram criados em péletes de farelo e folhas de alface. Ninfas de sexo misto e igual tamanho e não mais que 5 dias de idade foram selecionadas para uso neste experimento. RNA de fita dupla foi misturado com ração de roedor peletizada a base de trigo (ração padrão de ratos e camundongos, B 85 K Universal Ltd., Grimston, Aldbrough, Hull, UK). A ração, BK001P, contém os seguintes ingredientes em ordem decrescente em peso: trigo, soja, farelo de trigo, cevada, ligante de pélete, vitamina mineral para roedor, gorduras, fosfato de dicálcio,

158/225 “mould carb”. A ração de roedor peletizada foi finamente moída e tratada a quente em um forno de micro-ondas antes de ser misturada, de maneira a desativar quaisquer componentes enzimáticos. Toda a ração para roedor foi tomada da mesma batelada de maneira a se assegurar consistência. A ração moída e o dsRNA foram misturados completamente e formados em pequenos péletes de peso igual, os quais foram deixados secar durante a noite à temperatura ambiente.

Amostras de RNA de fita dupla dos alvos e de gfp de controle nas concentrações de 10 pg/μΐ foram aplicadas em uma razão de 1 g de ração moída mais 1 ml de solução de dsRNA, desta forma resultando em uma taxa de aplicação de 10 mg de dsRNA por grama de pélete. Os péletes foram substituídos semanalmente. Os insetos são providos com péletes tratados nas primeiras três semanas de experimento. Após o que são providos péletes não tratados. Os insetos são mantidos em recipientes plásticos tampados (9 cm de diâmetro, 4,5 cm de profundidade), dez por recipiente. Cada arena contém um pélete isca tratado e uma fonte de água (bola de lã de algodão umedecida), cada uma colocada em uma pequena barcaça de pesagem separada. A água é renovada ad lib durante todo o experimento.

As observações são feitas com intervalo de duas vezes por semana, com não mais que quatro dias entre as observações, até que todos os insetos de controle haviam ou morrido ou mudado para o estágio adulto (84 dias). A cada observação os insetos foram analisados como vivos ou mortos, e examinados quanto a anomalias. A partir do dia 46 em diante, uma vez iniciada a muda para o estágio adulto, todos os insetos (vivos e mortos) são analisados como ninfa ou adulto. Os insetos sobreviventes são pesados no dia 55 do experimento. Quatro replicatas são realizadas para cada um dos tratamentos. Durante o experimento as condições de teste são 25 a 33°C e 20 a 25% de úmida

159/225 de relativa, com um fotoperíodo de 12:12 horas de luz:escuro.

B - Clonagem de Fragmento de Gene de MLB em vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de

DNA correspondendo a um gene alvo de MLB em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições:

5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), cionado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfí (referên20 cia ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

F - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3).

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105,

160/225 foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21 (DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico de 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta

161/225 cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

G - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Anthonomus grandis

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o CBW com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a

3^5

162/225 condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados CBWs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

Exemplo 7

Tribolium castaneum (Besouro Castanho da Farinha)

A - Clonagem de Seqüências Parciais

3>3é

163/225 de Tribolium castaneum

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de todos os diferentes estágios de inseto de Tribolium castaneum (besouro castanho da farinha; fonte: Dr. Lara Sênior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Wales, UK) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes TC001, TC002, TC010, TC014 e TC015, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-TC. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C, 1 minuto e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C (TC001, TC014, TC015); 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 2 minutos e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C (TC010); 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C (TC002). Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n°

164/225

28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-TC e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3-TC.

B - Produção de dsRNA de genes de Tribolium castaneum

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° PI700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-TC. As condições nas reações PCR foram como se segue: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C (0,5°C/ciclo) e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-TC. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e

J-Ss

165/225 precipitação com NaClO₄. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-TC.

C - Recombinação dos Genes de Tribolium castaneum no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações antisenso e senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) é obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes alvo, contendo o promotor - senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo

2). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL é

4^3

166/225 purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubado por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total é transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos são selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Experimentos de Laboratório

Para Testar Alvos de dsRNA, Utilizando-se Ração Artificial

Para Atividade Contra Larvas de Tribo lium castaneum

O Exemplo provido abaixo é um exemplo da observação de que larvas do besouro castanho da farinha (RFB) são susceptíveis a dsRNA ingerido oralmente correspondente a seus próprios genes alvo.

Besouros castanhos da farinha, Tribolium castaneum, foram mantidos na Insect Investigations Ltd. (origem: Imperial College of Science, Technology and Medicine, Silwood Park, Berkshire, UK). Os insetos foram criados de acordo com o SOP/251/Ol da companhia. Em resumo, os besouros foram alojados em jarras ou tanques de plástico.

Estes apresentam uma abertura na parte superior para permitir a ventilação. Um pedaço de tela foi ajustado sobre a parte superior e fixada com um elástico para evitar o escapa. O meio de cultivo larval (farinha) foi colocado no recipiente onde os besouros podem se multiplicar. As colônias de besouro armazenadas foram mantidas em um ambiente com temperatura controlada a 25 ± 3°C com um ciclo de 16:8 horas de luz:escuro.

RNA de fita dupla do alvo TC014 (com seqüência correspondendo à SEQ ID No.: 799) foi incorporado em uma mistura de farinha e leite em pó (farinha integral deite em pó na razão de 4:1) e deixou-se secar

167/225 durante a noite. Cada replicata foi preparada separadamente: 100 μΐ de uma solução a 10pg/pl de dsRNA (1 mg de dsRNA) foram adicionados a 0,1 g da mistura farinha/leite. A mistura seca foi moída a um pó fino. Os insetos foram mantidos em placas de Petri (55 mm de diâme5 tro), forradas com uma camada dupla de papel de filtro. A ração tratada foi colocada entre duas camadas de papel de filtro. Dez larvas de primeiro instar, sexo misturado, foram colocadas em cada placa (replicata). Quatro replicatas foram obtidas para cada tratamento. O controle foi com água Milli-Q. As observações (número de sobreviven10 tes) foram realizadas regularmente. Durante o experimento, as condições do teste foram 25-33°C e 20-25°C de umidade relativa, com um fotoperíodo de 12:12 horas de luz:escuro.

A sobrevivência das larvas de T. castaneum no tempo em ração artificial tratada com dsRNA do alvo TC014 foi significativamente reduzida quando em comparação com a ração de controle, conforme mostrado na Figura 1.

E - Clonagem de Fragmento de Gene de RFB num Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de

DNA correspondendo a um gene alvo de RFB em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8-TC. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes

168/225 condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfi (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-EV. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

F - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbe169/225 nicilina. Α cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 =5θ3

170/225 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

G - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Tribolium castaneum

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o RFB com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados RFBs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105

171/225 de Ε. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

Exemplo 10

Myzus persicae (Pulgão Verde do Pêssego)

A - Clonagem de Seqüências Parciais de Myzus persicae

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de ninfas de Myzus persicae (pulgão verde do pêssego; fonte: Dra. Rachel Down, Insect δε Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York,

YO41 1LZ, UK) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando25 se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes MP001, MP002, MP010, MP016 e MP027, uma série de

ÜOÔ

172/225 reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-MP. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: para MOOOl, MP002 e MP 016, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C, 1 minuto e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C; para MP027, foi utilizado um programa “touch-down”: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 10 ciclos de 30 segundos a 95°C, 40 segundos a 60°C com uma redução na temperatura de 1°C por ciclo e 1 minuto e 10 segundos a 72°C, seguindo-se 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 40 segundos a 50°C e 1 minuto e 10 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C; para MP010, 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 3 minutos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2MP e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3-MP.

B - Produção de dsRNA de Genes de Myzus persícae

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° PI700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados

173/225 únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-MP. Uma reação PCR “touch-down” foi realizada como se segue: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C (para MP001, MP002, MP016, MP027 e gfp) ou 30 segundos a 50°C (para MP010) com uma redução na temperatura de 0,5°C por ciclo e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 45°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8MP. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-MP.

C - Recombinação dos Genes de Myzus persícae no Vetor Vegetal pK7GW!WG2D(Il)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes

174/225 alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações antisenso e senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo A) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) é obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimá10 tica LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes MP001, MP002, MP010, MP016 e MP026, contendo o promotor - senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor

35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

Uma digestão com a enzima de restrição Alw44I foi conduzida para todos os alvos clonados no plasmídeo pCR8/GW/topo (ver Exemplo B). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL foi purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubados por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total foi transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos foram selecionados por análise de digestão por restrição. A seqüência completa da construção em grampo para:

- MP001 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é represen175/225 tada na SEQ ID No.: 1066;

- MP002 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 1067;

- MP010 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 1068;

- MP016 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 1069;

- MP027 (senso - intron - CmR - intron - anti-senso) é representada na SEQ ID No.: 1070.

A Tabela 9-MP provê as seqüências completas para cada construção em grampo.

D - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Ração Artificial Líquida Para Atividade Contra Myzus persicae

A ração artificial líquida para o pulgão verde do pêssego, Myzus persicae, foi preparada com base na ração adequada para pulgões de ervilha (Acyrthosiphon pisum), conforme descrita por Febvay e colaboradores (1988) [“Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum (Homoptera: Aphididae”); Can. J. Zool. 66: 2449-2453], mas com algumas modificações. O componente de aminoácidos da ração foi preparado como se segue: em mg/100 ml, alanina 178,71, beta-alanina 6,22, arginina

244,9, asparagina 298,55, ácido aspártico 88,25, cisteína 29,59, ácido glutâmico 149,36, glutamina 445,61, glicina 166,56, histidina 136,02, isoleucina 164,75, leucina 231,56, hidrocloreto de lisina 351,09, metionina 72,35, ornitina (HCI) 9,41, fenilalanina 293, prolina 129,33, serina 124,28, treonina 127,16, triptofano 42,75, tirosina 38,63, Lvalina 190,85. Os aminoácidos foram dissolvidos em 30 ml de água

176/225

Milli-Q exceto para a tirosina que foi primeiramente dissolvida em algumas gotas de HCl 1M antes de ser adicionada à mistura de aminoácidos. O componente da mistura vitamínica da ração foi preparado como um concentrado 5x como se segue: em mg/l, ácido aminobenzóico

100, ácido ascórbico 1000, biotina 1, pantotenato de cálcio 50, cloreto de colina 500, ácido fólico 10, mioinositol 420, ácido nicotínico 100, hidrocloreto de piridoxina 25, riboflavina 5, hidrocloreto de tiamina 25. A riboflavina foi dissolvida em 1 ml de H2O a 50°C e então adicionada à mistura vitamínica. A mistura vitamínica foi dividida em alíquotas de

20 ml e armazenada a -20°C. Uma alíquota da mistura vitamínica foi adicionada à solução de aminoácidos. Foram adicionados sacarose e MgSO4.7H2O à mistura nas seguintes quantidades: 20 g e 242 mg, respectivamente. Foi preparada uma solução estoque de traços de metal como se segue: em mg/100 ml, CUSO4.5H2O 4,7, FeCl3.6H2O

44,5, MnCl2.4H2O 6,5, NaCI 25,4, ZnCb 8,3. Dez ml da solução de traços de metal e 250 mg de KH2PO4 foram adicionados à ração e foi adicionada água Milli-Q para um volume final da ração líquida de 100 ml. O pH da ração foi ajustado para 7 com uma solução 1M de KOH. A ração líquida foi esterilizada por filtração através de um disco de filtro de 0,22 pm (Millipore).

Os pulgões verdes do pêssego (Myzus persicae; fonte: Dra. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratoiy, Sand Hutton, York, YO41 ILZ, UK) foram criados em colza com de 4 a 6 semanas de idade (Brassica napus variedade SW Oban; fonte:

Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, UK) em gaiolas de alumínio de mesh 70 pm em uma câmara de ambiente controlado nas seguintes condições: 23 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro.

Um dia antes do início do bioensaio, os adultos foram coletados

-=Q

177/225 das gaiolas de criação e colocados em folhas de colza destacadas frescas em uma placa de Petri e deixados durante uma noite na câmara de inseto. NO dia seguinte, ninfas de primeiro instar foram tomadas e transferidas para câmaras de alimentação. Uma câmara de alimenta5 ção contendo 10 ninfas de primeiro instar colocadas em uma pequena placa de Petri (com diâmetro de 3 cm) coberta com uma camada única de parafilme M finamente esticado sobre o qual foram adicionados 50 μΐ de ração. A câmara foi vedada com uma segunda camada de parafilme e incubada nas mesmas condições das culturas de adultos. Ração com dsRNA foi renovada dia sim dia não e a sobrevivência dos insetos foi observada no dia 8, isto é, no 8° dia após o início do bioensaio. Foram estabelecidas 5 câmaras de alimentação do bioensaio (replicatas) por tratamento simultaneamente. Soluções de dsRNA de teste e de controle (gfp) foram incorporadas na ração para uma concentração final de 2 pg/pl. As câmaras de alimentação foram mantidas a 23 ± 2°C e 60 ± 5% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Um teste de Mann-Whitney foi determinado pela versão 4 do programa GraphPad Prism para se estabelecer se os medianos diferem significativamente entre o alvo 27 (MP027) e o dsRNA gfp.

No bioensaio, a ração artificial líquida de alimentação suplementada com dsRNA nu intacto do alvo 27 (SEQ ID No.: 1061) a ninfas de Myzus persicae utilizando-se uma câmara de alimentação, resultou em um aumento significativo na mortalidade, conforme mostrado na Figura

1. A sobrevivência percentual média para o tratamento com alvo 27, dsRNA gfp e ração apenas foi de 2, 34 e 82, respectivamente. Uma comparação dos grupos do alvo 027 com o do dsRNA gfp utilizando-se o teste de Mann-Whitney resultou em um valor P unicaudal de 0,004 o que indica que o mediano do alvo 027 é significativamente diferente (P < 0,05) do mediano maior esperado do dsRNA gfp. Os pulgões verdes do

JL

178/225 pêssego na ração líquida com dsRNA do alvo 027 incorporado eram nitidamente menores que aqueles que foram alimentados apenas com ração ou com dsRNA gfp de controle (dados não apresentados).

E - Clonagem de Fragmento de Gene de GPA em um Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de GPA em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8-MP. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfi (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-MP. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

F - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de EscherichÍa coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos acima são seguidos a fim de

179/225 expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 μg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi

180/225 determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

G - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Myzus persicae

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o GPA com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa

181/225 <3<S2plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados GPAs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/ desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

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182/225

Exemplo 11

Nilaparvata lugens (Cigarrinha Marrom)

A - Clonagem de Seqüências Parciais de Nilaparvata lugens

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de Nilaparvata lugens (fonte: Dr. J. A. Gatehouse, Dept. Ciências Biológicas, Durham University, UK). Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se o protocolo do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes NL001, NL002, NL003, NL004, NL005, NL006, NL007, NL008, NL009, NL010, NL011, NL012, NL013, NL014, NL015, NL016, NL018, NL019, NL021, NL022, e NL027 de Nilaparvata lugens, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se o protocolo do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-NL. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: para NL001: 5 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C: para NL002: 3 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL003: 3 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 61°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL004: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 51°C e 1 minuto a 72°C; para NL005: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto a 72°C, <=2* J £=>

183/225 seguindo-se 10 minutos a 72°C, para NL006: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 3 minuto 30 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL007: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 15 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL008: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindose 10 minutos a 72°C; para NL009: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL010: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 2 minuto 30 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL011: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C; para NL012: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C; para NL013: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 10 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL014: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL015: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 40 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL016: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 40 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL018: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 35 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL019: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL021: 10 minu184/225 tos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 45 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C: para NL022: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 45 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; e para NL027: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 1 minuto 45 segundos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-NL e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3-NL.

B - Clonagem de uma Seqüência Parcial do Gene NL023 de Nilaparvata lugens por Meio de uma Seqüência EST

A partir de RNA intacto de alta qualidade de Nilaparvata lugens (fonte: Dr. J. A. Gatehouse, Dept. Ciências Biológicas, Durham University, UK) foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maiyland, EUA), seguindo-se o protocolo do fabricante.

Uma seqüência de cDNA parcial, NL023, foi amplificada a partir do cDNA de Nilaparvata lugens que corresponde a uma seqüência EST de Nilaparvata lugens no banco de dados público Genebank sob o número de acesso CAH65679.2. De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte do gene NL023, uma série de reações

185/225

PCR com iniciadores baseados em EST foram realizadas utilizando-se o PerfectShot™ ExTaq (Cat n° RR005A, Takara Bio Inc.) seguindo-se o protocolo do fabricante.

Para o NL023, foram utilizados os iniciadores específicos oGBKW002 e oGBKW003 (representados aqui como SEQ ID No.: 1157 e SEQ ID No.: 1158, respectivamente) em duas reações PCR independentes nas seguintes condições: 3 minutos a 95°C, seguindo-se 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 56°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick®; Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência consenso resultante do seqüenciamento de ambos os produtos de PCR é representada aqui como SEQ ID No.: 1111 e é referida como a seqüência parcial do gene NL023. A seqüência de aminoácidos parcial correspondente é representada aqui como SEQ ID No.: 1112.

C - Produção de dsRNA de Genes de Nilaparvata lugens

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizan20 do-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° PI700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 4. As condições das reações PCR foram as seguintes: para NL001: 4 minutos a 94°C,

186/225 seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL002: 4 minutos a 94°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL003: 4 minutos a 94°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 66°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL004: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL005: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 57°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL006: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL007: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 51°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL008: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL009: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL010: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL011 : 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL012: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL013: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL014: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 51°C e 1 minuto

187/225 a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL015: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL016: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 57°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL018: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL019: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL021: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL022: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 53°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; para NL023: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 52°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C; e para NL027: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 52°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 4-NL. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen). Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante, mas com as seguintes modificações: o pélete

188/225 de RNA é lavado duas vezes com etanoi 70%. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-NL.

O DNA molde utilizado para as reações PCR com iniciadores T7 na proteína fluorescente verde (gfp) de controle foi o plasmídeo pPD96.12 (Fire Lab, http://genome-www.stanford.edu/group/fire/), que contém a seqüência de codificação da gfp selvagem entremeada por 3 introns sintéticos. O RNA de fita dupla foi sintetizado utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° PI700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7. Para a gfp, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se o iniciador FW T7 específico oGAU183 e o iniciador RV específico oGAU182 (representados aqui como SEQ ID No.: 236 e SEQ ID No.: 237, respectivamente) em uma reação PCR nas seguintes condições: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde anti-senso foi gerado utilizando-se o iniciador FW específico 0GAUI8I e o iniciador T7 RV específico oGAU184 (representados aqui como SEQ ID No.: 238 e SEQ ID No.: 239, respectivamente) em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick®; Cat. n° 28706, Qiagen). Os moldes T7 FW e RV foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas por precipitação com acetato de sódio e isopropanol, seguindo-se o protocolo do fabricante, mas com a seguinte modificação: o pélete de RNA foi lavado duas vezes em etanoi 70%. As fitas senso do dsRNA resultante é representada aqui como SEQ ID No.: 235.

189/225

D - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Ração Artificial Líquida Para Atividade Contra Nilaparvata lugens

Foi preparada a ração artificial líquida (MMD-1) para a cigarrinha marrom do arroz, Nilaparvata lugens, como descrito por Koyama (1988) [“Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppers and leafhoppers (Homoptera: Delphacidae and Deltocephalidae) on a holidic diet. JARQ 22:20-27], mas com uma modificação na concentra10 ção final do componente sacarose da ração: 14,4% (peso/volume). Os componentes da ração foram preparados como concentrados separados: 10 x estoque mineral (armazenado a 4°C), 2 x estoque de aminoácidos (armazenado a -20°C e 10 x estoque vitamínico (armazenado a -20°C). Os componentes estoque foram misturados imediatamente antes do início do bioensaio para uma concentração de x 4/3 para permitir a diluição com a solução do dsRNA de teste (4 x concentração), o pH foi ajustado para 6,5, e esterilizou-se por filtração em alíquotas de aproximadamente 500 μΐ.

As cigarrinhas marrons do arroz (Nilaparvata lugens) foram criadas em plantas de arroz (Oryza sativa cv Taichung Native 1) de 2 a 3 meses de idade em um câmara com ambiente controlado: 27 ± 2°C, 80% de umidade relativa, com fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Uma câmara de alimentação compreendendo 10 ninfas de primeiro e segundo instares colocadas em uma pequena placa de Petri (com diâmetro de

3 cm) coberta com uma única camada de parafilme M finamente esticado sobre o qual 50 μΐ de ração foram adicionados. A câmara foi vedada com uma segunda camada de parafilme e incubada nas mesmas condições que para as culturas de adultos, mas sem exposição direta à luz. A ração com dsRNA foi renovada dia sim dia não e a sobrevivência

190/225 dos insetos foi avaliada diariamente. Por tratamento, 5 câmaras de alimentação de bioensaio (replicatas) foram estabelecidas simultaneamente. As solução de dsRNA de controle (gfp) e de teste foram incorporadas na ração para uma concentração final de 2 mg/ml. As câmaras de alimentação foram mantidas a 27 ± 2°C, 80% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Os dados de sobrevivência dos insetos foram analisados utilizando-se a curva modelo de sobrevivência de Kaplan-Meier e as sobrevivências foram comparadas entre os grupos utilizando-se o teste logrank (Prism, versão 4.0).

A alimentação com ração artificial líquida suplementada com dsRNA nu intacto de Nilaparvata lugens in vitro utilizando-se uma câmara de alimentação resultou em aumentos significativos na mortalidade das ninfas conforme mostrado em quatro bioensaios separados (Figuras l(a)-(d)-NL; Tabelas la-d-NL). Estes resultados demonstram que dsRNAs correspondendo a diferentes genes BPH essenciais provocaram toxidez significativa em cigarrinha marrom do arroz.

O efeito do dsRNA de gfp sobre a sobrevivência de BPH nestes bioensaios não é significativamente diferente da sobrevivência em ração apenas.

As Tabelas lOa-d-NL mostram um resumo da sobrevivência de Nilaparvata lugens em ração artificial suplementada com 2 mg/ml (concentração final) dos seguintes alvos; na Tabela 10(a)-NL: NL002, NL003, NL005, NL010; na Tabela 10(b)-NL NL009, NL016; na Tabela 10(c)-NL: NL014, NL018; e na Tabela 10(d)-NL: NL013, NL015, NL021. Na coluna de análise de sobrevivência, o efeito do RNAi está indicado como se segue: + = sobrevivência significativamente reduzida em comparação com o controle de dsRNA gfp (alfa < 0,05); - = diferença não significativa na sobrevivência em comparação com o controle dsRNA gfp. As curvas de sobrevivência foram comparadas (entre ração apenas

191/225 e ração suplementada com dsRNA de teste, dsRNA de gfp e dsRNA de teste, e ração apenas e dsRNA de gfp) utilizando-se o teste logrank.

E - Experimentos de Laboratório Para Selecionar dsRNAs a Diferentes Concentrações Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade Contra Nilaparvata lugens

Cinquenta μΐ de ração artificial líquida suplementada com diferentes concentrações de dsRNA do alvo NL002, a saber, 1, 0,2, 0,08 e 0,04 mg/ml (concentração final), foram aplicados às câmaras de alimentação de cigarrinha marrom. A ração com dsRNA foi renovada dia sim dia não e a sobrevivência dos insetos foi observada diariamente. Por tratamento, 5 câmaras de alimentação de bioensaio (replicatas) foram estabelecidas simultaneamente. As câmaras de alimentação foram mantidas a 27 ± 2°C, 80% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Os dados de sobrevivência dos insetos foram analisados utilizando-se a curva modelo de sobrevivência de Kaplan-Meier e as sobrevivências foram comparadas entre os grupos utilizando-se o teste logrank (Prism, versão 4.0).

A alimentação com ração artificial líquida suplementada com dsRNA nu intacto do alvo NL002 a diferentes concentrações resultou em mortalidades significativamente mais altas nas concentrações finais tão baixas quanto 0,04 mg de dsRNA por ml de ração quando em comparação com a sobrevivência em ração apenas, como mostrado na Figura 2NL e Tabela 9-NL. A Tabela 9-NL resume a sobrevivência de Nilaparvata lugens em alimentação com ração artificial suplementada com 1, 0,2, 0,08 e 0,04 mg/ml (concentração final) do alvo NL002. Na coluna de análise de sobrevivência o efeito do RNAi está indicado como se segue: + = sobrevivência significativamente reduzida em comparação com o controle de ração apenas (alfa < 0,05); - = diferenças não significativas

192/225 na sobrevivência em comparação com o controle de ração apenas. As curvas de sobrevivência foram comparadas utilizando-se o teste logrank.

F - Clonagem de Fragmento de Gene de BPH num Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de BPH em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfi (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-NL. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOO.

G - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a

193/225 se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo

RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi

194/225 determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

H - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Nilaparvata lugens

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o BPH com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa

195/225 plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados BPHs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

196/225

Exemplo 10

Chilo suppressalis (Broca do Colmo do Arroz)

A. Clonagem de seqüências parciais de Chilo suppressalis por meio de família de PCR

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de 4 estágios larvais diferentes de Chilo suppressalis (broca do colmo do arroz) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes CS001, CS002, CS003, CS006, CS007, CS009, CS011, CS013, CS014, CS015, CS016 e CS018, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-CS. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1 minuto 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resul197/225 tantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-CS e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3-CS.

B - Produção de dsRNA de Genes de Chilo suppressalís

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P1700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-CS. As condições das reações PCR foram como se segue: 4 minutos a 95°C, seguindo-se 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-CS. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as

198/225 instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-CS.

C - Recombinação dos Genes de Chilo suppressalis no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações antisenso e senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) é obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes alvo, contendo o promotor - senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo

B). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL é purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubados por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamen199/225 to com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total é transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos são selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade Contra Chilo suppressalis

Brocas do colmo do arroz, Chilo suppressalis, (origem: Syngenta, Stein, Suíça) foram mantidas em uma ração artificial modificada baseada na descrita por Kamano e Sato, 1985 (em: Handbook of Insect Rearing. Volumes I & II. P. Singh e R.F. Moore, eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam e New York, 1985, pgs. 448). Em resumo, um litro de ração foi obtido como se segue: 20 g de agar foram adicionados a 980 ml de água Milli-Q e autoclavados; a solução de agar foi resfriada para aproximadamente 55°C e os demais ingredientes foram adicionados e misturados completamente: 40 g de farinha de milho (Polenta), 20 g de celulose, 30 g de sacarose, 30 g de caseína, 20 g de gérmen de trigo (torrado), 8 g de mistura salina de Wesson, 12 g de mistura vitamínica de Varderzant, 1,8 g de ácido sórbico, 1,6 g de nipagin (metilparabeno), 0,3 g de aureomicina, 0,4 g de colesterol e 0,6 g de L-cisteína. A ração foi resfriada para aproximadamente 45°C e derramada em bandejas ou copos de criação. A ração foi deixada se estabelecer em uma cabine de fluxo laminar horizontal. Seções de folha de arroz com ovos depositados foram removidas de uma gaiola alojando mariposas adultas e fixadas à ração sólida no copo ou bandeja de criação. Os ovos foram deixados eclodir e as larvas recém nascidas foram disponibilizadas para bioensaios e a manutenção das culturas de insetos. Durante os experimentos e criação, as condições foram 28 ± 2°C e 80 ± 5% de

200/225 umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro.

A mesma ração artificial é utilizada para os bioensaios, mas neste caso a ração é colocada em quantidades iguais em placas de 24 poços, com cada poço contendo 1 ml de ração. Uma vez a ração pronta, as formulações de teste são aplicadas à superfície da ração (2 cm²), à proporção de 50 μΐ de 1 μg/μl de dsRNA do alvo. As soluções de dsRNA são deixadas secar e duas larvas de mariposa de primeiro instar são colocadas em cada poço. Após 7 dias, as larvas são transferidas para ração fresca tratada em placas multi-poço. No dia 14 (isto é, 14 dias após o início do bioensaio) o número de insetos vivos e mortos é registrado e examinado para anomalias. Um total de vinte e quatro larvas é testado por tratamento.

Um bioensaio alternativo é realizado no qual folhas de arroz são alimentadas a larvas recém nascidas de broca do colmo do arroz.

Pequenas seções de folha de arroz Indica variedade Taichung native 1 são mergulhadas em uma solução 0,05% de Triton X-100 contendo 1 pg/μΐ de dsRNA do alvo, deixadas secar e cada seção colocada em um poço de uma placa de 24 poços contendo agar 2% gelificado. Duas larvas recém nascidas são transferidas da bandeja de criação para cada seção de folha tratada com dsRNA (24 larvas por tratamento). Após 4 e 8 dias, as larvas são transferidas para novas seções de folha de arroz tratada. O número de larvas vivas e mortas é observado nos dias 4, 8 e 12; quaisquer anomalias são também registradas.

E - Clonagem de Fragmento de Gene de SSB num Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de SSB em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora

I

201/225 qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfi (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-CS. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

F - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21 (DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um

202/225 tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

203/225

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

G - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Chilo suppressalis

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar o SSB com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados SSBs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma

204/225 suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

Exemplo 9

Plutella xylostella (Traça das Crucíferas)

A - Clonagem de Seqüências Parciais de Plutella xylostella

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de todos os diferentes estágios larvais de Plutella xylostella (traça das crucíferas; fonte: Dra. Lara Sênior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Wales, UK) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindose as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na prepara205/225 ção de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Mar5 yland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes PX001, PX009, PX010, PX015 e PX016, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-PX. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C e 1 minuto e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C (para PX001, PX009, PX015 e PX016); 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 54°C e 2 minutos e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C (para PX010). Os fragmentos de PCR resultantes foram analisa20 dos em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K453020, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 2-PX e são referidas como seqüências parciais. As seqüên25 cias de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3-PX.

B - Produção de dsRNA de Genes de Plutella xylostella

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizan0 3=1

206/225 do-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P1700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-PX. As condições das reações PCR foram como se segue: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C (0,5°C/ciclo) e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-PX. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaClO4. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na Tabela 8-PX.

C - Recombinação dos Genes de Plutella xylostella no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através

207/225 de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações antisenso e senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) é obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes alvo, contendo o promotor - senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo

2). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL é purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubados por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamen25 to com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total é transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos são selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Experimentos de Laboratório

208/225

Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade

Contra Plutella xylostella

Traças das crucíferas, Plutella xylostella, foram mantidas na

Insect Investigations Ltd. (origem: Newcastle University, Newcastleupon-Tyne, UK). Os insetos foram criados em folhas de alface. Larvas de ambos os sexos de primeiro instar (com aproximadamente 1 dia de idade) foram selecionadas para uso no experimento. Os insetos foram mantidos em tubos Eppendorf (1,5 ml de capacidade). Uma ração para traça das crucíferas disponível comercialmente (Bio-Serv, NJ, EUA), preparada seguindo-se as instruções do fabricante, foi colocada na tampa de cada tubo (0,25 ml de capacidade, 8 mm de diâmetro). Enquanto ainda líquida, a ração foi alisada para remover o excesso e produzir uma superfície homogênea.

Uma vez pronta a ração, as formulações de teste foram aplicadas à superfície da ração, à proporção de 25 μΐ de formulação não diluída (1 μg/μl de dsRNA dos alvos) por replicata. As formulações de teste são deixadas secar e uma larva de mariposa de primeiro instar é colocadas em cada tubo. A larva é colocada na superfície da ração na tampa e o tubo é cuidadosamente fechado. Os tubos foram armazenados de cabeça para baixo, sobre as tampas de tal forma que cada larva permaneceu na superfície da ração. Duas vezes por semana, as larvas são transferidas novos tubos Eppendorf com ração fresca. Os insetos são providos com ração tratada pelas primeiras duas semanas de experi25 mento e depois com ração não tratada.

As observações foram feitas duas vezes por semana por um total de 38 dias, momento em que todas as larvas estavam mortas. A cada observação, os insetos foram avaliados como vivos ou mortos e examinados para anomalias. Replicatas de 40 larvas únicas são foram «3

209/225 realizadas para cada um dos tratamentos. Durante o experimento as condições do teste foram 23 a 26°C e 50 a 65% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro.

E - Clonagem de Fragmento de Gene de DBM num Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de DBM em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8-PX. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condições: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72 °C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfl (referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-PX. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

F - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a

210/225 se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB30920 1 05 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopro25 piltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi

211/225 determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

G - Experimentos de Laboratório Para Testar EscherichÍa coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Plutella xylostella

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar a DBM com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa <7Ξ>

212/225 plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocadas

DBMs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

3Α&

213/225

Exemplo 12

Acheta domesticus (Grilo Doméstico)

A - Clonagem de Seqüências Parciais de Acheta domesticus

RNA intacto de alta qualidade foi isolado de todos os diferentes estágios de inseto de Acheta domesticus (grilo doméstico; fonte: Dra. Lara Sênior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Wales, UK) utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindose as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte dos genes AD001, AD002, AD009, ADO 15 e ADO 16, uma série de reações PCR com iniciadores degenerados foi realizada utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante.

As seqüências dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação de cada um dos genes são fornecidas na Tabela 2-AD. Estes iniciadores foram utilizados nas reações PCR respectivas nas seguintes condições: 10 minutos a 95°C, seguindo-se 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C e 1 minuto e 30 segundos a 72°C, seguindo-se 7 minutos a 72°C. Os fragmentos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose, purificados (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4/TOPO (Cat. n° K4530-20, Invitrogen) e seqüenciados. As seqüências dos produtos de PCR resultantes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos.

Ύ

214/225 fornecidas na Tabela 2-AD e são referidas como seqüências parciais. As seqüências de aminoácidos parciais correspondentes são representadas pelas respectivas SEQ ID Nos. fornecidas na Tabela 3-AD.

B - Produção de dsRNA de Genes de Acheta domesticus

O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P1700, Promega) comercialmente disponível. Primeiramente dois moldes separados únicos de promotor de RNA polimerase 5’ T7 foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente em relação ao promotor T7.

Para cada um dos genes alvo, o molde T7 senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-AD. As condições das reações PCR foram como se segue: 1 minuto a 95°C, seguindo-se 20 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C (0,5°C/ciclo) e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 15 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C e 1 minuto a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O molde T7 anti-senso foi gerado utilizando-se iniciadores positivo e reverso T7 específicos em uma reação PCR nas mesmas condições descritas acima. As seqüências dos respectivos iniciadores para a amplificação do molde anti-senso para cada um dos genes alvo são fornecidas na Tabela 8-AD. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaCICU. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com

215/225 acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante. A fita senso do dsRNA resultante para cada um dos genes alvo é fornecida na

Tabela 8-AD.

C - Recombinação dos Genes de Acheta domesticus no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações antisenso e senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo 1) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) foi obtido da

VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimática LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para cada um dos genes alvo, contendo o promotor - senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo os diferentes alvos (ver Exemplo 2). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL é purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR

216/225 clonase II e incubados por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total é transformada em células quimicamente competentes Top 10. Os clones positivos são selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Experimentos de Laboratório Para Testar Alvos de dsRNA,

Utilizando-se Ração Artificial Para Atividade Contra Acheta domesticus

Foram mantidos grilos domésticos, Acheta domesticus, na Insect Investigations Ltd. (origem: Blades Biological Ltd., Kent, UK). Os insetos foram criados em péletes de farelo e folhas de alface. Ninfas de sexo misto e igual tamanho e não mais que 5 dias de idade foram selecionadas para uso no experimento. RNA de fita dupla foi misturado com ração de roedor peletizada a base de trigo (ração padrão de ratos e camundongos, B & K Universal Ltd., Grimston, Aldbrough, Hull, UK). A ração, BK001P, contém os seguintes ingredientes em ordem decrescente em peso: trigo, soja, farelo de trigo, cevada, ligante de pélete, vitamina mineral para roedor, gorduras, fosfato de dicálcio, “mould carb”. A ração de roedor peletizada foi finamente moída e tratada a quente em um forno de micro-ondas antes de ser misturada, de maneira a desativar quaisquer componentes enzimáticos. Toda a ração para roedor foi tomada da mesma batelada de maneira a se assegurar consistência. A ração moída e o dsRNA foram misturados completamente e formados em pequenos péletes de peso igual, os quais foram deixados secar durante a noite à temperatura ambiente.

Amostras de RNA de fita dupla dos alvos e gfp de controle em concentrações de 10 pg/μΐ foram aplicadas a uma proporção de 1 g de ração moída mais 1 ml da solução de dsRNA, resultando, desta forma,

217/225 em uma taxa de aplicação de 10 mg de dsRNA por g de pélete. Os péletes foram substituídos semanalmente. Os insetos foram providos com péletes tratados durante as primeiras três semanas de experimento. Após isto, foram providos péletes não tratados. Os insetos foram mantidos em recipientes de plástico tampados (9 cm de diâmetro, 4,5 cm de profundidade), dez por recipiente. Cada arena continha um pélete isca tratado e uma fonte de água (bola de lã de algodão umedecida), cada uma colocada em uma pequena barcaça de pesagem separada. A água é renovada ad lib durante todo o experimento.

As observações foram feitas com intervalos de duas vezes por semana, com não mais que quatro dias entre as observações, até que todos os insetos de controle haviam ou morrido ou mudado para o estágio adulto (84 dias). A cada observação os insetos foram avaliados como vivos ou mortos, e examinados quanto a anomalias. A partir do dia 46 em diante, uma vez iniciada a muda para o estágio adulto, todos os insetos (vivos e mortos) foram avaliados como ninfa ou adulto. Os insetos sobreviventes foram pesados no dia 55 do experimento. Quatro replicatas foram realizadas para cada um dos tratamentos. Durante o experimento as condições de teste são 25 a 33°C e 20 a 25% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 12:12 horas de luz:escuro.

E - Clonagem de Fragmento de Gene de HC num Vetor Adequado Para Produção em Bactéria de RNA de Fita Dupla Ativo em Inseto

O que se segue é um Exemplo de clonagem de um fragmento de DNA correspondendo a um gene alvo de HC em um vetor para a expressão de RNA de fita dupla em um hospedeiro bacteriano, embora qualquer vetor contendo um promotor T7 ou qualquer outro promotor para transcrição eficiente em bactéria, possa ser utilizado (referência ao documento WO 00/01846).

218/225

As seqüências dos iniciadores específicos utilizados para a amplificação dos genes alvo são providas na Tabela 8. O molde utilizado é o vetor pCR8/GW/topo contendo quaisquer das seqüências alvo. Os iniciadores são utilizados em uma reação PCR nas seguintes condi5 ções: 5 minutos a 98°C, seguindo-se 30 ciclos de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguindo-se 10 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante é analisado em gel de agarose, purificado (kit de extração em gel QIAquick, Cat. n° 28706, Qiagen), clonado com extremidade cega em vetor pGNA49A linearizado com Srfi.

(referência ao documento WO 00/188121 Al), e seqüenciado. A seqüência do produto de PCR resultante corresponde à respectiva seqüência tal como fornecida na Tabela 8-AD. O vetor recombinante contendo esta seqüência é denominado de pGBNJOOXX.

F - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em inseto do inseto alvo em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatro219/225 centos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo

Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 μg/ml de colesterol) suplementado com 100 μg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de

220/225 teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram armazenados a -20°C até a utilização posterior.

G - Experimentos de Laboratório Para Testar Escherichia coli Expressando Alvos de dsRNA Contra Acheta domesticus

Bioensaios com base em plantas.

Plantas inteiras foram aspergidas com suspensões de bactérias quimicamente induzidas expressando dsRNA antes de alimentar a HC com as plantas. As plantas foram cultivadas em uma câmara de cultivo de plantas. As plantas foram engaioladas colocando-se uma garrafa plástica de 500 ml de cabeça para baixo sobre a planta com o gargalo da garrafa firmemente colocado no solo em um vaso e a base aberta coberta com uma malha fina de nylon para permitir a aeração, reduzir a condensação no interior e prevenir o escape do inseto. Foram colocados HCs em cada planta tratada na gaiola. As plantas foram tratadas com uma suspensão de E. coli AB309-105 contendo ou o plasmídeo pGBNJOOl ou o plasmídeo pGN29. Diferentes quantidades de bactéria foram aplicadas às plantas: por exemplo, 66, 22 e 7 unidades, onde uma unidade é definida como 10⁹ células bacterianas em 1 ml de uma suspensão de bactérias a um valor de densidade ótica de 1 a um comprimento de onda de 600 nm. Em cada caso, um volume total de

221/225 entre 1 e 10 ml foi aspergido sobre a planta com o auxílio de um vaporizador. Uma planta é utilizada por tratamento neste experimento. O número de sobreviventes é contado e o peso de cada sobrevivente é registrado.

A aspersão de plantas com uma suspensão da cepa AB309-105 de E. coli expressando dsRNA alvo a partir de pGBNJ003 levou a um aumento dramático na mortalidade dos insetos quando em comparação com o controle com pGN29. Estes experimentos mostram que o RNA de fita dupla correspondendo a uma seqüência de gene alvo de inseto produzido ou no sistema de expressão bacteriano do tipo selvagem ou no deficiente em RNaselII, é tóxico ao inseto em termos de aumentos substanciais na mortalidade e retardo do crescimento/ desenvolvimento dos insetos no que diz respeito às larvas sobreviventes. Fica claro também a partir destes experimentos que é provido um exemplo da proteção efetiva de plantas/plantações contra danos causados por insetos pela utilização da aspersão de uma formulação consistindo em bactérias expressando RNA de fita dupla correspondendo a um gene alvo de inseto.

Exemplo 13

Pyricularia grisea (Brusone do Arroz)

A - Clonagem de Seqüências Parciais de P. grisea

Foi isolado RNA intacto de alta qualidade de diferentes estágios de crescimento de P. grisea utilizando-se reagente TRIzol (Cat. n° 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) seguindose as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação de RNA foi removido por tratamento com DNase (Cat. n° 1700, Promega) seguindo-se as instruções do fabricante. Foi gerado o cDNA utilizando-se um kit comercialmente disponível (Superscript™ III Reverse Transcriptase, Cat. n° 18080044, Invitrogen, Rockville, Mar

222/225 yland, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.

De maneira a isolar seqüências de cDNA compreendendo uma parte de um gene alvo, uma reação PCR é realizada com iniciadores degenerados utilizando-se o Amplitaq Gold (Cat. n° N8080240, Applied

Biosystems) seguindo-se as instruções do fabricante. Os produtos de PCR resultantes foram fracionados e seqüenciados.

B - Produção de dsRNA de Genes de P. grisea O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas utilizando-se o kit T7 Ribomax™ Express RNAi System (Cat. n° P1700, Prome10 ga) comercialmente disponível. Os produtos de PCR resultantes foram analisados em gel de agarose e purificados pelo kit de purificação de PCR (kit de purificação de PCR Qiaquick, Cat. n° 28106, Qiagen) e precipitação com NaC104. Os moldes positivo e reverso T7 gerados foram misturados para serem transcritos e as fitas de RNA resultantes foram aneladas, tratadas com DNase e RNase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo-se as instruções do fabricante.

C - Recombinação de Alvo de P. grisea no Vetor Vegetal pK7GWIWG2D(II)

Uma vez que o mecanismo de interferência de RNA opera através de fragmentos de dsRNA, as seqüências de nucleotídeos alvo dos genes alvo, tal como selecionados acima, foram clonadas nas orientações antisenso e senso, separadas pela intron - CmR - intron, onde CmR é o marcador de resistência a cloranfenicol, para formar uma construção de dsRNA em grampo. Estas construções em grampo foram geradas utilizando-se a reação de recombinação LR entre um clone de entrada contendo attL (ver Exemplo A) e um vetor de destino contendo attR (= pK7GWIWG2D(II)). O vetor vegetal pK7GWIWG2D(II) foi obtido da VIB/Plant Systems Biology com acordo de transferência de material. A reação de recombinação LR é realizada utilizando-se a mistura enzimá223/225 tica LR Clonase™ II (Cat. n° 11791-020, Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Estes experimentos de clonagem resultaram em uma construção em grampo para o gene alvo, contendo o promotor senso - intron - CmR - intron - orientação anti-senso, e onde o promotor é o promotor 35S operável em planta. O vetor binário pK7GWIWG2D(II) com o promotor 35S é adequado para transformação em A. tumefaciens.

As digestões com enzima de restrição foram conduzidas nos plasmídeos pCR8/GW/TOPO contendo o alvo (ver Exemplo B). A banda contendo o gene de interesse flanqueado pelos sítios attL foi purificada utilizando-se o kit de extração em gel Qiaquick (Cat. n° 28706, Qiagen). Uma quantidade de 150 ng do fragmento purificado e 150 ng de pK7GWIWG2D(II) foram adicionados juntos com a enzima LR clonase II e incubados por pelo menos 1 hora a 25°C. Após o tratamento com a solução de proteinase K (10 minutos a 37°C), a mistura de recombinação total foi transformada em células quimicamente competentes Top

10. Os clones positivos foram selecionados por análise de digestão por restrição.

D - Expressão e Produção de um Alvo de RNA de Fita Dupla em Duas Cepas de Escherichia coli:

(1) AB309-105 e (2) BL21(DE3)

Os procedimentos descritos abaixo foram seguidos de maneira a se expressar níveis adequados de RNA de fita dupla ativo em fungo do alvo fúngico em bactéria. Uma cepa deficiente em RNaselII, AB309-105, foi utilizada em comparação com uma bactéria selvagem contendo RNaselII, BL21(DE3).

Transformação de AB309-105 e BL21(DE3)

Trezentos ng do plasmídeo foram adicionados e gentilmente

224/225 misturados a uma alíquota gelada de 50 μΐ das cepas AB309-105 ou BL21(DE3) de E. coli quimicamente competentes. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos antes de serem submetidas a um tratamento de choque térmico a 37°C por 5 minutos, após o que as células foram colocadas de volta em gelo por mais 5 minutos. Quatrocentos e cinqüenta μΐ de meio SOC à temperatura ambiente foram adicionados às células e a suspensão foi incubada em um agitador (250 rpm) a 37°C por 1 hora. Cem μΐ da suspensão bacteriana foram transferidos para um frasco cônico de 500 ml contendo 150 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 pg/ml do antibiótico carbenicilina. A cultura foi incubada em um agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37°C por uma noite (16 a 18 horas).

Indução química da expressão de RNA de fita dupla em AB309105 e BL21(DE3).

A expressão de RNA de fita dupla a partir do vetor recombinante pGBNJ003, na cepa bacteriana AB309-105 ou BL21(DE3), foi possibilitada uma vez que todos os componentes genéticos para a expressão controlada estavam presentes. Na presença do indutor químico isopropiltiogalactosídeo, ou IPTG, a T7 polimerase irá acionar a transcrição da seqüência alvo tanto na direção anti-senso quanto na direção senso, uma vez que estas estão flanqueadas por promotores T7 de orientações opostas entre si.

A densidade ótica a 600 nm da cultura bacteriana pernoitada foi determinada utilizando-se um espectrofotômetro apropriado ajustado para um valor de 1 pela adição de caldo LB fresco. Cinqüenta ml desta cultura foram transferidos para um tubo Falcon de 50 ml e a cultura foi então centrifugada a 3000 g a 15°C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete bacteriano foi re-suspendido em 50 ml de meio completo S fresco (meio SNC mais 5 pg/ml de colesterol) suplementado

225/225 com 100 pg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG. As bactérias foram induzidas por de 2 a 4 horas à temperatura ambiente.

Tratamento térmico das bactérias.

As bactérias foram mortas por tratamento térmico de maneira a se minimizar o risco de contaminação da ração artificial nas placas de teste. Entretanto, o tratamento térmico das bactérias expressando o RNA de fita dupla não é um pré-requisito para a indução de toxidez nos insetos devido à interferência de RNA. A cultura bacteriana induzida foi centrifugada a 3000 g à temperatura ambiente por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi submetido a 80°C por 20 minutos em um banho-maria. Após o tratamento térmico, o pélete bacteriano foi re-suspendido em 1,5 ml de água MilliQ e a suspensão foi transferida para um tubo microfuge. Vários tubos foram preparados e utilizados nos bioensaios para cada renovação. Os tubos foram arma15 zenados a -20°C até a utilização posterior.

1/1

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. RNA de fita dupla isolado compreendendo fitas complementares aneladas, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das referidas fitas compreende SEQ ID NO:240, em que a ingestão da referida sequência

   5 de ribonucleotídeo por um inseto peste de plantas inibe o crescimento da referida peste.
2. 2. Método de controle de infestação de peste, caracterizado pelo fato de que compreende prover um inseto peste de planta com ração artificial compreendendo o ribonucleotídeo como definido na reivindicação 1, em que

   10 a ingestão da referida ração artificial pela referida peste inibe o crescimento da referida peste.
3. 3. Uso de uma ração artificial compreendendo sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, como definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para tratar infestação de plantas por insetos.

   Petição 870170085441, de 06/11/2017, pág. 8/10

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